CN113234703B

CN113234703B - Bn2基因及其在植物中的应用

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Publication number: CN113234703B
Application number: CN202110499853.4A
Authority: CN
Inventors: 刘玉乐; 王韵婧; 龚骞
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2021-05-08
Filing date: 2021-05-08
Publication date: 2023-01-03
Anticipated expiration: 2041-05-08
Also published as: CN113234703A

Abstract

本发明提供了一种BN2基因及其在植物中的应用。提供了BN2基因或者活性片段在促进RNA沉默中的用途。植物体内敲除BN2基因后会显著降低植物体内RNA沉默通路，使得植物对病毒更敏感；BN2基因能够显著促进植物体内RNA沉默信号通路；而且bn2基因敲除植株中，利用农杆菌瞬时过表达外源蛋白，能够使得外源蛋白的量有显著提高，从而可以用来在植物体内过表达蛋白或者应用于植物抗病育种领域。

Description

BN2基因及其在植物中的应用

技术领域

本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种BN2基因及其在植物中的应用，尤其涉及BN2基因在植物抗病育种领域中的用途。

背景技术

棉花曲叶病(Cotton Leaf Curl Disease，CLCuD)是棉花生产种植过程中最具爆发性和毁灭性病害之一，该病是由烟粉風传播的棉花曲叶病毒侵染所致。此病害因1988年在巴基斯坦的木尔坦(Multan)地区大爆发而闻名，随后此病迅速传播至其他国家和地区。由于棉花对该病抗性极低，一旦侵染将会造成棉花的减产甚至绝产，目前棉花曲叶病对整个巴基斯坦、印度及东亚和南亚的棉花生产来说都是最严峻的威胁和挑战(Briddon andMarkham,2000)。

截至目前的报道，能引起棉花曲叶病的病毒有10种。其中木尔坦型棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMuV)是其中发病范围最广、侵染力最强、造成危害最大的病毒(Briddon and Markham,2000)。CLCuMuV可以侵染棉花、黄秋葵、朱槿、垂花悬铃花等多种寄主作物，并且能实现植株间交叉传染。CLCuMuV侵染后的棉花病株叶片皱缩、向下或向上卷曲，叶脉增厚、膨大，叶背而出现耳状突起，植株矮化，棉花产量急剧降低(Fauquet et al.,2008；Mansoor et al.,2006；Sattar et al.,2013)(图1.2)。CLCuMuV属于单组份病毒，基因组含有DNA-A和DNA-β，DNA-β上只编码βC1蛋白。DNA-A可以单独侵染棉花，但病状微弱。DNA-A和DNA-β共同侵染时会诱导典型的棉花曲叶病症状(Sattar et al.,2013)。

RNA沉默(RNA silencing，RANi)是指真核生物通过小RNA(small RNA，sRNA)靶向基因mRNA从而调节基因的表达的机制。RNA沉默作为生物界保守的防御机制在动物和植物的发育、抗逆境胁迫等方面具有至关重要的作用(Brodersen et al.,2008；Chinnusamyand Zhu,2009；Heo and Kim,2009)。总体来说，当病毒进入宿主细胞后，便开始利用细胞的酶、底物以及细胞器进行自身自身遗传物质的复制，并转录翻译出病毒蛋白以加快病毒的扩增。而这些大量产生的mRNA、RNA片段会在RNA依赖的RNA合成酶(RNA-dependent RNA-polymerases，RDR)的作用下形成双链dsRNA然后双链dsRNA会被DCL家族蛋白(DICER-LIKE，DCL)和dsRNA结合蛋白(dsRNA binding proteins，DRB)所识别，然后被剪切成21–24nt大小的小RNA(包括siRNA、miRNA、tasiRNA等)，这些小RNA会进一步被ARGONAUTE(AGO)家族蛋白识别并结合，和其他蛋白一起形成“RNA诱导的沉默复合体”(RNA-induced silencingcomplexes，RISCs)。沉默复合体一方面能够结合到靶标mRNA上，从而剪切降解靶标mRNA，实现相关基因的沉默，另一方面RISC结构也可以通过影响染色体的甲基化状态，形成转录水平上的基因沉默(Bologna and Voinnet,2014；Meister and Tuschl,2004；Pumplin andVoinnet,2013；Qi et al.,2006；Zilberman et al.,2004)。按照发生的位置和作用机制，植物基因沉默主要分为两个部分，转录水平基因沉默(transcriptional gene silence，TGS)和转录后基因沉默(post transcriptional gene silence，PTGS)，两者在植物对双生病毒的抵抗过程中都起到重要的作用。

通过RNA沉默调控植物内基因表达，从而改善植物的性能，还需要进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本发明涉及一个正调控植物抗双生病毒的基因BN2。双功能核酸酶(Bifunctional Nuclease 2，BN2)是一个含有核酸酶结构域的酶。发明人在研究过程中创造性的发现当植物体内敲除BN2(bn2)基因后会显著降低植物RNAi通路，使得植物对双生病毒更敏感；而且在BN2基因敲除植株中，利用农杆菌瞬时过表达外源蛋白，如GFP蛋白，能够使得外源蛋白的量有显著提高。本发明应用BN2基因或其活性片段能够用于植物内过表达蛋白、酶活剪切miRNAs及植物抗病育种领域。

为此，本发明的第一方面提供了一种BN2基因或者活性片段在促进RNA沉默中的用途。

本发明的发明人首次创造性的发现基因BN2涉及RNAi通路。后续实验结果证实BN2在抗病过程中起正调控作用，及解析BN2抗病过程的分子机制是通过特异性切割降解调节miRNA水平，进而调节AGO1、AGO2和DCL1的mRNA水平，正向促进转录后基因沉默。而且利用农杆菌在烟草中瞬时过表达的GFP蛋白，发现在bn2敲除植物中，GFP蛋白的表达量有显著提高。因此，本发明不仅为植物抗病育种提供重要的理论支持，而且可将bn2基因敲除植物作为生物发生器在植物内过表达蛋白及利用BN2的酶活功能特异性剪切miRNA。

本发明的第二方面提供了一种BN2基因或其活性片段在植物抗病毒领域中的用途。

本发明的第三方面提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

使得目标植物体内BN2基因或其活性片段的表达水平与所述目标植物的野生型表现出差异，以便获得所述转基因植物。

本发明的第四方面提供了一种促进外源蛋白在植物中表达的方法，包括：

将外源蛋白的编码基因导入到所述植物体内，以便促进外源蛋白在所述植物中的表达，其中所述植物体内低表达或者不表达BN2基因或其活性片段。

本发明的第五方面提供了一种表达载体在RNA沉默中的用途，所述表达载体含有BN2基因或其活性片段。根据本发明的实施例，所述表达载体为质粒。

本发明的第六方面提供了一种BN2基因或其活性片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于促进RNA沉默中的用途。

附图说明

图1是根据本发明的实施例提供的BN2正向调控RNAi结果图。

图2是根据本发明的实施例提供的BN2能够正向调节AGO1、AGO2、DCL1的mRNA水平结果图。

图3是根据本发明的实施例提供的Cas9敲除BN2后烟草miR162、miR168、miR403的水平升高的结果图。

图4是根据本发明的实施例提供的BN2能够剪切降解miRNA的结果图。

图5是根据本发明的实施例提供的BN2不能剪切Pre-miRNA、RNA和ssDNA的结果图。

图6是根据本发明的实施例提供的CLCuMuV在bn2转基因烟草上侵染能力增强的结果图。

图7是根据本发明的实施例提供的PPV在bn2转基因烟草上侵染能力增强的结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，旨在用于解释本发明，但所述实施不构成对本发明的限制。

本文中，所提到的“BN2基因”是指编码双功能核酸酶的基因。所提到的“活性片段”是指能够表现出BN2基因活性的片段，该活性片段可能相较于BN2基因来说核酸链稍长或者稍短，只要表现出BN2基因的活性即可。根据本发明的实施例，所提到的BN2基因的活性是指能够促进RNA沉默。

本文中，在对氨基酸进行表述时，采用单个字母进行表示，本领域技术人员也可以采用三个字母进行表示。

发明人在研究过程中创造性的发现：BN2基因涉及RNAi通路。进一步实验发现，BN2能够剪切降解miRNA，同时这种对核酸的剪切较为特异，其并不剪切pri-miRNA、RNA和ssDNA。这些实验结果表明BN2可以通过切割降解调节miRNA水平，进而调节RNAi通路中核心基因AGO1、AGO2和DCL1的mRNA水平，正向促进转录后基因沉默。因此，可以将BN2基因应用于植物内过表达蛋白、酶活剪切及植物抗病育种。

本发明的第一方面提供了一种BN2基因或者活性片段在抑制RNA沉默中的用途。首发明人在研究过程中创造性的发现：BN2基因涉及RNAi通路。而且经过实验证实BN2在抗病过程中起正调控作用，并通过解析BN2抗病过程的分子机制是通过特异性切割降解调节miRNA水平，进而调节AGO1、AGO2和DCL1的mRNA水平，正向促进转录后基因沉默。而且利用农杆菌在烟草中瞬时过表达的GFP蛋白的量在bn2植物中有显著提高。因此，本发明不仅为植物抗病育种提供重要的理论支持，而且可将bn2基因敲除植物作为生物发生器在植物内过表达蛋白及利用BN2的酶活功能特异性剪切miRNA。

在本发明的一些实施方式中，所述BN2基因或其活性片段如SEQ ID NO:1所示序列。

其中SEQ ID NO:1所示序列为：

ATGAGCTCTCTACAAGGGCCTGTTATTTGTCCCGTGGTTCGTGGAAAGCAAACAAGTCAGTTTGCTGTTCCTGTCAAATCTTCTGTAGCGAGGGCTAAGGTTTTGAAAAGTGGGTTCTGGGGGCTCAATGGGATCTCTAGCTGCCGGCTTAATGTGGGTTGTCAACCACGATCACGAGTAAGCAAGGTGATTGGATGCAGTTTTAGTTCGTCATCAAATGGAAATGGTAGCACGGCAGAGAATTCCAACGAAAATGATGCAGATTATGTGAACTCTAGCGTGGTAGAAGCTGTTGAAGTGCGAAGTGGGCCAGACGGTTTCATGATCAAGATGAGAGATGGCAGGCATTTGAAATGTGTCCATAATAATCCACAAGGAGGTCATCTACCTGATTATGCTCCACATCCTGCGATTGTTTTAAGAATGGAAGATGGGACAGGACTTCTTCTCCCTATTATTGTTTTGGAGATGCCAAGTGCGCTGCTCATGGCAGCTGTGCGCAATGTCCAAATTGCCAGACCAACAATGTATCAAGTTGTGAAGGAAATGGTTGAGAAGATGGGTTATACGGTTAAACTTGTTCGAGTTACCAAGAGAGTGCATGAGGCATATTATGCTCAGTTATACCTGACAAAGTCAGACAATGATGCTGAGATAATTAGCTTTGATCTCCGTCCTTCTGATGCAATCAACATTGCTGTGAGGAGCAAGGTGCCAATACAAGTCAACAAGTACTTGGCATACAATGATGGTATGAGAATAGTTGAAACTCCGAAGCCAGCAGTGCATACTACTGGTTCGGATGGTTTATTGTTCACTGAGCTTGACAGACCTTCTGGCCGGCCATGCATTGAAACAAAGGAGTTTATTCTTGTGCGGAACATGCTGATTGCAGCAGTTGAAGAACGATATAGAGATGCAGCTCTGTGGAGGGACAAGCTTACTCAACTGCGGTCCAAACGAAACTGGATATAA(SEQID NO:1)

根据本发明的实施例，所述BN2基因或其活性片段编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。

SEQ ID NO:2所示序列为：

MSSLQGPVICPVVRGKQTSQFAVPVKSSVARAKVLKSGFWGLNGISSCRLNVGCQPRSRVSKVIGCSFSSSSNGNGSTAENSNENDADYVNSSVVEAVEVRSGPDGFMIKMRDGRHLKCVHNNPQGGHLPDYAPHPAIVLRMEDGTGLLLPIIVLEMPSALLMAAVRNVQIARPTMYQVVKEMVEKMGYTVKLVRVTKRVHEAYYAQLYLTKSDNDAEIISFDLRPSDAINIAVRSKVPIQVNKYLAYNDGMRIVETPKPAVHTTGSDGLLFTELDRPSGRPCIETKEFILVRNMLIAAVEERYRDAALWRDKLTQLRSKRNWI(SEQ ID NO:2)

在研究过程中发现：在烟草中利用CRISPR技术敲除BN2，植株没有发育表型。进一步实验发现，BN2能够剪切降解miRNA，同时这种对核酸的剪切较为特异，其并不剪切pri-miRNA、RNA和ssDNA。这些实验结果表明BN2可以通过切割降解调节miRNA水平，进而调节RNAi通路中核心基因AGO1、AGO2和DCL1的mRNA水平，正向促进转录后基因沉默。因此，BN2基因能应用于植物内过表达蛋白、酶活剪切及植物抗病育种。

本发明还提供了一种BN2基因或其活性片段在植物抗病毒领域中的用途。在本发明的一些实施方式中，所述植物包括但不限于烟草，例如本生烟草。所提到的病毒可以为双生病毒，DNA病毒或者RNA病毒等等。我们在BN2敲除转基因植物上接种CLCuMuV验证了在敲除BN2基因后，病毒的侵染力增强，病株症状加重，病毒量升高。由此可以将BN2基因应用于植物抗病毒领域。例如，通过在bn2转基因植物上接种CLCuMuV，验证了在敲除BN2后病毒的侵染力增强，病株症状加重，病毒量升高。由此，BN2基因可以应用于植物抗病毒领域。

本发明的还提供了一种制备转基因植物的方法，包括：使得目标植物体内BN2基因或其活性片段的表达水平与所述目标植物的野生型表现出差异，以便获得所述转基因植物。

在至少一些实施方式中，所述方法包括：使得目标植物体内过表达所述BN2基因或其活性片段。根据本发明的实施例，将BN2基因或其活性片段导入到目标植物体内，使得目标植物体内过表达所述BN2基因或其活性片段。例如，所述BN2基因或其活性片段通过含有所述BN2基因或其活性片段的表达载体导入到目标植物中。

在至少一些实施方式中，所述方法包括：使得目标植物体内低表达或者不表达所述BN2基因或其活性片段。可以采用本领域常用的方法使得目标植物体内低表达或者不表达所述BN2基因或其活性片段。例如，利用CRISPR-Cas9技术敲除所述目标植物体内的BN2基因或其活性片段或者利用基因突变技术，使得目标植物体内低表达或者不表达所述BN2基因或其活性片段。所提到的基因突变技术可以是某些使得BN2基因所表达的某个氨基酸发生突变，。

根据本发明的实施例，所提到的目标植物可以为烟草。

可以将BN2基因应用于植物内过表达蛋白及植物抗病育种领域。本发明的第四方面提供了一种促进外源蛋白在植物中表达的方法，包括：将外源蛋白的编码基因导入到所述植物体内，以便促进外源蛋白在所述植物中的表达，其中所述植物体内低表达或者不表达BN2基因或其活性片段。根据本发明的实施例，所述植物为烟草。所述外源蛋白包括但不限于GFP蛋白，还可以是任意其他功能蛋白。例如，发明人在研究过程中发现：在纯合T3代BN2基因敲除植株上过表达了35S:GFP。和普通本生烟草相比，BN2基因敲除植株表达的GFP更多，GFP的mRNA、蛋白水平更高，GFP介导产生的siRNA更少。这说明BN2被敲除后削弱了植物转录后基因沉默功能。而且瞬时共表达BN2与GFP，发现与对照相比，与BN2共表达后，GFP的荧光显著变弱，mRNA、蛋白水平下降，而GFP介导的siRNA水平升高，这说明瞬时过表达BN2后会增强转录后基因沉默过程。从而可以应用敲除BN2基因促进外源蛋白在植物种的表达。

本文中，所提到的低表达或者不表达是指相较于野生型植物相比，BN2基因或其表达产物的量要更低，或者不表达相应的蛋白。

本发明的第五方面提供了一种表达载体在RNA沉默中的用途，所述表达载体含有BN2基因或其活性片段。在至少一些实施方式中，所述表达载体包括但不限于质粒。

本发明的第六方面提供了一种BN2基因或其活性片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于促进RNA沉默。所提供的试剂盒可以利用BN2基因或其活性片段促进植物、动物体内RNA沉默水平。而RNA沉默作为生物界保守的防御机制，在植物和动物的发育、抗逆境胁迫等方面表现出重要的作用，尤其是可以应用于植物育种领域。

本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

实施例1构建了一种转基因植物材料，包括：

使用Cas9编辑系统的载体及构建方法(参照Xingliang M.A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocotand Dicot Plants[J].Molecular Plant,2015,8(8):1274-1284)构建转基因烟草NbBN2-Cas9(其中Nb为本生烟草Nicotiana benthamiana的缩写，表示通过Cas9编辑系统构建的转基因Nb烟草，其敲除了本生烟草上的BN2基因)。.

另外，所构建的转基因烟草命名为bn2-1(代表野生型本生烟草背景下BN2敲除转基因1号株系)，bn2-2(代表野生型本生烟草背景下BN2敲除转基因2号株系)。

实施例2

为了观察在转基因植物和对照野生型本生烟草中BN2对于GFP蛋白表达的影响。首先在bn2-1、bn2-2和对照野生型本生烟上农杆菌注射了GFP，并借助于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的手段观察GFP的表达是否会有改变。

首先分别提取注射区域的烟草叶片总RNA，用RNA反转录产生的cDNA作为模板，cDNA稀释4倍。引物设计采用在线软件Primer3。采用引物在引物列表中。仪器采用美国Bio-Rad公司的CFX96^TM Real-Time System。染料采用2X SYBR Green Master Mix(YEAEN，11201ES08X)。反应体系如下：

所用到的引物如下所示：

正向引物(SEQ ID NO:3)：ATGGGCACAAATTTTCTGTCA

反向引物(SEQ ID NO:4)：ATGGGCACAAATTTTCTGTCA

表1荧光定量PCR反应体系

反应条件为：

95℃5min；

95℃15s，60℃30s，重复40个循环；

72℃10min。

根据仪器反馈的Ct值，应用2^-ΔΔCt法，并以Actin作为内参，对样品中靶基因的表达量进行相对定量。

结果如图1中A，B和D所示。其中，图1中A为在bn2-1和bn2-2的植株叶片上注射携带35S:GFP质粒的农杆菌，注射4天后白光和紫外下观察拍照结果。图1中B为提取注射区域的烟草叶片总RNA，进行qRT-PCR检测结果。以ACTIN2作为内参，检测GFP的mRNA水平。采用student’s t法统计方差，*代表p<0.05，**代表p<0.01。图1中D为提取注射区域的烟草叶片小RNA，以GFP片段为探针检测siGFP水平，以U6为内参。实验结果表明，第四天时，bn2-1、bn2-2上的GFP荧光明显强于野生型本生烟，qRT-PCR结果显示对照组的GFP的mRNA水平明显低于bn2-1、bn2-2组植物中的GFP。Western blot结果也显示bn2-1、bn2-2中的GFP蛋白水平远高于对照组。

为了确定是BN2影响了转录后基因沉默而不是其他生物学过程导致GFP的mRNA和蛋白水平的升高，我们还提取了WT和bn2-1、bn2-2 GFP注射区域叶片的小RNA，并且进行了检测。

其中小RNA提取步骤如下所示:

(1)用液氮磨碎植物粉末，取粉末5mL左右，加入8mL RNAiso Plus(Takara，9109)，用涡旋震荡器混匀。静置15分钟。

(2)每管加3mL氯仿，混匀，放入四度离心机，45000rpm，4℃离心1小时。

(3)取1.5mL新的EP管8个，每管中加入750μL异丙醇，吸取离心的上清至每个管中。上下颠倒EP管20次，放入-20℃冰箱冷藏30分钟。

(3)取出EP管，4℃，12000rpm，离心15分钟。

(4)弃上清，每管中加入1mL 75％DEPC-乙醇溶液，用枪头吹起沉淀，将8管沉淀合成2管。

(5)4℃，12000rpm，离心1分钟，倒掉上清，吸尽上清。开盖晾干10分钟。

(6)每管中加308μL DEPC水，溶解。

(7)每管中加入70μL PEG8000，42μL 5M NaCl。用涡旋震荡器混匀。

(8)在冰上放置1小时，放入4℃离心机中，12000rpm离心10分钟，留上清，弃去沉淀，将上清加入到新管中，每管中加入1mL无水乙醇，混匀。

(9)EP管放入-20℃冰箱2个小时，4℃离心，12000rpm，10分钟，倒去上清，甩干，吸尽上清，开盖晾晒5分钟。

(10)每管中加入50μL DEPC水溶解。取1μL溶液用Nano drop测浓度。

结果如图1中C所示。图1中C为提取注射区域的烟草叶片总蛋白，Western blot检测植株中GFP蛋白的表达量。利用anti-GFP抗体，通过丽春红对NC膜染色，以1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基条带作为内参。结果显示：bn2-1、bn2-2植物中GFP产生的siRNA远少于野生型本生烟GFP产生的siRNA。这些结果表明用Cas9系统敲除BN2基因后，植物的转录后基因沉默功能受到了影响。

我们发现用Crispr-Cas9系统敲除BN2基因后，植物的转录后基因沉默功能受到了影响，那瞬时过表达BN2会对转录后基因沉默造成怎样的影响呢？我们构建了35S:HA-BN2(代表35S启动子表达携带hemagglutinin(HA)标签的BN2蛋白)，以35S:HA-nLUC(代表35S启动子表达携带hemagglutinin(HA)标签的N端Luciferase蛋白)为对照，将GFP分别与35S:HA-BN2或35S:HA-nLUC通过农杆菌共注射于本生烟中，观察GFP表达的差异。

其中所用到的引物为：

35S:HA-BN2

正向引物(SEQ ID NO:5)：

CGACGACAAGACCGTCACCATGAGCTCTCTACAAGGGCCTG

反向引物(SEQ ID NO:6)：

GAGGAGAAGAGCCGTCGTTATATCCAGTTTCGTTTGGACCGC

如图1中E、F、G和H所示，其中图1中E为将含有HA-nLUC和HA-BN2的农杆菌分别与含有GFP载体的农杆菌共注射本生烟叶片中，注射4天后观察拍照结果。图1中F为注射区域的烟草叶片提取总RNA，进行qRT-PCR检测，检测GFP的mRNA水平。采用student’s t法统计方差，*代表p<0.05，**代表p<0.01。图1中G为提取注射区域的烟草叶片总蛋白，Western blot检测植株中GFP蛋白的表达量结果。图1中H为提取注射区域的烟草叶片小RNA，以GFP片段为探针检测siGFP水平，以U6为内参。

实验结果表明：当HA-BN2与GFP共注射后，4天时GFP的荧光明显弱于对照组，GFP的mRNA、蛋白量都少于对照组，但是HA-BN2注射的叶片中却有更多的GFP介导的siRNA。这说明在瞬时过表达HA-BN2后，植物转录后基因沉默功能得到增强。

实施例3

鉴于BN2可能参与调控RNAi基因的mRNA水平。我们分别提取bn2和对照植物的mRNA、瞬时过表达HA-BN2和HA-nLUC叶片的mRNA，并用qRT-PCR对RDR6、AGO1、AGO2和DCL1基因的mRNA含量进行鉴定。

其中所用到的引物序列分别如下所示：

qRT-PCR检测引物：

Actin正向引物(SEQ ID NO:7)：CCCAGAGAGGAAATACAGTG

Actin反向引物(SEQ ID NO:8)：CAATAGACGGACCAGATTCG

RDR6正向引物(SEQ ID NO:9)：TGTCAACCCTCCTTCTGCTT

RDR6反向引物(SEQ ID NO:10)：GCAGGGTTACTATTTGCCGG

AGO1正向引物(SEQ ID NO:11)：TGCGGAAGAAGAGAACTGATGT

AGO1反向引物(SEQ ID NO:12)：CACGGCCACCATGTCCTC

AGO2正向引物(SEQ ID NO:13)：AATCGTGGTGGTGGTGGTG

AGO2反向引物(SEQ ID NO:14)：GGCCTTGCTCCTGTTCGTAT

DCL1正向引物(SEQ ID NO:15)：TCCCAGCTACCAAGTGACAG

DCL1反向引物(SEQ ID NO:16)：CAACTTTCTCCAACTCCGCC

结果显示如图2中A和B所示。其中图2中A为提取HA-nLUC和HA-BN2的植株叶片总RNA，进行qRT-PCR检测。检测RDR6、AGO1、AGO2、DCL1的mRNA水平。采用student’s t法统计方差，*代表p<0.05，**代表p<0.01。图2中B为提取WT和bn2的植株叶片总RNA，进行qRT-PCR检测。检测RDR6、AGO1、AGO2、DCL1的mRNA水平。采用student’s t法统计方差，*代表p<0.05，**代表p<0.01。实验结果表明：除了RDR6，bn2植物中AGO1、AGO2和DCL1的mRNA水平显著降低。而瞬时过表达HA-BN2的AGO1、AGO2和DCL1基因的mRNA含量会显著升高。这说明BN2会正向调控AGO1、AGO2和DCL1的mRNA水平。

实施例4

在发现BN2会正向调控AGO1、AGO2和DCL1的mRNA水平后，我们接着继续探索BN2调控这些基因mRNA的机制，我们从BN2自身的结构特征入手，BN2含有一个核酸酶结构域，这预示着可能BN2可以剪切降解核酸，同时BN2正向调节AGO1、AGO2和DCL1的mRNA水平，这代表着其维持并升高了AGO1、AGO2和DCL1的mRNA水平。在搜索文献的过程中，我们发现AGO1、AGO2和DCL1的mRNA都有一个共同的特点，就是受到miRNA的调节(Allen et al.,2005；Vaucheret et al.,2004；Xie et al.,2003)。MiR168、miR162和miR403能够分别靶向并介导降解AGO1、AGO2和DCL1的mRNA。BN2是否是通过调节miRNA的量从而间接调节AGO1、AGO2和DCL1的mRNA水平呢？我们提取了bn2、和野生型本生烟的小RNA和mRNA，然后分别用qRT-PCR和Northern blot鉴定了植物的miR168、miR162和miR403的水平是否发生了改变。采用student’s t法统计方差，*代表p<0.05，**代表p<0.01。

如图3所示，qRT-PCR和Northern blot检测结果显示和野生型本生烟相比，bn2的miR168、miR162和miR403的水平都有明显的上升，这说明BN2能够负调控miR168、miR162和miR403的水平。

实施例5

为了研究BN2是如何负调控miR168、miR162和miR403的水平。由于BN2含有一个核酸酶结构域，我们猜测可能BN2可以剪切降解miRNA。之前的报道中，拟南芥SDN1家族蛋白能够作为核酸外切酶，从3`-5`端特异降解小RNA，我们借鉴其方法，验证了BN2是否能够剪切miR168、miR162和miR403(Ramachandran and Chen,2008)。我们分别将纯化好的GST(Glutathione S-transferase标签蛋白)、GST-BN2M(携带GST标签的核酸酶位点突变体)、GST-BN2与合成的单链miRNA168、miR162和miR403进行孵育，反应条件如文章所示(Ramachandran and Chen,2008)，miRNA168、miR162和miR403的3`端都带有2`-O-methyl的修饰。一小时后，我们将孵育的miRNA168、miR162和miR403电泳跑胶。其中图4B的上样顺序与图4A相同，结果如图4B所示。其中图4中A为剪切实验上样顺序图，用Western blot检测所上样品的蛋白量的变化情况。图4中B为BN2剪切miR162、miR168及miR403结果的扫描胶图。图4中B上标注的1-6对应图4中A中的1-6。

实验结果表明：加入GST或只有裂解液孵育的miRNA没有降解，但是加入GST-BN2M、GST-BN2后miRNA都会开始降解，并且随着加入GST-BN2的量的增多，miRNA的降解程度加剧，且即使GST-BN2M的蛋白量多于GST-BN2，其孵育的miRNA的降解程度却弱于GST-BN2。这说明BN2是通过其核酸酶结构域剪切降解miRNA。

除此之外，我们还检测了BN2是否会剪切pri-miRNA、RNA和ssDNA。我们分别构建出T7启动子驱动的pri-miRNA168、ACTIN2的片段，用RiboMAX large scale RNA productionsystem-T7试剂盒(promega，P1300)进行体外合成pri-miRNA和RNA。我们还人工合成了ACTIN的120bp的寡聚脱氧核苷酸链并标记上生物素biotin作为ssDNA。我们分别将pri-miRNA、RNA和ssDNA与GST、GST-BN2M、GST-BN2进行孵育然后电泳跑胶。结果如图5所示，其中图5中A为用纯化后的GST-BN2方式对ssDNA进行剪切的实验结果。图5中B为用纯化后的GST-BN2方式对Pre-miRNA进行剪切的实验结果。其中L表示lysate；G表示GST；M表示GST-BN2M；B1表示GST-BN2；B2表示2倍量的GST-BN2。

实验结果发现：与miRNA不同，BN2不会剪切pri-miRNA、RNA和ssDNA。这也说明和拟南芥SDN1一样，BN2可以特异性的切割小RNA。这也预示着BN2可以通过切割miRNA调节miRNA水平，进而调节AGO1、AGO2和DCL1的mRNA水平。

实施例5

为了研究BN2在对病毒的抗性中发挥什么作用，本实施例采用之前提到过的bn2转基因烟草为实验材料，然后用农杆菌接种上双生病毒CLCuMuV。将含有CLCuMuV的农杆菌注射野生型、bn2-1和bn2-2植物，注射15天后观察发病表型并拍照；同时用Northern blot检测CLCuMuV小RNA量；并用Southern blot检测接病植株中的V1的量。

如图6所示，A为拍照结果，B为用Northern blot检测CLCuMuV小RNA量，C为Southern blot检测接病植株中的V1的量的结果。结果表明bn2转基因烟草上双生病毒的发病症状显著强于对照组，进一步的Southern blot实验证实了发病表型的结果，通过条带对比可以发现bn2转基因烟草中的CLCuMuV量显著高于对照本生烟中的病毒量。这些结果表明，BN2在抗双生病毒中也发挥着至关重要的作用。

BN2正向参与了植物对DNA病毒(如CLCuMuV)的抗性，是否也能增强植物对RNA病毒的抗性呢？我们采用bn2转基因烟草为实验材料，然后用农杆菌接种李痘病毒(PPV)。将含有PPV的农杆菌注射野生型、bn2-1和bn2-2植物，注射5天后观察发病表型并拍照。并用qRT-PCR的方法检测接病植株中的PPV病毒的量。

其中用到的引物为：

qRT-PPV F’(SEQ ID NO:17)TCAAACGCGCTAGTCAACAC

qRT-PPV R’(SEQ ID NO:18)TGCCAAATGGTTCAAGTTCA

如图7所示，图7中A可以看出bn2转基因烟草上李痘病毒的发病症状显著高于对照组，图7中B所示的qRT-PCR实验结果进一步证实了发病表型的结果。这些结果表明BN2能正向调节对PPV的抗性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学

<120> BN2基因及其在植物中的应用

<130> BI3210189

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 975

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BN2基因或其活性片段

<400> 1

atgagctctc tacaagggcc tgttatttgt cccgtggttc gtggaaagca aacaagtcag 60

tttgctgttc ctgtcaaatc ttctgtagcg agggctaagg ttttgaaaag tgggttctgg 120

gggctcaatg ggatctctag ctgccggctt aatgtgggtt gtcaaccacg atcacgagta 180

agcaaggtga ttggatgcag ttttagttcg tcatcaaatg gaaatggtag cacggcagag 240

aattccaacg aaaatgatgc agattatgtg aactctagcg tggtagaagc tgttgaagtg 300

cgaagtgggc cagacggttt catgatcaag atgagagatg gcaggcattt gaaatgtgtc 360

cataataatc cacaaggagg tcatctacct gattatgctc cacatcctgc gattgtttta 420

agaatggaag atgggacagg acttcttctc cctattattg ttttggagat gccaagtgcg 480

ctgctcatgg cagctgtgcg caatgtccaa attgccagac caacaatgta tcaagttgtg 540

aaggaaatgg ttgagaagat gggttatacg gttaaacttg ttcgagttac caagagagtg 600

catgaggcat attatgctca gttatacctg acaaagtcag acaatgatgc tgagataatt 660

agctttgatc tccgtccttc tgatgcaatc aacattgctg tgaggagcaa ggtgccaata 720

caagtcaaca agtacttggc atacaatgat ggtatgagaa tagttgaaac tccgaagcca 780

gcagtgcata ctactggttc ggatggttta ttgttcactg agcttgacag accttctggc 840

cggccatgca ttgaaacaaa ggagtttatt cttgtgcgga acatgctgat tgcagcagtt 900

gaagaacgat atagagatgc agctctgtgg agggacaagc ttactcaact gcggtccaaa 960

cgaaactgga tataa 975

<210> 2

<211> 324

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BN2基因或其活性片段编码氨基酸

<400> 2

Met Ser Ser Leu Gln Gly Pro Val Ile Cys Pro Val Val Arg Gly Lys

1 5 10 15

Gln Thr Ser Gln Phe Ala Val Pro Val Lys Ser Ser Val Ala Arg Ala

20 25 30

Lys Val Leu Lys Ser Gly Phe Trp Gly Leu Asn Gly Ile Ser Ser Cys

35 40 45

Arg Leu Asn Val Gly Cys Gln Pro Arg Ser Arg Val Ser Lys Val Ile

50 55 60

Gly Cys Ser Phe Ser Ser Ser Ser Asn Gly Asn Gly Ser Thr Ala Glu

65 70 75 80

Asn Ser Asn Glu Asn Asp Ala Asp Tyr Val Asn Ser Ser Val Val Glu

85 90 95

Ala Val Glu Val Arg Ser Gly Pro Asp Gly Phe Met Ile Lys Met Arg

100 105 110

Asp Gly Arg His Leu Lys Cys Val His Asn Asn Pro Gln Gly Gly His

115 120 125

Leu Pro Asp Tyr Ala Pro His Pro Ala Ile Val Leu Arg Met Glu Asp

130 135 140

Gly Thr Gly Leu Leu Leu Pro Ile Ile Val Leu Glu Met Pro Ser Ala

145 150 155 160

Leu Leu Met Ala Ala Val Arg Asn Val Gln Ile Ala Arg Pro Thr Met

165 170 175

Tyr Gln Val Val Lys Glu Met Val Glu Lys Met Gly Tyr Thr Val Lys

180 185 190

Leu Val Arg Val Thr Lys Arg Val His Glu Ala Tyr Tyr Ala Gln Leu

195 200 205

Tyr Leu Thr Lys Ser Asp Asn Asp Ala Glu Ile Ile Ser Phe Asp Leu

210 215 220

Arg Pro Ser Asp Ala Ile Asn Ile Ala Val Arg Ser Lys Val Pro Ile

225 230 235 240

Gln Val Asn Lys Tyr Leu Ala Tyr Asn Asp Gly Met Arg Ile Val Glu

245 250 255

Thr Pro Lys Pro Ala Val His Thr Thr Gly Ser Asp Gly Leu Leu Phe

260 265 270

Thr Glu Leu Asp Arg Pro Ser Gly Arg Pro Cys Ile Glu Thr Lys Glu

275 280 285

Phe Ile Leu Val Arg Asn Met Leu Ile Ala Ala Val Glu Glu Arg Tyr

290 295 300

Arg Asp Ala Ala Leu Trp Arg Asp Lys Leu Thr Gln Leu Arg Ser Lys

305 310 315 320

Arg Asn Trp Ile

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物

<400> 3

atgggcacaa attttctgtc a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物

<400> 4

atgggcacaa attttctgtc a 21

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 35S:HA-BN2正向引物

<400> 5

cgacgacaag accgtcacca tgagctctct acaagggcct g 41

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 35S:HA-BN2反向引物

<400> 6

gaggagaaga gccgtcgtta tatccagttt cgtttggacc gc 42

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Actin正向引物

<400> 7

cccagagagg aaatacagtg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Actin 反向引物

<400> 8

caatagacgg accagattcg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RDR6 正向引物

<400> 9

tgtcaaccct ccttctgctt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RDR6反向引物

<400> 10

gcagggttac tatttgccgg 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AGO1正向引物

<400> 11

tgcggaagaa gagaactgat gt 22

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AGO1反向引物

<400> 12

cacggccacc atgtcctc 18

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AGO2正向引物

<400> 13

aatcgtggtg gtggtggtg 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AGO2反向引物

<400> 14

ggccttgctc ctgttcgtat 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DCL1正向引物

<400> 15

tcccagctac caagtgacag 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DCL1反向引物

<400> 16

caactttctc caactccgcc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> qRT-PPV F'

<400> 17

tcaaacgcgc tagtcaacac 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> qRT-PPV R'

<400> 18

tgccaaatgg ttcaagttca 20

Claims

1.BN2基因在促进植物中转录后基因沉默方面的用途，其特征在于，所述BN2基因通过特异性切割降解miR168、miR162和miR403进而正向调控AGO1、AGO2和DCL1的mRNA水平，促进转录后基因沉默；其中所述植物为烟草；

所述BN2基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述BN2基因编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。

3.BN2基因在植物抗病毒领域中的用途，其特征在于，将BN2基因导入目标植物体内，使得目标植物体内过表达所述BN2基因；其中所述目标植物为烟草，

所述BN2基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述BN2基因编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。

5.一种促进外源蛋白在植物中表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将外源蛋白的编码基因导入到低表达或者不表达BN2基因的植物体内，以促进外源蛋白在所述植物中的表达；其中所述植物为烟草，所述BN2基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述外源蛋白为GFP蛋白。

7.含有BN2基因的表达载体在促进植物中转录后基因沉默方面的用途，其特征在于，所述BN2基因通过特异性切割降解miR168、miR162和miR403进而正向调控AGO1、AGO2和DCL1的mRNA水平，促进转录后基因沉默；所述BN2基因的序列如SEQ ID NO:1所示，所述植物为烟草。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述表达载体为质粒。