CN103602682B - 一种抑制IRS2基因表达的shRNA及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制IRS2基因表达的shRNA及应用，属于基因工程技术领域。本发明提供的shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1。本发明还提供了一种抑制IRS2基因表达的shRNA干扰载体。根据克隆经对比分析后的猪源IRS2基因保守序列，合成带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点干扰片段，并将干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的质粒载体上，经筛选后获得有效干扰载体。本发明提供的shRNA及其干扰载体，能够有效抑制IRS2基因的表达，影响细胞的糖脂代谢，为2型糖尿病模型猪的构建奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种抑制IRS2基因表达的shRNA及应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，它能够抑制正常生物体内特定基因的表达。外源dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）的反义链和多种核苷酸酶作用后会形成具有结合和切割mRNA作用的沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC），从而最终介导RNA干扰过程。与耗时较长的基因敲除技术相比，RNAi可在较短时间内可控性地关闭多达10个基因。藉此灵活快速的特点，RNAi技术已经成为研究基因功能的重要工具，并在遗传性疾病、病毒病和肿瘤病的致病机理和治疗方面发挥重要作用。
2型糖尿病(type2diabetes mellitus,T2DM)是一种复杂的代谢紊乱疾病，其发病率正随着人口老龄化，而逐年升高。2型糖尿病主要的发病机制为外周胰岛素抵抗与胰腺β细胞功能发生障碍，而这主要是有遗传缺陷引起的。胰岛素受体底物(insulin receptor substrates,IRSs)蛋白处于胰岛素信号通路的枢纽位置，通过自身磷酸化作用招募并结合下游的许多信号转导分子，将胰岛素信号传递、发散到下级网络，在维持细胞正常的生理功能上起到重要的作用，IRS1和IRS2基因的缺陷是2型糖尿病发病的主要诱因。原因在于IRS1和IRS2功能的缺失会引起机体生长发育缓慢，以及对胰岛素敏感性的降低和β细胞分泌功能障碍。
在目前以小鼠为主利用转基因技术产生的2型糖尿病模型中，基本上都是具有胰岛素抵抗以及β细胞失活的特征。敲除IRS1基因的小鼠表现出生长发育缓慢以及一定的胰岛素抵抗现象，敲除IRS2基因的小鼠在出生后直接表现为胰高血糖症以及β细胞分泌功能障碍，导致生成2型糖尿病，而同时敲除IRS1和IRS2基因的小鼠出生前就会死亡。但是，小鼠模型还是具有很多局限性，小鼠在遗传水平与表型上不能很好地模拟人类疾病，而且小鼠寿命较短，不能作为长期患病的研究目标。作为糖尿病的动物模型，小鼠对于葡糖以及胆固醇食物的反应与人类也存在较大差异。
猪和人在解剖学、生理学以及代谢特点方面均有很大的相似性，包括心脏血管的功能与结构，脂蛋白的分布，体型，发胖的趋势以及杂食的习惯等。这使得猪作为研究2型糖尿病的模式动物具有很多优点。譬如，患有2型糖尿病的猪会伴随着动脉粥样硬化，发病的解剖学位置与人类相同，而且与人类相应疾病的组织病理学特征是相似的。由于患有2型糖尿病的猪所表现出来的代谢异常与人类更加接近，因此建立有价值并且稳定的2型糖尿病猪模型是非常必要的。
发明内容
本发明提供一种抑制猪IRS2基因表达的shRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，主要在抑制猪源IRS2基因表达制品中应用。。
本发明还提供了一种shRNA干扰载体的制备方法，步骤如下：
（1）在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列两端加入合成带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，获得干扰片段；
（2）将步骤（1）中获得的干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的质粒载体上，获得干扰载体。
具体步骤如下：
（1）在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列两端加入合成带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，获得shRNA干扰片段；
（2）将步骤（1）中获得的干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的p-Genesil 1.0质粒载体上，获得干扰载体p-Genesil-shIRS2。
本发明提供的shRNA干扰载体的制备方法在抑制IRS2基因表达制品中的应用。
具体而言，对比人的IRS2基因序列和猪的基因组，根据保守区域序列设计引物，克隆猪IRS2的保守序列。
根据克隆获得猪IRS2序列，通过Ambion网站分别设计4对干扰片段，分别合成带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点的单链shRNA干扰片段，复性成双链后，连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的p-Genesil 1.0载体。构建并筛选的有效干扰片段为shIRS2。
本发明的优点在于，干扰载体p-Genesil-shIRS2具有非常明显地敲低猪源IRS2基因表达的作用，对于构建2型糖尿病猪模型具有重要作用。因shRNA片段在体内一段时间会被降解，本发明研究成果对血糖浓度较低者采用RNA干扰技术提高血糖浓度具有借鉴意义。
附图说明
图1：猪与人IRS2基因3’UTR序列比对结果及有效干扰片段的筛选。
具体实施方式
以下结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特别说明，均为购自常规生化试剂商店。
实验所用的巴马仔猪均来自东北农业大学实验基地猪场，实验所用的菌株质粒包括干扰载体pGenesil1.0(Shen,Y.M.,X.C.Yang,et al.(2010)."Growth inhibition induced by shorthairpin RNA to silence survivin gene in human pancreatic cancer cells."Hepatobiliary Pancreat DisInt9(1):69-77.)、猪胎儿原代成纤维细胞、大肠杆菌DH5α均来自东北农业大学胚胎工程实验室。反转录试剂盒、LA Taq酶、SYBR荧光实时定量PCR试剂盒、T4连接酶、PMD-18T载体、3’RACE试剂盒、质粒大提试剂盒均购自Takara试剂公司；胶回收试剂盒购自Axygen公司；质粒小量试剂盒购自天根生物有限公司、DNA marker购自Trans gene公司；胎牛血清、DMEM培养基、非必需氨基酸、谷氨酰胺、Lipofectamin LTX and plus均购自Gibico公司；DNA测序由上海立菲生物技术有限公司完成。
SEQ ID NO.1：ggtttctggagatggagatgcgtgtgctgtccgcatctccatctccagaaacc
实施例1：
猪IRS2基因的克隆及筛选
（1）猪IRS2基因3’UTR区域的克隆
人的IRS2基因序列为已知的，将人IRS2基因与猪的基因组进行比对，根据保守区域序列设计引物，以2d巴马猪肝脏组织cDNA为模板，克隆得到猪IRS2基因的保守序列，PCR反应体系20ul：cDNA 0.5ul，引物2ul，rTaq 0.5ul，10×PCR Buffer 2.5ul，dNTPs 2ul，dH2O17.5ul。PCR反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，59.3℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳中观察结果，将目的条带胶回收，连接PMD-18T克隆载体进行测序。得到无突变序列进行3’RACE扩增，标准操作按照Takara公司试剂盒说明书进行。
结果显示，获得的片段为950bp，具有PolyA结构，位于猪11号染色体，不编码氨基酸，与人IRS2基因3’UTR序列的相似性达到了73.08%(图1A)。将p-Genesil-shIRS2-1-4转染猪肝脏细胞，Real-time PCR检测干扰效率。实验结果表明，shIRS2-1显著敲低了IRS2基因的表达，干扰效率达到60%(图1B)。
实施例2：
p-Genesil-shIRS2干扰载体的构建
根据克隆获得猪IRS2序列，通过Ambion网站分别设计4对干扰片段(表1)，分别合成带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的单链shRNA干扰片段，复性成双链后，连接到经过BamHⅠ和HindⅢ线性化的p-Genesil1.0载体。经过测序正确之后，构建成功的载体为p-Genensil-shIRS2-1-4。筛选出的有效干扰载体为p-Genensil-shIRS2-1。
表1猪IRS2基因的干扰片段序列
Claims (3)
1.一种抑制IRS2基因表达的shRNA，其特征在于，能够敲低猪源IRS2基因的表达，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种含有权利要求1所述的shRNA干扰载体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列两端加入BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，得到干扰片段；
(2)将步骤(1)中获得的干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的质粒载体上，获得干扰载体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列两端加入BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，得到shRNA干扰片段；
(2)将步骤(1)中获得的干扰片段连接到经过BamH Ⅰ和HindⅢ线性化的p-Genesil 1.0质粒载体上，获得干扰载体p-Genesil-shIRS2。
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