CN115925843A - 柿单宁生物合成正调控转录因子DkMYB21基因、蛋白质及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了柿单宁生物合成正调控转录因子DkMYB21基因、蛋白质及其应用，所述转录因子DkMYB21的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其核苷酸序列为在SEQ ID NO:1所示序列中存在一个或多个核苷酸的缺失、添加和/或取代但功能不变的序列。本发明从不同脱涩类型柿品种数据库中筛选得到在果实发育早期特异表达的DkMYB21基因，其可正调控柿中单宁的生物合成，在柿叶片和果实中沉默DkMYB21基因后可显著降低可溶性单宁的累积，为主栽涩柿的“甜柿化”改造提供了重要的基因资源。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种正调控柿单宁(原花色素)生物合成的转录因子DkMYB21的基因序列、蛋白质序列，以及其在涩柿“甜柿化”改造中的应用。
背景技术
柿(Diospyros kaki Thunb.)为柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros Linn.)木本果树，原产我国，后传播到日本和韩国并被广泛种植。根据果实成熟时能否自然脱涩及其性状遗传特点，现有柿品种分完全甜柿和非完全甜柿两大类。完全甜柿成熟后无需任何处理可直接脆食，改善了果实商品的鲜食体验，且方便运输和贮藏，因而更受市场青睐。非完全甜柿可进一步分为不完全甜柿、不完全涩柿和完全涩柿。非完全甜柿在成熟期时果肉中仍含有大量的可溶性单宁，是果实产生涩感的主要原因，需经脱涩处理后方可食用。但由于人工脱涩成本较高，费时费力，且脱涩后的果实极易软化，不耐贮运，货架期较短，商品价值较低，经济效应及食用体验不佳。因此，可自然脱涩的完全甜柿既是产业发展的主要对象，也是遗传改良的重点目标，但目前国内外甜柿主栽品种均源自日本。日本甜柿不太适应我国“上山下滩”的土壤条件，且部分优质品种与我国习用的砧木君迁子(Diospyros lotus L.)嫁接亲和性较差；此外，由于日本甜柿骨干亲本起源地狭窄，其遗传背景较近，长期的相互杂交已引发较严重的近交衰退现象。因此，培育具有自主知识产权的中国甜柿新品种是我国柿产业可持续发展亟待解决的“瓶颈”问题。
柿果果肉单宁细胞中含有大量的缩合单宁，即原花色素(proanthocyanidin，PA)。根据其于醇溶液的溶解性差异，可分为可溶性单宁和不溶性单宁。柿单宁主要是通过苯丙烷-类黄酮-原花青素代谢通路顺序合成(Xie and Dixon 2005，Akagi et al.2011)。这些代谢通路上的结构基因的功能较明晰，其遗传特性以及生化功能在众多植物中已经得到了验证(Lepiniec et al.2006)，结构基因的表达转录受转录因子的调控。目前已报道的与单宁合成相关的转录因子多为MYB型转录因子，根据MYB转录因子氨基酸序列中存在的基序，可将其分为TT2-type以及PA1型转录因子。模式植物拟南芥tt2突变体中的MYB123(TT2)基因缺失，即引起单宁合成功能丧失，其种皮不能正常累积单宁。许多园艺植物，如葡萄、苹果、草莓均存在单宁，尤其是葡萄，其果皮及种子均含有大量单宁。在葡萄中，共鉴定到4个与单宁合成相关的MYB转录因子VvMYBPA1/2以及VvMYB5a/b，其中VvMYBPA1为PA1-type转录因子(Deluc et al.2006，2008，Bogs et al.2007，Terrier et al.2009)。苹果中也报道了多个单宁相关MYB转录因子，TT2类MdMYB9、MdMYB11和PA1类转录因子MdMYBPA1(Gesell etal.2014，An et al.2015，2018，Wang et al.2017，2018)。草莓中也报道了MYB转录因子FaMYB9/11具有促进单宁生物合成的功能(Schaart et al.2013)。杨树中鉴定得到两个单宁相关转录因子：TT2型PtMYB134和PA1型PtMYB115转录因子(Mellway et al.2009，Gesellet al.2014，James et al.2017)。
目前有关柿单宁生物合成的转录调控的报道不多，Akagi et al(2009)曾发现一个可抑制日本甜柿单宁生物合成的转录因子DkMYB4，但该转录因子的上游调控网络尚不清楚；Chen et al(2021)也报道一个单宁生物合成抑制型转录因子DkMYB14，其主要促进中国甜柿中单宁的凝固过程，对非完全甜柿无效。因此，进一步挖掘柿果单宁生物合成的关键调控因子非常必要，也十分紧迫。另一方面，非完全甜柿遗传多样性丰富，现有柿品种主要为非完全甜柿，若能利用现在生物技术手段，如基因组编辑等对其进行“甜柿化”遗传改造，对我国柿产业发展将具有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明从不同脱涩类型柿品种的转录组数据库中，筛选得到了MYB型转录因子DkMYB21基因，其在果实发育早期特异表达，具体为TT2型单宁合成正调控转录因子，具有促进柿果单宁累积的作用。
本发明的技术方案具体如下：
本发明第一方面提供了一种正调控柿单宁生物合成的转录因子DkMYB21，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其核苷酸序列为在SEQ ID NO:1所示序列中存在一个或多个核苷酸的缺失、添加和/或取代但功能不变的序列。
本发明第二方面提供了由上述转录因子DkMYB21编码的蛋白质，具体的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者其氨基酸序列为在SEQ ID NO:2所示序列中进行一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代但功能结构域相同的序列。
本发明第三方面提供了一种重组表达载体，其包含上述的转录因子DkMYB21。
本发明第四方面提供了一种重组菌，其包含上述转录因子DkMYB21，或包含上述重组表达载体。
本发明第五方面提供了一种调控柿中单宁生物合成的方法，具体为：将上述转录因子DkMYB21导入柿生物材料中得到稳定的转基因植株。
进一步地，在上述技术方案中，获得转基因植株的方法可以为：将包含转录因子DkMYB21的片段连接到载体上，将重组载体转化根癌农杆菌后侵染柿生物材料，并筛选培养获得转基因植株。
更进一步地，所述柿生物材料为柿组培苗或柿下胚轴。
本发明第六方面提供了上述转录因子DkMYB21、或重组表达载体，或重组菌在调节柿单宁生物合成中的应用，具体为：将转录因子DkMYB21的序列插入过表达或者沉默载体，再将重组载体转化根癌农杆菌后侵染柿生物材料，达到将重组载体导入柿生物材料的细胞中的目的，获得瞬时或者稳定的转化材料，进而通过影响DkMYB21表达情况调控转化材料中单宁的累积。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明通过转录组差异表达基因首次鉴定到一个DkMYB21转录因子，其在柿果实发育早期具有较高的表达模式，其可通过激活单宁合成基因的表达从而促进柿果实中单宁的合成，是柿单宁生物合成正调控转录因子，丰富了柿单宁合成的转录调控网络；
2)本发明中鉴定到的DkMYB21转录因子对完全甜柿育种具有重要意义，可通过现代基因工程技术，在柿中敲除或者沉默DkMYB21基因，达到显著降低柿单宁生物合成的目的，为涩柿“甜柿化”改造提供了重要的基因资源。
附图说明
图1为DkMYB21基因在不同脱涩类型柿果实发育时期的表达量分析图；
图2为DkMYB21转录自激活活性检测结果图；
图3为瞬时超表达DkMYB21时柿叶单宁含量的检测结果图；
图4为瞬时沉默DkMYB21时柿叶单宁含量的检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
本发明从不同脱涩类型柿品种数据库中筛选得到在果实发育早期特异表达DkMYB21基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，可正调控柿中单宁的生物合成。
本实施例检测了该基因在不同柿品种中的果实于不同发育时期的表达差异，具体为：
提取不同脱涩类型柿品种‘罗田甜柿’、‘磨盘柿’和‘阳丰’的不同发育时期的果实RNA，并反转录成cDNA后进行实时荧光定量PCR实验(qRT-PCR)。每个基因扩增均伴有以D.kakiThunb.Actin(GenBank Accession No.AB219402)作为内参基因。本实施例具体采用难提植物总RNA小提试剂盒进行果实总RNA的提取(Magen)，反转录使用PrimeScriptTM RTreagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara Bio，Japan)。
其中，qRT-PCR实验采用SYBR Premix Ex Taq II(Takara Bio，Japan)试剂，按照其说明书进行试剂配制，完成后于ABI QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR仪上样检测。反应程序为：第一阶段(1个循环)：50℃、2min，95℃、10min；第二阶段(40个循环)：95℃、10s，58℃、30s，72℃、30s；第三阶段(1个循环)：95℃、15s，60℃、60s，95℃、15s。qRT-PCR实验采用的引物具体为：DkMYB21定量引物的序列如SEQ ID NO:3～4所示，内参基因DkActin定量引物的序列如SEQ ID NO:5～6。。
实验结果如图1所示(所有结果显示为具有相应标准差的均值(SD))：DkMYB21均在三个品种‘罗田甜柿’、‘磨盘柿’和‘阳丰’花后2.5周的果实中具有最高的表达量，此后在中国柿种质‘罗田甜柿’和‘磨盘柿’花后5周仍具有较高表达量，而此时在‘阳丰’中的表达量几乎检测不到；随着果实发育，DkMYB21在‘罗田甜柿’果实中持续表达直至花后25周。
实施例2
本实施例通过DkMYB21基因克隆并构建表达载体探究了DkMYB21基因的转录激活活性以及激活结构域，具体步骤如下：
(1)采用的酵母载体为pGBKT7，选用BamHI和EcoRI两个限制性酶切位点对载体进行双酶切。双酶切完成后，对线性化的载体进行切胶回收。
(2)设计不同的引物对DkMYB21基因的全长CDS序列(所用引物的序列如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示)、以及各分段序列R2端(所用引物的序列如SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:9所示)、R3端(所用引物的序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示)以及Cter端(所用引物的序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:8所示)分别进行扩增获得带有同源臂的片段，扩增选用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara Bio，Japan)高保真酶。扩增得到的目的条带后进行切胶回收。
(3)使用无缝克隆技术将步骤(2)所得回收后的产物片段连接到步骤(1)所得线性化的载体上，获得DkMYB21基因的全长序列的重组载体pGBKT7-FL、以及各分段片段的重组质粒pGBKT7-R2/R3/Cter。其中，无缝克隆所用试剂为ClonExpress II onestepcloningkit(诺唯赞)。
将构建成功的重组质粒以及空载(pGBKT7)在AH109酵母菌株中进行转化探究DkMYB21转录激活活性以及激活结构域。实验结果如图2所示：所有酵母转化菌株(对照组pGBKT7空载和实验组)均能在SD/-T选择培养基上生长，但只有转化pGBKT7-FL和pGBKT7-Cter的酵母细胞能在SD/-T/-A/-H缺陷培养基上生长并且在含X-α-gal的培养基上变蓝色。以上结果说明，DkMYB21转录因子具有转录激活活性，且其转录激活结构域在C端序列上。
实施例3
本实施例采用超表达重组载体和沉默重组载体调控柿中单宁的生物合成，具体过程如下：
(1)重组载体的制备
设计带有限制性酶切位点的DkMYB21基因特异引物，且其序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示，以‘罗田甜柿’的cDNA为模板，扩增获得DkMYB21基因CDS序列，并将其整合至超表达载体上，由CaMV 35S启动子驱动，超表达重组载体在细菌以及植物中抗性均为Kan，所得超表达重组载体记为35S:DkMYB21，并将其通过化学转化法转入农杆菌GV3101菌株中。
设计带有载体同源臂的基因特异引物，且其序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO:16所示，扩增DkMYB21基因3’端非保守区域355bp的片段(扩增引物包含pTRV2载体同源臂序列)；扩增完成后纯化扩增产物，并使用无缝克隆技术将片段与线性化的病毒诱导的基因沉默pTRV2载体(载体经BamHI和SmaI限制性内切酶线性化处理)进行连接。经测序确认，得到构建成功的pTRV2-DkMYB21载体，并将其用于农杆菌GV3101转化。
(2)将带有35S:DkMYB21、pTRV2-DkMYB21重组载体的农杆菌菌液以及对照组(含空载的农杆菌液)瞬时侵染柿叶获得DkMYB21过表达以及沉默柿叶材料，具体过程为：
①农杆菌活化：将DkMYB21的超表达载体、VIGS载体pTRV2-DkMYB21和pTRV1，以及各自的空载对照载体在含Kan(50mg/L)的LB固体培养基上进行划线复苏、活化后进行菌液大摇；
②DkMYB21超表达载体农杆菌浸染液制备：大摇的菌液OD600达到0.8左右后，停止培养，离心收集菌体。用渗透液(含10mM MES，10mM MgCl2，200μM乙酰丁香酮)重悬菌体，并调整超表达载体和其空载的菌液OD600＝0.6～0.8，室温孵育2～3h(超表达载体对照组为超表达载体空载)；
③VIGS载体农杆菌侵染液的制备：用渗透液悬浮pTRV2-DkMYB21、pTRV1和pTRV2菌体，将其菌液OD600调整至1.0，取等体积侵染液pTRV1:pTRV2-DkMYB21＝1:1混合，室温孵育2～3h即可用于侵染(对照组为pTRV1与pTRV2空载等体积混合)；
④柿叶片注射：先用注射器针头在叶片背面轻轻划出小裂纹2～3mm，然后用1mL塑料注射器(去掉针头)将农杆菌侵染菌液通过造伤处渗透至叶片组织细胞中，并做好标记；
⑤叶片采集：浸染7d后，采集侵染后的叶片，并立即用冰带回实验室；
⑥叶片处理及保存：取一片叶片，去掉叶脉，并用打孔器或手术刀去掉注射口处的叶片，处理后的叶片称取0.1g于2mL的离心管中，此叶片用于可溶以及不溶性单宁含量的测定，剩余叶片保存在密封袋中用于RNA抽提进行后续定量分析，两份叶片立即用液氮速冻后保存于-80℃。按照以上步骤依次处理剩下的叶片。
采用DMACA法对采集的叶片中的可溶性和不溶性单宁含量进行测定，具体实验步骤如下：
可溶性单宁提取及测定：
①称取0.1g样品，液氮研磨充分后加入5mL 70％丙酮(含1％抗坏血酸)，涡旋混匀后置于振荡摇床上避光摇1h；
②12,000g离心10min后，将上清液移入新的10mL的离心管；打开沉淀的离心管盖子，风干沉淀；
③在上清液中加入等体积的氯仿(约4mL)，上下混匀5min，12,000g离心10min，吸取上清液；
④重复步骤③；
⑤在得到的含可溶性单宁的上清液中加入等体积的正己烷，混匀离心(4,000g，10min)，将下层液转入新的离心管中，此为最终的含可溶性单宁待测液；
⑥取1mL待测液+1mL 0.2％DMACA溶液，混匀，黑暗中反应20min后测定OD640(注：在反应前，应先用待测液做一下预实验，看是否需要用溶剂丙酮稀释后再进行吸光度测定)。按照儿茶素的标准曲线进行可溶性单宁定量。
不溶性单宁提取及测定：
①②同可溶性单宁；
③向风干的沉淀残渣中加入5mL 5％盐酸-正丁醇溶液，混匀后室温超声1h(超声时间过久，水温易升高，注意控制水温不要过热)；
④超声后的溶液离心(4,000g，10min)，取上清液。上清液均匀分成两份：一份取2mL于OD550测定吸光度；另一份装入15mL离心管中，煮沸1h(于通风橱内)，冷却至室温后测定OD550吸光度。利用原花青素B1并进行上述同样操作后制作标准曲线进行不溶性单宁的定量。将测定获得的两个值相减即是不溶性单宁的含量。
瞬时超表达柿叶后，对DkMYB21表达量显著升高叶片的单宁含量进行测定，结果显示：超表达叶片中可溶性单宁含量显著升高，而不溶性单宁含量未发生显著变化(图3)。
在柿叶片利用VIGS技术瞬时沉默了DkMYB21后，选择DkMYB21表达量显著降低的叶片进行单宁含量测定结果显示：沉默后柿叶片可溶性单宁显著降低，不溶性单宁含量无显著性变化(图4)。
综上所述，DkMYB21为柿果实发育早期特异表达基因，具有促进柿果单宁累积的作用；在柿叶中瞬时超表达DkMYB21可显著促进可溶性单宁的生物合成，瞬时沉默DkMYB21基因则可抑制单宁的累积，因此通过调控DkMYB21基因的表达可调控柿单宁的累积模式。
以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种正调控柿单宁合成的转录因子DkMYB21，其特征在于，所述转录因子DkMYB21的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其核苷酸序列为在SEQ ID NO:1所示序列中存在一个或多个核苷酸的缺失、添加和/或取代但功能不变的序列。
2.一种由权利要求1所述转录因子DkMYB21编码的蛋白质。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的转录因子DkMYB21。
4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求1所述的转录因子DkMYB21，或包含权利要求3所述的重组表达载体。
5.一种调控柿单宁生物合成的方法，其特征在于，将权利要求1所述的转录因子DkMYB21导入柿生物材料中得到转基因植株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，获得所述转基因植株的方法具体为：将包含所述转录因子DkMYB21的片段连接到载体上，通过农杆菌介导转化法侵染柿生物材料中，并筛选培养获得转基因植株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述柿生物材料为柿组培苗或柿下胚轴。
8.权利要求1所述的转录因子DkMYB21，或权利要求3所述的重组表达载体，或权利要求4所述的重组菌在调节柿单宁生物合成中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将重组表达载体导入柿组织的细胞中，通过影响DkMYB21表达量调控单宁的生物合成。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述柿组织为柿叶、柿组培苗或柿下胚轴。
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