CN107236740A - 梨PbrmiR397a及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了梨PbrmiR397a及其应用。一种分离自‘砀山酥梨’具有调控梨果实石细胞发育的microRNA基因(PbrmiR397a)，其前体核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。通过农杆菌介导遗传转化方法将PbrmiR397a转化烟草，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PbrmiR397a基因具有减少木质素合成的功能。PbrmiR397a基因的发现，为减少木质素合成的分子育种提供新的基因资源。由于PbrmiR397a基因具有同时靶向调控多个基因的优点，为分子育种提供更高效地途径。

Description

梨PbrmiR397a及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及梨PbrmiR397a及其应用，具体涉及从‘砀山酥梨’中分离、克隆得到一个调控梨果实石细胞发育的microRNA基因(PbrmiR397a)及其应用。

背景技术

中国每年的梨产量占到了全球产量的60％以上。但由于果实品质较差，梨的出口量只占全世界梨出口量的15％左右，而且出口价格明显低于平均出口价格。梨石细胞含量是影响梨果实品质的重要因素之一。梨果实石细胞是由薄壁细胞在其细胞壁上沉积了大量木质素而形成的厚壁细胞。因此木质素的合成是影响石细胞发育的关键因素[1]。

木质素的含量与组成在不同植物、组织、细胞和亚细胞位置差异很大，且受发育阶段和环境的影响[2]。双子叶植物中主要是G-木质素和S-木质素，并有微量的H-木质素；单子叶植物中G-木质素和S-木质素含量差不多，并含有比双子叶植物多的H-木质素。通常G-木质素和 S-木质素的含量要比H-木质素多。木质素不易进行化学降解，其含量直接影响作物转化为生物燃料和纤维质产物的能力[3]。

木质素的研究已在多种植物中广泛开展，包括模式植物拟南芥、林木植物(杨树、桉树)、作物(玉米、苜蓿、水稻、柳枝稷、甘蔗)以及少量的果蔬(竹笋、枇杷)等，但不同植物的木质素相关研究目的不尽相同。拟南芥作为模式植物，主要用于开展一些基础研究；桉树等林木植物作为造纸原料，柳枝稷、甘蔗等作为生物能源植物，木质素含量是制约其产物转化的重要因素，因此，研究目标在于获得积累较少木质素的植株或是形成更容易被化学方法降解的木质素[4]。

MicroRNAs(MiRNAs)是近年来备受关注的一类非编码RNA，它在生物中广泛存在，长度为19-25nt。在植物中，由具有茎环结构的miRNA前体经过DCL1(Dicer-like1)酶的两步切割产生成熟miRNA。成熟miRNA与Argonaute蛋白结合进入RNA诱导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex,RISC)，通过碱基互补配对的方式与靶基因的mRNA结合导致靶基因的表达被抑制，其作用机制主要包括引起靶基因mRNA降解和抑制翻译两种情况。miRNA在生物体的不同发育阶段和不同部位，存在着时间上和空间上的特异表达，对生物体的转录后基因调控起着关键作用[5]。随着园艺植物miRNAs研究的不断深入，越来越多的证据表明miRNA在园艺植物生长发育，以及响应生物胁迫与非生物胁迫方面都起着重要的调节作用。

有关miRNAs调控木质素的研究最早出现在Acacia mangium上。通过对Acaciamangium 高木质素含量(41％)和低木质素含量(21％)次生木质部的两个样品进行高通量测序，得到了两个miRNAs数据库。经过比较发现这些miRNAs预测的靶基因为一些转录因子，而这些转录因子在木质素的合成过程中，起着重要的作用[6]。随后又发现在Acaciamangium中，有 6个高度保守的miRNAs家族参与次生细胞壁的合成。其中miR 166家族在韧皮部和木质部中表达量上存在着巨大的差异。MiR 166家族的miRNAs预测的靶基因(HD-ZIPIII、C4H、CAD、 CCoAOMT)在木质素的合成过程中，担任着重要的角色[7]。在木本植物的模式植物毛果杨 (Populus trichocarpa)中，miR 397的靶向基因为49个漆酶基因。MiR 397过量表达的转基因毛果杨中，漆酶基因的表达量全部下调，而且与野生型相比茎干中木质素含量下降40％[8]。

有关MiRNAs的大部分信息来源于模式作物，如拟南芥、杨树等，但有关果树的MiRNAs 的研究则非常有限。本发明以‘砀山酥梨’为试材，利用同源克隆技术，克隆得到梨PbrmiR397a 基因的前体序列，构建过量表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化烟草使其过量表达，证明其可能参与烟草茎杆维管束的发育，从而扩展了梨果实石细胞形成的分子调控途径。另外，克隆梨中调控木质素合成的基因很大程度上提高作物改良和育种的效率，对农业生产也具有非常重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种调控梨果实木质素合成的PbrmiR397a基因。

本发明的另一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

分离来自‘砀山酥梨’具有调控梨果实木质素合成的PbrmiR397a基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，包含107nt的前体核苷酸序列。

含有本发明所述PbrmiR397a基因的重组表达载体。

所述的重组表达载体，优选以pCAMBIA1301为出发载体，所述PbrmiR397a基因的插入位点为Bgl II和BstE II之间。

含有本发明所述PbrmiR397a基因的宿主菌。

克隆本发明所述PbrmiR397a基因序列的引物对，上游引物PbrmiR397a-F1序列如SEQ ID No.2所示，下游引物PbrmiR397a-R1序列如SEQ ID No.3所示。

本发明所述的PbrmiR397a重组过量表达载体在减少烟草木质素合成的应用。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1.PbrmiR397a基因的发现，为减少木质素合成的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。

2.通过农杆菌介导遗传转化方法将miRNA转化烟草，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PbrmiR397a基因具有同时靶向抑制多个基因表达的功能，从而减少烟草木质素合成的功能。PbrmiR397a基因这种能同时调控多个基因的优点，为分子育种提供更高效地途径。

附图说明

图1为本发明PbrmiR397a基因前体序列形成的stem-loop结构图。

图2为本发明pCAMBIA1301-PbrmiR397a载体结构示意图。

图3为PbrmiR397a基因转基因植株PCR鉴定图。其中，利用PbrmiR397a基因特异引物PCR 鉴定烟草转基因植株。M：DL 2000Marker，1：阳性对照，2：阴性对照，3，野生型烟草，4-23：转基因株系；具有特异条带的为转基因植株，没有特定条带的为假阳性植株。

图4为本发明PbrmiR397a基因在转基因植株的基因表达量分析图。WT为野生型，其余编号：转基因株系。

图5野生型及转基因烟草植株组织学分析。其中：WT：野生型；397a为转基因株系。

(a)-(d)为甲苯胺蓝染色，(e)-(f)405nm下木质素的自发荧光，(g)-(h)透射电镜示意图

图6野生型及转基因烟草植株木质部切片分析。

(a)木质部宽度，(b)木质部细胞次生细胞壁厚度。*表示差异显著，**表示差异极显著。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1 PbrmiR397a基因分离克隆

从‘砀山酥梨’叶片中抽提DNA，用于扩增PbrmiR397a基因前体序列。

DNA抽提使用植物基因组提取试剂盒(购自成都福际，按照该试剂盒提供的操作说明书操作)。扩增基因引物对为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。50μL的反应体系中包括200ngDNA， 1×缓冲液(TransStart FastPfu Buffer)，10mM dNTP，1U Taq聚合酶(TransStartFastPfu DNA Polymerase)(前述缓冲液和Taq聚合酶购自TRANS公司)，500nM上述引物。PCR反应在 eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性2分钟，95℃变性20秒，60℃退火20秒， 72℃延伸30秒，35个热循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。产生一条单一PCR条带产物。

PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用小量胶回收试剂盒(购自康为世纪，按照该试剂盒提供的操作说明书操作)回收DNA片段。回收纯化的DNA溶液与pEASY载体(购自Trangen公司)进行连接反应，按说明书步骤操作。连接反应体系总体积是5μL，其中包括4.5μL纯化的PCR产物，0.5μL T载体。16℃连接10分钟。取5μL连接产物，采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L 氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序(由上海英俊生物技术有限公司完成)。测序结果表明，PbrmiR397a基因前体序列全长为107nt，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，用在线软件Sfold(http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.pl)预测二级结构，发现能够形成茎环结构(图1)。

实施例2 植物转化超表达载体的构建

对pCAMBIA-1301载体的多克隆位点和PbrmiR397a基因的前体序列上的酶切位点分析，选择Bgl II和BstE II作为内切酶。按照一般设计引物的原则用Primer Primer 3.0软件设计出带有酶切位点的引物，其引物对序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。以测序正确的保存菌液提取质粒为模板，进行含限制性酶切位点基因的克隆。PCR扩增的退火温度为60℃，PCR反应体系及扩增程序同实施例1。回收目的条带，再连接pEASY载体上。双酶切体系总体积为 40μL，其中含有pEASY-PbrmiR397a质粒12μL，10×K Buffer(购自NEB公司)4μL，Bgl II 0.8μL，BstE II 0.8μL及水22.2μL。pCAMBIA1301载体的双酶切体系总体积为40μL，其中含有经过质粒提取获得的pCAMBIA1301载体DNA 8μL，10×K Buffer(购自NEB公司)4μL， Bgl II 0.8μL，BstE II 0.8μL及水26.2μL。于37℃酶切2小时后回收。经过限制性内切酶消化过的表达载体pCAMBIA1301与PbrmiR397a基因使用T4 DNA连接酶(购自NEB公司) 于16℃连接14-16小时。反应总体积5μL，其中含有10×T4 DNALigase Buffer 0.5μL，T4 DNALigase 0.5μL，PbrmiR397a基因的双酶切回收产物3.5μL，pCAMBIA1301载体的双酶切回收产物0.5μL。取连接产物5μL转化大肠杆菌感受态DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选出阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序结果确定碱基突变，获得含有插入目的片段的重组载体，将其命名为pCAMBIA1301-PbrmiR397a重组载体，构建完成的载体图见图2所示。应用冻融法将重组载体导入到农杆菌GV3101中。

实施例3 烟草的遗传转化及转化植株分子鉴定

根癌农杆菌介导的烟草遗传转化具体步骤参照黄小三博士毕业论文(2012)[9]。按照上述方法得到转PbrmiR397a的烟草植株，采用小量法提取烟草植株叶片的总DNA，以此为模板，采用克隆引物对进行PCR扩增，鉴定阳性苗。反应程序：94℃变性3分钟，94℃预变性30 秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环，循环完成后72℃延伸10分钟。烟草转基因植株鉴定见图3。

转基因烟草PbrmiR397a表达水平分析：

转基因烟草外源基因表达量采用荧光定量q-PCR进行表达水平分析。选取相同发育阶段的经PCR鉴定为阳性烟草植株与野生型烟草植株茎干的第二个节为材料，提取总RNA并反转录为cDNA，荧光定量检测靶基因的表达量。所用引物为基因特异引物对：SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3；以U6为内参基因，引物由试剂盒提供(购自TaKaRa公司)。Real-timePCR所用仪器为Roche 480定量PCR仪，反应体系为：2×SYBR GreenI Master Mix 10μL，上下游引物(10 μM)0.4μL，2μLcDNA，7.2μLPCR级别的水。反应条件为95℃变性5min；95℃预变性5s，60℃退火5s，72℃延伸10s重复45个循环；熔解曲线分析65℃到95℃，每5s升高1℃：。荧光定量PCR分析结果如图4所示，目的基因在转基因株系中超量表达，野生型中没有表达。可以看出，目的基因确实已经整合到了烟草植株中，选取397a-3、4、8、11用于随后的功能的研究。

实施例4 转基因植株的表型观察

(1)转基因植株表型观察

本专利对转基因烟草茎干的木质素含量进行测定，发现超表达植株茎杆木质素含量下降了 19％-34％(表1)。

表1 PbrmiR397a过表达烟草植株木质素含量测定

以WT1的木质素含量为100，标准化其他株系的木质素含量。

(2)转基因烟草茎干解剖结构观察

本实验选取转基因阳性植株和野生型植株茎干的第二个节为材料，制备石蜡切片及电镜切片，用于观察转基因烟草与野生型烟草植株茎干解剖结构的差异。结果表明，PbrmiR397a过表达植株中维管束组织细胞数目减少(图5a-d和图6a)。405nm紫外光下，发现野生型烟草的木质部有更多的木质素自发荧光(图5e,f)。PbrmiR397a过表达植株木质部细胞的次生细胞壁更薄(图5g,h和图6b)。

(3)PbrmiR397a超表达影响木质素合成相关基因的表达

为了从木质素合成出发，寻找控制其产生的分子机理，以野生型烟草为对照，对正常生长条件下的转基因烟草株系397a-8的木质素合成相关基因进行q-PCR检测(表2),引物序列见表3。结果显示，转基因株9个laccase基因表达量相对于野生型烟草下降28-90％，但与laccase 基因有相似功能的PRX、POD基因表达量有所上升，其他木质素合成结构基因表达量差别不大。因此推测PbrmiR397a基因的过表达主要抑制多个laccase基因的表达，使其不能氧化木质素单体使其形成高聚合的木质素，从而影响木质素的合成。

表2 转基因株系397a-8和野生型烟草木质素合成相关基因表达量检测

表3 用于q-PCR检测的引物

主要参考文献

1.Smith WW:THE COURSE OF STONE CELL FORMATION IN PEAR FRUITS.PlantPhysiology 1935,10(4):587.

2.Campbell MM,Sederoff RR:Variation in Lignin Content and Composition(Mechanisms of Control and Implications for the Genetic Improvement ofPlants).Plant Physiology 1996,110(1):3.

3.Ambavaram MM,Krishnan A,Trijatmiko KR,Pereira A:Coordinatedactivation of cellulose and repression of lignin biosynthesis pathways inrice.Plant Physiology 2011,155(2):916.

4.Schubert C:Can biofuels finally take center stage？NatureBiotechnology 2006,24(24):777-784.

5.Bartel DP:MicroRNA Target Recognition and Regulatory Functions.Cell2009,136(2):215-233.

6.Ong SS,Wickneswari R:Expression profile of small RNAs in Acaciamangium secondary xylem tissue with contrasting lignin content-potentialregulatory sequences in monolignol biosynthetic pathway.BMC genomics 2011,12Suppl 3:S13.

7.Ong SS,Wickneswari R:Characterization of microRNAs expressed duringsecondary wall biosynthesis in Acacia mangium.PloS one 2012,7(11):e49662.

8.Lu S,Li Q,Wei H,Chang M-J,Tunlaya-Anukit S,Kim H,Liu J,Song J,SunY-H,Yuan L:Ptr-miR397a is a negative regulator of laccase genes affectinglignin content in Populus trichocarpa.Proceedings of the National Academy ofSciences 2013,110(26):10848-10853.

9.黄小三:枳抗逆基因的克隆及功能鉴定.华中农业大学；2011。

<110> 南京农业大学

<120> 梨PbrmiR397a及其应用

<160> 5

<210> 1

<211> 107

<212> DNA

<213> ‘砀山酥梨’

<220>

<223> PbrmiR397a前体序列

<400> 1

tgaagaaaca tcattgagtg cagcgttgat gaaagtccgt attccttacg aatcttcatt 60

aggcatcgga aactttcgtc agcgctgcac ccaattatgt ttctatc 107

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PbrmiR397a-F1

<400> 2

gaagaaacat cattgagtgc agc 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PbrmiR397a-R1

<400> 3

atagaaacat aattgggtgc agc 23

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PbrmiR397a-F2

<400> 4

cagatcttga agaaacatca ttgagtgcag c 31

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PbrmiR397a-R2

<400> 5

gggtaaccga tagaaacata attgggtgca gc 32

Claims (7)

1.一种分离自‘砀山酥梨’具有调控梨果实石细胞发育的microRNA基因PbrmiR397a，其前体核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.含有权利要求1所述基因的重组表达载体。

3.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于以pCAMBIA1301为出发载体，权利要求1所述基因的插入位点为Bgl II和BstE II之间。

4.含有权利要求1所述基因的宿主菌。

5.克隆权利要求1所述基因序列的引物对，其特征在于上游引物PbrmiR397a-F1序列如SEQ ID No.2所示，下游引物PbrmiR397a-R1序列如SEQ ID No.3所示。

6.权利要求1所述的基因在抑制烟草茎杆木质素合成中的应用。

7.权利要求3所述的重组表达载体在抑制烟草茎杆木质素合成中的应用。