CN1837362B - 抑制sars冠状病毒n蛋白表达的小干扰rna分子及其编码基因 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子及其编码基因与应用。该抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子,是下述1)和2)中的至少一个双链RNA序列:1)正义链具有序列表中序列1的核苷酸序列,反义链具有序列表中序列2的核苷酸序列;2)正义链具有序列表中序列3的核苷酸序列,反义链具有序列表中序列4的核苷酸序列。本发明将在制备以抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子或携带所述抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子编码基因的表达载体为活性成分的药物中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子及其编码基因。
背景技术
引起严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS)的病原体SARS-CoV为一种新型的冠状病毒,具有棘突蛋白S(spike),基质蛋白M(matrix),包膜蛋白E(Envelope)和核蛋白N(Nuclear protein)等数种主要结构蛋白(HolmesKV.SARS-associated coronavirus.N Engl J Med,2003,348(20):1948-51.)。研究表明,S蛋白是该病毒的主要保护性抗原,N蛋白和M蛋白也可以诱导免疫效应,特别是N蛋白具有较强的免疫原性。SARS-CoV N蛋白由422个氨基酸残基组成,相对分子质量48KD,其编码基因的长度为1268bp,是SARS-CoV主要的结构蛋白,在冠状病毒颗粒中,N蛋白位于病毒颗粒的核心部分和基因组RNA结合(Marra MA,JonesSJ,Astell CR,et al.The genome sequence of the SARS-associatedcoronavirus.Science,2003,300(5624):1399-1404.;Wang J,J i J,Ye J,et al.The structure analysis and antigenicity study of the N protein of SARS-CoVGenomics Proteomics Bioinformatics,2003,1(2):145-154.)。以往对动物冠状病毒结构蛋白的研究表明,N蛋白在病毒复制和产生的病理反应中起重要作用(HiscoxJA,Wurm T,Wilson L,et al.The coronavirus infectious bronchitis virusnucleoprotein localizes to the nucleolus.J Virol,2001,75(1):506-512.)。但目前,尚未有直接而有效的抑制SARS-CoV的方法。
RNA干扰技术(RNAi)是在小双链RNA(dsRNA)分子的介导下特异性降解靶基因的生物技术,能使基因表达沉默,达到拮抗靶基因和实现生物(基因)治疗目的。长度为21到22个碱基的所谓小干扰RNA(siRNA,small interfering RNA)介导特异性干扰反应,只降解与其高度互补的特定基因的mRNA(Elbashir,S.M.,Harborth,J.,Lendeckel,W.et al.,Duplexes of21-nucleotide RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells,Nature,2001,411(6836):494)。RNAi技术因其在疾病治疗方面具有巨大潜力而备受关注。迄今为止,有关siRNA可诱导产生针对SARS病毒基因RNA的干扰效应,从而使该病毒的复制和蛋白表达受到抑制对细胞形成保护作用,在ncbi上已有一些报道,但针对SARS-CoVN蛋白设计的siRNA未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供可抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子及其编码基因。
本发明所提供的抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子,是下述1)和2)中的至少一个双链RNA序列:
1)正义链具有序列表中序列1的核苷酸序列,反义链具有序列表中序列2的核苷酸序列;
2)正义链具有序列表中序列3的核苷酸序列,反义链具有序列表中序列4的核苷酸序列。
将具有1)的双链RNA序列命名为siRNA1,其反义链与SARS-CoV N mRNA(序列表中的序列9)的213-233位置序列5’GGGCGUUCCAAUCAACACCAA3’互补。序列表中序列1由21个碱基组成,序列的方向从左至右为5′端→3′端;序列表中序列2由21个碱基组成,序列的方向从左至右为5′端→3′端。
将具有2)的双链RNA序列命名为s iRNA2,其反义链与SARS-CoV N mRNA的862-883位置序列5’GGGGACCAAGACCUAAUCAGAC3’互补。序列表中序列3由22个碱基组成,序列的方向从左至右为5′端→3′端;序列表中序列4由22个碱基组成,序列的方向从左至右为5′端→3′端。
上述抑制SARS-CoV N蛋白表达的小干扰RNA分子的编码基因可具有下述1)和2)中至少一个双链核苷酸序列:
1)有义链(正义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中序列5的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列;反义链(做模板的DNA链)具有序列表中序列6的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列;
2)有义链(正义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中序列7的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列;反义链(做模板的DNA链)具有序列表中序列8的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC),0.1%SDS的溶液中,在65℃下杂交并洗膜。
将具有1)的双链寡核苷酸序列编码基因命名为siDNA1,编码siRNA1。序列表中序列5由58个碱基组成,序列的方向从左至右为5′端→3′端;序列表中序列6由54个碱基组成,序列的方向从左至右为3′端→5′端。
将具有2)的双链寡核苷酸序列编码基因命名为siDNA2,编码siRNA2。序列表中序列7由60个碱基组成,序列的方向从左至右为5′端→3′端;序列表中序列8由56个碱基组成,序列的方向从左至右为3′端→5′端。
含有上述抑制SARS-CoV N蛋白表达的小干扰RNA分子的编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明提供的siRNA1和siRNA2小干扰RNA分子均可对SARS冠状病毒N蛋白的表达产生干扰效应,且随着含有siRNA1编码基因的RNAi干扰载体的转染量的增加,SARS-CoV N蛋白的表达量逐渐下降,表明针对SARS-CoV N蛋白设计的siRNA的有效性和其抑制SARS-CoV N蛋白表达的剂量效应,为SARS冠状病毒N蛋白的功能研究奠定了基础,为进一步研究SARS-CoV N蛋白在SARS-CoV的致病机制中的作用提供了新的平台,对于揭示SARS的致病机制具有重要意义,同时也为预防和治疗SARS提供了新的思路和方法。本发明将在SARS的特异性预防和治疗方法中具有潜在的应用价值,特别是在制备以抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子或携带所述抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子编码基因的表达载体为活性成分的药物中将发挥重要作用。
附图说明
图1为SARS-CoV N蛋白的RNAi载体pBS/U6+1abcd和pBS/U6+2abcd的酶切鉴定结果
图1b为抑制SARS-CoV N蛋白表达的RNAi干扰载体的工作原理示意图
图2为含SARS-CoV N蛋白的全基因序列的真核重组表达载体pcMyc+N的酶切鉴定结果
图3为重组SARS-CoV N蛋白表达的westernblot检测结果
图4为RNAi干扰载体对SARS-CoV N蛋白表达的干扰效应的westernblot检测结果
图5为上样与图4完全对应的对照(内参)β-actin的Western blot检测结果
图6为RNAi干扰载体对SARS-CoV N蛋白干扰效应的定量分析结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,所用DNA序列均由上海生工合成。
实施例1、抑制SARS-CoV N蛋白表达的小干扰RNA分子的设计、RNAi干扰载体的构建及其酶切鉴定
一、抑制SARS-CoV N蛋白表达的小干扰RNA分子的设计
按下述方法设计抑制SARS-CoV N蛋白表达的小干扰RNA分子:
1、在SARS-CoV N的mRNA序列(序列表中序列9)中筛选连续的“GGG”序列,该序列通常应选择在AUG下游至少100bp后;
2、截取GGG后18-19bp的序列,以使加上GGG后序列总长度为21-22bp;
3、对经步骤1和2获得的siRNA序列进行筛选,具体筛选要求为:
1)21-22bp siRNA的G/C%为45-65%;
2)在ncbi上对siRNA序列进行序列同源性比对,以确保所筛选的抑制SARS-CoVN蛋白表达的siRNA序列经检测和除SARS-CoV外的其它种属序列无同源性。
经上述步骤获得了两对抑制SARS-CoV N蛋白表达的小干扰RNA分子,分别命名为siRNA1(序列表中序列1和序列2)和siRNA2(序列表中序列3和序列4),siRNA1作用于SARS-CoV N mRNA(序列表中的序列9)的213-233位置序列5’GGGCGUUCCAAUCAACACCAA3’,s iRNA2作用于SARS-CoV N mRNA的862-883位置序列5’GGGGACCAAGACCUAAUCAGAC3’。
二、抑制SARS-CoV N蛋白表达的RNAi干扰载体的构建及其酶切鉴定
1、根据siRNA1和siRNA2所作用的靶序列以及载体pBS/U6(Sui GC etal.PNAS.2002April;99(8):5515-5520)的使用要求,设计siRNA1和siRNA2的siDNA序列,分别命名为siDNA1和siDNA2,具体序列如下(下划线碱基序列为针对SARS-CoVNmRNA的靶序列):
siDNA1正义链:
5’-gggcgttccaatcaacaccaaa agcttttggtgttgattggaacgccctttttctgca-3(序列5)siDNA1反义链:
3’-cccgcaaggttagttgtggttttcga aaaccacaactaaccttgcgggaaaaag-5’(序列6)siDNA2正义链:
5’-ggggaccaagacctaatcagaca agcttgtctgattaggtcttggtcccctttttctgca-3(序列7)siDNA2反义链:
3’-cccctggttctggattagtctgttcga acagactaatccagaaccaggggaaaaag-5’(序列8)
2、根据所设计的siDNA1和siDNA2序列合成8条寡核苷酸,序列如下:
1a:5’-ggcgttccaatcaacaccaaa-3’
1b:3’-ccgcaaggttagttgtggttttcga-5’
1c:5’-agcttttggtgttgattggaacgccctttttctgca-3’
1d:3’-aaaccacaactaaccttgcgggaaaaag-5’
2a:5’-gggaccaagacctaatcagaca-3’
2b:3’-ccctggttctggattagtctgttcga-5’
2c:5’-agcttgtctgattaggtcttggtcccctttttctgca-3’
2d:3’-acagactaatccagaaccaggggaaaaag-5’
将上述8条两两互补的寡核苷酸片断经煮沸后缓慢退火得到1ab、1cd、2ab、2cd四条双链dsRNA,对1ab和2ab分别进行以下操作:用限制性内切酶Apa I和HindIII进行双酶切,将酶切产物克隆入经同样酶酶切的含有U6启动子的载体pBS/U6中,将含有1ab的载体命名为pBS/U6+1ab,将含有2ab的载体命名为pBS/U6+2ab。再将1cd分别用限制性内切酶Hind III和Pst I进行双酶切后克隆入经同样酶酶切的载体pBS/U6+1ab中,得到以5’GGGCGUUCCAAUCAACACCAA3’为靶序列的SARS-CoV N蛋白的RNAi载体,将其命名为pBS/U6+1abcd;将2cd用同样方法克隆入载体pBS/U6+2ab中,得到以5’GGGACCAAGACCUAAUCAGACA3’为靶序列的SARS-CoV N蛋白的RNAi载体,将其命名为pBS/U6+2abcd。对pBS/U6+1abcd和pBS/U6+2abcd用EcoRI&Kpn I、Sal I&Kpn I分别进行双酶切鉴定(以空载体pBS/U6为对照),结果如图1所示(泳道M为Marker,泳道1为pBS/U6+2abcd的EcoR I和Kpn I双酶切产物,泳道2为pBSU6+1abcd的EcoRI和Kpn I的双酶切产物,泳道3为pBS/U6的EcoR I和Kpn I的双酶切产物,泳道4为pBS/U6+2ab的SalI和Kpn I的双酶切产物,泳道5为pBS/U6+1ab的Sal I和Kpn I的双酶切产物,泳道6为pBS/U6的Sal I和Kpn I的双酶切产物),空载体pBS/U6经双酶切可以释放长度约为500bp左右的DNA片段,而构建的载体pBS/U6+1ab、pBS/U6+2ab、pBS/U6+1abcd和pBS/U6+2abcd因插入dsRNA使限制酶切位点缺失而不能释放该长度约为500bp左右的DNA片段,表明正确构建了分别含有siDNA1和siDNA2抑制SARS-CoV N蛋白表达的RNAi干扰载体,其工作原理示意图如图1b所示。
实施例2、SARS-CoV N蛋白的真核重组表达载体的构建及表达以及用western blot法检测RNAi干扰载体对SARS-CoV N蛋白表达的干扰效应及定量分析
一、SARS-CoV N蛋白的真核重组表达载体的构建及该蛋白的表达
1、SARS-CoV N蛋白的真核重组表达载体的构建
根据SARS-CoV N蛋白的CDS区设计引物,引物序列如下:
引物1:(上游引物)5’-TATAGAATTCTGTCTGATAATGGACCCCAAT-3’;(划线部分碱基为EcoRI识别位点)
引物2:(下游引物)5’-TATAGGTACCTTATGCCTGAGTTGAATCAG-3’(划线部分碱基为Kpn I识别位点)
以经SARS-CoV HKU-39849株(Zeng FW et al Exp Biol Med(Maywood).2003Jul;228(7):866-73)感染的vero E6细胞(ATCC)的RNA提取物为模板,在引物1和引物2的引导下,用RT-PCR法扩增SARS-CoV N蛋白的全基因序列并在其两端分别添加限制性内切酶EcoRI和KpnI识别位点,然后将SARS-CoV N蛋白的全基因序列克隆入质粒载体pGEM-T easy(promega公司)中,再利用限制性内切酶EcoR I和KpnI将SARS-CoV N蛋白的全基因序列亚克隆入真核表达载体pCMV-Myc(美国Clontech公司)中,将重组载体命名为pcMyc+N,并对其进行酶切鉴定(以空载体pCMV-Myc为对照),结果如图2所示(泳道M为Marker,泳道1为pcmyc+N的BamHI单酶切产物,泳道2为pCMV-Myc的Apa I和Kpn I双酶切产物,泳道3为pcmyc+N的ApaI和Kpn I双酶切产物,泳道4为pCMV-Myc的BamHI单酶切产物),表明重组载体pcMyc+N比空白载体pCMV-Myc多释放一条1200bp左右的DNA片段,该片段大小与SARS-CoV N蛋白的全基因序列的大小相符,证明获得了正确的含有SARS-CoV N蛋白全基因序列的真核重组表达载体pcMyc+N。
2、SARS-CoV N蛋白的表达
将pcMyc+N用脂质体法转染(所用转染试剂TfxTM-20购自promega公司)293细胞(ATCC,用购自美国Gibco公司的MEM培养基培养),以pCMV-Myc空白载体为对照,48小时后收获细胞,将细胞裂解后进行westernblot检测SARS-CoV N蛋白的表达情况,结果如图3所示(泳道1为用pcMyc+N转染的细胞裂解物,泳道2为用pCMV-Myc转染的细胞裂解物),表明用pcMyc+N转染的293细胞表达有分子量大小约为48kD的蛋白,与SARS-CoV N蛋白的分子量大小一致,而对照空白载体pCMV-Myc没有蛋白表达。
二、用western blot法检测RNAi干扰载体对SARS-CoV N蛋白表达的干扰效应
将步骤一构建的SARS-CoV N蛋白的真核表达载体pcmyc+N、RNAi干扰载体pBS/U6+1abcd和pBS/U6+2abcd分别用脂质体法共转293细胞检测其对SARS-CoV N蛋白表达的干扰效应,同时设定不同剂量关系测定RNAi干扰载体pBS/U6+1abcd及pBS/U6+2abcd干扰SARS-CoV N蛋白表达的剂量效应,具体方法为:在保证总转染量和pcmyc+N转染量相同的情况下,改变RNAi干扰载体pBS/U6+1abcd或pBS/U6+2abcd的转染量,即分别以pcmyc+N:RNAi干扰载体为1:1、1:3和1:6的比例(质量比)共转293细胞,48小时后收获细胞,将细胞裂解后进行westernblot检测SARS-CoV N蛋白的表达情况(选择购自Santa Cruz公司的小鼠anti-Myc单克隆抗体和HRP标记的羊抗小鼠IgG及ECL试剂),结果如图4所示(泳道1为pcMyc&pBS/U6+2abcd,泳道2为pcmyc+N&pBS/U6+2abcd(1:6),泳道3为pcmyc+N&pBS/U6+2abcd(1:3),泳道4为pcmyc+N&pBS/U6+2abcd(1:1),泳道5为pcmyc+N&pBS/U6,泳道6为pcmyc+N&pBS/U6+1abcd(1:1),泳道7为pcmyc+N&pBS/U6+1abcd(1:3),泳道8为pcmyc+N&pBS/U6+1abcd(1:6),泳道9为pcmyc&pBS/U6+1abcd,泳道M为蛋白Marker),表明SARS-CoV N蛋白的表达随着siRNA剂量的增加被明显的抑制,然后相对应于上述的剂量和条件下以293细胞自身表达的β-actin作内参,用Western blot法作鉴定(选择购自Santa Cruz公司的山羊anti-β-actin单克隆抗体和HRP标记的鼠抗羊IgG及ECL试剂),结果如图5所示,可按下述方法对SARS-CoVN蛋白表达水平进行定量分析。
三、RNAi干扰载体对SARS-CoV N蛋白干扰效应的定量分析
通过UVISoft UVIBand Application V97.04软件对图5中的SARS-CoV N蛋白和β-actin进行定量测定,通过计算统一β-actin内参为固定值并设定只转染pcmyc+N的SARS-CoV N蛋白表达量为1(100%),分析RNAi干扰载体和SARS-CoV N蛋白表达载体共转后SARS-CoV N蛋白表达下降的百分比,结果如图6所示,纵坐标为SARS-CoV N蛋白表达量,横坐标为pcmyc+N与RNAi干扰载体pBS/U6+1abcd或pBS/U6+2abcd的质量比。图6结果表明随着RNAi干扰载体转染量的增加(从1:0增加到1:6),SARS-CoV N蛋白的表达百分比下降显著,1:6时表达百分比仅为只转染pcmyc+N时的20%,说明RNAi对SARS-CoV N蛋白的表达具有明显抑制作用。
序列表
<160>9
<210>1
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
<210>3
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
<210>4
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
<210>5
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
<210>6
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
<210>7
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
<210>8
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
<210>9
<211>1269
<212>mRNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
Claims (7)
1.抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子,是一个双链RNA序列,其正义链为序列表中序列1表示的核苷酸序列,反义链为序列表中序列2表示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因,其特征在于:所述抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子的编码基因为一个双链核苷酸序列,其有义链是序列表中序列5表示的核苷酸序列;反义链是序列表中序列6表示的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述的抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子编码基因的表达载体。
5.含有权利要求2或3所述的抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子编码基因的转基因细胞系。
6.含有权利要求2或3所述的抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子编码基因的宿主菌。
7.以权利要求1所述的抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子或携带所述抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子编码基因的表达载体为活性成分的药物。
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张勇,等,.针对SARS冠状病毒重要蛋白的SIRNA涉及.生物化学与生物物理进展30 3.2003,30(3),335-338. |
张勇,等,.针对SARS冠状病毒重要蛋白的SIRNA涉及.生物化学与生物物理进展30 3.2003,30(3),335-338. * |
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Ullmer et al. | Direct and indirect effects on viral translation and RNA replication are required for AUF1 restriction of enterovirus infections in human cells | |
Vagnozzi et al. | Inhibition of foot-and-mouth disease virus infections in cell cultures with antisense morpholino oligomers | |
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Sánchez et al. | RNA interference-mediated virus clearance from cells both acutely and chronically infected with the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
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