CN101736003A - 日本血吸虫miRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明关于日本血吸虫miRNA。本发明首次从血吸虫中分离获得一类新的miRNA,这些miRNA在血吸虫生活史中的表达具期特异性特点。血吸虫感染阶段的尾蚴转染修饰的miRNA的反义寡核苷酸,能影响其后续的发育。本发明人提供鉴定到的日本血吸虫miRNA及其前体序列、调节所述miRNA表达的反义寡核苷酸等在血吸虫防治中的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物医学和寄生虫领域;更具体地,本发明涉及分离自血吸虫的miRNA、其前体及反义寡核苷酸,以及它们在制备抑制血吸虫的组合物中的用途。
背景技术
微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一类真核生物高度保守的内源性小调节RNA,长度约18~26个核苷酸,通过与靶mRNA特异性碱基配对引起靶mRNA降解或翻译抑制,调控基因转录后表达。它来源于长度约为1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA),Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60~80nt的具有茎环结构的miRNA前体(Pre-miRNA)。Pre-miRNA转运至胞质后,被Dicer酶进一步切割成长约22nt的双链miRNA。双链miRNA解开后,成熟的miRNA进入RNA诱导基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),与互补mRNA完全或不完全配对,降解靶mRNA或阻遏其表达。miRNA具有广泛的基因调节功能,能对基因活动(生长、分化、凋亡及应激反应等)的各个层面进行调节,参与了生命过程中的一系列重要进程,包括早期胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢以及干细胞维持和分化等。
目前,虽然已经发现了大量的miRNA,但严重危害人类健康的血吸虫病的病原体——血吸虫的miRNA尚属空白。因此本领域需要鉴定出与日本血吸虫生长发育或致病相关的miRNA,从而为日本血吸虫病的防治和药物的研制提供新的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供分离自血吸虫的miRNA、其前体及反义寡核苷酸,以及它们在制备抑制血吸虫的组合物中的用途。
本发明的目的还在于提供用于调节(下调或上调)血吸虫miRNA表达或数量的方法,从而发挥调节血吸虫生长、发育等作用;以及提供一种新的抑制血吸虫生长发育的方法。
在本发明的第一方面,提供一种分离的miRNA,所述的miRNA选自:
(i)序列如SEQ ID NO:n所示的miRNA,其中n为选自1-5的正整数;或
(ii)与SEQ ID NO:n所示序列互补的miRNA。
在另一优选例中,所述的miRNA分离自血吸虫。
在另一优选例中,所述的血吸虫是日本血吸虫(Schistosoma japonicum)。
在本发明的第二方面,提供一种分离的前体miRNA,所述的前体miRNA选自:
(A)序列如SEQ ID NO:(n+5)所示的前体miRNA,所述的前体miRNA可在血吸虫细胞内被剪切且表达成如SEQ ID NO:n所示的miRNA,其中n为选自1-5的正整数;或
(B)与SEQ ID NO:(n+5)所示序列互补的前体miRNA。
在本发明的第三方面,提供所述的miRNA的反义寡核苷酸,所述的反义寡核苷酸选自:
(a)序列如SEQ ID NO:(n+10)所示的寡核苷酸,其中n为选自1-5的正整数;或
(b)与SEQ ID NO:(n+10)所示序列互补的寡核苷酸。
在另一优选例中,所述的寡核苷酸是核酸锁(LNA)修饰的寡核苷酸.
在另一优选例中,所述的寡核苷酸是硫代修饰磷酸二酯键骨架的寡核苷酸;或者所述的寡核苷酸是2’-核糖甲乙氧基、甲氧基、甲基或氟嘧啶修饰的寡核苷酸。
在另一优选例中,所述的反义寡核苷酸是DNA或与所述序列相应的RNA。
在本发明的第四方面,提供一种分离的多核苷酸,所述的多核苷酸能被血吸虫细胞转录成前体miRNA,所述的前体miRNA能在血吸虫细胞内被剪切且表达成如SEQ ID NO:n所示的miRNA,其中n为选自1-5的正整数。
在另一优选例中,所述的多核苷酸含有式I所示的结构:
Seq正向-X-Seq反向 式I,
式I中,
Seq正向为能在血吸虫细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列,
Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列;
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列,并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补,
式I所示的结构在转入血吸虫细胞后,形成式II所示的二级结构:
式II中,Seq正向、Seq反向和X的定义如上述,
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
在本发明的第五方面,提供所述的反义寡核苷酸的用途,用于制备抑制血吸虫生长发育(或杀血吸虫)的组合物。
在本发明的第六方面,提供一种抑制血吸虫生长发育(或杀血吸虫)的组合物,所述的组合物含有有效量的所述的反义寡核苷酸;以及药学上可接受的载体。
在本发明的第七方面,提供一种抑制血吸虫生长发育(或杀血吸虫)的方法(优选非治疗性的方法),所述的方法包括:给予血吸虫或感染血吸虫的宿主有效量的所述的反义寡核苷酸。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1.日本血吸虫和曼氏血吸虫miRNA茎环二级结构。
图2.Northern blot检测五种日本血吸虫miRNA。
图3.日本血吸虫三种miRNA茎环RT real time PCR融解曲线(B)和扩增产物8%PAGE电泳分析(A)。
图4.茎环RT-PCR检测血吸虫miRNA特异性分析。
图4A中,泳道1为以小鼠血细胞RNA为模板获得的扩增产物的电泳结果;泳道2为以兔血细胞RNA为模板获得的扩增产物的电泳结果;泳道3为以日本血吸虫成虫RNA为模板获得的扩增产物的电泳结果。
图4B中,泳道1为5μg总RNA;泳道2为从5μg总RNA中分离低分子量(LMW)RNA;泳道3为采用15%变性PAGE从5μg总RNA中分离的miRNAs前体(60-100nt);泳道4为采用15%变性PAGE从5μg总RNA中分离的成熟miRNAs(约22nt)。
图5.日本血吸虫三种新miRNA在其生活史6个阶段表达分析。
图6.反义寡核苷酸(ASO)转染肝期童虫后三种miRNA表达变化;图示结果为三次独立试验的平均结果。
具体实施方式
miRNA能够特异性结合到mRNA的相应部位,影响相应的mRNA的转录或翻译,从而影响相应的基因的表达。本发明人经过长期而广泛的研究,首次从血吸虫中分离获得一类新的miRNA。不同生活史表达分析表明,血吸虫miRNA在血吸虫生长发育不同阶段存在期表达特异性,提示可对血吸虫生长、发育产生影响。此外,本发明人还设计了针对所述miRNA的反义寡核苷酸等,用于在细胞内调节(如下调或上调)miRNA的表达或数量,以发挥调节血吸虫生长、发育等作用。
miRNA及其前体
本发明提供了一类从血吸虫中发现的miRNA。如本文所用,所述的“miRNA”是指一种RNA分子,从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt),也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
血吸虫来源的miRNA可被从血吸虫细胞中分离。如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
血吸虫miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA,Pre-miRNA)加工而来,所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构,所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。因此,本发明的另一方面关于可在血吸虫细胞中被加工产生miRNA的前体miRNA。并且,所述的前体miRNA也是可从血吸虫中被分离的。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构,茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
前体miRNA可被血吸虫细胞剪切生成miRNA,所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用,“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的,可以以一种可预见的方式发生相互作用,如形成二级结构(如茎环结构)。通常,两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的;优选的,至少有80%的核苷酸是互补的;更优选的,至少有90%的核苷酸是互补的;进一步优选的,至少有95%的核苷酸是互补的;如98%、99%或100%。一般地,两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸;优选的,具有最多30个不匹配的核苷酸;更优选的,具有最多20个不匹配的核苷酸;进一步优选的,具有最多10个不匹配的核苷酸,如具有0、1、2、3、4、5、8、9个不匹配的核苷酸。
如本文所用,“茎环”结构也被称作“发夹”结构,是指一种核苷酸分子,其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构,所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成,两个区域分列双链部分的两侧;其还包括至少一个“环”结构,包括非互补的核苷酸分子,即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的,核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如,插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构,然而,该两个区域仍可基本上互补,并在可预见的方式中发生相互作用,形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的,通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后,本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明以血吸虫成虫为材料进行miRNA克隆分析。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离回收日本血吸虫18~26nt大小RNA,两端分别连接接头进行RT-PCR,构建日本血吸虫成虫小RNA的cDNA文库。挑取阳性克隆进行测序分析,将获得的18~26nt的RNA序列检索日本及曼氏血吸虫数据库去除mRNA、rRNA和tRNA降解产物后,针对候选miRNA编码区域,以Mfold程序分析包括候选序列两端约80bp的侧翼序列,分析其是否可形成pre-miRNA结构,并进一步通过Nothern blot杂交验证。结果发现了一类新的miRNA,其前体序列均可以形成miRNA前体的典型茎环结构,符合miRNA的结构特征。对这些miRNA的研究发现,它们在血吸虫不同生活阶段(虫卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴、肝期童虫及成虫等)具有不同程度的表达。
本发明所述的miRNA具有如SEQ ID NO:n所示的序列,其中n为选自1-5的正整数(也即n选自1,2,3,4或5)。较优选的,所述的miRNA是具有如SEQ ID NO:2所示的序列的miRNA。在下调了SEQ ID NO:2所示的序列miRNA的表达后,可以明显地减少血吸虫的产生和抑制生长发育,因此可见该miRNA具有促进血吸虫生长发育的作用,可基于此开发抑制血吸虫生长发育的药物。
为了提高miRNA的稳定性或其它性质,还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基,如“TT”等。
本发明所述的前体miRNA具有如SEQ ID NO:(n+5)所示的序列,其中n为选自1-5的正整数(也即n选自1,2,3,4或5)。较优选的,所述的前体miRNA是具有如SEQ ID NO:7所示的序列的前体miRNA。
反义寡核苷酸
根据所述的血吸虫miRNA序列,本发明人还设计出了它们的反义寡核苷酸,所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的miRNA的表达。如本文所用,“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides,AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”,是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。
本发明所述的反义寡核苷酸具有如SEQ ID NO:(n+10)所示的序列,其中n为选自1-5的正整数(也即n选自1,2,3,4或5)。较优选的,所述的反义寡核苷酸具有如SEQ ID NO:11-13所示的序列(分别对应于SEQ ID NO:1-3所示序列的miRNA);更优选的,所述的反义寡核苷酸具有如SEQ ID NO:12所示的序列(分别对应于SEQ ID NO:2所示序列的miRNA)。
在本发明中,所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸,所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性,更佳地,所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleic acid,LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2’氧原子和4’碳原子连接起来的修饰技术。LNA能延长miRNA的血清半衰期,提高对靶标亲和性,减少脱靶作用的范围和程度。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性,抗核酸酶降解等方面大有改善,且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种,包括硫代法,例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代,可抵抗核酸酶降解。应理解,任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。
作为本发明的优选方式,对反义寡核苷酸进行核酸锁修饰;更佳地还进行硫代修饰。
将本发明所述的反义寡核苷酸转移到血吸虫体内后,它们能够明显下调相关miRNA的表达。该结果说明所述的血吸虫miRNA分子在日本血吸虫的生长和发育中具有重要的生物学功能。
本发明还提供了所述的反义寡核苷酸的用途,用于制备抑制血吸虫生长发育(或杀血吸虫)的组合物。
本发明还提供了一种药物组合物,所述的药物组合物含有有效量的所述的反义寡核苷酸,以及药学上可接受的载体。所述的组合物可抑制血吸虫生长发育或杀死血吸虫。
所述“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即有合理的效益/风险比的物质。所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体:它们本身并不是必要的活性成分,且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体,如水、盐水、甘油和乙醇。
本发明的反义寡核苷酸的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:反义寡核苷酸的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常,当本发明的反义核苷酸每天以约0.001-100mg/kg(优选的为0.01-20mg/kg)动物体重的剂量给予时,能得到令人满意的效果。
本发明还提供了一种抑制血吸虫生长发育或杀血吸虫的方法,所述的方法优选是非治疗性的,所述的方法包括:给予血吸虫或感染血吸虫的宿主有效量的所述的反义寡核苷酸。所述的血吸虫的宿主例如是非人哺乳动物或人。
多核苷酸构建物
此外,根据本发明所提供的血吸虫miRNA序列,可设计出在被导入血吸虫中后可被血吸虫加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物,也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此,本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物),所述的多核苷酸(构建物)可被血吸虫细胞转录成前体miRNA,所述的前体miRNA可被血吸虫细胞剪切且表达成所述的miRNA。
作为本发明的一种优选方式,所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构:
Seq正向-X-Seq反向 式I,
式I中,
Seq正向为可在血吸虫细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列,Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列;或者,Seq反向为可在血吸虫细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列,Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列:
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列,并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补;
式I所示的结构在转入血吸虫细胞后,形成式II所示的二级结构:
式II中,Seq正向、Seq反向和X的定义如上述;
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
本发明还提供一种抑制目的基因表达的方法,所述的方法包括步骤:
(1)提供一种分离的多核苷酸,所述的多核苷酸可被血吸虫细胞转录成前体miRNA,所述的前体miRNA可被血吸虫细胞剪切且加工成能够与该目的基因对应的mRNA的至少一部分序列互补的miRNA;
(2)将(1)中所述的多核苷酸导入到血吸虫细胞中,从而抑制所述目的基因的功能。
将所述的多核苷酸构建物导入到血吸虫中,该多核苷酸构建物在体内被转录成前体miRNA,之后所述的前体miRNA被加工成miRNA,所述的miRNA可与相应的mRNA的部分序列相互补,从而抑制该mRNA相应的目的基因的表达。
通常,所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此,本发明还包括一种载体,它含有所述的miRNA,或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
芯片
此外,利用本发明所述的miRNA序列,还可以点制miRNA芯片研究其表达谱以及miRNAs的调节方式,具有很高的应用价值。通过利用所述的miRNA制备的miRNA芯片,可分析miRNA基因的表达模式,可了解血吸虫中相应的基因对血吸虫生长发育不同周期的调节情况;可设计相应的策略,调节和修饰靶基因,调节血吸虫的生长发育。因此本发明还提供一种用于分析miRNA表达谱的芯片,所述的miRNA芯片包括:
固相载体;以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:5所示的序列。较佳的,所述的寡核苷酸探针具有SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:15所述的序列。所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料,例如但不限于尼龙膜,经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如,如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片,探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串,可将寡核苷酸探针配制成溶液,然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上,排列成预定的序列或阵列,然后通过放置过夜来固定,就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰,则其制备方法也可参照:王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》;J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science,1997;278:680和马立人,蒋中华主编.生物芯片.北京:化学工业出版社,2000,1-130。
本发明的主要优点在于:
(1)从血吸虫这一重要病原体中分离获得一类新的miRNA,这些miRNA与调节血吸虫生长发育相关。
(2)针对所述新的miRNA,获得了一类反义寡核苷酸,具有良好的下调所述miRNA的作用,且部分反义寡核苷酸具有非常显著的减虫作用。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室指南(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1.日本血吸虫小RNA的分离纯化
日本血吸虫尾蚴经贴片感染实验动物(新西兰大白兔或昆明鼠),42天后剖杀动物,获取成虫。
血吸虫成虫标本液氮研磨至粉末状,用Trizol(Invitrogen)提取总RNA。用DEPC处理水将无降解的总RNA调整浓度到1mg/ml,加入终浓度为0.5M的NaCl和5%PEG8000,混匀,室温沉淀10min,12000rpm,4℃,15min,取上清,加入2.5倍体积的无水乙醇,混匀,-20℃沉淀2h以上。然后13000rpm,4℃,30min。弃去上清,沉淀室温干燥5min。加入适量DEPC处理水或者甲酰胺溶解RNA,测定浓度,用于18~26nt小RNA分离。
实施例2.构建小RNA的cDNA文库
用15%尿素变性PAGE胶回收18~26nt的小RNA,分别用T4 RNA连接酶(MBI)加3’-接头5’-p acuGTAGGCACCATCAA(SEQ ID NO:16)p-3’和5’-接头5’-ATCGTaggcaccugaaa-3’(SEQ ID NO:17)(其中,小写为RNA,大写为DNA,p指磷酸基团),然后用RT引物(5’-ATTGATGGTGCCTAC-3’(SEQ IDNO:18))逆转录加接头的小RNA,获得cDNA。根据RT引物及RNA接头设计PCR引物(5’引物:5’-ATCGTAGGCACCTGAAA-3’(SEQ ID NO:19),3’引物:5’-ATTGATGGTGCCTACAG-3’(SEQ ID NO:20))。以所得cDNA为模板进行PCR扩增,PCR产物经BshN I(MBI)酶切,将酶切产物自身连接,再补平,连接T载体pMD18-T质粒(Takara),PCR筛选阳性克隆,测序。
实施例3.血吸虫小RNA文库生物信息学分析
将测序获得的序列去除载体及两端接头序列,获得小RNA序列。选择18~26nt长度序列进一步分析。将获得的序列比对(BLAST)日本血吸虫(S.japonicum)转录组数据库(http://www.ncbi.nih.gov/Genbank/index.html),及尚未完成拼接的基因组数据库(http://lifecenter.sgst.cn/sj.do)。曼氏血吸虫基因组数据库(S.mansoni)(http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_mansoni)也用于辅助解析克隆获得的序列。若与报道的序列存在3个或3个以上碱基差异将不进一步分析。在排除rRNA,tRNA及mRNA序列之后,剩余的小RNA序列进一步二级结构预测。从基因组选择包括候选序列2端约100bp的侧翼序列,应用RNA二级结构预测软件Mfold(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold)分析形成稳定茎环结构可能。
miRNA确定标准和鉴定方法:miRNA区别于其他内源性小RNA的一个重要特征是其前体能形成典型的茎环结构。传统上以表达特征和生物起源作为判定miRNA标准。(1)表达标准:①在RNA标本中检测到长度约22nt的RNA转录产物,通常以Northern blotting检测;②在构建的小RNA cDNA文库中存在与该物种基因组严格匹配的长度约22nt的序列。(2)生物起源标准:①以最低自由能规则(如mfold软件)能预测到包含约22nt序列的茎环前体结构(pre-miRNA),不存在内环或膨出,特别是大的不对称膨出。动物的茎环前体长度通常60~80nt。②miRNA及其预测的发夹结构前体物种间保守;③下调Dicer酶能检测到pre-miRNA积聚。理想的miRNA需满足上述所有标准,但实际上,往往以表达长度约22nt且存在典型茎环结构的小非编码RNA定义为miRNA。
通过以上分析,共获得五种日本血吸虫成虫新的miRNA序列如下(分别命名为sj-miR-1至sj-miR-5):
1)sj-miR-1 5’GGAGGUAGUUCGUUGUGUGGU(SEQ ID NO:1);
2)sj-miR-2 5’UGAAAGACGAUGGUAGUGAGA(SEQ ID NO:2);
3)sj-miR-3 5’UGAGAUCGCGAUUAAAGCUGGU(SEQ ID NO:3);
4)sj-miR-4 5’UCCCUGAGACCCUUUGAUUGUC(SEQ ID NO:4);
5)sj-miR-5 5’UCCCUGAGACUGAUAAUUGCUC(SEQ ID NO:5)。
及其前体RNA序列如下:
sj-miR-1前体:
5’UGGGAGGUAGUUCGUUGUGUGGUUUGCUUAUUAAAAUGAUCUUAAGAAGACCAUACAACCGACUGGCUUUCCCA(SEQ ID NO:6);
sj-miR-2前体:
5’GUGAUACUAGUGCUGUGAAAGACGAUGGUAGUGAGAUGCCAGUUGCAUCUCGCUUCCCCGCCUUUCCCGGUAAGAAUCAC(SEQ ID NO:7);
sj-miR-3前体:
5’AAGUCGGCUUUUAUUGCGCUCUGAGAAAAACCAAUUCAUUGCUUUUUUUUAUUUAUCUGAGAUCGCGAUUAAAGCUGGUUU(SEQ ID NO:8);
sj-miR-4前体:
5’GCUCCCUGAGACCCUUUGAUUGUCUCGUUAAACAUAAUUCUAUAUGUUAAAUGUAAUCAGGCAGCCAAAGUGACUCAGGUGUGC(SEQ ID NO:9);
sj-miR-5前体:
5’AUCCCUGAGACUGAUAAUUGCUCUAGUUAUUAUAUCAUUAAUGAGUUUACAAUAAGGGCAAUUAUUAUUCUCAGGUGU(SEQ ID NO:10)。
经鉴定,五种日本血吸虫成虫新的miRNA前体均可以形成典型的发夹结构。另外,分析表明,这些miRNA序列在曼氏血吸虫中也是保守的。包括miRNA序列的约70nt的曼氏血吸虫序列也能形成典型的miRNA前体二级结构,见图1。
实施例4.Nothern blot检测miRNA
根据上述候选的miRNA序列,合成5’端生物素标记的miRNA反义寡核苷酸探针。本实施例用到的Northern探针序列分别为(其中,b表示生物素化的(biotinylated)):
对应sj-miR-1的探针:5’-b ACCACACAACGAACTACCTCC(SEQ lD NO:11)-3’;
对应sj-miR-2的探针:5’-b TCTCACTACCATCGTCTTTCA(SEQ ID NO:12)-3’;
对应sj-miR-3的探针:5’-b ACCAGCTTTAATCGCGATCTCA(SEQ ID NO:13)-3’;
对应sj-miR-4的探针:5’-b GACAATCAAAGGGTCTCAGGGA(SEQ ID NO:14)-3’;
对应sj-miR-5的探针:5’-b GAGCAATTATCAGTCTCAGGGA(SEQ ID NO:15)-3’。
按照常规Northern blot方法检测sj-miR-1至sj-miR-5在日本血吸虫成虫中的表达。其结果如图2,其中泳道1-5分别代表sj-miR-1至sj-miR-5的检测结果。可见sj-miR-1、sj-miR-2和sj-miR-3具备miRNA典型特征(检测到约22nt的成熟的miRNA及70nt的前体);sj-miR-4和sj-miR-5仅检测到约22nt的成熟的miRNA。
实施例5.日本血吸虫miRNA茎环RT-Real Time PCR分析方法建立
血吸虫总RNA经特异茎环RT引物逆转录后,再利用特异的前向引物和通用的反向引物进行扩增。伴随着扩增的过程,SYBR Green染料掺入到双链的DNA分子中,产生荧光。扩增的循环数与样品的模板量成反比。机器检测PCR扩增到达检测阈值的循环数。表1为本部分研究相关的RT及随后定量分析的real time PCR引物序列。通用反向引物与茎环RT引物的环状部分匹配。按照常规的real time定量PCR进行。以α-微管蛋白作为内参照,8%PAGE电泳分析real time PCR产物。
表1日本血吸虫miRNA茎环RT real time PCR检测相关引物序列
其结果如图3和图4。如图3所示,日本血吸虫miRNA茎环RT-PCR后在8%PAGE上显示为分子量约67bp的扩增条带(A),real time RT-PCR融解曲线(dissociation curves)显示为狭窄尖锐的单一峰(B)。如图4A所示,以宿主(小鼠及兔子)血细胞抽提的RNA为模板,无扩增条带(图4A泳道1、2),由此说明建立的茎环RT-PCR能特异的扩增相应的miRNA,不受宿主miRNA的影响。为分析建立的基于茎环RT-PCR是否能区分成熟的miRNA或是miRNA前体,本发明人使用5μg总RNA,并从同样量总RNA分离低分子量LMW RNA(小于200nt)、利用15%尿素变性PAGE分离60~100nt的miRNA前体部分,以及22nt左右的成熟miRNA部分,进行茎环RT-PCR分析。如图4B所示,不管循环数是25还是30,总RNA和LMW RNA的条带亮度几乎一致。30个循环后,miRNA前体部分才可见到微弱条带,25个循环未见扩增。上述的结果表明,本发明人建立的方法是特异针对成熟的miRNA分析方法,不受pre-miRNA影响。这些数据说明茎环RT real time PCR高度敏感特异的检测到目的miRNA。
实施例6.茎环RT-real time PCR分析三种miRNA在日本血吸虫不同发育阶段表达
采用实施例5建立的茎环RT-real time PCR对血吸虫发育不同阶段的三种miRNA表达水平进行分析。以日本血吸虫α-微管蛋白为内参,分析前述鉴定的sj-miR-1、sj-miR-2和sj-miR-3分别在虫卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴、肝期童虫及成虫等血吸虫6个生活史阶段的表达。
结果如图5所示,在上述三个miRNA中,sj-miR-2在各阶段中表达丰度最高,其次是sj-miR-3,sj-miR-1表达丰度最低。就sj-miR-1不同生活史表达而言,虫卵和毛蚴阶段表达最低,胞蚴时表达快速升高,尾蚴阶段表达达高峰。当尾蚴进入宿主后,该miRNA表达略有下降。sj-miR-2和sj-miR-3在尾蚴阶段表达水平最高,肝期童虫阶段相对低表达,其它生活史阶段维持在相对中等的恒定水平。
实施例7.miRNA反义寡核苷酸(ASO)对日本血吸虫生长发育的影响
(1)化学修饰的miRNA反义寡核苷酸(ASO)的合成
为探讨鉴定到的血吸虫miRNA功能,本发明人合成化学修饰的miRNAASO,转染血吸虫,分析其对血吸虫生长发育变化。本发明人设计了核酸锁(LNA)修饰的miRNA ASO。其中sj-miR-1至sj-miR-5的反义寡核苷酸如下:
1)sj-miR-1反义寡核苷酸5’ACCACACAACGAACTACCTCC 3’(SEQ IDNO:11);
2)sj-miR-2反义寡核苷酸5’TCTCACTACCATCGTCTTTCA 3’(SEQ ID NO:12);
3)sj-miR-3反义寡核苷酸5’ACCAGCTTTAATCGCGATCTCA 3’(SEQ IDNO:13);
4)sj-miR-4反义寡核苷酸5’GACAATCAAAGGGTCTCAGGGA 3’(SEQ IDNO:14);
5)sj-miR-5反义寡核苷酸5’GAGCAATTATCAGTCTCAGGGA 3’(SEQ IDNO:15)。
上述反义寡核苷酸与对应的成熟miRNA完全配对,每隔3个碱基以LNA修饰。由于LNA和DNA/RNA化学结构完全一致,可用氨基磷酸法在DNA自动合成仪上合成,通过高效液相色谱(HPLC)纯化获得。LNA-ASO-sj-miR-1至LNA-ASO-sj-miR-5(统称为miRNA ASO)序列分别为:
LNA-ASO-sj-miR-1,5’-accAcamCaamCgaActAccTcc-3’;
LNA-ASO-sj-miR-2,5’-tctmCacTacmCatmCgtmCttTca-3’;
LNA-ASO-sj-miR-3,5’-acmCagmCttTaaTcgmCgaTctmCa-3’。
同时本发明人设计了与LNA-ASO-sj-miR-2序列三个碱基突变(mutation)的对照LNA-ASO-sj-miR-2-3M,其序列为5’-tctmCacTacAatActmCttTca-3’。大写为LNA,小写为DNA,mC为甲基化胞嘧啶。为增加合成的miRNA ASO稳定性,可进一步硫代修饰(PS)磷酸二酯键骨架。
硫代修饰方法:寡核苷酸合成时,每合成一个磷酸二酯键即用硫化剂四乙基秋蓝姆(tetraethylthiorame)等进行硫化。一般情况下,硫代修饰寡核苷酸序列两端的各一个碱基,必要时全部碱基给予硫代修饰。
(2)化学修饰的miRNA ASO转染效应分析
a)肝期童虫电转染
尾蚴感染小鼠约14天后,将小鼠脱臼处死,以灭菌的生理盐水灌注法取肝期童虫。以RPMI1640无血清培养基洗涤2次后,取约100条童虫至200μl含终浓度为2uM miRNA ASO的RPMI1640无血清培养基,并转移至4mm电极杯中。采用Bio-Rad的Genepluser Xcell电转仪,按以下条件进行电转化:125V电压矩形波,20ms,电击一次。电转结束后,将血吸虫童虫转移到6孔板,补充培养液至2ml,其中含青链霉素双抗及10%胎牛血清,并补加miRNA ASO至终浓度为2uM,连续培养3天。培养结束后,吸弃培养液,用生理盐水洗涤童吸虫3次,然后加入Trizol,收集RNA。然后以茎环real-time PCR分析miRNA表达丰度变化。
结果如图6所示,化学修饰的ASO转染对血吸虫对应靶miRNA表达具明显抑制效应。与对照组比较,LNA-ASO-sj-miR-1转染后使得sj-miR-1靶下调表达18.9倍(P=0.014),LNA-ASO-sj-miR-2转染后使sj-miR-2下调表达2.8倍(P=0.028),LNA-ASO-sj-miR-3转染后使sj-miR-3下调表达12.6倍(P=0.041),而这些ASO的转染基本不影响其他miRNA的表达。另外,与LNA-ASO-sj-miR-2存在三个碱基突变的LNA-ASO-sj-miR-2-3M比较,LNA-ASO-sj-miR-2干扰效应是LNA-ASO-sj-miR-2-3M的1.5倍(P=0.084),这种趋势说明miRNA ASO的干扰效应是序列特异性的。同时也提示,中间区域3个碱基突变的ASO可能尚不能完全消除与靶miRNA结合的能力。
b)尾蚴浸泡转染
上述的结果表明,miRNA ASO转染血吸虫后能下调其对应miRNA的表达。血吸虫不同发育阶段miRNA表达分析表明,本发明人检测的三条miRNA除sj-miR-1外,sj-miR-2和sj-miR-3在尾蚴阶段特异高表达。为此,将三条LNA修饰的miRNA ASO以通用的浸泡方式转染尾蚴,若具有推测的干扰效应,则血吸虫的生长发育应受到影响,比较分析这些干预组成虫数量及病变严重程度,即可初步了解这些miRNA对血吸虫生长发育的影响。
新释放的尾蚴分别浸泡于含2uM LNA修饰的sj-miR-1、sj-miR-2、sj-miR-2-3M及sj-miR-3 ASO的去氯水,作用4hr后,分别取30条尾蚴感染BALB/c小鼠,10只/组。于感染42天后,肝门静脉灌注法冲虫,收获成虫并计数。计算实验组减虫率。计算公式为:减虫率(%)=[(对照组回收虫体平均数-干预组回收虫体平均数)/对照组回收虫体平均数]×100%。
实验结果表明,sj-miR-2 ASO干预组具显著的减虫效果,减虫率为29%-40%。这一结果表明,该miRNA与日本血吸虫生长发育相关。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>同济大学
<120>日本血吸虫miRNA及其应用
<130>087221
<160>29
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>21
<212>RNA
<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400>1
ggagguaguu cguugugugg u 21
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400>2
ugaaagacga ugguagugag a 21
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<211>22
<212>RNA
<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400>3
ugagaucgcg auuaaagcug gu 22
<210>4
<211>22
<212>RNA
<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400>4
ucccugagac ccuuugauug uc 22
<210>5
<211>22
<212>RNA
<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400>5
ucccugagac ugauaauugc uc 22
<210>6
<211>74
<212>RNA
<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400>6
ugggagguag uucguugugu gguuugcuua uuaaaaugau cuuaagaaga ccauacaacc 60
gacuggcuuu ccca 74
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<212>RNA
<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400>7
gugauacuag ugcugugaaa gacgauggua gugagaugcc aguugcaucu cgcuuccccg 60
ccuuucccgg uaagaaucac 80
<210>8
<211>81
<212>RNA
<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400>8
aagucggcuu uuauugcgcu cugagaaaaa ccaauucauu gcuuuuuuuu auuuaucuga 60
gaucgcgauu aaagcugguu u 81
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<212>RNA
<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400>9
gcucccugag acccuuugau ugucucguua aacauaauuc uauauguuaa auguaaucag 60
gcagccaaag ugacucaggu gugc 84
<210>10
<211>78
<212>RNA
<213>日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400>10
aucccugaga cugauaauug cucuaguuau uauaucauua augaguuuac aauaagggca 60
auuauuauuc ucaggugu 78
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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accacacaac gaactacctc c 21
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acugtaggca ccatcaa 17
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acactccagc tgggtgaaag acgatggt 28
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acactccagc tgggtgagat cgcgattaaa 30
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<400>28
gtacatgttg gtcaagctgg tgt 23
<210>29
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<212>DNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<223>寡核苷酸
<400>29
agttcgcact tcatccacta cagt 24
Claims (10)
1.一种分离的miRNA,其特征在于,所述的miRNA选自:
(i)序列如SEQ ID NO:n所示的miRNA,其中n为选自1-5的正整数;或
(ii)与SEQ ID NO:n所示序列互补的miRNA。
2.如权利要求1所述的miRNA,其特征在于,所述的miRNA分离自血吸虫。
3.一种分离的前体miRNA,其特征在于,所述的前体miRNA选自:
(A)序列如SEQ ID NO:(n+5)所示的前体miRNA,所述的前体miRNA可在血吸虫细胞内被剪切且表达成如SEQ ID NO:n所示的miRNA,其中n为选自1-5的正整数;或
(B)与SEQ ID NO:(n+5)所示序列互补的前体miRNA。
4.权利要求1所述的miRNA的反义寡核苷酸,所述的反义寡核苷酸选自:
(a)序列如SEQ ID NO:(n+10)所示的寡核苷酸,其中n为选白1-5的正整数;或
(b)与SEQ ID NO:(n+10)所示序列互补的寡核苷酸。
5.如权利要求4所述的反义寡核苷酸,其特征在于,所述的寡核苷酸是核酸锁修饰的寡核苷酸.
6.如权利要求4所述的反义寡核苷酸,其特征在于,所述的寡核苷酸是硫代修饰磷酸二酯键骨架的寡核苷酸;或者所述的寡核苷酸是2’-核糖甲乙氧基、甲氧基、甲基或氟嘧啶修饰的寡核苷酸。
7.一种分离的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸能被血吸虫细胞转录成前体miRNA,所述的前体miRNA能在血吸虫细胞内被剪切且表达成如SEQID NO:n所示的miRNA,其中n为选白1-5的正整数。
8.权利要求4-6任一所述的反义寡核苷酸的用途,用于制备抑制血吸虫生长发育的组合物。
9.一种抑制血吸虫生长发育的组合物,其特征在于,所述的组合物含有有效量的权利要求4所述的反义寡核苷酸;以及药学上可接受的载体。
10.一种抑制血吸虫生长发育的方法,其特征在于,所述的方法包括:给予血吸虫或感染血吸虫的宿主有效量的权利要求4所述的反义寡核苷酸。
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