CN101597607B - 抑制sars冠状病毒n蛋白表达的小干扰rna分子及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子及其编码基因与应用。该抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子，是一个双链RNA序列，其正义链为序列表中序列3的核苷酸序列，反义链为序列表中序列4的核苷酸序列。本发明将在制备以抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子或携带所述抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子编码基因的表达载体为活性成分的药物中发挥重要作用。

Description

抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子及其编码基因

本申请是2005年3月25日提交的申请号为200510057000.6专利申请的分案。

技术领域

本发明涉及抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子及其编码基因。

背景技术

引起严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)的病原体SARS-CoV为一种新型的冠状病毒，具有棘突蛋白S(spike)，基质蛋白M(matrix)，包膜蛋白E(Envelope)和核蛋白N(Nuclear protein)等数种主要结构蛋白(HolmesKV.SARS-associated coronavirus.N Engl J Med，2003，348(20)：1948-51.)。研究表明，S蛋白是该病毒的主要保护性抗原，N蛋白和M蛋白也可以诱导免疫效应，特别是N蛋白具有较强的免疫原性。SARS-CoV N蛋白由422个氨基酸残基组成，相对分子质量48KD，其编码基因的长度为1268bp，是SARS-CoV主要的结构蛋白，在冠状病毒颗粒中，N蛋白位于病毒颗粒的核心部分和基因组RNA结合(Marra MA，JonesSJ，Astell CR，et al.The genome sequence of the SARS-associatedcoronavirus.Science，2003，300(5624)：1399-1404.；Wang J，Ji J，Ye J，et al.The structure analysis and antigenicity study of the N protein of SARS-CoV.Genomics Proteomics Bioinformatics，2003，1(2)：145-154.)。以往对动物冠状病毒结构蛋白的研究表明，N蛋白在病毒复制和产生的病理反应中起重要作用(HiscoxJA，Wurm T，Wilson L，et al.The coronavirus infectious bronchitis virusnucleoprotein local izes to the nucleolus.J Virol，2001，75(1)：506-512.)。但目前，尚未有直接而有效的抑制SARS-CoV的方法。

RNA干扰技术(RNAi)是在小双链RNA(dsRNA)分子的介导下特异性降解靶基因的生物技术，能使基因表达沉默，达到拮抗靶基因和实现生物(基因)治疗目的。长度为21到22个碱基的所谓小干扰RNA(siRNA，small interfering RNA)介导特异性干扰反应，只降解与其高度互补的特定基因的mRNA(Elbashir，S.M.，Harborth，J.，Lendeckel，W.et al.，Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells，Nature，2001，411(6836)：494)。RNAi技术因其在疾病治疗方面具有巨大潜力而备受关注。迄今为止，有关siRNA可诱导产生针对SARS病毒基因RNA的干扰效应，从而使该病毒的复制和蛋白表达受到抑制对细胞形成保护作用，在ncbi上已有一些报道，但针对SARS-CoV N蛋白设计的siRNA未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供可抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子及其编码基因。

本发明所提供的抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子，是下述1)和2)中的至少一个双链RNA序列：

1)正义链具有序列表中序列1的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列2的核苷酸序列；

2)正义链具有序列表中序列3的核苷酸序列，反义链具有序列表中序列4的核苷酸序列。

将具有1)的双链RNA序列命名为siRNA1，其反义链与SARS-CoV N mRNA(序列表中的序列9)的213-233位置序列5’GGGCGUUCCAAUCAACACCAA 3’互补。序列表中序列1由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列2由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

将具有2)的双链RNA序列命名为siRNA2，其反义链与SARS-CoV N mRNA的862-883位置序列5’GGGGACCAAGACCUAAUCAGAC 3’互补。序列表中序列3由22个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列4由22个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

上述抑制SARS-CoV N蛋白表达的小干扰RNA分子的编码基因可具有下述1)和2)中至少一个双链核苷酸序列：

1)有义链(正义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中序列5的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中序列6的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

2)有义链(正义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中序列7的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中序列8的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

将具有1)的双链寡核苷酸序列编码基因命名为siDNA1，编码siRNA1。序列表中序列5由58个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列6由54个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。

将具有2)的双链寡核苷酸序列编码基因命名为siDNA2，编码siRNA2。序列表中序列7由60个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列8由56个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。

含有上述抑制SARS-CoV N蛋白表达的小干扰RNA分子的编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明提供的siRNA1和siRNA2小干扰RNA分子均可对SARS冠状病毒N蛋白的表达产生干扰效应，且随着含有siRNA1编码基因的RNAi干扰载体的转染量的增加，SARS-CoV N蛋白的表达量逐渐下降，表明针对SARS-CoV N蛋白设计的siRNA的有效性和其抑制SARS-CoV N蛋白表达的剂量效应，为SARS冠状病毒N蛋白的功能研究奠定了基础，为进一步研究SARS-CoV N蛋白在SARS-CoV的致病机制中的作用提供了新的平台，对于揭示SARS的致病机制具有重要意义，同时也为预防和治疗SARS提供了新的思路和方法。本发明将在SARS的特异性预防和治疗方法中具有潜在的应用价值，特别是在制备以抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子或携带所述抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子编码基因的表达载体为活性成分的药物中将发挥重要作用。

附图说明

图1为SARS-CoV N蛋白的RNAi载体pBS/U6+1abcd和pBS/U6+2abcd的酶切鉴定结果

图1b为抑制SARS-CoV N蛋白表达的RNAi干扰载体的工作原理示意图

图2为含SARS-CoV N蛋白的全基因序列的真核重组表达载体pcMyc+N的酶切鉴定结果

图3为重组SARS-CoV N蛋白表达的westernblot检测结果

图4为RNAi干扰载体对SARS-CoV N蛋白表达的干扰效应的westernblot检测结果

图5为上样与图4完全对应的对照(内参)β-actin的Western blot检测结果

图6为RNAi干扰载体对SARS-CoV N蛋白干扰效应的定量分析结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用DNA序列均由上海生工合成。

实施例1、抑制SARS-CoV N蛋白表达的小干扰RNA分子的设计、RNAi干扰载体的构建及其酶切鉴定

一、抑制SARS-CoV N蛋白表达的小干扰RNA分子的设计

按下述方法设计抑制SARS-CoV N蛋白表达的小干扰RNA分子：

1、在SARS-CoV N的mRNA序列(序列表中序列9)中筛选连续的“GGG”序列，该序列通常应选择在AUG下游至少100bp后；

2、截取GGG后18-19bp的序列，以使加上GGG后序列总长度为21-22bp；

3、对经步骤1和2获得的siRNA序列进行筛选，具体筛选要求为：

1)21-22bp siRNA的G/C％为45-65％；

2)在ncbi上对siRNA序列进行序列同源性比对，以确保所筛选的抑制SARS-CoVN蛋白表达的siRNA序列经检测和除SARS-CoV外的其它种属序列无同源性。

经上述步骤获得了两对抑制SARS-CoV N蛋白表达的小干扰RNA分子，分别命名为siRNA1(序列表中序列1和序列2)和siRNA2(序列表中序列3和序列4)，siRNA1作用于SARS-CoV N mRNA(序列表中的序列9)的213-233位置序列5’GGGCGUUCCAAUCAACACCAA 3’，s iRNA2作用于SARS-CoV N mRNA的862-883位置序列5’GGGGACCAAGACCUAAUCAGAC 3’。

二、抑制SARS-CoV N蛋白表达的RNAi干扰载体的构建及其酶切鉴定

1、根据siRNA1和siRNA2所作用的靶序列以及载体pBS/U6(Sui GC etal.PNAS.2002April；99(8)：5515-5520)的使用要求，设计siRNA1和siRNA2的siDNA序列，分别命名为siDNA1和siDNA2，具体序列如下(下划线碱基序列为针对SARS-CoV NmRNA的靶序列)：

siDNA1正义链：

5’-gggcgttccaatcaacaccaaa agcttttggtgttgattggaacgccctttttctgca-3(序列5)siDNA1反义链：

3’-cccgcaaggttagttgtggttttcga aaaccacaactaaccttgcgggaaaaag-5’(序列6)siDNA2正义链：

5’-ggggaccaagacctaatcagaca agcttgtctgattaggtcttggtcccctttttctgca-3(序列7)siDNA2反义链：

3’-cccctggttctggattagtctgttcga acagactaatccagaaccaggggaaaaag-5’(序列8)

2、根据所设计的siDNA1和siDNA2序列合成8条寡核苷酸，序列如下：

1a：5’-ggcgttccaatcaacaccaaa-3’

1b：3’-ccgcaaggttagttgtggttttcga-5’

1c：5’-agcttttggtgttgattggaacgccctttttctgca-3’

1d：3’-aaaccacaactaaccttgcgggaaaaag-5’

2a：5’-gggaccaagacctaatcagaca-3’

2b：3’-ccctggttctggattagtctgttcga-5’

2c：5’-agcttgtctgattaggtcttggtcccctttttctgca-3’

2d：3’-acagactaatccagaaccaggggaaaaag-5’

将上述8条两两互补的寡核苷酸片断经煮沸后缓慢退火得到1ab、1cd、2ab、2cd四条双链dsRNA，对1ab和2ab分别进行以下操作：用限制性内切酶Apa I和HindIII进行双酶切，将酶切产物克隆入经同样酶酶切的含有U6启动子的载体pBS/U6中，将含有1ab的载体命名为pBS/U6+1ab，将含有2ab的载体命名为pBS/U6+2ab。再将1cd分别用限制性内切酶Hind III和Pst I进行双酶切后克隆入经同样酶酶切的载体pBS/U6+1ab中，得到以5’GGGCGUUCCAAUCAACACCAA 3’为靶序列的SARS-CoV N蛋白的RNAi载体，将其命名为pBS/U6+1abcd；将2cd用同样方法克隆入载体pBS/U6+2ab中，得到以5’GGGACCAAGACCUAAUCAGACA 3’为靶序列的SARS-CoV N蛋白的RNAi载体，将其命名为pBS/U6+2abcd。对pBS/U6+1abcd和pBS/U6+2abcd用EcoR I &Kpn I、Sa1I & Kpn I分别进行双酶切鉴定(以空载体pBS/U6为对照)，结果如图1所示(泳道M为Marker，泳道1为pBS/U6+2abcd的EcoR I和Kpn I双酶切产物，泳道2为pBSU6+1abcd的EcoR I和Kpn I的双酶切产物，泳道3为pBS/U6的EcoR I和Kpn I的双酶切产物，泳道4为pBS/U6+2ab的Sa1 I和Kpn I的双酶切产物，泳道5为pBS/U6+1ab的Sa1 I和Kpn I的双酶切产物，泳道6为pBS/U6的Sa1 I和Kpn I的双酶切产物)，空载体pBS/U6经双酶切可以释放长度约为500bp左右的DNA片段，而构建的载体pBS/U6+1ab、pBS/U6+2ab、pBS/U6+1abcd和pBS/U6+2abcd因插入dsRNA使限制酶切位点缺失而不能释放该长度约为500bp左右的DNA片段，表明正确构建了分别含有siDNA1和siDNA2抑制SARS-CoV N蛋白表达的RNAi干扰载体，其工作原理示意图如图1b所示。

实施例2、SARS-CoV N蛋白的真核重组表达载体的构建及表达以及用western blot法检测RNAi干扰载体对SARS-CoV N蛋白表达的干扰效应及定量分析

一、SARS-CoV N蛋白的真核重组表达载体的构建及该蛋白的表达

1、SARS-CoV N蛋白的真核重组表达载体的构建

根据SARS-CoV N蛋白的CDS区设计引物，引物序列如下：

引物1：(上游引物)5’-TATAGAATTCTGTCTGATAATGGACCCCAAT-3’；(划线部分碱基为EcoRI识别位点)

引物2：(下游引物)5’-TATAGGTACCTTATGCCTGAGTTGAATCAG-3’(划线部分碱基为Kpn I识别位点)

以经SARS-CoV HKU-39849株(Zeng FW et al Exp Biol Med(Maywood).2003Jul；228(7)：866-73)感染的vero E6细胞(ATCC)的RNA提取物为模板，在引物1和引物2的引导下，用RT-PCR法扩增SARS-CoV N蛋白的全基因序列并在其两端分别添加限制性内切酶EcoR I和Kpn I识别位点，然后将SARS-CoV N蛋白的全基因序列克隆入质粒载体pGEM-T easy(promega公司)中，再利用限制性内切酶EcoR I和KpnI将SARS-CoV N蛋白的全基因序列亚克隆入真核表达载体pCMV-Myc(美国Clontech公司)中，将重组载体命名为pcMyc+N，并对其进行酶切鉴定(以空载体pCMV-Myc为对照)，结果如图2所示(泳道M为Marker，泳道1为pcmyc+N的BamHI单酶切产物，泳道2为pCMV-Myc的如a I和Kpn I双酶切产物，泳道3为pcmyc+N的如aI和Kpn I双酶切产物，泳道4为pCMV-Myc的BamHI单酶切产物)，表明重组载体pcMyc+N比空白载体pCMV-Myc多释放一条1200bp左右的DNA片段，该片段大小与SARS-CoV N蛋白的全基因序列的大小相符，证明获得了正确的含有SARS-CoV N蛋白全基因序列的真核重组表达载体pcMyc+N。

2、SARS-CoV N蛋白的表达

将pcMyc+N用脂质体法转染(所用转染试剂Tfx^TM-20购自promega公司)293细胞(ATCC，用购自美国Gibco公司的MEM培养基培养)，以pCMV-Myc空白载体为对照，48小时后收获细胞，将细胞裂解后进行westernblot检测SARS-CoV N蛋白的表达情况，结果如图3所示(泳道1为用pcMyc+N转染的细胞裂解物，泳道2为用pCMV-Myc转染的细胞裂解物)，表明用pcMyc+N转染的293细胞表达有分子量大小约为48kD的蛋白，与SARS-CoV N蛋白的分子量大小一致，而对照空白载体pCMV-Myc没有蛋白表达。

二、用western blot法检测RNAi干扰载体对SARS-CoV N蛋白表达的干扰效应

将步骤一构建的SARS-CoV N蛋白的真核表达载体pcmyc+N、RNAi干扰载体pBS/U6+1abcd和pBS/U6+2abcd分别用脂质体法共转293细胞检测其对SARS-CoV N蛋白表达的干扰效应，同时设定不同剂量关系测定RNAi干扰载体pBS/U6+1abcd及pBS/U6+2abcd干扰SARS-CoV N蛋白表达的剂量效应，具体方法为：在保证总转染量和pcmyc+N转染量相同的情况下，改变RNAi干扰载体pBS/U6+1abcd或pBS/U6+2abcd的转染量，即分别以pcmyc+N：RNAi干扰载体为1∶1、1∶3和1∶6的比例(质量比)共转293细胞，48小时后收获细胞，将细胞裂解后进行westernblot检测SARS-CoV N蛋白的表达情况(选择购自Santa Cruz公司的小鼠anti-Myc单克隆抗体和HRP标记的羊抗小鼠IgG及ECL试剂)，结果如图4所示(泳道1为pcMyc&pBS/U6+2abcd，泳道2为pcmyc+N&pBS/U6+2abcd(1∶6)，泳道3为pcmyc+N&pBS/U6+2abcd(1∶3)，泳道4为pcmyc+N&pBS/U6+2abcd(1∶1)，泳道5为pcmyc+N&pBS/U6，泳道6为pcmyc+N&pBS/U6+1abcd(1∶1)，泳道7为pcmyc+N&pBS/U6+1abcd(1∶3)，泳道8为pcmyc+N&pBS/U6+1abcd(1∶6)，泳道9为pcmyc&pBS/U6+1abcd，泳道M为蛋白Marker)，表明SARS-CoV N蛋白的表达随着siRNA剂量的增加被明显的抑制，然后相对应于上述的剂量和条件下以293细胞自身表达的β-actin作内参，用Western blot法作鉴定(选择购自Santa Cruz公司的山羊anti-β-actin单克隆抗体和HRP标记的鼠抗羊IgG及ECL试剂)，结果如图5所示，可按下述方法对SARS-CoVN蛋白表达水平进行定量分析。

三、RNAi干扰载体对SARS-CoV N蛋白干扰效应的定量分析

通过UVISoft UVIBand Application V97.04软件对图5中的SARS-CoV N蛋白和β-actin进行定量测定，通过计算统一β-actin内参为固定值并设定只转染pcmyc+N的SARS-CoV N蛋白表达量为1(100％)，分析RNAi干扰载体和SARS-CoV N蛋白表达载体共转后SARS-CoV N蛋白表达下降的百分比，结果如图6所示，纵坐标为SARS-CoV N蛋白表达量，横坐标为pcmyc+N与RNAi干扰载体pBS/U6+1abcd或pBS/U6+2abcd的质量比。图6结果表明随着RNAi干扰载体转染量的增加(从1∶0增加到1∶6)，SARS-CoV N蛋白的表达百分比下降显著，1∶6时表达百分比仅为只转染pcmyc+N时的20％，说明RNAi对SARS-CoV N蛋白的表达具有明显抑制作用。

序列表

<160>9

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gggcguucca aucaacacca a                             21

<210>2

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

uugguguuga uuggaacgcc  c                            21

<210>3

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ggggaccaag accuaaucag ac                                           22

<210>4

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gucugauuag gucuuggucc cc                                           22

<210>5

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gggcgttcca atcaacacca aaagcttttg gtgttgattg gaacgccctt tttctgca    58

<210>6

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gaaaaagggc gttccaatca acaccaaaag cttttggtgt tgattggaac gccc          54

<210>7

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

ggggaccaag acctaatcag acaagcttgt ctgattaggt cttggtcccc tttttctgca    60

<210>8

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

gaaaaagggg accaagacct aatcagacaa gcttgtctga ttaggtcttg gtcccc        56

<210>9

<211>1269

<212>mRNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

augucugaua auggacccca aucaaaccaa cguagugccc cccgcauuac auuuggugga     60

cccacagauu caacugacaa uaaccagaau ggaggacgca auggggcaag gccaaaacag    120

cgccgacccc aagguuuacc caauaauacu gcgucuuggu ucacagcucu cacucagcau    180

ggcaaggagg aacuuagauu cccucgaggc cagggcguuc caaucaacac caauaguggu    240

ccagaugacc aaauuggcua cuaccgaaga gcuacccgac gaguucgugg uggugacggc    300

aaaaugaaag agcucagccc cagaugguac uucuauuacc uaggaacugg cccagaagcu    360

ucacuucccu acggcgcuaa caaagaaggc aucguauggg uugcaacuga gggagccuug    420

aauacaccca aagaccacau uggcacccgc aauccuaaua acaaugcugc caccgugcua    480

caacuuccuc aaggaacaac auugccaaaa ggcuucuacg cagagggaag cagaggcggc    540

agucaagccu cuucucgcuc cucaucacgu agucgcggua auucaagaaa uucaacuccu    600

ggcagcagua ggggaaauuc uccugcucga auggcuagcg gaggugguga aacugcccuc    660

gcgcuauugc ugcuagacag auugaaccag cuugagagca aaguuucugg uaaaggccaa    720

caacaacaag gccaaacugu cacuaagaaa ucugcugcug aggcaucuaa aaagccucgc    780

caaaaacgua cugccacaaa acaguacaac gucacucaag cauuugggag acguggucca    840

gaacaaaccc aaggaaauuu cggggaccaa gaccuaauca gacaaggaac ugauuacaaa    900

cauuggccgc aaauugcaca auuugcucca agugccucug cauucuuugg aaugucacgc    960

auuggcaugg aagucacacc uucgggaaca uggcugacuu aucauggagc cauuaaauug   1020

gaugacaaag auccacaauu caaagacaac gucauacugc ugaacaagca cauugacgca   1080

uacaaaacau ucccaccaac agagccuaaa aaggacaaaa agaaaaagac ugaugaagcu   1140

cagccuuugc cgcagagaca aaagaagcag cccacuguga cucuucuucc ugcggcugac   1200

auggaugauu ucuccagaca acuucaaaau uccaugagug gagcuucugc ugauucaacu   1260

caggcauaa                                                           1269

Claims (4)

1.抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子，是一个双链RNA序列，正义链为序列表中序列3表示的核苷酸序列，反义链为序列表中序列4表示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子的编码基因是一个双链核苷酸序列，其有义链为序列表中序列7表示的核苷酸序列，反义链为序列表中序列8表示的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述的抑制SARS冠状病毒N蛋白表达的小干扰RNA分子编码基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。 

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