CN103620038B - 转录终止子序列 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新的转录终止信号序列，尤其是包含至少两个连续的转录终止信号的多核苷酸，其特征在于所述连续的转录终止信号包含至少第一和相距至多1000个核苷酸的第二转录终止信号，并且终止信号中至少一个具有或编码RNA发夹结构。

Description

转录终止子序列
技术领域
本发明涉及表达系统和多核苷酸构建体的领域。
背景技术
为了通过表达系统生产足够产量的重组蛋白，在设计多核苷酸构建体和重组表达系统时，必须考虑多个方面。重要的方面是宿主细胞培养的类型以及选择适当的转染系统，以保证在整个生产过程中的细胞活性和保证高表达效率。这些关注点常常是相悖的，因为高的表达速率（expression rate）（二级蛋白的高表达速率对存活不是必要的）对细胞的健康和存活是有害的。需要可控的表达系统以允许对表达速率和对细胞代谢的修饰进行特异性调整。重组表达系统的一个重要方面是转录效率，包括终止的效率。低终止效率导致转录通读和产生冗长的mRNA，该mRNA本身对细胞造成负担，但更严重的是该mRNA会导致不需要的蛋白的表达或扰乱转基因构建体的复制控制，尤其是在质粒载体领域。不需要的复制反过来产生转基因的许多拷贝数，因此给细胞系统增加了代谢负担，使低效表达系统的问题加倍。
转录位于细胞基因表达的核心，因此可呈现出最强大的选择来操控单基因或基因群的表达速率。当三元复合体组成，其必足够稳定以允许，在非终止转录暂停或延迟期间，每秒并入多达上百个碱基，而无需RNA聚合酶的解离。因此，延伸RNA聚合酶与模板DNA以及生成的RNA转录物的紧密结合，对于生产具有数百或上千核苷酸长度的mRNA的能力而言是必不可少的。
在转录起始后以及异常稳定的三元复合物组成后，酶沿着模板移动，一个接一个地并入核苷酸并产生所需的RNA链。RNA的合成与单基因或转录操纵子的mRNA的释放必须在模板上的不同位点上停止。这个过程就称为转录终止，这个过程与转录起始期间的事件相类似但是顺序相反，结果导致了RNA聚合酶的解离以及转录的RNA的释放。对模板DNA中的明确信号（所谓的转录终止子）作出响应时发生终止。就像每一个生物过程一样，甚至终止也不是决定胜负的，因此终止并不以100%的程度发生。事实上，终止子在其终止效率上变化很广泛，在终止效率（TE）上有巨大的差异。事实上，终止信号对给定的RNA聚合酶是高度特异的。非终止事件也被描述为聚合酶的通读。
终止子可以分成几组。在终止信号的第一组，核心酶可在体外在缺少任何其它因子的情况下在某些位点上终止（如体外实验所测试的）。这些终止位点称为固有（intrinsic）终止子或I类终止子。固有终止子常常具有一个共同的结构特征， 称为发夹或茎环结构。一方面，发夹包含茎结构，其由富含dG-dC序列的双重对称（dyad asymmetric）结构所编码。另一方面，该终止子在紧随茎结构后的3'端又展示了富含dA-dT的区。当RNA聚合酶在发夹结构上暂停时，3'端富含鸟苷的区被认为有助于转录物释放。
很长一段时间以来，在茎结构内的由G-C对所介导的发夹的稳定性，被认为是影响TE的发夹结构的最基本部分（compartment）。在茎结构上插入假定的碱基，在理论上应导致更高的整体ΔG值，并且因此整体TE应升高。令人吃惊的是，通过插入G-C对来增加热力学稳定性，并未导致更高的TE，这说明发夹结构的稳定性并不是终止的唯一基本决定因素。据推测，除了稳定性之外，发夹的三维结构在终止中也起重要作用。对最典型的固有终止子而言，从茎结构的第一个封闭碱基对（closing base pair）到第一终止位置的距离是保守的。该不变性可看作是三维结构重要性的假定证据。作为结论，发夹似乎具有（assume）一个截然不同的三维形状以便与延伸聚合酶相互作用。
Wilson和von Hippel(PNAS92,1995;8793-8797)描述了tR2发夹终止子的变体以及使用大肠杆菌（E.coli）RNA聚合酶的终止效率。最大终止效率的最佳发夹结构具有至多有8或9个G/C碱基对的茎以及有4-8个残基跟随其后是6-8个rU残基的环。进一步延长该茎则降低转录效率。
Orosz等人(Eur.J.Biochem201,1991:653-659)调查了使用大肠杆菌RNA聚合酶的rrnB基因的大肠杆菌终止子的结构需求。天然终止子区由两个发夹终止子和两段间断的小重复组成，每段间断的小重复被认为各自都能形成小的茎。有意思的是，删除第一终止子外的所有结构不导致终止效率的降低。第一终止子的茎具有43%的G/C含量。
Jeng等人(J Biol Chem267(27),1992:19306-19312)描述了使用噬菌体T7RNA聚合酶的thr弱化子（attenuator）的体外终止。thr弱化子的终止可能受thr弱化子上游和远端（distal）的远端（remote）序列影响，具有7对G/C碱基对和可变A/T附加序列（additions）的富含G/C的茎环发夹，在发夹前的脱氧胸苷延伸（stretch）以及环结构（偏好thr弱化子的反向序列）。随后的调查显示，对终止而言，茎环上游的腺苷残基延伸是不需要的(Yang等人,J Biol Chem270(49),1995:23330-23336)。
终止子包含在细菌的序列中，例如在质粒pAPEC-O1-ColBM(NCBI数据库acc.no.NC_009837.1)或大肠杆菌APEC O1株的基因组中(NCBI数据库acc.no.NC_008563.1)。
Carafa等人(J Mol Biol216(4)(1999):835-858)描述了Rho依赖性的大肠杆菌转录终止子。
Mitra等人(Nucleic Acids Research,39(2011):D129-D135)提供了WebGeSTer数据库的展示，转录终止子数据库。
Unniraman等人(Nucleic Acids Research30(3)(2002):675-684)提供了某些终止子结构和分类的综述。
Quiagen的QIAexpress pQE载体(“The QIAexpress System”,TheQIAexpressionist06/2003,第5版,，第15页)包含两个终止子。
Unniraman等人(Journal of Biological Chemistry,276(45)(2001):41850-41855)涉及真细菌的固有转录终止子。
Friedman等人(Annual Review of Genetics,21(1)(1987):453-488)提供了I类和II类终止子的综述。
Lesnik等人(Nucleic Acid Research,29(17)(2001):3583-3594)描述了用于研究固有rho依赖性终止子的RNA基序项目（RNAMotif）。
发明内容
本发明的目的是通过有效的转录终止提供改进的表达系统，表达系统具有提高的所需产物的表达效率，尤其是高度加工的RNA聚合酶，如T7RNA聚合酶的表达效率。
这个目的通过权利要求的主题和本文描述的定义得以解决。
在第一方面，本发明提供包含至少两个连续的转录终止信号的多核苷酸，其中所述连续的转录终止信号包含至少第一转录终止信号和至多相距1000个核苷酸的第二转录终止信号，并且终止信号中至少有一个具有或编码RNA发夹结构。根据本发明，人们已经发现，连续的终止信号能够互相影响并导致终止效率的显著增加，尤其是如果至少一个终止子包含发夹结构。所述发夹具有包含至少12对内部碱基对的茎的结构，其中具有至少60%的G或C("G/C")核酸。在优选的实施方案中，发夹有在第二方面所限定的特定结构。本发明提供包含2、3、4或更多终止信号的组合的多核苷酸，终止信号是可操纵地连接的以允许在之前编码的序列转录之后以协同的行动（concerted action）终止，用于增加终止效率。
在第二方面，本发明还提供包含至少一个转录终止信号的多核苷酸，所述转录终止信号包含具有序列Y-U/T-NNG-Z的发夹结构，
其中Y是至少8个核苷酸长并具有至少60%，优选至少70%的G/C含量的核苷酸序列；
Z是与Y具有至少70%互补性的核苷酸序列，
Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，序列U/T-NNG是没有与Y或Z配对的碱基的环，其中N是选自T(U)、A、C、G的任一核苷酸；序列U/T-NNG优选是U/T-U/T-CG。该第二方面与发明的第一方面可组合：考虑到满足第一方面的限制（Y和Z至少12个核苷酸长），这种类型的终止子也可以用作多核苷酸上的二级发夹，或者可进一步限定一级发夹。尤其是如果用作特定基因或表达构建体的唯一终止子时，优选较长的茎结构，例如至少13、14、15、16或更多碱基对（Y和 Z）。根据本发明，通过进一步增加G/C含量、茎的互补性以及对环进行优化（这些将在下文中详述）可以提高终止效率。如根据本发明已经发现的，所有这些选择增加发夹的稳定性，其导致终止效率增加。一般而言，发夹的形成吉布斯能（Gibbs-energy，dG）通过这些结构优化得以降低。然而，如Wilson和von Hippel（见前）已发现的，单一的dG优化并不必然导致终止效率的增加：增加茎长度至超过9个碱基对-虽然其降低dG（并且增加发夹的稳定性）-并不导致终止效率的增加。
如本文所用，在核苷酸序列中的“/”或用括号括起的核苷酸指的是替代的核苷酸，例如在RNA序列中替代的U取代在DNA序列中的T。因此，U/T或U(T)表示一个可以是U或是T的核苷酸位点。同样地，A/T指的是核苷酸A或T；G/C指的是核苷酸G或C。因为U和T之间的功能的同一性，本文中任何对U或T的引用，也可被视作对T或U中另一个的公开。例如，对（在RNA上的）序列UUCG的引用也可被理解为（在对应的DNA上的）序列TTCG的公开。为简单起见，这些选择中只有一个可用于本文描述。
互补的核苷酸或碱基是那些能够碱基配对的，例如A和T（或U）；G和C；G和U。
发夹或茎环（stem-loop）是RNA单链部分的RNA结构，RNA单链部分自身折叠形成茎内的（内部）碱基对以及在茎部分之间的中间环序列上没有碱基配对。环优选是短的，如长度是3、4、5、6、7或8个核苷酸。本发明的多核苷酸可有1、2、3、4个或更多的发夹，如本文所限定的至少1、2、3或4，其中至少一个具有至少12个碱基对的较大茎长度，优选在14到26碱基对范围内。
本发明的多核苷酸可以是DNA（通常编码终止子）或者RNA（其通常能够折叠成发夹结构并可包含发明的终止子）。多核苷酸可以是单链（尤其是对RNA）或者是双链（尤其是对DNA）。
如本文所用，“同一性”意为当比对序列以使序列匹配最大化时在两个或多个序列中对应位置上相同核苷酸所占的比例，即，考虑到空位（gaps）和插入。设计确定同一性的方法用于在测试的序列之间给出最大的匹配。此外，确定同一性的方法编码于公开可用的计算机程序。在两序列间确定同一性的计算机程序方法包括但不仅限于GCG程序包、BLASTP、BLASTN、和FASTA。BLAST程序从NCBI和其它资源可以公开获得(BLAST手册,Altschul,S等人.,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894;Altschul,S等人.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。公知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。能够例如使用具有11.0的开放空位（open gap）罚分和1.0的延伸空位（extended gap）罚分的默认参数来运行以及使用blosum-62矩阵来运行BLASTN。
如本文所用，“包含”（comprising）可理解为对开放式限定的引用，允许相似的其它成员或其它特征。“由……组成”（Consisting of）可理解为涉及有限范围的 特征的封闭式限定。
本文使用的“终止”（Termination），如果没有另外注明，指的是转录终止。“终止信号”或（Termination signal）仅“终止子”（terminator），如果没有另外注明，指的是“转录终止信号”（transcription termination signal）。终止子是妨碍或是阻止聚合酶转录的序列。本发明的终止子是为T7RNA聚合酶特别优化的，但是也能在一定程度上影响其它RNA聚合酶的终止。
“ORF”或“开放阅读框”是能被翻译成多肽的核苷酸序列。这样的延伸序列的编码序列(“CDS”)不能被终止密码子打断。终止密码子可以存在于基因表达期间被删除的内含子中。代表全长蛋白质的编码序列的ORF起始于“起始”密码子，通常是ATG，终止于“终止”密码子之一。出于本申请的目的，ORF可以是编码序列的任何部分，具有或没有起始和/或终止密码子。对编码基因产物的序列而言，“ORF”和“CDS”可以互换使用。
如本文所用，术语“可操作地连接”或“可操作地定位”（operably positioned）涉及ORF，例如在表达盒中（expression cassette），其意思是具有本发明的终止子活性的序列与该核酸分子的另一核苷酸组件在功能上相关。例如，如果终止子影响到编码序列的转录，那么该终止子与编码序列可操作地连接。这样的可操作的连接可以例如通过在和基因编码序列相同的DNA分子上提供本发明的终止子。如果两个或更多的终止子彼此被定位用于为之前的编码序列提供协同的终止，那么它们可以是可操作地连接的。尤其优选地，终止子序列位于编码序列的下游，例如在编码序列的3’位置。终止子可以在编码序列的下游，例如至少1个、至少10个、至少30个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个、至少500个核苷酸处，或者终止子可与编码序列直接相邻。终止子序列，以其组合或其独立的形式，可以位于编码序列的下游10000个以内、8000个以内、6000个以内、5000个以内、4500个以内、4000个以内、3500个以内、3000个以内、2500个以内、2000个以内、1500个以内、1000个以内、750个以内、500个以内、250个以内、100个以内核苷酸处。
在本发明的优选的实施方案中，多核苷酸可包含第三转录终止信号，其任选地包含或编码RNA发夹结构（例如上文所限定的，然而独立地选自任何其它发夹终止子，或其它），所述第三转录终止信号与第一或第二转录终止信号相距至多1000个核苷酸。第一、第二和任选的第三终止子可以被放置在（相同的）基因或编码序列的末端，用以停止所述基因或编码序列的转录。多核苷酸可包含其它终止子。
在第一和第二终止子之间的核苷酸距离，在第一和第三终止子之间的和/或在第二和第三终止子之间的核苷酸距离可各自单独地选自下述任何范围，至多1000个核苷酸、至多900个核苷酸、至多800个核苷酸、至多700个核苷酸、至多600个核苷酸、至多500个核苷酸、至多400个核苷酸、至多300个核苷酸、至多250 个核苷酸、至多200个核苷酸、至多180个核苷酸、至多160个核苷酸、至多150个核苷酸、至多140个核苷酸、至多130个核苷酸、至多120个核苷酸、至多110个核苷酸、至多100个核苷酸、至多90个核苷酸、至多80个核苷酸、至多70个核苷酸、至多60个核苷酸、至多50个核苷酸。此外，在第一和第二终止子之间的核苷酸距离，在第一和第三终止子之间的和/或在第二和第三终止子之间的核苷酸距离可各自单独地选自下述任何范围，至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少60个核苷酸、至少70个核苷酸、至少80个核苷酸。终止子在多核苷酸上的放置可允许可操作的定位以影响其它终止子的终止。
发夹是包含分子内碱基配对的茎环序列，发夹也是一种能在单链DNA或，更通常地，在RNA中发生的模式（pattern）。所述结构也称为发夹环。当同一链上的两个区，以相反方向阅读时核苷酸序列上大部分互补时，碱基对形成末端是未配对环的双螺旋，而产生发夹。茎环结构的形成依赖于生成的螺旋和环区的稳定性。显然，第一前提是存在能够自身回折以形成配对的双螺旋的序列。该螺旋的稳定性取决于其长度、错配数或其包含的凸出（bulges）数（小数目是可容许的，尤其是在长螺旋中）以及配对区的碱基组成。鸟嘌呤和胞嘧啶之间的配对具有三个氢键，比腺嘌呤-尿嘧啶的配对（只有两个氢键）更稳定。在RNA中，以两个氢键为特征的鸟嘌呤-尿嘧啶配对也是常见和有利的。碱基堆积相互作用，使碱基的芳香环的pi轨道以有利的方向排列，也促进螺旋的形成。
在尤其优选的实施方案中，发夹结构被序列Y-X-Z所限定，其中Y是至少8个核苷酸长的核苷酸序列，并具有至少40%的G/C含量，优选至少50%，尤其优选至少60%，
X是3至9核苷酸长的核苷酸序列，Z是与Y具有至少70%互补性的核苷酸序列，Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，X是没有与Y或Z（也没有在X内部）配对的碱基的环。优选X在是3个、4个、5个、6个、7个或8个核苷酸长。这种一般结构能够通过增加茎的G/C含量、优化环以及增加Y和Z之间的互补性来进一步改善TE。X的四元环（tetraloop）（长度为4）结构是尤其优选的。X可包含或可由序列U/T-NNG组成，或反之亦然，其中N是选自U(T)、A、C、G的任一核苷酸；序列U/T-NNG优选是U/T-NCG，尤其是U/T-U/T-CG。在Y和Z上具有相邻G/C的四元环形成非常稳定的环结构，其显示出非常高的终止效率并且属于本发明最优选的实施方案中。
这样的式X-Y-Z的发夹结构可位于第一、第二和/或第三转录终止信号上。其它终止信号可包含其它的发夹终止子或替代的非发夹（例如II类）终止子，或者当然也可包含式X-Y-Z的发夹的终止子，其中Y、X和Z是独立选择的。在优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含两个发夹终止子，尤其优选其中一个或两个是本发明的X-Y-Z结构。
本发明也提供包含至少一个转录终止信号的多核苷酸，该转录终止信号包含具有所述序列Y-U/T-NNG-Z的发夹结构，
其中Y是至少10个核苷酸长的核苷酸序列，并具有至少60%的G/C含量，
Z是与Y具有至少70%互补性的核苷酸序列，
Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，序列U/T-NNG是没有与Y或Z相配对的碱基的环，其中N是选自T(U)、A、C、G的任一核苷酸；序列U/T-NNG优选是U/T-U/T-CG。这样的具有上述Y-X-Z结构的多核苷酸，其中X是U/T-NNG（当然任选地也包括反之亦然），可包含仅一个终止子，尤其是其位置独立于其它终止子，例如可操作地连接至ORF或可插入ORF的克隆位点。涉及X-Y-Z发夹的上文和下文适用于本发明的所有方面。
在发夹的茎（Y或Z或两者一起）中高G/C含量在能量上是有利的，导致高度稳定的发夹，继而增加终止效率。在优选的实施方案中，在Y或Z或两者的核苷酸中的G/C含量是至少50%、至少52%、至少54%、至少56%、至少58%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%。
在优选的实施方案中，至少一个转录终止信号（第一、第二和/或第三）包含富含A/T(U)的区，该区是至少4个、优选至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、或至少10个核苷酸长，该区包含至少75%的A或T(U)，其中所述富含A/T(U)的区优选位于发夹下游，尤其优选地距所述发夹不多于20个核苷酸。富含A/T(U)的区可包含选自A/T(U)的至少3个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个核苷酸，优选至多1个、至多2个、至多3个G/C核苷酸。尤其优选富含A/T(U)的区是与发夹直接相邻，或者与发夹相距（通常下游）至多20个核苷酸、优选至多15个核苷酸、至多12个核苷酸、至多10个核苷酸、至多8个核苷酸、至多7个核苷酸、至多6个核苷酸、至多5个核苷酸、至多4个核苷酸、至多3个核苷酸、至多2个核苷酸、至多1个核苷酸。富含A/T(U)的区可以是富含T(U)的，而且优选包含至少3个T(U)、至少4个T(U)、至少5个T(U)、至少6个T(U)、至少7个T(U)或至少8个T(U)。富含A/T(U)的区在长度上可以多至20、多至15、多至12、多至10、多至8个核苷酸。发夹下游的富含A/T(U)的区通常增加终止效率。其可与茎（Z）重叠。在这种情况下，优选地，Z的最后1个、2个、3个、4个或5个核苷酸可是A或T(U)，优选T(U)。
在本发明的式Y-X-Z的发夹中，优选Y在长度上是9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。Y的长度，通过互补性决定Z的长度，其可选自相同的核苷酸长度。基本上互补的Y和Z，即发夹的茎，的长度在碱基对上决定茎的长度。该茎并不一定是100%互补的，如下文所述，而是对于Y和Z具有有限的非互补的不同碱基（opposing bases）。
尤其地，Y和Z可以是m个核苷酸长，其中Y由核苷酸y1到ym组成，Z由核苷酸z1到zm组成，发夹由序列ymym-1ym-2...y8y7y6y5y4y3y2y1-X-z1z2z3z4z5z6z7z8...zm-1zm组成。优选z1与y1互补，以及zm与ym互补，意思是发夹的茎的端点是互补的。此外，任何一个ya都可以与Za互补，a是从1到m的整数，尤其是在ya和za之间的互补性，a可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30以及其任意组合。尤其优选地，茎的开始的和\或最后的1个、2个、3个、4个或5个核苷酸是互补的。
Y和Z需具有高互补性以形成高效和稳定的发夹，例如，Y和Z至少80%互补，优选至少82%、至少84%、至少85%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或者甚至100%互补。最优选地，互补性是至少70%、优选地至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或者至少100%G-C或A-T(U)互补性。
在由X和Z形成的茎结构中，应该限制非互补性（non-complementarites）。某些有限的非互补性是可能的，但是不应将其相邻放置以避免形成“泡”（bubble）或额外的环。在优选的实施方案中，在发夹内，Y和Z的核苷酸之间，至多3、2或1个G-U互补与另一个G-U互补相邻，优选无相邻G-U互补的发夹。
本发明的一个尤其优选的终止子是SEQ ID NO:4编码。本发明扩充至与SEQ IDNO:4编码的终止子有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的其它同源终止子。优选地，非同一性（non-identities）仍然如上文所限定的，例如，形成没有或有限的非互补的茎结构或者形成如前所述的富含A/T的区。SEQ ID NO:4描述一个人工优化的终止子，具有茎(nts1至16、21至36)、环(nts17至20)和茎之后的富含A/U的区(nts37至40)。其在茎结构上（25/32nts）具有78%的G/C含量。
在优选的实施方案中，本发明的多核苷酸的终止子中的至少一个是II类终止子。
与通常的发夹样终止子相反，终止事件（II类终止子的作用需要非编码链的存在），因此是双链驱动过程(He等人.,J Biol Chem267,1998:19306-19312)。进一步的证据是，在这些新序列上的转录终止，所谓的II类终止信号，是通过独立于I类终止途经的机制介导的，源于使用突变的T7RNA聚合酶的体外转录分析。在20kDa N-端部分和80kDa C-端片段之间的突变导致该聚合酶的“切口”（nicked）形，其不能在II类终止信号上终止，但是当转录包含I类终止信号的发夹时，其依然能够阻止延伸(Lyakhov等人.,J Mol Biol269,1997:28-40)。因此，在大肠杆菌中有两种不同的机制能够完成转录的终止，并且两种途径是彼此独立地操作。
对推测的（putative）生物体的序列分析揭示存在其它II类终止信号。这些不寻常的序列存在于大肠杆菌rrnB T1终止位点内、在水疱性口炎病毒（vesicular stomatitisvirus，VSV）的cDNA拷贝上、在腺病毒DNA中、以及在噬菌体的lambda DNA上(Zhang和Studier,1995)(Sousa等人.,1992)。与固有终止信号上的U串（U-run）相比，所有这些新发现的序列共享7bp长的共有序列（根据非模板链ATCTGTT）和3'端的不均衡的（unequally）长串尿苷。
II类终止子的实例是:
Figure BDA0000425738540000091
(来自Lyakhov等人.,J Mol Biol280(1998):201-213)
缺乏相邻的尿苷串（在非模板链上的T）的共有序列存在于正在复制的T7DNA的多联体连接点（the concatemer junction，CJ）的右端（Lyakhov等人，1997）。因为缺少尿苷束（uridine tract），通过将固有T7聚合酶突变为“切口”形以提前分析这段7bp长的序列的重要性。表达切口的T7聚合酶的噬菌体不能够识别潜在的II类终止位点。
根据本发明，发明的II类终止子包含全部7个实施例所共用的共有序列TCTGTT，尤其优选，T在所述TCTGTT序列3'的2个核苷酸内。优选地，II类终止子包含至少20个核苷酸长的序列，优选至少22个、至少24个或至少26个核苷酸长，具有至少40%的T含量（包括该共有序列）。在8个核苷酸长以内的至少40%T的富含T的区与共有序列3'或5'相邻。
II类终止信号可以与发夹终止信号相邻。这样的II类终止子可以是直接位于发夹的前面或者后面，具有很少的或没有中间核苷酸，优选具有至多10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个或者没有中间核苷酸。在发夹之后的富含A/T(U)，尤其是富含T（U）的区可以位于发夹和相邻的II类终止子之间。
在体外转录分析中，使用包含PTH基因中存在的II类终止位点的模板，显示约55%的终止效率，因此与形成T7终止子的发夹相比，所述终止子效率较低（天然的T7终止子序列显示约80%的TE）。然而，根据本发明发现，I类和II类终止子的组合具有令人惊奇的增高的总效率。
包含至少两个可操作连接的终止子信号的本发明多核苷酸的可能性是：
1）第一终止子信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少14个核苷酸长的核苷酸序列，并具有至少60%，优选至少65%的G/C含量，
X是3至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及Z是与Y具有至少90%互补性的核苷 酸序列，
Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z（且也没有在X中内部）配对的碱基的环；
第二终止子信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少8个核苷酸长的核苷酸序列，并具有至少40%、优选至少50%、尤其至少60%的G/C含量，
X是3个至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及Z是与Y具有至少70%互补性的核苷酸序列，
Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z（且也没有在X中内部）配对的碱基的环；第一和第二终止子相距至多1000个核苷酸以通过第一和第二终止信号提供协同的终止。第一和第二个终止子的Y、X和Z可以如上述独立地选择。终止子信号可以是以任何顺序或是如上文所列的顺序。
2）第一终止子信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少12个核苷酸长的核苷酸序列，并具有至少60%、优选至少65%的G/C含量，
X是3至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及Z是与Y具有至少80%互补性的核苷酸序列，
Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z（且也没有在X中内部）配对的碱基的环；
第二终止子信号包含II类终止信号，优选地包含共有序列TCTGTT，尤其优选地包含至少20个核苷酸长且具有至少40%的T含量的序列；第一终止子和任选的其它终止子的Y、X和Z以及II类终止信号的参数可以如上文所述独立地选择。终止子信号可以是任何顺序或是如上文所列的顺序。II类终止信号可以相邻于上述中的一个或者相邻于另一发夹终止信号。
3）第一终止子信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少12个核苷酸长的核苷酸序列并具有至少60%、优选至少65%的G/C含量，
X是3个至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及Z是与Y具有至少80%互补性的核苷酸序列，
Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z（且也没有在X中内部）配对的碱基的环；
第二终止子信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少8个核苷酸长的核苷酸序列并具有至少40%、优选至少50%的，尤其至少60%的G/C含量，
X是3至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及Z是与Y具有至少70%互补性的核苷酸序列，
Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z（且也没有在X中内部）配对的碱基的环；
第三终止子信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少8个核苷酸长的核苷酸序列，并具有至少40%、优选至少50%，尤其至少60%的G/C含量，
X是3至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及Z是与Y具有至少70%互补性的核苷酸序列，
Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z（且也没有在X中内部）配对的碱基的环；第一、第二和第三终止子相距至多1000个核苷酸以通过第一、第二和第三终止信号提供协同的终止。第一、第二或第三终止子的Y、X和Z可以如上述独立地选择。终止子信号可以是以任何顺序或是如上文所列的顺序。
4）第一终止子信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少12个核苷酸长的核苷酸序列并具有至少60%、优选至少65%的G/C含量，
X是3至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及Z是与Y具有至少80%互补性的核苷酸序列，
Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z（且也没有在X中内部）配对的碱基的环；
第二终止子信号包含II类终止信号，优选地包含共有序列TCTGTT，尤其优选地包含至少20个核苷酸长且具有至少40%T含量的序列；
第三终止子信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少8个核苷酸长的核苷酸序列并具有至少40%、优选至少50%的，尤其至少60%的G/C含量，
X是3至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及Z是与Y具有至少70%互补性的核苷酸序列，
Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z（且也没有在X中内部）配对的碱基的环；第一、第二和第三终止子相距至多1000个核苷酸以通过第一和第二和第三终止信号提供协同的终止。第一或第三终止子的Y、X和Z以及II类终止信号的共有且富含T的序列可以如上述独立地选择。终止子信号可以是以任何顺序或是如上文所列的顺序。II类终止信号可以相邻于上述中的一个或者相邻于另一发夹终止信号。
5）第一终止子信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少12个核苷酸长的核苷酸序列并具有至少60%、优选至少65%的G/C含量，
X是3个至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及Z是与Y具有至少80%互补性的核苷酸序列，
Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z（且也没有在X中内部）配对的碱基的环；
第二终止子信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少8个核 苷酸长的核苷酸序列并具有至少40%、优选至少50%的，尤其至少60%的G/C含量，
X是3至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及Z是与Y具有至少70%互补性的核苷酸序列，
Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z（且也没有在X中内部）配对的碱基的环，以及II类终止信号相邻于发夹结构，优选地包含共有序列TCTGTT，尤其优选地包含至少20个核苷酸长且具有至少40%T含量的序列；
第三终止子信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少8个核苷酸长的核苷酸序列并具有至少40%、优选至少50%，尤其至少60%的G/C含量，X是3至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及Z是与Y具有至少70%互补性的核苷酸序列，
Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z（且也没有在X中内部）配对的碱基的环；第一、第二和第三终止子相距至多1000个核苷酸以通过第一、第二和第三终止信号提供协同的终止。第一、第二或第三终止子的Y、X和Z以及II类终止信号的共有且富含T的序列可以如上述独立地选择。终止子信号可以是以任何顺序或是以如上文所列的顺序。II类终止信号可以相邻于上述中的一个或者相邻于另一发夹终止信号。
优选地，以例如有限的长度等适于简单操作的形式提供本发明的多核苷酸。多核苷酸可因此排除基因组序列或大基因组片段。在优选的实施方案中，多核苷酸包含至多30,000nts（核苷酸）、至多25,000nts、至多20,000nts、至多15,000nts、至多12,500nts、至多10,000nts、至多9,000nts、至多8,000nts、至多7,000nts、至多6,000nts。
本发明的多核苷酸优选地包含一个或多个限制性位点，所述限制性位点位于所述转录终止信号的侧面和/或位于转录终止信号上游的克隆位点的侧面、或位于转录终止信号上游的编码序列（CDS）的侧面，其中优选CDS还与启动子可操作地连接。这样的多核苷酸允许在可操作地连接的CDS的转录期间功能性上的高速率的终止。所选的CDS可通过在多核苷酸分子上提供限制性位点来插入。为了终止多克隆位点（编码序列可插入其中）的转录物，可以可操作地定位本发明的终止子。术语“多克隆位点”指包含至少两个限制性酶位点的位点，然而优选其包含多种限制性酶的数个位点。
启动子可用于起始转录。优选地使用T7RNA聚合酶启动子。在优选的实施方案中，所述多核苷酸在其5'和/或3'末端的两侧是内切酶的限制性位点。末端的限制性位点允许简单操作将本发明的多核苷酸并入到其它核酸分子中，例如载体或表达盒。
本发明的终止子序列与T7RNA聚合酶一起工作得尤其好。在优选的实施方案中，具有新终止子序列的本发明的多核苷酸可以获自包含T7终止子的任何多核 苷酸或载体，再用本发明的终止子序列取代所述T7终止子。
T7终止子起源于噬菌体T7的基因组，至今已广泛使用于如质粒载体pET30的合成载体中。在商业可获得的pET30a载体(Novagen,Merck kgaA,HE,德国；图1；SEQ ID NO:1,反向互补序列：SEQ ID NO:2)中，所述T7终止子DNA序列(SEQ ID NO:3)发现于反向互补序列(SEQ ID NO:2）的位置5345至5417处。T7终止子进一步使用在载体pIGDMCT7RS（NCBI数据库DQ485721.1）、pLM99（NCBI数据库AF308739.1）、pLM100（NCBI数据库AF308740.1）、pLM101（NCBI数据库AF308741.1）、pXZ240（NCBI数据库AF316555.1）、pJH391（NCBI数据库AF316554.1）、pJH370（NCBI数据库AF316553）、pT7RS（NCBI数据库AY923866.1）、pLM3（NCBI数据库AF179892.1）、pLS13（NCBI数据库AF169190.1）、pLS3（NCBI数据库AF169189.1）、pZH3（NCBI数据库AF168612）、pBIT（NCBI数据库JF275063.1）、pNit::ET（NCBI数据库GU459073.1）、pYUBDuet（NCBI数据库HQ247815.1）、pYUB28b（NCBI数据库HQ247814.1）、pSB4316（NCBI数据库HQ343239.1），仅举几例。通过在可获得的核苷酸序列数据库，如NCBI数据库、EMBL-EBI数据库、DDBJ数据库中BLAST搜索，可很容易的确定其它具有T7终止子的载体。BLAST程序公开获自NCBI和其它资源（BLAST手册,Altschul,S等人，NCBI NLM NIHBethesda,Md.20894;Altschul,S等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)）。在其它序列中可发现功能等同的终止子，其具有与SEQ ID NO:3至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。依据本发明的转录终止信号，任何这样的序列和载体可用于修饰转录终止。
在本发明的另一实施方案中提供表达盒，其包含如上限定的核酸序列和基因产物序列（即编码序列，ORF），其中为终止基因产物的转录，对本发明的终止子序列进行可操作地定位。也可分离和/或纯化所述表达盒。例如，这样的表达盒可在适于转染宿主细胞的载体中提供。基因表达盒也可在宿主细胞修饰的基因组（modified genome）中提供。例如，能通过重组技术尤其是基因敲入（knock-in）操作或提供人工染色体以修饰基因组。
本发明的表达盒优选地以例如有限长度等适于简单操作的形式提供。本发明的表达盒因此排除了基因组序列或大基因组片段。在优选的实施方案中，所述表达盒包含至多30,000nts、至多25,000nts、至多20,000nts、至多15,000nts、至多12,500nts、至多10,000nts、至多9,000nts、至多8,000nts、至多7,000nts、至多6,000nts。在优选的实施方案中，所述表达盒在其5'和/或3'末端的两侧是内切酶的限制性位点。
在其它优选的实施方案中，表达盒包含不被翻译并且在转录和翻译之间被切除的内含子序列。例如，这样的内含子序列可位于启动子序列和编码序列的起始 密码子之间或位于编码序列内。已发现，这样的内含子序列因为与转录物加工在机械上相关联（mechanistical relationship）所以能提高基因表达。
在本发明的另一方面，提供包含如上所限定的核酸分子序列的载体。所述载体也可包含如上所提及的表达盒。其可被分离和/或纯化。所述载体优选地是如表达载体或噬菌体等生物学功能的载体。
具有基因转录终止活性的本发明的序列优选地定位于内切酶位点侧面。这允许将编码序列容易克隆入此载体中，所述载体可操作地连接于具有终止子活性的本发明的序列。除了与本发明终止子可操作地定位的多克隆位点或编码序列以外，质粒可包含下述的一个或多个：原核的复制起点、标志物或抗生素耐药性基因序列。
在又一实施方案中，本发明涉及包含如上所限定的多核苷酸或表达盒或载体的细胞。在优选的实施方案中，将所述多核苷酸、表达盒或载体稳定整合至所述细胞的基因组中。可选择地，其也可能短暂地合并这些多核苷酸、表达盒或载体。
所述细胞应适于表达来自本发明的多核苷酸的基因产物。适合表达基因产物的宿主细胞是例如原核、真核、酵母，尤其是细菌、哺乳动物、禽、植物或昆虫细胞。在优选的实施方案中，所述细胞表达T7RNA聚合酶，T7RNA聚合酶极为精确的且只转录提供有T7启动子序列的DNA序列，其能识别发夹终止子（I类终止子）-野生型和切口形的T7聚合酶-以及还任选地识别II类终止子-野生型而非切口形的T7聚合酶。与大肠杆菌的RNA聚合酶相比，T7聚合酶转录多达5（倍）。T7RNA聚合酶的表达可以是内源的（例如通过宿主细胞，尤其是T7聚合酶由宿主细胞的基因组所编码）或通过人工转染（例如T7聚合酶存在于载体中并且也可整合入基因组中）。优选地，细胞是原核的，尤其是大肠杆菌。优选地，细胞是细菌细胞培养的，优选非病原培养物，如大肠杆菌的非病原株，例如MG1655株、BL21株、HMS174株或者所述株的DE3溶源菌。
在另一方面，本发明的多核苷酸、表达盒或载体能用于基因产物的表达（或生产）。一个实例是表达基因产物，优选蛋白，的方法，所述方法包括将根据本发明的表达盒转染入分离的细胞或细胞系并且表达基因产物，任选地进一步包括分离表达的基因产物。本发明的生产基因产物的方法可包括提供如上所述的细胞，并且在允许所述基因表达的条件下培养所述细胞。
可选择地，基因产物可在合成的/细胞外的翻译系统中离体地表达。
本发明提供体外生产mRNA的方法，其包括提供具有本发明终止子信号以及提供所述转录终止信号上游的编码序列的多核苷酸，以及使所述多核苷酸接触所述T7RNA聚合酶。体外转录需要包含启动子的多核苷酸模板，通常为DNA，需要核糖核苷三磷酸、含镁离子的缓冲系统、和适当的噬菌体RNA聚合酶，优选T7RNA聚合酶。产生的mRNA可然后用于分析用途和/或表达基因产物。最常用的无细胞翻译系统由来自兔网织红细胞、麦胚和大肠杆菌的提取物组成。所有经 制备作为粗提物，其包含外源RNA翻译所需的所有大分子组份（70S或80S核糖体、tRNA、氨酰tRNA合成酶、起始因子、延伸因子和终止因子，等等）。为确保有效翻译，各提取物应补充以氨基酸、能量源（ATP、GTP）、能量再生系统（对于真核系统为磷酸肌酸和肌酸磷酸激酶，对于大肠杆菌裂解物为磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶）、以及其它本领域已知的辅因子。
本发明的另一方面涉及多核苷酸分子，其包含具有终止子活性的本发明的序列之一的互补序列。这样的互补分子通常作为所谓的“抗终止子”（anti-terminator）结合至本发明的序列上。抗终止子描述于如Sooncheol等人（Nucleic Acids Research38(18),2010:6045-6053）。所述互补分子优选结合至本发明的终止子的茎环序列，通过竞争性地与茎序列的至少一部分结合来阻止或阻碍形成合适的茎。优选地，抗终止子与茎序列的3、4、5、6、7个或更多核酸互补。例如，这样的互补序列能用于稳定地结合本发明具有终止子活性的序列，例如，以控制基因的表达。一旦这种互补序列稳定结合，终止可得到增强或抑制，尤其是得到抑制。具有互补序列的核酸分子可以是任何核苷酸类型，优选的核苷酸类型强烈地结合至具有本发明有终止子活性的序列的DNA分子。这样的具有高结合能力的核酸类型是如RNA、LNA（锁核酸)、或PNA（肽核酸）。
本发明还涉及通过上述限定的表达盒控制基因产物的终止和/或表达的方法，其包括向细胞施用具有上述互补序列的表达盒核酸分子。
通过以下附图和实施例进一步阐明本发明，而并非限制于本发明的这些示例性实施方案。
附图说明
图1：表达质粒pET30a（Novagen,Merck KgaA,HE,德国）的质粒图。
图2：携带修饰的pET30a质粒的大肠杆菌HMS174（DE3)株的补料分批生物反应器培养。在补料模式一代后（7h），根据在过程末期计算的CDM量，添加诱导物量至取得20μmol/gCDM的IPTG浓度以完全诱导细胞。只描绘补料开始后的前16小时，因为16小时后检测不到细胞生长和推测的重组蛋白生产。质粒I：固有T7终止子；质粒J：固有T7终止子的104bp删除。黑线类似当推测没有限制的指数增长时的理论细胞生长。质粒J因通读显示出质粒拷贝数增加然而蛋白（SOD）生产减少。
图3：4种终止信号（指明限制性位点）。从上到下：噬菌体T3中存在的固有终止子，原始T7终止子，具有改变的四元环的修饰的T7终止子，以及源于VSV的II类终止子。
图4：人工终止子“T7UUCG”和高度相似的原始T7终止子发夹环。（a）野生型T7终止子包括6个核苷酸的环序列和包含两个未配对的G-U残基的未配对区。（b）与原始T7终止子相比，人工合成的新T7UUCG终止信号展现某些修饰。六 核苷酸环替换为强成核位点（nucleation site）UUCG。茎结构内的未配对区通过G-C碱基对的存在代替G-U得以删除。
图5：携带所指示的pET30a衍生物的大肠杆菌HMS174(DE3)株的补料分批生物反应器培养。在补料模式一代后（7h），根据在过程末期计算的CDM量，添加诱导物量至取得20μmol/g CDM的IPTG浓度以完全诱导细胞。只描绘补料开始后的前16小时。
图6：携带所指示的pET30a衍生物的大肠杆菌HMS174(DE3)株的补料分批生物反应器培养。在补料模式一代后（7h），根据实际存在的CDM(0.9μmol/g CDM)通过持续的诱导物补料诱导细胞。在整个发酵过程中观察细胞生长和重组蛋白生产。在28小时补料分批期后，中断培养。
图7：使用大肠杆菌HMS174(DE3)(A:ptZENIT,B:pET30a)的有限诱导的补料分批培养。计算的和实际的细胞干重（CDW）的进程（course），质粒拷贝数（PCN)的进程和总产物产量的进程。
图8：使用大肠杆菌HMS174(DE3)(A:ptZENIT,B:pET30a)的有限诱导的补料分批培养。可溶的、聚集的和总特定重组蛋白（人超氧化物歧化酶）的进程。
图9：使用大肠杆菌HMS174(DE3)(A:ptZENIT,B:pET30a)的完全诱导的补料分批培养。可溶的、聚集的和总特定重组蛋白（人超氧化物歧化酶）的进程。
具体实施方式
实施例
1.材料和方法
1.1:细菌株
对于克隆程序，大肠杆菌株DH5α(F-endA1glnV44thi-1recA1relA1gyrA96deoRnupGΦ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169,hsdR17(rK-mK+),λ–)用作宿主，大肠杆菌HMS174(DE3)(F-recA1hsdR(rK12-mK12+)(DE3)(Rif R))(Novagen,Merck KgaA,HE,德国)用作生产株。因此通过添加IPTG诱导T7聚合酶的表达。
1.2:质粒
pET30a(Novagen,Merck KgaA,HE,德国;见图1;SEQ ID NOs:1和2)作为标准载体使用。该质粒携带卡那霉素抗性基因和编码抑制分子LacI的推测的基因。对于外来DNA的克隆，多克隆位点（MCS）内的多个限制性位点是可用的。插入的基因在诱导型T7/lac杂交启动子的控制下，由T7聚合酶介导，转录在3'端单一T7终止信号处停止。复制由ColE1样复制起点所介导。
1.3:表达基因
选择重组人超氧化物歧化酶（rhSOD)作为模型蛋白。到目前为止，尚未观察到hSOD在大肠杆菌中表达时的毒性作用，因此表达外源基因引起的对宿主的细胞负担仅仅由生产速率（qP)的水平造成。
在其活性中心复合Cu/Zn的hSOD参与几乎所有暴露于氧气的细胞的细胞质的抗氧化防御中。尤其是红细胞和肝细胞拥有高水平的活性hSOD酶，催化双氧自由基的还原，导致过氧化氢的形成。该蛋白具有32kDa的分子量，该酶其活性形式由两个非共价结合的相同亚基（每个153AA)组成，在其活性中心复合有一个锌原子和一个铜原子。
用引物扩增编码hSOD的基因，该引物在其5’端包含限制性酶XbaI和BamHI的识别序列（引物GTCGTCGGATCCTTACTATTGGGCGATCCC(SEQ ID NO:5)和GTCGTCTCTAGAAATAATTTTGTTTAAC(SEQ ID NO:6))。所得片段用于把hSOD基因克隆到原始的pET30a载体中。
1.4:克隆方法
根据(Sambrook和Russel,2001)完成克隆过程。限制性酶和其它修饰酶购于NewEngland Biolabs(Ipswich,MA,美国)，并根据制造商的建议来实施。所有的引物与合成的寡核苷酸从Sigma Aldrich(St.Louis,MO,美国)获得。
使用CLC主工作台完成引物设计、电子克隆（in silico cloning）、序列分析和二级结构预测。使用覆盖足够序列区的PCR确认片段的正确插入，通过琼脂糖凝胶电泳根据长度验证扩增产物。在液体介质里扩增具有正确克隆产物的克隆，使用标准质粒制备试剂盒（来自Promega的Wizard Plus SV Minipreps DNA purification System,Cat.No:A1330)分离各（respective）质粒。纯化的质粒送至AGOWA(AGOWA genomics GmbH,B,德国)进行测序。大多数的样本含有显示明显二级结构的序列区，基于这样的事实，在有变性试剂存在下以单一经济的阅读模式完成测序。
1.5:固有终止子删除
为调查不充分转录终止对质粒拷贝数控制的下调的作用，生产缺少固有T7终止子的pET30a衍生物。使用具有克隆的(XbaI/BamHI)hSOD的原始pET30质粒，pET30质粒作为起始材料，克隆的(XbaI/BamHI)hSOD作为模型蛋白。该质粒被命名为质粒_I，其功能是作为所有后续分析的参考质粒。
为在原始的pET30a质粒上删除固有T7终止信号，设计反向PCR。构建引物以使其3’端以相反的方向结合到DNA模板上（引物TTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGG(SEQ ID NO:7)和GGAGGAACTATATCCGGATTGGCG(SEQ ID NO:8)。因此，在两引物结合位点间存在的DNA序列得以删除。再次选择KODHifi聚合酶（Merck KgaA,HE,德国)来进行PCR反应。得到的质粒被命名为质粒_J，比用作模板的质粒_I短140bp。通过测序恰当的区来确认终止信号的正确删除。
1.6:体外转录
在构建具有改变的终止信号的几个pET30a衍生物后，通过使用来自EpicentreBiotechnologies(Biozym Scientific GmbH,NI,德国)的AmpliScribeTM T7高产转录 试剂盒验证各自终止T7聚合酶介导的转录的能力。
使用QIAfilter质粒Midi试剂盒纯化的纯质粒溶液作为模板使用。在使用前，用SmaI将模板限制成线性。该限制性位点在所有模板中存在，在消化后产生具有平端的双链DNA。该SmaI位点位于pET30a的MCS的下游约1000bp处，代表最长的可能的转录产物。终止产物和通读产物在尺寸上有大约1000bp的差异，通过电泳分离后可区分开。大约2μg的不同的模板DNA用SmaI在25℃消化3小时。随后在65℃中孵育20分钟以使限制性酶失活，使用Wizard SV凝胶和PCRClean-Up系统纯化反应混合物。包含约200ng的线性且纯化的质粒DNA的体积用于后续体外转录。
整个转录方法在37℃孵育2小时-3小时。随后，进行任选的脱氧核糖核酸酶I消化以除去模板DNA。出于该目的，把1ul的不含核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶I溶液(1MBU/μl)加入到体外转录反应混合物中，在37℃进行额外的15分钟消化。一分子生物学单位（MBU）的脱氧核糖核酸酶I定义为足以在37℃下10分钟内把1μg的pUC19DNA消化成寡脱氧核苷酸的酶量。
1.7:转录物分析和终止效率（TE）的计算
使用Agilent Technologies(Santa Clara,CA,USA)提供的Bioanalyzer2100系统根据其尺寸和量分析纯化的RNA样本。原理上该系统依赖于传统电泳，但是通过在作为支持材料的玻璃上蚀刻微通道，已经转化成芯片格式。该芯片格式急剧地减少分离时间以及样本和试剂的消耗。具体来说，包含25ng-250ngRNA的仅1ul就足够单次运行。该系统以数字格式提供自动化的尺寸（sizing）和量化信息。
用筛分聚合物和荧光染料填充微通道用于分离。负载样本后施加电压，因此带电荷的生物分子如核酸迁移到带正电的极。因为恒定的质荷比和存在筛分聚合物矩阵（sieving polymer matrix），分子根据尺寸被分离。较小的片段比较大的迁移更快。通过激光诱导荧光测量来检测嵌入到DNA或RNA链中的染料分子以及那些复合物。数据被转化成凝胶状图像（条带）或电泳图（峰）。借助于包含已知尺寸的组份的梯，绘制迁移时间对片段尺寸的标准曲线。根据样本中每个片段所测的迁移时间，计算尺寸。梯还含有不同浓度的组份，因此通过计算梯的面积、随后与样本峰面积相比较可以进行定量(http://www.chem.agilent.com)。
使用Agilent RNA6000Nano
Figure BDA0000425738540000181
试剂盒以分离和定量体外转录的RNA。根据制造商的建议制备和分析样本。对所有的运行，在芯片上加载包含200ngRNA的大约1ul。通过在一个芯片上加载至少三个样本来验证每个体外转录分析。源于一个转录分析的大多数RNA样本，又通过加载在两个不同芯片上来验证。在两种情况下，计算的终止效率（TE）的标准差在一个非常小的范围内变动，且绝不溢出±0.4。在非常罕见的情况下，也根据不同的体外转录分析来计算TE，由此计算的TE显示出大约±1%的较高标准差。
根据其尺寸分离RNA转录物后，通过峰面积的计算以及随后与梯面积相比较 来评估各个RNA馏分（fraction）的量。终止效率计算为终止的转录物与终止和通读转录物总和之间的摩尔比，取至少三次测量的平均值。
1.8:细胞培养条件
所有的发酵都以补料分批模式运行。调整的生长速率、诱导物的量和介质补料速率（medium feed rate）受制于诱导策略（见过程设计和重组蛋白的诱导）。1ml(OD600)小瓶解冻的主细胞库(master cell bank，MCB)作为接种物在无菌条件下注射。发酵过程根据下述过程参数来运行，并通过指示装置来观察。
使用来自MBR Bioreactor AG(Wetzikon，瑞士)的20L生物反应器(14L净容积，4L分批容积（batch volume）)，并配备标准控制单元(Siemens PS7,Intellution iFIX)。温度维持在37℃±0.5℃，使用Pt100温度探头测量。通过添加25%的氨溶液(ACROS Organics)，pH维持在pH7.0±0.05。采用市售可获得的缓冲溶液来校准。通过每升介质添加0.5ml消泡剂（PPG2000Sigma Aldrich）来抑制起泡。
使用Clark探头进行pO2测量。在发酵条件下(37°和800rpm)生物反应器灭菌后进行校准。为设置0%饱和度点，使用N2气或O2模拟器（simulator）(Mettler Toledo)。为指定100%饱和度，流入（streamed in）(121/min)压缩气体。在发酵中通过调节搅拌速度不断地将pO2保持在30%以上。当达到1200rpm的最大搅拌速度时，逐步增加进口气流。
为了将生长率保持在期望值，基质（Substrate）按照指数谱（exponentialprofile）加入到生物反应器中。根据指数增长算法来增加泵速，伴随（with）基质罐（substrate tank）重量损失的叠加（superimposed）反馈控制，从而达到补料控制。除非另有说明，所有化学药品均购自Merck。用于这些培养的基本培养物包含每升3gKH2PO4和6gK2HPO4*3H2O。这些浓度提供了所需的缓冲能力，并且担当P和K源。涉及到所产生的克细胞干重（gram cell dry mass，CDM)，加入其它组份：Na3-柠檬酸盐*2H2O(ACROS organics)0.25g、MgSO4*7H2O0.10g、CaCl2*2H2O0.02g、微量元素溶液50μl和葡萄糖*H2O3g。除了微量元素溶液以外，为了与重组hSOD一起培养，每克CDM添加4mg CuCl2*2H2O和3.2mg ZnSO4*7H2O。微量元素溶液：在5N HCl(g*l-1)中制备：FeSO4*7H2O40.0、MnSO4*H2O10.0、AlCl3*6H2O10.0、CoCl2(Fluka)4.0、ZnSO4*7H2O2.0、Na2MoO2*2H2O2.0、CuCl2*2H2O1.0、H3BO30.50。
补料期（feeding phase）的基本介质旨在达到共计386g的CDM(30g/L)。补料分批介质需要的除葡萄糖以外的所有组份都在相当于约5000g的体积内混合。葡萄糖单独溶于相当于3500g的体积内。两溶液独立地高压灭菌并在冷却后混合到一起。通过添加25%的氨溶液维持氮水平以控制pH。在把所有的混合到一起后，确定净重，并将其作为自动补料控制算法的输入。为了加速群（population）的初始生长，向基本介质中加入复杂组分酵母提取物(0.15g/g CDM)，使其成为分批介质，此外，加入2.5g/L氯化铵（NH4Cl）和2.1g/L的硫酸铵((NH4)2SO4)以避免分 批期的氮限制（N-limitation）。计算基本分批介质以使其达到22.5gCDM(5.62g/L)，组份溶解于等同于3800克的体积中。葡萄糖再次分开地溶解于等同于300克的体积中。两种溶液经过高压灭菌后无菌地组合。
在重组蛋白的诱导之前，生产细胞在非诱导状态下生长以便适应分批补料条件。在一段倍增时间（大约7小时）后，使用IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导细胞。实施两种不同的策略以诱导。在第一个实验设计中，通过单次添加高浓度的IPTG来充分地诱导细胞。为在过程的后期提供所预期的386g的CDM，计算诱导物的需求量，其中IPTG浓度为20μmol/CDM（细胞干重）。使用提供有无菌滤器的注射器将IPTG溶液无菌地直接加入到生物反应器中，以达到典型的脉冲式诱导。
根据Striedner等人(Striedner等人,2003,Biotechnol Prog19:1427-1432)进行第二个诱导策略。以恒定比向产生的生物质中添加有限量的诱导物以允许最佳地利用细胞生产重组蛋白的能力。IPTG浓度维持在0.9μmol/g CDM（有限诱导条件）的生理耐受水平。如经典方法，细胞也是在生长一代后，通过使用注射器来外部添加IPTG进行诱导。然后根据指数范围（exponential regime）补入(feeded)IPTG。为此目的，类似于流入补料介质所进行的安排，实施外部诱导物补料。将含诱导物溶液的罐放到天平上，根据细菌的指数增长加入IPTG。通过调整泵速控制诱导物溶液的流入，以及根据自动流入算法（计算出的）重量损失来控制诱导物溶液的流入。诱导物的指数补料抵消（encountered）生物质的增加遇到，导致在整个过程中诱导物对生物质的恒定比。IPTG浓度的减少降低了转录速率，因此外来基因的转录减少至更耐受的水平，其结果是更高的产物产量。
1.9:过程监控
用分光光度计(Amersham Biosciences Ultrospec500pro,Pharmacia BiotechUltrospec1000E)在波长λ=600nm下测量样本，以确定发酵肉汤的浊度。为确保测量在线性范围（OD600=0.1-0.6）内，样本在RO-H2O中稀释，水也用作参照。
为确定细胞干重（CDW），10ml的细胞材料从生物反应器中无菌的取出，以5000rpm(Heraeus Laborfuge200)离心10min。弃上清，细胞重悬于5ml RO-H2O中并再次离心。除去多余水后，细胞再次悬浮于RO-H2O中，并立即转移到预称重的烧杯中。所有烧杯在105℃干燥24小时，并重新称重。为确定生物反应器中的总CDM，须计算取出样本的时间点上的总肉汤体积。通过总结分批体积、补料介质的消耗以及25%氨溶液的流入，得出生物反应器中的总体积。通过减去取出的样本体积该值降低，该值等于在不同时间点上生物反应器中存在的体积。将总体积与确定的CDM/ml相乘，显示在取样时刻生物反应器中的总CDM。
为确定质粒稳定性，细胞涂布到含卡那霉素和不含卡那霉素的琼脂板上。因此，1ml的充足的细胞稀释系列被吸取到培养皿中，并与55℃预热的营养琼脂混合。该方法根据其发明人被称作郭霍涂布（Koch plating）。
为确定在细菌细胞内的质粒分子数目，计算质粒DNA(pDNA)对染色体DNA的比。使用标准质粒纯化试剂盒(来自Promega的Wizard Plus SV Minipreps DNA purificationSystem,Cat.No:A1330)分离pDNA。用溶菌酶和SDS破碎细胞后，使用
Figure BDA0000425738540000211
染料H33258荧光计量法测量总DNA。在纯化前添加内部标准(pUC19)来处理样本以确定在纯化期间pDNA的损失。在纯化后，通过毛细管电泳(Agilent2100Bioanalyzer)分析质粒DNA的量及其完整性。
因生产重组蛋白，诱导细胞受高度胁迫，因此诱导细胞不能增殖以形成菌落。为检验抗生素抗性、非生产细胞的数目，也将样本倾至含卡那霉素和IPTG的琼脂板上。1ml的样本稀释于生理活性盐溶液（0.9%）中至10-9的终稀释。从10-7到10-9稀释中每一步，三次用1ml与不含卡那霉素的预热营养肉汤琼脂以及存在卡那霉素(100mg/l)的预热营养肉汤琼脂一起涂布板。从10-3到10-5的稀释，1ml倾至含有卡那霉素(100mg/l)和IPTG(200mg/l)的营养肉汤琼脂板上。板在37℃孵育24小时以计数菌落形成单位(CFU)。
为定量细胞质中的可溶hSOD的量，进行酶联免疫吸附分析（ELISA)。为此目的，hSOD通过结合第一SOD抗体得以固定，并依次固着在适当的微滴定板的表面。在洗去多余试剂后，加入第二单克隆鼠抗体。该二抗识别包含与hSOD结合的一抗的复合物，并与碱性磷酸酶相连，碱性磷酸酶能够利用生色物质对硝基苯磷酸盐（p-Nitrophenylphosphat）形成淡黄色的产物。使用光度计在405nm测量有色物质的量，因此，发射光的强度与结合的hSOD量相关，并能定量产生的重组蛋白。
实施例1：终止子设计和体外测试
四种不同终止子（见图3）被克隆(SalI/HindIII)进生产质粒pET30a（质粒_I）编码的T7终止子的上游。插入的终止子序列：
VSV：TCGACCTAGCATATCCATGATATCTGTTAGTTTTTTTCCTGAAAGA(SEQ ID NO：16)
T3:TCGACCTAGCATAAACCCCTTGGGTTCCCTCTTTAGGAGTCTGAGGGGTTTTTTGCT-GAAAGA(SEQ ID NO：17)
T7:TCGACCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCT-GAAAGA(SEQID NO：18)
T7UUCG：TCGACCTAGCATAACCCCGCGGGGCCTCTTCGGGGGTCTCGCGGGGTTTTTTGCT-GAAAGA(SEO ID NO:19)
那些终止子中的三个是典型的固有终止子。T7终止子是众所周知的发夹终止信号，其也用于原始pET30a中。T3源于噬菌体T3，其结构与T7相似。第三终止子与原始T7几乎相同，但是携带某些突变(SEQ ID NO:4)。主要的是，六元环（hexaloop）变换成特别稳定的四元环（tetraloop）UUCG（因此本文使用名称“T7UUCG”)，并且茎结构内的两个弱G-U碱基对被换成更加稳定的G-C碱基对（见图4）。
原始的T7终止子在茎结构内包含更弱结合（bound）的G-U碱基对，但是其中的一些被描述为与T7聚合酶的重要相互作用位点（Schwartz等人.,2003）。令人吃惊的是，增加A-T和G-C互补性提高终止效率。最后的终止信号是已知的II类终止信号，其来源于水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）。总而言之，生成了四种命名为质粒_V、质粒_K、质粒_L和质粒_M（见表1）的新质粒，其除固有质粒编码的T7终止信号以外，全都包含第二终止信号。为获得四种终止子单独存在时的TE，删除原始pET30a的固有T7终止子（质粒_J），然后所述四个插入克隆（SalI/HindIII）至所得质粒的MCS中。因此，生产出四种推测的质粒（质粒_S、质粒_R、质粒_Q和质粒_O）（见表1），那些质粒仅在克隆的hSOD基因的3’端含有单一终止信号。
所有那些质粒以其线性形式被用作体外转录分析的模板。用Bioanalyzer2100系统分析纯化的RNA馏分计算终止效率。为验证所用系统获得的结果，质粒_I（其原始终止区包含T7终止子）被用于体外转录，并使用Bionalyzer系统执行随后的电泳分析。结果表明RNA的纯度是影响TE计算的最重要因素。为所述目的，从Wizard Plus SV Minipreps获得的不够纯的质粒制备物，被替代为用QIAGEN的QIAfilter Plasmid Midi试剂盒获得的更加纯的质粒馏分。在RNA沉淀期间，用95%乙醇执行第二步附加纯化步骤。当使用Bioanalyzer系统分析RNA转录物时，那两步获得极为明显的峰。基于所述电泳图计算的TE显示，在质粒_I中存在的T7终止子上79.45%±0.35的TE。因此，所述值与在文献中提到的T7终止子80%的TE相符合。
首先生成的8个质粒的分析揭示出某些非常有趣并新颖的特征。各自计算的终止效率总结在表1中。
引入第二个相同的T7终止信号（如质粒_V中完成的）并不导致TE的显著升高。如Jeng等人（见上文）中也描述的，引入的终止信号只诱导原始终止子上的终止事件的平分。当高度相似的T3终止子被克隆时（质粒_K），可以观察到相同的结果。令人吃惊的是，在质粒_L上，使得人工终止信号标记的T7UUCG与固有T7终止信号同时出现，将总终止效率显著升高至93.2%的值。旨在提高茎内互补性的调整修饰，引起较高的TE。在质粒_M上可以观察到近乎相同的效果，质粒_M携带两种不同型的Rho非依赖性终止信号的组合。
表1：终止子修饰的质粒及其终止效率
Figure BDA0000425738540000231
如上述，为确定所述四种终止插入各自的TE，将其克隆入质粒_J的MCS中。在第一个视图中，通过使用所述质粒作为模板的体外转录获得的结果（表1）有些令人惊讶。例如，数据揭示克隆至缩短的质粒（质粒_S）的MCS中的T7终止子仅展示48.08%的TE，然而野生型质粒（质粒_I）上相同信号则显示近80%的计算的TE。因此，相同的终止子因实际周围序列不同而具有非常不同的终止转录的能力。该结果与观察，即仅仅改变几个周围的核苷酸就能大幅度地影响不同终止信号的TE，完全吻合。对包围（encompassing）序列的依赖性也可以解释当不同的终止子出现在不同的克隆载体上时在计算TE上的差异。那些较小的发夹也许帮助终止，并且也许是在质粒_J衍生物上观察到减小的TE的原因。如表1所示，所有克隆至质粒_J的MCS中的终止子显示出低于80%的TE，因此不如原始T7终止子有效。一个解释可能是，在104bp删除片段上存在的其它元件可能影响终止效率。
实施例2：引入暂停信号
为进一步提高终止效率，在质粒_V、质粒_K和质粒_L的两个固有终止子之间克隆入暂停信号T7-CJ。插入序列：
HindIII_T7-CJ:AGCTTTGTGTCCCTATCTGTTACAGTCTCCTGC(SEQ ID NO：20)
NotI_T7-CJ:GGCCGCAGGAGACTGTAACAGATAGGGACACAA(SEQ ID NO：21)
所述暂停信号共享所有已知II类终止信号的共有序列，但是在3’端缺乏相邻成串（run）的尿苷。据推测，迫使RNA聚合酶暂停的序列，因为放大了可发生终止的时间窗，可有助于更有效的终止。一方面，位于下游的暂停信号的出现，通过放大新合成的发夹序列的成核作用（nucleation）中的时间，从而可导致更有效地形成发夹结构。因此，与竞争性的DNA-RNA杂合体形成相比，发夹形成更受青睐。另一方面，在终止子序列前的暂停信号可导致延伸中的RNA聚合酶的减速，因此可能增强终止。如表1所示，所述暂停信号的确在第一终止子处增强TE；虽然与没有暂停信号的终止子组合相比，总终止效率在一个例子（质粒_W）中略有增加，在其余的两个例子（质粒_Z和质粒_T）中甚至是减少的-但是与天然的pET30T7终止子相比，总终止效率依然是增加的。
实施例3：核糖体终止信号的克隆
因为最高测量TE的质粒含有T7UUCG和T7的组合，此质粒被用于进一步克隆程序。位于在rrnB基因3’端的放大的终止区的终止子1（T1）包含I类和II类终止信号两者。因此rrnBT1的插入为质粒提供II类终止子。此外，核糖体终止子将增强存在于3’端的二级结构。将核糖体终止子克隆至质粒_L的MCS中，紧随在先引入的T7UUCG信号之后。克隆使用的限制性位点是HindIII和NotI。序列：
NotI_rrnBT1：GGCCGCAGCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAG-TCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGA(SEQ ID NO:22)
HindIII_r厂nBT1:AGCTTCAAATA大AACGAAAGGCTCAGTCGAAA-GACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGCTGC'(SEQ ID NO：23)
在生成修饰的质粒后，实施体外转录分析，再次使用Bioanalyzer系统分离转录物。如表1所示，添加的终止信号再次导致总TE的进一步升高（在第一终止子（T7UUCG）处60%TE，在第二终止子（rrnBT1）处32%TE和第三终止子（天然T7）处7%TE）。计算出的总体TE现在显示了约98.5%的值，其揭示这种放大的终止区具有高效转录终止，同时没有因终止反应的平分而总体下降。通读的转录物急剧减少，这种终止信号因其停止转录的巨大能力被命名为tZENIT，携带所述信号的pET30a衍生物被命名为ptZENIT。
实施例4：带有质粒-J和质粒_I的大肠杆菌HMS174(DE3)的补料分批培养，以表征在重组蛋白合成的完全诱导期间，T7终止子的删除对宿主细胞反应的作用。
如实施例1.5所描述的，生成具有固有T7终止子的pET质粒（质粒_I）和删除104bp所述终止子的pET质粒（质粒_J），所述pET质粒均具有作为模型蛋白的hSOD。将所述质粒转化进大肠杆菌HMS174(DE3)细胞内，用于调查其在发酵过程中的行为。细胞在补料期（feeding phase）生长一代后，被高量的诱导物IPTG（20μmol/g CDM，根据过程末期计算的CDM的量）完全诱导。
如图2所绘，缺少转录T7终止子，对宿主的生长行为、对产物产量以及对质粒拷贝数控制，显示严重影响。利用野生型质粒，最大PCN包含约每细胞350个拷贝，并在第14个补料小时达到最大PCN，此后PCN稳定在该值。与此相反，缺少转录终止子显著升高细胞内的质粒数目，PCN在第15个补料小时达到近600的值。根据PCN曲线的形状可以推测，PCN并不是在第15个补料小时达到最大值，而是PCN将显示出进一步的升高。数据清楚地揭示，缺少转录终止强烈干扰质粒复制的控制。
虽然携带质粒_J的细胞显示每细胞质粒的极大升高，但是推测的因维持较高量的质粒而造成的负担并没有导致生长速率降低。而是，包含质粒_J的株在过程的末期达到了较高的总细胞干重（CDM），并且相较于包含质粒_I的株（在第9小时），约1小时后（在第10小时）发生了理论生物质增长的偏差。因此，与携带野生型质粒的株相比，细胞生长期扩大了1小时。表达载体不包含转录终止子时，在获得产物产量时，重组蛋白（hSOD/g CDM）的特定含量以及hSOD的总量（-17%）都减少。因此，终止信号的缺少造成产物形成率的减小，并导致宿主代谢负担的降低，并因此造成生长期的扩大，这在总CDM的增长上是明显的。为了维持观察到的PCN增加而造成的源于质粒复制的代谢负担似乎是次要的，显示出对细胞生长几乎没有影响。
实施例5：携带质粒ptZENIT的大肠杆菌HMS174（DE3）的补料分批培养，以表征在重组蛋白合成的完全或有限诱导期间tZENIT终止子对宿主细胞反应的作用。
如实施例3中所描述的，pET30a的衍生物ptZENIT的特征在于非常有效的转录终止区。根据推定，不充分的转录终止事件能够解除对质粒复制的控制，如此增强的终止应该对质粒拷贝数控制有明显作用。因此使用质粒ptZENIT转化大肠杆菌HMS174（DE3）细胞，生产株特征在于生物反应器培养过程。在补料介质中生长一代后，通过注射IPTG（20μmol/gCDM）诱导重组蛋白生产，因此细胞被完全诱导。
考虑图5所示结果时，很明显地，PCN在参照株（携带质粒_I的大肠杆菌HMS174(DE3)）中约350的最大值显著下降至在含有ptZENIT时约150的值。在两个例子中，都在第14个补料小时处达到所述最大质粒拷贝数，然后在整个过程中得以维持。当涉及其余参数时，例如总CDM、特定的产物含量和总hSOD量，携带野生型质粒的参照株的测量结果中没检测到偏差。当排除PCN数据时，携带质粒_I或ptZENIT的大肠杆菌HMS174(DE3)株在行为上高度相似。尽管如此，仍能获得关于在转录终止和质粒复制之间推测的相关性的另一证据。在完全诱导发酵条件下，源于重组蛋白生产的代谢负担似乎太高，因此维持较低质粒拷贝数的能源消耗被减少，减少的基因剂量的副作用似乎不重要，并不导致生物质增长的增强。
携带ptZENIT作为表达载体时，为进一步表征对宿主生存力（viability）的影响，实施推测的生物反应器培养。这一次不是完全诱导细胞，而是使IPTG浓度维持在0.9μmol/CDM的临界诱导物浓度。如图6所示，如细胞增长在整个过程中保持延续（perpetuation）所指示，更加温和的过程设计大幅度地提高宿主细胞的生存力。对比在相同条件下培养的携带质粒_I的大肠杆菌HMS174(DE3)株，总CDM升高约+26%。细菌细胞的增强的增长表明，使用ptZENT作为表达载体在生产状态下具有较低的胁迫水平。如在标准培养条件下已经观察到的，PCN的减少和稳定被再次确定。当考虑到产物产量时，可以观察到特定的hSOD含量和总hSOD两者的显著增加。在第17h-28h补料小时之间，特定的重组蛋白的生产是约170mg/gCDM近乎恒定的值，如果是携带ptZENIT的细胞所述值在同一时期升高至约240mg/g CDM的值。产生生物质的增加和特定的hSOD形成的增加两者都将总hSOD产量提升至约+64%的值。这意味着，hSOD的总产量从25g增至完全回收（total recovery）的约41g。因此，对在原始pET30a质粒上存在的转录T7终止子信号的改造，被证明能够稳定质粒拷贝数（见图5和图6），也表现出对重组蛋白的产量具有积极影响的能力。
实施例6：产物质量
在完全诱导条件（20μmol IPTG每g CDM）和有限诱导条件（0.9μmol IPTG每g CDM）期间，调查重组蛋白（SOD）的产物质量。在胁迫期间，生产细胞倾向于产生导致聚集和包涵体的不正确折叠的蛋白。对于此调查，产生的SOD区分为可溶SOD和SOD聚集体（aggregates）。在pTZENIT和天然pET30a质粒之间的差异得以证实。如之前一样，对于pTZENIT，质粒计数依然较低，但其具有增加的总蛋白生产（图7）。有限和完全诱导下产生的SOD的类型分别显示在图8和图9中。对于pTZENIT，总生产以及可溶相对于聚集的SOD明显更高，这表明通过有效的终止，产物质量由于胁迫减少的表达条件得以提高。
Figure IDA0000425738600000011
Figure IDA0000425738600000021
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Figure IDA0000425738600000061
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Claims (21)

1.一种包含至少两个连续的转录终止信号的多核苷酸，其特征在于所述连续的转录终止信号包含至少第一转录终止信号和相距至多1000个核苷酸的第二转录终止信号，并且终止信号中至少一个具有或编码SEQ ID NO:4的RNA发夹结构。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其包含第三转录终止信号，任选地包含或编码RNA发夹结构，所述第三转录终止信号距所述第一转录终止信号或第二转录终止信号至多1000个核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述终止信号中至少一个是II类终止子。
4.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，所述多核苷酸是DNA或者所述多核苷酸是RNA。
5.一种根据权利要求1或2所述的多核苷酸，所述多核苷酸尺寸是至多10000个核苷酸长。
6.一种根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含一个或多个限制性位点，所述限制性位点位于所述转录终止信号的侧面和/或位于转录终止信号上游的克隆位点的侧面，或位于转录终止信号上游的编码序列的侧面。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述编码序列与启动子可操作地连接。
8.一种根据权利要求1所述的多核苷酸，其包含第一终止信号和第二终止信号，所述第一终止信号包含由SEQ ID NO:4所限定的发夹结构；
所述第二终止信号包含II类终止信号。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中II类终止信号包含共有序列TCTGTT，或包含具有至少40％的T含量的至少20个核苷酸长的序列。
10.一种根据权利要求1所述的多核苷酸，其包含第一终止信号和第二终止信号，
所述第一终止信号包含由SEQ ID NO:4所限定的发夹结构；
所述第二终止信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少8个核苷酸长并具有至少40％的G/C含量的核苷酸序列，
X是3至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及
Z是与Y具有至少70％互补性的核苷酸序列，Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z配对的碱基的环；其中第一终止子和第二终止子相距至多1000个核苷酸以通过第一终止信号和第二终止信号提供协同的终止，其中第二终止子的Y、X和Z可独立地选择。
11.一种根据权利要求1所述的多核苷酸，其包含第一终止信号、第二终止信号和第三终止信号，
所述第一终止信号包含由SEQ ID NO:4所限定的发夹结构；
所述第二终止信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少8个核苷酸长并具有至少40％的G/C含量的核苷酸序列，
X是3至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及
Z是与Y具有至少70％互补性的核苷酸序列，Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z配对的碱基的环；
所述第三终止信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少8个核苷酸长并具有至少40％的G/C含量的核苷酸序列，
X是3至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及
Z是与Y具有至少70％互补性的核苷酸序列，Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z配对的碱基的环；
其中所述第一终止子、第二终止子和第三终止子相距至多1000个核苷酸以通过第一终止信号、第二终止信号和第三终止信号提供协同的终止，其中第二终止子或第三终止子的Y、X和Z可独立地选择。
12.一种根据权利要求1所述的多核苷酸，其包含第一终止信号、第二终止信号和第三终止信号，
所述第一终止信号包含由SEQ ID NO:4所限定的发夹结构；
所述第二终止信号包含II类终止信号；
所述第三终止信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少8个核苷酸长并具有至少40％的G/C含量的核苷酸序列，
X是3至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及
Z是与Y具有至少70％互补性的核苷酸序列，Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z配对的碱基的环；其中第一终止子、第二终止子和第三终止子相距至多1000个核苷酸以通过第一终止信号、第二终止信号和第三终止信号提供协同的终止，其中第三终止子的Y、X和Z以及II类终止信号的共有且富含T的序列可独立地选择。
13.根据权利要求12所述的多核苷酸，其中所述II类终止信号包含共有序列TCTGTT，或包含具有至少40％的T含量的至少20个核苷酸长的序列。
14.一种根据权利要求1所述的多核苷酸，其包含第一终止信号、第二终止信号和第三终止信号，
所述第一终止信号包含由SEQ ID NO:4所限定的发夹结构；
所述第二终止信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少8个核苷酸长并具有至少40％的G/C含量的核苷酸序列，
X是3至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及
Z是与Y具有至少70％互补性的核苷酸序列，Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z配对的碱基的环，以及与所述发夹结构相邻的II类终止信号；
所述第三终止信号包含由序列Y-X-Z所限定的发夹结构，其中Y是至少8个核苷酸长并具有至少40％的G/C含量的核苷酸序列，
X是3至9个核苷酸长的核苷酸序列，以及
Z是与Y具有至少70％互补性的核苷酸序列，Z的互补核苷酸与Y的核苷酸碱基配对，以及X是没有与Y或Z配对的碱基的环；其中第一终止子、第二终止子和第三终止子相距至多1000个核苷酸以通过第一终止信号、第二终止信号和第三终止信号提供协同的终止，其中第二终止子或第三终止子的Y、X和Z以及II类终止信号的共有且富含T的序列可独立地选择。
15.一种表达盒，其包含根据权利要求1和7至14中任一项所述的多核苷酸序列和编码序列，其中为了终止所述编码序列，对所述序列进行可操作地定位。
16.一种载体，其包含根据权利要求1和7至14中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求15所述的表达盒。
17.根据权利要求16所述的载体，所述载体是质粒。
18.一种包含多核苷酸分子的细胞，其中基因与根据权利要求1和7至14中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求16所述的载体的转录终止信号可操作地连接。
19.根据权利要求18所述的细胞，所述细胞包含T7RNA聚合酶或编码所述T7RNA聚合酶的多核苷酸。
20.一种生产基因产物的方法，其包括提供根据权利要求18或19所述的细胞，以及在允许所述基因表达的条件下培养所述细胞。
21.一种生产mRNA的体外方法，其包括提供根据权利要求1和7至14中任一项所述的多核苷酸和所述转录终止信号上游的编码序列，以及使所述多核苷酸接触T7RNA聚合酶。
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