CN103205461B - 一种siRNA表达载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于构建siRNA表达载体的空载体及其重组载体和应用。该空载体从5’到3’依次包括：1）来源于CMV RNA聚合酶II依赖型启动子序列；2）pri-MiR21前部片段序列SEQ ID NO.1；3）限制性内切酶酶切位点序列；4）pri-MiR21后部片段序列SEQ ID NO.2；5）终止子序列。在限制性内切酶酶切位点插入序列siRNA正义序列-MiR21环结构序列-siRNA反义序列，即得siRNA重组表达载体。本发明采用RNA Pol II启动子，可方便有效地将shRNA连接到pri-MiR21骨架上，使shRNA经由RNAPol II启动子稳定表达，且表达高效，提高了RNAi的敲减效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种siRNA表达载体及其应用，特别的涉及一种用于构建siRNA表达载体的空载体及其重组载体和应用。
背景技术
由dsRNA剪切形成的siRNA。siRNA长21-25nt，3'端突出。siRNA的3`末端2-nt的突出对靶点识别的特异性起一定的作用，可将其限定在第一个碱基对相邻的不成对碱基的位置。随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默。近年来以数以千计的人类和老鼠基因为目标创建了RNAi库，在哺乳动物中利用小的干涉RNA和短发夹RNA（short hairpin RNAs，shRNA）来进行RNA干涉以使基因沉默已经成为强大而有力的生物工具，通过siRNA，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉默，可以迅速阻断基因活性。
经化学合成的siRNA被转染到细胞内，能发挥沉默基因的作用，但因其量少，只能在细胞内发挥短暂的效应，且由于其合成成本高，在一定程度上限制了其应用。现有的对于动物细胞的siRNA研究中，通过使用带有RNA PolIII启动子的质粒，对病毒进行钙转或包装成为慢病毒，对细胞进行转染，以达到RNAi的功能。但这种方法仍然有较大的缺陷，首先RNA Pol III启动子驱动能力较弱，仅能驱动约100bp大小的片段，同时对启动子下游的基因的表达效率不高。其次，对引入的shRNA的检测需共表达一个由RNA Pol III启动子驱动的报告基因，而该标记基因的表达并不总是与shRNA的表达相一致。另外，调控RNA Pol III启动子的表达比较困难。
2004年Daniel等（Daniel Boden,et al.，2004,Vol.32,No.3：1154~1158），使用pAAV-U6-MCS质粒进构建，克隆得到has-mir-30的前体71nt的片段，将MiR-30替换成tat-shRNA，使用RNA Pol III启动子，启动并成功表达了MiR-30骨架的tat基因siRNA。这一实验证明，shRNA导入至MicroRNA的骨架后，可以模拟MicroRNA，形成小片段的siRNA。但这种方法仍然未能摆脱使用RNA Pol III启动子，虽然可以证明micro RNA骨架可以用于shRNA的表达，但并没有解决质粒表达shRNA效率较低的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，现有的siRNA过表达技术，主要使用的是RNA模拟物以及RNA Pol III启动子所启动的shRNA质粒，前者不能对靶基因稳定敲减，后者则是存在表达量较弱的缺点。
本发明为解决上述技术问题的第一个技术方案是：一种用于构建siRNA表达载体的空载体，其序列从5’到3’依次包括以下序列：
1）来源于CMV RNA聚合酶II依赖型启动子序列；
2）pri-MiR21前部片段序列；
3）限制性内切酶酶切位点序列；
4）pri-MiR21后部片段序列；和
5）终止子序列。
其中，所述的RNA聚合酶II依赖型启动子是来源于CMV（即疱疹病毒亚β科）的启动子。
成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，初级转录物称为pri-miRNA。pri-miRNA长度从几百到几千个碱基不等，带有5‘帽子和3’polyA尾巴，以及1到数个发夹径环结构。pri-miRNA经剪切可产生约70个碱基的miRNA前体，即pre-miRNA。由于不存在内含子，所以pri-miRNA可以从基因组DNA中直接扩增得到。
本发明中，所述的pri-MiR21前部片段序列是指pri-MiR21cDNA从MiRNA21前体序列的5’前约200-300nt到3’开始的茎环结构中的第一个茎干的序列，不包括MiRNA及环。更佳的，所述的pri-MiR21前部片段序列是指从MiR21前体的前臂(即茎环结构中的第一个茎干的序列)及MiR21前体5’端前200nt-300nt的部分。所述的pri-MiR21前部片段序列可由人肝脏基因组DNA扩增获得。较佳的，所述pri-MiR21前部片段序列如SEQ IDNO.1所示。
所述的pri-MiR21后部片段序列是指pri-MiR21cDNA从5’端开始的茎环结构中的第二个茎干的序列到MiRNA前体的3’端后约200-300nt，不包括MiRNA*（与MiRNA互补的MiRNA）及环。更佳的，所述的pri-MiR21前部片段序列是指从MiR21前体的后臂(即茎环结构中的第二个茎干的序列)及MiR21前体3’端后200nt-300nt的部分。所述的pri-MiR21后部片段序列可由人肝脏基因组DNA扩增获得。较佳的，所述pri-MiR21后部片段序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明中所述的pri-MiR21前部片段或后部片段大小各控制在200-300bp，也能够实现发明目的。
所述的限制性内切酶酶切位点可以是常规的任何限制性内切酶可以识别并切割的位点，较佳的可以是Bsm AI、Bsm BI、Bsp CNI（非对称切割的内切酶）酶切位点，最佳的是Bsm BI酶切位点。优选的，该酶切位点由5’-3’反向顺序为，BsmBI反向序列，SalI，BsmBI正向序列。该酶切位点序列优选的如SEQ ID NO.3所示。
所述的终止子序列是来源于SV40PolyA(猴空泡病毒PolyA,简称PolyA)序列，序列是有转录终止作用和使转录的mRNA添加PolyA尾的DNA序列(240bp),含有AATAAA六核苷酸多腺苷化信号(Polyadenylation signal)。更优选的，所述终止子的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明所述空载体的骨架是常规的siRNA表达载体，可以是pCMV、pTR-UF5、pEGFP、pEXPR-IBA3等等。较佳的为pCDH系列质粒。
本发明为解决上述技术问题的第二个技术方案是：一种表达siRNA的重组载体，其序列从5’到3’依次包括以下序列：
1）来源于CMV RNA聚合酶II依赖型启动子序列；
2）pri-MiR21前部片段序列；
3）siRNA正义序列-MiR21环结构序列-siRNA反义序列；
4）pri-MiR21后部片段序列；和
5）终止子序列。
其中1）、2）、4）、5）如上文所述。
3）中表示的是插入上述空载体酶切位点的外源的表达siRNA的基因的序列。所述的siRNA的正义序列和反义序列是任何可以沉默目标基因的siRNA的正义序列以及相应的反义序列。可以是已知的各种基因的siRNA的序列，例如可以是Sigma公司的siRNA库中记载的各种基因的siRNA序列。siRNA也可自行设计，取所要敲减的基因的mRNA序列的某段（21-23nt）作为siRNA的正义序列，只要能够沉默该目标基因即可。
其中，所述siRNA正义序列是与将被沉默的基因转录的mRNA的21-23个核苷酸cDNA序列。
所述siRNA反义序列是与所述siRNA正义序列互补的DNA序列。
其中，较佳的，所述的MiR21环结构序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明载体的制备方法如常规，可以人工合成，也可以在现有的载体的基础上加工而成，比如将核酸片段通过限制性内切酶、DNA连接酶等合成。
本发明为解决上述技术问题的第三个技术方案是：所述的表达siRNA的重组载体在基因沉默中的用途。可用于基因治疗等领域。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：1）相对于原有的RNA模拟物转染，本发明可以实现更高效并且稳定的转染；2）相对于原有的RNA Pol III启动子启动的shRNA表达，本发明采用了RNA Pol II启动子，相对于原有的技术，本发明可完成更高效的siRNA的表达；3）本发明采用了pri-MiRNA21作为shRNA的骨架，可以避免可能产生大量siRNA互补序列所导致的竞争性抑制，在一定程度上提高RNAi的敲减效率。
本发明改造构建了一种具有RNA Pol II启动子及pri-MiR21作为骨架的新型质粒，可以方便有效地将shRNA无缝连接到pri-MiR21的骨架上，更高效地表达siRNA。在使用pri-MiR21骨架后，即可使得shRNA可以经由RNAPol II启动子进行稳定表达，且表达的效率要远高于采用RNA Pol III启动子所启动的shRNA质粒。
本发明改造了一种pCDH质粒，该质粒带有CMV（RNA Pol II型启动子），将pri-MiR21分为前后约200bp片段两片，使用带有酶切位点BsmBI及EcoRI、SalI、BamHI引物扩增pri-MiR21前部片段，连入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体，再使用带有SalI、BamHI引物扩增pri-MiR21后部片段，通过酶切连入pCDH-CMV-MCS-pri-MiR21前-EF1-copGFP质粒，完成质粒的改造。该质粒中不包括MiR21、MiR21*以及MiRNA的环结构（具体设计见图1）。
在前片及后片之间，设计了特有的酶切位点（BsmBI），该酶切位点可以切断酶切位点后1位及后5位的碱基，这样可以避免导入普通酶切位点而造成的碱基的偏移，可保证shRNA无缝连接入MiRNA21骨架之中（质粒图见图3）。
通过设计shRNA的Oligo（寡核苷酸），将退火后带有MiR21环的shRNA通过酶切连接，连入该质粒。通过质粒的转染或者包装病毒，即可过表达该目标基因的siRNA，起到高效并稳定的RNAi的效果。
附图说明
图1为质粒改造构建图。（A）为质粒pCDH-CMV-pri-MiR21-EF1-copGFP的细部结构，BsmBI的正向位点是酶切该酶切位点3’末端后第一位及其互补链第五位的碱基，BsmBI的反向位点是酶切该酶切位点5’末端前第五位及其互补链第一位的碱基。（B）为质粒pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli1-EF1-copGFP的细部结构，其中，shFli1的正反向链结构中加入的为MiR21的环结构序列。（C）本发明的siRNA表达载体。（D）Pri MiRNA21。
图2为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒图谱。
图3为pCDH-CMV-pri-MiR21-EF1-copGFP质粒图谱。
图4为pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli1-EF1-copGFP质粒图谱。
图5为pCDH-CMV-pri-MiR21-EF1-copGFP质粒构建流程图。
图6为293T空白细胞及293T细胞转染pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒后荧光照片。A,293T空白细胞，白光100×；B,293T转染质粒细胞，白光100×；C,293T空白细胞，荧光100×；D,293T转染质粒细胞，荧光100×。
图7为293T空白细胞及293T细胞转染pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒后对于Fli1的敲减效率。
图8为H1299细胞感染pCDH-CMV--pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒包装的慢病毒后荧光照片，其中H1299-CON为空白的H1299细胞，H1299-NC为感染阴性病毒的H1299细胞，H1299-VL为感染了pCDH-CMV--pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒包装的慢病毒后的H1299细胞。
图9为H1299细胞感染pCDH-CMV--pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒包装的慢病毒后对于Fli1基因的敲减效率，其中H1299-CON为空白的H1299细胞，H1299-NC为感染阴性病毒的H1299细胞，H1299-VL为感染了pCDH-CMV--pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒包装的慢病毒后的H1299细胞。
具体实施方式
本发明人发现，利用pri-miRNA作为骨架并使用RNA Pol II启动子，对siRNA进行表达，能够达到了高效表达miRNA的目的，并且使得同样使用RNA Pol II启动子的报告基因（GFP）能与siRNA的表达更为一致。
在miRNA骨架的选择上，本发明人还发现，将pri-MiR-21作为micro RNA骨架，具有预料不到的更好的效果。MiR30的转录本为5p MiRNA，即该MiRNA位于pre-MiRNA的5`末端，其表达的丰度与其互补的MiR30*表达差异并不是很大，使用MiRNA30作为骨架表达siRNA，siRNA的互补链也有一定的表达，siRNA的互补链作为siRNA的抑制剂对所产生的siRNA起到竞争性抑制的作用，大大降低作为实用的siRNA的表达所产生敲减的效率。而采用pri-MiR-21作为micro RNA骨架，作为一个位于5`末端的miRNA，其互补链MiR-21*的表达在深度测序后显示，要远小于MiR21的表达量，产生的影响也更小，其对基因的敲减效率更高。
本发明首先制备pri-MiR21前部片段（PCR扩增）、制备pri-MiR21后部片段（PCR扩增）。接着将pri-MiR21前部片段和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒（pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒，购自System Biosciences,SBI,公司，货号：CD511B-1）连接，获得质粒pCDH-CMV-MCS-pri-MiR21前-EF1-copGFP。然后将pri-MiR21后部片段连接入其中，得到质粒pCDH-CMV-MCS-pri-MiR21-EF1-copGFP，如图3。
本发明然后制备ShFli1退火片段（使用带有MiRNA环序列Oligo（寡核苷酸）005及Oligo（寡核苷酸）006进行退火）。接着连接ShFli1退火片段及质粒pCDH-CMV-MCS-pri-MiR21-EF1-copGFP，获得最终改造质粒pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP，如图4。
用该最终改造质粒转染293细胞。抽提转染质粒的293T细胞RNA，反转录为cDNA，通过实时定量PCR方法检测Fli1基因敲减效率。可见，转染最终改造质粒pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP后，293T细胞中Fli1基因的表达量有明显降低，降低了原水平的80%。
本发明还使用最终改造质粒pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP包装慢病毒，荧光拍照记录转染效率。感染后观察荧光，拍照几率荧光效率并推算病毒滴度约2×106左右。
本发明还使用pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP慢病毒感染H1299细胞，抽提感染病毒后H1299细胞的RNA，反转录为cDNA，通过实时定量PCR方法检测Fli1基因敲减效率。可见，经过pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP慢病毒感染，H1299细胞的Fli1基因明显下调，基因的表达量降低了原表达的90%以上。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
实验试剂及器材：
主要仪器为：5417R台式冷冻高速离心机，thermo公司，商品号cat#5417R；
PCR仪，cat#2500；
ThermoForma310系列直热式CO2培养箱，thermo公司，cat#3111；
酶标仪Biotek公司，VE-186；
qPCR仪，BioRad公司，CFX Connect，商品号：BR001139。
主要试剂为：反转录酶，Takara公司，商品号：cat#U1240；
E.coli Poly(A)聚合酶，NEB公司，商品号：#M0276S；
pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒(质粒图见图2)，购自SystemBiosciences(SBI)公司，货号：CD511B-1；
内切酶：EcoRI，NEB公司，cat#R0101V；SalI，NEB公司，cat#R0138V；BsmBI，NEB公司，cat#R0580L；BamHI，NEB公司，cat#0136V；
人肝脏抽提的基因组DNA，购自杭州赞道科技有限公司，BioDev货号ZD10-6404；
DH5α感受态细胞，购自北京艾比根生物技术有限公司，货号：C1041；
5×退火缓冲液，碧云天公司，商品号：D0251；
GXD kit iq SYBRBio-Rad公司，商品号：1708882AP。
293T细胞株，购自中科院细胞库，商品号：GNHu17；
H1299细胞株，购自中科院细胞库，商品号：TCHu160；
DMEM/高糖培养基购自Hyclone，货号：SH30243.01B
改良RPMI-1640培养基,购自Hyclone，货号：SH30809.01B；
FBS，胎牛血清，购自普飞生物，货号：1101-500；
SP(Penicillin-Streptomycin solution，青霉素/链霉素双抗)，购自Hyclone，货号：J121071；
试剂，购自Invitrogen公司，货号：15596-026；
荧光染料：IQTM Green Super Mix，购自BioRad公司，货号：170-8880AP；
无水乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司，货号：10009218；
异丙醇，购自国药集团化学试剂有限公司，货号：80109218；
氯仿，购自国药集团化学试剂有限公司，货号：10006818；
无水氯化钙，购自国药集团化学试剂有限公司，货号：SCRCCSDS100058；
HEPES，购自上海源聚生物科技有限公司，货号：No.7365-45-9；
NaCl，购自国药集团化学试剂有限公司，货号：10019318；
KCl，购自国药集团化学试剂有限公司，货号：10016318；
Na2HPO4，购自国药集团化学试剂有限公司，货号：20040617；
Dextrose(葡萄糖)，购自国药集团化学试剂有限公司，货号：K4913901
阴性慢病毒：pSCN-阴性满病毒颗粒，购自纽恩生物，货号：NED1120。
1.引物合成
引物001:CGGAATTCTGATTGAACTTGTTCATTTTGT。
引物002:
CGGGATCCCGCCCGTCGACCGTCTCCCCGACAAGGTGGTACA。
引物003:CCCGTCGACCGTCTCTCTGACATTTTGGTATCTTTCATC。
引物004:CGGGATCCAAGACTATCCCCATTTCTCCA。
引物005：
TCGGGGCTGTTGTCACACCTCAGTTACTGTTGAATCTCATGGTAACTGAGGTGTGACAACAGCT。
引物006：
TCAGAGCTGTTGTCACACCTCAGTTACCATGAGATTCAACAGTAACTGAGGTGTG ACAACAGCC。
引物007：GATGGCAAGGAACTGTGTA。
引物008：TGAGGTAACTGAGGTGTGA。
其中引物001/002用于扩增pri-Mirco RNA-21的前部片段，其中导入了EcoRI,BsmBI,SalI及BamHI酶切位点；引物003/004用于扩增priMircoRNA21的后部片段，其中导入了SalI,BsmBI及BamHI酶切位点；引物005/006为带有MiRNA环序列的shFli1退火用Oligo（寡核苷酸）序列；引物007/008为Fli1基因检测引物对。
2.对pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒进行改造
对pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒（见图2）进行酶切，并分别连入pri-MiR21的前部片段及后部片段，改造成为pCDH-CMV-pri-MiR21
-EF1-copGFP质粒，改造流程示意图见图5。
1）模板DNA为人肝脏基因组DNA（购自杭州赞道科技有限公司，货号ZD10-6404）。使用引物001及002扩增pri-MiR21前部片段，使用引物003及004扩增pri-MiR21后部片段，PCR反应体系如下：
PCR程序如下：
2）使用EcoRI及BamHI及双酶切pri-MiR21前部片段及
pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒，37℃酶切2小时，酶切体系如下：
3）使用连接酶，将两片段连接，4℃反应3小时，连接体系如下：
4）转化连接产物至大肠杆菌，步骤如下：
①大肠杆菌感受态DH5α，加入连接产物后冰浴30min，
②42℃热激90sec，
③加入无抗培养基，并37℃培养45min，
④1000rpm离心1min后涂amp（氨苄青霉素）抗性培养基，37℃培养16小时，
⑤扩大培养抽提质粒，获得质粒pCDH-CMV-MCS-pri-MiR21前-EF1-copGFP。
5）使用SalI及BamHI对得到的质粒pCDH-CMV-MCS-pri-MiR21前-EF1-copGFP与pri-MiR21后部片段，分别进行双酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下：
6）使用连接酶，将两片段连接，4℃反应3小时，连接体系如下：
7）转化连接产物至大肠杆菌，步骤如下：
①大肠杆菌感受态DH5α，加入连接产物后冰浴30min；
②42℃热激90sec；
③加入无抗培养基，并37℃培养45min；
④1000rpm离心1min后涂amp（氨苄青霉素）抗性培养基，37℃培养16小时；
⑤扩大培养抽提质粒。
8）测序鉴定，得到最终的改造后质粒pCDH-CMV-pri-MiR21-EF1-copGFP，如图3，其细部结构如图1(A)。
3.构建pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒
将构建好的pCDH-CMV-pri-MiR21-EF1-copGFP质粒，采用BsmBI酶切，并连接入退火的ShFli1片段，构建完成pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒，操作流程示意图见图5。
1）获得ShFli1退火片段，使用Oligo005及Oligo006进行退火，退火反应体系如下：
反应程序如下：
1.95℃2分钟
2.每8秒下降0.1℃，降至25℃
3.4℃保存
2）将质粒pCDH-CMV-MCS-pri-MiR21-EF1-copGFP进行BsmBI单酶切，50℃反应2小时，反应体系如下：
3）使用连接酶连接ShFli1退火产物及pCDH-CMV-MCS-pri-MiR21-EF1-copGFP质粒，4℃反应3小时，连接体系如下：
4）转化连接产物至大肠杆菌，步骤如下：
①大肠杆菌感受态DH5α，加入连接产物后冰浴30min；
②42℃热激90sec；
③加入无抗培养基，并37℃培养45min；
④1000rpm离心1min后涂amp（氨苄青霉素）抗性培养基，37℃培养16小时；
⑤扩大培养抽提质粒。
5）测序验证pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒，如图4，其细部结构如图1（B）。
实际最终构建成功的pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒，保证了shFli1片段无缝连接进入MiR21的骨架结构之中，其与pri-MiR21之间的比较图见图1（C）。
4.使用磷酸钙转染法转染293细胞，验证质粒转染方法下，pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒对于Fli1基因的敲减效率。
1）pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒磷酸钙转染法转染293T细胞，方法如下：
①细胞铺板：通过胰酶消化收集293T细胞，用适当的完全培养基以1×105至4×105细胞/cm2的密度接种细胞于细胞培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的50－60％）。将细胞置于含5％CO2的37°C温箱中孵育8-24h，当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前2h换液（用新鲜的完全培养基置换旧的培养基）；
②制备磷酸钙－pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒沉淀：以60mm组织培养皿用500μl反应总体积为例。在灭菌水中加入pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒DNA（3-5μg），再加入31μl2M CaCl2，使三者总体积达250μl，混匀；
③将质粒和CaCl2的混合物逐滴加入250μl（等体积）2×HBS缓冲溶液，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀。静置20min后，将这500μl的磷酸钙－DNA悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中,轻轻摇动平皿混匀；
（2×HBS配方如下）
④置于含5%CO2的37℃温箱孵育。培养一段时间后（8-24h）吸去培养基与DNA沉淀，加入5ml37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，培养24-48h后荧光拍照，曝光时间5sec，感染结果见图6。
2）抽提转染质粒的293T细胞RNA，方法如下：
①将六孔板中的细胞，直接加入1ml 进行消化、裂解；
②细胞或组织加后，室温放置5min，使其充分裂解；
③12,000rpm离心5min，弃沉淀；
④按200μL氯仿/ml加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min；
⑤4℃12,000g离心15min；
⑥吸取上层水相，至另一离心管中；
⑦按0.5ml异丙醇/ml加入异丙醇混匀，室温放置5-10min；
⑧4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；
⑨按1ml75%乙醇/ml加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
⑩室温晾干或真空干燥5-10min。
3）将所得到的RNA反转录为cDNA，方法如下：
①稀释RNA至1μg/μL，取1μL，加入7.5μL Oligo dT，6.5μL ddH2O，72℃反应10min。
②混合一下体系并加入到反应后的管中，体系如下：
③所述反转录的程序为：
a.30℃反应10min；
b.42℃反应50min；
c.50℃反应15min；
d.95℃反应10min；
e.将所得cDNA样品于4℃保存。
④利用酶标仪检测所得cDNA样品浓度为：
4）使用引物007/008，通过实时定量PCR方法检测样品中Fli1基因敲减效率。
实时定量PCR反应体系（Realtime-PCR）组分如下：
上述实时定量PCR反应的程序为：
①预变性95℃，1分钟；
②变性95℃，5S；
③退火延伸60℃，20S；
④回到步骤②-③共进行40个循环，每次在延伸阶段读取吸光值。
⑤PCR程序结束后从65℃开始升温到95℃，每秒上升0.5度，得到熔解曲线。
5）所述实时定量PCR反应结果如下：
上表中数据显示,转染pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒后,293T细胞中Fli1基因的表达量有明显降低,降低了原水平的80%,见图7。
5.使用pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒包装慢病毒
1）使用pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒包装病毒，具体步骤如下：
①细胞铺板：通过胰酶消化收集293T细胞，用适当的完全培养基以1×105至4×105细胞/cm2的密度接种细胞于细胞培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的50－60％）。将细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前2h换液（用新鲜的完全培养基置换旧的培养基）；
②制备磷酸钙－DNA沉淀：以60mm组织培养皿用500μl反应总体积为例。在灭菌水中加入pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP质粒，pVSVG质粒及pΔ8.2质粒DNA（3-5μg），再加入31μl2M CaCl2，使三者总体积达到250μl，混匀。
③将质粒和CaCl2的混合物逐滴加入250μl（等体积）2×HBS缓冲溶液，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀。静置20min后，将这500μl的磷酸钙－DNA悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。2×HBS配方如下：
④置于含5%CO2的37℃温箱孵育。培养一段时间后（5-6h）吸去培养基与DNA沉淀，加入37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，培养24h后荧光拍照记录转染效率。培养至48h收取上清于4℃保存，继续加入mL37℃预热的完全培养基培养24h后上清于4℃保存。培养板置于2%SDS溶液中浸泡1天后丢弃。
2）病毒滴度测定
①293T细胞铺板：用不含EDTA的胰酶消化细胞，离心收集细胞，以20000个/孔的密度种于96孔板中。每孔中培养基体积为100μl。
②细胞贴壁后，将病毒原液分别按照100μl、50μl、20μl、10μl、1μl加入96孔板中。同时，标准品病毒以108、107、106的量作为参照。
③感染1天后换液，并每天换液，感染72小时后观察荧光，拍照几率荧光效率并推算病毒滴度约2×106左右。
6.使用pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP慢病毒感染
①细胞铺板：通过胰酶消化收集H1299细胞，细胞尽量消化成单个细胞，进行细胞计数。感染病毒使用六孔板，每孔铺入细胞量约为5×104个/3ml/孔，在显微镜下观察，细胞密度应为培养皿面积的15%左右，如果过多过少，需要根据经验参考决定细胞计数增加细胞量还是降低细胞量来铺其余的孔。将细胞置于含5％CO2的37°C温箱中孵育8h；
②8小时后，感染病毒：细胞铺板后约6h待细胞贴壁后，根据细胞MOI值计算每孔需要加入的病毒量[病毒颗粒=MOI*5×104,病毒量=病毒颗粒/TU·mL-1）]。感染前，配制含5μg/ml polybrene(聚凝胺)的新完全培养基，按照polybrene(聚凝胺)的浓度稀释[如polybrene(聚凝胺)的浓度为2000×，则1ml培养基中加入0.5μL polybrene(聚凝胺)]。吸去培养板中的培养基，再加入含polybrene(聚凝胺)的新鲜培养基1ml/孔。在生物安全柜内，加入病毒，十字形摇晃培养板，使病毒均匀分布于培养基中，将细胞置于培养箱中培养过夜，本实验加病毒量如下：
③16小时后观察细胞状态，将病毒感染培养基换成预热的新鲜培养基液3ml/孔。
④100小时后，荧光拍照，曝光时间5sec，荧光感染结果见图8。
7.抽提H1299感染病毒后的RNA，并反转录为cDNA
1）抽提转染质粒的H1299的孔板细胞RNA，方法如下：
①将六孔板中的细胞，直接加入1ml进行消化、裂解；
②细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；
③12,000rpm离心5min，弃沉淀；
④按200μL氯仿/ml加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min；
⑤4℃12,000g离心15min；
⑥吸取上层水相，至另一离心管中；
⑦按0.5ml异丙醇/ml加入异丙醇混匀，室温放置5-10min；
⑧4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；
⑨按1ml75%乙醇/ml加入75%乙醇,温和振荡离心管，悬浮沉淀；
⑩室温晾干或真空干燥5-10min。
2）将所得到的RNA反转录为cDNA，方法如下：
①稀释RNA至1μg/μL，取1μL，加入7.5μL Oligo dT，6.5μL ddH2O，72℃反应10min。
②混合一下体系并加入到反应后的管中，体系如下：
③所述反转录的程序为：
a.30℃反应10min；
b.42℃反应50min；
c.50℃反应15min；
d.95℃反应10min；
e.将所得cDNA样品于4℃保存。
④利用酶标仪检测所得cDNA样品浓度为：
4）通过引物007/008，实时定量PCR方法检测样品中Fli1基因敲减效率
实时定量PCR反应体系（Realtime-PCR）组分如下：
上述实时定量PCR反应的程序为：
①预变性95℃，1分钟；
②变性95℃，5S；
③退火延伸60℃，20S；
④回到步骤②-③共进行40个循环，每次在延伸阶段读取吸光值。
⑤PCR程序结束后从65℃开始升温到95℃，每秒上升0.5度，得到熔解曲线。
5）所述实时定量PCR反应结果如下：
对于上述结果分析，可明显发现，经过pCDH-CMV-pri-MiR21-shFli-EF1-copGFP慢病毒感染，H1299细胞的Fli1基因明显下调，基因的表达量降低了原表达的90%以上，见图9。
Claims (7)
1.一种用于构建siRNA表达载体的空载体，其特征在于，其序列从5’到3’依次包括以下序列：
1)来源于CMV RNA聚合酶II依赖型启动子序列；
2)pri-MiR21前部片段序列，其序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；
3)限制性内切酶酶切位点序列；
4)pri-MiR21后部片段序列，其序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；和
5)终止子序列；
所述空载体的骨架为pCDH质粒。
2.如权利要求1所述的空载体，其特征在于，所述的限制性内切酶酶切位点是Bsm BI酶切位点。
3.如权利要求1所述的空载体，其特征在于，所述的终止子序列是来源于SV40PolyA的序列。
4.一种表达siRNA的重组载体，其序列中包括以下序列，其特征在于，其序列从5’到3’依次包括以下序列：
1)来源于CMV RNA聚合酶II依赖型启动子序列；
2)pri-MiR21前部片段序列，其序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；
3)siRNA正义序列-MiR21环结构序列-siRNA反义序列；
4)pri-MiR21后部片段序列，其序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；和
5)终止子序列；
所述重组载体的骨架为pCDH质粒。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的MiR21环结构序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。
6.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的终止子序列是来源于SV40PolyA的序列。
7.如权利要求4-6任一项所述的表达siRNA的重组载体在基因沉默中的用途。
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