CN1546672A

CN1546672A - 一种植物基因重组表达载体的构建方法

Info

Publication number: CN1546672A
Application number: CNA2003101065607A
Authority: CN
Inventors: 何晓兰; 刘桂华; 朱卫民; 张保龙; 倪万潮; 钦佩; 侯喜林
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2003-12-09
Filing date: 2003-12-09
Publication date: 2004-11-17

Abstract

本发明一种植物基因重组表达载体的构建方法，属于三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因表达载体的构建。利用RT－PCR技术从盐生植物三角叶滨藜总RNA中，扩增并克隆了BADH基因。该基因全序列显示，核苷酸序列长1520bp，推测的氨基酸序列全长500个氨基酸残基。利用BamHI和SacI酶切位点将BADH基因连接到pCAMBIA2301的多克隆位点，并把35S启动子和nos终止子分别连接到BADH基因的上游和下游的多克隆位点上，获表达载体pCBAMATBADH682，正用于农杆菌介导转化油菜，希望通过转基因技术获得耐盐油菜新种质。

Description

一种植物基因重组表达载体的构建方法

一、技术领域

本发明一种植物基因重组表达载体的构建方法，属于三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因植物表达载体的构建方法，专用于利用三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因进行植物表达，创造耐盐新种质。

二、技术背景

三角叶滨藜(Atriplex triangularis)是藜科滨藜属植物，自然分布于沿海沼泽边缘，可以经受海水直接浇灌的一年生多叶植物，叶可食用，且具有较强的耐盐耐干旱能力。生物对非生物胁迫的普遍反应是积累与细胞代谢相容的低分子量有机溶质，如蔗糖、甘露醇、脯氨酸、海藻糖以及季胺类化合物。甜菜碱是一类季胺类化合物。

甘氨酸甜菜碱是植物的一个重要的渗透保护剂，BADH是甘氨酸甜菜碱合成的关键酶。但很多主要的农作物如水稻、油菜、马铃薯和蕃茄等却没有甜菜碱积累。据报道，在植物中，甘氨酸甜菜碱(GB)是经两步催化合成，乙酰胆碱→甘氨酸甜菜碱醛→甘氨酸甜菜碱，第二步是由甜菜碱醛脱氢酶(BADH)所催化。GB作为参与调渗的小分子，它的积累与盐胁迫和缺水的严重程度成比例，在生物合成水平上受到调控。自从Elizabeth A.等于1990年首次从菠菜中克隆出BADH基因。目前，人们已对藜科、禾本科和苋科的BADH有所了解。BADH基因已从山菠菜、猪苋菜、甜菜、大麦等中得到分离和鉴定。并有将菠菜和山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因转入烟草、小麦、草莓等中的报道，使转化植株的耐盐性有所提高。而三角叶滨藜海水浇灌亦能开花结实，表明其有较强的耐盐性。现有技术已从三角叶滨藜中克隆得到BADH cDNA的拼接序列(GenBank注册号：AY256971)，但未能克隆到植物表达载体上，以便创造耐盐新种质。

三、发明内容

技术问题本发明的目的在于提供一种植物基因重组表达载体的构建方法，构建三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因的植物表达载体，以期将三角叶滨藜中BADH基因克隆到植物表达载体上，从而达到利用该基因进行植物表达以及创造耐盐新种质的要求。

技术方案

一种植物基因重组表达载体的构建方法，包括：

1)三角叶滨藜RNA提取

用Trizol法抽提三角叶滨藜总RNA；

2)引物设计及目的基因的扩增

根据本实验室克隆的三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因BADH cDNA拼接序列，设计下列引物，

TBf：5’-TTCA G↓GATCCATGGCGTTTCCTATGCC-3’

BamHI

TBr：5’-TCA GAGCT↓CTAAGGAGACTTGTACCAG-3’

Sacl

以三角叶滨藜总RNA为模板，参照TakaRa RNA PCR kit(AMV)ver21提供方法进行cDNA合成及PCR扩增；

3)BADH基因克隆和DNA序列测定

PCR产物经1.5％(g/100ml，下文同)琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA gelextraction回收纯化，将回收的DNA片段插入pMD18-T载体，构建重组质粒pBADH，转化感受态大肠杆菌JM109，根据α互补原理，酶切电泳法以及PCR法筛选重组子pBADH，DNA测序三角叶滨藜BADH基因核苷酸序列为SEQ IDNO.1和推测的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；

4)植物重组表达质粒的构建

用BamHI和SacI双酶切消化pBADH以及pCAMBIA2301，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA gel extraction Kit回收纯化BADH基因片段以及线性载体片段，并用T4DNA连接酶连接两片段，然后将35S启动子和nos终止子分别构建于重组载体的BADH区段上下游多克隆位点上，获植物重组表达质粒pCAMATBADH；

5)转化

植物重组表达质粒pCAMATBADH转化大肠杆菌JM109，将转化产物均匀涂布于在含100mg/L Kan的LB平板上，于37℃培养14个小时；挑取单菌落，分别接种于3mL含100mg/L Kan的LB液体培养基中，于37℃下，200rpm/min振荡培养过夜；用3S plasmid Miniprep Kit V3.1抽提质粒，并进行琼脂糖凝胶电泳检验和PCR及酶切鉴定；确认外源片段已插入到pCAMBIA2301的多克隆位点上，其中35S和nos插入片段的PCR检测及酶切分析未显示，即获得植物重组表达载体。

有益效果

1、本发明一种植物基因重组表达载体的构建方法，根据从三角叶滨藜中克隆到的BADH cDNA的拼接序列设计引物，从盐生植物三角叶滨藜总RNA中分离了BADH基因，并将其克隆到植物表达载体上，以便对该基因进行植物表达研究以及为进一步阐明植物耐盐分子机理及创造耐盐新种质。

2、本发明利用RT-PCR技术从盐生植物三角叶滨藜总RNA中，扩增并克隆了BADH基因。该基因全序列显示，核苷酸序列长1520bp，12～1515bp为一个开放阅读框架，推测的氨基酸序列全长500个氨基酸残基与菠菜和山菠菜的同源性分别为89％和95％。

3、利用BamHI和SacI酶切位点将BADH基因连接到pCAMBIA2301的多克隆位点，并把35S启动子和nos终止子分别连接到BADH基因的上游和下游的多克隆位点上，获重组植物表达载体pCBAMATBADH682，并转入根癌农杆菌LBA4404中，用于农杆菌介导。

4、所克隆的BADH基因核苷酸序列和推测的氨基酸序列与原三角叶滨藜BADHcDNA拼接序列的相同性分别为99％和96％，在核苷酸序列和推测的氨基酸序列的多个位点存在差异。对PCR产物进行多个克隆的测序分析，去除少数突变产物克隆，可以降低PCR产物直接用于基因表达等后期工作的难度。

5、三角叶滨藜海水浇灌亦能开花结实，表明其有较强的耐盐性。本发明三角叶滨藜BADH基因成功构建到pCAMBIA2301载体上，获得pCAMATBADH682植物重组表达载体，并将其转入根癌农杆菌LBA4404中，目前课题组正在用于农杆菌介导法将三角叶滨藜BADH基因转化油菜。希望通过转基因技术获得耐盐油菜新种质。

四、附图说明

图1琼脂糖电泳分析

a.以三角叶滨藜cDNA为模板，PCR扩增BADH基因分析

M.GeneRulerTMDNA Ladder Mix；A.cDNA的PCR产物

图2琼脂糖电泳分析

a.pCAMATBADH的BamHI和SacI酶切鉴定；b.LBA4404(pCAMATBADH)的PCR鉴定。

M1.λDNA/HindIII marker；M2.GeneRulerTMDNA Ladder Mix；A为pCAMATBADH682酶切产物；CK.PCR的LBA4404空菌株对照；E-G为LBA4404(pCAMATBADH682)的PCR产物。

五、具体实施方式

1.材料和方法

1.1材料

1.1.1植物材料

三角叶滨藜三角叶滨藜播种于蛭石中，经Hongland营养液培养，待幼苗长出2片真叶，部分幼苗进行盐处理，处理起始浓度为50mM NaCl，每隔3天提高50mM，直至500mM，并使苗在500mM NaCl的溶液中生长一周。

1.1.2菌种和质粒

pMD18-T Vector为TakaRa公司产品。PCAMBIA2301(Hajdukiewicz P，Svab Z，Maliga P(1994)The small，versatile Ppzp family of Agrobacteriumbinary vectors forplant transformation.Plant Mol.Biol.25：989-994)和JM109(目前生化公司有售)为本实验室所保存。LBA4404(目前生化公司有售)为南京农业大学王华忠博士提供。

1.1.3主要化学试剂和酶

Trizol kit和3S plasmid Miniprep Kit V3.1为上海申能博彩公司产品；TakaRaRNA PCR kit(AMV)ver21、RNase H、T4 DNA连接酶、LA-Taq以及BamHI和SacI等为TakaRA公司产品。DNA gel extraction Kit为Vitagene公司产品。

1.2方法

1.2.1三角叶滨藜RNA提取

取经盐处理后的三角叶滨藜幼嫩展开叶，用Trizol法抽提总RNA(参照Trizol kit说明书的方法)。

1.2.2引物设计及目的基因的扩增

根据本实验室克隆的三角叶滨藜BADH cDNA拼接序列，设计下列引物，

TBf：5’-TTCA G↓GATCCATGGCGTTTCCTATGCC-3’

BamHI

TBr：5’-TCA GAGCT↓CTAAGGAGACTTGTACCAG-3’

Sacl

以三角叶滨藜总RNA为模板，参照TakaRa RNA PCR kit(AMV)ver21提供方法进行cDNA合成及PCR扩增。

1.2.3BADH基因克隆和DNA序列测定

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA gel extraction Kit回收纯化，将回收的DNA片段插入pMD18-T载体，构建重组质粒pBADH，转化感受态大肠杆菌JM109，根据α互补原理，酶切电泳法以及PCR法筛选重组子。DNA测序由上海申能博彩公司测定，三角叶滨藜BADH基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1和推测的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；。

1.2.4植物重组表达质粒的构建

用BamHI和SacI双酶切消化pBADH以及pCAMBIA2301，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA gel extraction Kit回收纯化BADH基因片段以及线性载体片段，并用T4DNA连接酶连接两片段，然后将35S启动子和nos终止子分别构建于重组载体的BADH区段上下游多克隆位点上，获植物重组表达质粒pCAMATBADH。重组质粒转化大肠杆菌JM109，将转化产物均匀涂布于在含100mg/L Kan的LB平板上，于37℃培养14个小时。挑取单菌落，分别接种于3mL含100mg/L Kan的LB液体培养基中，于37℃下，200rpm/min振荡培养过夜；用3S plasmid Miniprep Kit V3.1抽提质粒，并进行琼脂糖凝胶电泳检验和PCR及酶切鉴定。

1.2.5植物重组表达质粒的根癌农杆菌转化

用冻融法，将植物重组表达质粒pCAMATBADH转入根癌农杆菌LBA4404，涂布于含100mg/L Kan和200mg/L Rif的YEB平板上，于28℃培养36小时。挑取单菌落，分别接种于3mL含100mg/L Kan和200mg/L Rif的YEB液体培养基中，于28℃下，250rpm/min振荡培养过夜，并进行PCR检测。

2.结果

2.1三角叶滨藜BADH基因的克隆

以本实验室克隆的三角叶滨藜BADH cDNA拼接序列设计的引物TBf和TBr，对三角叶滨藜cDNA进行PCR扩增，获得长近1.5kb特异条带(图2)。将纯化后的PCR产物与pMD18-T连接，并转化大肠杆菌JM109。单克隆的BamHI限制性内切酶酶切鉴定以及用TBf和TBr引物的PCR检测表明，已获得插有近1.5kb的外源DNA片段的克隆pBADH(图2)。测序结果显示该外源片段全长为1520bp，含有一个1501bp的ORF(表1)。其核苷酸序列和推测的氨基酸序列与菠菜和山菠菜的相同性分别为89％和95％与86％和93％与本实验室原克隆的BADH cDNA序列亦在55、239、322、327、579、706、715、1053以及1367位点存在差异，同源性为99％。

2.2三角叶滨藜BADH基因植物表达载体的构建

将上述重组质粒pBADH经Bam和Sacl酶切，将1520bp片段分别连接到pCAMBIA2301的多克隆位点BamI和SacI之间，然后将35S启动子和nos终止子分别构建于重组载体的BADH区段上下游多克隆位点上。转化感受态JM109。单克隆的限制性内切酶BamI和SacI的酶切鉴定以及用TBf和TBr引物的PCR检测，确认外源片段已插入到pCAMBI2301的多克隆位点上(图3)，其中35S和nos插入片段的PCR检测及酶切分析未显示。获植物重组表达质粒pCAMATBADH682。

2.3植物重组表达载体的根癌农杆菌LBA4404的转化

用冻融法将植物重组表达质粒pCAMATBADH682转入感受态根癌农杆菌LBA4404，挑取3个单克隆，用TBf和TBr引物进行PCR检测，得到与BADH基因大小相同的PCR产物(图3)。表明植物重组表达质粒pCAMATBADH682已转入LBA4404，命名为LBA4404(PCAMATBADH682)。

3.讨论

本发明所克隆的BADH基因核苷酸序列和推测的氨基酸序列与原三角叶滨藜BADH cDNA拼接序列的相同性分别为99％和96％，在核苷酸序列和推测的氨基酸序列的多个位点存在差异，其可能原因是BADH基因是一个多基因家族成员，这在高梁、红树、猪苋菜等上已有报道。其二是PCR扩增引入突变。采取高保真的pfu酶进行PCR扩增等措施可降低PCR的突变率。另外，对PCR产物进行多个克隆的测序分析，去除少数突变产物克隆，可以降低PCR产物直接用于基因表达等后期工作的难度。

目前梁峥、郭北海、刘凤华、何锶洁以及李银心等已分别将菠菜和山菠菜BADH基因转入烟草、小麦、草莓、水稻、玉米以及豆瓣菜中，并证明了转基因植物的BADH活性及耐盐性均高于对照。而三角叶滨藜海水浇灌亦能开花结实，表明其有较强的耐盐性。我们从三角叶滨藜中克隆的BADH基因，其推测的氨基酸序列与菠菜和山菠菜有一定的差异。本研究把三角叶滨藜BADH基因成功构建到pCAMBIA2301载体上，获得pCAMATBADH植物重组表达质粒pCAMATBADH682，并将其转入根癌农杆菌LBA4404中，获重组表达载体LBA4404(pCAMATBADH682)。油菜中亦存在BADH基因，但油菜在干旱和盐诱导下不积累BADH。因此本实验室已建立了完善的油菜不定芽再生体系及转化体系。目前正通过农杆菌介导法将三角叶滨藜BADH基因转化油菜。希望通过转基因技术获得耐盐油菜新种质。

BADH.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>江苏省农业科学院

<120>一种植物基因重组表达载体的构建方法

<130>00

<140>00

<141>2003-12-08

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1520

<212>DNA

<213>三角叶滨藜BADHgene

<220>

<221>三角叶滨藜BADHgene

<222>(1)..(1520)

<223>

<400>1

ttcaggatcc atggcgtttc ctatgcctgt tcgtcaactc ttcatcgatg gggagtggag 60

agaacccctt ttaaaaaatc gcattcccat catcaaccct tctactgaag aaatcatcgg 120

tgatattcct gctgcaactg cagaggatgt agaggttgca gtagtagcag ctagaaaagc 180

atttaagagg aacaaaggta gagattgggc tgcaacttct ggtgctcatc gtgctaaata 240

tttgcgtgct attgctgcta agataacaga aagaaaagat catttcgtta aactggaaac 300

ccttgattct ggaaaaccat tcgatgaagc cgtgttggac attgatgatg ttgcttcatg 360

ctttgaatac tttgctggtc aagcagaagc tctggatgct aaacaaaagg ctccagtcac 420

cctgcctatg gacagattta aaagtcatgt tctcaggcag cccattggtg ttgttggatt 480

aatatcccca tggaattatc cacttctaat ggctacatgg aaagttgctc ccgcacttgc 540

tgctggatgc acagctgtac ttaaaccatc agaatcggca tctgtgactt gtctagaatt 600

tggtgaagtg tgtaacgaag tgggacttcc tccaggtgtg ttgaatattt tgacaggatt 660

aggtcctgat gctggtgccc caatagtatc tcatcctgat attgataaga ttgcatttac 720

BADH.ST25

tgggagtagt gccactggaa gcaagattat ggcttctgct gcccaactag ttaagcctgt 780

tacgttagag cttggaggta aaagtcctgt tatcatgttc gaagatattg atattgaaac 840

agctgttgaa tggactcttt ttggcgtttt ctggacaaat ggtcaaatct gtagtgcaac 900

atctagactg cttttgcatg aaagtattgc agctgaattt gttgatagga tggtaaagtg 960

gacaaaaaac ataaaaattt ctgacccgtt tgaagaagga tgccgacttg gtcctgttat 1020

cagtaaagga cagtatgaca agattatgaa gtacatatca acagcaaaga gtgaaggggc 1080

tacaattttg tgtggaggct ctcgccctga gcatttgaag aaagggtatt atattgaacc 1140

caccattata actgatatta ccacatccat gcaaatatgg aaagaggaag tgtttggccc 1200

tgtcatatgt gttaaaacat ttaaaactga agatgaagcc attgaattgg caaatgatac 1260

agagtatggt ttagctggtg ccgtgttttc taaagatctt gaaagatgtg agagggtaac 1320

taaggctcta gaagttggag ctgtttgggt taattgctca caaccacgct ttgttcatgc 1380

tccatgggga ggagtgaagc gtagtggatt tggacgtgaa cttggggaat ggggtatcga 1440

gaattacttg aatatcaagc aggtgactag cgatatttct gatgaaccat ggggctggta 1500

caagtctcct tagagctctg 1520

<210>2

<211>500

<212>PRT

<213>三角叶滨藜BADH

<220>

<221>三角叶滨藜BADH

<222>(1)..(500)

<223>

<400>2

Met Ala Phe Pro Met Pro Val Arg Gln Leu Phe Ile Asp Gly Glu Trp

1 5 10 15

Arg Glu Pro Leu Leu Lys Asn Arg Ile Pro Ile Ile Asn Pro Ser Thr

20 25 30

Glu Glu Ile Ile Gly Asp Ile Pro Ala Ala Thr Ala Glu Asp Val Glu

35 40 45

Val Ala Val Val Ala Ala Arg Lys Ala Phe Lys Arg Asn Lys Gly Arg

50 55 60

Asp Trp Ala Ala Thr Ser Gly Ala His Arg Ala Lys Tyr Leu Arg Ala

65 70 75 80

Ile Ala Ala Lys Ile Thr Glu Arg Lys Asp His Phe Val Lys Leu Glu

85 90 95

BADH.ST25

Thr Leu Asp Ser Gly Lys Pro Phe Asp Glu Ala Val Leu Asp Ile Asp

100 105 110

Asp Val Ala Ser Cys Phe Glu Tyr Phe Ala Gly Gln Ala Glu Ala Leu

115 120 125

Asp Ala Lys Gln Lys Ala Pro Val Thr Leu Pro Met Asp Arg Phe Lys

130 135 140

Ser His Val Leu Arg Gln Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Ser Pro

145 150 155 160

Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Thr Trp Lys Val Ala Pro Ala Leu

165 170 175

Ala Ala Gly Cys Thr Ala Val Leu Lys Pro Ser Glu Ser Ala Ser Val

180 185 190

Thr Cys Leu Glu Phe Gly Glu Val Cys Asn Glu Val Gly Leu Pro Pro

195 200 205

Gly Val Leu Asn Ile Leu Thr Gly Leu Gly Pro Asp Ala Gly Ala Pro

210 215 220

Ile Val Ser His Pro Asp Ile Asp Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ser Ser

225 230 235 240

Ala Thr Gly Ser Lys Ile Met Ala Ser Ala Ala Gln Leu Val Lys Pro

245 250 255

Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Val Ile Met Phe Glu Asp

260 265 270

Ile Asp Ile Glu Thr Ala Val Glu Trp Thr Leu Phe Gly Val Phe Trp

275 280 285

Thr Asn Gly Gln Ile Cys Ser Ala Thr Ser Arg Leu Leu Leu His Glu

290 295 300

Ser Ile Ala Ala Glu Phe Val Asp Arg Met Val Lys Trp Thr Lys Asn

305 310 315 320

Ile Lys Ile Ser Asp Pro Phe Glu Glu Gly Cys Arg Leu Gly Pro Val

325 330 335

Ila Ser Lys Gly Gln Tyr Asp Lys Ile Met Lys Tyr Ile Ser Thr Ala

340 345 350

Lys Ser Glu Gly Ala Thr Ile Leu Cys Gly Gly Ser Arg Pro Glu His

355 360 365

Leu Lys Lys Gly Tyr Tyr Ile Glu Pro Thr Ile Ile Thr Asp Ile Thr

370 375 380

Thr Ser Met Gln Ile Trp Lys Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Ile Cys

385 390 395 400

BADH.ST25

Val Lys Thr Phe Lys Thr Glu Asp Glu Ala Ile Glu Leu Ala Asn Asp

405 410 415

Thr Glu Tyr Gly Leu Ala Gly Ala Val Phe Ser Lys Asp Leu Glu Arg

420 425 430

Cys Glu Arg Val Thr Lys Ala Leu Glu Val Gly Ala Val Trp Val Asn

435 440 445

Cys Ser Gln Pro Arg Phe Val His Ala Pro Trp Gly Gly Val Lys Arg

450 455 460

Ser Gly Phe Gly Arg Glu Leu Gly Glu Trp Gly Ile Glu Asn Tyr Leu

465 470 475 480

Asn Ile Lys Gln Val Thr Ser Asp Ile Ser Asp Glu Pro Trp Gly Trp

485 490 495

Tyr Lys Ser Pro

500

Claims

1、一种植物基因重组表达载体的构建方法，包括：

1)三角叶滨藜RNA提取

用Trizol法抽提三角叶滨藜总RNA；

2)引物设计及目的基因的扩增

TBf： 5’-TTCA G↓GATCCATGGCGTTTCCTATGCC-3’

BamHI

TBr： 5’-TCA GAGCT↓CTAAGGAGACTTGTACCAG-3’

Sacl

3)BADH基因克隆和DNA序列测定

PCR产物经1.5％(g/100ml，下文同)琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA gelextraction Kit回收纯化，将回收的DNA片段插入pMD18-T载体，构建重组质粒pBADH，转化感受态大肠杆菌JM109，根据α互补原理，酶切电泳法以及PCR法筛选重组子pBADH，DNA测序，三角叶滨藜BADH基因核苷酸序列为SEQID NO.1和推测的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；

4)植物重组表达质粒的构建

5)转化

植物重组表达质粒pCAMATBADH转化大肠杆菌JM109，将转化产物均匀涂布于在含100mg/L Kan的LB平板上，于37℃培养14个小时；挑取单菌落，分别接种于3mL含100mg/L Kan的LB液体培养基中，于37℃下，200rpm/min振荡培养过夜；用3S plasmid Miniprep Kit V3.1抽提质粒，并进行琼脂糖凝胶电泳检验和PCR及酶切鉴定，确认外源片段已插入到pCAMBIA2301的多克隆位点上，其中35S和nos插入片段的PCR检测及酶切分析未显示，即获得植物基因重组表达载体。