CN103589730A - 一种抑制IRS1基因表达的shRNA及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制IRS1基因表达的shRNA及应用，属于基因工程技术领域。本发明提供的shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1。通过与具有IRS2基因的质粒载体进行连接，本发明还提供了一种具有同时敲低猪源IRS1和IRS2基因表达的shRNA干扰载体。猪肝脏细胞IRS基因表达实验的结果显示，shRNA干扰载体分别将猪的IRS1基因和IRS2基因敲低了78%和64%。同时，IRS基因表达水平的敲低对猪肝脏细胞的糖脂代谢产生影响，提高了猪肝脏细胞的血糖浓度。本发明不仅为构建2型糖尿病模型猪奠定基础，还对如何提高猪血糖浓度进行了有益探索。
Description
技术领域
本发明涉及一种抑制IRS1基因表达的shRNA及应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，它能够抑制正常生物体内特定基因的表达。外源dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）的反义链和多种核苷酸酶作用后会形成具有结合和切割mRNA作用的沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC），从而最终介导RNA干扰过程。与耗时较长的基因敲除技术相比，RNAi可在较短时间内可控性地关闭多达10个基因。藉此灵活快速的特点，RNAi技术已经成为研究基因功能的重要工具，并在遗传性疾病、病毒病和肿瘤病的致病机理和治疗方面发挥重要作用。
2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一种复杂的代谢紊乱疾病，其发病率正随着人口老龄化，而逐年升高。2型糖尿病主要的发病机制为外周胰岛素抵抗与胰腺β细胞功能发生障碍，而这主要是有遗传缺陷引起的。胰岛素受体底物(insulin receptor substrates,IRSs)蛋白处于胰岛素信号通路的枢纽位置，通过自身磷酸化作用招募并结合下游的许多信号转导分子，将胰岛素信号传递、发散到下级网络，在维持细胞正常的生理功能上起到重要的作用，IRS1和IRS2基因的缺陷是2型糖尿病发病的主要诱因。原因在于IRS1和IRS2功能的缺失会引起机体生长发育缓慢，以及对胰岛素敏感性的降低和β细胞分泌功能障碍。
在目前以小鼠为主利用转基因技术产生的2型糖尿病模型中，基本上都是具有胰岛素抵抗以及β细胞失活的特征。敲除IRS1基因的小鼠表现出生长发育缓慢以及一定的胰岛素抵抗现象，敲除IRS2基因的小鼠在出生后直接表现为胰高血糖症以及β细胞分泌功能障碍，导致生成2型糖尿病，而同时敲除IRS1和IRS2基因的小鼠出生前就会死亡。但是，小鼠模型还是具有很多局限性，小鼠在遗传水平与表型上不能很好地模拟人类疾病，而且小鼠寿命较短，不能作为长期患病的研究目标。作为糖尿病的动物模型，小鼠对于葡糖以及胆固醇食物的反应与人类也存在较大差异。
猪和人在解剖学、生理学以及代谢特点方面均有很大的相似性，包括心脏血管的功能与结构，脂蛋白的分布，体型，发胖的趋势以及杂食的习惯等。这使得猪作为研究2型糖尿病的模式动物具有很多优点。譬如，患有2型糖尿病的猪会伴随着动脉粥样硬化，发病的解剖学位置与人类相同，而且与人类相应疾病的组织病理学特征是相似的。由于患有2型糖尿病的猪所表现出来的代谢异常与人类更加接近，因此建立有价值并且稳定的2型糖尿病猪模型是非常必要的。
发明内容
本发明提供一种抑制猪IRS1基因表达的shRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，主要用于制备抑制猪源IRS1基因的制品。
本发明提供的shRNA以干扰载体的形式存在，其特征在于，制备步骤如下：
（1）在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列两端加入BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，得到干扰片段；
（2）将步骤（1）获得的干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的质粒载体上，获得干扰载体。
上述方法的具体步骤为：
（1）在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列两端加入BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，得到shRNA干扰片段；
（2）将步骤（1）获得的干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的p-Genesil 1.0质粒载体上，获得p-Genesil-shIRS1干扰载体。
本发明还提供了一种制备shRNA干扰载体的方法，步骤如下：
（1）分别在SEQ ID NO.1和SE Q ID NO.2所示的核苷酸序列两端加入BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，获得干扰片段；
（2）分别将步骤（1）中获得的干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的质粒载体上，获得重组质粒；
（3）合成带有Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的单链shIRS2干扰片段，连接到经过Nhe Ⅰ和XhoⅠ线性化的shIRS1载体，获得同时具有IRS1和IRS2基因的线性化载体；
（4）扩增具有SnaB Ⅰ与Nhe Ⅰ酶切位点的hU6启动子，并将其连接到步骤（3）中获得的线性化载体，得到shRNA干扰载体。
上述方法的具体步骤如下：
（1）分别在SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列两端加入BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，获得干扰片段；
（2）分别将步骤（1）中获得的干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的p-Genesil 1.0质粒载体上，获得重组质粒p-Genesil-shIRS1和p-Genesil-shIRS2；
（3）合成带有Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的单链shIRS2干扰片段，连接到经过Nhe Ⅰ和XhoⅠ线性化的p-Genesil-shIRS1载体，获得同时具有IRS1和IRS2基因的线性化载体；
（4）扩增具有SnaB Ⅰ与Nhe Ⅰ酶切位点的hU6启动子，并将其连接到步骤（3）中获得的线性化载体，得到p-Genesil-shIRS1/shIRS2干扰载体。
本发明提供的shRNA干扰载体在抑制IRS基因表达中应用，特别是用于制备猪2型糖尿病模型的制品。
具体而言，根据已知的猪IRS1基因序列，设计4对引物，利用重叠PCR法，克隆猪的IRS1全长基因。对比人的IRS2基因序列和猪的基因组，根据保守区域序列设计引物，克隆猪ISR2的保守序列。
根据克隆获得猪IRS1以及IRS2序列，通过Ambion网站分别设计4对干扰片段，分别合成带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点的单链shRNA干扰片段，复性成双链后，连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的p-Genesil 1.0载体。构建成功并经筛选的有效干扰片段分别为shIRS1和shIRS2。重新合成带有Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的单链shIRS2干扰片段，复性成双链后，连接到筛选出有效的经过Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ线性化的p-Genesil-shIRS1载体。之后PCR扩增hU6启动子，带有SnaB Ⅰ与Nhe Ⅰ酶切位点，连入有两个基因干扰片段的线性化载体，经鉴定后，即获得p-Genesil-shIRS1/shIRS2干扰载体。
另外，本发明还检测了p-Genesil-shIRS1/shIRS2干扰载体对猪源IRS1和IRS2基因表达的抑制效果和对猪肝脏细胞糖脂代谢的影响。
本发明还提供了一种p-Genesil-shIRS1/shIRS2干扰载体用于制备抑制猪肝脏细胞IRS1和IRS2基因表达的模型猪制品。
本发明的优点在于，干扰载体p-Genesil-shIRS1/shIRS2具有非常明显地同时敲低猪源IRS1和IRS2基因表达的作用，对于构建2型糖尿病猪模型具有重要意义。因shRNA片段在体内一段时间会被降解，本发明研究成果对血糖浓度较低者采用RNA干扰技术提高血糖浓度具有借鉴意义。
附图说明
图1：猪IRS1基因电泳及结构图。
图2：猪IRS1基因的表达及有效片段的干扰效果。
图3：猪与人IRS2基因3’UTR序列比对结果及有效干扰片段的筛选。
图4：p-Genesil-shIRS1/shIRS2载体干扰IRS1和IRS2基因的表达。
图5：干扰IRS1和IRS2对糖代谢相关基因表达的影响。
图6：干扰IRS1和IRS2对胆固醇相关基因表达的影响。
具体实施方式
以下结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特别说明，均为购自常规生化试剂商店。
实验所用的巴马仔猪均来自东北农业大学实验基地猪场，实验所用的菌株质粒包括干扰载体pGenesil 1.0(Shen,Y.M.,X.C.Yang,et al.(2010).″Growth inhibition induced by shorthairpin RNA to silence survivin gene in human pancreatic cancer cells.″Hepatobiliary Pancreat Dis Int9(1):69-77.)、猪胎儿原代成纤维细胞、大肠杆菌DH5α均来自东北农业大学胚胎工程实验室。反转录试剂盒、LA Taq酶、SYBR荧光实时定量PCR试剂盒、T4连接酶、PMD-18T载体、3’RACE试剂盒、质粒大提试剂盒均购自Takara试剂公司；胶回收试剂盒购自Axygen公司；质粒小量试剂盒购自天根生物有限公司、DNA marker购自Trans gene公司；胎牛血清、DMEM培养基、非必需氨基酸、谷氨酰胺、Lipofectamin LTX and plus均购自Gibico公司；DNA测序由上海立菲生物技术有限公司完成。
SEQ ID NO.1：gcagtagtggcaagctcttgtgtgtgctgtccacaagagcttgccactactgc
SEQ ID NO.2：ggtttctggagatggagatgcgtgtgctgtccgcatctccatctccagaaacc
实施例1：
猪IRS基因的克隆及在各组织中的表达
（1）猪IRS1基因的克隆
根据已知得到的猪IRS1基因序列，设计4对引物(表1)，利用重叠PCR方法，克隆猪的IRS1全长基因。其中第1,2,4对引物为外显子区域，并且不跨内含子，直接以巴马猪的基因组为模板进行PCR扩增，第3对引物位于内含子区域，以巴马猪肝脏cDNA为模板进行PCR扩增，总体系为50ul。PCR反应体系包括：LA Taq 1ul，10×LA Taq Buffer 5ul，dNTPs 4ul，模板1ul，Forward Primer 2ul，Reverse Primer 2ul，dH2O 35ul。PCR反应参数为：94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸2min,35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳中观察结果，将目的条带胶回收，连接PMD-18T克隆载体进行测序。
测序分别得到4段无突变序列之后，各自从质粒上PCR扩增下来，并进行胶回收，为了防止发生非特异性扩增，将胶回收片段进行末端补平，PCR总反应体系25ul，包括：BluntingEnzyme Mix 1ul，Quick Blunting Kit Buffer 2.5ul，dNTPs 2.5ul，胶回收片段10ul，dH2O 9ul。PCR反应程序为：25℃ 1h，16℃ 30min。得到了4段目的片段，分别为IRS1-1，IRS1-2，IRS1-3，IRS1-4，作为重叠PCR的模板。首先将IRS1-1与IRS1-2重叠，PCR总反应体系50ul，反应体系包括：IRS1-1 10ul,IRS1-2 10ul,引物4ul(IRS1-F1 2ul，IRS1-R2 2ul)，LA Taq 1ul，10×LATaq Buffer 5ul，dNTPs 4ul，dH2O 16ul；将IRS1-3与IRS1-4重叠，PCR总反应体系50ul，反应体系包括：IRS1-3 10ul,IRS1-4 10ul,引物4ul(IRS1-F3 2ul,IRS1-R4 2ul)，LA Taq 1ul，10×LATaq Buffer 5ul，dNTPs 4ul，dH2O 16ul。PCR反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火40s,72℃延伸3min,40个循环；72℃终延伸10min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳中观察结果，将目的条带胶回收，连接PMD-18T克隆载体进行测序，得到无突变的IRS1-12与IRS1-34片段，从质粒扩增下来之后，进行末端补平，补平实验体系如上，最终以IRS1-12与IRS1-34为模板，重叠PCR得到猪IRS1基因全长。PCR总反应体系为50ul，包括：IRS1-12 10ul，IRS1-34 10ul，引物4ul(IRS1-F1 2ul，IRS1-R4 2ul)，LA Taq 1ul，10×LA Taq Buffer 5ul，dNTPs4ul，dH2O 16ul。PCR反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,62℃退火40s,72℃延伸3min30s,40个循环；72℃终延伸10min。
结果显示，通过重叠PCR的方法，分4段扩增猪IRS1基因得到IRS1的全长基因。经过测序分析，克隆的IRS1基因与已知序列的氨基酸序列相似性为100%。猪IRS1基因mRNA全长为4814bp，由两个外显子组成，第一外显子为3747bp，第二外显子为1068bp，CDS区序列为3726bp，3’-UTR序列为215bp(图1)，其中图1A为PCR扩增得到IRS1基因的四段片段，大小分别为1-2113bp,2-1612bp,3-593bp,4-1106bp，图1B为重叠PCR得到猪IRS1基因全长，大小为4814bp，图1C为猪IRS1基因结构图。
（2）IRS1基因在猪各组织器官中的表达
Real-time PCR方法检测巴马猪的15种组织器官中IRS1基因的表达。用Trizol试剂提取2d巴马猪的甲状腺、肺、肌肉、胎盘、肾上腺、胸腺、肝脏、气管、胰腺、垂体、大脑、海马体、舌、睾丸和十二指肠组织的RNA，并反转录为cDNA。Real-time PCR检测以上15种组织中IRS1基因的表达量。反应体系为20ul：Forward Primer 0.4ul，Reverse Primer 0.4ul，SYBR Mix 10ul，cDNA 1ul，dH2O 7.8ul。反应程序为：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。
结果表明，猪肝脏组织中IRS1的表达量显著高于其它组织(P<0.01)(图2A)。接下来，我们在猪肝脏细胞中筛选IRS1基因的干扰片段。Nr5a2基因为肝脏细胞的特异表达基因，经Real-time PCR检测，Nr5a2基因在我们获得的猪肝脏细胞中高表达(图2B)。将p-Genesil-shIRS1-1-4转染猪肝脏细胞，对照组不转染干扰载体，Real-time PCR检测干扰效率。实验结果表明，shIRS1-1显著敲低了IRS1基因的表达，干扰效率达到61%(图2C)。
（3）猪IRS2基因3’UTR区域的克隆
人的IRS2基因序列为已知的，将人IRS2基因与猪的基因组进行比对，根据保守区域序列设计引物，以2d巴马猪肝脏组织cDNA为模板，克隆得到猪IRS2基因的保守序列，PCR反应体系20ul：cDNA 0.5ul，引物2ul，rTaq 0.5ul，10×PCR Buffer 2.5ul，dNTPs 2ul，dH2O17.5ul。PCR反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，59.3℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳中观察结果，将目的条带胶回收，连接PMD-18T克隆载体进行测序。得到无突变序列进行3’RACE扩增，标准操作按照Takara公司试剂盒说明书进行。
结果显示，获得的片段为950bp，具有PolyA结构，位于猪11号染色体，不编码氨基酸，与人IRS2基因3’UTR序列的相似性达到了73.08%(图3A)。将p-Genesil-shIRS2-1-4转染猪肝脏细胞，Real-time PCR检测干扰效率。实验结果表明，shIRS2-1显著敲低了IRS2基因的表达，干扰效率达到60%(图3B)。
实施例2：
p-Genesil-shIRS1/shIRS2干扰载体的构建
根据克隆获得猪IRS1以及IRS2序列，通过Ambion网站分别设计4对干扰片段(表2)，分别合成带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点的单链shRNA干扰片段，复性成双链后，连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的p-Genesil 1.0载体。经过测序正确之后，构建成功的载体为p-Genesil-shIRS1-1-4和p-Genensil-shIRS2-1-4。
shIRS1-1和shIRS2-1分别为筛选出的有效干扰片段，重新合成带有Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的单链shIRS2干扰片段，复性成双链后，连接到筛选出有效的经过Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ线性化的p-Genesil-shIRS1载体。之后PCR扩增hU6启动子，带有SnaB Ⅰ与Nhe Ⅰ酶切位点，连入有两个基因干扰片段的线性化载体，经过测序鉴定以后，序列正确的载体即为p-Genesil-shIRS1/shIRS2干扰载体。
实施例3：
猪肝原代细胞的培养及干扰载体效果的检测
（1）猪肝原代细胞的培养
取1d巴马猪肝脏组织约0.5cm3放置含有双抗的生理盐水中，对组织进行清洗，剥离肝脏表面系膜，剔除血液等杂物，清洗至肝脏组织呈鲜红色，洗液无明显杂物。将组织移置培养皿之后，用手术剪将其剪碎。添加1ml胶原酶放入37℃培养箱内进行消化5min。加入培养液进行终止。将组织吹散，将此混合物添加到离心管中进行离心，1200rpm，3min。离心后弃上清，加入3ml培养液重悬。接种到三个大皿中移置到37℃培养箱中培养。隔天观察细胞有组织块贴壁，换成新鲜的培养液。4-5天后在组织块周围有细胞长出待密度达到60%以上进行传代标记为P1代，将P1代培养至密度达到100%时，进行冻存。
（2）干扰载体对猪干细胞糖脂代谢的影响
根据NCBI网站上提供的基因序列，设计猪PEPCK，G6Pase，F-1,6-BP，Gck，SREBP，Fasn，LXRA，Abcg8和Cyp7a1基因的Real-time PCR引物,每个基因设计2对引物，经过RT-PCR方法验证特异性后，通过Real-time PCR检测猪肝脏细胞在分别转染p-Genesil-shIRS1、p-Genesil-shIRS2以及p-Genesil-shIRS1/shIRS干扰载体之后，上述基因表达量的变化情况。Real-time PCR反应体系为20ul：Forward Primer 0.4ul，Reverse Primer 0.4ul，SYBR Mix 10ul，cDNA 1ul，dH2O 7.8ul。反应程序为：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。Real-time PCR反应仪器的型号为ABI 7500。
将p-Genesil-shIRS1/shIRS2转染猪肝脏细胞，Real-time PCR验证IRS1基因的表达下降了78%，IRS2基因的表达下降了64%(图4)。采用Real-time PCR检测了糖代谢相关基因的表达变化。结果表明，磷酸烯醇丙酮酸激酶(PEPCK),果糖-1,6-二磷酸酶(F-1,6-BP)是糖异生作用的两种关键酶，不适当的激活这些酶表达会使糖异生作用增强，从而增加了血浆中葡萄糖含量。在同时干扰IRS1和IRS2基因时，猪肝脏细胞中PEPCK与F-1,6-BP基因的表达分别为对照组的2.46倍与2.96倍。而单独干扰时，这两种基因的表达没有显著变化(图5A.B)。
葡糖激酶(Gck)是催化肝脏中糖酵解的第一步反应的关键酶，多存在于动物肝脏中。若基因表达被抑制，会影响糖酵解作用降低，血浆中葡萄糖含量会升高。本实验在猪肝脏细胞中单独敲低IRS1基因时，Gck表达下降了79%，单独干扰IRS2基因之后，该基因表达无明显差异，但同时敲低IRS1和IRS2时，Gck基因表达下降了36%(图5C)。
胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1)为胆固醇敏感器，可调节胆固醇代谢以及血浆中胆固醇水平。在同时敲低IRS1和IRS2基因的猪肝脏细胞中，检测胆固醇代谢关键基因的表达效果，结果表明：SREBP-1基因表达升高，可直接反映胆固醇水平升高。单独在猪肝脏细胞中敲低IRS1或IRS2时，该基因表达无明显变化，同时敲低这两个基因时，SREBP-1基因表达显著上升，为对照组3.0倍(图6A)。胰岛素还可以通过激活肝脏X受体(LXRA)来调节脂类代谢。只有当单独敲低IRS2基因时，LXRA基因的表达会显著上升，为对照组的1.6倍(图6B)。LXRA下游与之相结合的一系列调节胆固醇代谢的基因，包括Abcg8以及CYP7a1。实验结果表明，在单独敲低IRS2基因以及同时敲低IRS1和IRS2基因时，Abcg8基因的表达均显著上升，为对照组的4.6和4.8倍，CYP7a1基因的表达也显著上升，为对照组的6.0和8.3倍(图6C)。以上结果表明，敲低IRS1和IRS2基因，会引起猪肝脏细胞胆固醇代谢的异常。
表1 引物序列及扩增片段长度
表2 猪IRS1以及IRS2基因的干扰片段序列
Claims (7)
1.一种抑制IRS1基因表达的shRNA，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的shRNA用于制备抑制猪源IRS1基因的制品。
3.一种含有权利要求1所述的shRNA的干扰载体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列两端加入BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，得到干扰片段；
（2）将步骤（1）获得的干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的质粒载体上，获得干扰载体。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列两端加入BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，得到shRNA干扰片段；
（2）将步骤（1）中获得的干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的p-Genesil 1.0质粒载体上，获得干扰载体p-Genesil-shIRS1。
5.一种含有权利要求1所述的shRNA的干扰载体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）分别在SEQ ID NO.1和SE Q ID NO.2所示的核苷酸序列两端加入BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，获得干扰片段；
（2）分别将步骤（1）中获得的干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的质粒载体上，获得重组质粒；
（3）合成带有Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的单链shIRS2干扰片段，连接到经过Nhe Ⅰ和XhoⅠ线性化的shIRS1载体，获得同时具有IRS1和IRS2基因的线性化载体；
（4）扩增具有SnaB Ⅰ与Nhe Ⅰ酶切位点的hU6启动子，并将其连接到步骤（3）中获得的线性化载体，得到shRNA干扰载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）分别在SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列两端加入BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，获得干扰片段；
（2）分别将步骤（1）中获得的干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的p-Genesil 1.0质粒载体上，获得重组质粒p-Genesil-shIRS1和p-Genesil-shIRS2；
（3）合成带有Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的单链shIRS2干扰片段，连接到经过Nhe Ⅰ和XhoⅠ线性化的p-Genesil-shIRS1载体，获得同时具有IRS1和IRS2基因的线性化载体；
（4）扩增具有SnaB Ⅰ与Nhe Ⅰ酶切位点的hU6启动子，并将其连接到步骤（3）中获得的线性化载体，得到p-Genesil-shIRS1/shIRS2干扰载体。
7.权利要求3制备的shRNA干扰载体用于制备猪2型糖尿病模型的制品。
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| US20100316639A1 (en) * | 2009-06-16 | 2010-12-16 | Genentech, Inc. | Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy |
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2013
- 2013-11-13 CN CN201310562508.6A patent/CN103589730B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100316639A1 (en) * | 2009-06-16 | 2010-12-16 | Genentech, Inc. | Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy |
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| CN103589730B (zh) | 2015-10-21 |
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