JP2020513421A - B型肝炎の予防または治療用医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
現在、HBV感染を抑制しうるワクチンが開発されて、新規感染率が多く減っているが、発展途上国では依然として感染の実態が深刻な実情であり、ワクチン接種前にHBVに感した患者が多く、社会的に多くの問題を引き起こしている。
HBVは3.2kbの二本鎖DNAをゲノムで有しているウイルスであり、DNAの周りはキャプシド(capsid)タンパク質が取り囲んでおり、外皮(surface)タンパク質がその周辺を覆っている形態で存在する。HBVは肝細胞に特化されている屈性(tropism)があり、非細胞毒性(non-cytotoxic)の状態で持続的な感染を起こし、宿主範囲が非常に狭くてヒトとチンパンジー以外の動物には感染されないという特徴がある(非特許文献1)。
HBVは感染後にキャプシドが解体されて遺伝子が核内に移動し、宿主の核内で二本鎖ウイルスDNAがcccDNA(covalently closed circular DNA)に転換される。cccDNAはHBV転写の鋳型(template)としてHBVライフサイクル(life cycle)において最も重要な役割を担っている。最近の研究によると、cccDNAはヒストン(histone)に巻かれており、これらの様々な変形によって調節されうるという事実が明らかになった(非特許文献2)。cccDNAはエピソーム(episome)形態のミニ染色体(minichromosome)としてHBVの全てのRNAを作るだけでなく、現在の治療剤ではこれを取り除くことができないため、慢性感染を引き起こす主な原因として知られている(非特許文献3)。
cccDNAから生成されたウイルス核酸(viral RNA)は、コア(core)、表面(surface)、ポリメラーゼ(polymerase)などを作り、細胞質からゲノムDNAへの転換が可能なプレゲノムRNA(pregenomic RNA)を中心に移入(encapsidation)が行われる。プレゲノムRNAから成功的にDNA転換まで終えたHBVビリオン(virion)は出芽(budding)される。以後、周辺肝細胞に感染したり、再感染されて着実に増殖することになる(非特許文献3)。
現在使用中のすべてのB型肝炎治療剤は核酸誘導体として、プレゲノムRNAがキャプシド内でポリメラーゼによってDNAに転換されるときに、ウイルスの新生DNA鎖に割り込んで最終的に合成を終了させる。したがって、この部分を標的とする現在のすべての薬剤は、HBVポリメラーゼのRT(reverse transcriptase)ドメイン内の活性部位に突然変異が生じると薬剤耐性を誘発するため、長期的な治療の時は、ほとんどこのような薬剤耐性の突然変異によって完全治療が難しい(非特許文献4)。
現在、FDAの承認を受けた慢性B型感染の治療剤である核酸類似体には、ラミブジン(lamivudin)、アデホビル(adefovir)、エンテカビル(entecavir)、テルビブジン(telbivudin)、クレブジン(clevudine)及びテノホビル(tenofovir)があり、これらはすべてポリメラーゼ阻害剤であるため、慢性肝炎を完治することはできない。
2014年、LuciforaらがIFN−αとリンホトキシンb受容体(Lymphotoxin b receptor;LTbR)がAPOBEC3Aまたは3Bを誘導し、これらが細胞死滅せずにcccDNAのみを選択的に除去できると報告したが、使用量が多すぎて実際の適用には困難がある(非特許文献5)。
細胞基盤のcccDNA分析方法を構築して、85,000個の化合物を分析した結果、DSS(disubstituted sulfonamides)の2つ(CCC-0975、CCC-0346)がcccDNAをある程度減らすことができることが発見されたが、薬に開発されるにはまだ効果が不足し、作用メカニズムも知られていない(非特許文献6)。
したがって、HBV感染疾患を治療するためには新しい治療法が必要である。本発明者らは、HBVのゲノムを分析して、グアニン4重合体を成し遂げられる部分を発見し、HBV遺伝子の活性を調節してHBVのcccDNAを除去する技術を開発した。グアニン4重合体(G-quadruplex)は、4つのグアニン同士の結合を基本とする4本のDNAらせんである(非特許文献7)。
また、前記医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、B型肝炎の治療または予防方法が提供される。
また、HBVと候補物質とを接触させて、グアニン4重合体を形成するかどうかを確認する段階を含む、B型肝炎治療剤のスクリーニング方法が提供される。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つ以上のヌクレオシド間のリンケージ(linkage)が化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記ヌクレオシド間のリンケージが化学的変形されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート(phosphorothioate)、ホスホロジチオエート(phosphorodithioate)、ホスホロアミデート(phosphoramidate)またはボラノホスフェート(boranophosphate)に化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つ以上の糖部(sugar moiety)が化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記糖部は、ヌクレオチド内の5炭糖の2’番位置の−H基が、メトキシエチル(MOE)、ジメチルアミノオキシエトキシ(DMAOE)、ジメチルアミノエトキシエチル(DMAEOE)、メチル( Ome)、アミノプロポキシ(AP)またはフッ素(F)に置換されて変形されたり、前記糖部が、F−ANAに置換されて変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記糖部は、LNA(locked nucleic acid)またはPNA(peptide nucleic acid)の形態に化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドは、3’または5’末端にリンカーを介してGalNAc(N-acetylgalactosamine)が結合されている形態であってもよい。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間のリンケージの化学的変形及び糖部の化学的変形からなる群から選択される2種以上の化学的変形を有するものであってもよい。
一部具体例において、2種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらにヌクレオチド内の5炭糖の2’番位置の−H基がメトキシエチル(MOE)、ジメチルアミノオキシエトキシ(DMAOE)、ジメチルアミノエトキシエチル(DMAEOE)、メチル(Ome)、アミノプロポキシ(AP )またはフッ素(F)に置換されて変形されたり、ヌクレオチドの糖部が、F−ANAに置換されて変形されたものであってもよい。
一部具体例において、2種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらに糖部がLNA(locked nucleic acid)またはPNA(peptide nucleic acid)の形態に化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、2種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらに3’または5’末端にリンカーを介してGalNAc(N-acetylgalactosamine)が結合されている形態であってもよい。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドは、HBVとグアニン4重合体(G-quadruplex)を形成するものであってもよい。
一部具体例において、前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、HBVのcccDNA(covalently closed circular DNA)を減らすものであってもよい。
一部具体例において、前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むものであってもよい。
一部具体例において、前記薬剤学的に許容可能な担体は、キトサンナノ粒子、コロイド分散システム、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、微小球体、ビーズ、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含むものであってもよいが、これに制限されるものではない。
一部具体例において、前記薬剤学的に許容可能な担体は、キトサンナノ粒子であり、前記キトサンは、50〜190kDaの分子量を有するものであってもよい。
一部具体例において、前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、経口または非経口で個体に投与されるものであってもよい。
一部具体例において、前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、腹膜内、静脈内、経皮、舌下、筋肉内、鼻腔内、または皮下に個体に投与されるものであってもよい。
本明細書に記載されたオリゴヌクレオチドは、B型肝炎の予防及び/または治療、及び治療のための医薬の製造に用いてもよい。
配列番号1、2または6の核酸配列またはその相補的な核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチド及び前記オリゴヌクレオチド上に少なくとも1つの化学的変形(chemical modification)を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択される1つ以上のオリゴヌクレオチドを有効成分として含むB型肝炎の治療または予防用医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、B型肝炎の治療または予防方法が提供される。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つ以上のヌクレオシド間のリンケージが化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記ヌクレオシド間のリンケージが化学的変形されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つ以上の糖部が化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記糖部はヌクレオチド内の5炭糖の2’番位置の−H基が、メトキシエチル(MOE)、ジメチルアミノオキシエトキシ(DMAOE)、ジメチルアミノエトキシエチル(DMAEOE)、メチル(Ome)、アミノプロポキシ(AP)またはフッ素(F)に置換されて変形されたり、前記糖部が、F−ANAに置換されて変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記糖部は、LNA(locked nucleic acid)またはPNA(peptide nucleic acid)の形態に化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドは、3’または5’末端にリンカーを介してGalNAc(N-acetylgalactosamine)が結合されている形態であってもよい。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間のリンケージの化学的変形及び糖部の化学的変形からなる群から選択される2種以上の化学的変形を有するものであってもよい。
一部具体例において、前記2種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらにヌクレオチド内の5炭糖の2’番位置の−H基がメトキシエチル(MOE)、ジメチルアミノオキシエトキシ(DMAOE)、ジメチルアミノエトキシエチル(DMAEOE)、メチル(Ome)、アミノプロポキシ(AP)またはフッ素(F)に置換されて変形されたり、ヌクレオチドの糖部がF−ANAに置換されて変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記2種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらに糖部がLNA(locked nucleic acid)またはPNA(peptide nucleic acid)の形態に化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、前記2種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらに3’または5’末端にリンカーを介してGalNAc(N-acetylgalactosamine)が結合されている形態であってもよい。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドは、HBVとグアニン4重合体(G-quadruplex)を形成するものであってもよい。
一部具体例において、前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、HBVのcccDNA(covalently closed circular DNA)を減らすものであってもよい。
一部具体例において、前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むものであってもよい。
一部具体例において、前記薬剤学的に許容可能な担体は、キトサンナノ粒子、コロイド分散システム、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、微小球体、ビーズ、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含むものであってもよい。
一部具体例において、前記薬剤学的に許容可能な担体は、キトサンナノ粒子であり、前記キトサンは、50〜190kDaの分子量を有するものであってもよい。
一部具体例において、前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、経口または非経口で個体に投与されるものであってもよい。
一部具体例において、前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、腹膜内、静脈内、経皮、舌下、筋肉内、鼻腔内または皮下に個体に投与されるものであってもよい。
また、HBVと候補物質とを接触させ、前記HBVと候補物質がグアニン4重合体(G-quadruplex)を形成するかどうかを確認する段階を含む、B型肝炎治療剤のスクリーニング方法が提供される。
一部具体例において、HBVと候補物質がグアニン4重合体を形成する場合、B型肝炎治療剤として選定する段階をさらに含んでもよい。
一部具体例において、グアニン4重合体を確認する段階は、EMSA(Electrophoretic mobility shift assay)、円偏光二色性(circular dichroism、CD)、核磁気共鳴(nuclear magnetic resonance、NMR)、またはグアニン4重合体特異抗体を用いた方法を用いてもよいが、これに制限されるものではない。
一部具体例において、前記候補物質は、グアニン(G)を4つ以上含むものであってもよい。
一部具体例において、前記候補物質は、HBVのエンハンサーII部位と結合してグアニン4重合体を形成することにより、HBVの発現を阻害してもよい。
下記実施例によると、配列番号1、2または6の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドをHBV感染の肝臓がん細胞株に処理し、HBVマウスモデルに注入したとき、HBVタンパク質の生成が阻害されることを確認した。これにより、配列番号1、2または6の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドがHBVに対する抗ウイルス効果を有することを確認した。したがって、配列番号1、2または6の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列も、HBVに対する抗ウイルス効果を有する。
別の具体例では、オリゴヌクレオチドの細胞透過を容易にするために、配列番号1、2または6の核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチド上に少なくとも1つの化学的変形(chemical modification)を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これをHBV感染の肝臓がん細胞株及びHBV感染のマウスモデルに処理した。その結果、HBVタンパク質の生成が阻害されることを確認し、これにより、前記少なくとも1つの化学的変形(chemical modification)を有するオリゴヌクレオチドが化学的変形にもかかわらず、HBVに対する優れた抗ウイルス効果を有することを確認した。
したがって、配列番号1、2または6の核酸配列またはその相補的な核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチド;及び前記オリゴヌクレオチド上に少なくとも1つの化学的変形(chemical modification)を有するオリゴヌクレオチド;からなる群から選択される1つ以上のオリゴヌクレオチドは、B型肝炎の治療または予防のための医薬の有効成分として用いられる。
医薬組成物において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つ以上のヌクレオシド間のリンケージ(linkage)が化学的変形されたものであるか、少なくとも1つ以上の糖部(sugar moiety)が化学的変形されたものであってもよい。
具体例において、オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)とは、これに制限されるものではないが、約5〜40個、例えば、10〜30個のヌクレオチドからなる重合体である。
ヌクレオチド(nucleotide)は、塩基(base)、5炭糖、リン酸基(ホスフェート)で構成される。前記塩基は、プリン(アデニンまたはグアニン)またはピリミジン(シトシン、チミンまたはウラシル)であってもよい。また、5炭糖は、リボース、デオキシリボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたはこれらの糖の安定化された変形形態であってもよい。
例えば、5炭糖がデオキシリボースである場合、ヌクレオチドは下記式(1)のような構造で表してもよい。
前記式(1)において、
Bは、塩基(base)を示し、R1、は−Hである。
化学的変形(chemical modification)について、より具体的に説明すると、次の通りである。前記化学的変形されたオリゴヌクレオチドは、自然オリゴヌクレオチドと比較する時、ヌクレオシド間のリンケージ、リボース単位体及び/または自然ヌクレオシド塩基(アデニン、グアニン、シトシン、チミンなど)を伴う様々な化学的変形(chemical modification)を含んでもよい。変形はオリゴヌクレオチドの合成の間に、または合成の後に発生してもよい。合成の間に、変形された塩基は内部的にまたはそれの末端に組み込まれてもよい。合成の後に、変形は活性基(アミノ変形者を介して、3’または5’ヒドロキシル基を介して、またはリン酸基を介して)を用いて行われてもよい。通常の技術者は、オリゴヌクレオチドの変形方法をよく知っている。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは少なくとも1つ以上のヌクレオシド間のリンケージが化学的変形されたものであってもよい。
ヌクレオシド間のリンケージが化学的変形されるということは、ヌクレオシドを互いに連結させているリン酸基内の酸素が1つ以上の他の置換基に置換されていることをいう。
一部具体例として、ヌクレオシド間のリンケージに参与しないリン酸基中の酸素が硫黄に置き換えられている核酸分子の安定化された糖ホスフェートバックボーンを「ホスホロチオエートバックボーン」という。前記ホスホロチオエートの他にヌクレオチドのリン酸基は、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートにも置換されてもよいが、これに制限されない。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートバックボーンは、それぞれ下記の式(2)〜(5)に示す。
前記式(2)〜(5)において、Bは、塩基(base)を示す。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは少なくとも1つ以上の糖部が化学的変形されたものであってもよい。
糖部が化学的変形されたことは、ヌクレオチド内の5炭糖に化学的変形が起きたことをいう。
糖部の化学的変形は、例えば、ヌクレオチド内の5炭糖の2’位置の−H基が他の置換基に置換されたり、5炭糖の基本構造が変形される場合を含む。
ヌクレオチド内の5炭糖の2’位置の−H基が他の置換基に置換されている糖部の化学的変形は、下記式(1)の5炭糖の2’の位置であるR1、が−H基以外の置換基に置換されることを意味する。
前記式(1)において、
Bは、塩基(base)を示し、R1は、−Hである。
一部具体例において、前記糖部はヌクレオチド内の5炭糖の2’位置の−H基が、これに制限されるものではないが、メトキシエトキシ[2’−O−CH2CH2OCH3、2’−O−(2−メトキシエチル);MOE]、式(6))、ジメチルアミノオキシエトキシ([2’−O(CH2)2ON(CH3)2;DMAOE]、式(7))、ジメチルアミノエチルオキシエチル([2’−OCH2CH2−O−CH2CH2−N(CH3)2;DMAEOE]、式(8))、メトキシ([2’−OCH3;Ome]、式(9))、アミノプロポキシ([2’−OCH2CH2CH2NH2;AP]、式(10))またはフッ素(2’−F、式(11))に置換されて変形されたり、前記糖部が、F−ANA(2’−F−β−D−アラビノフラノシル、式(12))に置換されて変形されたものであってもよい。
前記式(6)〜(12)で、Bは、塩基(base)を示す。
一部具体例において、ヌクレオチド内の5炭糖の基本構造が変形されている場合は、これに制限されるものではないが、ヌクレオチド内の5炭糖がLNA(locked nucleic acid)またはPNA(peptide nucleic acid)の形態に化学的変形されたものを含んでもよい。
LNA(locked nucleic acid)は、「ロック核酸」または「バイサイクリックヌクレオシド(bicyclic nucleoside)」とも呼ばれ、ヌクレオチド内の5炭糖の2’位置と4’位置との間の共有ブリッジを含むヌクレオシドを含むことをいう。LNAは、下記式(13)で表示される。
前記式(13)において、Bは、塩基(base)を示す。
PNA(peptide nucleic acid)は、「ペプチド核酸」とも呼ばれ、ヌクレオチドの基本骨格に塩基(base)が保有されており、基本骨格のアミド(amide-)部分のアザ(aza-)窒素原子に直接または間接的に結合される。PNAは、下記式(14)で表してもよい。
前記式(14)において、Bは、塩基(base)を示す。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドは3’または5’末端にリンカーを介してGalNAc(N-acetylgalactosamine)が結合されている形態であってもよい。
これに制限されるものではないが、前記GalNAcは、オリゴヌクレオチドの末端に連結されたリンカー部分に必要な数だけ、例えば、1個、2個、または3個を導入してもよい。
GalNAcは、肝臓細胞のアシアロ糖タンパク質(asialoglycoprotein)受容体に結合されるために、肝臓標的化の一部としてGalNAcをオリゴヌクレオチドの末端に結合させて、肝臓特異的な伝達をする技術が開発されている。前記オリゴヌクレオチドは、肝臓特異的な伝達が必要であるため、このような公知のGalNAc結合技術を活用してオリゴヌクレオチドをさらに化学的変形させてもよい。
一部具体例において、前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間のリンケージの化学的変形及び糖部の化学的変形からなる群から選択される2種以上の化学的変形を有するものであってもよい。
前記糖部の化学的変形は、同一または異なってもよい。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドの1つ以上のヌクレオチドは糖部の化学的変形を含み、化学的変形を有するヌクレオシド間のリンケージによって結合してもよい。1つのヌクレオチドの化学的変形は同一のオリゴヌクレオチド内に存在する他のヌクレオチドの化学的変形とは関係ない。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドは、糖部の化学的変形を含んでもよい。
一部具体例において、化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%が変形されたものであってもよい。
例えば、2種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらにヌクレオチド内の5炭糖の2’位置の−H基がメトキシエチル(MOE)、ジメチルアミノオキシエトキシ(DMAOE)、ジメチルアミノエトキシエチル(DMAEOE)、メチル(Ome)、アミノプロポキシ(AP)またはフッ素(F)に置換されて変形されたり、ヌクレオチドの糖部がF−ANAに置換されて変形されたものであってもよい。
また別の例において、2種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドは、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらに糖部がLNA(locked nucleic acid)またはPNA(peptide nucleic acid)の形態に化学的変形されたものであってもよい。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドの5’末端は、1、2、3、4または5つの隣接する化学的変形を含んでもよい。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドの3’末端は、1、2、3、4または5つの隣接する化学的変形を含んでもよい。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドは、5’末端及び3’末端に1、2、3、4または5つの隣接する化学的変形を含んでもよい。
例えば、下記具体例で見られるように、オリゴヌクレオチドは全体バックボーンがホスホロチオエート(PS)バックボーンに変形され、オリゴヌクレオチドの5’と3’の両端でそれぞれ4つのヌクレオチドをO−メチルに変形させたPS−OMe(4、4);またはオリゴヌクレオチドの5’と3’の両端でそれぞれ5つのヌクレオチドをO−メチルに変形させたPS−OMe(5、5)であってもよい。
また別の具体例において、オリゴヌクレオチド全体のバックボーンは、ホスホロチオエート(PS)であり、オリゴヌクレオチドの5’と3’の両端でそれぞれ2つのヌクレオチドをLNAに変形させたPS−LNA(2、2);オリゴヌクレオチドの5’と3’の両端でそれぞれ3つのヌクレオチドをLNAに変形させたPS−LNA(3、3);オリゴヌクレオチドの5’と3’の両端でそれぞれ4つのヌクレオチドをLNAに変形させたPS−LNA(4、4);またはオリゴヌクレオチドの5’と3’の両端でそれぞれ5つのヌクレオチドをLNAに変形させたPS−LNA(5、5)であってもよい。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドは、配列番号1の核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチドまたはそれと相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドは、配列番号2の核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチドまたはそれと相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドは、配列番号6の核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチドまたはそれと相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
具体例では、化学的変形を有するオリゴヌクレオチドで配列番号20〜57の核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチドを用いたが、これに制限されるものではない。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドはHBVとグアニン4重合体(G-quadruplex)を形成してもよい。
ワトソン−クリック(Watson-Crick)モデルに記述されている二重らせんDNAは、アデニン(A)はチミン(T)と、グアニン(G)はシトシン(C)と水素結合を介してペアをなす。しかし、フーグスティーン(Hoogsteen)は、グアニンがリッチなところには4つのグアニンが平面的に水素結合して1つのカルテット(quartet)をなして、カルテット3つが垂直に層をなした形を成したが、これをグアニン4重合体(G-quadruplex)と提案した。一般的に、グアニンが多く位置いた遺伝子において、グアニン4重合体の構造に現れると報告された。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドは、HBVと結合してグアニン4重合体を形成してHBV活性を阻害することを確認した(実施例3参照)。
前記オリゴヌクレオチドは、細胞、組織のような個体でHBVの発現を抑制するために用いられてもよい。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドを用いて個体に投与するための組成物、すなわち、医薬組成物を製剤化してもよい。前記製剤は、薬学的に許容可能な賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容可能な賦形剤は、活性薬剤の成分(例えば、オリゴヌクレオチド、治療剤など)を除いた物質である。賦形剤は、添加された投与量では効果を示さない。
具体例において、前記オリゴヌクレオチドの中の1つ以上を含むB型肝炎の治療または予防用医薬組成物が提供される。
オリゴヌクレオチドは、「抗ウイルス性オリゴヌクレオチド」または「抗HBVオリゴヌクレオチド」として記述してもよい。
一部具体例において、前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物は、HBVのcccDNA(covalently closed circular DNA)を減らすことによってHBV活性を阻害しうる。
したがって、「抗ウイルス性オリゴヌクレオチド」を含む医薬組成物が提供される。
前記医薬組成物は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドらを含み、生体内(インビボ)で抗ウイルス剤としての使用を妨げない他の物質を含んでもよい。これらの他の物質は制限されず、希釈剤、賦形剤、担体、及び/または他の抗ウイルス性物質を含んでもよい。
具体例において、オリゴヌクレオチドは、様々な医薬組成物で製剤化されてもよい。医薬組成物は、意図された使用に適した形態で製造される。一般的に、これは発熱源(pyrogens)だけでなく、人間または動物に害を及ぼすことができる他の不純物のない組成物の製造を必要とする。例示的な伝達/製剤システムは、キトサンナノ粒子、コロイド分散システム、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、微小球体、ビーズ、及び水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースのシステムを含む。
一部具体例において、前記薬剤学的に許容可能な担体は、キトサンナノ粒子であり、前記キトサンは、50〜190kDaの分子量を有するものであってもよい。
組成物または製剤は、本発明に記載された少なくとも1つを含む多数の治療的オリゴヌクレオチドを用いてもよい。例えば、組成物または製剤は、本発明に記載された少なくとも1、2、または3つの抗ウイルス性オリゴヌクレオチドを用いてもよい。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドは他の治療剤との組み合わせで用いられてもよい。組み合わせはまた、細胞を1つ以上の区別された組成物または製剤と同時に接触させることにより達成できる。選択的に、組み合わせは連続的に投与されてもよい。
一部具体例において、オリゴヌクレオチドは例えば、殺菌水と一般的な食塩水を含む、適切な希釈液と一緒に製剤化することにより、通常の皮下または静脈投与のために製剤化される。
医薬組成物及び製剤は、伝達ビークルを安定化し、標的細胞によって吸収されるように適切な塩及び緩衝液が用いられてもよい。具体例において、医薬組成物は、抑制剤オリゴヌクレオチド(例えば、リポソーム、ナノ粒子、または他の複合体)を含む有効量の伝達ビークルが含まれ、薬学的に許容可能な担体または水性媒質で溶解されるか、または分散される。「薬剤学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」は、動物または人間に投与された場合、有害であるか、アレルギーになるか、または他の副反応を示さない分子または組成物をいう。
用語、「許容可能な担体」は、人間に投与するのに適した医薬のような医薬を製剤化するために用いるのに適した1つ以上の溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗菌性及び抗真菌性物質、等張性及び吸収遅延物質等を含む。医薬的に活性である物質のためのこのような媒質及び物質の使用は、この技術分野でよく知られている。また、補助的な活性成分が組成物に含まれてもよい。
医薬組成物の投与、または伝達は、標的組織がその経路を介して利用できる限り、任意の経路を通してもよい。例えば、投与は、局所または皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、冠状動脈内、硬膜内または静脈内注射、または標的組織(例えば、心臓組織)内への直接注射によってもよい。本発明に開示されたオリゴヌクレオチドの安定性及び/または効力は皮下、皮内、静脈内及び筋肉内を含む便利な投与経路を考慮する。また、本発明に記載されたオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、カテーテルシステムまたは治療物質を心臓に伝達するために、冠状循環を隔離するシステムによって投与してもよい。治療物質を心臓及び冠状脈管構造に伝達するための様々なカテーテルシステムは、この技術分野で知られている。
前記オリゴヌクレオチド及び医薬組成物は、キット(kit)、容器(container)、パック(pack)またはディスペンサー(dispenser)に含まれてもよい。
一部具体例において、前記オリゴヌクレオチドの中の1つ以上を含む医薬組成物は、細胞、組織、または個体におけるHBV発現の抑制に有用である。また、組成物または製剤は、非経口、腹膜内、静脈内、経皮、舌下、筋肉内、鼻腔内、または皮下に投与されてもよい。例として、遊離塩基または薬剤学的に許容可能な塩として、コンジュゲート(conjugate)の溶液は、水でヒドロキシプロピルセルロース(hydroxypropyl cellulose)のような界面活性剤と適切に混合して製造してもよい。また、分散液は、グリセロール(glycerol)、液体ポリエチレングリコール(polyethyleneglycol)、これらの混合物及び油で製造してもよい。
通常の保存及び使用条件下で、これらの製剤は微生物の成長を防ぐために、一般的に防腐剤を含む。注射用途またはカテーテル(catheter)伝達に適した薬学的形態は、例えば、殺菌水性溶液または分散液及び滅菌注射溶液または分散液の即時製造のための滅菌粉末を含む。一般的に、これらの製剤は滅菌されて、容易な注入性が存在する程度に流動的である。製剤は、製造及び保管条件下で安定である必要があり、細菌及び菌類のような微生物の汚染作用に備えて保管しなければならない。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、これらの適切な混合物、及び植物油を含んでもよい。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持されうる。微生物作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌及び抗真菌物質によって行われる。多くの場合では、等張性物質、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが適切である。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収遅延剤、例えば、アルミニウムモノステアレート及びゼラチンを組成物に用いて行ってもよい。
殺菌注射溶液は、適切な量のコンジュゲートを溶媒に望む任意の他の成分(例えば、前記の列挙したもの)と一緒に混合することにより製造してもよい。一般的に、分散液は、様々な殺菌活性成分を基本的な分散媒と望む他の成分、例えば、前に列挙したものを含む殺菌ビークルに混合することにより製造される。殺菌注射溶液の製造のための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、前記殺菌/ろ過された溶液から任意のさらに要求される成分を加えた活性成分のパウダーを生産する真空乾燥及び凍結乾燥技術を含む。
製剤において、溶液はなるべく投与製剤に適した方法及び治療に効果的な量で投与される。製剤は注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどの多様な投薬形態で容易に投与されうる。水溶液においては非経口投与のために、例えば、溶液は一般的に適切に緩衝され、液状希釈液は、まず、例えば、十分な生理食塩水またはグルコースで等張性を作る。これらの水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下及び腹膜内投与に使用されてもよい。好ましくは、特に本明細書の観点から、この技術分野の通常の技術を有する者に既に知られている通り、殺菌水性媒体が使用される。例として、単一投与量は、1mlの等張性NaCl溶液に溶解されて1000mlの皮下注液流体(hypodermoclysis fluid)に添加されるか、または予定された注入部位に注射されてもよい(例えば、非特許文献8のページ1035−1038及び1570−1580を参照)。治療を受ける対象の疾患に応じて、容量の一部変化は必然的に生じることになる。投与に対して責任を負う者はどんなことがあっても、個々の対象のための適切な容量を決定するべきである。また、人間への投与において、剤形はFDAの生物学基準事務局によって要求される殺菌性、発熱原性、一般的な安全及び純度の基準を満たしていなければならない。
具体例において、オリゴヌクレオチドを(例えば、本明細書に記述された組成物または製剤の一部として)細胞に伝達する方法、及び対象における疾患の進行を治療、軽減、または予防する方法が提供される。用語、「対象」または「患者」は、人間及び他の霊長類(例えば、チンパンジー及び他の類人猿及びサル種)、農場動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及び馬)、家庭用哺乳類(例えば、犬及び猫)、実験室動物(例えば、マウス、ラット、及びモルモットのようなげっ歯類)及び鳥(例えば、鶏、七面鳥及び家禽類のような家庭用、野生用及び競技用の鳥、アヒル、ガチョウなど)を含むが、これに制限されない任意の脊椎動物を意味する。一部の実施態様において、対象は哺乳類である。
一部具体例において、哺乳類は人間である。
具体例において、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は標的細胞(例えば、哺乳類細胞)とインビトロ(in vitro)またはインビボで接触されてもよい。一部具体例において、前記細胞は肝臓細胞であってもよい。
また、B型肝炎ウイルス(HBV)と候補物質とを接触させて、前記HBVと候補物質がグアニン4重合体(G-quadruplex)を形成するかどうかを確認する段階を含む、B型肝炎治療剤のスクリーニング方法が提供される。
前記スクリーニング方法でHBVと候補物質がグアニン4重合体を形成する場合、前記候補物質がB型肝炎に治療効果があると判断してもよい。
具体例において、HBVと候補物質がグアニン4重合体を形成するかどうかを確認する方法は、EMSA(Electrophoretic mobility shift assay)、円偏光二色性(circular dichroism、CD)、核磁気共鳴(nuclear magnetic resonance、NMR)、またはグアニン4重合体に特異抗体を用いた方法を用いて確認してもよいが、DNAとタンパク質間に結合するかどうかを確認できる方法であれば、特に制限されるものではない。
前記候補物質は、グアニン(G)を4つ以上含むものであってもよい。前記候補物質がグアニンを4つ以上含むことにより、グアニン4つの結合を基本として、4本のヘリックスが1つの構造をなすグアニン4重合体を形成しうる。
前記グアニン4重合体は、HBVのエンハンサーII部位と候補物質が結合して形成されるものであってもよい。前記エンハンサーIIは、配列番号19の核酸配列を有するものであってもよい。
下記実施例では、配列番号2の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドがHBVのエンハンサーII領域と物理的に結合して、部分的にグアニン4重合体を形成することを確認することにより、HBVのエンハンサーの活性を阻害することを確認した。
一部具体例において、前記候補物質は、配列番号1、2または6の核酸配列またはその相補的な核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチドであるか、前記オリゴヌクレオチド上に少なくとも1つの化学的変形(chemical modification)を有するオリゴヌクレオチドであるか、前記オリゴヌクレオチドをすべて含むものであってもよい。
前記オリゴヌクレオチドは、先に述べたすべての内容をそのまま適用してもよい。
一部具体例において、前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物を経口または非経口で個体に投与されることを含む、B型肝炎の治療または予防方法が提供される。
臨床的な使用のために、オリゴヌクレオチドは望む治療結果を達成するのに効果的な任意の適切な投与経路を介して単独で投与されるか、医薬組成物に剤形化されてもよい。オリゴヌクレオチドの投与「経路」は、経腸、非経口及び局所投与または吸入を意味する。オリゴヌクレオチドの経腸投与の経路は口腔、胃腸、腸、及び直腸を含む。非経口の経路は、静脈内、腹腔内、筋肉内、脊髄腔内、皮下、局所注入、膣、局所、鼻腔、粘膜及び肺投与を含む。オリゴヌクレオチドの局所投与の経路は、表皮、口腔、及び耳、目及び鼻内へのオリゴヌクレオチドの外部適用を示す。
用語、「予防」とは、医薬組成物を個体に投与して炎症疾患または免疫疾患を抑制させたり、遅延させる全ての行為を意味する。
用語、「治療」とは、医薬組成物をB型肝炎の発生が疑われる個体に投与して、肝炎の症状が好転するようにしたり、有利になるようにするすべての行為を意味する。
用語、「改善」は、治療される状態に関連するパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも減少させる全ての行為を意味する。
本発明は、制限的なものと解釈されるべきではない次の追加例によりさらに説明される。通常の技術者は、本発明の観点で本発明の趣旨と範囲を逸脱することなく、開示された特定の実施態様に対する色々な変化が可能であり、同様または類似の結果を得ることができると理解するべきである。
他の式で定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野で熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用される命名法は、本技術分野でよく知られていて、通常使用されるものである。
以下、本発明を実施例を介して詳細に説明する。下記実施例は、本発明を例示するだけであり、本発明の範囲が下記実施例に限定されるものではない。
実施例1:材料及び方法
1−1:細胞培養及び感染(transfection)
人間肝臓がん細胞株(HepG2及びHuh7細胞)は、American Type Culture Collection(Manassas、VA、USA)から提供された。 hNTCP[NM_003049.3]のNCBI番号を有するhomo sapiens solute carrier family 10(ナトリウム/胆汁酸共輸送体)またはメンバー1(SLC10A1)が発現可能なプラスミドは、HepG2−hNTCP細胞株を確立するために、製造社の指示に従って、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いてHepG2細胞に感染(transfection)させた。細胞株は、DMEMで培養した。DMEMには、10%(v/v)のFBS(Gibco BRL)を入れ、1%ペニシリンと1%ストレプトマイシンを添加して用いた。HepG2及びHuh7細胞を5%CO2が発生するインキュベーターで37℃の温度で培養した。初代ヒト肝細胞(Primary human hepatocytes、PHHs)はカトリック大学病院(議政府、京畿道、韓国)の患者組織からIRBの承認を受けて、分離して用いた。一次維持培地(primary maintenance medium)(Gibco BRL、Oregon、USA)にCM4000(Thermo、Rockford、USA)を入れ、1%ペニシリンと1%ストレプトマイシンを添加してPHHを培養した。
感染(Transfection)は、ガイドラインに従ってリポフェクタミン2000を用いて、80%程度の細胞が培養されたときに行った。感染後15時間が経過したとき、細胞は新しい培地に変えた。細胞、感染後2〜3日目に収穫した。
1−2:HBV感染の研究
接種可能なHBVを集めるために、約100倍に濃縮されたHepAD38細胞の培養上澄み液を6%PEG8000と一緒に沈殿させた。25%FBSを含むPBSにHBV粒子を準備した。感染性のあるHBVストックを−80℃で保管した。HBVの定量は、点ブロット検定(dot blot assay)を介して計算した。HBV感染のために、4%PEGと2.5%DMSOを含むPMMと一緒に、HepG2−NTCP細胞とPHH細胞を用いた。感染15時間後、フレッシュPMMで培地を交替した。感染(infection)して7日後に、感染された細胞を収穫した。
1−3:サザンブロット(Southern blot)
サザンブロット(Southern blot)でウイルスDNAを検出した。簡略に言うと、感染して3日後に掻き取って(scrapping)細胞ペレットを収穫した。そして収穫された細胞を冷たいHEPES(10mM HEPES pH7.5、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5%NP−40)バッファー 100μlで溶かした後、26%PEG8000 バッファーで溶解物にあるHBVコアキャプシド(HBV core capsid)を沈殿させた。その後、HBVコアキャプシドを0.5%SDSバッファー(250mgプロテイナーゼK含有)で、37℃で3時間分解させた。HBV DNAをフェノールクロロホルム(phenol-chloroform)で抽出し、NaOACとエタノール(ethanol)で沈殿させた。総DNAを0.8%アガロースゲルで90Vで3時間電気泳動を通して分離させ、XLニトロセルロースメンブレン(XL nitrocellulose membrane)(GE healthcare)に移した(transfer)。その後、HBVのDNAを高純度ランダム化HBVプローブ(highly pure randomized HBV probe)で検出し、ホスホイメージャー(Phospho-imager)を使って相対的なHBVのDNA複製の水準を定量化した。
1−4:ノーザンブロット(Northern blot)
ノーザンブロット(Northern blot)でHBVのmRNAを検出した。簡略に言うと、製造社の指示に従って、TRIzol試薬(Invitrogen)を用いて総細胞RNAを抽出した。20μlの総RNAを1%ホルムアルデヒド(formaldehyde)アガロースゲルで120Vで3時間電気泳動を通して分離させ、XLニトロセルロースメンブレン(GE healthcare)に16〜18時間移した(transfer)。HBV特異的mRNA(HBV-specific mRNA)を検出するために、メンブレンを高純度ランダム化HBVプローブと一緒に混成化(hybridization)させ、ホスホイメージャーを使って相対的なHBVのDNA複製の水準を定量化した。
1−5:ウエスタンブロット(Western blot)
感染2日後、細胞を収穫してRIPA バッファー (20mM Tris/HCl、1%NP−40、0.5%プロテアーゼ阻害剤カクテル(protease inhibitor cocktail)(Sigma、St.Luis、MO)、150mM NaCl、2mM KCl、pH7.4)に30分間4℃で溶解させた。タンパク質溶解物はSDS−PAGE方法で分離した。SDS−PAGEした後、ポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)のタンパク質をPVDFメンブレンに移した。抗体(Antibody)は1:2000の割合で用いた。1次抗体(1st antibody)は、抗アクチン(anti-actin)(Sigma)、HBsAg(Abcam)、HBcAg(DAKO、USA)を用いた。
1−6:リアルタイム(real-time)PCRを用いたrcDNA及びcccDNAの定量分析
HBVのrcDNAを定量するために、HBVが感染したPHHでQIAamp DNA Mini kit(Qiagen)を用いて全体細胞のDNAを抽出した。cccDNAを増幅する前に、DNAをT5 econuclease(NEB)処理した。リアルタイムPCRは、DNAを20ng含むLightCycler(roche)20μl、0.5μmol/Lの正方向プライマー、0.5μmol/Lの逆方向プライマー、0.2μmol/Lの3’−フルオレセイン(fluorescein)(FL)が標示されたプローブ、及び0.4μmol/Lの5’−Red640(R640)が標示されたプローブを用いた。cccDNAの増幅のための正方向と逆方向プライマーは、それぞれ5’−CTCCCCGTCTGTGCCTTCT−3’(配列番号10)及び5’−GCCCCAAAGCCACCCAAG−3’(配列番号11)の構造であり、肝臓内のrcDNAの増幅は、 5’−CTCGTGGTGGACTTCTCTC−3’(配列番号12)及び5’−CTGCAGGATGAAGAGGAA−3’(配列番号13)をそれぞれ用いた。FRET混成化プローブは、cccDNAの増幅のために、5’−GTTCACGGTGGTCTCCATGCAACGT−FL−3’(配列番号14)及び5’−R640−AGGTGAAGCGAAGTGCACACGGACC−3’(配列番号15)、rcDNAの増幅のために5’−CACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAA−FL−3’(配列番号16)及び5’−R640 TGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCT−3’(配列番号17)をそれぞれ用いた。HBV DNAの総量の増幅は、記述したように行った:95℃で10分間処理した後に、95℃で10秒、58℃で10秒、72℃で15秒を45回繰り返した。cccDNAの増幅は、次に記述したように行った:95℃で10分間処理した後に、95℃で10秒、58℃で5秒、72℃で20秒を45回繰り返した。ノーマライジングするために、ベータグロビンの遺伝子をLightCycler b−Globin control kit(Roche)を用いて増幅させた。HBVモノマー(pHBVEcoRI)が含まれたプラスミドを段階希釈したものを定量標準とした。
1−7:ルシフェラーゼレポーター(luciferase reporter)の分析
HBVエンハンサーの活性を確認するために、エンハンサールシフェラーゼレポーターアッセイを行った。12ウェルプレートに2×105個のHepG2細胞株を用意して、0.5μgのエンハンサーLuc(pEnhI.II、pEnhI.ΔII、pEnhIXp、pXp.EnhII、pNRE.EnhII、pEnhII/cp、pEnhI△Xp−D2、pEnhIXp−D6、pEnhI△Xp−D7、及びpEnhIXp−D8:図5及び図6参照)及び50nMのD2をトランスフェクションした。トランスフェクション48時間後に、細胞を収穫してプロメガ溶解バッファー(promega lysis buffer)に溶解し、その後、エンハンサールシフェラーゼの活性をルシフェラーゼ試薬(Promega、Madison、WI)を用いて測定した。
1−8:オリゴヌクレオチドの製作
1−8−1:変形されないオリゴヌクレオチドの製作
図1は、HBVのゲノム分析を通してグアニン4重合体(G-quadruplex)などの特異な構造をなす、抗ウイルスの効果を出せる配列スクリーニングの模式図を示したものである。
本発明に用いたオリゴ化合物D1−D9はcosmogenetech(Seoul、Korea)またはBio Basic(Canada)で合成した。それぞれの詳細な説明は、以下の表2に記載した。
D1−D9は、変形されないオリゴヌクレオチドである。このうち、D2をPS(Phosphorothioate)、OMe(O-Methyl)、PNA(Peptide nucleic acid)、LNA(locked nucleic acid)、PS−OMe、及びPS−LNAに変形して用いた。
PSに変形されたオリゴヌクレオチドは、細胞内への透過が容易であり、エキソヌクレアーゼ(exonuclease)による分解を防げる。OMe変形は、RNAと類似の特徴を有するが、細胞内でヌクレアーゼ(nuclease)の加水分解に対して安定性が増加する特徴がある。また、2重構造のTmは1−4℃程度増加する。PNAは、人為的に作られた重合体であって、DNAまたはRNAと類似の構造を有し、骨格はペプチド結合によってN−(2−アミノエチル)−グリシンが繰り返して連結されている。LNAに変形されたオリゴヌクレオチドは2’酸素と4’炭素が連結されてロックされた構造であって、混成化する時にTmが増加して分解から安定した特徴がある。部分的に変形されたD2は、5’末端と3’末端配列に部分的に変形させた。例えば、PS−LNA(4、4)は、全体バックボーンがPSであり、5’と3’の両端でそれぞれ4つのヌクレオチドをLNAに変形させたことを意味する。このように、部分的に変形させて製作したD2としては、PS−OMe(4、4)、PS−OMe(5、5)、PS−LNA(2、2)、PS−LNA(3、3)(配列番号76)、PS−LNA(4、4)( 配列番号77)、PS−LNA(5、5)などがある。
1−8−2:変形されたオリゴヌクレオチドの製作
抗ウイルス効果の最適化のために、前記1−8−1のD2を用いて多様な形態のオリゴヌクレオチドを以下のような命名法を用いて作製した:DNAは、大文字のA、G、C、Tと命名し、RNAはa、g、c、tと命名した。ヌクレオチド内の5炭糖の2’位置をO−メチルに変形させた場合、核酸の前にmを付けて、LNAに変形させた場合は核酸の前にIを付けた。DNAバックボーン(backbone)の場合、ホスホロチオエート(phosphorthioate、PS)となっている場合、中括弧([])で表記した。一般DNAは、中括弧がない形態である。前記命名法については、表3に示した。
前記命名法の規則に基づいて、合計58個のオリゴヌクレオチドを合成し、表4及び5に示した。本発明では、下記の表4及び5に示されたオリゴヌクレオチドは、順番に配列番号20〜 配列番号77で示し、下記の表4及び5で核酸配列に付与された番号はオリゴ変形#(Oligo modification #)を意味する。
HBVのエンハンサーDNAは30ngを使用し、[32P]−ガンマ同位元素を用いてラベリングした。D2は500ngをグアニン4重合体(G-quadruplex)を形成するのに用いた。DNAを(D2、pEnhI△Xp、pEnhI△Xp−D2、及びエンハンサーI、II)バッファー溶液(10mM Tris−HCl pH7.5、0.1M KCl、1mM DTT、及び10mM MgCl2)と混合し、熱を加えた後、冷やしてDNAをフォルディングさせた。DNA混合物に反応させた後、BG4抗体(Absolute antibody、United Kingdom)を添加してDNA−タンパク質結合を介して特異的なグアニン4重合体(G-quadruplex)DNAを確認した。常温で結合反応した後、DNA−DNA複合体は6%ポリアクリルアミドゲルを用いて低温で電気泳動を行った。電気泳動した後、ゲルは70℃の温度で30分間乾燥させた。結果は、ホスホイメージャーを用いて分析した。
1−10:マウスに流体力学的な注入(hydrodynamic injection)を用いた実験
流体力学的な注入方法を用いて、6週齢のマウス(BALB/C)にプラスミドDNA(HBV 1.2 25μg、D2 25μg及びb−gal 5μg)を伝達した。マウス体重の10%に該当する体積のPBSを用意してマウスの尾静脈に注射した。変形されたD2(50μg)もマウスの尾静脈に注射した。DNAを含むPBSは注射器を用いて4−6秒間、迅速に静脈に注射した。すべての動物実験は、建国大学の動物管理委員会(Animal Care Committee)によって承認された。
1−11:細胞のグアニン4重合体を顕微鏡で分析する方法
6ウェルプレートにカバーグラスを底に敷いて細胞を培養した。前記細胞にHBVを感染させて、500nMの変形されたD2を処理した。アセトンで細胞を固定させた後、PBSで3回洗浄した。3%BSAを含むPBSを用いてブロッキングを行った。PBSで3回洗浄した後、BG4(absolute antibody、Ab00174-1.1)抗体を1:300の割合で混ぜて、冷蔵室(cold room)で一晩反応させた。PBSで3回洗浄した後、抗マウスアレクサ568(Anti-mouse alexa 568)を用いて1時間6ウェルプレートにカバーグラスを底に敷いて細胞を培養した。前記細胞にHBVを感染させて、500nMの変形されたD2を処理した。アセトンで細胞を固定させた後、PBSで3回洗浄した。3%BSAを含むPBSを用いてブロッキングを行った。PBSで3回洗浄した後、BG4(absolute antibody、Ab00174-1.1)抗体を1:300の割合で混ぜて、冷蔵室(cold room)で一晩反応させた。PBSで3回洗浄した後、抗マウスアレクサ568(Anti-mouse alexa 568)を用いて1時間反応させた。PBSで3回洗浄した後、30分間DAPIで核を染色した。PBSで3回洗浄した後、カバーガラスをスライドガラスに取り付けた後、乾燥させた。
1−12:キトサンナノ粒子を用いたインビボ実験
流体力学的な注入方法を用いて、6週齢のマウス(BALB/C)にプラスミドDNA(HBV 1.2 25μg及びb−gal 5μg)を伝達した。マウス体重の10%に該当する体積のPBSを用意してマウスの尾静脈に注射した。DNAを含むPBSは注射器を用いて4−6秒間、迅速に静脈に注射した。翌日、キトサンナノ粒子D2 8μgもマウスの尾静脈に注射した。キトサンナノ粒子は、低細胞毒性と免疫原性だけでなく、効率的な生体適合性分子であって、siRNAのようなオリゴヌクレオチドを効率的に転送できる特徴がある(非特許文献9)。
前記の実験のために用いられたキトサンナノ粒子は、キトサン(MW 50−190KDa)とD2のイオン的ゲル化(gelation)を基に製造した。TPP(0.25%w/v)とD2(1μg/μL)を1%(w/v)キトサン溶液に添加した。室温で連続的な反応が起き、インキュベーション反応が終わった後、4℃で40分間13,000RPMで遠心分離してペレットを収得した。収得されたペレットはDWで3回にわたって洗浄し、使用するまで4℃で保管した。すべての動物実験は、建国大学の動物管理委員会によって承認された。
実施例2:抗ウイルス効果の確認
2−1:抗ウイルス効果を示すオリゴヌクレオチドの確認
D1〜D9のオリゴヌクレオチドをHBVと一緒に肝臓がん細胞株に感染させた後、ウイルスタンパク質(HBSAg及びHBeAg)の生成阻害及び複製阻害によって抗ウイルス効果を判断した。
具体的には、HBV 1.2プラスミド及びオリゴヌクレオチド(D1〜D9は、それぞれ配列番号1〜9)は、HepG2に感染させた。感染させた後3日間、細胞と上澄み液を培養した。HBVタンパク質の発現を決定するために、分泌されたHBeAg及びHBsAgを測定した。培養培地のHBeAg及びHBsAgはHBeAg及びHBsAgELSIAキット(Wantai pharm Inc.、Beijing、China)を用いて分析した。HBV DNAはサザンブロットで測定した。
その結果、図2に示すように、D1、D2及びD6が抗ウイルス効果を示した。
2−2:HBV RNA発現の阻害
前記実施例2−1で確認したように、D1、D2とD6オリゴヌクレオチドの中で抗ウイルス効果が最も優れたD2オリゴヌクレオチドを用いて、HBV RNA発現阻害の実験を行った。具体的には、どの段階のHBVライフサイクルがD2オリゴヌクレオチドによって阻害されるのかを確認するために、Huh7細胞にHBV 1.2merを感染させた後、HBV mRNAレベルをノーザンブロットで分析した。
その結果、図3に示すように、D2オリゴヌクレオチドは用量依存的にHBV RNAsを抑制させることを確認した。したがって、D2オリゴヌクレオチドがHBV RNA発現も阻害することを確認することにより、D2オリゴヌクレオチドがウイルスのRNA転写段階に作用して、阻害することを確認した。
2−3:HBVタンパク質の発現阻害を確認
D2オリゴヌクレオチドがHBVタンパク質発現を阻害するかどうかを確認するために、Huh7細胞にHBV 1.2merとD2オリゴヌクレオチドを感染させた後、ウエスタンブロット分析で表面タンパク質の発現レベルを測定した。
その結果、図4に示すように、D2オリゴヌクレオチドがHBVのタンパク質の1つである表面タンパク質の発現を濃度依存的に阻害することを確認した。
2−4:HBVのエンハンサー/プロモーター(enhancer/promoter)活性の阻害
D2オリゴヌクレオチドがHBV mRNAレベルをどのように減少させるのかを調べるために、HBVのエンハンサーを用いてルシフェラーゼレポーター分析を行った。
その結果、図5(a)及び(b)に示すように、D2オリゴヌクレオチド感染によってHBVのエンハンサーI、II活性が約80%が阻害されることを確認した。このような事実により、D2オリゴヌクレオチドはエンハンサーI及びIIの活性すべてを阻害することを確認した。しかし、エンハンサーI(EnhI)、pEnhI△Xpの上位部位では効果が現れなかった。D2オリゴヌクレオチド感染によって、HBVのエンハンサーII(EnhII)は、約48%阻害されることを確認した。このような事実により、HBVのエンハンサーIIの1742Gリッチ部位(1742〜1747の領域)がD2オリゴヌクレオチドによるエンハンサー活性の抑制に重要なものであることを確認した。
結果的に図5の結果により、D2オリゴヌクレオチドがエンハンサーIとIIの活性を減らすことによって、転写段階で抗ウイルス効果を出すという事実を確認した。
D2オリゴヌクレオチドがどのようにHBVのエンハンサー活性を減少させるかを調べるために、前述したレポータープラスミドを製作した後、レポーター活性を測定した。図6(a)のように、表2のD2、D6、D7及びD8の塩基GがリッチなHBVモチーフがレポータープラスミドのプロモーター領域に導入された。
その結果、図6(b)に示すように、pEnhI△Xpルシフェラーゼクローンは何の効果もなかったが、D2またはD6モチーフを含むpEnhI△Xpルシフェラーゼクローンは、ルシフェラーゼ活性を強く阻害することを確認した。
したがって、D2オリゴヌクレオチドはエンハンサーI(EnhI)の上流であるpEnhI△Xpレポーターには全く作用できないが、ここに自己と同じ塩基配列を入れると、強力な阻害効果を発揮することを確認し、D2オリゴヌクレオチドと同様の塩基配列を有するD6オリゴヌクレオチドを入れたレポーターも阻害することを確認した。これはD2オリゴヌクレチドが自身の塩基配列を認知して阻害作用をすることを示す結果である。
実施例3:グアニン4重合体(G-quadruplex)構造の形成
3−1:D2オリゴヌクレオチドがHBVのエンハンサーI、II部位を認知してグアニン4重合体(G-quadruplex)を形成
D2オリゴヌクレオチドがエンハンサーI、IIの配列とグアニン4重合体を形成するかどうかを確認するために、D2オリゴヌクレオチド及びP32標示のHBVエンハンサー配列を用いてインビトロEMSA(electrophoretic mobility shift assay)を行った(図7 (a))。
その結果、EMSAを通してD2オリゴヌクレオチドがエンハンサーI、IIの配列と部分的にグアニン4重合体を形成することを確認した。図7(b)に示すように、グアニン4重合体の形成は、グアニン4重合体に特異的BG4抗体を用いてバンドのスーパーシフトから確認した。これはホスホルイメージング(phosphorimaging)でゲルを視覚化した結果である。すなわち、図7を通してD2オリゴヌクレオチドがHBVのエンハンサー部位と物理的に結合してグアニン4重合体を形成することによって、HBVのエンハンサーの活性を阻害することを確認した。
3−2:D2オリゴヌクレオチドがHBVのエンハンサーIIの領域とグアニン4重合体を形成
D2オリゴヌクレオチドがエンハンサーII領域とグアニン4重合体を形成するかどうかを確認するために、D2及びHBVを用いてインビトロEMSAを行った。
その結果、EMSAを通してD2オリゴヌクレオチドがエンハンサーIIの配列と部分的にグアニン4重合体を形成することを確認した。グアニン4重合体の形成は、グアニン4重合体に特異的BG4抗体を用いてバンドのスーパーシフトから確認した。図8を通して、D2オリゴヌクレオチドがHBVのエンハンサーII領域を介してグアニン4重合体構造を形成することを確認した。
3−3:D2オリゴヌクレオチドが自己の塩基配列を有する部位と完全なグアニン4重合体(G-quadruplex)構造を形成
D2オリゴヌクレオチドが、自己の配列を通してHBVゲノムと完全なグアニン4重合体を形成するかどうかを確認するために、インビトロEMSAを行った。
その結果、図9に示すように、EMSAを通してD2オリゴヌクレオチドが自己の配列を介してHBVゲノムと完全なグアニン4重合体を形成することを確認した。グアニン4重合体の形成は、グアニン4重合体に特異的BG4抗体を用いてバンドのスーパーシフトから確認し、ゲルはホスホルイメージングにより視覚化した。
図9によれば、D2オリゴヌクレオチドがエンハンサーIの部位(EnhI△Xp)とは結合しないが、ここに自己の塩基配列を入れたもの(EnhI△Xp−D2)とは完全なグアニン4重合体構造を形成した。これは、D2オリゴヌクレオチドが自己の塩基配列を認知してグアニン4重合体の構造を形成し、これがウイルスの阻害に関連することを意味する。
3−4:D2オリゴヌクレオチドの塩基配列に点突然変異を導入したD3オリゴヌクレオチドは、グアニン4重合体の構造を形成できない
図10に示すように、インビトロEMSAを通して、D2オリゴヌクレオチドの塩基配列に点突然変異を導入したD3オリゴヌクレオチドは、グアニン4重合体の構造を形成できないことを確認した。具体的には、D2オリゴヌクレオチド配列の中間部位の保存的なGGGGGGをGGGTGGに点突然変異させたD3オリゴヌクレオチドは、HBVゲノムとグアニン4重合体を形成しなかった。この結果により、D2オリゴヌクレオチドのGリッチ部位がグアニン4重合体の形成に非常に重要であることが分かる。
また、図2から分かるように、D3オリゴヌクレオチドは全くウイルス阻害作用を示さず、図10に示されたEMSAの結果であるD3オリゴヌクレオチドのグアニン4重合体構造の未形成結果と一緒に見ると、グアニン4重合体構造の形成が抗ウイルス作用の必要条件であることが分かる。
実施例4:HBV活性の阻害
4−1:変形されたD2オリゴヌクレオチドが細胞を透過してHBVのエンハンサー活性を阻害する
HBVのエンハンサーI、IIのプラスミドをHepG2細胞に感染させた。感染の前に、多数の変形されたD2オリゴヌクレオチド(PS、OPMe、PNA、LNA PS−OMe、PS−LNA)をHepG2細胞(最終濃度500nM)で前処理した。翌日、細胞を500nMの変形されたD2オリゴヌクレオチドを含む新しい培地(DMEM)で置き換えた。感染後24時間細胞を培養し、Steady Glo−Luciferase systemを利用して、ルシフェラーゼの活性を分析した。
その結果、図11に示すように、PS変形によって優れた細胞透過及びHBV阻害活性を示すことを確認した。前記結果によると、PS(phosphorothioate)またはLNA(locked nucleic acids)にオリゴヌクレオチドのバックボーン骨格を変形させると、オリゴヌクレオチドの透過性を向上させ、結果的に、そのオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果を増加させる。
4−2:変形されたD2オリゴヌクレオチドがHBV感染モデルでHBVを阻害する
HBV感染モデルでもD2オリゴヌクレオチドが阻害効果を示すのかを見るために、HBV感染性細胞株であるHepG2−NTCP細胞株にHBVを感染させた後、PSで変形されたD2オリゴヌクレオチド(PS、PS−OMe、PS−LNA)を処理して行った。具体的には、図12(a)のHepG2−NTCP細胞のHBV感染とウイルスタンパク質の分析過程を模式図に示したように、実験手順は以下の通りである:HepG2−NTCP細胞は、2%DMSOと4%PEG8000を含有したPMM(PHH maintain media、Gibco)で16〜20時間培養した2000 HBV細胞あたりゲノム当量(Geq/cell)で感染させた。次に、感染された細胞はPBS 500μlで3回洗浄し、PMM(2%DMSO)に維持させた後に7日間培養した。HBVタンパク質の発現を分析するために、分泌されたHBeAg及びHBsAgを測定した。培養培地内のHBeAg及びHBsAgは、HBeAg及びHBsAg ELISAキット(Wantai Pharm Inc、Beijing、China)を用いて分析した。D2オリゴヌクレオチドの感染(transfection)(D1、T.F)を抗HBV効果の陽性対照群として用いた。変形されないD2オリゴヌクレオチド処理(D2、Tr)は、陰性対照群として用いた。 LMVはラミブジンである。
HBVタンパク質の発現解析の結果、図12(b)及び(c)に示すように、PSに変形されたD2オリゴヌクレオチド(PS、PS−OMe、PS−LNA)がHBV感染性細胞株であるHepG2−NTCPでもHBVを阻害することを確認し、変形されたD2オリゴヌクレオチドを処理したときの抗ウイルス効果を確認した。
4−3:変形されたD2オリゴヌクレオチドがPHH(primary human hepatocyte)でHBVを阻害する
PSに変形されたD2オリゴヌクレオチドがPHH(primary human hepatocyte)でHBVを阻害することを確認するために、肝臓手術を受けた人の肝臓組織からPHHを分離した後、ここにHBVを感染させた後に、変形されたD2オリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果を調査した。具体的には、図13(a)のPHHsのHBV感染とウイルスタンパク質の分析過程を模式図に示したように、実験手順は以下の通りである:PHHsは2%DMSOと4%PEG8000を含有したPMM(PHH maintain media、Gibco)で16〜20時間培養した5000 HBV細胞あたりゲノム当量(Geq/cell)で感染させた。次に、感染された細胞はPBS 500μlで3回洗浄し、PMM(2%DMSO)に維持させた後に7日間培養した。HBVタンパク質の発現を分析するために、分泌されたHBeAg及びHBsAgを測定した。培養培地内のHBeAg及びHBsAgは、HBeAg及びHBsAg ELISAキット(Wantai Pharm Inc、Beijing、China)を用いて分析した。変形されないD2は陰性対照群として用いた。LMVはラミブジンである。
HBVタンパク質の発現解析の結果、図13に示すように、変形されたD2オリゴヌクレオチドは抗ウイルス効果が優れており、特にPS−LNAに変形されたD2オリゴヌクレオチドが90%以上のウイルスを阻害する結果を示すことで、最も強力な阻害効果を示した。これらの結果を通じ、変形されたD2オリゴヌクレオチドをヒト細胞に処理したときにも抗ウイルス効果が表示されることを確認した。
4−4:D2オリゴヌクレオチドの分析
最適の効果を示す変形の形態を見つけるために、D2オリゴヌクレオチドの末端を3つずつ(3、3)、4つずつ(4、4)、または5つずつ(5、5)を変形した。分析のために、HBVのエンハンサーI、IIの構造体をHepG2細胞に感染させた。感染前に、多数の変形されたD2(PS、PS−Ome(4、4)、PS−Ome(5、5)、PS−Ome(all)、PS−LNA(2、2)、PS−LNA(3、3)、PS−LNA(4、4)、PS−LNA(5、5)、PS−LNA(all))をHepG2細胞(最終濃度500nM)で前処理した。翌日、 細胞を500nMの変形されたD2オリゴヌクレオチドを含む新しい培地(DMEM)で置き換えた。感染2日後に、ルシフェラーゼアッセイシステム(luciferase assay system)(Promega; madison、WI)を用いて、プロトコルに従ってHBVエンハンサーのルシフェラーゼ活性を分析した。
その結果、図14に示すように、変形されたD2オリゴヌクレオチドは優れた抗ウイルス効果を示した。その中、5’末端と3’末端がすべて4つのLNAに変形されたPS−LNA(4、4)が最も強力な抗ウイルス効果を示した。
4−5:HepG2細胞における変形されたオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果の確認
1−8−2で製作したオリゴヌクレオチドをHepG2細胞にHBVと一緒に挿入した。50nM濃度の58個のオリゴヌクレオチドをそれぞれ、HBV 1μgと一緒に2mlの培地に入れて、感染させた。翌日、培地を新しい培地(DMEM)に変えた後、72時間細胞を培養した。以後、培養培地内のHBeAg及びHBsAgをHBeAg及びHBsAg ELISAキット(Wantai Pharm Inc.、Beijing、China)を用いて分析した。HBeAgに対する結果を図15に、HBsAgに対する結果を図16に示した。
その結果、図15に示すように、多数のオリゴヌクレオチドがHBeAgを阻害することが確認できた。特に、HepG2細胞のHBeAgを効果的に減らした物質は9、17、18、20、21、34、37、40、41、42、43、44、46、47、50、51、54、55、(3、3)、(4、4)であった。
また、図16では、多数のオリゴヌクレオチドがHBsAgを阻害することが確認できた。特に、HepG2細胞のHBsAgを効果的に減らした物質は、9、10、18、20、21、24、28、34、37、40、41、44、48、(3、3)であった。
4−6:HepG2−NTCP細胞での変形されたオリゴヌクレオチドの効果の確認
1−8−2で製作したオリゴヌクレオチドのHBV感染モデルでの効果を確認するために、HBV感染性細胞株であるHepG2−NTCP細胞を用いた。具体的には、HBVを2%DMSOと4%PEG8000を含有したPMM(PHH maintain media、Gibco)で16〜20時間培養した2000 HBV細胞あたりにゲノム当量(Geq/cell)で感染させた。次に、感染された細胞はPBS 500μlで3回洗浄し、PMM(2%DMSO)に維持させた後に7日間培養した。感染後3日目から58個の変形されたオリゴヌクレオチドを毎日処理した。この時、処理濃度は500nMである。感染後7日目になったとき、分泌されたHBeAg及びHBsAgを測定してHBVタンパク質の発現を分析した。培養培地内のHBeAg及びHBsAgはHBeAg及びHBsAg ELISAキットを用いて分析した。HBeAgに対する結果を図17に、HBsAgに対する結果を図18に示した。
その結果、図17に示すように、多数のオリゴヌクレオチドがHBeAgを阻害することが確認できた。特に、HepG2−NTCP細胞のHBeAgを効果的に減らした物質は、8、17、18、19、20、21、27、40、44、47、55、(3、3)、(4、4)であった。また、図18のように、HBsAgも多数オリゴヌクレオチドによって阻害されることが確認できた。HepG2−NTCP細胞のHBsAgを効果的に減らした物質は、7、8、9、18、19、20、40、42、44、45、(3、3)、(4、4)であった。
4−7:PHH(Primary human hepatocyte)細胞での変形されたオリゴヌクレオチドの効果の確認
1−8−2で製作したオリゴヌクレオチドがPHH(Primary human hepatocyte)でもHBVを阻害することができるかを確認するために、肝臓手術を受けたヒトの肝臓組織からPHHを分離してHBVを感染させ、58個の変形されたオリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果を確認した。具体的には、PHHsのHBV感染とウイルスタンパク質の分析過程は、以下の通りである:HBVを2%DMSOと4%PEG8000を含有したPMM(PHH maintain media、Gibco)で16〜20時間培養した2000 HBV細胞あたりにゲノム当量(Geq/cell)で感染させた。次に、HepG2−NTCP細胞と同様に、PHHsはPBS 500μlで3回洗浄し、PMM(2%DMSO)に維持させた後に11日間培養した。感染後5日目から58個の変形されたオリゴヌクレオチドを毎日処理し、この時の処理濃度は500nMにした。感染後11日目になったとき、HBVタンパク質発現を分析するために培養培地内HBeAg及びHBsAgを測定した。HBeAgに対する結果を図19に、HBsAgに対する結果を図20に示した。
その結果、図19に示すように、多数のオリゴヌクレオチドがHBeAgを阻害することが確認できた。特に、PHH細胞のHBeAgを効果的に減らした物質は、7、8、18、19、20、52、(3、3)、(4、4)であった。また、図20のように、HBsAgも多数のオリゴヌクレオチドによって阻害されることが確認できた。PHH細胞のHBsAgを効果的に減らした物質は、6、7、8、15、16、18、19、42、(3、3)、(4、4)であった。
HBVタンパク質の発現解析の結果、それぞれの結果に示されたように、変形されたD2オリゴヌクレオチドの抗ウイルス効果が優れており、特に、様々な形態のgap merの中で、PS−LNAで部分変形されたD2が最も強力な阻害効果を示すことを確認した。特に、(3、3)または(4、4)のようにGが連続的にある部分が変形されない場合にHBeAg及びHBsAg阻害効果が優れていた。これはオリゴヌクレオチドの合成に必要な単価を下げることができ、部分的または完全に変形されたD2オリゴヌクレオチドをヒト細胞に処理したとき、抗ウイルス効果が現れることを確認した。
実施例5:インビボモデル
5−1:D2オリゴヌクレオチドはマウスのインビボモデルでHBVを阻害する
D2オリゴヌクレオチドがインビボでも作用するかを見るためにHBVマウスモデルを用いて実験した。実験は、図21(a)に基づいて行った。6週齢の雄マウスを、各グループに用いた。PBSを対照群として注射した(Mock)。流体力学的注射(hydrodynamic injection)の方法で注射された(HI)DNAは、以下の通りである:25μg HBV 1.2mer、25μgの空ベクター(empty vector)またはD2オリゴヌクレオチド、及び5μgのb−gal。b−galは、注射対照群として用いた。マウスを犠牲にして血液サンプルを得た。マウス血清は、PBSで希釈した(HBeAgの場合は1:50、HBsAgの場合は1:2000)。ウイルスタンパク質(HBeAg及びHBsAg)は、ELISAキットで測定した。
その結果、図21(b)及び(c)に示すように、D2オリゴヌクレオチドを注射したマウスで強力な抗ウイルス効果を示した。また、図21(d)に示すように、サザンブロットを利用してD2オリゴヌクレオチドを注射したマウスで、HBV DNAが大幅に減ったことを確認した。
5−2:変形されたD2オリゴヌクレオチドをマウスのインビボモデルに静脈注射したとき、HBVを阻害する
変形されたD2オリゴヌクレオチドを注射したとき、インビボでも作用するかを調べるためにHBVマウスモデルを用いて実験した。インビボ実験は、図22(a)に基づいて行った。6週齢の雄マウスを、各グループに用いた。HBVのみを注射したものを対照群とした。25μgのHBV 1.2mer及び5μgのb−galプラスミドが流体力学的注射(hydrodynamic injection)方法で注射された。その次、50μgの変形されたDNA(PS、PS−OMe及びPS−LNA)を3日間静脈内注射した。注射4日後、マウスを犠牲にして血液サンプルを得た。b−galは注射対照群として使用した。マウス血清は、PBSで希釈した(HBeAgの場合は1:50、HBsAgの場合は1:2000)。ウイルスタンパク質(HBeAg及びHBsAg)は、ELISAキットで測定した。
その結果、図22(b)及び(c)に示すように、変形されたD2オリゴヌクレオチドを注射したマウスで抗ウイルス効果を示した。図22(d)に示すように、サザンブロットで確認したとき、HBV DNAレベルでも抗ウイルス効果が示した。これは、変形されたD2オリゴヌクレオチドを注射したとき、マウスの肝臓に伝達されてウイルス阻害作用を示すことを確認した結果である。
5−3:ナノ粒子(キトサン)でD2オリゴヌクレオチドを包んだ後、マウスのインビボモデルに静脈注射したとき、HBVを阻害する
ナノ粒子(キトサン)でD2オリゴヌクレオチドを包んだ後に注射したとき、インビボでも作用するかを調べるためにHBVマウスモデルを用いて実験した。ナノ粒子を用いてD2オリゴヌクレオチドを包むと効率的に肝臓に転送される。図23(a)に基づいてインビボ実験を行った。6週齢の雄マウスを各グループに用いた。25μgのHBV 1.2mer及び5μgのb−galプラスミドが流体力学的注射(hydrodynamic injection)方法で注射された。その次、8μgのナノ粒子D2をHBVに感染させた後、1回静脈内注射した。注射4日後、マウスを犠牲にして血液サンプルを得た。b−galは、注射対照群として用いた。マウス血清はPBSで希釈した(HBeAgの場合は1:50、HBsAgの場合は1:2000)。ウイルスタンパク質(HBeAg及びHBsAg)は、ELISAキットで測定した。
その結果、図23(b)及び(c)に示すように、ナノ粒子D2を注射したマウスで抗ウイルス効果を示した。この時、最初のバーは、mock、2番目のバーは、HBV、3番目のバーは、HBVとキトサンナノ粒子D2、4番目のバーは、HBVとキトサンナノ粒子D4を意味する。キトサンナノ粒子D4はHBVを全く阻害できない陰性対照群として用いた。図23(d)に示すように、サザンブロットで確認したとき、HBV DNAレベルでも抗ウイルス効果が現れた。これはキトサンナノ粒子D2を注射したとき、マウスの肝臓に伝達されて、非常に強力なウイルス活性を阻害したことを確認した。
実施例6:PHH(primary human hepatocyte)でのHBV cccDNAの阻害
6−1:変形されたD2が最初から処理されてHBVを阻害する
D2オリゴヌクレオチドがPHHでHBV cccDNAを除去するかどうか見るために、PHHにHBVに感染させて実験した。本実験は、HBV感染後の翌日から変形されたD2オリゴヌクレオチドを処理し、この方法は、図24(a)に示すように、PHHにHBVに感染させる手順について模式化した。このとき、IFN−αは陽性対照群として用い、変形されない一般的なD2オリゴヌクレオチドを処理した場合は、HBVを全く阻害できないため、陰性対照群として用いた。図24(d)及び(e)は、リアルタイムPCRを利用して定量的に行った。
その結果、図24(b)及び(c)では、PS−LNA(3、3)、PS−LNA(4、4)、PS−LNA(all)に部分変形されたD2オリゴヌクレオチドを処理した場合、HBeAg及びHBsAgが減少することを確認した。また、図24(d)で示すように、HBV rcDNAがPS−LNA(3、3)、PS−LNA(4、4)、PS−LNA(all)に部分変形されたD2オリゴヌクレオチドで効率的に減少することを示した。重要な結果として、HBVを最終的に治療するためには、cccDNAを除去する必要があり、図24(e)に示すように、HBV cccDNAがPS−LNA(3、3)、PS−LNA(4、4)、PS−LNA( all)に部分変形されたD2オリゴヌクレオチドが処理されたときに減少することが分かった。
6−2:変形されたD2オリゴヌクレオチドがcccDNAが十分に生成された場合も、HBVを阻害する
HBV感染後5日間、十分な再感染の条件でもD2オリゴヌクレオチドがPHHでHBV cccDNAを除去するかどうか見るために実験を行った。本実験は、HBV感染後5日後から変形されたD2オリゴヌクレオチド(PS−LNA(all)0.5μM、PS−LNA(all)1μM)を処理し、この方法は、図25(a)に示すように、PHHにHBVに感染させる手順について模式化した。この時、IFN−αはHBeAg、HBsAg、rcDNA、cccDNAを減らす陽性対照群として用い、変形されない一般的なD2オリゴヌクレオチドを処理した場合は、HBVを全く阻害できないため陰性対照群として用いた。
その結果、図25(b)及び(c)では、変形されたD2オリゴヌクレオチドを濃度別処理した場合、HBeAg及びHBsAgが減少することがわかった。図25(d)は、一般的なPCRを行った後、DNA電気泳動でHBV DNAとcccDNAの量の違いを確認した。また、図25(d)で示すように、HBV rcDNAとcccDNAが部分変形されたD2オリゴヌクレオチドで濃度依存的に減少することを示した。
実施例7:HepG2−NTCPでD2オリゴヌクレオチドとHBV cccDNAが形成されるグアニン4重合体(G-quadrueplex)の確認
PS−LNAに変形されたD2オリゴヌクレオチドがHepG2−NTCPでHBV cccDNAを効率的に認識し、グアニン4重合体(G-quadruplex)を形成するかどうかを調べるために、NTCPにHBVを感染させ、D2オリゴヌクレオチドを処理して、顕微鏡を用いて見た。本実験は、HBV感染後5日目から変形されたD2オリゴヌクレオチドを処理し、7日目に細胞を固定させた。以後、BG4抗体を用いて、グアニン4重合体(G-quadruplex)を確認できるように赤いシグナルが出てくるように、スライドグラスを製作した。
その結果、図26(a)は、NTCPで感染されて生成されたHBV cccDNAと変形されたD2オリゴヌクレオチドを処理したとき、グアニン4重合体(G-quadruplex)を認識するBG4抗体によってD2オリゴヌクレオチドとcccDNAがグアニン4重合体を形成することを確認した。また、HBeAgレベルがHBVでは正常に発現して、変形されたD2を処理した場合には減少する結果を確認することにより、変形されたD2オリゴヌクレオチドによる抗ウイルス効果も一緒に検定できた。図26(b)にまとめたグラフ及び図26(a)の下段にまとめたBG4によるfoci数を見たとき、Mockの場合は一般的な細胞の条件で約5つの内因性(endogenus)形態のグアニン4重合体のシグナルが確認された。変形されたD2オリゴヌクレオチドのみを処理した場合、約6つのシグナルが確認された。 HBVのみ感染された場合、約7つのシグナルが確認された。何よりも、HBVと変形されたD2オリゴヌクレオチドを処理したとき、約16個のシグナルが確認された。この結果は、HBV cccDNAが変形されたD2オリゴヌクレオチドによってグアニン4重合体を形成することを示す結果である。
Claims (39)
- 配列番号1、2または6の核酸配列またはその相補的な核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチド;及び前記オリゴヌクレオチド上に少なくとも1つの化学的変形(chemical modification)を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択される1つ以上のオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、B型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
- 前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つ以上のヌクレオシド間のリンケージが化学的変形されたものである、請求項1に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
- 前記ヌクレオシド間のリンケージが化学的変形されたオリゴヌクレオチドが、ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形されたものである、請求項2に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
- 前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つ以上の糖部(Sugar moiety)が化学的変形されたものである、請求項1に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
- 前記糖部が、ヌクレオチド内の5炭糖の2’番位置の−H基がメトキシエチル(MOE)、ジメチルアミノオキシエトキシ(DMAOE)、ジメチルアミノエトキシエチル(DMAEOE)、メチル(Ome)、アミノプロポキシ(AP)またはフッ素(F)に置換されて変形されたり、
前記糖部が、F−ANAに置換されて変形されたものである、請求項4に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。 - 前記糖部が、LNA(locked nucleic acid)またはPNA(peptide nucleic acid)の形態に化学的変形されたものである、請求項4に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、3’または5’末端にリンカーを介してGalNAc(N-acetylgalactosamine)が結合されている形態である、請求項1に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
- 前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドが、ヌクレオシド間のリンケージの化学的変形及び糖部の化学的変形からなる群から選択される2種以上の化学的変形を有するものである、請求項1に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
- 2種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドが、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらにヌクレオチド内の5炭糖の2’番位置の−H基がメトキシエチル(MOE)、ジメチルアミノオキシエトキシ(DMAOE)、ジメチルアミノエトキシエチル(DMAEOE)、メチル(Ome)、アミノプロポキシ(AP)またはフッ素(F)に置換されて変形されたり、ヌクレオチドの糖部がF−ANAに置換されて変形されたものである、請求項8に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。 - 2種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドが、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらに糖部がLNA(locked nucleic acid)またはPNA(peptide nucleic acid)の形態に化学的変形されたものである、請求項8に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。 - 前記オリゴヌクレオチドが、HBVとグアニン4重合体(G-quadruplex)を形成するものである、請求項1に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
- 前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物が、HBVのcccDNA(covalently closed circular DNA)を減らすものである、請求項1に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
- 前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物が、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むものである、請求項1に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
- 前記薬剤学的に許容可能な担体が、キトサンナノ粒子、コロイド分散システム、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、微小球体、ビーズ、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含むものである、請求項13に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
- 前記薬剤学的に許容可能な担体が、キトサンナノ粒子であり、
前記キトサンが、50〜190kDaの分子量を有するものである、請求項14に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。 - 前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物が、経口または非経口で個体に投与されるものである、請求項1に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
- 前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物が、腹膜内、静脈内、経皮、舌下、筋肉内、鼻腔内、または皮下に個体に投与されるものである、請求項1に記載のB型肝炎の治療または予防用医薬組成物。
- 配列番号1、2または6の核酸配列またはその相補的な核酸配列で表現されるオリゴヌクレオチド;及び前記オリゴヌクレオチド上に少なくとも1つの化学的変形(chemical modification)を有するオリゴヌクレオチド;からなる群から選択される1つ以上のオリゴヌクレオチドを有効成分として含むB型肝炎の治療または予防用医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、B型肝炎の治療または予防方法。
- 前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つ以上のヌクレオシド間のリンケージが化学的変形されたものである、請求項18に記載のB型肝炎の治療または予防方法。
- 前記ヌクレオシド間のリンケージが化学的変形されたオリゴヌクレオチドが、ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形されたものである、請求項19に記載のB型肝炎の治療または予防方法。
- 前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つ以上の糖部が化学的変形されたものである、請求項18に記載のB型肝炎の治療または予防方法。
- 前記糖部が、ヌクレオチド内の5炭糖の2’番位置の−H基がメトキシエチル(MOE)、ジメチルアミノオキシエトキシ(DMAOE)、ジメチルアミノエトキシエチル(DMAEOE)、メチル(Ome)、アミノプロポキシ(AP)またはフッ素(F)に置換されて変形されたり、
前記糖部が、F−ANAに置換されて変形されたものである、請求項21に記載のB型肝炎の治療または予防方法。 - 前記糖部が、LNA(locked nucleic acid)またはPNA(peptide nucleic acid)の形態に化学的変形されたものである、請求項21に記載のB型肝炎の治療または予防方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、3’または5’末端にリンカーを介してGalNAc(N-acetylgalactosamine)が結合されている形態である、請求項18に記載のB型肝炎の治療または予防方法。
- 前記化学的変形を有するオリゴヌクレオチドが、ヌクレオシド間のリンケージの化学的変形及び糖部の化学的変形からなる群から選択される2種以上の化学的変形を有するものである、請求項18に記載のB型肝炎の治療または予防方法。
- 2種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドが、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらにヌクレオチド内の5炭糖の2’番位置の−H基がメトキシエチル(MOE)、ジメチルアミノオキシエトキシ(DMAOE)、ジメチルアミノエトキシエチル(DMAEOE)、メチル(Ome)、アミノプロポキシ(AP)またはフッ素(F)に置換されて変形されたり、ヌクレオチドの糖部がF−ANAに置換されて変形されたものである、請求項25に記載のB型肝炎の治療または予防方法。 - 2種以上の化学的変形を有するオリゴヌクレオチドが、
ヌクレオチドのリン酸基がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはボラノホスフェートに化学的変形され、
さらに糖部がLNA(locked nucleic acid)またはPNA(peptide nucleic acid)の形態に化学的変形されたものである、請求項25に記載のB型肝炎の治療または予防方法。 - 前記オリゴヌクレオチドが、HBVとグアニン4重合体(G-quadruplex)を形成するものである、請求項18に記載のHBVの治療または予防方法。
- 前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物が、HBVのcccDNA(covalently closed circular DNA)を減らすものである、請求項18に記載のB型肝炎の治療または予防方法。
- 前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物が、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むものである、請求項18に記載のB型肝炎の治療または予防方法。
- 前記薬剤学的に許容可能な担体が、キトサンナノ粒子、コロイド分散システム、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、微小球体、ビーズ、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含むものである、請求項30に記載のB型肝炎の治療または予防方法。
- 前記薬剤学的に許容可能な担体が、キトサンナノ粒子であり、
前記キトサンが、50〜190kDaの分子量を有するものである、請求項31に記載のB型肝炎の治療または予防方法。 - 前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物が、経口または非経口で個体に投与されるものである、請求項18に記載のB型肝炎の治療または予防方法。
- 前記B型肝炎の治療または予防用医薬組成物が、腹膜内、静脈内、経皮、舌下、筋肉内、鼻腔内、または皮下に個体に投与されるものである、請求項18に記載のB型肝炎の治療または予防方法。
- B型肝炎ウイルス(Hepatitis B virus、HBV)と候補物質を接触させて、前記HBVと候補物質がグアニン4重合体(G-quadruplex)を形成するかどうかを確認する段階を含む、B型肝炎治療剤のスクリーニング方法。
- HBVと候補物質がグアニン4重合体を形成する場合、B型肝炎治療剤として選定する段階をさらに含む、請求項35に記載のB型肝炎治療剤のスクリーニング方法。
- グアニン4重合体を形成するかどうかを確認する段階が、EMSA(Electrophoretic mobility shift assay)、円偏光二色性(circular dichroism、CD)、核磁気共鳴(nuclear magnetic resonance、NMR)、及びグアニン4重合体特異抗体を用いた方法からなる群から選択される方法により確認するものである、請求項35に記載のB型肝炎治療剤のスクリーニング方法。
- 候補物質が、グアニン(G)を4つ以上含むものである、請求項35に記載のB型肝炎治療剤のスクリーニング方法。
- グアニン4重合体が、HBVの配列番号19の核酸配列を有するエンハンサーII(enhancer II)部位と候補物質が結合して形成されるものである、請求項35に記載のB型肝炎治療剤のスクリーニング方法。
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