CN102154267B

CN102154267B - 单链非编码MicroRNA四及其用途

Info

Publication number: CN102154267B
Application number: CN 201010609742
Authority: CN
Inventors: 陈智; 陈�峰; 郑敏; 李淑萍; 刘东成
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-12-28
Filing date: 2010-12-28
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2030-12-28
Also published as: CN102154267A

Abstract

本发明公开了一种单链非编码MicroRNA，该MicroRNA159a为SEQIDNO：1所示的序列。本发明还同时公开了上述单链非编码MicroRNA在制备诊断乙型重症肝炎的试剂盒中的应用。本发明还同时公开了一种用于诊断乙型重症肝炎的试剂盒，包括PCR试剂、探针、上游引物和下游引物；探针为SEQIDNO：5所示的序列，上游引物为SEQIDNO：3所示的序列，下游引物为SEQIDNO：4所示的序列。

Description

单链非编码MicroRNA四及其用途

技术领域

本发明涉及一种MicroRNA的乙肝重症病人血浆中的表达水平及其在预测和诊断乙型肝炎重症化中的作用。

背景技术

目前全球估计有3.5亿慢性乙肝病毒(HBV)携带者，有三分之一的人口感染过HBV。在我国，乙型肝炎是最为严重、最广泛的传染病之一，感染率高达60％，约有1.2亿人携带HBV。乙型肝炎的发病率居传染病首位，死亡数居传染病第三位。

乙肝重型肝炎是一类表现为短期大量肝细胞坏死导致肝功能衰竭的综合症，其死亡率极高，发展迅速，凶险而且临床预后差。并严重威胁人们身体健康的肝疾病，因此，早期诊断，以便及时采取有效的治疗措施尤其重要。

MicroRNA是由机体内源基因转录的约70nt的发夹状结构前体(pre-MicroRNA)被Dicer酶切割后产生的约22nt的非编码单链RNA片段，在进化过程中高度保守，能通过与靶基因mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译，广泛地负调控靶基因的表达。MicroRNA作为一种新的基因干预工具，具有高效、特异、快速等优点，为基因调控的研究和基因治疗的发展带来了新的视角。MicroRNA非常稳定，用于临床诊断试剂的研发具有重复性好、容易操作等优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用单链非编码MicroRNA159a制备诊断试剂盒以诊断重症肝炎。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种单链非编码MicroRNA，该MicroRNA 159a为SEQ ID NO：1所示的序列。

本发明还同时提供了上述单链非编码MicroRNA在制备诊断乙型重症肝炎的试剂盒中的应用。

本发明还同时提供了一种用于诊断乙型重症肝炎的试剂盒，包括PCR试剂、探针、上游引物和下游引物；探针为SEQ ID NO：5所示的序列，上游引物为SEQ ID NO：3所示的序列，下游引物为SEQ ID NO：4所示的序列。

作为本发明的用于诊断乙型重症肝炎的试剂盒的改进：PCR试剂为1×TaqManUniversal PCR MasteMix。

MicroRNA是一类高度保守的单链RNA(约21～23个核苷酸)，生物信息学分析表明，每个microRNA可能调节数百个靶基因，提示microRNA可能参与调节细胞生命活动中众多的信号转导途径，在细胞增殖、分化、凋亡、免疫反应及血管生成等一系列过程中发挥作用。另外，MicroRNA的异常表达将会导致生理的异常和疾病的产生，相反疾病的产生也将导致MicroRNA的表达水平的改变，人们可以利用它来反映疾病的程度并做出相应的治疗。

MicroRNA序列测定相对简单，通过基因工程技术可以比较容易地分离纯化人类外周血中存在的MicroRNA，并对其进行测序。到目前为止已经报道了超过800个MicroRNA序列，但是由于MicroRNA功能的复杂性，大部分MicroRNA的功能和用途仍属未知，因此，寻找和开发有用的MicroRNA用于临床诊断和治疗是当前研究热点。美国应用生物系统公司根据目前的研究现状研发了MicroRNA芯片(TaqMan MicroRNA Arrays)，它包含大部分已知的MicroRNA的反转录引物，利用该芯片可以检测出已知序列的这些MicroRNA表达水平的变化情况。本发明利用该芯片对乙型肝炎重症患者血浆中MicroRNA进行检测，以正常人为对照，对患者作一个比较全面的MicroRNA图谱，从中找出与乙型肝炎重症化病情变化密切相关的MicroRNA分子。利用该分子可研发预测和诊断肝炎重症化诊断试剂。

在本发明中，发明人通过检测乙型肝炎重症患者血浆中MicroRNA 159a的表达水平，观察乙型肝炎重症状态下MicroRNA的改变情况。本发明选取正常人和已被确诊为乙型肝炎重症患者的血浆，从血浆中提取RNA，利用MicroRNA表达谱芯片(美国应用生物系统公司

Human MicroRNA Array A(B))对MicroRNA进行分析。结果发现，MicroRNA 159a在乙型肝炎重症患者血浆中显著上调，即，该MicroRNA在乙型肝炎重症患者血浆中表达较正常人明显增高。提示MicroRNA 159a在乙型肝炎重症化中起着重要的调控作用，同时该MicroRNA可以作为乙型肝炎重症化的诊断标志物。

采用本发明的方法来早期诊断乙型肝炎重症化，具有如下优点：

本发明确认了MicroRNA 159a作为诊断乙肝重型肝炎的潜在靶点，能用于快速检测和诊断。

microRNA在血浆和血清中非常稳定，它们有效保护以免接触RNases，在严酷环境的条件下仍能保持稳定。因此，它们的稳定性使得其实际值与在病人身上得到的测试值吻合的很好。血清中microRNA表达谱的检测技术已经成熟，目前研究microRNA表达谱的常用技术主要有Northern杂交、表达芯片、实时荧光定量PCR和Solexa测序等，方法快速、便捷，精确度和灵敏度可满足临床需求。

血清microRNA作为临床诊断和预后的标志物，主要有以下优点：检测的损伤小、稳定性好、灵敏度高，可应用于疾病早期变化的检测。目前尚未见用于诊断乙型肝炎重症化的microRNA，但是microRNA用于诊断其他疾病已经获得许多令人鼓舞效果：例如血浆miR-92被成功用作结直肠癌的分子标志物，灵敏度可达89％，特异性达到70％，且肿瘤切除后miR-92的表达量较术前显著降低；早期诊断可以大大提高生存率和改善预后。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是MicroRNA表达谱芯片检测结果，正常人中MicroRNA159a几乎不表达，而乙型肝炎重症患者则明显的高表达。

具体实施方式

实施例1血浆中总RNA的提取

选取浙江大学医学院附属第一医院，乙型肝炎重症患者4例，同时选取4例年龄、性别相匹配的正常人，抽取4ml全血；即抽取乙型肝炎重症患者的全血、正常人的全血各4例。以U6snRNA作为内参，MicroRNA的相对表达水平用2^-ΔCt表示，检测方法相同。实时荧光定量PCR根据美国应用生物系统公司提供的

MicroRNA Arrays进行操作。

为了减少个体差异我们把不同组的血浆进行混合(即，4例患者的血浆进行混合，4例正常人的进行混合)。利用mirVana^TM PARIS^TM Kit来从血浆样品中提取总RNA，提取方法根据该试剂盒的说明书操作，过程依次如下：

1.将血浆样品(最大体积625μL)(冰上冻融)与等体积的2X Denaturing Solution室温混匀。如果血浆样品少于100ul，先加Cell Disruption Buffer到≥100μL，再加入等体积的2X Denaturing Solution，立刻充分混匀(涡旋30s)，冰上孵育5min。

2.加入试剂盒中所提供的酸化的酚/氯仿到上述混合液。

3.涡旋震荡30-60s混匀。

4.室温10,000×g离心5min分离出水相和有机相(水相在上层)。

5.转移位于上层的水相到新的EP管，并标注体积。

6.加入水相1.25倍体积的100％乙醇(室温)到水相，充分混匀。

7.将过滤柱置于Collection Tube(收集管)中，吸取裂解物和乙醇的混合物(即步骤6所得)到过滤柱上。

8.10,000×g离心30s。

9.弃滤液，重复离心，直到所有的裂解物/乙醇混合物都滤过过滤柱为止。将过滤柱重新置于收集管中。加入700μL MicroRNA Wash Solution 1到过滤柱。10,000×g离心15s。

10.弃滤液，置过滤柱到相同的收集管。

11.加入500μL Wash Solution 2/3到过滤柱。10,000×g离心15s，弃滤液，置过滤柱到相同的收集管。

12.重复步骤11。

13.10,000×g空离1min。

14.转移过滤柱到新的收集管。

15.加入100μL预热(95℃)的洗脱液或者无核酶水到过滤柱中央，闭盖，10,000×g离心30s，弃柱，收集总RNA，-20℃保存或更低温度保存。

以下实施例中所用的试剂均为常规试剂，能通过市购的方式获得，例如，可购自美国ABI公司

实施例2预扩增

1.进行逆转录(RT)

(1)冻融以下试剂：

Megaplex RT Primers

MicroRNA Reverse Transcription Kit components

MgCl₂

反应体系：

3μL(1 to 350ng)total RNA(实施例1所得)

4.5μL of RT reaction mix(如表1)

(2)混合以下试剂(如表1所述)到1.5ml微离管。

表1

(3)倒置管6次以混匀，稍微离心一下数秒。

(4)在96-well

Optical Reaction Plate或

Strip中，吸取4.5μL RT反应混合物到各孔或管。

(5)加入3μL(1 to 350ng)总RNA到含有RT反应混合物的各孔或管，得到7.5ul体积的混合液。

(6)用

Clear Adhesive Film或

Optical Strip Caps封口，接着倒置板或管6次以混匀，稍微离心一下。

(7)冰浴5min。

(8)设置以下RT运行条件(表2)，反应体积：7.5μl。

表2

获得的cDNA可以-15 to -25℃保存一周以上。

2.预扩增反应

预扩增反应体积：25μL

2.5μL RT产物(即上述RT步骤所得的cDNA)

22.5μL PreAmp reaction mix(如下表3所示)

(1)冰上冻融Megaplex^TM PreAmp Primers，倒置管6次以混匀。

(2)回荡瓶以混匀

PreAmp Master Mix(2×)。

(3)混合以下试剂(表3)到1.5ml微离管。

表3

(4)倒置管6次以混匀，稍微离心一下。

(5)在96-well

Optical Reaction Plate或者

Strips中，加入2.5μL RT产物到对应的孔或管。

(6)再加入22.5μL of PreAmp reaction mix到96-well plate或者MicroAmp Optical 8-Tube中。

(7)用

Clear Adhesive Film或

Optical Strip Caps封口，倒置板或管6次以混匀，稍微离心一下.

(8)冰浴5min。

(9)反应体积(μL)：25

(10)按照以下反应条件(表4)运行。

表4、反应条件

3.稀释反应体系

(1)拿出96-well plate或者8-tube strips。

(2)稍微离心一下。

(3)加入75μL of 0.1×TE pH 8.0到各孔或管。

(4)板或管封口，倒置板或管6次以混匀，稍微离心一下。

(5)预扩增产物保存在-15至-25℃。或者将产物置冰上进行后续实时荧光定量PCR反应。

实施例3、实时荧光定量PCR

PCR反应液的准备：

1.冰上冻融稀释保存的预扩增产物，倒置6次以混匀，稍微离心一下。

2.回荡瓶以混匀TaqMan Universal PCR Master Mix。

3.将以下试剂(表5)加到1.5mL微离管。

表5

倒置6次以混匀，接着稍微离心一下。

4.加入100μL PCR reaction mix到TaqMan MicroRNA Array的各自通道中。

5.离心，接着封口。

6.上样运行384 well TaqMan Low Density Array default thermal-cycling conditions。

7.反应完成后收集各MicroRNA的ΔCt值进行分析。具体如表6所示。

表6

MicroRNA表达谱芯片检测结果，正常人中MicroRNA 159a几乎不表达，而乙型肝炎重症患者则明显的高表达，可作为乙型肝炎重症化的诊断标志物。

实施例4、一种用于诊断乙型重症肝炎的试剂盒：

试剂盒中含有四种成分：A：1×TaqMan Universal PCR MasteMix，B：探针(SEQ ID NO：5)，C：上游引物(SEQ ID NO：3)，D：下游引物(SEQ ID NO：4)。其中，A为普通PCR试剂，可通过市购的方式获得；B、C、D是根据本发明特选的MicroRNA 159a序列设计的5uM浓度的特异的探针和引物，实际使用时需要进行稀释；也可直接选用0.2uM探针(SEQ ID NO：5)、1.5uM上游引物(SEQ ID NO：3)和0.7uM下游引物(SEQ ID NO：4)。

使用方法具体如下：

1、抽提RNA：

抽取待检患者的4ml全血，然后按照实施例1所述的方法提取血浆中总RNA；

2、预扩增：

(1)、进行逆转录(RT)

1)融解以下试剂：

stem-loop逆转录引物(SEQ ID NO：2)

MicroRNA Reverse Transcription Kit components

MgCl₂

2)反应体系：

3μL(1 to 350ng)total RNA(上述步骤1)所得)

4.5μL of RT reaction mix(如表7)

3)混合以下试剂(如表7所述)到1.5ml微离管。

表7

4)操作方法同实施例2的逆转录(RT)。

(2)预扩增反应

1)预扩增反应体积：25μL

2.5μL RT产物(即上述RT步骤所得的cDNA)

22.5μL PreAmp reaction mix(如下表8所示)

2)冰上冻融Megaplex^TM PreAmp Primers，倒置管6次以混匀。

3)回荡瓶以混匀

PreAmp Master Mix(2×)。

4)混合以下试剂(表8)到1.5ml微离管。

表8

5)操作方法同实施例2的预扩增反应。

(3)稀释反应体系同实施例2的稀释反应体系。

3、实时荧光定量PCR

(1)PCR反应液的准备：

1)冰上冻融稀释保存的预扩增产物，倒置6次以混匀，稍微离心一下。

2)回荡瓶以混匀1×TaqMan Universal PCR MasteMix；

3)将以下试剂(表9)加到0.2mL微离管。

表9

4)倒置6次以混匀，接着稍微离心一下，封口。

5)上样运行PCR反应：PCR反应程序为：95℃10min，然后运行以下程序40次循环95℃ 15s 60℃ 1min。

6)反应完成后所得的平均Ct值定义为Ct1。

4、判断：

采用同一患者的cDNA针对U6snRNA用荧光定量PCR进行检测，方法和程序同上(其所用探针和引物为通用标准品，可以由

公司购得)。反应完成后所得的平均Ct值定义为Ct2。

ΔCt＝Ct1-Ct2。当ΔCt值＜5时，判定为乙型肝炎重症化。

分别选取事先已知为健康者的4人和预先已知为乙型肝炎重症病人的4人作为实验对象，分别使用实施例4所述的试剂盒(包括使用方法)进行检测，结果如表10和表11所示；

表10、健康对照组

表11、乙型肝炎重症病人组

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQ ID NO：1

uuuggauuga agggagcucu a 21

SEQ ID NO：2

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagtaga gctc 44

SEQ ID NO：3

atctcaactg gtgtcgtgga gtc 23

SEQ ID NO：4

aggctgacga tttggattga ag 22

SEQ ID NO：5

caattcagtt gagtagagct 20

Claims

1.单链非编码MicroRNA 159a在制备诊断乙型重症肝炎的试剂盒中的应用，其特征是：MicroRNA 159a为SEQ ID NO：1所示的序列。