CN1648250A - 乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供乙肝病毒(HBV)基因的小干扰核糖核酸(siRNA)序列及制备方法，SEQID NO.1－4为本发明提供的转录siRNA的2对针对HBV(ayw亚型)S基因的DNA模板序列，用体外转录方法合成针对HBV(ayw亚型)基因的特异siRNA，经转染细胞后，达到抑制HBV基因表达的目的。该方法可快速、经济、较大量地获得抗HBV的siRNA，为抗HBV的实验研究和临床应用提供技术和大量siRNA。

Description

乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术，涉及基因工程技术领域，具体地说涉及针对乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列及制备方法。

背景技术

(1)乙肝病毒(HBV)的治疗现状

慢性乙型肝炎是我国的高发疾病之一，是导致肝纤维化和肝癌的主要原因。目前治疗乙型肝炎的药物主要是以α干扰素为主的免疫调节剂和以拉米呋啶、阿德福韦为主的核苷类似物，但治疗效果仍不满意。HBV DNA的持续复制是导致乙型肝炎慢性化的主要原因。因此有效抑制HBV DNA复制，是治疗慢性乙型肝炎和控制HBV持续感染的关键。

(2)RNA干扰的现状

最近，RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术的出现，给抗病毒疾病的治疗注入了新的活力。几十年来，RNA被认为仅仅是从DNA获取遗传信息，并将信息传递给蛋白质。但最近研究发现，小片段RNA(small RNA)发挥着基因调控的作用，它能关闭基因的表达，或改变基因表达的水平[1]。现实验研究已经证实在哺乳动物细胞中，21-23个核苷酸长度的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，可有效降解特定的RNA，从而阻断蛋白质的表达[2，3]，这些特定长度的dsRNA被称为siRNA(small interfering RNAs)。进一步的机理研究发现，siRNA不仅能够在转录后水平沉默(transcriptionalgene silencing PTGS)特定基因的功能，还能在DNA和转录水平调节基因(transcriptional gene silencing，TGS)的表达[4]。现研究主要集中在转录后水平，siRNAs在细胞浆中形成后首先进入RISC复合体(RNA induced silencingcomplex)，在ATP和解旋酶等的作用下解旋成单链，反义链通过碱基互补方式结合到特定序列的RNA上，在RISC复合体的协助下切割特定RNA序列，从而降解RNA，使之无法翻译成蛋白质，造成该特定基因沉默(gene silencing)，失去功能[4]。同时，RNAi具有高度特异性，19对核苷酸的双链RNA(其3’端外挂2个脲嘧啶序列[5])几乎可以完全抑制基因的表达，而将其中的一个核苷酸突变掉后，它对基因的抑制作用就消失了，这对siRNA的应用是非常重要的，可以避免siRNA降解与靶mRNA同家族的其他的mRNA[5]。此外，已有研究发现，RNAi除了在转录后水平调节基因表达，而且能使同源DNA序列甲基化结构，因而在转录水平具有重要的调控作用，Mette等证实与NOSPro基因启动子区同源的23nt的dsRNA可直接引起目的基因的DNA序列的甲基化，导致转录失活[6]。

RNAi作为一种RNA基础上的细胞“免疫”系统，近来被应用于抗病毒感染和复制的研究中，并在HIV的体外实验中取得了较理想的结果，作用强度远远超过了反义核酸和核酶技术[7]。Rossi等将HIV-1编码rev的基因和与它同源的双链RNA共转染到293细胞中，rev基因的表达被显著抑制；同时将siRNA的抑制效应与反义RNA，核酶等进行了比较，发现只有siRNA组抑制了HIVrev-EGFP的表达，其抑制率达到90％，而反义RNA，核酶组与对照组无显著差异[7]，这一结果同样被Sharp等学者所证实[8]。在针对肝炎病毒基因的RNAi研究中，已有研究表明：针对HCV基因靶序列的siRNA能有效抑制HCV RNA的复制及病毒蛋白的表达[10]。由于RNA干扰采用的是双链RNA，它比较稳定，不易被降解，因此RNA干扰不仅在体外，而且在动物体内亦具有较好的效果。因此，RNAi现象的发现，被《SCIENCE》杂志和美国科学促进会评为2002年十大科学成就之一，具有广阔的应用前景。现今一致认为针对病毒基因的siRNA是最佳的治疗策略[9]。

(3)RNA干扰的5种方法

目前，用于RNA干扰的方法主要有5种：(1)化学合成法：直接通过化学方法合成dsRNA，其优点是快速、合成量较大，但是价格昂贵；(2)体外转录法：以Oligo DNA为模板，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成而言比较低，而且能够比化学合成法更快得到siRNAs。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，一般只需化学合成的siRNA量的1/10就可以达到同等的效果。但技术难度较大；(3)RNaseIII降解dsRNA法：将200～1000个碱基的靶mRNA用体外转录的方法制备后，然后用RNaseIII在体外消化，得到有多种siRNA的混合物，其优点是可以快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型，但是不适合长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗；(4)siRNA表达载体法：构建表达特异性siRNA的载体，导入真核细胞内表达siRNA，具有可以大量扩增的优点，但是存在基因整合的潜在危险；(5)siRNA表达框架(siRNA expressioncassettes)法：直接通过PCR方法得到表达siRNA的DNA模板，导入真核细胞后在体内转录成siRNA，其优点是方法简单、速度快，可用于筛选有效siRNA序列，但是也存在基因整合的潜在危险。

纵观上述5种方法的优缺点，和RNA干扰应用在慢性HBV感染的实验研究和临床应用中的前景，本发明选择体外转录法合成特定靶序列的dsRNA。

发明内容

本发明提供乙肝病毒(HBV)基因的小干扰核糖核酸(siRNA)序列及制备方法，SEQ ID NO.1-4为本发明提供的转录siRNA的2对针对HBV(ayw亚型)S基因的DNA模板序列，用体外转录方法合成针对HBV(ayw亚型)基因的特异siRNA，经转染细胞后，达到抑制HBV基因表达的目的。该方法可快速、经济、较大量地获得抗HBV的siRNA，为抗HBV的实验研究和临床应用提供技术和大量siRNA。

本发明提供转录siRNA的2对针对HBV(ayw亚型)S基因的DNA模板序列：

SEQ ID NO.1(Antisense anti-s siRNA1 Oligonucleotide template)

       5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGCCCTGTCTC-3’

SEQ ID NO.2(Sense anti-s siRNA1 Oligonucleotide template)

       5’-AAGCAATTTCCGTCCGAAGGTCCTGTCTC-3’

SEQ ID NO.3(Antisense anti-s siRNA2 Oligonucleotide template)

        5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTCCCTGTCTC-3’

SEQ ID NO.4(Sense anti-s siRNA2 Oligonucleotide template)

        5’-AAGAGTCTAGACTCTGCGGTACCTGTCTC-3’本发明的2对针对HBV(ayw亚型)S基因的DNA模板序列通过以下步骤实现：

(1)siRNA的设计

(2)特异性siRNA的转录模板的设计和合成

(3)退火

(4)补平

(5)转录

(6)模板降解

(7)过柱纯化

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步说明。

实施例一    体外转录合成干扰RNA体外抑制HBV表面抗原融合基因的表达

siRNA的制备

(1)siRNA的设计  根据siRNA的设计原理并利用直接合成siRNA的实验结果，选取针对HBV(ayw亚型)S基因的2条siRNA的目标cDNA靶序列。序列如下：

(anti-s siRNA1)5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGC-3’

(anti-s siRNA2)5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTC-3’

(2)特异性siRNA的转录模板的设计和合成根据上述的cDNA靶序列，设计并合成两段29-mer的DNA作为模板，包括8个与T7启动子引物3’端匹配的碱基(称为引导序列，leader sequence)和21个设计的siRNA序列。

①特异性anti-s siRNA1的反义链和正义链如下：

Antisense anti-s siRNA1 Oligonucleotide template

5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGCCCTGTCTC-3’

Sense anti-s siRNA1 Oligonucleotide template

5’-AAGCAATTTCCGTCCGAAGGTCCTGTCTC-3’

②特异性anti-s siRNA2的反义链和正义链如下：

Antisense anti-s siRNA2 Oligonucleotide template

5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTCCCTGTCTC-3’

Sense anti-s siRNA2 Oligonucleotide template

5’-AAGAGTCTAGACTCTGCGGTACCTGTCTC-3’

(3)退火将这两个模板和对应的T7启动子引物分别混合，引物末端和DNA模板退火结合。

2μl T7 promoter primer

6μl DNA Hyb buffer

2μl正义或反义的模板

70℃，5min→room temp，5min

(4)补平  用DNA聚合酶Klenow大片断补平成为双链DNA模板。

在上述反应管中加入：

2μl 10×Klenow Reaction buffer

2μl 10×dNTP Mix

4μl Nuclease-free water

2μl Exo-klenow

轻柔混匀，37℃，30min；

(5)转录  分别用T7 RNA聚合酶进行体外转录，将产物混合形成dsRNA，新的双链RNA包含5’端单链的引导序列和中间互补的19个碱基序列以及3’端两个重复的U(UU)。

每个转录反应管中加入：

2μl 正义或反义siRNA模板

4μl Nuclease-free water

10μl 2×NTP Mix

2μl 10×T7 Reaction buffer

2μl T7 Enzyme Mix

轻柔混匀，37℃，2hr；

正义和反义转录产物混合，置于37℃过夜

(6)模板降解  通过DNA酶降解模板，同时用单链专一的核酸酶消化5′的引导序列，由于RNase不能切开U碱基也不能切双链RNA，所以得到的产物就是我们需要的21-mer的双链siRNAs——有19个碱基互补，3′端各有2个U突出。

上述反应物中加入：

6μl Digestion buffer

48.5μl Nuclease-free water

3μl RNase

2.5μl DNase

混匀后，37℃，2hr；

(7)过柱纯化  通过试剂盒提供的纯化小柱，去除引物、碱基盐和蛋白质等杂质，得到的就是可以立即转化用的siRNAs，按说明书进行。

实施例2 anti-s siRNA抑制报告质粒pGFP-S和siRNA共转染HepG2细胞的绿荧光蛋白表达和HBV S基因表达的实验

(1)报告质粒pGFP-S和siRNA共转染HepG2细胞  报告质粒pGFP-S是表达报告基因绿荧光蛋白和HBsAg融合蛋白的质粒。HepG2细胞按照1×10⁵/孔接种24孔板，培养24小时后达到80％-90％融合率，共转染pGFP-S和siRNA，具体步骤参照Invitrogen公司Lipofectamine2000说明书。6小时后换10％FCS DMEM，同时设置只转染pGFP-S载体的阴性组，每组重复3孔。

(2)荧光显微镜观察细胞绿荧光蛋白表达  转染48小时后，在倒置荧光显微镜(DM IRB，Leica)下观察绿荧光蛋白在HepG2细胞中的表达情况。结果显示，与pGFP-S载体的阴性组相比，转染pGFP-S和anti-S siRNA的HepG2细胞的荧光强度减弱，荧光细胞数减少。

(3)流式细胞仪观察细胞绿荧光蛋白表达  转染48小时后，常规消化HepG2细胞，离心悬液，重悬于PBS，流式细胞仪检测表达荧光蛋白的阳性细胞数比例和平均荧光强度。结果显示，与pGFP-S载体的阴性组相比，转染pGFP-S和siRNA的HepG2的阳性细胞数比例降低，平均荧光强度降低。

(4)逆转录-实时荧光定量PCR法检测HBV S基因RNA的表达RNA准备：转染72小时后，收获HepG2细胞，Trizol法抽提RNA，方法参照Invitrogen公司说明书。逆转录，过程参照MBI操作说明书。荧光染料法定量PCR，上游引物：5′-CTCACAATACCGCAGAGTC-3′；下游引物：5′-TAAACTGAGCCAGGAGAAA-3′；内参照GAPDH，上游引物：5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，下游引物：5′-GCAACAATATCCACTTTACCAGAG-3＇.PCR条件为：95℃3min，再94℃30s，56℃ 30s，72℃ 45s，25个循环，荧光检测点选择72℃。同时做阳性对照(直接以pGFP-S质粒DNA为模板组)和阴性对照(不加模板组)。实时定量PCR在25循环定点检测显示，与阴性对照相比，anti-S siRNA1和anti-SsiRNA2对S基因的抑制率均达到50％以上。

实施例3 anti-s siRNA抑制对siRNA转染HepG2.2.15细胞的HBsAg和HbeAg表达的实验

(1)siRNA转染HepG2.2.15细胞HepG2.2.15细胞按照1×10⁴接种24孔板，培养24小时后达到30％-40％融合率，转染siRNA各0.84μg，具体步骤参见Invitrogen公司OLIGOFECTAMINE试剂说明书。设置无关对照siGFP组(FEBS Letters 543(2003)51-54)：sense RNA 5-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3，anti-sense RNA 5-UGCGCUCCUGGACGUAGCCTT-3。6小时后换10％FCS DMEM。每组设3个复孔。

(2)放射免疫法检测HBsAg和HBeAg浓度变化转染HepG2.2.15细胞后第48h，分别收集细胞培养液，离心去除细胞碎片，上清进行放射免疫法检测，检测方法参见试剂盒说明。转染anti-S siRNA1和anti-S siRNA2后，HepG2.2.15细胞上清中的HBsAg和HBeAg的浓度较HepG2.2.15细胞低，anti-SsiRNA1和anti-S siRNA2对HBsAg和HBeAg的抑制率均达到60％以上。

Claims (10)

1.乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列，其特征是：SEQ ID NO.1-4为转录siRNA的2对针对乙肝病毒基因的DNA模板序列：

SEQ ID NO.1  5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGCCCTGTCTC-3’

SEQ ID NO.2  5’-AAGCAATTTCCGTCCGAAGGTCCTGTCTC-3’

SEQ ID NO.3  5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTCCCTGTCTC-3’

SEQ ID NO.4  5’-AAGAGTCTAGACTCTGCGGTACCTGTCTC-3’。

2.根据权利要求1所述的乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列的制备方法，其特征是通过以下步骤实现：

(1)siRNA的设计，

(2)特异性siRNA的转录模板的设计和合成，

(3)退火，

(4)补平，

(5)转录，

(6)模板降解，

(7)过柱纯化。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(1)选取针对乙肝病毒ayw亚型S基因的2条siRNA的目标cDNA靶序列，序列如下：

5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGC-3’

5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTC-3’。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(2)设计并合成两段29-mer的DNA作为模板，包括8个与T7启动子引物3’端匹配的碱基和21个设计的siRNA序列。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(3)将这两个模板和对应的T7启动子引物分别混合，引物末端和DNA模板退火结合。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(4)用DNA聚合酶Klenow大片断补平成为双链DNA模板。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(5)分别用T7 RNA聚合酶进行体外转录，将产物混合形成dsRNA，新的双链RNA包含5’端单链的引导序列和中间互补的19个碱基序列以及3’端两个重复的U。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(6)通过DNA酶降解模板，同时用单链专一的核酸酶消化5′的引导序列，由于RNase不能切开U碱基也不能切双链RNA，所以得到的产物就是我们需要的21-mer的双链siRNAs——有19个碱基互补，3′端各有2个U突出。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(7)通过试剂盒提供的纯化小柱，去除引物、碱基盐和蛋白质等杂质，得到siRNAs。

10.根据权利要求1所述的乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列，在制备抑制乙肝病毒基因表达药物中的应用。