CN104561019B - 家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因及其重组表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因及其重组表达载体和应用，家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因包括BmREEPa‑L和BmREEPa‑S两种剪切体，其中BmREEPa‑L的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，BmREEPa‑S的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；经研究发现，家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因与BmNPV感染家蚕相关，当该基因被干涉后，BmNPV对BmN‑SWU1细胞的感染明显被抑制，而当过表达该基因后，BmNPV的感染被明显促进，表明该基因可用于BmNPV的防治以及抗BmNPV家蚕品系制备，对抗逆家蚕的研究具有重要意义。

Description

家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因及其重组表达载体和 应用

技术领域

本发明属于生物领域，特别涉及家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因，还涉及还有该基因的重组表达载体和应用。

背景技术

家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫。BmNPV是蚕业生产上最常见且危害最严重的一类病原，对蚕业影响巨大。如何利用当今发展迅速的基因工程技术，从根本上提高家蚕病毒抗性，是蚕业领域重要的研究课题。近些年对宿主抗性基因的研究表明，干涉或过表达某些宿主的基因可以影响BmNPV对宿主的感染。因此，干涉或过表达这些宿主基因将成为防治家蚕感染BmNPV的一种有效策略。

基因RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指外源性双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发生物体内同源mRNA降解从而表现出的基因转录后沉默现象，现已成为分子生物学家分析基因组功能和基因治疗的一个有力工具。小干扰RNA(small interferenceRNA，siRNA)是RNAi的效应分子，是一类长21～23个核苷酸的双链RNA，在体内可特异性降解与其序列互补的mRNA而引发RNA沉默。产生siRNA的方法有多种，其中化学合成法简单易行，但由于siRNA的稳定性较差，在体内易被核酸酶降解，RNAi干扰效应时间短，因而分子生物学家多采用siRNA表达载体法，即将短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)对应的DNA模板序列插入载体启动子后构建RNAi载体，RNAi载体导入体内后持续转录出shRNA，shRNA被RNaseⅢ家族的内切核酸酶Dicer剪切成siRNA，从而引发较长时间的RNA沉默效果。因此，利用RNAi技术，以目的基因为靶标构建RNAi载体，再将其导入家蚕细胞并持续表达能够导致目的基因mRNA降解的siRNA，是防治家蚕感染BmNPV和培育家蚕抗病毒品系的一种有效手段。基因过表达是指将基因序列插入到宿主适用的启动子后，构建目的基因的表达载体，然后将表达载体导入宿主细胞，从而使目的基因在宿主中的表达量上调。利用过表达技术将BmNPV抗性基因导入家蚕细胞以增强的家蚕细胞的BmNPV抗性，同样也是防治家蚕感染BmNPV和培育家蚕抗病毒品系的一种有效手段。

近年来，研究者对REEP基因的研究只局限于哺乳动物中其对受体的增强作用和与各类神经性疾病的关系；昆虫中，只有果蝇中有研究指出果蝇的REEP1基因与果蝇的抗逆性相关。但迄今为止，尚未见有关家蚕BmREEP基因及其功能的研究报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因；本发明的目的之二在于提供含有家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因的重组表达载体；本发明的目的之三在于提供含有上述重组表达载体的转化子；本发明的目的之四在于提供BmREEPa基因干扰序列或干扰BmREEPa基因表达的RNA干扰载体在制备抗核型多角体病毒家蚕或家蚕细胞中的应用。

为实现上述发明目的，经过研究后本发明提供如下技术方案：

1、家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因，所述BmREEPa基因包括BmREEPa-L和BmREEPa-S两种剪切体，所述BmREEPa-L的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述BmREEPa-S的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2、含有所述家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因的重组表达载体。

进一步，所述重组表达载体为干扰BmREEPa基因表达的干扰载体或含有BmREEPa基因编码区的过表达载体。

进一步，所述干扰BmREEPa基因表达的干扰载体为将BmREEPa基因干扰序列连入经改造的pIZ/V5-His载体而得，所述改造的pIZ/V5-His载体是在pIZ/V5-His载体的HindIII和KpnI之间连入红色荧光蛋白Dsred表达框的载体。

进一步，所述BmREEPa基因干扰序列如SEQ ID No.5所示。

进一步，所述含有BmREEPa基因编码区的过表达载体是将SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2所示序列连入pIZ/V5-His载体多克隆酶切位点处而得。

3、含有所述重组表达载体的转化体。

4、BmREEPa基因干扰序列或干扰BmREEPa基因表达的RNA干扰载体在制备抗核型多角体病毒家蚕或家蚕细胞中的应用。

进一步，所述干扰BmREEPa基因表达的RNA干扰载体为将BmREEPa基因干扰序列连入经改造的pIZ/V5-His载体而得，所述改造的pIZ/V5-His载体是在pIZ/V5-His载体的HindIII和KpnI之间连入红色荧光蛋白Dsred表达框的载体；所述BmREEPa基因干扰序列如SEQ ID No.5所示。

更进一步，所述家蚕细胞为家蚕卵巢细胞。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一个与BmNPV感染高度相关的宿主基因，能够改变家蚕细胞对BmNPV的感染能力。利用本发明的RNAi载体，可以使家蚕细胞对BmNPV的感染能力下降，达到抗BmNPV的效果；同时也可能为家蚕抗逆性的研究提供新的素材。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为BmREEPa基因两种剪切体的序列比对结果。

图2为BmREEPa基因干涉与过表达载体的效果检测。

图3为Control、导入BmREEPa干涉载体、导入BmREEPa过表达载体后感染BmNPV后48h的荧光图(A为荧光视野，B为白光视野)。

图4为Control、导入BmREEPa干涉载体、导入BmREEPa过表达载体后感染BmNPV 48h病毒滴度测定结果。

图5为Control、导入BmREEPa干涉载体、导入BmREEPa过表达载体后感染BmNPV后48h Vp39基因的定量检测结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、BmREEPa基因的克隆

从silkDB和transDB中确定其mRNA序列。通过Primer Premier 5.0软件设计如下PCR特异引物：上游引物BmREEPa-F：5’-tcacattcggttagccactaaaag-3’(SEQ ID No.3)，下游引物BmREEPa-R：5’-cgcataagcgaagtgctgaaa-3’(SEQ ID No.4)。然后以感染BmNPV的家蚕全蚕cDNA为模板，以BmREEPa-F和BmREEPa-R为引物进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。将扩增所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、切胶回收纯化后，与pMD19-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞，用含有氨苄青霉素(Amp)的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，用含有Amp的LB培养基过夜培养后提取质粒，然后进行测序。测序结果显示扩增获得的序列为两个剪切体形式，分别命名为BmREEPa-L和BmREEPa-S，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，形成的质粒分别命名为pMD19-T-BmREEPa-L和pMD19-T-BmREEPa-S。将测序获得的BmREEPa-L和BmREEPa-S进行比对，结果如图1所示。结果显示，BmREEPa-S在序列内部缺失108bp的序列，其他序列完全相同，表明了BmREEPa-L和BmREEPa-S是两个不同的剪切体。

实施例2、BmREEPa干涉载体和过表达载体的构建

1、BmREEPa基因干涉载体的构建

根据BmREEPa基因的序列设计3个miRNA序列，加入骨架中，形成干涉骨架(命名为BmREEPaRNAi)，其序列如SEQ ID No.5所示，然后将干涉骨架连接到PUC57载体上，得PUC57-BmREEPaRNAi。然后用EcoRI和SacII限制性内切酶酶切PUC57-BmREEPaRNAi载体将BmREEPaRNAi从PUC57载体上切下，连接到Piz/Dsred-v5-his载体上(Piz/Dsred-v5-his载体由pIZ/V5-His载体改造而来，具体是在pIZ/V5-His载体的HindIII和KpnI之间连接红色荧光蛋白Dsred表达框，pIZ/V5-His载体购自invitrogen公司，货号为V8000-01)，获得BmREEPa基因干涉载体，命名为Piz-Dsred-v5-his-BmREEPaRNAi。

2、BmREEPa基因过表达载体的构建与检测

用引物Piz-BmREEPaF：3’-cggaattcgatggcatccaaattacaagagt-5’(SEQ IDNo.6)，Piz-BmREEPa-LR：3’-ccgctcgagcgcagctttttaagtgtcttgctga-5’(SEQ ID No.7)，Piz-BmREEPa-SR：3’-ccgctcgagcgatcttgtttccctgtgttggcc-5’(SEQ ID No.8)分别扩增BmREEPa-L和BmREEPa-S两个片段(下划线为酶切位点)，PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。然后用EcoRI和XhoI限制性内切酶分别酶切扩增获得的BmREEPa-L和BmREEPa-S产物，同时用相同的限制性内切酶酶切pIZ/V5-His载体，回收后用T4DNA连接酶在16℃连接过夜，转化Trans-T1感受态细胞，挑取阳性克隆测序，分别获得BmREEPa过表达载体，命名为Piz-BmREEPa-L和Piz-BmREEPa-S。

3、BmREEPa干涉和过表达效果检测

将BmREEPa基因干涉载体Piz-Dsred-v5-his-BmREEPaRNAi、过表达载体Piz-BmREEPa-L和Piz-BmREEPa-S分别导入家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1中，同时以未转染细胞为对照，48小时后，收集细胞提取RNA，反转合成cDNA后，通过荧光定量PCR检测BmREEPa的表达量，荧光定量PCR检测的引物：BmREEPa-DL-F:5’-gtctatgaaggctctggagtc-3’(SEQ IDNo.9)；

BmREEPa-DL-R:5’-taaggacgaatgatacggtagtag-3’(SEQ ID No.10)，检测结果如图2所示。结果显示，转染干涉载体Piz-Dsred-v5-his-BmREEPaRNAi的细胞中BmREEpa表达量低于未转染的家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1，表明BmREEpa基因被成功干涉掉；而转染过表达载体

Piz-BmREEPa-L和Piz-BmREEPa-S的家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1的细胞中BmREEPa表达量明显升高，表明BmREEPa基因成功过表达。

实施例3、BmREEPa基因在BmN-SWU1细胞中对BmNPV感染的影响

将转染干涉和过表达载体的BmN-SWU1细胞培养48小时后，向细胞中加入eGFP标记的BmNPV的BV粒子(MOI＝1)，于48h后观察荧光，结果如图3所示。结果显示，导入过表达载体的BmN-SWU1细胞中eGFP阳性细胞明显多于干涉表达的BmN-SWU1细胞，而导入干涉载体的BmN-SWU1细胞中eGFP阳性细胞数明显低于未干涉表达的细胞(对照组)。然后收集各组细胞的培养基测定病毒滴度，结果如图4所示。结果显示，病毒滴度与荧光观察一致。再收集各组细胞提取RNA，反转录合成cDNA，采用荧光定量PCR检测VP39基因的表达量，荧光定量检测引物为：VP39-DL-F：5’-ctaatgcccgtgggtatgg-3’(SEQ ID No.11)；VP39-DL-R：5’-ttgatgaggtggctgttgc-3’(SEQ ID No.12)，检测结果如图5所示。结果显示，VP39基因的表达情况与病毒滴度检测结果一致。

上述实验结果证实：BmREEPa基因与BmNPV感染家蚕细胞有明显的相关性，干涉BmREEPa基因表达的家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1的BmNPV感染能力明显下降，而过表达BmREEPa基因后，家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1的BmNPV感染能力增强。因此，可以通过干涉BmREEPa基因表达获得抗BmNPV感染的家蚕。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

<110> 西南大学

<120> 家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因及其重组表达载体和应用

<160> 12

<210> 1

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmREEPa-L基因

<400> 1

atggcatcca aattacaaga gtataaagac aacatagaac aaagtctgaa cgacaaaagc 60

aagccatgga cgaaatattt tgaactagcc gaacaaaagg tcggcgtgaa cagattgtac 120

attttcttag gcttggtcgc gttcaccggt ttatatttag tgttcggttt cggagctgaa 180

ttaatatgca actcgatcgg cttcgtgtac cccgcgtaca tgtctatgaa ggctctggag 240

tcaccgcaga aggatgacga tacaaaatgg cttacatatt gggtggtgta cgcctgtttt 300

tctatcgtgg agtacttttc cgatttcatc gtcggctggt ttccattgta ctggctgtta 360

aagtgcatct tcgtgatctg gtgctacctg ccgactgaat acaacgggtc cctcgtgatc 420

tactaccgta tcattcgtcc ttactaccag aagcatcatg gtcgtatcga tgatatggcc 480

aacacagatc ccatgaatga tatcattaaa gacctcaatg aatcgattga taaaacaatg 540

acagctttca gcaagacact taaaaagctg taa 573

<210> 2

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmREEPa-S基因

<400> 2

atggcatcca aattacaaga gtataaagac aacatagaac aaagtctgaa cgacaaaagc 60

aagccatgga cgaaatattt tgaactagcc gaacaaaagg tcggcgtgaa cagattgtac 120

attttcttag gcttggtcgc gttcaccggt ttatatttag tgttcggttt cggagctgaa 180

ttaatatgca actcgatcgg cttcgtgtac cccgcgtaca tgtctatgaa ggctctggag 240

tcaccgcaga aggatgacga tacaaaatgg cttacatatt gggtggtgta cgcctgtttt 300

tctatcgtgg agtacttttc cgatttcatc gtcggctggt ttccattgta ctggctgtta 360

aagtgcatct tcgtgatctg gtgctacctg ccgactgaat acaacgggtc cctcgtgatc 420

tactaccgta tcattcgtcc ttactaccag aagcatcatg gtcgtatcga tgatatggcc 480

aacacaggga aacaagatta a 501

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物BmREEPa-F

<400> 3

tcacattcgg ttagccacta aaag 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物BmREEPa-R

<400> 4

cgcataagcg aagtgctgaa a 21

<210> 5

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 两端带有EcoRI和SacII酶切位点的BmREEPa干涉骨架

<400> 5

cggaattccg gcgtagtaat cagcggagac gtcaatttct ttcggcagaa gtcggacgat 61

acagaatgtt tatttacacc atttgtatcg tcatccttct gcccatggaa gttgcgaggt 121

tcgtcgccga gagcagtcgg cgtagtaatc agcggagacg tcaatttctt tcgcgtcggc 181

agttttccat tggtatgttt atttacacca tacaatggaa accagccgac gccatggaag 241

ttgcgaggtt cgtcgccgag agcagtcggc gtagtaatca gcggagacgt caatttcttt 301

cgccctcgtc agctactacc ggtatgttta tttacaccat acggtagtag atcacgaggg 361

ccatggaagt tgcgaggttc gtcgccgaga ccgcgggga 399

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 带有EcoRI的上游引物Piz-BmREEPaF

<400> 6

cggaattcga tggcatccaa attacaagag t 31

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 带有XhoI酶切位点的下游引物Piz-BmREEPa-LR

<400> 7

ccgctcgagc gcagcttttt aagtgtcttg ctga 34

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 带有XhoI酶切位点的下游引物Piz-BmREEPa-SR

<400> 8

ccgctcgagc gatcttgttt ccctgtgttg gcc 33

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmREEPa荧光定量上游引物BmREEPa-DL-F

<400> 9

gtctatgaag gctctggagt c 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmREEPa荧光定量下游引物BmREEPa-DL-R

<400> 10

taaggacgaa tgatacggta gtag 24

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VP39荧光定量上游引物VP39-DL-F

<400> 11

ctaatgcccg tgggtatgg 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VP39荧光定量上游引物VP39-DL-R

<400> 12

ttgatgaggt ggctgttgc 19

Claims (10)

1.家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因，其特征在于：所述BmREEPa基因的剪切体为BmREEPa-L和BmREEPa-S两种，所述BmREEPa-L的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述BmREEPa-S的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.含有权利要求1所述家蚕受体表达增强蛋白BmREEPa基因的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为干扰BmREEPa基因表达的干扰载体或含有BmREEPa基因编码区的过表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述干扰BmREEPa基因表达的干扰载体为将BmREEPa基因干扰序列连入经改造的pIZ/V5-His 载体而得，所述改造的pIZ/V5-His 载体是在pIZ/V5-His 载体的HindIII和KpnI之间连入红色荧光蛋白Dsred表达框的载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述BmREEPa基因干扰序列如SEQID No.5所示。

6.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述含有BmREEPa基因编码区的过表达载体是将SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列连入pIZ/V5-His载体多克隆酶切位点处而得。

7.含有权利要求2~6任一项所述重组表达载体的转化体。

8.BmREEPa基因干扰序列或干扰BmREEPa基因表达的RNA干扰载体在制备抗核型多角体病毒家蚕或家蚕细胞中的应用；所述BmREEPa基因的剪切体为BmREEPa-L和BmREEPa-S两种，所述BmREEPa-L的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述BmREEPa-S的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述干扰BmREEPa基因表达的RNA干扰载体为将BmREEPa基因干扰序列连入经改造的pIZ/V5-His 载体而得，所述改造的pIZ/V5-His载体是在pIZ/V5-His 载体的HindIII和KpnI之间连入红色荧光蛋白Dsred表达框的载体；所述BmREEPa基因干扰序列如SEQ ID No.5所示。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述家蚕细胞为家蚕卵巢细胞。