CN118064451A - 正调控柿脱涩的转录因子基因DkMYB6、重组表达载体、重组菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种正调控柿脱涩的转录因子基因DkMYB6、重组表达载体、重组菌及其应用，属于基因工程技术领域。该正调控柿脱涩的转录因子基因DkMYB6，所述转录因子基因DkMYB6的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提出一种上述正调控柿脱涩的转录因子基因DkMYB6在调控单宁的生物合成中的应用。本发明提出的转录因子基因DkMYB6通过调节乙醛代谢参与柿子脱涩过程实现柿子的脱涩。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种正调控柿脱涩的转录因子基因DkMYB6、重组表达载体、重组菌及其应用。
背景技术
柿果果肉单宁细胞中含有大量的缩合单宁，即原花色素(proanthocyanidin，PA)。根据其于醇溶液的溶解性差异，可分为可溶性单宁和不溶性单宁。柿单宁主要是通过公共苯丙烷-核心类黄酮-原花青素代谢通路顺序合成(Xie andDixon 2005，Akagi etal.2011)。这些代谢通路上的结构基因的功能较明晰，其遗传特性以及生化功能在众多植物中已经得到了验证(Lepiniec et al.2006)，结构基因的表达转录受转录因子的调控。
目前有关柿单宁生物合成的转录调控的报道不多，Akagi et al(2009)曾发现1个可调控日本甜柿单宁生物合成的转录因子DkMYB4，但该转录因子的上游调控网络尚不清楚；Chen et al(2021)也报道一个单宁生物合成抑制型转录因子DkMYB14，其主要促进中国甜柿中单宁的凝固过程，对非完全甜柿无效。因此，进一步挖掘柿果单宁生物合成的关键调控因子非常必要，也十分紧迫。另一方面，非完全甜柿遗传多样性丰富，现有柿品种主要为非完全甜柿，若能利用现在生物技术手段，如基因组编辑等对其进行“甜柿化”遗传改造，对我国柿产业发展将具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种正调控柿脱涩的转录因子基因DkMYB6、重组表达载体、重组菌及其应用，解决现有技术中如何实现柿子脱涩的技术问题。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种正调控柿脱涩的转录因子基因DkMYB6，所述转录因子基因DkMYB6的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施例中，所述转录因子基因DkMYB6的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些实施例中，所述转录因子基因DkMYB6的核苷酸序列由cDNA为模版进行PCR扩增获得，所述cDNA的序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提出一种重组表达载体，包含上述转录因子基因DkMYB6。
在一些实施例中，所述重组表达载体为pMDC32-DkMYB6或者pH7GWIWG2-DkMYB6重组质粒。
此外，本发明还提出一种重组菌，包括上述转录因子基因DkMYB6。
在一些实施例中，所述重组菌为介导入转录因子基因DkMYB6的农杆菌GV3101。
此外，本发明还提出一种上述正调控柿脱涩的转录因子基因DkMYB6在调控单宁的生物合成中的应用。
在一些实施例中，将上述转录因子基因DkMYB6导入柿子的活体叶片中。
在一些实施例中，将上述转录因子基因DkMYB6通过注射渗透法导入柿子的活体叶片中。
在一些实施例中，转录因子基因DkMYB6通过影响乙醛代谢调控单宁的生物合成。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：在柿子活体叶片中瞬时超表达DkMYB6，叶片中DkMYB6基因上调表达，且可溶性单宁含量降低，不溶性单宁含量增加，在柿子活体叶片中瞬时沉默表达DkMYB6，叶片中DkMYB6基因下调表达，且可溶性单宁含量增加，不溶性单宁含量降低。进一步对乙醛代谢通路相关基因表达量进行分析，发现超表达DkMYB6后，乙醛脱氢酶基因DkADH1、DkADH2、DkADH3，丙酮酸脱羧酶基因DkPDC1、DkPDC2、DkPDC3及乙烯响应因子DkERF9上调表达，而沉默表达DkMYB6后，乙醛脱氢酶基因DkADH1、DkADH2、DkADH3，丙酮酸脱羧酶基因DkPDC1、DkPDC2、DkPDC3及乙烯响应因子DkERF9下调表达。综上所述，DkMYB6是一种预测35％乙醇诱导的转录激活因子，它通过调节乙醛代谢参与柿子脱涩过程实现柿子的脱涩。
附图说明
图1是本发明实施例1‘赣方1号’果实可溶性单宁浓度和不溶性单宁浓度的变化趋势。
图2是本发明实施例1‘赣方1号’果实发育过程中DkMYB6基因表达量的变化。
图3是35％乙醇处理‘赣方1号’成熟果实后不同时间段果肉可溶性单宁和不溶性单宁含量的变化。
图4是本发明实施例1DkMYB6蛋白与不同物种MYB蛋白序列的聚类分析和DkMYB6基因的亚细胞定位分析；其中，图4A为DkMYB6蛋白与不同物种MYB蛋白序列的聚类分析；图4B为DkMYB6基因的亚细胞定位分析。
图5是本发明实施例1DkMYB6在‘赣方1号’活体叶片中瞬时表达；其中图5A是DkMYB6基因在‘赣方1号’活体叶片瞬时超表达和瞬时沉默表达后叶片中DkMYB6基因的表达量变化；图5B是可溶性单宁含量的变化；图5C是不溶性单宁含量的变化。
图6是实施例1‘赣方1号’活体叶片瞬时超表达和干涉表达DkMYB6基因后乙醛代谢相关基因DkERF9、DkADH1、DkADH2、DkPDC1、DkPDC2、DkPDC3的表达分析；图6A是DkERF9的表达分析；图6B是DkADH1的表达分析；图6C是DkADH2的表达分析；图6D是DkPDC1的表达分析；图6E是DkPDC2的表达分析；图6F是DkPDC3的表达分析；图6G是DkPDC3的表达分析。
具体实施方式
在本发明中，涉及到“一些实施例”、“本实施例”以及举例等等，其描述了所有可能实施例的子集，但是可以理解，“一些实施例”可以是所有可能实施例的相同子集或不同子集，并且可以在不冲突的情况下相互结合。
如果申请文件中出现“第一/第二”的类似描述则增加以下的说明，在以下的描述中，所涉及的术语“第一\第二\第三”仅仅是是区别类似的对象，不代表针对对象的特定排序，可以理解地，“第一\第二\第三”在允许的情况下可以互换特定的顺序或先后次序，以使这里描述的本实施例能够以除了在这里图示或描述的以外的顺序实施。
本实施例中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如对象A和/或对象B，可以表示：单独存在对象A，同时存在对象A和对象B，单独存在对象B这三种情况。
本具体实施方式提供了一种正调控柿脱涩的转录因子基因DkMYB6，所述转录因子基因DkMYB6的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施例中，所述转录因子基因DkMYB6的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些实施例中，所述转录因子基因DkMYB6的核苷酸序列由cDNA为模版进行PCR扩增获得，所述cDNA的序列如SEQ ID NO:3所示。
在本具体实施方式中，所述重组表达载体，包含上述转录因子基因DkMYB6；在一些实施例中，所述重组表达载体为pMDC32-DkMYB6或者pH7GWIWG2-DkMYB6重组质粒。
本具体实施方式还提出一种重组菌，包括上述转录因子基因DkMYB6；在一些实施例中，所述重组菌为介导入转录因子基因DkMYB6的农杆菌GV3101。
本具体实施方式还提出一种上述正调控柿脱涩的转录因子基因DkMYB6在调控单宁的生物合成中的应用；在一些实施例中，将上述转录因子基因DkMYB6导入柿子的活体叶片中；进一步地，在一些实施例中，将上述转录因子基因DkMYB6通过注射渗透法导入柿子的叶片中。
在一些实施例中，转录因子基因DkMYB6通过影响乙醛代谢调控单宁的生物合成。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例的柿子以‘赣方1号’进行相关实验。
实施例1
1.原花青素含量的定量测定
采用Folin-Ciocalteu法测定‘赣方1号’5个时期的果肉(5、10、15、20、25WAB)原花青素含量(Oshida et al.1996)。
2.RNA的提取和cDNA的合成
总RNA的提取利用RNAplant Plus(TIANGEN)试剂盒，按说明书步骤操作。RNA的纯度和完整性用1％凝胶电泳来检测，并且利用Nano Drop2000分光光度计测定其在260nm处的吸光值进行定量分析。cDNA的合成利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(TaKaRa)试剂盒，按试剂盒说明书操作。
3.qRT-PCR表达分析
D.kaki Thunb.Actin(GenBank Accession No.AB219402)作为qRT-PCR的内参基因，根据DkMYB6全长序列设计定量引物P1，qRT-PCR在480ⅡReal-Time PCR仪(Roche，Germany)上运行，利用/>Green Realtime PCR Master Mix荧光染料(Takara，Beijing)，反应体系按操作手册进行，反应程序为95℃30s，接着95℃5s，58℃10s，72℃15s，并运行45个循环，然后95℃60s，40℃30s，每个样品进行四次机械重复。
4.DkMYB6的克隆和序列分析
根据NCBI中DkMYB6设计特异引物P2，以‘赣方1号’cDNA为模板进行PCR扩增获得DkMYB6全长序列。PCR程序为94℃3min，接着94℃30s，58℃30s，72℃80s，并运行45个循环，最后进行72℃5min的延伸。扩增产物通过凝胶电泳分离，切胶回收。分离得到的DkMYB6被克隆到pEASYTM-Blunt Simple Cloning Vector(TransGenBiotech，Beijing，China)克隆载体中，获得pEASY-DkMYB6重组质粒并进行测序。cDNA的序列如SEQ ID NO:3所示。
5.生物信息学分析
SoftBerry tool
(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？topic＝fgenesplus&group＝programs&subgroup＝gfs)用于对DkMYB6编码的蛋白质序列进行预测。进化树构建利用邻位相连法在MEGA5.0上进行。
6.亚细胞定位
为了确定DkMYB6的亚细胞定位点，通过特异引物P3进行PCR扩增获得DkMYB6全长，引物包含限制性酶切位点BamHI和KpnI。PCR程序为94℃3min，然后94℃30s，58℃30s，72℃80s，并进行35个循环，最后72℃额外扩增5min。PCR产物将被连接到pCAMBIA 1302载体，形成一个DkMYB6:YFP融合质粒，通过测序确认序列准确性后，分别取2μg纯化的重组质粒和对照(pCAMBIA 1302)质粒DNA，加入200μL感受态细胞中，混匀，冰浴5min，转入液氮冷冻1min，迅速置于37℃，250r/min震荡预表达4h。离心收集菌体，以余下的200μL LB重悬浮液，用移液器吸打均匀。将200μL菌液移至LB固体选择培养基(含相应抗生素)表面，均匀涂布于整个平板。28℃培养2d，挑取单菌落进行阳性检测和下一步试验。农杆菌介导的烟草叶片遗传转化根据Kumar和Kirti的方法(2010)。转化后的烟草培养2-3天后，在荧光显微镜(NikonECLIPSE 90i)检测荧光蛋白的分布。
7.DkMYB6在‘赣方1号’叶片中瞬时表达
分别构建DkMYB6超表达载体和干涉载体。DkMYB6超表达载体采用pMDC32二元表达载体，特异引物P4含限制性酶切位点XbaⅠ和SmaⅠ，构建方法如上所述。DkMYB6hpRNA干涉载体的构建采用Gateway技术体系，分别以DkMYB6的5’序列设计特异引物P5进行PCR扩增，获得300bp左右的片段长度，并分别通过BP重组反应导入入门载体pDONRTM222和LR反应导入ihpRNA干涉载体pH7GWIWG2获得pH7GWIWG2-DkMYB6重组质粒，方法按照2XTranzymeMasterMix(BP)反应试剂盒和2X Fuzyme MasterMix(LR)穿梭克隆试剂盒说明书步骤操作。通过序列准确性验证后的重组质粒利用热激法导入农杆菌GV3101。农杆菌介导的DkMYB6在‘赣方1号’叶片瞬时超表达和瞬时干涉表达采用注射渗透法，利用1mL塑料注射器，去掉针头，吸取菌液，然后用针头在柿叶片背面轻轻划破一个小口，通过划破的小口将菌液注射渗透到叶片组织中。注射10天后，收集注射后叶片做进一步分析。
引物P1-P5的序列和编号如表1所示。
表1引物序列
结果与分析
1.柿果实单宁含量的变化
如图1所示，可溶性单宁(即Soluble PA)和不溶性单宁(即Insoluble PA)含量整体上呈现下降趋势，可溶性单宁在花后20周有一个显著性下降趋势，不溶性单宁在花后15-20周有一个轻微的上升趋势。
2.DkMYB6在‘赣方1号’果实发育过程中的表达分析
如图2所示，DkMYB6在‘赣方1号’不同发育时期果肉呈现上调趋势，其中在花后20-25周显著上调表达，与‘赣方1号’果实不同发育时期的单宁含量成负相关关系。
3.乙醇处理对‘赣方1号’果实脱涩的影响
如图3所示，用35％乙醇处理‘赣方1号’成熟期果实，其可溶性单宁浓度呈现下降趋势，处理4天后，果实完成脱涩，不溶性单宁浓度逐渐升高，在处理4天后不溶性单宁达到最大值。
4.DkMYB6聚类分析和亚细胞定位分析
如图4所示，对DkMYB6和其它物种中的MYB基因进行聚类分析，发现DkMYB6基因与DkMYB5基因聚为一类。进一步对DkMYB6进行亚细胞定位分析，发现其定位于细胞核。
5.DkMYB6在‘赣方1号’活体叶片中瞬时表达
如图5所示，其中CK表示空白对照，OE-DkMYB6表示瞬时超表达后DkMYB6的变化，SE-DkMYB6表示瞬时干涉表达后DkMYB6的变化；对DkMYB6在‘赣方1号’活体叶片中瞬时超表达后，发现‘赣方1号’活体叶片中内源性DkMYB6基因显著上调表达，单宁含量测定分析表明瞬时超表达DkMYB6后，叶片中可溶性单宁含量下降，不溶性单宁含量上升；对DkMYB6在‘赣方1号’活体叶片中瞬时干涉表达后，发现‘赣方1号’活体叶片中内源性DkMYB6基因显著下调表达，单宁含量测定分析表明瞬时干涉表达DkMYB6后，叶片中可溶性单宁含量上升，不溶性单宁含量降低。
6.乙醛代谢相关基因的表达分析
如图6所示，其中CK表示空白对照，OE-DkMYB6表示瞬时超表达后DkMYB6的变化，SE-DkMYB6表示瞬时干涉表达后DkMYB6的变化；对DkMYB6在‘赣方1号’活体叶片中瞬时超表达后，发现叶片中乙醛代谢相关基因DkERF9、ADH1、ADH2、ADH3、PDC1、PDC2、PDC3上调表达；对DkMYB6在‘赣方1号’活体叶片中瞬时干涉表达后，发现叶片中乙醛代谢相关基因DkERF9、ADH1、ADH2、ADH3、PDC1、PDC2、PDC3下调表达。上述结果表明DkMYB6可能通过影响乙醛相关基因的表达调控乙醛代谢进而导致‘赣方1号’脱涩。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种正调控柿脱涩的转录因子基因DkMYB6，其特征在于，所述转录因子基因DkMYB6的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的正调控柿脱涩的转录因子基因DkMYB6，其特征在于，所述转录因子基因DkMYB6的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的正调控柿脱涩的转录因子基因DkMYB6，其特征在于，所述转录因子基因DkMYB6的核苷酸序列由cDNA为模版进行PCR扩增获得，所述cDNA的序列如SEQ IDNO:3所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的转录因子基因DkMYB6。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pMDC32-DkMYB6或者pH7GWIWG2-DkMYB6重组质粒。
6.一种重组菌，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的转录因子基因DkMYB6。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为介导入转录因子基因DkMYB6的农杆菌GV3101。
8.一种权利要求1-3任一项所述的正调控柿脱涩的转录因子基因DkMYB6在调控单宁的生物合成中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述转录因子基因DkMYB6导入柿子的活体叶片中；和/或，转录因子基因DkMYB6通过影响乙醛代谢调控单宁的生物合成。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述的转录因子基因DkMYB6通过注射渗透法导入柿子的活体叶片中。
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