CN110564726A - 草莓长链非编码rna-frilair及其在果实成熟中的应用 - Google Patents

草莓长链非编码rna-frilair及其在果实成熟中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种草莓长链非编码RNA‑FRILAIR及其在果实成熟中的应用，所述的FRILAIR核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过RT‑PCR证实了FRILAIR的客观存在，且克隆草莓长链非编码RNA‑FRILAIR全长转录本，并构建过表达载体瞬时转化草莓，过表达FRILAIR后促进草莓果实成熟；草莓长链非编码RNA‑FRILAIR序列中含有一个miR397结合位点，而过表达突变或删除了miR397结合位点的FRILAIR并不能促进草莓果实成熟，如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。这表明过表达草莓长链非编码RNA‑FRILAIR可以促进草莓果实成熟。

Description

草莓长链非编码RNA-FRILAIR及其在果实成熟中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术以及遗传学领域，具体涉及确定一种草莓长链非编码RNA-FRILAIR及其在果实成熟中的应用。
背景技术
长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是一种广泛存在于动植物体内的非编码RNA。在哺乳动物中，长链非编码RNA可以在染色质状态的控制、基因转录和转录后mRNA的加工等方面发挥重要调控作用。此外，生物信息学分析也揭示了长链非编码RNA在植物的多种生物学过程中具有重要调控功能。例如，在拟南芥中，核糖体相关的长链非编码RNA参与mRNA丰度和翻译调控；在番茄中，长链非编码RNA参与抵制致病疫霉(P.infestans)侵染；在草莓(Fragaria vesca)中，长链非编码RNA参与调控果实发育。
果实成熟是一个复杂的过程，其中包括代谢和生理特性的变化。新的证据表明，长链非编码RNA在果实成熟过程中也发挥着重要作用。在番茄中，通过病毒介导的基因沉默系统(VIGS)敲低lncRNA1459和lncRNA1840，可以延缓果实成熟。在沙棘果中，沉默两种长链非编码RNA(LNC1和LNC2)影响其果实成熟过程中花青素的合成。草莓是一种非呼吸跃变型水果，具有典型的成熟过程。已有研究表明，脱落酸(ABA)生物合成和分解代谢相关蛋白编码基因参与草莓果实成熟过程，如FaNCED1和FveCYP707A4a。通过生物信息学分析，在林地草莓花期和果实发育过程中也发现了lncRNAs的存在，但其在果实成熟过程中的潜在作用尚未系统研究。因此我们深入挖掘草莓果实成熟相关的长链非编码RNA，并研究其在草莓果实成熟过程中的作用，从而为今后植物lncRNAs的调控机制研究奠定基础。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一个草莓果实成熟相关的长链非编码RNA-FRILAIR，探索其在草莓果实成熟过程中的作用机制，进而应用该长链非编码RNA调节草莓果实成熟的时期以及培育草莓新品种。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种草莓果实成熟相关的长链非编码RNA，其为lncRNA-FRILAIR，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明的第二方面，提供含有上述草莓长链非编码RNA的植物过表达载体。
进一步，本发明还提供包含上述植物表达载体的重组菌。
本发明的第三方面，提供上述草莓长链非编码RNA、植物表达载体或重组菌在促进果实成熟中的应用。
本发明的第四方面，提供一种促进果实成熟的方法，包括：将本发明第一方面所述的基因或者第二方面所述的重组表达载体导入植物或者植物组织并使所述的基因表达。所述的植物为草莓。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明首次从草莓中分离得到一个与草莓果实成熟相关的长链非编码RNA-FRILAIR。本发明的lncRNA-FRILAIR可作为基因资源在农业上使用或者选育转基因植物以缩短果实成熟周期，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为lncRNA-FRILAIR的结构示意图；
图2为克隆lncRNA-FRILAIR的扩增结果，其中lncRNA-FRILAIR的PCR扩增片段1520bp，FV1-3表示所选的三个不同发育时期的草莓果实，GSP表示特异性引物(Genespecific primer)，ACTIN表示内参基因；
图3为FRILAIR序列突变miR397结合位点示意图；
图4为过表达载体pCAMBIA1300-FRILAIR的菌落PCR结果，所用DNA marker为Plus II；
图5为过表达载体pCAMBIA1300-FRILAIR mut1的菌落PCR结果，所用DNA marker为Plus II：
图6为过表达载体pCAMBIA1300-FRILAIR mut2的菌落PCR结果，所用DNA marker为Plus II：
图7为qPCR扩增鉴定FRILAIR过表达果实的结果；
图8为qPCR扩增鉴定FRILAIR mut1和FRILAIR mut2过表达果实的结果；
图9为瞬时过表达阳性植株表型。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，lncRNA与植物的多种生长发育过程密切相关，但与草莓果实成熟相关的lncRNA还未见报道。基于此，本发明的目的是提供一种草莓成熟相关的长链非编码RNA-FRIIAIR。
本发明运用高通量测序技术(RNA-Seq)，对不同成熟阶段的草莓果实进行转录组测序，其中每个样品均构建rRNA-depleted library和poly(A)-depleted library两种文库，以便获得更全面的lncRNA测序结果。从中筛选到一个与草莓果实成熟相关的长链非编码RNA-FRILAIR，序列分析发现lncRNA-FRILAIR具有一个miR397结合位点，其序列长度为1520bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，属于lincRNA。
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.1所示多核苷酸的变体，只要其与该核苷酸具有90％以上一致性，且具有相同的功能，则均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。
本发明还克隆了lncRNA-FRILAIR转录本序列，通过Kpn I和Xba I酶切位点将lncRNA-FRILAIR连接入表达载体pCAMBIA1300，再经测序鉴定。用农杆菌GV3101介导侵染草莓果实，通过分子检测，获得瞬时过表达FRILAIR的转基因草莓果实。结果证实，过表达lncRNA-FRILAIR后促进草莓果实成熟。
根据FRILAIR的转录本序列设计引物，分别构建过表达突变或删除miR397结合位点的FRILAIR mut1/2载体，以相同的方法注射到草莓果实，结果证实，过表达FRILAIRmut1/2的草莓果实未呈现明显早熟表型。
综上所述，运用植物过表达载体，使草莓成熟相关的长链非编码RNA-FRILAIR表达量增加，可以促进草莓果实成熟。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的实验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规实验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
实施例1：lncRNA-FRILAIR的克隆
1.材料与试剂
1.1材料
本实验所用草莓为二倍体草莓(Fragaria vesca，F.vesca)。
1.2试剂
Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit和反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix购自全式金公司；零背景pTOPO-Simple克隆试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；TRizol reagent、III First-Strand Synthesis System购自Invitrogen公司，Ex Taq polymerase、RNase-free Water购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖回收试剂盒购自Omega公司；Phusion High-Fidelity PCR Master Mix购自ThermoFisher公司。
2.实验方法
2.1 lncRNA的转录组测序
为了研究与草莓成熟相关的lncRNA，我们以模式植物二倍体草莓(Hawaii4)为研究对象，分别采集未成熟时期果实(green achene，18-20 DPA，Fv1)，成熟果实(yellowachene，21-23 DPA，Fv2)，成熟后果实(brown achene，25-28 DPA，Fv3)等三个时期的草莓果实组织进行二代测序，每个时期都有三个生物学重复。
根据Trizol方法提取三个时期草莓果实总RNA后，将所提取的RNA用NanoPhotometer分光光度计检测其纯度(IMPLEN，CA，USA)和用3.0Flurometer(LifeTechnologies，CA，USA)检测RNA样品浓度，同时用安捷伦2100 RNA Nano 6000 Assay Kit(Agilent Technologies，CA，USA)检测RNA的质量，保存数据备用。RNA-seq委托北京安诺优达基因科技有限公司进行，所有样品均进行rRNA-depleted library和poly(A)-depletedlibrary cDNA文库构建，通过Illumina Hiseq 2500平台进行文库测序，并产生150bp配对末端读数。
2.2 lncRNA-FRILAIR的检测
2.2.1总RNA提取
以三个发育时期的草莓果实组织作为对象，草莓总RNA提取参照TRizol使用说明书，具体操作如下：
称取100mg植物材料，用液氮研磨成粉末，并加入1mL Trizol，剧烈涡旋，常温静置5min；加入200μL氯仿，涡旋1min，常温静置5min；4℃，12000rpm离心15min；取500μL上清液到一个新的1.5mL EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀1min，常温静置5min；4℃，12000rpm离心10min；倒掉上清夜(用小枪头吸进上清液)，加入1mL75％乙醇；重复以上两个步骤；4℃，12000rpm离心10min；将上清小心倒掉，于通风橱放置2-3min，使得酒精挥发完全；用30-50μL DEPC水溶解，混匀，可存于-80℃备用。
2.2.2用DNase I消化总RNA中的基因组DNA
按照上述反应体系，37℃反应30min；放冰上2min，补RNA-free水到400μL，加入400μL氯仿，涡旋混匀，25℃放置5min；4℃，12000rpm离心15min；取350μL上清到一个新的1.5mLEP管中，加入1/10体积的5M NaAc(pH 5.2)，再加入2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜；4℃，12000rpm离心15min；小心倒尽上清，加入1mL 75％乙醇；4℃，12000rpm离心15min；重复上述两个步骤；4℃，12000rpm离心15min；舍弃上清液，尽量除尽液体后25℃室温晾干10mini用20μL RNase-free水溶解RNA，混匀；用NanoDrop测浓度，可存于-80℃或-20℃备用；以此RNA为模板扩增内参基因或者其他基因，如果没有条带扩增出来，表明基因组DNA被消化完全。
用NanoPhotometer测定所提总RNA的OD260、OD280和OD230，记录RNA浓度。取约1μg所提取总RNA样品用1％琼脂糖凝胶电泳方法检测总RNA完整度。
2.2.3引物设计
根据lncRNA-FRILAIR的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，通过Primer 5.0软件设计PCR引物，产物长度在1500bp左右，使用ACTIN作为内参基因，引物序列如下：
2.2.4反转录反应
以提取的总RNA(1μg)为模板，按照全式金TransScript One-Step cDNASynthesis SuperMix说明书加好反应体系，置于42℃ 30min，85℃ 5s，获得cDNA备用。
2.2.5 lncRNA-FRILAIR转录本克隆
使用高保真酶2×Phusion High-Fidelity PCR Master Mix克隆lncRNA-FRILAIR，反应体系和反应程序如下：
试剂 加入体积(μL)
cDNA 0.5
2×Phusion High-Fidelity PCR Master Mix 10
10μM Forward Primer 1
10μM Reverse Primer 1
RNA-free H<sub>2</sub>O 补到总体积20μL
step1：94℃ 3min
step2：94℃ 30sec
step3：55℃ 30sec(根据各引物退火温度更改)
step4：72℃ 1min(根据扩增片段长度更改，1kb/30sec)
Repeat step 2-4 35 cycles
stpe5：72℃ 10min
step6：12℃ 保温
接下来我们使用逆转录(RT)-PCR来验证RNA-seq分析的结果，可通过oligodT和基因特异性引物扩增到FRILAIR cDNA，且在三个不同发育时期(Fv1-Fv3)均有表达(图1)，进一步说明FRILAIR具有polyadenylation结构。待PCR设定程序结束后，取样跑1％琼脂糖凝胶，然后用ChemiDocTM MP-Bio-Rad凝胶成像系统观察胶图(图4)，将凝胶上相应大小条带切下来，用Takara Gel Extraction Kit进行PCR产物胶回收，最后加入30μL无菌ddH2O洗脱，得到样品后用分光光度计检测浓度，4℃备用或者-20℃保存。
2.2.6鉴定核苷酸序列
根据pEASY-Blunt Zero Cloning Kit说明书，加入4μL回收产物和pEASY-BluntZero Cloning vector 1μL，轻轻混合，25℃反应5min，置于冰上1min后，直接转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，平板置于37℃过夜培养，挑取单克隆培养10-12h，进行菌液PCR检测，提取阳性单克隆的质粒，送至北京擎科生物公司测序鉴定，证实该lncRNA-FRILAIR真实存在。
实施例2：瞬时过表达lncRNA-FRILAIR
1.材料与试剂
1.1材料
本实验所用草莓为八倍体草莓(Fragaria×ananassa Duch.，Falandi)。
1.2试剂
M519培养基购自PhytoTechnology Laboratories，乙酰丁香酮(Acetosyringone)购自Sigma，ClonExpress II One Step Cloning Kit购自诺唯赞生物科技有限公司，质粒提取试剂盒购自Omega。
2.实验方法
2.1 lncRNA-FRILAIR过表达载体构建
其中，FRILAIR含有一个miR397靶点(图2)，据报道miR397参与水稻种子发育与梨果实发育。为了验证FRILAIR和miR397之间是否存在关系，我们对FRILAIR序列中的miR397结合位点进行突变，FRILAIR mut1表示突变miR397结合位点序列上部分核苷酸，FRILAIRmut2表示删除21bp miR397结合位点(图3)，序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
将植物过表达载体pCAMBIA1300用KpnI和XbaI线性化后，用ClonExpress II重组酶将测序正确的FRILAIR序列片段连接到该载体上，37℃反应30min，随后转化大肠杆菌，取适量菌液涂布相应抗性的LB平板，平板置于37℃过夜培养，挑取单克隆培养10-12h，进行菌液PCR检测(图4，pCAMBIA1300-FRILAIR；图5，pCAMBIA1300-FRILAIR mut1；图6，pCAMBIA1300-FRILAIR mut2)，提取阳性单克隆的质粒，送至北京擎科生物公司测序鉴定。质粒提取按照质粒提取试剂盒说明书(Omega)进行。
2.2 lncRNA-FRILAIR过表达载体转化农杆菌
将上述提取的pCAMBIA1300-FRILAIR质粒转化至农杆菌GV3101，每50μL感受态加入约1μg质粒，用手轻轻拨打管底混匀，依次于冰上静置10min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min，随后加入800μL无抗性LB液体培养基，于28℃振荡培养3小时。取100μL菌液涂布在相应抗性的LB固体平板上，平板倒置于28℃培养48h后挑取单克隆进行PCR扩增鉴定。
2.3农杆菌注射草莓果实
将上述pCAMBIA1300-FRILAIR农杆菌进行摇菌培养(含有卡那霉素和利福平的LB培养基)，28℃振荡培养过夜，第二天4000rpm离心5min收集菌，随后用悬浮液(10mM MgCl2、10Mm MES、20μM Acetosyringone)悬浮至OD600为1.0。将悬浮菌置于室温下1-3h后用于草莓果实注射。用注射器针头直接将菌液注射到法兰蒂草莓(Falandi)大绿期果实(BG)中。用塑料盖住植株，在黑暗的光线下培养48h后，置于正常光照条件下继续培养五天。
实施例3：lncRNA-FRILAIR OE植株表型鉴定
1.材料与试剂
1.1材料
八倍体草莓(Fragaria×ananassa Duch.，Falandi)
1.2试剂
TB Green Advantage qPCR premixes购自大连宝生物工程有限公司。
2.实验方法
2.1.引物设计
根据lncRNA-FRILAIR的核苷酸序列，通过Primer 5.0软件设计qPCR引物，产物长度在150-200bp左右，使用GAPDH作为内参基因，引物序列如下：
2.2.Quantitative real time PCR
提取上述瞬时过表达FRILAIR果实的RNA(方法同实验例1)，以cDNA为模板使用TBGreen Advantage qPCR premixes试剂盒在Bio Rad CFX96定量PCR仪上进行实时定量PCR反应，检测FRILAIR的表达水平，以GAPDH为内参基因，验证基因过表达的有效性。在冰上配制如下反应体系：
试剂 加入体积(μL)
Total RNA 1μg
TB Green premixes 10
10μM Forward Primer 1
10μM Reverse Primer 1
RNA-free H2O 补到总体积20μL
荧光定量PCR以两步法，扩增程序为95℃ 30s预变性，95℃ 15s、55℃ 30s进行PCR反应45个循环，最后进行熔解曲线分析，获得Ct值。草莓GAPDH基因表达量作为标准内参，以2^-ΔΔCt衡量每个样品中的基因表达的相对水平，每个样品三个生物学重复，每个生物学重复进行三次技术重复。
2.3.实验结果
根据qPCR结果，FRILAIR OE果实中FRILAIR的表达量显著增加(P＜0.05，two-sample Independent t-test)(如图7)，而FRILAIR mut1和FRILAIR mut2果实中FRILAIR的表达量显著增加(P＜0.05，two-sample Independent t-test)(如图8)。有趣的是，相比对照组，过表达FRILAIR可以促进草莓果实成熟(如图9)，与对照组相比，过表达FRILAIR mut1和FRILAIR mut2并不影响草莓果实成熟(如图9)。这进一步说明了FRILAIR在草莓果实成熟过程中发挥着重要作用，且与miR397的调控密切相关。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 南昌大学
<120> 草莓长链非编码RNA-FRILAIR及其在果实成熟中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1520
<212> DNA
<213> 草莓(Fragaria vesca)
<400> 1
ctgaccaatc acaagtcatg ccatctcctt ttttttttca gcaaacttgt gcgtccgcaa 60
ccgctaagtt tttttttttt tccagcaaac ttgtgcgtct gaaatctgat tcacctgtct 120
ttaagtattc ataagctgtt ttgattcaat gttataatta accgtagtag atcaatatta 180
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtatgaagta tgagctgatt tggtgatgaa cagatgagat acgagtgtcc ttgcctccta 540
gactcacatt ggggttttct ttgctaggtg cgtgcgctga ggttgagcct tgattaggag 600
cccagtttga cctcaaagta tagacaaaca acacccaatc gccggaacct gaacggctgc 660
accgaactgc accaaccaag gtgatcggtt tccgtctggg tttattgagt gtagtcattc 720
gtgaacacct cacaaatcga ttagtactgg tacatataac atgtaaatta gttataaatc 780
aaaacaacta aacaatgtgt gttcattgat ctagcacttc tctttttaaa aagtcatgat 840
ttcatttttc agacaaaaaa aaaaagtcaa ccgtcacttt tcctcatcaa catccaacat 900
tttgggaaga aaaatgctat caacaagaat agagttagct agaacaatac atgagagtat 960
atgacaccat agtttttcac aatcatgata tacattctga gaatctcaat gttgaaaaaa 1020
atgtgtctaa tgaaaacact tactgtccag aaggaataga aacataattg ggtgcagcgt 1080
tgatgaaatt gcctccagct cgcctccatg aagatcatcg gaactcggaa acgaaactaa 1140
ggacttgaag atccgacgag tgtaagtcgt ttcttcattc tgaaacctcc ggtgccatat 1200
aaaccgagct cgaccaattc tataggtctg atactgatgc ttcttttata attggctgta 1260
gcaatagatt caagaaggta gtacacagta cacacagaga ctttgtacgt atggaatatc 1320
gaccttgctt gtactatcat ttcatcttcc caaacgctac ctcttttatg gctgcacgtt 1380
tctctgtact aggtgtatgg tagttgtact acatttccac ctactgaaaa taatttggaa 1440
acgaattttc tgtgcttgct atttgctttc tctggcttat ttcaatccta ccccgtttac 1500
aaactaaaag catgttattc 1520
<210> 3
<211> 1499
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgaccaatc acaagtcatg ccatctcctt ttttttttca gcaaacttgt gcgtccgcaa 60
ccgctaagtt tttttttttt tccagcaaac ttgtgcgtct gaaatctgat tcacctgtct 120
ttaagtattc ataagctgtt ttgattcaat gttataatta accgtagtag atcaatatta 180
tcttacagta attgtagatt ctatattaac ttaatagtac cattgtaaac agcagtaaat 240
ctgttacata tgtgtatact tgtaaataca aatcctaatg aaattcaact tcaatatata 300
cgtagcaggg gaaaaaaaca actgaggtca ttatattctt ctatatccta aacattttaa 360
gttatttaaa ataataatgc gcgaaatagc tcaataaaag acataaaatg gtgtgccatg 420
taaacaaagt ggtggcaatt tcagttcgag caaccagtgc catgaatcca tgctactggg 480
gtatgaagta tgagctgatt tggtgatgaa cagatgagat acgagtgtcc ttgcctccta 540
gactcacatt ggggttttct ttgctaggtg cgtgcgctga ggttgagcct tgattaggag 600
cccagtttga cctcaaagta tagacaaaca acacccaatc gccggaacct gaacggctgc 660
accgaactgc accaaccaag gtgatcggtt tccgtctggg tttattgagt gtagtcattc 720
gtgaacacct cacaaatcga ttagtactgg tacatataac atgtaaatta gttataaatc 780
aaaacaacta aacaatgtgt gttcattgat ctagcacttc tctttttaaa aagtcatgat 840
ttcatttttc agacaaaaaa aaaaagtcaa ccgtcacttt tcctcatcaa catccaacat 900
tttgggaaga aaaatgctat caacaagaat agagttagct agaacaatac atgagagtat 960
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ataggtctga tactgatgct tcttttataa ttggctgtag caatagattc aagaaggtag 1260
tacacagtac acacagagac tttgtacgta tggaatatcg accttgcttg tactatcatt 1320
tcatcttccc aaacgctacc tcttttatgg ctgcacgttt ctctgtacta ggtgtatggt 1380
agttgtacta catttccacc tactgaaaat aatttggaaa cgaattttct gtgcttgcta 1440
tttgctttct ctggcttatt tcaatcctac cccgtttaca aactaaaagc atgttattc 1499

Claims (5)

1.一种草莓长链非编码RNA-FRILAIR，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述草莓长链非编码RNA的植物表达载体。
3.含有权利要求2所述植物表达载体的重组菌。
4.权利要求1所述草莓长链非编码RNA-FRILAIR、权利要求2所述的植物表达载体或权利要求3所述的重组菌在促进果实成熟方面的应用。
5.草莓长链非编码RNA-FRILAIR在促进果实成熟中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建含有SEQ ID NO.1所示的草莓长链非编码RNA的植物表达载体；
(2)将步骤(1)的植物表达载体瞬时转化到草莓果实中，使草莓果实中长链非编码RNA-FRILAIR的表达量增加，促进果实成熟。
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