CN116555295A - 一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因属于植物分子生物学和基因工程技术领域，提供了一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。根据PpyPPO4基因全长序列设计VIGS引物，以高褐变品种‘威宁大黄梨’果实cDNA为模板，PCR扩增PpyPPO4基因的截断片段，截断片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；将截断片段与pTRV2‑VIGS载体相连，构建pTRV2‑PpyPPO4‑VIGS载体。通过VIGS瞬时转化技术可以显著降低易褐变品种‘威宁大黄梨’果实的PPO酶活及褐变。本发明构建的PpyPPO4基因VIGS载体可以显著抑制砂梨果实的酶促褐变，可利用基因工程基因干涉或敲除该基因，在水果低褐变或不褐变的分子育种中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物学和基因工程技术领域，具体是指一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因。
背景技术
果蔬在鲜食、贮运、包装或加工过程中受机械损伤后极易发生变色，这种现象被称为酶促褐变。据估计，超过50％热带和亚热带水果和蔬菜损失由酶促褐变造成。酶促褐变是指植物质体内储存的多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)在细胞损伤变成有氧条件下，催化液泡内酚类底物产生醌并形成褐色聚合物的过程。
梨(Pyrus spp.)是我国第三大栽培水果，酶促褐变也发生在梨鲜食、运输、包装、贮藏、加工等生产各环节，严重影响梨果外观品质和内在品质，大大降低其商品价值。低褐变种质创新和酶促褐变抑制技术研发是解决梨酶促褐变问题的关键，研究梨酶促褐变调控机理是重要的基础和前提。目前，国内外梨酶促褐变研究主要集中在生理机制方面，在其调控机制方面尚缺乏深入研究。酶促褐变多由高含量多酚和高水平PPO酶活引起，介于酚类物质在植物的抗病、抗虫、抗逆起到重要的作用，抑制PPO基因表达或活性是解决酶促褐变问题最直接有效的方法。
PPO是一类核基因编码酶，受多个基因控制，主要存在质体类囊体腔中，在植物中主要指儿茶酚氧化酶。PPO基因多基因家族性决定PPO的功能和活性各有差异。比如马铃薯9个不同PPO基因对褐变相关PPO活性的贡献不一样，其中一个PPO基因贡献率达到55％，说明影响酶促褐变的PPO基因虽然是多基因控制的但是存在关键的一个或几个PPO基因，通过CRISPR/Cas9技术将StPPO2基因突变后可显著降低PPO活性和酶促褐变。
前人通过生物信息学分析在GDR数据库的西洋梨中发现8个PPO基因序列。如专利申请号为CN200510019062.8的莲多酚氧化酶的基因序列及用途公开了莲幼叶cDNA中PPO基因的7个克隆序列，长度在978bp－1057bp，编码326－352个氨基酸，而且7个核苷酸序列及其相对应的7个氨基酸序列之间都有明显的差异。与GenBank中其它物种的PPO进行比较，其核苷酸序列相似性至少达到79％，氨基酸序列相似性至少达到61％。该基因的成功克隆，通过反义抑制或超量表达等生物工程方法选择性调节特定的莲器官、组织中PPO表达，抑制了莲藕的酶促褐变，增加了莲的抗虫抗病性。然而，目前关于梨中多酚氧化酶基因的功能分析鲜有报道，梨PPO家族的哪些成员在梨果实酶促褐变过程中发挥作用也不明确。因此，挖掘和利用PPO基因，明晰PPO基因在梨果实酶促褐变中的功能，对梨低褐变基因资源挖掘和酶促褐变控制技术研发具有重要的理论意义和应用价值。
发明内容
本发明要解决上述技术问题，提供针对梨低褐变基因资源挖掘和利用不足的的现状，本发明的目的是提供梨PpyPPO4基因及其应用，能够通过调控它们基因表达达到调控梨果实酶促褐变的效果。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因，所述的基因的全长核酸序列如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，并包含1764bp的开放阅读框和编码587个氨基酸。
优选地，所述的编码587个氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示的截断片段核苷酸序列。
优选地，根据所述的基因全长序列设计VIGS正向引物VIPPO4-Xba I-F和反向引物VIPPO4-Bam HI-R。
优选地，所述的正向引物VIPPO4-Xba I-F的序列为5’
-AGGTTACCGAATTCTCTAGAACCACCCTCTTCCGCTCT-3’。
优选地，所述的反向引物VIPPO4-Bam HI-R的序列为5’
-CGTGAGCTCGGTACCGGATCCGTCTGGAAGTGCCCGCAT-3’。
一种利用梨多酚氧化酶PpyPPO4基因制成侵染砂梨果实的方法，包括以下步骤：
S1、根据所述的基因全长序列为引物，并用PCR扩增基因截断序列，截断序列的长度为441bp，其序列如SEQ ID No.3所示的基因截断序列；
S2、将基因截断序列与pTRV2-VIGS载体相连，构建pTRV2-PpyPPO4-VIGS载体；
S3、将pTRV1与pTRV2-PpyPPO4-VIGS载体1∶1混合制成侵染砂梨果实。
采用以上配方后，本发明具有如下优点：
1、本发明通过克隆梨多酚氧化酶基因的家族成员得到PpyPPO4，分析了不同褐变的砂梨资源果实酶促褐变过程中的表达模式。并利用VIGS技术诱导PpyPPO4基因沉默，降低多酚氧化酶活性，从而抑制酶促褐变。PpyPPO4基因的发现对低褐变资源创新具有积极的理论指导意义。
2、由于VIGS作用机制是基于目标基因的同源性，基因截断序列如果选择不当可能会造成基因沉默的‘脱靶’，影响基因沉默效果。本发明中设计的PpyPPO4基因截断序列，通过验证可有效沉默目标基因。通过该基因片段的干涉或敲除可达到有效抑制褐变，从而在水果低褐变或不褐变的分子育种中发挥重要作用。
上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不意以任何方式进行限制。除上述描述的示意性的方面、实施方式和特征之外，通过参考全文和以下的详细描述，本发明进一步的方面、实施方式和特征将会是容易明白的。
附图说明
图1是实施例一中从转录测序分析中筛选的PpyPPO4基因(A)图，基因克隆的PCR扩增凝聚电泳结果为(B)图；
图2是实施例二中不同褐变型果实鲜切前后1h对比状态(A)，以及不同样品的褐变度分析(B)、PpyPPO4相对表达量分析(C)和PPO酶活分析(D)；
图3是实施例三中PpyPPO4沉默载体瞬时转化梨果实表型变化(A)，以及转化样品的褐变度(B)和PPO酶活分析(C)。
具体实施方式
现在将详细提及本发明的具体实施方案。尽管结合这些具体的实施方案描述本发明，但应认识到不打算限制本发明到这些具体实施方案。相反，这些实施方案意欲覆盖可包括在由权利要求限定的发明精神和范围内的替代、改变或等价实施方案。在下面的描述中，阐述了大量具体细节以便提供对本发明的全面理解。本发明可在没有部分或全部这些具体细节的情况下被实施。在其它情况下，为了不使本发明不必要地模糊，没有详细描述熟知的工艺操作。
当与本说明书和附加权利要求中的“包括”、“方法包括”、或类似语言联合使用时，单数形式“某”、“某个”、“该”包括复数引用，除非上下文另外清楚指明。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面结合全文对本发明做进一步的详细说明。
结合附图1-3，所述的基因的全长核酸序列如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，并包含1764bp的开放阅读框和编码587个氨基酸。
其中全长核酸序列如：
ATGGCTTCATCTCCCTTACCACCAACTTCTACAATGGCCGCCCTGCACTCCACCACCACAACCACCCTCTTCCGCTCTCCTTTATTCCCAAACAAGTCCCAGACTCCACTGCAACGAAAACCCAAACAATGCCTTGCGGGCAGAGTGCGCTGCAAAGCAACAAAAGGTGACAACGATAACCTAGACCAGGGCCTAGCAAGACTCGACAGGAGGAACATGCTGATAGGTTTAGGCGCCGGGGGTCTCTACGGTGCGGCAGGAAACCCATTTGCTTTTGCCGCACCAATATCCGCCCCAGACCTGACCACGTGTGGCCCTGCCGACAAGCCAGACGGGTCCACCATCGATTGTTGCCCACCTACCACCACGACCATCATCGACTTCAAACTCCCCGACAAAGGCCCACTCCGCACTAGGCCCGCTGCTCAGGACGTTGCAAAAGACCCTGCATACTTGGCCAAATACAAAAAGGCCGTCGAGCTGATGCGGGCACTTCCAGACGACGACCCGCGCAGTCACGCCCAACAGGCCATGGTACACTGCTCCTACTGCGACGGTGGATACCCACAAGTCGGATATTCGGATTTGGAGATCCAAGTTCACTACTGTTGGCTCTTCTTCCCGTTCCATCGTTGGTACCTCTACTTCTACGAGAAAATCTTGGGCGAGCTTATTGGGGACCCAACCTTCGCCCTCCCCTTCTGGAACTGGGACGCGCCAGCTGGCATGTACATTCCTGAGATTTTCACCGACACGTCGTCATCCCTCTACGACCAGTACAGAAATGCAGCGCATCAGCCCCCGAAGCTCCTGGACTTGAATTACAGCGGGACCGACGATGACGTCGACGACCCCACACGAATCAAAGAGAACTTAACAACGATGTACCAGCAGATGGTGTCGAAGGCCACCTCTCACAGACTCTTCTACGGAGAGCCCTACAGCGCAGGGGACGACCCAAGCCCTGGCGCCGGAAACATTGAGAGCATTCCCCATAACAATATTCACTTTTGGACTGGCGACCCAACCCAGACAAACGGGGAGGACATGGGGGCCTTTTACTCTTCGGGGAGGGATCCGCTGTTTTACTCCCACCATTCCAACGTGGACCGCATGTGGTCTATATACAAAGATAAGTTGGGCGGTACGGACATAGAAAAGACCGACTGGCTGGACACGGAGTTCTTGTTCTACGACGAGAAAAAGAATCTCGTGCGCGTCAAGGTTCGGGACTCGCTCGACACGAAAAAACTGGGGTACGTGTACGACCAGAAAGTCCCGATCCCGTGGCTGAAATATAAGCCGACGGCTCGTAAGTCGACGAATAAGAGAAAAGCCTCGGTTTCATCTTCTGATCTTACTACGACGTTCCCTGCTGTACTGTCGGATACAATCAGCGTCGAGGTGACGAGGCCGTCTGCGACGAAGCGGACAGCTGCCCAGAAGAAGGCGCAGGACGAGGTGCTGGTGATTAAGGGGATTGAGTTTGCCGGGAATGAGACTGTGAAGTTCGACGTGTTTGTGAACGATGACGCGGACTCGCTGGCCGGGAAAGACAAGTCGGAGTTTGCTGGGAGTTTCGTTCACGTGCCGCATAAGCATAAGAAAAATATTAAGACGAACCTGCGGCTGAGCATTGCGAGCTTGTTGGAGGAGTTGGCTGCGGAGACGGACAGCAGTTTGGTGGTGACTTTGGTGCCGAAAGTTGGGAAGGGGCCAATCACCATCGGAGGGTTTAGCATTGAGCTCATTAATACTACCTAA(SEQ ID No.1)。
所述的编码587个氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示的截断片段核苷酸序列。
其中截断片段核苷酸序列如下：
MASSPLPPTSTMAALHSTTTTTLFRSPLFPNKSQTPLQRKPKQCLAGRVRCKATKGDNDNLDQGLARLDRRN
MLIGLGAGGLYGAAGNPFAFAAPISAPDLTTCGPADKPDGSTIDCCPPTTTTIIDFKLPDKGPLRTRPAAQDVAKD
PAYLAKYKKAVELMRALPDDDPRSHAQQAMVHCSYCDGGYPQVGYSDLEIQVHYCWLFFPFHRWYLYFYEKILGEL
IGDPTFALPFWNWDAPAGMYIPEIFTDTSSSLYDQYRNAAHQPPKLLDLNYSGTDDDVDDPTRIKENLTTMYQQMV
SKATSHRLFYGEPYSAGDDPSPGAGNIESIPHNNIHFWTGDPTQTNGEDMGAFYSSGRDPLFYSHHSNVDRMWSIY
KDKLGGTDIEKTDWLDTEFLFYDEKKNLVRVKVRDSLDTKKLGYVYDQKVPIPWLKYKPTARKSTNKRKASVSSSD
LTTTFPAVLSDTISVEVTRPSATKRTAAQKKAQDEVLVIKGIEFAGNETVKFDVFVNDDADSLAGKDKSEFAGSFV
HVPHKHKKNIKTNLRLSIASLLEELAAETDSSLVVTLVPKVGKGPITIGGFSIELINTT*(SEQ IDNo.2)。
根据所述的基因全长序列设计VIGS正向引物VIPPO4-Xba I-F和反向引物VIPPO4-Bam HI-R。
所述的正向引物VIPPO4-Xba I-F的序列为5’
-AGGTTACCGAATTCTCTAGAACCACCCTCTTCCGCTCT-3’。
所述的反向引物VIPPO4-Bam HI-R的序列为5’
-CGTGAGCTCGGTACCGGATCCGTCTGGAAGTGCCCGCAT-3’。
一种利用梨多酚氧化酶PpyPPO4基因制成侵染砂梨果实的方法，包括以下步骤：
S1、根据所述的基因全长序列为引物，并用PCR扩增基因截断序列，截断序列的长度为441bp，其序列如SEQ ID No.3所示的基因截断序列；
S2、将基因截断序列与pTRV2-VIGS载体相连，构建pTRV2-PpyPPO4-VIGS载体；
S3、将pTRV1与pTRV2-PpyPPO4-VIGS载体1∶1混合制成侵染砂梨果实。
其中基因截断序列如下：
ACCACCCTCTTCCGCTCTCCTTTATTCCCAAACAAGTCCCAGACTCCACTGCAACGAAAACCCAAACAATGCC
TTGCGGGCAGAGTGCGCTGCAAAGCAACAAAAGGTGACAACGATAACCTAGACCAGGGCCTAGCAAGACTCGACAGG
AGGAACATGCTGATAGGTTTAGGCGCCGGGGGTCTCTACGGTGCGGCAGGAAACCCATTTGCTTTTGCCGCACCAAT
ATCCGCCCCAGACCTGACCACGTGTGGCCCTGCCGACAAGCCAGACGGGTCCACCATCGATTGTTGCCCACCTACCA
CCACGACCATCATCGACTTCAAACTCCCCGACAAAGGCCCACTCCGCACTAGGCCCGCTGCTCAGGACGTTGCAAAA
GACCCTGCATACTTGGCCAAATACAAAAAGGCCGTCGAGCTGATGCGGGCACTTCCAGAC(SEQ IDNo.3)。
以砂梨‘威宁大黄梨’cDNA为模板，将基因全长序列为引物为引物，PCR扩增PpyPPO4基因截断序列，截断序列的长度为441bp，其序列如SEQ ID No.3所示；将步骤的PpyPPO4基因截断序列与pTRV2-VIGS载体相连，构建pTRV2-PpyPPO4-VIGS载体；将pTRV1与pTRV2-PpyPPO4-VIGS载体1∶1混合侵染砂梨果实，可明显降低多酚氧化酶活性，抑制果实褐变。
实施例一：PpyPPO4基因的筛选与克隆。
前期以低褐变品种‘鄂梨2号’(LB)和高褐变品种‘威宁大黄梨’(HB)在果肉鲜切的0h和1h为实验样品，进行Illumina转录组测序，通过差异基因筛选，发现在不同褐变品种中有2个差异表达的PPO基因和4个POD基因，PpyPPO4在高褐变‘威宁大黄梨’的表达量高于PpyPPO2和其它POD基因，如图1A所示。进一步分析表明该基因与砂梨果实酶促褐变紧密相关。
PpyPPO4引物合成：根据蔷薇科植物基因组数据库中梨基因组数据公布的参考基因信息，设计引物，正向引物为5’-ATGGCTTCATCTCCCTTA-3’，反向引物为5’-TTAGGTAGTATTAATGAG-3’。
砂梨RNA提取与基因扩增：以高褐变‘威宁大黄梨’果肉为样本，采用植物RNA提取试剂盒提取果肉总RNA。将质量检测合格的RNA用cNDA反转录试剂盒进行cDNA第一条链的合成。以反转录合成的cDNA为模板，利用引物上述正向和反向引物进行PCR扩增；反应程序为：98℃5min；98℃10s，55℃30s，72℃90s，35个循环，72℃10min。
PCR产物检测与回收测序：PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，如图1B所示，回收PCR产物并与p MD-18T载体连接。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性克隆鉴定后进一步测序验证。测序结果显示，克隆所获基因大小为1764bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸长度为587个氨基酸。
实施例二：不同砂梨褐变型果实中PpyPPO4基因的表达差异分析。
为了进一步明确PpyPPO4与酶促褐变的关系，采用Real-time PCR的方法分别检测不同砂梨褐变型果实中的表达情况，同时检测果实的PPO酶活与褐变度。
样品采集：实验样品采自国家砂梨种质资源圃(武汉)8年生的低褐变品种‘鄂梨2号’(LB)和高褐变品种‘威宁大黄梨’(HB)的成熟果实各10个，采集果实鲜切0h的果肉样品LB-0h、HB-0h，鲜切后在空气中放置1h样品LB-1h和HB-1h，如图2A所示。
果实褐变度检测：采用色差仪检测鲜切果实的色度值L*、a*、b*等指标，褐变度BI计算公式：
BI＝(x-0.31)/0.172×100；
x＝(a*+1.75L*)/(5.645L*+a*-3.012b*)。
结果显示‘威宁大黄梨’鲜切1h后果实褐变度明显高于低褐变品种‘鄂梨2号’，如图2B所示。
PpyPPO4表达量分析：提取上述4个样品的总RNA并反转录为cDNA，根据PpyPPO4基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1设计其荧光定量引物，正向引物为5’-ACCACCACAACCACCCTCTT-3’，反向引物为5’-TCTTGCTAGGCCCTGGTCTA-3’。以梨YLS8基因作为内参基因，每个样品进行三次生物学重复，采用法计算各基因的相对表达水平。PCR反应程序为：95℃和3min，95℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环；后做65℃到95℃溶解曲线分析。所用仪器为BIO-RAD CFX ConnectTM荧光定量PCR仪。结果显示在PpyPPO4在高褐变品种‘威宁大黄梨’(HB)鲜切前后的相对表达量都显著高于低褐变品种‘鄂梨2号’，如图2C所示。
不同样品的PPO酶活检测：采用PPO检测试剂盒提取上述样品的酶，采用分光光度计检测，以每ml反应样品在530nm波长处每分钟吸光度变化0.005表示1个PPO活性单位(U)。结果显示，在高褐变品种‘威宁大黄梨’鲜切0h的PPO酶活最高，如图2D所示，与PpyPPO4相对表达一致，说明PpyPPO4直接影响砂梨果实酶促褐变。
实施例三：TRV介导砂梨果实PpyPPO4基因沉默。
载体构建：将pTRV2进行XbaI和BamHI双酶切，回收大片段作为线性化pTRV2-VIGS连接载体。设计与pTRV2片段互为反向互补且带有XbaI和BamHI酶切位点的PpyPPO4基因特异性引物，正向引物为5’-AGGTTACCGAATTCTCTAGAACCACCCTCTTCCGCTCT-3’，反向引物为5’-CGTGAGCTCGGTACCGGATCCGTCTGGAAGTGCCCGCAT-3’。从实施例一中的cDNA中扩增441bp的PpyPPO4截断片段，其序列如SEQ ID No.3所示。回收此片段作为插入片段，并将该片段连接到线性化的pTRV2-VIGS载体，构建pTRV2-PpyPPO4-VIGS载体，并转入大肠杆菌DH5α感受态中，挑取阳性菌株，经PCR鉴定测序，测序结果如SEQ ID No.4所示，发现所测序列含有目的基因的序列，表明PpyPPO4截断片段连接至pTRV2载体，将pTRV2-PpyPPO4-VIGS载体转入农杆菌菌种GV3101中备用。
其中测序结果序列如下：
TGGGTGGGAAAAAGATGGACATTGTTACTCAAGGAAGCACGATGAGCTTTATTATTACGGACGAGTGGACTTAGATTCTGTGAGTAAGGTTACCGAATTCTCTAGAACCACCCTCTTCCGCTCTCCTTTATTCCCAAACAAGTC CCAGACTCCACTGCAACGAAAACCCAAACAATGCCTTGCGGGCAGAGTGCGCTGCAAAGCAACAAAAGGTGACAAC GATAACCTAGACCAGGGCCTAGCAAGACTCGACAGGAGGAACATGCTGATAGGTTTAGGCGCCGGGGGTCTCTACG GTGCGGCAGGAAACCCATTTGCTTTTGCCGCACCAATATCCGCCCCAGACCTGACCACGTGTGGCCCTGCCGACAA GCCAGACGGGTCCACCATCGATTGTTGCCCACCTACCACCACGACCATCATCGACTTCAAACTCCCCGACAAAGGC CCACTCCGCACTAGGCCCGCTGCTCAGGACGTTGCAAAAGACCCTGCATACTTGGCCAAATACAAAAAGGCCGTCG AGCTGATGCGGGCACTTCCAGACGGATCCGGTACCGAGCTCACGCGTCTCGAGGCCCGGGCATGTCCCGAAGACATTAAACTACGGTTCTTTAAGTAGATCCGTGTCTGAAGTTTTAGGTTCAATTTAAACCTACGAGATTGACATTCTCGACTGATCTTGATTGATCGGTAAGTCTTTTGTAATTTAATTTTCTTTTTGATTTTATTTTAAATTGTTATCTGT(SEQID No.4)。
菌液活化：取pTRV1、pTRV2、pTRV2-PpyPPO4-VIGS的农杆菌GV3101划线到LB固体培养基(含卡那霉素50mg/L)上28℃培养，进行一次活化；两天后挑取单克隆进行二次活化，一天收集二次活化长起来的农杆菌至100ml大小锥形瓶中，加入适量(30-50ml)液体抗性LB培养基，28℃，200r·min-1，活化培养24h。
梨果实PpyPPO4基因VIGS转化：收集培养好的农杆菌菌液(6000rpm,5min)，加入AS侵染液(0.01M MgCl2，0.01M MES，200uM AS)调整菌液OD值至0.8左右，PTRV1与PTRV2或pTRV2-PpyPPO4-VIGS菌液1：1混合，避光25℃左右诱导3～5h侵染。选取花后90d高褐变品种‘威宁大黄梨’砂梨果实，用1mL注射器采用注射压迫法注射到果实赤道面上。注射完毕后避光保存1d后光下透气放置，4d后检测果实的褐变度并收集样品。
VIGS瞬时转化砂梨果实的褐变度和PPO酶活分析：采用TRV介导的VIGS梨果实瞬时转化技术，PpyPPO4基因沉默后，梨果实鲜切后1h的褐变度明显低于超表达的果实，如图3A和图3B所示。PPO酶活检测表明PpyPPO4沉默后，果实鲜切0h和1h酶活低于超表达样品，如图3C所示，说明沉默PpyPPO4表达后通过降低PPO酶活抑制果实的褐变。
本发明通过克隆梨多酚氧化酶基因的家族成员得到PpyPPO4，分析了不同褐变的砂梨资源果实酶促褐变过程中的表达模式。并利用VIGS技术诱导PpyPPO4基因沉默，降低多酚氧化酶活性，从而抑制酶促褐变。PpyPPO4基因的发现对低褐变资源创新具有积极的理论指导意义。
由于VIGS作用机制是基于目标基因的同源性，基因截断序列如果选择不当可能会造成基因沉默的‘脱靶’，影响基因沉默效果。本发明中设计的PpyPPO4基因截断序列，通过验证可有效沉默目标基因。通过该基因片段的干涉或敲除可达到有效抑制褐变，从而在水果低褐变或不褐变的分子育种中发挥重要作用。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，全文中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因，其特征在于，所述的基因的全长核酸序列如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列，并包含1764bp的开放阅读框和编码587个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因，其特征在于：所述的编码587个氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示的截断片段核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因，其特征在于：根据所述的基因全长序列设计VIGS正向引物VIPPO4-XbaI-F和反向引物VIPPO4-BamHI-R。
4.根据权利要求3所述的一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因，其特征在于：所述的正向引物VIPPO4-XbaI-F的序列为5’-AGGTTACCGAATTCTCTAGAACCACCCTCTTCCGCTCT-3’。
5.根据权利要求3所述的一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因，其特征在于：所述的反向引物VIPPO4-BamHI-R的序列为5’
-CGTGAGCTCGGTACCGGATCCGTCTGGAAGTGCCCGCAT-3’。
6.一种利用梨多酚氧化酶PpyPPO4基因制成侵染砂梨果实的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、根据所述的基因全长序列为引物，并用PCR扩增基因截断序列，截断序列的长度为441bp，其序列如SEQ ID No.3所示的基因截断序列；
S2、将基因截断序列与pTRV2-VIGS载体相连，构建pTRV2-PpyPPO4-VIGS载体；
S3、将pTRV1与pTRV2-PpyPPO4-VIGS载体1∶1混合制成侵染砂梨果实。
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