CN110272906B - 一种柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1及其miRNA抗性靶标rTcSBP1和应用 - Google Patents

一种柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1及其miRNA抗性靶标rTcSBP1和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1及其miRNA抗性靶标rTcSBP1和应用。所述的柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明通过大引物突变技术将TcSBP1基因的miR156响应元件同义突变，获得了miR156抗性靶标rTcSBP1，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。在盐胁迫下，TcSBP1受miR156的转录后调控，而rTcSBP1则不受其调控。柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1及其miR156抗性靶标rTcSBP1在植物耐盐性或林木抗性育种领域的研究和应用中有重要价值。

Description

一种柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1及其miRNA抗性靶标rTcSBP1 和应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1及其miRNA抗性靶标rTcSBP1的应用。
背景技术
我国存在大面积无法有效利用的盐碱地，通过抗逆育种方法培育耐盐种质，可以增加可耕种地面积、提高粮食产量。相比草本植物和禾本科作物，耐盐树种可以在盐渍化土壤、滨海滩涂上正常生长，具有独特的高耐盐特性，其耐盐机制是抗逆育种的理论基础，相关的耐盐基因资源对高耐盐性的作物品种培育的指导意义巨大。中国柽柳(Tamarixchinensis Lour.)是我国柽柳属植物中分布区最广的，以灌木形式丛生于内陆荒漠区和滨海滩涂，辽、冀、豫、鲁、苏北、皖北、新疆等地都有野生群体分布(张鹏云，1990)。由于其能够在2％的盐碱地上正常生长，中国柽柳是耐盐性最强的树种之一。仅在生理层面解析了部分中国柽柳独特的耐高盐特性相关机制，如泌盐、离子区域化等机制，但是其分子层面了解较少，目前在柽柳属的其他物种中已经克隆得到了十几个抗逆相关的转录因子，但中国柽柳尚未有耐盐基因的分离鉴定报道，急需开展相关研究。挖掘中国盐胁迫响应相关的转录因子基因并研究其表达调控模式，不仅可以加深理解柽柳耐盐分子机理，同时可以为盐渍地脱盐、抗逆植物育种提供分子工具。
花分生组织特征基因SQUAMOSA(SQUA)的启动子结合蛋白最早在金鱼草(Antirrhinum majus)中被分离出来，命名为SQUA启动子结合蛋白(SBP，SQUAMOSApromoter binding)，后续研究从拟南芥中分离得到了编码类似SBP蛋白(SBP-like)的基因，命名为SPL。SBP(或SPL)基因家族是植物特有的一类多功能的转录因子家族，都具有保守的DNA结合结构域SBP结构域。该结构域由约80个氨基酸残基构成，核磁共振测定显示SBP结构域三维构象具有2个特异性的锌指(zinc finger)结构和1个核定位信号(NLS)，能够识别并结合GTAC回文序列为核心的顺式元件。SBP家族在陆生植物未分化前已经存在，系统进化分析表明陆生植物SBP家族除了藻类植物自成一组，其他成员分化为两组，I组相对原始，II组分为a-g共7个分支，a-b分支出现较早主要包括苔藓和松类的SBP，c-g分支出现较晚，且对应的基因都含有miR156的靶位点。SPL家族研究发现除了参与植物花器官发育和叶形态建成，还具和果实发育、孢子发育、赤霉素信号、抗霉菌和铜离子胁迫有关。SBP基因的miR156响应元件(miRNA response elements，MREs)是高度保守的，如11个拟南芥SPL基因受miR156调控，水稻19个SBP基因中11个有miR156-MRE，研究表明miR156-SPL控制植物生理年龄从而影响器官发育和形态建成的各个阶段。拟南芥中miR156显著被盐胁迫诱导，miR156超表达提高了植株盐、旱的耐性同时延迟了开花时间，而超表达靶基因模拟物或消除MRE的抗性靶标SPL9，植株出现相反表型，对盐、旱敏感且提前开花。水稻miR156同样受盐胁迫诱导，超表达miR156或者抗性靶标的水稻，表型类似于拟南芥。推测SPL9通过调控二氢黄酮醇还原酶DFR(Dihydroflavonol-4-reductase)影响花青素代谢，花青素积累提高植株的抗逆性，miR156-SPL9-DFR通路将逆境和发育调控动态联系。类似的情况发生在热胁迫下，热胁迫诱导了miR156，SPL下调使得植株适应性提高但生长减慢，而在低温环境下，超表达miR156的植株通过更高效的抑制SPL3翻译，导致FT启动子无法启动转录，使得开花显著延迟，miR156-SPL9-FT使得植株平衡了环境温度和发育进程。可以看出，miR156-SPL将非生物胁迫和植物生长发育相关联，使得植物灵活控制胁迫响应和生长发育。
上述结果表明，SBP在植物盐胁迫响应方面有重要作用，并且受到miR156的转录后调控的影响。目前，尚未有中国柽柳的SBP转录因子相关报道，克隆和开发利用中国柽柳SBP转录因子，不仅有助于阐明其高度耐盐的分子机制，而且可以为筛选重要耐盐基因和抗逆遗传育种提供理论基础和分子工具，对盐碱地利用和农业综合生产能力提高具有重要价值。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1，满足植物耐盐性或林木抗性育种的应用需求。本发明的另一目的是提供一种上述柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1改造后的miRNA抗性靶标rTcSBP1。本发明还有一目的是提供一种上述柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1或miRNA抗性靶标rTcSBP1的应用。
技术方案：为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
所述柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
一种miR156抗性靶标rTcSBP1，由所述柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1通过miR156响应元件同义突变获得，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
含有所述柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1的载体。
含有所述miR156抗性靶标rTcSBP1的载体。
优选地，所述柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1载体为双荧光素酶报告载体35sGLO：TcSBP1，在TcSBP1的miR156响应元件的5′端上游组装有组成型强表达启动子P35S和萤火虫荧光素酶报告基因，3′端下游组装有海肾荧光素酶报告基因。
优选地，所述miR156抗性靶标rTcSBP1的载体为双荧光素酶报告载体35sGLO：rTcSBP1，在rTcSBP1的miR156响应元件同义突变的5′端上游组装有组成型强表达启动子P35S和萤火虫荧光素酶报告基因，3′端下游组装有海肾荧光素酶报告基因。
优选地，所述miR156抗性靶标rTcSBP1的载体为rTcSBP1的过表达载体PBI121GW：rTcSBP1，组装35S启动子；组装NPTII基因表达盒，组装LB和RB序列，LB和RB序列之间为rTcSBP1基因表达框架和基因NPTII。
所述的柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1或所述柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1的表达蛋白或所述柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1的载体在植物耐盐性或林木抗性育种中的应用。
所述的miR156抗性靶标rTcSBP1或所述的miR156抗性靶标rTcSBP1的载体在植物耐盐性或林木抗性育种中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明以中国柽柳(Tamarix chinensis)为材料，通过RACE技术克隆了TcSBP1基因；通过双荧光素酶报告系统鉴定了TcSBP1的miR156响应元件；通过实时荧光定量PCR技术检测了TcSBP1基因在盐胁迫下的时空表达模式；通过大引物突变技术将miR156响应元件同义突变，获得了miR156抗性靶标rTcSBP1。在盐胁迫下，TcSBP1的miR156响应元件受到miR156调控，TcSBP1在柽柳茎中迅速下调，突变该元件后的rTcSBP1不受miR156的转录后调控，柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1及其miR156抗性靶标rTcSBP1在植物耐盐性或林木抗性育种领域中有重要应用价值。
附图说明
图1是TcSBP1基因盐胁迫下的表达模式图；
图2是双荧光素酶报告基因载体35sGLO结构图；
图3是TcSBP1基因的miR156响应元件荧光检测图；
图4是过表达载体PBI121GW结构图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的方法或本领域的常规方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：通过RACE技术克隆TcSBP1基因
基于柽柳RNA-seq数据的TcSBP1转录本，设计5′和3′的RACE引物，通过巢式PCR扩增两段特异性产物，通过T-载体克隆测序，测序结果通过重叠区拼接，得到cDNA全长。具体如下：
I.引物设计
3′RACE正向引物(F)：
Outer Primer：5′-GAATTATTATGTGGCACGAAGGGTAG-3′；
Inner Primer：5′-ATTTAACCAGCAATGAACCGCAACA-3′；
3′RACE反向引物(R)：
Outer Primer：
5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′；
Inner Primer：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；
5′RACE正向引物(F)：
Outer Primer：
5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′；
Inner Primer：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；
5′RACE反向引物(R)：
Outer Primer：5′-AGCAGCTATGACCGAATGAAACGTGT-3′；
Inner Primer：5′-ATGATACCTTATGAGAGTTCGGACA-3′。
II.3′RACE反应过程：
(1)反转录，将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中：1μgTotal RNA(植物材料为柽柳叶片)，4μL dNTP Mix，2μL 3′RACE Adapter，2μL 10×RTBuffer，1μL RNase Inhibitor，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-freeWater补至20μL。
(2)轻轻混匀，短暂离心，42℃温育1小时，进入PCR步骤；
(3)3′RACE巢式PCR；
3′RACE Outer PCR反应体系(50μL)组成：5.0μL 10×LA PCR Buffer(Mg2+Free)，5.0μL MgCl2(25mM)，8.0μL dNTP Mixture(each 2.5mM)，2.0μL 3′RACE Outer Primer F(10μM)，2.0μL 3′Outer Primer R(10μM)，1μL RT reaction product，0.5μL TakaRa LATaq(5U/μL)，26.5μL Nuclease-free Water。
3′RACE Inner PCR反应体系(50μL)组成：5.0μL 10×LA PCR Buffer(Mg2+Free)，5.0μL MgCl2(25mM)，8.0μL dNTP Mixture(each 2.5mM)，2.0μL 3′RACE Inner Primer F(10μM)，2.0μL 3′RACE Inner Primer R(10μM)，1μL Outer 3′RACE PCR product，0.5μLTakaRa LA Taq(5U/μL)，26.5μL Nuclease-free Water。
反应程序：94℃ 3分钟；94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟，35cycles；72℃ 7分钟。
(4)纯化片段的连接反应
采用TaKaRa公司的pMD19-T simple Vector克隆目的DNA分子，反应体系(5μL)：2.2μL纯化回收的PCR产物，0.3μL pMD-19 Simple Vector，2.5μL Solution I。反应条件：16℃ 30分钟；4℃过夜。
(5)大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌TOP10感受态细胞在冰上融化；取5μL纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100μL感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30分钟；42℃水浴中热击90秒，迅速置于冰上3-5分钟；加入800μL LB液体培养基，37℃100转/分钟摇菌1小时；4000转/分钟离心3分钟，吸掉上层800μL培养基，混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板上，37℃倒置培养过夜。
(6)阳性克隆筛选及测序分析
从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中，37℃ 250转/分钟摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测。
反应体系(20μL)：2.0μL 10×PCR Buffer(Mg2+ free)，1.5μL MgCl2(25mM)，1.3μLdNTP Mixture(each 2.5mM)，1.0μL 3′RACE gene specific inner primer(10μM)，1.0μL3′RACE Inner Primer(10μM)，0.1μL菌液，1.0μL rTaq，12.1μL Milli-Q Water。反应程序：94℃ 3分钟；94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟，28 cycles；72℃ 7分钟。
阳性克隆通过Sanger测序法测序得到碱基序列。
III.5′RACE反应过程
(1)RNA处理：CIP反应，将如下成分加入到RNase-free的小离心管中：10μg TotalRNA，2μL 10×CIP buffer，2μL Calf Intestine Alkaline Phosphatase(CIP)，Nuclease-free Water至20μL。
(2)轻轻混匀，短暂离心；37℃温育1小时；
(3)加入以下试剂到CIP反应离心管：15μL Ammonium Acetate Solution，115μLNuclease-free Water，150μL acid phenol：chloroform。
(4)充分涡旋，室温高速离心(≥10000g)5分钟；
(5)转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μL氯仿，充分涡旋，室温高速离心(≥10000g)5分钟；
(6)转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μL异丙醇，充分涡旋，冰浴10分钟；
(7)最大转速离心20分钟，用0.5mL预冷的70％乙醇冲洗沉淀，最大转速离心5分钟，小心弃乙醇，气干沉淀；
(8)以11μL Nuclease-free Water重悬沉淀，即得CIP’d RNA，冰上放置进一步用于TAP反应，或者-20℃保存；
(9)TAP反应，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：5μL CIP’d RNA，1μL 10X TAP buffer，2μL Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)，2μL Nuclease-freeWater；
(10)轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1小时，即得CIP/TAP-treated RNA；进入接头连接步骤，或-20℃保存反应物；
(11)5′RACE接头连接，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：2μLCIP/TAP-treated RNA，1μL 5′RACE Adapter，1μL 10×RNA Ligase Buffer，2μL T4 RNALigase(2.5U/μL)，4μL Nuclease-free Water。
(12)轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1小时，即得Ligated RNA；进入反转录步骤，或-20℃保存反应物。
(13)将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中：2μL LigatedRNA，4μL dNTP Mix，2μL Random Decamers，2μL 10×RT Buffer，1μL RNase Inhibitor，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-free Water补至20μL。
(14)轻轻混匀，短暂离心；42℃温育1小时，即得RT reaction；进入PCR步骤，或-20℃保存反应物。
(15)5′RACE巢式PCR：反应体系、反应条件与3′RACE的巢式PCR一致。
(16)PCR产物克隆测序，操作与3′RACE克隆一致。
IV.ORF扩增
对3′RACE和5′RACE序列进行拼接，并利用NCBI-ORF finder工具预测其阅读框。根据基因全长序列设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子)，进行TcSBP1基因的全长克隆。其中，TcSBP1 ORF正向引物：5′-ATGATGGAATTGAATGCAAAAAGTC-3′，TcSBP1 ORF反向引物：5′-TCAGTACATATAGAAGTTAGGGTCA-3′，高保真PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer5.0μL；2.5mM dNTP Mixture 8.0μL；25mM Mg2+5.0μL；LA Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL；正向引物(10μM)2μL；反向引物(10μM)2μL；模板(柽柳cDNA)1μL；加无菌ddH2O补足50μL。反应程序：预变性94℃ 3分钟-(94℃ 40秒-55℃ 30秒-72℃ 30秒)×35个循环-72℃ 10分钟。
TcSBP1全长cDNA序列为2397bp，其序列如SEQ ID No.1所示，包含一个1449bp的完整阅读框(CDS)，对应的TcSBP1蛋白的氨基酸序列为482aa，其序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2：通过荧光定量PCR分析TcSBP1基因表达模式
通过荧光定量PCR技术验证TcSBP1基因的盐胁迫响应，基于TcSBP1基因的CDS区域设计荧光定量PCR引物，基于柽柳的TIF基因设计内参引物，序列如下：
TcSBP1正向引物：5′-ATTTAACCAGCAATGAACCGCAACA-3′；
TcSBP1反向引物：5′-ACCTGCAGGCTTACGTGTGT-3′；
TIF正向引物：5′-ACCACAGGAGTGTCCACCACA-3′；
TIF反向引物：5′-TGATGCTTTGCGTGCCAGTG-3′。
利用饱和染料evagreen(Biotium公司)和荧光定量PCR仪Viia7(ABI公司)，实时检测PCR过程的荧光强度，具体PCR体系参照evagreen说明书，通过比较TcSBP1基因和内参的达到荧光阈值的循环数来计算确定TcSBP1基因的相对表达量。其中，PCR模板为不同组织的mRNA反转录得到的cDNA，取样来自柽柳扦插苗，盐处理0.5小时、1小时、4小时的根、茎、叶，以无胁迫处理的根、茎、叶为对照，计算相对定量，结果如图1所示，TcSBP1在柽柳根、茎、叶中不同程度下调表达，在柽柳茎中尤为显著，表明TcSBP1为盐胁迫响应基因。另利用茎环引物法测得柽柳miR156被盐胁迫显著诱导，TcSBP1和miR156表现为盐胁迫下表达负相关关系，表明TcSBP1基因可能受到柽柳miR156的调控。
实施例3：
采用大引物PCR法进行多点突变，获得TcSBP1的miR156响应元件同义突变后的ORF，具体步骤如下：
根据密码子简并性，设计同义突变引物，引入尽可能多的突变位点，但不要有超过3碱基的poly结构，同时侧翼保留至少10nt的互补碱基，TcSBP1突变引物为5′-ACAGAATCATCTCATGTAAGCTGTTTCAGTAATCCCATGATC-3′，在一轮PCR反应中，通过TcSBP1突变引物和实施例1的TcSBP1 ORF反向引物，扩增得到一轮PCR产物片段。在二轮PCR反应中，利用一轮反应产物作为大引物，实施例1的TcSBP1 ORF正向引物，进行PCR获得引入多位点突变的抗性靶标rTcSBP1片段，第一轮和第二轮PCR均采用高保真PCR反应体系如下：10×LA PCRBuffer5.0μL；2.5mM dNTP Mixture 8.0μL；25mM Mg2+5.0μL；LA Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL；正向引物(10μM)2μL；反向引物(10μM)2μL；模板(柽柳cDNA)1μL；加无菌ddH2O补足50μL。反应程序：预变性94℃ 3分钟-(94℃ 40秒-55 ℃30秒-72℃ 30秒)×35个循环-72℃10分钟。将第二轮PCR产物连接T载体，转化大肠杆菌后进行克隆测序，回收包含阳性片段的T载体。
测序得到TcSBP1的miR156抗性靶标rTcSBP1，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
实施例4：TcSBP1基因的miRNA响应元件鉴定
实施例2的结果表明TcSBP1基因可能受到柽柳miR156的调控，结合序列互补性，预测到TcSBP1基因含有一个miR156响应元件(5′-GTGCTCTCTCTCTTCTGTCA-3′)，实施例3采用大引物PCR法进行多点突变，获得TcSBP1的miR156响应元件同义突变后的ORF，即rTcSBP1。本实施例通过构建双荧光素酶报告基因载体(图2)，测定荧光强度变化，通过定量miR156和响应元件间的互作强度，验证TcSBP1响应元件。
具体如下：
I.35sGLO：TcSBP1重组载体构建
1)寡核苷酸设计
TcSBP1响应元件侧翼添加酶切位点，按照以下要求设计两对寡核苷酸：
TcSBP1正义链：酶切位点A+Notl酶切位点+TcSBP1响应元件+酶切位点B残基；TcSBP1反义链：酶切位点B+反义TcSBP1响应元件+Notl酶切位点+酶切位点A残基；
rTcSBP1正义链：酶切位点A+Notl酶切位点+rTcSBP1突变序列+酶切位点B残基；rTcSBP1反义链：酶切位点B+反义rTcSBP1突变序列+Notl酶切位点+酶切位点A残基。
2)双酶切组合选择
35sGLO的多克隆位点存在多种酶切组合选择，原则上避开同尾酶和同裂酶，如SalI和XhoI，XbaI和NheI，且两个酶切位点距离不要太近，侧翼至少6nt的保护碱基。NheI(酶切位点A)和SalI(酶切位点B)符合以上规则，可以进行高效双酶切。利用NheI(酶切位点A)和SalI(酶切位点B)为酶切位点，设计寡核苷酸如下，利用PAGE合成寡核苷酸
TcSBP1+：5′-CTAGATAGCGGCCGCTAGTGCTCTCTCTCTTCTGTCAG-3′；
TcSBP1-：5′-TCGACTGACAGAAGAGAGAGAGCACTAGCGGCCGCTAT-3′；
rTcSBP1+：5′-CTAGATAGCGGCCGCTAGTGCTCTCTCAATTCTGTCAG-3′；
rTcSBP1-：5′-TCGACTGACAGAATTGAGAGAGCACTAGCGGCCGCTAT-3′。
3)35sGLO载体线性化
通过NEBcloner(https：//nebcloner.neb.com)获取理论最佳酶切体系(50μL)：1μL 35sGLO(1μg/μL)，5μL 10×CutSmart Buffer，0.5μL NheI(20U/μL)，0.5μL SalI(20U/μL)，43μL Nuclease-free Water。
配制反应体系(50μL)，吹打混匀，37℃孵育5-15min，电泳检测酶切产物，回收线性化质粒。
4)获插入片段
在2个0.2mL离心管中，按照以下体系(50μL)，分别进行两对寡核苷酸杂交：
2μL TcSBP1+/rTcSBP1+(1μg/μL)，2μL TcSBP1-/rTcSBP1-(1μg/μL)，46μL OligoAnnealing Buffer。
90℃反应3min，37℃退火15min后得到的TcSBP1和rTcSBP1杂交产物，即为插入片段。
5)载体重组
配制T4(NEB)连接体系(10μL)：1μL TcSBP1或rTcSBP1杂交产物(4ng/μL)，0.5μLT4连接酶(400U/μL)，1μL T4 10×buffer，X μL线性化35sGLO(50ng)，7.5-X μL ddH2O。
25℃孵育10min(或16℃过夜连接)
转化后提取质粒，NotI酶切得到140bp左右的片段为阳性质粒。
6)阳性质粒测序验证正确后，得到35sGLO：TcSBP1和35sGLO：rTcSBP1重组载体。
II.miR156瞬时表达载体构建
通过gateway体系，将柽柳miR156(5′-UGACAGAAGAGAGUGAGCAC-3′)插入带有35S启动子的P2GW7载体，构建miRNA瞬时表达载体。
首先利用BP反应，将miR156片段插入PCR8/GW/TOPO载体，测序验证插入片段，得到miR156入门载体。然后利用LR反应，通过
Figure BDA0002129781380000111
LR ClonaseTM II Enzyme Mix试剂盒，进行miR156入门载体和适用于植物原生质体的P2GW7超表达载体的重组反应，测序验证插入片段，抽提阳性质粒，得到P2GW7：miR156重组载体。
III.转染原生质体并测定荧光强度
将对照组：9μL的35sGLO：TcSBP1载体；
TcSBP1组：6μL的P2GW7：miR156载体(1μg/μL)和3μL的35sGLO：TcSBP1载体(1μg/μL)；
rTcSBP1组：6μL的P2GW7：miR156载体(1μg/μL)和3μL的35sGLO：rTcSBP1载体(1μg/μL)；
分别共转染到100μL杨树原生质体(6×105/mL)中，重复4次，室温黑暗培养16～24h充分进行转染后，进行荧光检测。
1)配置荧光素酶反应底物(Promega E1910试剂盒)，冰上待用；
LAR配制：10mL Luciferase Assay Buffer II溶解Luciferase AssaySubstrate，混匀，现用或-70冻存；
Stop&Glo配制：Stop&Glo Buffer和Substrate按照50∶1配制，混匀，现配现用，或者-20冻存；
2)4000rpm离心收集转染后的原生质体，加入100μL 1×Passive Lysis Buffer100mL裂解沉淀；
3)裂解后的转染液转移至96孔酶标板孔(100μL)，对照组，TcSBP1组和rTcSBP1组各重复4孔；
4)接通Glomax-96化学发光仪电源，打开GloMax软件，按照软件说明书，建立GloMax自动化测定程序，测定荧光强度；
将对照组的荧光强度设为100％，计算得到TcSBP1组和rTcSBP1组相对荧光强度，绘制为柱状图，如图3所示，可以看出TcSBP1组荧光强度仅为对照组1.58％，说明TcSBP1被柽柳miR156显著抑制，而rTcSBP1组荧光恢复为79.55％，说明突变后的rTcSBP1受到miR156抑制很大程度被解除，证明了TcSBP1的miR156响应元件受到miR156抑制。
实施例5：rTcSBP1基因植物表达载体构建
利用通路克隆技术构建rTcSBP1基因(SEQ ID No.3)的过量表达载体。使用特异PCR引物(实施例1的TcSBP1 ORF引物)，以实施例3中包含rTcSBP1片段的T载体为模板，进行PCR扩增，将rTcSBP1基因ORF构建到入门载体。入门载体为pCR8/GW/TOPOTM vector(Invitrogen)。反应体系为：Fresh PCR product(purified)10-20ng；Salt solution 1μL；pCR8/GW/TOPOTM vector 1μL；加无菌ddH2O补足6μL。反应程序为：室温静置30分钟。
从筛选培养板上挑取阳性克隆进行测序验证，阳性入门载体与植物表达载体PBI121GW进行LR反应。载体质粒如图4所示。反应体系为：入门载体100ng；PBI121GW vector(100ng/μL)1.5μL；LR Clonase II enzyme mix 2μL；加TE(pH 8.0)补足10μL。反应条件：25℃ 1小时。经LR反应后，rTcSBP1基因导入植物表达载体PBI121GW中。PBI121GW组装有通路克隆attR1和attR2元件，快速组装rTcSBP1基因表达框并确保准确翻译；组装有LB和RB序列，促使组装于其间的rTcSBP1基因和筛选标记基因NPTII整合至侵染的拟南芥染色体中。另外，在rTcSBP1基因的5′端组装组成型强表达启动子P35S，它能使TcSBP1高效表达。通过PCR检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为PBI121GW：rTcSBP1，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，rTcSBP1可在植物体内高效表达。
由于rTcSBP1不含有miR156响应元件，通过所述载体，该基因在植物体内的表达水平不受miR156转录后调控，过表达后的盐胁迫响应效应更为显著，是林木转基因耐盐研究的重要分子工具。
以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 一种柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1及其miRNA抗性靶标rTcSBP1和应用
<130> 100
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2397
<212> DNA
<213> Tamarix chinensis
<400> 1
gaaactctga attattatgt ggcacgaagg gtagttggtt gccattatta gtgaggttga 60
tgggcagcga caattcgccc cctttctttt cttcaatcca aaagtgggta cagatttcta 120
gcagtatgtt tatttcactg tgttgctttc ccaagttctt gagaaaatca tggccggcaa 180
atgcgatgca gaagctagta taaaaattca aaatcatgtc ctgtccttgc ttggtttcaa 240
tcattggaag gaagagagca aggttctgtt gactttattg tgaacttggt gaaagaacca 300
cttaaaaggg ttccgtttag ctttggagag gtgttttttt cagcatcatc aagtgttcgt 360
tttgttatcg actttccttt ttctccgatg tattgatatc aggctgtacg atgtccgaac 420
tctcataagg tatcattatg cctgcgactt gatgttcttg tgggcttctg aagcatttta 480
atcagcataa tctccacgat atgttatata gtattttgat gctctgcttg tgtttgtttt 540
aatgtacact ctgttccacg tgatgcatat ttgtcttaga ataatgaaga tctgattttt 600
tatttttagt ttttcttgca cttagaccca atacctttca gtgatgttta agtatgttcc 660
ttgatcctga actcagaagt aagcagcagg agccagcaaa ggattattgt ttagtacagt 720
agtgtgttca atgatggaat tgaatgcaaa aagtccgttt ctctgggatt gggagaactt 780
attcatgttt agctctaaaa cagttgaagc accgaagaaa ttgcagttgg ttgactctag 840
actcgatgct atggaaggat ttgaagctgc ttctatcttt tcttccgggg gtcgaagtga 900
agttggaagt ggtggttctg cttctgcttc tgatttcgga tatgggtctt catccaagag 960
ctcaaagtct gcttcagttg attcttccac aaacaaggtg ttgagagaat ctttgttgaa 1020
attggttgct aatgattgtt ctctagagga tccaaattgc aagagcaaag tggctaatgc 1080
ttggcaatct aaaacctcct cgacaactga gagtccagtt cattctggtg aatcattgat 1140
tggtctgatg ctaggtaaga gaacatattt tgaagatgtc tctgtgggta acaatggcaa 1200
gaccgctgct tcaattcctt ttccttcaga taatgctaca gaaaagagat ccaagttatg 1260
ttctttgaag acagagagtt ttcattgcca agttgaaggc tgtggtttag acctttcatt 1320
agctaaagat taccaccgta agcatcgagt ttgtgaagct cattccaaaa gccccgtggt 1380
tattgtttct ggtcttgagc gtcggttctg ccagcagtgc agtaggttcc atagtttgtc 1440
tgagtttgat caaaagaaga gaagctgccg caggcgtctc tctgatcaca attcaaggcg 1500
caggaagcca aaaccagaaa ttatcccatt caactccatg aggctgcctt catctttata 1560
tgatggaaga cagcagattg cattcgatca ggttccaatt gttcagccaa gggctaatgc 1620
aagtcctggt tgggatttca cagctgctac cgatgtaccc caagcaaggc taagcctgtt 1680
cagtagtacc aaagcaggag gtaacaatga cctgcattta accagcaatg aaccgcaaca 1740
tcctggagga gctaggcagt ttaatcatcc cacacaagtg gcaccgtcca agggtgtcct 1800
gtctgatgtt tttccggaag gcttacgtgt gtctacaata ccattgaact tggatgcgac 1860
tcgaaatctc cgtgctctct ctcttctgtc aaatactttg ggttcatccg agcctgcggc 1920
agcagccgca ctcaaccagc caacgctcag cagtcatccc agtcgtgcat ctcagcaacc 1980
actacaacgt agtggtatac atcccgtgtc cttaggctta cctcctgcgt cttctggata 2040
ttggcaaggt gaccaacaaa cagcagcccc ttcggggttg aatgtctcaa catcacgtaa 2100
tactcacgca tataacagcc acttccaaga gttccagcta ttcaagggtc caagtgaccc 2160
taacttctat atgtactgag gatgcataaa gttattcgtc gtcccactac ggacgactct 2220
ttttgtattg attccacgag cttatgactc ttggaatgat gggttatctt ttcgaatgaa 2280
gagcatctct catcagctac tcttgattta ctcggtcctt tttactataa catgtcgaaa 2340
ggtggctgag atttgataga agctttgttt ctgcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2397
<210> 2
<211> 482
<212> PRT
<213> Tamarix chinensis
<400> 2
Met Met Glu Leu Asn Ala Lys Ser Pro Phe Leu Trp Asp Trp Glu Asn
1 5 10 15
Leu Phe Met Phe Ser Ser Lys Thr Val Glu Ala Pro Lys Lys Leu Gln
20 25 30
Leu Val Asp Ser Arg Leu Asp Ala Met Glu Gly Phe Glu Ala Ala Ser
35 40 45
Ile Phe Ser Ser Gly Gly Arg Ser Glu Val Gly Ser Gly Gly Ser Ala
50 55 60
Ser Ala Ser Asp Phe Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Lys Ser Ser Lys Ser
65 70 75 80
Ala Ser Val Asp Ser Ser Thr Asn Lys Val Leu Arg Glu Ser Leu Leu
85 90 95
Lys Leu Val Ala Asn Asp Cys Ser Leu Glu Asp Pro Asn Cys Lys Ser
100 105 110
Lys Val Ala Asn Ala Trp Gln Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Glu Ser
115 120 125
Pro Val His Ser Gly Glu Ser Leu Ile Gly Leu Met Leu Gly Lys Arg
130 135 140
Thr Tyr Phe Glu Asp Val Ser Val Gly Asn Asn Gly Lys Thr Ala Ala
145 150 155 160
Ser Ile Pro Phe Pro Ser Asp Asn Ala Thr Glu Lys Arg Ser Lys Leu
165 170 175
Cys Ser Leu Lys Thr Glu Ser Phe His Cys Gln Val Glu Gly Cys Gly
180 185 190
Leu Asp Leu Ser Leu Ala Lys Asp Tyr His Arg Lys His Arg Val Cys
195 200 205
Glu Ala His Ser Lys Ser Pro Val Val Ile Val Ser Gly Leu Glu Arg
210 215 220
Arg Phe Cys Gln Gln Cys Ser Arg Phe His Ser Leu Ser Glu Phe Asp
225 230 235 240
Gln Lys Lys Arg Ser Cys Arg Arg Arg Leu Ser Asp His Asn Ser Arg
245 250 255
Arg Arg Lys Pro Lys Pro Glu Ile Ile Pro Phe Asn Ser Met Arg Leu
260 265 270
Pro Ser Ser Leu Tyr Asp Gly Arg Gln Gln Ile Ala Phe Asp Gln Val
275 280 285
Pro Ile Val Gln Pro Arg Ala Asn Ala Ser Pro Gly Trp Asp Phe Thr
290 295 300
Ala Ala Thr Asp Val Pro Gln Ala Arg Leu Ser Leu Phe Ser Ser Thr
305 310 315 320
Lys Ala Gly Gly Asn Asn Asp Leu His Leu Thr Ser Asn Glu Pro Gln
325 330 335
His Pro Gly Gly Ala Arg Gln Phe Asn His Pro Thr Gln Val Ala Pro
340 345 350
Ser Lys Gly Val Leu Ser Asp Val Phe Pro Glu Gly Leu Arg Val Ser
355 360 365
Thr Ile Pro Leu Asn Leu Asp Ala Thr Arg Asn Leu Arg Ala Leu Ser
370 375 380
Leu Leu Ser Asn Thr Leu Gly Ser Ser Glu Pro Ala Ala Ala Ala Ala
385 390 395 400
Leu Asn Gln Pro Thr Leu Ser Ser His Pro Ser Arg Ala Ser Gln Gln
405 410 415
Pro Leu Gln Arg Ser Gly Ile His Pro Val Ser Leu Gly Leu Pro Pro
420 425 430
Ala Ser Ser Gly Tyr Trp Gln Gly Asp Gln Gln Thr Ala Ala Pro Ser
435 440 445
Gly Leu Asn Val Ser Thr Ser Arg Asn Thr His Ala Tyr Asn Ser His
450 455 460
Phe Gln Glu Phe Gln Leu Phe Lys Gly Pro Ser Asp Pro Asn Phe Tyr
465 470 475 480
Met Tyr
<210> 3
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工突变序列rTcSBP1(Artificial)
<400> 3
atgatggaat tgaatgcaaa aagtccgttt ctctgggatt gggagaactt attcatgttt 60
agctctaaaa cagttgaagc accgaagaaa ttgcagttgg ttgactctag actcgatgct 120
atggaaggat ttgaagctgc ttctatcttt tcttccgggg gtcgaagtga agttggaagt 180
ggtggttctg cttctgcttc tgatttcgga tatgggtctt catccaagag ctcaaagtct 240
gcttcagttg attcttccac aaacaaggtg ttgagagaat ctttgttgaa attggttgct 300
aatgattgtt ctctagagga tccaaattgc aagagcaaag tggctaatgc ttggcaatct 360
aaaacctcct cgacaactga gagtccagtt cattctggtg aatcattgat tggtctgatg 420
ctaggtaaga gaacatattt tgaagatgtc tctgtgggta acaatggcaa gaccgctgct 480
tcaattcctt ttccttcaga taatgctaca gaaaagagat ccaagttatg ttctttgaag 540
acagagagtt ttcattgcca agttgaaggc tgtggtttag acctttcatt agctaaagat 600
taccaccgta agcatcgagt ttgtgaagct cattccaaaa gccccgtggt tattgtttct 660
ggtcttgagc gtcggttctg ccagcagtgc agtaggttcc atagtttgtc tgagtttgat 720
caaaagaaga gaagctgccg caggcgtctc tctgatcaca attcaaggcg caggaagcca 780
aaaccagaaa ttatcccatt caactccatg aggctgcctt catctttata tgatggaaga 840
cagcagattg cattcgatca ggttccaatt gttcagccaa gggctaatgc aagtcctggt 900
tgggatttca cagctgctac cgatgtaccc caagcaaggc taagcctgtt cagtagtacc 960
aaagcaggag gtaacaatga cctgcattta accagcaatg aaccgcaaca tcctggagga 1020
gctaggcagt ttaatcatcc cacacaagtg gcaccgtcca agggtgtcct gtctgatgtt 1080
tttccggaag gcttacgtgt gtctacaata ccattgaact tggatgcgac tcgaaatctc 1140
cgtgcactgt cactactatc taatactttg ggttcatccg agcctgcggc agcagccgca 1200
ctcaaccagc caacgctcag cagtcatccc agtcgtgcat ctcagcaacc actacaacgt 1260
agtggtatac atcccgtgtc cttaggctta cctcctgcgt cttctggata ttggcaaggt 1320
gaccaacaaa cagcagcccc ttcggggttg aatgtctcaa catcacgtaa tactcacgca 1380
tataacagcc acttccaaga gttccagcta ttcaagggtc caagtgaccc taacttctat 1440
atgtactga 1449
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物序列3' RACE Outer Primer F(Artificial)
<400> 4
gaattattat gtggcacgaa gggtag 26
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物序列3' RACE Inner Primer F(Artificial)
<400> 5
atttaaccag caatgaaccg caaca 25
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 引物序列3' RACE Outer Primer R(Artificial)
<400> 6
ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物序列3' RACE Inner Primer R(Artificial)
<400> 7
ctaatacgac tcactatagg gc 22
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 引物序列5' RACE Outer Primer F(Artificial)
<400> 8
ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物序列5' RACE Inner Primer F(Artificial)
<400> 9
ctaatacgac tcactatagg gc 22
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物序列5' RACE Outer Primer R(Artificial)
<400> 10
agcagctatg accgaatgaa acgtgt 26
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物序列5' RACE Inner Primer R(Artificial)
<400> 11
atgatacctt atgagagttc ggaca 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> TcSBP1 ORF正向引物(Artificial)
<400> 12
atgatggaat tgaatgcaaa aagtc 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> TcSBP1 ORF反向引物(Artificial)
<400> 13
tcagtacata tagaagttag ggtca 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> TcSBP1正向引物(Artificial)
<400> 14
atttaaccag caatgaaccg caaca 25
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> TcSBP1反向引物(Artificial)
<400> 15
acctgcaggc ttacgtgtgt 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> TIF正向引物(Artificial)
<400> 16
accacaggag tgtccaccac a 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> TIF反向引物(Artificial)
<400> 17
tgatgctttg cgtgccagtg 20
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> TcSBP1突变引物(Artificial)
<400> 18
acagaatcat ctcatgtaag ctgtttcagt aatcccatga tc 42
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> miR156响应元件(Artificial)
<400> 19
gtgctctctc tcttctgtca 20
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列TcSBP1+(Artificial)
<400> 20
ctagatagcg gccgctagtg ctctctctct tctgtcag 38
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列TcSBP1-(Artificial)
<400> 21
tcgactgaca gaagagagag agcactagcg gccgctat 38
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列rTcSBP1+(Artificial)
<400> 22
ctagatagcg gccgctagtg ctctctcaat tctgtcag 38
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列rTcSBP1-(Artificial)
<400> 23
tcgactgaca gaattgagag agcactagcg gccgctat 38
<210> 24
<211> 20
<212> RNA
<213> 柽柳miR156(Artificial)
<400> 24
ugacagaaga gagugagcac 20

Claims (10)

1.一种柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
3.一种miR156抗性靶标rTcSBP1，由权利要求1所述柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1通过miR156响应元件同义突变获得，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.含有权利要求1所述柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1的载体。
5.根据权利要求4所述载体，其特征在于：所述载体为双荧光素酶报告载体35sGLO：TcSBP1，在TcSBP1的miR156响应元件的5′端上游组装有组成型强表达启动子P35S和萤火虫荧光素酶报告基因，3′端下游组装有海肾荧光素酶报告基因。
6.含有权利要求3所述miR156抗性靶标rTcSBP1的载体。
7.根据权利要求6所述载体，其特征在于：所述载体为双荧光素酶报告载体35sGLO：rTcSBP1，在rTcSBP1的miR156响应元件同义突变的5′端上游组装有组成型强表达启动子P35S和萤火虫荧光素酶报告基因，3′端下游组装有海肾荧光素酶报告基因。
8.根据权利要求6所述载体，其特征在于：所述载体为rTcSBP1的过表达载体PBI121GW：rTcSBP1，组装35S启动子；组装NPTII基因表达盒，组装LB和RB序列，LB和RB序列之间为rTcSBP1基因表达框架和基因NPTII。
9.权利要求1所述的柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1或权利要求2所述柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1的表达蛋白或权利要求4所述柽柳盐胁迫响应基因TcSBP1的载体在植物耐盐性或林木抗性育种中的应用。
10.权利要求3所述的miR156抗性靶标rTcSBP1或权利要求6或7或8所述的miR156抗性靶标rTcSBP1的载体在植物耐盐性或林木抗性育种中的应用。
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