CN101948834B - 用于治疗HBV的siRNA - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗HBV的siRNA，其序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ IDNO.2所示或如SEQ ID NO.3所示。可人工合成，也可通过体内转录合成。将本发明的siRNA转染HepG2.2.15细胞24h和48h后，发现均能够下调HBx基因的表达，细胞内以及上清中HBsAg和HBeAg的含量也明显下降，并且3p-siRNA的作用效果比化学合成的更加显著。可以作为抗HBV的药物应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于治疗HBV的siRNA，属基因工程领域。
背景技术
目前，全世界约有4.2亿HBV携带者，HBV感染是严重影响人类健康的疾病之一。慢性HBV感染与肝纤维化、肝癌的发生密切相关。但是，大部分的慢性HBV患者并没有在常规的治疗方式下获得预期的结果。尽管干扰素能够抑制HBV的复制，但是HBV能够通过抑制干扰素的分泌和功能，从而对抗机体的抗病毒机制，而最终导致机体处于免疫耐受状态。比如，在慢性感染的病人的外周血和肝浸润细胞中，调节性T细胞的比例有明显增加。另外，HBsAg，HBeAg以及其他的病毒因子能够直接抑制TLR介导的固有免疫应答。HBV聚合酶能够阻断RIG-I和TLR3介导的IFN-β分泌。
目前，RNAi技术已经广泛应用于抗HBV研究。无论是细胞水平，还是HBV动物模型，siRNA分子均取得明显的抗HBV效果。RNAi干扰药物必将成为今后研究的重点。
能否设计一种分子，既能特异性的沉默HBV相关基因，同时能够诱导IFN的产生，从而能够改善HBV导致的免疫耐受状态。HBx特异的3p-siRNA的出现，使得这样的假想成为可能，为HBV的治疗提供了很好的指导意义。
发明内容
针对上述现有技术，针对HBV治疗现状的不足，本发明提供了一种用于治疗HBV的siRNA。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于治疗HBV的siRNA，其序列如SEQ ID NO.1所示：
SEQ ID NO.1：GGUCUUACAUAAGAGGACU。
或：如SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.2：GGACGUCCUUUGUUUACGU。
或：如SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.3：CCGACCUUGAGGCAUACUU。
本发明的用于治疗HBV的siRNA，是通过以下方法制备得到的：
1.siRNA的设计
(1)首先分析所研究的HBV亚型为ayw型，其序列如SEQ ID NO.4所示。
(2)针对HBV x基因的序列，设计针对HBV x基因的特异性沉默RNA，用siRNA设计软件，设定相关参数包括siRNA的长度为19个碱基序列；GC比例在35-50之间。将潜在的序列利用BLAST进行基因数据库的比较，排除和其他编码序列同源的序列。
(3)化学合成siRNA由广州锐博公司直接合成，其靶点和3p-siRNA相同，序列见表1，以及序列表SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3。
表1化学合成siRNA序列
| Name | Type | Sequence 5′-＞3 |
| siRNA1-sense | RNA | GGUCUUACAUAAGAGGACUdTdT |
| siRNA1-sense | RNA | AGTCCTCTTATGTAAGACCdTdT |
| siRNA2-sense | RNA | GGACGUCCUUUGUUUACGU dTdT |
| siRNA2-ansense | RNA | ACGTAAACAAAGGACGTCC dTdT |
| siRNA3-sense | RNA | CCGACCUUGAGGCAUACUU dTdT |
| siRNA3-ansense | RNA | AAGUAUGCCUCAAGGUCGGdTdT |
(4)3p-siRNA合成所需的DNA模板设计：T7Promoter序列之前(5’端方向)多加6个碱基GATCAC。
2.3p-siRNA的制备过程
(1)合成附带T7promoter的HBx-siRNA序列相对应的单链DNA(由北京六合华大基因科技股份有限公司合成)序列见表2。
表2用于体外转录的DNA模板
| Name | Type | Sequence 5′-＞3 |
| siRNA-1GGGs-s | DNA | GATCACTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTACATAAGAGGACTTT |
| siRNA-1GGGs-a | DNA | AAAGTCCTCTTATGTAAGACCCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC |
| siRNA-1GGGa-a | DNA | AAGGTCTTACATAAGAGGACTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC |
| siRNA-1GGGa-s | DNA | GATCACTAATACGACTCACTATAGGGAGTCCTCTTATGTAAGACCTT |
| siRNA-2GGGs-s | DNA | GATCACTAATACGACTCACTATAGGGGGACGTCCTTTGTTTACGTTT |
| siRNA-2GGGs-a | DNA | AAACGTAAACAAAGGACGTCCCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC |
| siRNA-2GGGa-a | DNA | AAGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC |
| siRNA-2GGGa-s | DNA | GATCACTAATACGACTCACTATAGGGACGTAAACAAAGGACGTCCTT |
| siRNA-3GGGs-s | DNA | GATCACTAATACGACTCACTATAGGG CCGACCTTGAGGCATACTT TT |
| siRNA-3GGGs-a | DNA | AAAAGTATGCCTCAAGGTCGGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC |
| siRNA-3GGGa-a | DNA | AACCGACCTTGA GGCATACTTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC |
| siRNA-3GGGa-s | DNA | GATCACTAATACGACTCACTATAGGGAAGTATGCCTC AAGGTCGGTT |
(2)双链Oligo DNA的制备(体外转录试剂盒购自Takara公司)。
①将合成的单链Oligo DNA用DEPC处理水溶解，配制成100pmol/μl的DNA溶液。
②按下列组份配制Oligo DNA退火反应液，如表3所示；
表3
| 10×Annealing Buffer | 2μl |
| 100pmol/μl Oligo A* | 2μl |
| 100pmol/μl Oligo B* | 2μl |
| DEPC处理H2O | 14μl |
*A、B必须配对，具体配对情况如下：
Oligo-1和Oligo-2；Oligo-3和Oligo-4；
n-Oligo-1和n-Oligo-2；n-Oligo-3和n-Oligo-4。
将上述Oligo DNA退火反应液置于PCR扩增仪上，95℃处理2分钟后，经45分钟冷却至25℃，然后在25℃保持10分钟。此时一对单链Oligo DNA便经退火形成双链Oligo DNA，双链Oligo DNA的浓度为：10pmol/μl。进行体外转录实验时应将本溶液稀释(使用DEPC处理水)成4pmol/μl后使用。
(3)体外转录反应
①按下列组份配制RNA体外转录反应液，如表4所示：
表4
| 10×Transcription Buffer | 2μl |
| ATP Solution | 2μl |
| GTP Solution | 2μl |
| CTP Solution | 2μl |
| UTP Solution | 2μl |
| RNase Inhibitor | 0.5μl |
| T7RNA Polymerase | 2μl |
| RNase free ddH2O | 5.5μl |
| 4pmol/μl双链Oligo DNA溶液(Oligo-1/-2)* | 1μl |
| 4pmol/μl双链Oligo DNA溶液(Oligo-3/-4)* | 1μl |
| 合计 | 20μl |
②将上述溶液均匀混合后轻微离心，将转录反应液收集于反应管底部，42℃反应16小时。
(4)siRNA的纯化
①向上述反应液中加入水饱和的酸性苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，上下充分倒置混合后室温，10,000rpm，离心5分钟。
②将上层(水层)移至另一新的1.5ml离心管中，加入等量的5M的醋酸钠(pH5.6)和4倍量的99.5％的乙醇。
③室温静置5分钟后，4℃，12,000rpm离心10分钟。
④除去上清液后加入1ml 75％的乙醇，4℃，12,000rpm离心5分钟
⑤除去上清液，轻微干燥后加入50μl的DEPC处理水溶解沉淀。
⑥取1μl用DEPC水稀释10倍，其中2μl用于测定OD260nm值，剩余的8μl进行4％的琼脂糖凝胶电泳确认RNA纯度。
⑦根据测定的浓度，将上述溶液稀释为20pmol/μl溶液，进行RNA干扰实验。
(上述⑤中得到的沉淀，即是3p-siRNA，其序列见序列表SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3)
上述实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规实验方法，上述实验试剂均为市售产品。
本发明的发明人将上述取得的化学合成siRNA和体外转录的3p-siRNA(两者在序列上没有差异，唯一差别就是体外转录的在5’有三磷酸)转染HepG2.2.15细胞24h和48h后，发现均能够下调HBx基因的表达，细胞内以及上清中HBsAg和HBeAg的含量也明显下降，并且3p-siRNA的作用效果比化学合成的更加显著。
本发明的siRNA，尤其是体外转录的3p-siRNA，转染HepG2.2.15细胞后，发现能明显诱导RIG-I通路的激活，诱导干扰素和抗病毒蛋白的产生，使得其在抗HBV作用更加明显。可以作为抗HBV的药物应用。
附图说明
图1为体外转录3p-siRNA的电泳图。
图2为HBx-3p-siRNA在HepG2.2.15细胞中的沉默作用检测。
图3为3p-siRNA可以抑制细胞上清中的HBsAg的含量。
图4为3p-siRNA可以抑制细胞上清中的的HBeAg的含量。
图5为3p-siRNA可以抑制细胞内的HBsAg的表达，其中，A：siRNA1；B：siRNA2；C：siRNA3；D：3p-siRNA1；E：3p-siRNA2；F：3p-siRNA3；G：Scramble。
图6为3p-siRNA可以抑制细胞内的HBcAg的表达，其中，A：siRNA1；B：siRNA2；C：siRNA3；D：3p-siRNA1；E：3p-siRNA2；F：3p-siRNA3；G：Scramble。
图7为3p-siRNA能明显诱导干扰素产生，其中，A表明，相比于化学合成siRNA，3p-siRNA更加明显诱导IFN-αmRNA的产生；B图代表的是IFN-β在mRNA水平的表达；C图显示的是荧光素酶报告基因检测IFN-β的诱导。
图8为3p-siRNA能明显诱导抗病毒蛋白的产生，其中，A表明，3p-siRNA能诱导RIG-I的表达，同时能诱导抗病毒蛋白MxA和ISG15的表达；B图表明，3p-siRNA能激活MAPK信号通路；C图表明，3p-siRNA能激活NF-κB信号通路。
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售产品。
实施例
1、化学合成siRNA的合成：
针对HBV X基因设计siRNA：根据siRNA设计原则将三对siRNA交由广州锐博公司直接合成siRNA序列，见表1，及序列表SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3。
2、3p-siRNA的体外转录：
(1)靶点以及序列和化学合成siRNA完全一致。
(2)合成附带T7promoter的HBx-siRNA序列相对应的单链DNA，见表2。
(3)双链Oligo DNA的制备：将合成的单链Oligo DNA用DEPC处理水溶解，配制成100pmol/μl的DNA溶液。
①按表3所示组份配制Oligo DNA退火反应液。
②将上述Oligo DNA退火反应液置于PCR扩增仪上，95℃处理2分钟后，经45分钟冷却至25℃，然后在25℃保持10分钟。此时一对单链Oligo DNA便经退火形成双链Oligo DNA，双链Oligo DNA的浓度为：10pmol/μl。进行体外转录实验时应将本溶液稀释(使用DEPC处理水)成4pmol/μl后使用。
(4)体外转录反应
①按表4所示组份配制RNA体外转录反应液。
②将上述溶液均匀混合后轻微离心，将转录反应液收集于反应管底部，42℃反应16小时。
(5)siRNA的纯化
①向上述反应液中加入水饱和的酸性苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，上下充分倒置混合后室温，10,000rpm，离心5分钟。
②将上层(水层)移至另一新的1.5ml离心管中，加入等量的5M的醋酸钠(pH5.6)和4倍量的99.5％的乙醇。
③室温静置5分钟后，4℃，12,000rpm离心10分钟。
④除去上清液后加入1ml 75％的乙醇，4℃，12,000rpm离心5分钟。
⑤除去上清液，轻微干燥后加入50μl的DEPC处理水溶解沉淀。
⑥取1μl用DEPC水稀释10倍，其中2μl用于测定OD260nm值，剩余的8μl进行4％的琼脂糖凝胶电泳确认RNA纯度，如图1所示，从图1可以看出，3p-siRNA成功转录，片段大小为21bp。
⑦根据测定的浓度，将上述溶液稀释为20pmol/μl溶液，进行RNA干扰实验。
3、3p-siRNA可以抑制HBx的表达
以HepG2.2.15细胞作为研究对象，使用Lipofectamin 2000(购自invitrogen)进行化学合成siRNA和体外转录3p-siRNA的转染，转染24h后，提取细胞总RNA，用引物用5’端引物5’-CCGTCTGTGCCTTCTCATCTGC-3’和3’端引物5’-ACCAATTTATGCCTACAGCCTCC-3’进行定量PCR扩增HBV X基因。PCR反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，45循环。HBx的表达水平，GAPDH作为内参进行比较，如图2所示，图2中，横坐标分别代表siRNA、3p-siRNA不同的处理组，纵坐标代表HBx相对于内参基因GAPDH的表达。从图2可以看出，siRNA和3p-siRNA均能明显抑制HBV X基因的表达，并且3p-siRNA的抑制效果更加明显。
4、3p-siRNA可以抑制细胞上清中的HBV的复制
转染HepG2.2.15细胞后，转染3p-siRNA24h后，用定量PCR检测上清中的HBV DNA拷贝数。取细胞上清液，加入等体积的DNA浓缩液，充分混匀；煮沸10分钟，12,000rpm离心5分钟；上清液用于做PCR。HBV S的特异性引物是：上游5′ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT 3′，下游5′ACAGGGGGAAAGCCCTACGAA 3′；荧光探针是5′FAM-TGGCTAGTTTACAGTGCCATTTG TAMRA 3′，FAM荧光基团作为荧光报告TAMRA作为淬灭荧光，反应条件是93℃预变性2分钟；95℃变性30s，55℃退火45s，45循环。
5、3p-siRNA可以抑制细胞上清中的HBsAg的含量
以HepG2.2.15细胞作为研究对象，使用Lipofectamin 2000进行3p-siRNA的转染，转染48h后，收集细胞上清，用ELISA试剂盒检测上清中的HBsAg的含量，如图3所示，图3中，横坐标分别代表siRNA、3p-siRNA不同的处理组，纵坐标代表HBsAg的含量。从图3可以看出，siRNA和3p-siRNA均能明显抑制细胞上清中HBsAg的含量，并且3p-siRNA的抑制效果更加明显。
6、3p-siRNA可以抑制细胞上清中的的HBeAg的含量
以HepG2.2.15细胞作为研究对象，使用Lipofectamin 2000进行3p-siRNA的转染，转染48h后，收集细胞上清，用ELISA试剂盒检测上清中的HBsAg的含量，如图4所示，图4中，横坐标分别代表siRNA、3p-siRNA不同的处理组，纵坐标代表HBeAg的含量。从图4可以看出，siRNA和3p-siRNA均能明显抑制细胞上清中HBeAg的含量，并且3p-siRNA的抑制效果更加明显。
7、3p-siRNA可以抑制细胞内的HBsAg的表达
以HepG2.2.15细胞作为研究对象，使用Lipofectamin 2000进行3p-siRNA的转染，转染48h后，收集细胞上清，用免疫组化方法检测细胞内HBsAg的表达，如图5所示，从图5可以看出，siRNA和3p-siRNA均能明显抑制胞内HBsAg的表达，并且3p-siRNA的抑制效果更加明显。
8、3p-siRNA可以抑制细胞内的HBcAg的表达
以HepG2.2.15细胞作为研究对象，使用Lipofectamin 2000进行3p-siRNA的转染，转染48h后，收集细胞上清，用免疫组化方法检测细胞内HBsAg的表达，如图6所示，从图6可以看出，siRNA和3p-siRNA均能明显抑制胞内HBcAg的表达，并且3p-siRNA的抑制效果更加明显。
9、3p-siRN能明显诱导干扰素的产生
分析3p-siRNA能够明显抑制HBV的复制和表达。分析其机制，表明在3p-siRNA在发挥RNAi作用的同时，能够明显诱导干扰素和抗病毒蛋白的产生。以HepG2.2.15细胞作为研究对象，使用Lipofectamin 2000进行3p-siRNA的转染，转染24h后，用定量PCR法和荧光素报告基因的方法检测干扰素的诱导表达，如图7所示，其中，横坐标分别代表siRNA、3p-siRNA不同的处理组，A图纵坐标代表IFN-α相对于内参基因GAPDH的表达；B图纵坐标代表IFN-β相对于内参基因GAPDH的表达；C图纵坐标代表IFN-β的诱导倍数。从图7可以看出，siRNA和3p-siRNA均能引起干扰素的诱导表达，并且3p-siRNA的诱导效果更加明显。
10、3p-siRNA能明显抗病毒蛋白的产生
以HepG2.2.15细胞作为研究对象，使用Lipofectamin 2000进行3p-siRNA的转染，转染48h后，用Western blot方法检测抗病毒蛋白的诱导表达，如图8所示，从图8可以看出，3p-siRNA可以明显诱导抗病毒蛋白的表达，这种诱导作用和3p-siRNA诱导RIG-I并激活RIG-I下游的MAPK和NF-κB信号通路有关。
序列表.txt
SEQUENCE LISTING
<110>山东大学
<120>用于治疗HBV的体外转录3p-siRNA
<130>
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>3p-siRNA
<222>(1)…(19)
<400>1
ggucuuacau aagaggacu 19
<210>2
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>3p-siRNA
<222>(1)…(19)
<400>2
ggacguccuu uguuuacgu 19
<210>3
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>3p-siRNA
<222>(1)…(19)
<400>3
ccgaccuuga ggcauacuu 19
<210>4
<211>447
<212>DNA
<213>乙肝病毒
<400>4
atggctgcta ggctgtactg ccaactggat cctgcgcggg acgtcctttg tttacgtccc 60
gtcggcgctg aatcccgcgg acgacccttc tcggggtcgc ttggggctct atcgccccct 120
tctccgtctg ccgttccgac cgaccacggg gcgcacctct ctttacgcgg actccccgtc 180
tgtgccttct catctgccgg accgtgtgca cttcgcttca cctctgtacg tcgcatggaa 240
accaccgtga acgcccacca aatcttgccc aaggtcttat ataagaggac tcttggactc 300
tctgcaatgt caacgaccga ccttgaggca tacttcaaag actgtttgtt taaagactgg 360
gaggagttgg gggaggagac tagattacag ttgtttgtac taggaggctg taggcataaa 420
ttggtgtgcg caccagcacc atgcaac 447
Claims (1)
1.一种用于治疗HBV的siRNA，其特征在于：其序列如SEQ ID NO.1所示：SEQ ID NO.1：GGUCUUACAUAAGAGGACU。
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