KR102273071B1 - B형 간염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 또는 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나의 화학적 변형(chemical modification)을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물; 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염의 치료 또는 예방 방법; 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 B형 간염 바이러스 감염에 의한 cccDNA의 감소시키거나 그 기능을 저해하는 조성물; B형 간염 바이러스 감염에 의한 바이러스 RNA 및 단백질의 감소용 조성물; B형 간염 바이러스의 증식 억제용 조성물; 및 B형 간염 바이러스의 진단용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 HBV cccDNA(covalently closed circular DNA) 또는 바이러스 RNA와 구아닌-사중합체(G-quadruplex)를 형성하여 HBV의 cccDNA(covalently closed circular DNA)를 감소시키거나 그 전사를 억제함으로써 B형 간염의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드 또는 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나의 화학적 변형(chemical modification)을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물; 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염의 치료 또는 예방 방법; 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 B형 간염 바이러스 감염에 의한 cccDNA를 감소시키거나 그 기능을 저해하는 조성물; B형 간염 바이러스 감염에 의한 바이러스 RNA 및 단백질의 감소용 조성물; B형 간염 바이러스의 증식 억제용 조성물; 및 B형 간염 바이러스의 진단용 조성물에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, 이하 HBV)는 현재 전세계적으로 약 3억 5천만 명 이상이 감염되어 있을 정도로 바이러스 감염 중 인류에 가장 많은 폐해를 끼치고 있다. 개체가 HBV에 감염되면 만성간염, 간경화, 간암 등의 간질환이 발생할 수 있고, 심하면 바이러스성 간질환으로 인해 사망에 이르게 된다. HBV는 DNA를 게놈(genome)으로 가지고 있으며, 지금까지 알려진 바이러스 중 가장 작은 게놈을 가진 바이러스 중 하나이다. 현재 HBV 감염을 억제할 수 있는 백신이 개발되어 신규 감염률이 많이 줄어들고 있으나 저개발 국가에서는 여전히 감염 실태가 심각한 실정이며, 백신 접종 전에 HBV에 감염된 환자들이 많아 사회적으로 많은 문제를 야기하고 있다.
HBV는 3.2kb의 이중가닥 DNA를 게놈으로 가지고 있는 바이러스로, DNA 주변은 캡시드(capsid) 단백질이 둘러싸고 있고 외피(surface) 단백질이 그 주변을 감싸고 있는 형태로 존재한다. HBV는 간세포에 특화되어 있는 굴성(tropism)이 있고 비세포독성(non-cytotoxic) 상태로 지속적인 감염을 일으키며, 숙주 범위가 매우 좁아서 사람과 침팬지 외의 다른 동물에는 감염되지 않는 특징이 있다. HBV는 감염 후 캡시드가 해체되고 유전자가 핵 내로 이동하여 숙주의 핵 내에서 이중가닥 바이러스 DNA가 cccDNA(covalently closed circular DNA)로 전환된다. cccDNA는 HBV 전사의 주형(template)으로서 HBV 생활사(life cycle)에 있어서 가장 중요한 역할을 담당하고 있다. cccDNA는 히스톤(histone)에 감겨 있고 이들의 다양한 변형에 의해 조절될 수 있다는 사실이 밝혀졌다. cccDNA는 에피좀(episome) 형태의 꼬마염색체(minichromosome)로써 HBV의 모든 RNA를 만들 뿐만 아니라 현재의 치료제로는 이를 없앨 수 없기 때문에 만성 감염을 일으키는 주요한 원인으로 알려져 있다(Urban et al. J Hepatol (2010) 52, 282-284). cccDNA로부터 생성된 바이러스 핵산(viral RNA)은 코어(core), 표면(surface), 중합효소(polymerase), HBx, e항원 등의 단백질을 만들고, 세포질에서 게놈 DNA로 전환이 가능한 pregenomic RNA는 코어 단백질로 이루어진 캡시드에 이입(encapsidation)이 진행된다. Pregenomic RNA로부터 성공적으로 DNA 전환까지 마친 HBV 비리온(virion)은 표면 단백질을 획득한 후 출아(budding)된다. 이후 주변 간세포에 감염되거나 재감염이 되어 꾸준히 증식하게 된다(Urban et al. J Hepatol (2010) 52, 282-284). 현재 사용 중인 모든 B형 간염 치료제는 핵산 유도체로서 pregenomic RNA가 캡시드 안에서 중합효소에 의해 DNA로 전환될 때 바이러스의 신생 DNA 가닥에 끼어 들어가 궁극적으로 합성을 종식시키게 된다. 현재 사용되고 있는 모든 HBV 약제들은 모두 이 중합효소를 표적으로 하고 있으며, 따라서 현재의 모든 약제들은 HBV 중합효소의 RT(reverse transcriptase) 도메인 안의 활성부위에 돌연변이가 생기면 약제 내성을 유발하기 때문에 장기 치료 시 대부분 이러한 약제 내성 돌연변이에 의해 완전 치료가 어렵다(Zoulim and Locarnini, Gastroenterology (2009) 137, 1593-1608 e1591-1592). 현재 FDA의 승인을 받은 만성 B형 감염의 치료제인 핵산 유사체로는 라미부딘(lamivudin), 아데포비어(adefovir), 엔테카비어(entecavir), 텔비부딘(telbivudin), 클레부딘(clevudine) 및 테노포비어(tenofovir)가 있으며, 이들은 모두 중합효소 저해제이기 때문에 cccDNA를 조절할 수가 없어 만성 간염을 완치할 수는 없다. 2014년 Lucifora 등이 IFN-α와 Lymphotoxin b receptor(LTbR)가 APOBEC3A 또는 3B를 유도하고 이들이 세포사멸 없이 cccDNA 만을 선택적으로 제거할 수 있다고 보고하였으나 약제 사용량이 너무 많거나 부작용 등으로 인해 실제 적용에는 어려움이 있다(Lucifora et al. Science. (2014) Mar 14; 343 (6176):1221-8). 세포 기반 cccDNA 분석 방법을 구축하여 85,000개의 화합물을 분석한 결과, DSS(disubstituted sulfonamides) 2개(CCC-0975, CCC-0346)가 cccDNA를 어느정도 줄일 수 있음이 발견되었으나 약으로 개발되기에는 아직 효과가 부족하고 작용 기전도 알려지지 않고 있다(Cai et al. Antimicrob Agents Chemother. (2012) Aug; 56(8):4277-88). 따라서, HBV 감염 질환을 치료하기 위해서는 새로운 치료법이 필요하다.
본 발명의 하나의 목적은 B형 간염의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다. 구체적으로, B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나의 화학적 변형(chemical modification)을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염의 치료 또는 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염에 의한 cccDNA를 감소시키거나 그 기능을 저해하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염에 의한 바이러스 RNA 및 단백질의 감소용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염 바이러스의 증식 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염 바이러스의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 B형 간염 바이러스는 pan-genotype으로부터 유래된 것일 수 있으며, 구체적으로 genotype A, B, C 또는 D일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 본 발명의 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 B형 간염 바이러스의 pan-genotype으로부터 유래된 것일 수 있으며, genotype과 무관하게 동일하거나 상응한 효과를 나타낼 수 있다. 구체적으로, 상기 genotype의 B형 간염 바이러스는 SEQ ID NO: 104 내지 SEQ ID NO: 107의 핵산서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열은 하기 일반식 1의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
[일반식 1]
(TGCT)n(G)6(AATTGA)n'
(n= 0, 1, 2 또는 3, n'= 0, 1 또는 2)
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열은 SEQ ID NO: 78 내지 103의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드, 구체적으로 SEQ ID NO: 2 또는 6의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 뿐만 아니라, SEQ ID NO: 2 또는 6의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드의 핵산 서열 길이를 달리하거나 다른 genotype의 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열로 일부 치환시킨 경우, 즉 SEQ ID NO: 78 내지 103의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 또한 HBV cccDNA 또는 바이러스 RNA와 구아닌-사중합체(G-quadruplex)를 형성하여 HBV의 cccDNA를 감소시키거나 그 전사를 억제하여 B형 간염의 치료 또는 예방에 이용할 수 있다는 기술사상에 기초하며, 이는 본 발명자들에 의하여 최초로 규명된 것이다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나 이상의 뉴클레오시드간 링키지(linkage)가 화학적 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 뉴클레오시드간 링키지가 화학적 변형된 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 포스포아미데이트(phosphoramidate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate)로 화학적 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나 이상의 슈가 모이어티(sugar moiety)가 화학적 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 슈가 모이어티는 뉴클레오타이드 내 5 탄당의 2'번 위치의 -H기가 메톡시에틸(MOE), 디메틸아미노옥시에톡시(DMAOE), 디메틸아미노에톡시에틸(DMAEOE), 메틸(Ome), 아미노프로폭시(AP) 또는 플루오르(F)로 치환되어 변형되거나, 상기 슈가 모이어티가 F-ANA로 치환되어 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 슈가 모이어티는 LNA(locked nucleic acid) 또는 PNA(peptide nucleic acid) 형태로 화학적 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 3' 또는 5' 말단에 링커를 통해 GalNAc(N-acetylgalactosamine)이 결합되어 있는 형태일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오시드간 링키지의 화학적 변형 및 슈가 모이어티의 화학적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형되고, 추가로 뉴클레오타이드 내 5 탄당의 2'번 위치의 -H 기가 메톡시에틸(MOE), 디메틸아미노옥시에톡시(DMAOE), 디메틸아미노에톡시에틸(DMAEOE), 메틸(Ome), 아미노프로폭시(AP) 또는 플루오르(F)로 치환되어 변형되거나, 뉴클레오타이드의 슈가 모이어티가 F-ANA로 치환되어 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는, 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형되고, 추가로 슈가 모이어티가 LNA(locked nucleic acid) 또는 PNA(peptide nucleic acid) 형태로 화학적 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는, 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형되고, 추가로 3' 또는 5' 말단에 링커를 통해 GalNAc(N-acetylgalactosamine)이 결합되어 있는 형태일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 HBV cccDNA(covalently closed circular DNA) 또는 바이러스 RNA와 구아닌-사중합체(G-quadruplex)를 형성하는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물은 HBV의 cccDNA를 감소시키거나 그 기능을 저해하는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 키토산 나노입자, 콜로이드 분산 시스템, 고분자 복합체, 나노캡슐, 나노입자, 미소구체, 비드, 수중유 에멀전, 미셀, 혼합 미셀, 또는 리포솜을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 키토산 나노입자이고, 상기 키토산은 50 내지 190 kDa의 분자량을 가지는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 개체에 투여되는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 복막내, 정맥내, 경피, 설하, 근육내, 비강내 또는 피하로 개체에 투여되는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 적어도 하나의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 20 내지 77, 및 서열번호 108 내지 126의 염기 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드, 구체적으로 SEQ ID NO: 2 또는 6의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드; 및 SEQ ID NO: 78 내지 103의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 HBV 감염 간암 세포주에 처리하고, HBV 마우스 모델에 주입하였을 때, HBV 단백질 및 바이러스 RNA의 생성이 저해되고 유전자 복제도 저해되는 것을 확인하였다. 이를 통해 상기 올리고뉴클레오타이드가 HBV에 대한 항바이러스 효과를 가지는 것을 확인하였다. 이로부터, 상기 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 핵산 서열 또한 HBV에 대한 항바이러스 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 올리고뉴클레오타이드의 세포 투과를 용이하게 하기 위해 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드, 구체적으로 SEQ ID NO: 2 또는 6의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나의 화학적 변형(chemical modification)을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하고, 이를 HBV 감염 간암 세포주 및 HBV 감염 마우스 모델에 처리하였다. 그 결과, HBV를 저해하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 상기 적어도 하나의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드가 화학적 변형에도 불구하고 HBV에 대한 우수한 항바이러스 효과를 가지는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드, 구체적으로 SEQ ID NO: 2 또는 6의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 뿐만 아니라, SEQ ID NO: 2 또는 6의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드의 핵산 서열 길이를 달리하거나 다른 genotype의 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열로 일부 치환시킨 경우, 즉 SEQ ID NO: 78 내지 103의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드의 항바이러스 효과를 바이러스 단백질(HBsAg 및 HBeAg)의 생성 저해 여부로 확인한 결과, 상기 SEQ ID NO: 2 또는 6의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드의 핵산 서열 길이를 달리하거나, 다른 genotype의 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열로 일부 치환시킨 경우에도 우수한 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명에서 B형 간염의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드, 구체적으로 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드는, SEQ ID NO: 2 또는 6의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 상기 핵산 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 나타내는 핵산 서열로서 실질적으로 상기 올리고뉴클레오타이드와 동일하거나 상응하는 효과를 나타내는 핵산 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 나타내는 핵산 서열이라면 그 중 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 핵산 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 당업자에게 자명하다.
상기 "상동성"은 두 개의 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 의미한다. 구체적으로, 특정 핵산 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 특정 핵산 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다.
또한, 상기 “동일성”은 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산 서열 사이의 서열 관련성 정도를 의미하며, 경우에 따라서는 그러한 서열의 스트링 사이의 일치에 의해 결정된다. 예를 들면, 점수(score), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
따라서, B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드는 B형 간염의 치료 또는 예방 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나 이상의 뉴클레오시드간 링키지(linkage)가 화학적 변형된 것이거나, 적어도 하나 이상의 슈가 모이어티(sugar moiety)가 화학적 변형된 것일 수 있다.
상기 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)라 함은 이에 제한되는 것은 아니나, 5 내지 30개의 뉴클레오타이드로 이루어진 중합체이다.
뉴클레오타이드(nucleotide)는 염기(base), 5 탄당, 인산기(포스페이트)로 구성된다. 상기 염기는 퓨린(아데닌 또는 구아닌) 또는 피리미딘(시토신, 티민 또는 우라실)일 수 있다. 또한, 5 탄당은 리보오스, 데옥시리보오스, 아라비노스, 자일로스, 릭소스, 알로스, 알토스, 글루코스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스, 탈로스 또는 이들 당의 안정화된 변형 형태일 수 있다.
예를 들어, 5 탄당이 데옥시리보오스인 경우, 뉴클레오타이드는 하기 화학식 1과 같은 구조로 표현될 수 있다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, B는 염기(base)를 나타낸다.
화학적 변형(chemical modification)에 대해 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 상기 화학적 변형된 올리고뉴클레오타이드는 자연 올리고뉴클레오타이드와 비교시, 뉴클레오시드간 링키지, 리보오스 단위체 및/또는 자연 뉴클레오시드 염기(아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 등)를 수반하는 다양한 화학적 변형을 포함할 수 있다. 상기 화학적 변형은 올리고뉴클레오타이드의 합성 동안 또는 후에 발생할 수 있다. 합성 동안, 변형된 염기는 내부적으로 또는 그것의 말단에 통합될 수 있다. 합성 후에, 변형은 활성기(아미노 변형자를 통해, 3' 또는 5' 히드록실기를 통해, 또는 포스페이트 기를 통해)를 사용하여 수행될 수 있다. 당업자는 상기 올리고뉴클레오타이드의 변형 방법을 잘 알고 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나 이상의 뉴클레오시드간 링키지가 화학적 변형된 것일 수 있다.
뉴클레오시드간 링키지가 화학적 변형된다는 것은 뉴클레오시드들을 서로 연결시켜주고 있는 포스페이트기 내의 산소가 하나 이상의 다른 치환기로 치환되어 있는 것을 말한다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 뉴클레오시드간 링키지에 참여하지 않는 포스페이트기 중의 산소가 황에 의해 대체되어 있는 핵산 분자의 안정화된 당 포스페이트 백본(backbone)을 "포스포로티오에이트 백본"이라 한다. 상기 포스포로티오에이트 외에 뉴클레오티드의 인산기는 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로도 치환될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트 백본은 각각 하기의 화학식 2 내지 5로 나타낸다.
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
상기 화학식 2 내지 5에서, B는 염기(base)를 나타낸다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나 이상의 슈가 모이어티가 화학적 변형된 것일 수 있다. 슈가 모이어티가 화학적 변형되었다는 것은 뉴클레오타이드 내 5 탄당에 화학적 변형이 일어난 것을 말한다.
슈가 모이어티의 화학적 변형은 예를 들어, 뉴클레오타이드 내 5 탄당의 2' 위치의 -H기가 다른 치환기로 치환되어 있거나, 5 탄당의 기본구조가 변형되어 있는 경우를 포함한다.
뉴클레오타이드 내 5 탄당의 2' 위치의 -H기가 다른 치환기로 치환되어 있는 슈가 모이어티의 화학적 변형은 하기 화학식 6의 5 탄당의 2' 위치인 R1이 -H기가 아닌 다른 치환기로 치환되어 있는 것을 의미한다. 화학식 6에서 B는 염기(base)를 나타낸다.
[화학식 6]
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 슈가 모이어티는 뉴클레오타이드 내 5 탄당의 2' 위치의 R1은 이에 제한되는 것은 아니나, 메톡시에톡시[2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸); MOE], 화학식 7), 디메틸아미노옥시에톡시([2'-O(CH2)2ON(CH3)2;DMAOE], 화학식 8), 디메틸아미노에틸옥시에틸([2'-OCH2CH2-O-CH2CH2-N(CH3)2;DMAEOE], 화학식 9), 메톡시([2'-OCH3; Ome], 화학식 10), 아미노프로폭시([2'-OCH2CH2CH2NH2; AP], 화학식 11) 또는 플루오르(2'-F, 화학식 12)로 치환되어 변형되거나, 상기 슈가 모이어티가 F-ANA(2'-F-β-D-arabinofuranosyl, 화학식 13) 로 치환되어 변형되는 것일 수 있다.
[화학식 7]
[화학식 8]
[화학식 9]
[화학식 10]
[화학식 11]
[화학식 12]
[화학식 13]
상기 화학식 7 내지 13에서, B는 염기(base)를 나타낸다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 뉴클레오타이드 내 5 탄당의 기본구조가 변형되어 있는 경우는 이에 제한되는 것은 아니나, 뉴클레오타이드 내 5 탄당이 LNA(locked nucleic acid) 또는 PNA(peptide nucleic acid) 형태로 화학적 변형된 것을 포함할 수 있다.
LNA(locked nucleic acid)는 '잠금핵산' 또는 '바이사이클릭 뉴클레오사이드(bicyclic nucleoside)' 이라고도 하며, 뉴클레오타이드 내 5 탄당의 2' 위치와 4' 위치 사이에서의 공유 브릿지를 포함하는 뉴클레오사이드를 포함하는 것을 말한다. LNA는 하기 화학식 14로 표시된다.
[화학식 14]
상기 화학식 14에서, B는 염기(base)를 나타낸다.
PNA(peptide nucleic acid)는 '펩티드 핵산'이라고도 하며, 뉴클레오타이드의 기본 골격에서 염기(base)는 보유되며, 기본 골격의 아미드(amide-) 부분의 아자(aza-) 질소 원자에 직간접적으로 결합된다. PNA는 하기 화학식 15로 표시될 수 있다.
[화학식 15]
상기 화학식 15에서, B는 염기(base)를 나타낸다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 3' 또는 5' 말단에 링커를 통해 GalNAc(N-acetylgalactosamine)이 결합되어 있는 형태일 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 GalNAc은 올리고뉴클레오타이드의 말단에 연결된 링커 부분에 필요한 수만큼, 예를 들어, 1개, 2개, 또는 3개를 도입할 수 있다.
GalNAc은 간세포의 아시알로글리코단백질(asialoglycoprotein) 수용체에 특이적으로 결합하며, 이 수용체는 주로 세포의 표면에 발현하기 때문에 GalNAc을 올리고뉴클레오타이드의 말단에 결합시켜 간 특이적 전달을 위한 기술로 개발되어 왔다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 간 특이적 전달이 필요하므로, 이러한 공지의 GalNAc 결합 기술을 활용하여 올리고뉴클레오타이드를 추가적으로 화학적 변형시킬 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오시드간 링키지의 화학적 변형 및 슈가 모이어티의 화학적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 것일 수 있다.
상기 슈가 모이어티의 화학적 변형은 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 슈가 모이어티의 화학적 변형을 포함하고, 화학적 변형을 갖는 뉴클레오시드간 링키지에 의해 결합될 수 있다. 하나의 뉴클레오타이드의 화학적 변형은 동일한 올리고뉴클레오타이드 내에 존재하는 다른 뉴클레오타이드의 화학적 변형과는 무관하다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 올리고뉴클레오타이드의 모든 뉴클레오타이드는 슈가 모이어티의 화학적 변형을 포함할 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%가 변형된 것일 수 있다.
예를 들어, 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형되고, 추가로 뉴클레오타이드 내 5 탄당의 2' 위치의 -H기가 메톡시에틸(MOE), 디메틸아미노옥시에톡시(DMAOE), 디메틸아미노에톡시에틸(DMAEOE), 메틸(Ome), 아미노프로폭시(AP) 또는 플루오르(F)로 치환되어 변형되거나, 뉴클레오타이드의 슈가 모이어티가 F-ANA로 치환되어 변형된 것일 수 있다.
또 다른 예에서, 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형되고, 추가로 슈가 모이어티가 LNA(locked nucleic acid) 또는 PNA(peptide nucleic acid) 형태로 화학적 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 인접한 화학적 변형을 포함할 수 있다. 상기 구체예 중 어느 하나에서,, 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 인접한 화학적 변형을 포함할 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단 및 3' 말단에 1, 2, 3, 4 또는 5개의 인접한 화학적 변형을 포함할 수 있다.
구체적으로, 올리고뉴클레오타이드는 전체 백본이 포스포로티오에이트(PS) 백본으로 변형되고, 올리고뉴클레오타이드의 5'과 3'의 양끝에서 각각 4개의 뉴클레오타이드를 O-Methyl로 변형시킨 PS-OMe(4,4); 또는 올리고뉴클레오타이드의 5'과 3'의 양끝에서 각각 5개의 뉴클레오타이드를 O-Methyl로 변형시킨 PS-OMe(5,5)일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 올리고뉴클레오타이드 전체 백본은 포스포로티오에이트(PS)이고, 올리고뉴클레오타이드의 5'과 3'의 양끝에서 각각 2개의 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 PS-LNA(2,2); 올리고뉴클레오타이드의 5'과 3'의 양끝에서 각각 3개의 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 PS-LNA(3,3); 올리고뉴클레오타이드의 5'과 3'의 양끝에서 각각 4개의 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 PS-LNA(4,4); 또는 올리고뉴클레오타이드의 5'과 3'의 양끝에서 각각 5개의 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 PS-LNA(5,5)일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 적어도 하나의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 20 내지 77, 및 서열번호 108 내지 126의 염기 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 구성된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열로 표현되는 올리고뉴클레오타이드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2의 핵산 서열로 표현되는 올리고뉴클레오타이드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열로 표현되는 올리고뉴클레오타이드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2 또는 6의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드의 핵산 서열 길이를 달리하거나, 다른 genotype의 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열로 일부 치환시킨 올리고뉴클레오타이드, 즉 SEQ ID NO: 78 내지 103의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 SEQ ID NO: 20 내지 77의 핵산 서열로 표현되는 올리고뉴클레오타이드를 이용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 HBV cccDNA(covalently closed circular DNA) 또는 바이러스 RNA와 구아닌-사중합체(G-quadruplex)를 형성할 수 있다.
Watson-Crick 모델에 기술되어 있는 이중나선 DNA는 아데닌(A)는 티민(T)과, 구아닌(G)는 시토신(C)과 수소결합을 통해 쌍을 이룬다. 그러나 Hoogsteen은 구아닌이 풍부한 자리에는 4개의 구아닌이 수소 결합하여 하나의 콰르텟(quartet)으로 평면구조를 이루고, 콰르텟 3개 또는 그 이상이 수직으로 층을 이룬 모양을 구아닌-사중합체(G-quadruplex)로 제안하였다. 일반적으로 구아닌이 많이 위치한 유전자에서 구아닌-사중합체 구조로 나타난다고 보고되었다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 HBV 유전자 일부와 결합하여 구아닌-사중합체를 형성하여 HBV 활성을 저해함을 확인하였다(실시예 3 참고). 상기 올리고뉴클레오타이드는 세포, 조직과 같은 개체에서 HBV의 단백질 발현을 억제하거나, HBV 유전자(cccDNA)를 선택적으로 제거하는데 사용될 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 개체에 투여하기 위한 조성물, 즉 약학적 조성물을 제제화할 수 있다. 상기 제제는 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제, 부형제, 담체 및/또는 다른 항바이러스성 물질들을 포함할 수 있다. 부형제는 첨가된 투여량으로는 효과를 나타내지 않는다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 올리고뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함하는 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물이 제공된다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 “항바이러스성 올리고뉴클레오타이드” 또는 “항-HBV 올리고뉴클레오타이드”로 기술될 수 있다.
용어 “약학적 조성물”이란, 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 윤활제, 습윤제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 비경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다. 또한, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 제형화 할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 구체적으로, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 HBV의 cccDNA를 감소시키거나 그 기능을 저해함으로써 HBV 활성을 저해할 수 있다. 따라서 상기 "항바이러스성 올리고뉴클레오타이드"를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 생체내(in vivo)에서 항바이러스제로써의 사용을 방해하지 않는 다른 물질들을 포함할 수 있다. 이러한 다른 물질들은 제한되지 않으며, 희석제, 부형제, 담체 및/또는 다른 항바이러스성 물질들을 포함할 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 다양한 약학적 조성물로 제제화될 수 있다. 약학적 조성물은 의도된 사용에 적합한 형태로 제조될 것이다. 일반적으로, 이는 발열원(pyrogens) 뿐만 아니라 인간 또는 동물에 해로울 수 있는 다른 불순물이 없는 조성물의 제조를 필요로 할 것이다. 예시적인 전달/제제 시스템은 키토산 나노입자, 콜로이드 분산 시스템, 고분자 복합체, 나노캡슐, 나노입자, 미소구체, 비드, 및 수중유 에멀전, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포솜을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 키토산 나노입자이고, 상기 키토산은 50 내지 190 kDa의 분자량을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 구체예 중 어느 하나에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 중합체 (비제한적인 예로서, PLGA (polylactic-glycolic acid))를 이용하여 제제화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 이용되는 중합체는 고분자 화합물이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 하이드록시지방산의 폴리에스테르로, 폴리락트산(poly(lactic acid)) 및 폴리글리콜산(poly(glycolic acid))의 공중합체, 폴리락트산 또는 폴리락타이드만으로 이루어진 중합체, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 락트산과 아미노산의 공중합체 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
조성물 또는 제제는 본 발명에 기술된 적어도 하나를 포함하는 다수의 치료적 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있다. 예를 들어, 조성물 또는 제제는 본 발명에 기술된 적어도 1,. 2, 또는 3개의 항바이러스성 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 올리고뉴클레오타이드는 다른 치료제와 조합으로 사용될 수 있다. 상기 조합은 또한 세포를 하나 이상의 구별된 조성물 또는 제제와 동시에 접촉시킴으로써 성취될 수 있다. 선택적으로, 상기 조합은 연속적으로 투여될 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어, 살균수와 일반적인 식염수를 포함하는, 적절한 희석액과 함께 제제화함으로써, 통상적인 피하 또는 정맥 투여를 위해 제제화된다.
약학적 조성물 및 제제는 전달 비히클을 안정하게 만들고 표적 세포에 의해 흡수될 수 있도록 적절한 염 및 완충액이 사용될 수 있다. 구체예에서, 약학적 조성물은 억제제 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 리포솜, 나노입자 또는 다른 복합체)를 포함하는 유효량의 전달 비히클이 포함되며, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 수성 매질에서 용해되거나 또는 분산된다. "약제학적으로 허용 가능한" 또는 "약리학적으로 허용 가능한"은 동물 또는 인간에게 투여된 경우 해롭거나, 알러지이거나, 또는 다른 부반응들을 나타내지 않는 분자 또는 조성물을 말한다.
용어 "허용 가능한 담체"는 인간에게 투여하기에 적합한 의약을 제제화하는 데 사용하기에 적합한 하나 이상의 용매, 완충액, 용액, 분산매, 코팅, 항균성 및 항진균성 물질, 등장성 및 흡수 지연 물질 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질들을 위한 이러한 매질 및 물질의 사용은 이 기술분야에 잘 알려져 있다. 또한 보조적인 활성 성분들이 조성물에 포함될 수 있다.
약학적 조성물의 투여 또는 전달은 표적 조직이 그 경로를 통해 이용할 수 있는 한 임의의 경로를 통할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물의 투여는 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 선택할 수 있다. 보다 구체적으로, 국소 또는 피내, 피하, 근육내, 복강내, 동맥내, 관상동맥내, 경막내 또는 정맥내 주사, 또는 표적 조직 내로의 직접 주사에 의할 수 있다. 본 발명에 개시된 올리고뉴클레오타이드의 안정성 및/또는 효력은 피하, 피내, 정맥내 및 근육내를 포함하는 편리한 투여 경로를 고려한다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있다. 구체적으로, 일일 투여량은 본 발명 약학적 조성물의 양을 기준으로 0.0001 mg/kg 내지 100 mg/kg일 수 있으며, 구체적으로 0.001 mg/kg 내지 10 mg/kg일 수 있으며, 하루 1회 내지 6 회 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 올리고뉴클레오타이드 및 약학적 조성물은 키트(kit), 용기(container), 팩(pack) 또는 디스펜서(dispenser)로 포함될 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 올리고뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물은 세포, 조직 또는 개체에서 HBV 단백질 발현 억제에 유용하다. 또한, 상기 조성물 또는 제제는 비경구, 복막내, 정맥내, 경피, 설하, 근육내, 비강내 또는 피하로 투여될 수 있다. 예로써, 유리 염기 또는 약제학적으로 허용가능한 염으로써 콘주게이트(conjugate)의 용액은 물에서 히드록시프로필 셀룰로스(hydroxypropyl cellulose)와 같은 계면활성제와 적절히 혼합하여 제조될 수 있다. 또한 분산액은 글리세롤(glycerol), 액체 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다.
통상의 저장 및 사용 조건 하에서 상기 제제들은 미생물의 성장을 막기 위해 일반적으로 방부제를 포함할 수 있다. 주사 용도 또는 카테터(catheter) 전달에 적합한 약학적 형태는 예를 들어, 살균 수성 용액 또는 분산액 및 살균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 살균 분말을 포함한다. 일반적으로 이들 제제는 살균되며 쉬운 주입성이 존재할 정도로 유동성이다. 제제는 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하며 세균 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대비하여 보관되어야 한다. 적합한 용매 또는 분산매는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 및 액체 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물, 및 식물 오일을 포함할 수 있다. 적절한 유동성이 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등의 다양한 항균 및 항진균 물질에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에서, 등장성 물질, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 적합할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기 흡수는 흡수지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에서 사용하여 이루어질 수 있다.
살균 주사 용액은 적절한 양의 컨주게이트를 용매에 원하는 임의의 다른 성분(예를 들어, 상기에서 열거한 것)과 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 살균 활성 성분들을 기본적인 분산매와 원하는 다른 성분들, 예를 들어 앞에서 열거한 것들을 포함하는 살균 비히클에 혼합함으로써 제조된다. 살균 주사용액 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 상기 살균-여과된 용액으로부터 어떠한 추가적으로 요구되는 성분들을 더한 활성 성분(들)의 파우더를 생산하는 진공-건조 및 동결-건조 기술을 포함한다.
상기 제제에서, 용액들은 되도록 투약 제제에 적합한 방식 및 치료에 효과적인 양으로 투여된다. 제제는 주사 가능한 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투약 형태로 쉽게 투여될 수 있다. 수용액에서 비경구적 투여를 위해서, 예를 들어, 용액은 일반적으로 적절하게 완충되고, 액상 희석액은 먼저 예를 들어 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성을 만든다. 이러한 수용액은 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하 및 복막내 투여에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 특히 본 명세서의 관점에서, 이 기술분야의 통상적인 기술을 가진 자에게 이미 알려진 바 대로 살균 수성 매질이 사용된다. 예로써, 단일 복용량은 1ml의 등장성 NaCl 용액에 용해되고 1000ml의 피하주액 유체(hypodermoclysis fluid)에 첨가되거나 또는 예정된 주입 부위에 주사될 수 있다("Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, 페이지 1035-1038 및 1570-1580 참조). 치료받는 대상의 질환에 따라 용량의 일부 변화는 필연적으로 생기게 된다. 투여에 대해 책임을 지는 사람은 어떤 일이 있어도 개개의 대상을 위한 적합한 용량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여에 있어, 제형들은 FDA 생물학 기준 사무국에 의해 요구되는 살균성, 발열원성, 일반 안전 및 순도 기준을 만족해야만 한다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 본 명세서에 기술된 조성물 또는 제제의 일부로서)를 세포로 전달하는 방법, 및 질환의 진행을 치료, 경감, 또는 예방하는 방법이 제공된다. 본 발명에서 용어 "개체" 또는 "환자"는 인간 및 침팬지를 포함하는 영장류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는 임의의 척추동물을 의미한다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 올리고뉴클레오타이드 또는 약학적 조성물은 표적 세포(예를 들어, 포유류 세포)와 in vitro 또는 in vivo로 접촉될 수 있다. 상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 세포는 간 세포일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나의 화학적 변형(chemical modification)을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 B형 간염 바이러스는 pan-genotype으로부터 유래된 것일 수 있으며, 구체적으로 genotype A, B, C 또는 D일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 본 발명의 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 B형 간염 바이러스의 pan-genotype으로부터 유래된 것일 수 있으며, genotype과 무관하게 동일하거나 상응한 효과를 나타낼 수 있다. 상기 genotype의 B형 간염 바이러스는 SEQ ID NO: 104 내지 SEQ ID NO: 107의 핵산서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열은 하기 일반식 1의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
[일반식 1]
(TGCT)n(G)6(AATTGA)n'
(n= 0, 1, 2 또는 3, n'= 0, 1 또는 2)
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열은 SEQ ID NO: 78 내지 103의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나 이상의 뉴클레오시드간 링키지가 화학적 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 뉴클레오시드간 링키지가 화학적 변형된 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나 이상의 슈가 모이어티가 화학적 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 슈가 모이어티는 뉴클레오타이드 내 5 탄당의 2'번 위치의 -H기가 메톡시에틸(MOE), 디메틸아미노옥시에톡시(DMAOE), 디메틸아미노에톡시에틸(DMAEOE), 메틸(Ome), 아미노프로폭시(AP) 또는 플루오르(F)로 치환되어 변형되거나, 상기 모이어티가 F-ANA로 치환되어 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서,, 상기 슈가 모이어티는 LNA(locked nucleic acid) 또는 PNA(peptide nucleic acid) 형태로 화학적 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 3' 또는 5' 말단에 링커를 통해 GalNAc(N-acetylgalactosamine)이 결합되어 있는 형태일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오시드간 링키지의 화학적 변형 및 슈가 모이어티의 화학적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형되고, 추가로 뉴클레오타이드 내 5 탄당의 2'번 위치의 -H기가 메톡시에틸(MOE), 디메틸아미노옥시에톡시(DMAOE), 디메틸아미노에톡시에틸(DMAEOE), 메틸(Ome), 아미노프로폭시(AP) 또는 플루오르(F)로 치환되어 변형되거나, 뉴클레오타이드의 슈가 모이어티가 F-ANA로 치환되어 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는, 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형되고, 추가로 슈가 모이어티가 LNA(locked nucleic acid) 또는 PNA(peptide nucleic acid) 형태로 화학적 변형된 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는, 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형되고, 추가로 3' 또는 5' 말단에 링커를 통해 GalNAc(N-acetylgalactosamine)이 결합되어 있는 형태일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 HBV cccDNA(covalently closed circular DNA) 또는 바이러스 RNA와 구아닌-사중합체(G-quadruplex)를 형성하는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 HBV의 cccDNA(covalently closed circular DNA)를 감소시키거나 그 기능을 저해하는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 키토산 나노입자, 콜로이드 분산 시스템, 고분자 복합체, 나노캡슐, 나노입자, 미소구체, 비드, 수중유 에멀전, 미셀, 혼합 미셀, 또는 리포솜을 포함하는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 키토산 나노입자이고, 상기 키토산은 50 내지 190 kDa의 분자량을 가지는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 개체에 투여되는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 복막내, 정맥내, 경피, 설하, 근육내, 비강내 또는 피하로 개체에 투여되는 것일 수 있다.
임상적 사용을 위해, 올리고뉴클레오타이드는 원하는 치료 결과를 달성하는데 효과적인 임의의 적합한 투여 경로를 통해 단독으로 투여되거나 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 투여 "경로" 는 경장, 비경구 및 국소 투여 또는 흡입을 의미할 것이다. 올리고뉴클레오타이드의 경장 투여 경로는 구강, 위장, 창자, 및 직장을 포함한다. 비경구 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 척추강내, 피하, 국소 주입, 질, 국소, 비강, 점막 및 폐 투여를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드의 국소 투여 경로는 표피, 구강 및 귀, 눈 및 코 내로의 올리고뉴클레오타이드의 외부 적용을 나타낸다.
용어 "치료"란, 본 발명의 약학적 조성물을 B형 간염의 발생이 의심되거나 발병한 개체에 투여하여 B형 간염 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
용어 "예방"이란, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하여, B형 간염의 발병을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나의 화학적 변형(chemical modification)을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드; 및 이를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염에 의한 숙주세포 내의 cccDNA를 감소시키거나 그 기능을 저해하는 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 조성물은 B형 간염 바이러스의 전사를 억제하거나, B형 간염 바이러스가 감염된 숙주세포에서 이미 생성된 ccc DNA를 제거하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 구체예 중 어느 하나에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 2, 6, 20 내지 103, 및 108 내지 126의 핵산 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나의 화학적 변형(chemical modification)을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염에 의한 바이러스 RNA 및 단백질의 감소용 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나의 화학적 변형(chemical modification)을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염 바이러스의 증식 억제용 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 증식 억제는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 HBV cccDNA 또는 바이러스 RNA와 구아닌-사중합체(G-quadruplex)를 형성하여 HBV의 cccDNA를 감소시키거나 그 기능을 저해하거나, 전사를 억제하거나, 바이러스 RNA 및 단백질 발현을 감소시킴으로써 이루어질 수 잇으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나의 화학적 변형(chemical modification)을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염 바이러스의 증식 억제용 조성물 및 B형 간염 바이러스의 진단용 조성물을 제공한다.
용어 “진단”이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 모든 행위를 의미하며, 구체적으로 개체에서 B형 간염 바이러스의 감염 여부를 확인하는 일련의 행위를 의미할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 진단용 조성물은 “표지용 물질”을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 표지용 물질은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 존재여부를 가시적으로 확인하도록 보조하는 물질을 의미하여, 형광물, 리간드, 발광물 및 방사선 동위원소 등이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 형광물은 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 될 수 있고, 상기 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 될 수 있으며, 상기 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 될 수 있으며, 상기 방사선동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 제한적인 것으로 해석되지 않아야 하는 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다. 당업자는, 본 발명의 관점에서, 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않고 개시된 특정 실시태양에 대한 여러 변화가 가능할 수 있고, 동등한 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해해야 한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나의 화학적 변형(chemical modification)을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드는 HBV cccDNA(covalently closed circular DNA) 또는 바이러스 RNA와 구아닌-사중합체(G-quadruplex)를 형성하여 HBV의 cccDNA(covalently closed circular DNA)를 감소시키거나 그 전사를 억제함으로써 B형 간염의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.
도 1은 HBV의 게놈 분석을 통한 서열 스크리닝 모식도 및 D1 - D9 HBV DNA 부위를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 올리고뉴클레오타이드(D1, D2 및 D6)가 단백질 발현 저해[(a) 및 (b)] 및 HBV 복제 저해[(c)] 효과가 있음을 보여준다. (a) 및 (b)는 각각 HBV 1.2 플라스미드의 HBeAg 및 HBsAg 분비량, (c)는 HBV DNA 써던 블랏 결과이다.
도 3은 올리고뉴클레오타이드가 바이럴(viral) mRNAs 전사를 억제시키는 결과를 보여준다. pg/preC RNA는 pregenomic and precore RNA를 의미하고; pre-S/S RNA는 surface RNAs를 의미하며; HBx RNA는 HBx 단백질을 만드는 RNA를 의미한다.
도 4는 올리고뉴클레오타이드가 바이럴(viral) 표면 단백질을 저해시키는 것을 보여준다. 베타-액틴은 로딩 대조군이고, L, M, S는 표면단백질의 3가지 종류를 뜻하는 것으로, L은 큰 것, M은 중간 것, S는 작은 것을 의미한다.
도 5(a)와 (b)는, 올리고뉴클레오타이드가 HBV 인핸서 활성을 저해함을 보여주는 루시페라아제 리포터 분석 결과이다.
도 6 (a) 및 (b)는, 올리고뉴클레오타이드가 HBV 인핸서를 저해함을 보여준다. 도 7은 올리고뉴클레오타이드의 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 결과를 나타낸 것이다. 올리고뉴클레오타이드는 HBV 인핸서 I, II 서열과 결합하여 구아닌-사중합체를 형성함을 보여준다.
도 8은 올리고뉴클레오타이드의 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 결과를 나타낸 것이다. 상기 올리고뉴클레오타이드가 HBV 인핸서 II 부위와 부분적으로 구아닌-사중합체를 형성함을 보여준다.
도 9는 올리고뉴클레오타이드의 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 결과를 나타낸 것이다. 상기 올리고뉴클레오타이드가 자신의 염기서열을 인지하여 구아닌-사중합체 구조를 형성함을 보여준다.
도 10은 올리고뉴클레오타이드에 점돌연변이를 일으킨 돌연변이 뉴클레오타이드가 구아인-사중합체를 형성하는지 알아보기 위한 EMSA 결과이다. 상기 점돌연변이된 올리고뉴클레오타이드의 경우, 구아닌-사중합체를 형성하지 못한다.
도 11은 올리고뉴클레오타이들의 HBV 저해 활성을 루시퍼라아제 활성 분석을 통해 측정한 결과이다. PS는 포스포로티오에이트 변형된 D2, OMe는 O-methyl 변형된 D2, PNA는 PNA 변형된 D2, PS-OMe는 포스포로티오에이트와 O-메틸 변형된 D2, PS-LNA는 포스포로티오에이트와 LNA 변형된 D2를 나타낸다.
도 12(a)는 HepG2-NTCP 세포의 HBV 감염과 바이럴 단백질 분석 과정을 모식적으로 나타낸 것이다. (b) 및 (c)는 변형된 올리고뉴클레오타이드 처리시의 HBV 단백질 발현 분석 결과이다. PS는 포스포로티오에이트 변형된 D2를, PS-OMe는 포스포로티오에이트와 O-메틸 변형된 D2를, PS-LNA는 포스포로티오에이트와 LNA 변형된 D2를 나타낸다. D2의 트렌스펙션(transfection)(D2, T.F)을 항-HBV 효과의 양성 대조군으로 사용하였다. 변형되지 않은 D2 처리(D2 Tr)는 음성 대조군으로 사용하였다. LMV는 lamivudine이다.
도 13(a)는 PHHs (primary human hepatocytes)의 HBV 감염과 바이럴 단백질 분석 과정을 모식적으로 나타낸 것이다. (b) 및 (c)는 변형된 올리고뉴클레오타이드 처리시의 HBV 단백질 발현 분석결과이다. PS는 포스포로티오에이트 변형된 D2를, PS-OMe는 포스포로티오에이트와 O-메틸 변형된 D2를, PS-LNA는 포스포로티오에이트와 LNA 변형된 D2를 나타낸다. D2의 트렌스펙션(transfection)(D2, T.F)을 항-HBV 효과의 양성 대조군으로 사용하였다. 변형되지 않은 D2 처리(D2)는 음성 대조군으로 사용하였다.
도 14는 변형된 D2의 항-HBV 활성을 보여주는 루시퍼라아제 분석 결과이다. PS는 백본이 PS로 변형된 D2를, PS-Ome(4,4)는 백본은 PS이고 5'과 3'의 양끝에서 각각 4개의 뉴클레오타이드를 O-Methyl로 변형시킨 D2를, PS-Ome(5,5)는 백본은 PS이고 5'과 3'의 양끝에서 각각 5개의 뉴클레오타이드를 O-Methyl로 변형시킨 D2를, PS-Ome(all)은 백본은 PS이고 모든 뉴클레오타이드를 O-Methyl로 변형시킨 D2를, PS-LNA(2,2)는 백본은 PS이고 5'과 3'의 양끝에서 각각 2개의 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 D2를, PS-LNA(3,3)는 백본은 PS이고 5'과 3'의 양끝에서 각각 3개의 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 D2를, PS-LNA(4,4)는 백본은 PS이고 5'과 3'의 양끝에서 각각 4개의 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 D2를, PS-LNA(5,5)는 백본은 PS이고 5'과 3'의 양끝에서 각각 5개의 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 D2를, 그리고 PS-LNA(all)은 백본이 PS이고, 모든 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 D2를 의미한다.
도 15는 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드의 HepG2 세포에서의 HBeAg 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 16는 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드의 HepG2 세포에서의 HBsAg 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 17은 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드의 HepG2-NTCP 세포에서의 HBeAg 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 18은 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드의 HepG2-NTCP 세포에서의 HBsAg 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 19는 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드의 PHH 세포에서의 HBeAg 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 20은 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드의 PHH 세포에서의 HBsAg 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 21은 올리고뉴클레오타이드가 in vivo 모델에서 HBV를 저해함을 보여준다. (a)는 in vivo 실험 스케쥴을 모식적으로 나타낸 것이고, (b) 및 (c)는 각각 바이럴 단백질인 HBeAg 및 HBsAg 측정 결과이다. (b) 및 (c)의 첫번째 막대인 Mock은 control mouse이고 두번째는 HBV와 공백터가 있는 것이고, 세번째는 HBV DNA와 D2가 같이 들어있는 실험군을 의미한다.
도 22는 변형된 올리고뉴클레오타이드가 in vivo 모델에 정맥 주사하였을 때 HBV를 저해함을 보여준다. (a)는 in vivo 정맥(intravenous, IV) 주사 실험 스케쥴을 모식적으로 나타낸 것이고, (b) 및 (c)는 각각 바이럴 단백질인 HBeAg 및 HBsAg 측정 결과이다. (d)는 서던 블랏으로 확인한 결과이고, 각 숫자는 실험한 마우스의 번호를 나타낸다. PS는 백본이 포스포로티오에이트로 변형된 D2, PS-OMe는 백본은 PS이고 모든 뉴클레오타이드를 O-Methyl로 변형시킨 D2를, PS-LNA는 백본은 PS이고 모든 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 D2를 의미한다.
도 23은 변형된 올리고뉴클레오타이드를 나노입자(키토산)로 감싸준 뒤 in vivo 모델에 정맥 주사하였을 때 HBV를 저해함을 보여준다. (a)는 in vivo 정맥(intravenous, IV) 주사 실험 스케쥴을 모식적으로 나타낸 것이고, (b) 및 (c)는 각각 바이럴 단백질인 HBeAg 및 HBsAg 측정 결과이며, (d)는 서던 블랏으로 확인한 결과이다.
도 24는 변형된 올리고뉴클레오타이드가 처음부터 처리되었을 때 HBV 저해함을 보여준다. (a)는 PHH에 HBV를 감염시키는 절차에 대해서 모식화하여 나타낸 것이고, (b) 및 (c)는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 처리하였을 경우 cccDNA를 제거하는 작용이 우수함을 확인한 결과이며, (e) 및 (f)는 real-time PCR로 정량적으로 평가한 결과이다.
도 25는 변형된 올리고뉴클레오타이드가 HBV가 미리 감염되어 이미 cccDNA가 존재하는 상황에서도 상기 올리고뉴클레오타이드가 처리되었을 때 HBV를 저해함을 보여준다. (a)는 PHH에 HBV를 감염시키는 절차에 대해서 도식화하여 나타낸 것이고, (b) 및 (c)에서는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 농도별로 처리한 결과이며, (d)는 일반 PCR 수행 후 전기영동을 통해 HBV DNA 및 cccDNA의 양 차이를 확인한 결과이다.
도 26은 변형된 올리고뉴클레오타이드가 HepG2-NTCP에서 cccDNA를 효율적으로 인식하고 G-quadruplex를 형성하는지 확인한 결과이다. (a)는 HepG2-NTCP에서 감염되어 생성된 HBV cccDNA와 변형된 올리고뉴클레오타이드가 G-quadrueplex를 이루며 이를 인식하는 BG4 항체에 의해 D2와 cccDNA가 구아닌 중합체를 형성하는 것을 확인한 결과이며, (b)는 BG4에 의한 foci 개수를 나타낸 것이다.
도 27 및 도28은 D2 올리고뉴클레오타이드의 (G)6 서열을 중심으로 핵산 서열의 길이를 양쪽에서 줄였을 경우(L-1 내지 L-4, R-1 및 R-2), 각 각의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 수준을 나타낸 것이다.
도 29는 D2 올리고뉴클레오타이드의 (G)6 서열을 중심으로 핵산 서열을 추가한 경우(18, 20, 22, 24mer 및 24mer L, 24mer R), 각각의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 수준을 나타낸 것이다.
도 30은 D2 올리고뉴클레오타이드의 (G)6 서열 중 하나를 C로 치환한 경우(D2-1, D2-2) 및 (G)6 이외의 핵산 서열 중 일부를 다른 genotype의 B형 간염 바이러스 유래의 서열로 치환한 경우(D2-3, D2-4), 각각의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 수준을 나타낸 것이다.
도 31은 D6 올리고뉴클레오타이드의 (G)5 서열을 중심으로 5' 또는 3' 말단으로부터 핵산 서열의 길이를 줄이거나(D6-1), 추가(D6-2 내지 D6-8)한 경우; 및 (G)5 서열 이외의 핵산 서열 중 일부를 다른 genotype의 B형 간염 바이러스 유래의 서열로 치환한 경우(D6-9, D6-10), 각각의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 수준을 나타낸 것이다.
도 32a, 32b 및 32c는 본 발명의 변형되지 않은 D2 올리고뉴클레오타이드를 genotype A, C, D의 HBV에 트랜스펙션한 경우, 각각의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 수준을 나타낸 것이다.
도 33a, 33b 및 33c는 본 발명의 변형되지 않은 D2 올리고뉴클레오타이드를 genotype A, B, C의 HBV에 트랜스펙션한 경우, 각각의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 수준을 나타낸 것이다.
도 34는 올리고뉴클레오티드 (3,3) 및 63의 항바이러스 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 35는 올리고뉴클레오티드 63의 항바이러스 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 36은 올리고뉴클레오티드 8, 67, 15, 및 72의 항바이러스 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 37은 올리고뉴클레오티드 63의 항바이러스 활성을 in vivo에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 올리고뉴클레오타이드(D1, D2 및 D6)가 단백질 발현 저해[(a) 및 (b)] 및 HBV 복제 저해[(c)] 효과가 있음을 보여준다. (a) 및 (b)는 각각 HBV 1.2 플라스미드의 HBeAg 및 HBsAg 분비량, (c)는 HBV DNA 써던 블랏 결과이다.
도 3은 올리고뉴클레오타이드가 바이럴(viral) mRNAs 전사를 억제시키는 결과를 보여준다. pg/preC RNA는 pregenomic and precore RNA를 의미하고; pre-S/S RNA는 surface RNAs를 의미하며; HBx RNA는 HBx 단백질을 만드는 RNA를 의미한다.
도 4는 올리고뉴클레오타이드가 바이럴(viral) 표면 단백질을 저해시키는 것을 보여준다. 베타-액틴은 로딩 대조군이고, L, M, S는 표면단백질의 3가지 종류를 뜻하는 것으로, L은 큰 것, M은 중간 것, S는 작은 것을 의미한다.
도 5(a)와 (b)는, 올리고뉴클레오타이드가 HBV 인핸서 활성을 저해함을 보여주는 루시페라아제 리포터 분석 결과이다.
도 6 (a) 및 (b)는, 올리고뉴클레오타이드가 HBV 인핸서를 저해함을 보여준다. 도 7은 올리고뉴클레오타이드의 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 결과를 나타낸 것이다. 올리고뉴클레오타이드는 HBV 인핸서 I, II 서열과 결합하여 구아닌-사중합체를 형성함을 보여준다.
도 8은 올리고뉴클레오타이드의 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 결과를 나타낸 것이다. 상기 올리고뉴클레오타이드가 HBV 인핸서 II 부위와 부분적으로 구아닌-사중합체를 형성함을 보여준다.
도 9는 올리고뉴클레오타이드의 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 결과를 나타낸 것이다. 상기 올리고뉴클레오타이드가 자신의 염기서열을 인지하여 구아닌-사중합체 구조를 형성함을 보여준다.
도 10은 올리고뉴클레오타이드에 점돌연변이를 일으킨 돌연변이 뉴클레오타이드가 구아인-사중합체를 형성하는지 알아보기 위한 EMSA 결과이다. 상기 점돌연변이된 올리고뉴클레오타이드의 경우, 구아닌-사중합체를 형성하지 못한다.
도 11은 올리고뉴클레오타이들의 HBV 저해 활성을 루시퍼라아제 활성 분석을 통해 측정한 결과이다. PS는 포스포로티오에이트 변형된 D2, OMe는 O-methyl 변형된 D2, PNA는 PNA 변형된 D2, PS-OMe는 포스포로티오에이트와 O-메틸 변형된 D2, PS-LNA는 포스포로티오에이트와 LNA 변형된 D2를 나타낸다.
도 12(a)는 HepG2-NTCP 세포의 HBV 감염과 바이럴 단백질 분석 과정을 모식적으로 나타낸 것이다. (b) 및 (c)는 변형된 올리고뉴클레오타이드 처리시의 HBV 단백질 발현 분석 결과이다. PS는 포스포로티오에이트 변형된 D2를, PS-OMe는 포스포로티오에이트와 O-메틸 변형된 D2를, PS-LNA는 포스포로티오에이트와 LNA 변형된 D2를 나타낸다. D2의 트렌스펙션(transfection)(D2, T.F)을 항-HBV 효과의 양성 대조군으로 사용하였다. 변형되지 않은 D2 처리(D2 Tr)는 음성 대조군으로 사용하였다. LMV는 lamivudine이다.
도 13(a)는 PHHs (primary human hepatocytes)의 HBV 감염과 바이럴 단백질 분석 과정을 모식적으로 나타낸 것이다. (b) 및 (c)는 변형된 올리고뉴클레오타이드 처리시의 HBV 단백질 발현 분석결과이다. PS는 포스포로티오에이트 변형된 D2를, PS-OMe는 포스포로티오에이트와 O-메틸 변형된 D2를, PS-LNA는 포스포로티오에이트와 LNA 변형된 D2를 나타낸다. D2의 트렌스펙션(transfection)(D2, T.F)을 항-HBV 효과의 양성 대조군으로 사용하였다. 변형되지 않은 D2 처리(D2)는 음성 대조군으로 사용하였다.
도 14는 변형된 D2의 항-HBV 활성을 보여주는 루시퍼라아제 분석 결과이다. PS는 백본이 PS로 변형된 D2를, PS-Ome(4,4)는 백본은 PS이고 5'과 3'의 양끝에서 각각 4개의 뉴클레오타이드를 O-Methyl로 변형시킨 D2를, PS-Ome(5,5)는 백본은 PS이고 5'과 3'의 양끝에서 각각 5개의 뉴클레오타이드를 O-Methyl로 변형시킨 D2를, PS-Ome(all)은 백본은 PS이고 모든 뉴클레오타이드를 O-Methyl로 변형시킨 D2를, PS-LNA(2,2)는 백본은 PS이고 5'과 3'의 양끝에서 각각 2개의 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 D2를, PS-LNA(3,3)는 백본은 PS이고 5'과 3'의 양끝에서 각각 3개의 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 D2를, PS-LNA(4,4)는 백본은 PS이고 5'과 3'의 양끝에서 각각 4개의 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 D2를, PS-LNA(5,5)는 백본은 PS이고 5'과 3'의 양끝에서 각각 5개의 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 D2를, 그리고 PS-LNA(all)은 백본이 PS이고, 모든 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 D2를 의미한다.
도 15는 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드의 HepG2 세포에서의 HBeAg 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 16는 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드의 HepG2 세포에서의 HBsAg 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 17은 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드의 HepG2-NTCP 세포에서의 HBeAg 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 18은 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드의 HepG2-NTCP 세포에서의 HBsAg 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 19는 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드의 PHH 세포에서의 HBeAg 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 20은 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드의 PHH 세포에서의 HBsAg 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 21은 올리고뉴클레오타이드가 in vivo 모델에서 HBV를 저해함을 보여준다. (a)는 in vivo 실험 스케쥴을 모식적으로 나타낸 것이고, (b) 및 (c)는 각각 바이럴 단백질인 HBeAg 및 HBsAg 측정 결과이다. (b) 및 (c)의 첫번째 막대인 Mock은 control mouse이고 두번째는 HBV와 공백터가 있는 것이고, 세번째는 HBV DNA와 D2가 같이 들어있는 실험군을 의미한다.
도 22는 변형된 올리고뉴클레오타이드가 in vivo 모델에 정맥 주사하였을 때 HBV를 저해함을 보여준다. (a)는 in vivo 정맥(intravenous, IV) 주사 실험 스케쥴을 모식적으로 나타낸 것이고, (b) 및 (c)는 각각 바이럴 단백질인 HBeAg 및 HBsAg 측정 결과이다. (d)는 서던 블랏으로 확인한 결과이고, 각 숫자는 실험한 마우스의 번호를 나타낸다. PS는 백본이 포스포로티오에이트로 변형된 D2, PS-OMe는 백본은 PS이고 모든 뉴클레오타이드를 O-Methyl로 변형시킨 D2를, PS-LNA는 백본은 PS이고 모든 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 D2를 의미한다.
도 23은 변형된 올리고뉴클레오타이드를 나노입자(키토산)로 감싸준 뒤 in vivo 모델에 정맥 주사하였을 때 HBV를 저해함을 보여준다. (a)는 in vivo 정맥(intravenous, IV) 주사 실험 스케쥴을 모식적으로 나타낸 것이고, (b) 및 (c)는 각각 바이럴 단백질인 HBeAg 및 HBsAg 측정 결과이며, (d)는 서던 블랏으로 확인한 결과이다.
도 24는 변형된 올리고뉴클레오타이드가 처음부터 처리되었을 때 HBV 저해함을 보여준다. (a)는 PHH에 HBV를 감염시키는 절차에 대해서 모식화하여 나타낸 것이고, (b) 및 (c)는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 처리하였을 경우 cccDNA를 제거하는 작용이 우수함을 확인한 결과이며, (e) 및 (f)는 real-time PCR로 정량적으로 평가한 결과이다.
도 25는 변형된 올리고뉴클레오타이드가 HBV가 미리 감염되어 이미 cccDNA가 존재하는 상황에서도 상기 올리고뉴클레오타이드가 처리되었을 때 HBV를 저해함을 보여준다. (a)는 PHH에 HBV를 감염시키는 절차에 대해서 도식화하여 나타낸 것이고, (b) 및 (c)에서는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 농도별로 처리한 결과이며, (d)는 일반 PCR 수행 후 전기영동을 통해 HBV DNA 및 cccDNA의 양 차이를 확인한 결과이다.
도 26은 변형된 올리고뉴클레오타이드가 HepG2-NTCP에서 cccDNA를 효율적으로 인식하고 G-quadruplex를 형성하는지 확인한 결과이다. (a)는 HepG2-NTCP에서 감염되어 생성된 HBV cccDNA와 변형된 올리고뉴클레오타이드가 G-quadrueplex를 이루며 이를 인식하는 BG4 항체에 의해 D2와 cccDNA가 구아닌 중합체를 형성하는 것을 확인한 결과이며, (b)는 BG4에 의한 foci 개수를 나타낸 것이다.
도 27 및 도28은 D2 올리고뉴클레오타이드의 (G)6 서열을 중심으로 핵산 서열의 길이를 양쪽에서 줄였을 경우(L-1 내지 L-4, R-1 및 R-2), 각 각의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 수준을 나타낸 것이다.
도 29는 D2 올리고뉴클레오타이드의 (G)6 서열을 중심으로 핵산 서열을 추가한 경우(18, 20, 22, 24mer 및 24mer L, 24mer R), 각각의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 수준을 나타낸 것이다.
도 30은 D2 올리고뉴클레오타이드의 (G)6 서열 중 하나를 C로 치환한 경우(D2-1, D2-2) 및 (G)6 이외의 핵산 서열 중 일부를 다른 genotype의 B형 간염 바이러스 유래의 서열로 치환한 경우(D2-3, D2-4), 각각의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 수준을 나타낸 것이다.
도 31은 D6 올리고뉴클레오타이드의 (G)5 서열을 중심으로 5' 또는 3' 말단으로부터 핵산 서열의 길이를 줄이거나(D6-1), 추가(D6-2 내지 D6-8)한 경우; 및 (G)5 서열 이외의 핵산 서열 중 일부를 다른 genotype의 B형 간염 바이러스 유래의 서열로 치환한 경우(D6-9, D6-10), 각각의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 수준을 나타낸 것이다.
도 32a, 32b 및 32c는 본 발명의 변형되지 않은 D2 올리고뉴클레오타이드를 genotype A, C, D의 HBV에 트랜스펙션한 경우, 각각의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 수준을 나타낸 것이다.
도 33a, 33b 및 33c는 본 발명의 변형되지 않은 D2 올리고뉴클레오타이드를 genotype A, B, C의 HBV에 트랜스펙션한 경우, 각각의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 수준을 나타낸 것이다.
도 34는 올리고뉴클레오티드 (3,3) 및 63의 항바이러스 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 35는 올리고뉴클레오티드 63의 항바이러스 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 36은 올리고뉴클레오티드 8, 67, 15, 및 72의 항바이러스 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 37은 올리고뉴클레오티드 63의 항바이러스 활성을 in vivo에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
1-1: 세포배양 및 트렌스펙션(transfection)
인간 간암 세포주(HepG2 및 Huh7 세포)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 제공 받았다. hNTCP[NM_003049.3]의 NCBI 번호를 갖는 homo sapiens solute carrier family 10(sodium/bile acid cotransporter) 또는 member 1(SLC10A1)을 발현 가능한 플라스미드는 HepG2-hNTCP 세포주를 확립하기 위해 제조자의 지시에 따라 Lipofectamin 2000(Invitrogen)을 이용해 HepG2 세포에 트렌스펙션시켰다. 세포주는 DMEM에서 배양하였다. DMEM에는 10%(v/v)의 FBS(Gibco BRL)를 넣었고 1% 페니실린과 1% 스트렙토마이신을 첨가하여 사용했다. HepG2 및 Huh7 세포를 5 % CO2가 발생하는 인큐베이터에서 37℃ 온도로 배양하였다. Primary human hepatocytes(PHHs)는 가톨릭대학교 병원(의정부, 경기도, 한국) 또는 고려대학교 병원(서울, 한국)의 환자 조직으로부터 IRB 승인을 받아서 분리하여 사용하였다. Primary maintenance medium(Gibco BRL, Oregon, USA)에 CM4000(Thermo, Rockford, USA)을 넣고 1% 페니실린과 1% 스트렙토마이신을 첨가하여 PHH를 배양하였다. 트렌스펙션은 가이드라인에 따라 Lipofectamin 2000을 사용해 80% 정도 세포가 배양되었을 때 수행하였다. 트렌스펙션 후 15시간이 경과되었을 때, 세포들은 새 배지로 바꾸어주었다. 세포는 트렌스펙션 후 2~3일차에 수확하였다.
1-2. HBV 감염 연구
접종 가능한 HBV를 모으기 위해서, 대략 100배로 농축된 HepAD38 cell의 배양 상층액을 6% PEG8000과 함께 침전시켰다. 25% FBS를 포함하는 PBS에 HBV 입자들을 준비했다. 감염성이 있는 HBV stock을 -80℃에서 보관했다. HBV 정량은 점블랏 검정(dot blot assay)을 통해 계산했다. HBV 감염을 위해서, 4% PEG와 2.5% DMSO를 포함하는 PMM과 함께 HepG2-NTCP 세포와 PHH 세포를 사용하였다. 감염 15시간 이후, fresh PMM으로 배지를 교체해주었다. Infection 7일 후에 감염된 세포를 수확하였다.
1-3. 써던 블랏(Southern blot)
써던 블랏(Southern blot)으로 viral DNA를 검출하였다. 간략하게는, 감염 3일 후에 scrapping으로 세포 펠렛을 수확하였다. 그리고 수확된 세포들을 차가운 HEPES(10mM HEPES pH7.5, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5% NP-40) buffer 100ul로 녹인 후, 26% PEG8000 buffer로 용해물에 있는 HBV 코어 캡시드(HBV core capsid)들을 침전시켰다. 이후에 HBV 코어 캡시드를 0.5% SDS buffer(with 250mg Proteinase K)로 37℃에서 3시간 동안 분해시켰다. HBV DNA를 페놀-클로로포름(phenol-chloroform)으로 추출하고 NaOAC와 에탄올(ethanol)로 침전시켰다. 총 DNA를 0.8% 아가로스 겔에서 90V로 3시간 동안 전기영동을 통해 분리시키고 XL nitrocellulose membrane(GE healthcare)로 transfer시켰다. 그 후 HBV DNA를 highly pure randomized HBV probe로 검출하고, Phospho-imager를 사용해 상대적인 HBV DNA 복제 수준을 정량화하였다.
1-4. 노던 블랏(Northern blot)
노던 블랏(Northern blot)으로 HBV mRNA들을 검출하였다. 간략하게는, 제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol reagent(Invitrogen)을 사용해서 Total cell RNA들을 추출했다. 20ul의 total RNA들을 1% 포름알데하이드(formaldehyde) 아가로스 겔에서 120V로 3시간 동안 전기영동을 통해 분리시키고 XL nitrocellulose membrane(GE healthcare)로 16~18시간 동안 transfer시켰다. HBV-specific mRNA들을 검출하기 위해서, membrane을 highly pure randomly primed HBV probe와 함께 혼성화(hybridization)시켰으며, Phospho-imager를 사용해 상대적인 HBV DNA 복제 수준을 정량화하였다.
1-5: 웨스턴 블랏(Western blot)
감염 2일 후 세포를 수확하여 RIPA buffer [20mM Tris/HCl, 1% NP-40, 0.5% protease inhibitor cocktail(Sigma, St.Luis, MO), 150mM NaCl, 2mM KCl, pH7.4]에 30분간 4℃에서 용해시켰다. 단백질 용해물들은 SDS-PAGE 방법으로 분리하였다. SDS-PAGE 이후 polyacrylamide gel의 단백질들을 PVDF membrane으로 옮겼다. 항체(Antibody)는 1:2000의 비율로 사용하였다. 1차 항체(1st antibody)는 anti-actin(Sigma), HBsAg(Abcam) HBcAg(DAKO, USA)를 사용하였다.
1-6: 실시간(real-time) PCR을 이용한 rcDNA 및 cccDNA 정량 분석
HBV rcDNA(relaxed circular DNA)를 정량하기 위해 HBV가 감염된 PHH에서 QIAamp DNA Mini kit (Qiagen)를 사용하여 전체 cellular DNA를 추출하였다. cccDNA를 증폭하기 전에, DNA를 T5 exonuclease(NEB) 처리해 주었다. Real-time PCR은 DNA가 20ng이 포함된 Light Cycler(roche) 20ul, 0.5umol/L의 정방향, 역방향 프라이머, 0.2umol/L의 3'-fluorescein(FL)가 표지된 프로브, 그리고 0.4umol/L의 5'-Red640(R640)이 표지된 프로브를 사용하였다. cccDNA의 증폭을 위한 정방향과 역방향 프라이머는 각각 5'-CTCCCCGTCTGTGCCTTCT-3' (SEQ ID NO: 10) 및 5'-GCCCCAAAGCCACCCAAG-3'(SEQ ID NO: 11)의 구조이고, 간 내의 rcDNA의 증폭은 5'-CTCGTGGTGGACTTCTCTC-3'(SEQ ID NO: 12) 및 5'-CTGCAGGATGAAGAGGAA-3'(SEQ ID NO: 13)을 각각 사용하였다. FRET 혼성화 프로브는 cccDNA의 증폭을 위해 5'-GTTCACGGTGGTCTCCATGCAACGT-FL-3'(SEQ ID NO: 14) 및 5'-R640-AGGTGAAGCGAAGTGCACACGGACC-3'(SEQ ID NO: 15), rcDNA의 증폭을 위해 5'-CACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAA-FL-3'(SEQ ID NO: 16) 및 5'-R640 TGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCT-3'(SEQ ID NO: 17)을 각각 사용하였다. HBV DNA의 총량의 증폭은 기술한 바와 같이 수행 하였다: 95℃에 10분 처리한 다음에 95℃ 10초, 58℃ 10초, 72℃ 15초를 45회 반복하였다. cccDNA의 증폭은 다음 기술한 바와 같이 수행하였다: 95℃에 10분 처리한 다음에 95℃ 10초, 58℃ 5초, 72℃ 20초를 45회 반복하였다. 노멀라이징하기 위해 베타-글로빈 유전자를 LightCycler b-Globin control kit(Roche)를 이용하여 증폭시켰다. HBV 모노머(pHBV EcoRI)가 포함된 플라스미드를 단계적 희석한 것을 정량 표준으로 삼았다.
1-7: 루시퍼라아제 리포터(luciferase reporter) 분석
HBV 인핸서 활성을 확인하기 위해 인핸서 루시퍼라아제 리포터 어세이를 실시하였다. 12-well plate에 2Х105개의 HepG2 세포주를 준비하고, 0.5ug의 Enhancer-Luc(pEnhI.II, pEnhI.△II, pEnhIXp, pXp.EnhII, pNRE.EnhII, pEnhII/cp, pEnhI△Xp-D2, pEnhIXp-D6, pEnhI△Xp-D7, and pEnhIXp-D8: 도 5 및 도 6 참고), 그리고 50nM의 D2를 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 48시간 이후에, 세포를 수확하여 promega lysis buffer에 용해하고, 그 후 enhancer luciferase activity를 Luciferase reagent(Promega, Madison, WI)를 사용하여 측정하였다.
1-8: 올리고뉴클레오타이드 제작
1-8-1: 변형되지 않은 올리고뉴클레오타이드 제작
도 1은 HBV의 게놈 분석을 통하여 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 등 특이 구조를 이루어 항바이러스 효과를 낼 수 있는 서열 스크리닝 모식도를 나타낸 것이다.
본 발명에 사용한 올리고 화합물 D1 내지 D9는 cosmogenetech(Seoul, Korea) 또는 Bio Basic(Canada)에서 합성하였다. 각각의 자세한 설명은 아래 표 2에 기술하였다.
D1-D9는 변형되지 않은 올리고뉴클레오타이드이다. 이 중 D2를 PS(Phosphorothioate), OMe(O-Methyl), PNA(Peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), PS-OMe, 그리고 PS-LNA로 변형하여 사용하였다.
PS로 변형된 올리고뉴클레오타이드는 세포 내로 투과가 용이하고 엑소뉴클레이즈(exonuclease)에 의한 분해를 막을 수 있다. OMe 변형은 RNA와 유사한 성격을 지니나, 세포 내에서 뉴클레이즈(nuclease)와 가수분해에 대하여 안정성이 증가되는 특징이 있다. 또한 2중 구조에서의 Tm이 1-4℃ 정도 증가된다. PNA는 인위적으로 만들어진 폴리머로써, DNA 또는 RNA와 유사한 구조를 지니며 골격은 펩타이드 결합에 의해 N-(2-aminoethyl)-glycine이 반복적으로 연결되어 있다. LNA로 변형된 올리고뉴클레오타이드는 2' 산소와 4' 탄소가 연결되어 잠겨있는 구조로, 혼성화 시 Tm이 증가하고 분해로부터 안정적인 특징이 있다. 부분적으로 변형된 D2는 5' 말단과 3' 말단 서열에 부분적으로 변형을 시켰다. 예로, PS-LNA(4,4)는 전체 백본은 PS이고 5'과 3'의 양끝에서 각각 4개의 뉴클레오타이드를 LNA로 변형시킨 것을 의미한다. 이와 같이 부분적으로 변형시켜 제작된 D2로는 PS-OMe(4,4), PS-OMe(5,5), PS-LNA(2,2) PS-LNA(3,3)(SEQ ID NO: 76) PS-LNA(4,4)(SEQ ID NO: 77), PS-LNA(5,5) 등이 있다.
1-8-2: 변형된 올리고뉴클레오타이드 제작
항바이러스 효과의 최적화를 위해 상기 1-8-1의 D2를 이용하여 다양한 형태의 올리고뉴클레오타이드를 다음과 같은 명명법을 이용하여 제작하였다: DNA는 대문자 A, G, C, T로 명명하고, RNA는 a, g, c, t로 명명하였다. 뉴클레오타이드 내 5탄당의 2' 위치가 O-methyl로 변형시킨 경우 핵산 앞에 m을 붙이고, LNA로 변형시킨 경우 핵산 앞에 l을 붙였다. DNA 백본(backbone)의 경우 포스포로티오에이트(phosphorthioate, PS)로 되어 있으면 중괄호([ ])로 표기하였다. 일반 DNA는 중괄호가 없는 형태이다. 상기 명명법에 대해 표 3에 나타내었다.
상기 명명법 규칙에 따라 총 77개의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였으며, 표 4 내지 6에 나타내었다. 본 발명에서, 하기 표 4 내지 6에 나타난 올리고뉴클레오타이드는 순서대로 SEQ ID NO: 20 내지 SEQ ID NO: 77, 및 SEQ ID NO: 108 내지 126로 나타내었으며, 하기 표 4 내지 6에서 핵산서열에 부여된 번호는 올리고 변형#(Oligo modification#)를 의미한다.
1-8-3: 변형된 올리고뉴클레오타이드 제작
추가적으로, 본 발명자들은 상기 1-8-2의 D4를 이용하여 다음의 올리고뉴클레오타이드 65(서열번호 127)를 제작하였다. 하기 표 7의 명명법은 상술한 것과 동일하다.
1-9: EMSA (electrophoretic mobility shift assay)
HBV 인핸서 DNA는 30ng을 사용하였고 [32P]-gamma 동위원소를 사용하여 라벨링하였다. D2는 500ng을 G-quadruplex 형성하는데 사용하였다. DNA를 (D2, pEnhI△Xp, pEnhI△Xp-D2, 및 enhancer I.II) 버퍼용액 (10mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1M KCl, 1mM DTT, and 10mM MgCl2)과 섞고 열을 가해 준 후 식혀서 DNA가 접히게 하였다. DNA 혼합물에 반응시킨 후, BG4 antibody(Absolute antibody, United Kingdom)를 첨가해 DNA-protein 결합을 통해 특이적인 G-quadruplex DNA를 확인하였다. 상온에서 결합 반응 후, DNA-DNA complex는 6% polyacrylamide gel을 이용하여 차가운 온도에서 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후, 젤은 70℃의 온도에서 30분간 건조시켰다. 결과는 phospho-imager를 사용하여 분석하였다.
1-10: 마우스에 유체역학적 주입(hydrodynamic injection)을 이용한 실험 6주령의 쥐(BALB/C)에 plasmid DNA(HBV 1.2 25ug, D2 25ug 및 b-gal 5ug)를 hydrodynamic injection 방법을 이용해 전달하였다. 쥐 몸무게의 10%에 해당하는 부피를 PBS로 준비하였고, 마우스 꼬리 정맥에 주사하였다. 변형된 D2(50ug)들도 마우스 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. DNA를 포함한 PBS는 주사기를 이용해 4-6초간 빠른 속도를 통해 정맥에 주사하였다. 모든 동물실험은 건국대학교 Animal Care Committee에 의해 승인 받았다.
1-11: 세포에서의 구아닌-사중합체를 현미경으로 분석하는 방법
6웰 플레이트에 커버 글라스를 바닥에 깔아두고 세포를 배양하였다. 상기 세포에 HBV를 감염시키고 변형된 D2 500nM를 처리하였다. 아세톤으로 세포를 고정시킨 후 PBS로 3번 세척하였다. 3% BSA를 포함한 PBS를 사용해 blocking을 진행하였다. PBS로 3번 세척 후 BG4 (absolute antibody, Ab00174-1.1) 항체를 1:300 비율로 섞어서 cold room에 오버나잇으로 반응시켰다. PBS로 3번 세척 후 mouse alexa 568을 이용해 1시간동안 6웰 플레이트에 커버 글라스를 바닥에 깔아두고 세포를 배양하였다. 상기 세포에 HBV를 감염시키고 변형된 D2 500nM를 처리하였다. 아세톤으로 세포를 고정시킨 후 PBS로 3번 세척하였다. 3% BSA를 포함한 PBS를 사용해 blocking을 진행하였다. PBS로 3번 세척한 후 BG4 (absolute antibody, Ab00174-1.1) 항체를 1:300 비율로 섞어서 cold room에 오버나잇으로 반응시켰다. PBS로 3번 세척한 후 mouse alexa 568을 이용해 1시간동안 반응시켰다. PBS로 3번 세척한 후 DAPI를 30분간 사용해 핵을 염색시켰다. PBS로 3번 세척한 후 커버 글라스를 유리 슬라이드에 마운팅 시킨 후 건조시켰다.
1-12: 키토산 나노입자를 이용한 In vivo 실험
6주령의 쥐(BALB/C)에 plasmid DNA(HBV 1.2 25ug and b-gal 5ug)를 hydrodynamic injection 방법을 이용해 전달하였다. 쥐 몸무게의 10%에 해당하는 부피를 PBS로 준비하였고, 마우스 꼬리 정맥에 주사하였다. DNA를 포함한 PBS는 주사기를 이용해 4-6초간 빠른 속도를 통해 정맥에 주사하였다. 다음날 키토산 나노입자와 D2 혼합물 8ug도 마우스 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 키토산 나노입자는 낮은 세포독성과 면역원성뿐 아니라 효율적인 생체적합성 분자로 siRNA와 같은 올리고뉴클레오타이드를 효율적으로 전달할 수 있는 특징이 있다(Targeted Gene Silencing Using RGD-Labeled Chitosan Nanoparticles, Hee Dong Han, Clin Cancer Res. 2010).
상기의 실험을 위해 사용된 키토산 나노입자는 키토산(MW 50-190KDa)과 D2의 이온적인 겔화(gelation)를 기반으로 제조하였다. TPP(0.25% w/v)와 D2(1 μg/μL)를 1%(w/v) 키토산 솔루션에 첨가하였다. 실온에서 연속적인 반응이 일어났으며, 인큐베이션 반응이 끝난 후 4℃에서 40분간 13,000RPM으로 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛은 DW로 3번에 걸쳐 세척하였고 사용하기까지 4℃에서 보관하였다. 모든 동물실험은 건국대학교 Animal Care Committee에 의해 승인 받았다.
실시예 2: 항바이러스 효과 확인
2-1: 항바이러스 효과를 나타내는 올리고뉴클레오타이드 확인
D1 내지 D9의 올리고뉴클레오타이드를 HBV와 같이 간암 세포주에 감염시킨 후, 항바이러스 효과를 바이러스의 단백질(HBsAg 및 HBeAg) 생성 저해 및 복제 저해로 판단하였다.
구체적으로, HBV 1.2 플라스미드 및 올리고뉴클레오타이드(D1 내지 D9, 각각
SEQ ID NO: 1 내지 9)는 HepG2에 트렌스펙션시켰다. 트렌스펙션시킨 후 3일 동안 세포와 상등액을 배양하였다. HBV 단백질 발현을 결정하기 위해, 분비된 HBeAg 및 HBsAg를 측정하였다. 배양 배지의 HBeAg 및 HBsAg는 HBeAg 및 HBsAg ELSIA 키트(Wantai Pharm Inc., Beijing, China)를 사용하여 분석하였다. HBV DNA는 써던 블랏으로 측정하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 것과 같이 D1, D2 및 D6가 항바이러스 효과를 보였다.
2-2: HBV RNA 발현 저해
상기 실시예 2-1에서 확인하였듯이, D2 올리고뉴클레오타이드의 항바이러스 효능이 D1, D2 및 D6 올리고뉴클레오타이드 중에서 가장 우수한 D2 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 HBV RNA 발현 저해 실험을 수행하였다. 구체적으로, D2 올리고뉴클레오타이드에 의해 어떤 단계의 HBV 라이프 사이클이 저해되는지 확인하기 위해, Huh7 세포들에 HBV 1.2 mer를 감염시킨 후 HBV mRNA 레벨을 노던 블랏으로 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 것과 같이 D2 올리고뉴클레오타이드는 용량 의존적 방법으로 HBV RNAs를 억제시키는 것을 확인하였다. 따라서 D2 올리고뉴클레오타이드가 HBV RNA 발현 또한 저해함을 확인함으로써 D2 올리고뉴클레오타이드가 바이러스의 RNA 전사단계에 작용하여 저해함을 확인하였다.
2-3: HBV 단백질 발현 저해 확인
D2 올리고뉴클레오타이드의 HBV 단백질 발현을 저해하는지 확인하기 위해, Huh7 세포들에 HBV 1.2mer와 D2 올리고뉴클레오타이드를 트렌스펙션시킨 후에 웨스턴 블랏 분석으로 표면 단백질 발현 레벨을 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 것과 같이 D2 올리고뉴클레오타이드가 HBV의 단백질 중 하나인 표면 단백질들의 발현을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다.
2-4: HBV의 인핸서/프로모터(enhancer/promoter) 활성 저해
D2 올리고뉴클레오타이드가 HBV mRNA 레벨을 어떻게 감소시키는지 알아보기 위해, HBV 인핸서를 이용하여 루시퍼라아제 리포터 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 5(a) 및 (b)에 나타난 것과 같이 D2 올리고뉴클레오타이드 감염에 의해 HBV 인핸서 I, II 활성은 약 80%가 저해됨을 확인하였다. 이러한 사실을 통해 D2 올리고뉴클레오타이드는 인핸서 I 및 II 활성을 모두 억제함을 확인하였다. 그러나 인핸서 I(EnhI), pEnhI△Xp의 상위 부위에서는 효과가 나타나지 않았다. D2 올리고뉴클레오타이드 감염에 의해 HBV 인핸서 II(EnhII) 는 약 48% 저해되는 것을 확인하였다. 이러한 사실을 통해 HBV 인핸서 II의 1742 위치에 G가 풍부한 부위(1742부터 1747까지의 영역)가 D2 올리고뉴클레오타이드에 의한 인핸서 활성 억제에 중요한 것임을 확인하였다.
결과적으로 도 5의 결과를 통해, D2 올리고뉴클레오타이드가 인핸서 I과 II의 활성을 줄임으로써 전사단계에서 항바이러스 효과를 낸다는 사실을 확인하였다.
D2 올리고뉴클레오타이드가 어떻게 HBV 인핸서 활성을 감소시키는지 알아보기 위해, 앞서 언급한 리포터 플라스미드를 제작한 후에 리포터 활성을 측정하였다. 도 6(a)와 같이, 표 2의 D2, D6, D7 및 D8-염기 G가 풍부한 HBV 모티프가 리포터 플라스미드 프로모터 영역에 도입되었다.
그 결과, 도 6(b)에 나타난 것과 같이, pEnhI△Xp 루시퍼라아제 클론은 아무 효과가 없었으나, D2 또는 D6 모티프를 포함한 pEnhI△Xp 루시퍼라아제 클론은 루시퍼라아제 활성을 강하게 저해하는 것을 확인하였다.
따라서 D2 올리고뉴클레오타이드가 인핸서 I(EnhI) 앞부분인 pEnhI△Xp reporter에는 전혀 작용을 하지 못하지만, 여기에 자신과 동일한 염기서열을 넣어서 만들면 강력하게 저해 효과를 발휘하는 것을 확인하였고, D2 올리고뉴클레오타이드와 유사한 염기서열을 가진 D6 올리고뉴클레오타이드를 넣은 리포터도 저해하는 것을 확인하였다. 이는 D2 올리고뉴클레오타이드가 자신의 염기서열을 인지하여 저해 작용함을 나타내는 결과이다.
실시예3: G-quadruplex 구조 형성
3-1: D2 올리고뉴클레오타이드가 HBV 인핸서 I, II 부위를 인지하여 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 형성
D2 올리고뉴클레오타이드가 인핸서 I, II 서열과 구아닌-사중합체를 형성하는지 확인하기 위해, D2 올리고뉴클레오타이드 및 P32-표지 HBV 인핸서 서열을 이용하여, in vitro EMSA(electrophoretic mobility shift assay)를 수행하였다(도 7(a)).
그 결과, EMSA를 통해 D2 올리고뉴클레오타이드가 인핸서 I, II 서열과 부분적으로 구아닌-사중합체를 형성함을 확인하였다. 도 7(b)에 나타난 것과 같이, 구아닌-사중합체의 형성은 구아닌-사중합체 특이적 BG4 항체를 사용하여 밴드 수퍼 시프트를 통해 확인하였다. 이는 포스포르이미징(phosphorimaging)으로 겔을 시각화한 결과이다. 즉, 도 7을 통해 D2 올리고뉴클레오타이드가 HBV 인핸서 부위와 물리적으로 결합하여 구아닌-사중합체를 형성함으로써 HBV 인핸서 활성을 저해함을 확인하였다.
3-2: D2 올리고뉴클레오타이드가 HBV 인핸서 II 영역과 구아닌-사중합체 형성
D2 올리고뉴클레오타이드가 인핸서 II 영역과 구아닌-사중합체를 형성하는지 확인하기 위해, D2 및 HBV를 이용하여 in vitro EMSA를 수행하였다.
그 결과, EMSA를 통해 D2 올리고뉴클레오타이드가 인핸서 II 서열과 부분적으로 구아닌-사중합체를 형성함을 확인하였다. 구아닌-사중합체의 형성은 구아닌-사중합체 특이적 BG4 항체를 사용하여 밴드 수퍼 시프트를 통해 확인하였다. 도 8을 통해, D2 올리고뉴클레오타이드가 HBV 인핸서 II 영역을 통해서 구아닌-사중합체 구조를 형성함을 확인하였다.
3-3: D2 올리고뉴클레오타이드가 자신의 염기서열을 가진 부위와 완전한 G-quadruplex 구조 형성
D2 올리고뉴클레오타이드가 자신의 서열을 통해 HBV 게놈과 완전한 구아닌-사중합체를 형성하는지 확인하기 위해, in vitro EMSA를 수행하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 EMSA를 통해 D2 올리고뉴클레오타이드가 자신의 서열을 통해 HBV 게놈과 완전한 구아닌-사중합체를 형성함을 확인하였다. 구아닌-사중합체의 형성은 구아닌-사중합체 특이적 BG4 항체를 사용하여 밴드 수퍼 시프트를 통해 확인하였고, 겔은 포스포르이미징으로 시각화하였다.
도 9에 의하면 D2 올리고뉴클레오타이드가 인핸서 I 부위(EnhI△Xp)와는 결합하지 않지만, 여기에 자신의 염기서열을 넣은 것(EnhI△Xp-D2)과는 완전한 구아닌-사중합체 구조를 형성하였다. 이는 D2 올리고뉴클레오타이드가 자신의 염기서열을 인지하여 구아닌-사중합체 구조를 형성하고 이것이 바이러스의 저해와 관련 있음을 의미한다.
3-4: D2 올리고뉴클레오타이드의 염기서열에서 점돌연변이를 도입한 D3 올리고뉴클레오타이드는 구아닌-사중합체 구조를 형성하지 못함
도 10에 나타난 바와 같이, In vitro EMSA를 통해 D2 올리고뉴클레오타이드의 염기서열에서 점돌연변이를 도입한 D3 올리고뉴클레오타이드는 구아닌-사중합체 구조를 형성하지 못함을 확인하였다. 구체적으로, D2 올리고뉴클레오타이드 서열의 중간 부위의 보전적인 GGGGGG를 GGGTGG로 점 돌연변이시킨 D3 올리고뉴클레오타이드는, HBV 게놈과 구아닌-사중합체를 형성하지 못했다. 이 결과를 통해, D2 올리고뉴클레오타이드의 G-풍부 부위가 구아닌-사중합체 형성에 매우 중요함을 알 수 있다.
또한 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, D3 올리고뉴클레오타이드는 전혀 바이러스 저해작용을 나타내지 못하는데, 도 10에 나타난 EMSA 결과인 D3 올리고뉴클레오타이드의 구아닌-사중합체 구조 미형성 결과와 함께 보면, 구아닌-사중합체 구조의 형성이 항바이러스 작용의 필요 조건임을 알 수 있다.
실시예 4: HBV 활성 저해
4-1: 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드가 세포를 투과하여 HBV 인핸서 활성을
저해함
HBV 인핸서 I.II 플라스미드를 HepG2 세포들로 트렌스펙션시켰다. 트렌스펙션 전에, 다수의 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드(PS, OPMe, PNA, LNA PS-OMe, PS-LNA)를 HepG2 세포(500nM 최종 농도)로 전처리하였다. 그 다음날, 세포들을 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드 500nM을 포함하는 새로운 배지(DMEM)로 바꾸어주었다. 트렌스펙션 후 24시간 동안 세포를 배양하였고, Steady Glo-Luciferase system을 이용하여 루시퍼라아제 활성을 분석하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 PS 변형에 따라 세포 투과와 HBV 저해 활성이 우수함을 확인하였다. 상기 결과에 따르면, PS(phosphorothioate) 또는 LNA(locked nucleic acids)로 올리고뉴클레오타이드의 백본 골격을 변형시키는 것은 올리고뉴클레오타이드의 투과성을 향상시키고, 결과적으로 그 올리고뉴클레오타이드의 항바이러스 효과를 증가시킨다.
4-2: 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드가 HBV 감염 모델에서 HBV를 저해함
HBV 감염 모델에서도 D2 올리고뉴클레오타이드가 저해 효과를 나타내는지 보기 위해 HBV 감염이 가능한 세포주인 HepG2-NTCP 세포주에 HBV를 감염시킨 후, PS로 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드(PS, PS-OMe, PS-LNA)를 처리하여 진행하였다. 구체적으로, 도 12(a)의 HepG2-NTCP 세포의 HBV 감염과 바이럴 단백질 분석 과정을 모식도에 나타낸 것과 같이 실험과정은 다음과 같다:
HepG2-NTCP 세포는, 2% DMSO와 4% PEG8000를 함유한 PMM(PHH maintain media, Gibco)에서 16~20시간 동안 배양된 2000 HBV genome equivalent per cell(Geq/cell)로 감염시켰다. 그 다음, 세포는 PBS 500ul로 세 번 세척하고, PMM(2% DMSO)에 유지시켰으며, 감염 후 7일 동안 배양시켰다. HBV 단백질 발현을 분석하기 위해, 분비된 HBeAg 및 HBsAg를 측정하였다. 배양 배지 내의 HBeAg 및 HBsAg는 HBeAg 및 HBsAg ELISA 키트(Wantai Pharm Inc, Beijing, China)를 이용하여 분석하였다. D2 올리고뉴클레오타이드의 트렌스펙션(transfection)(D2, T.F)를 항-HBV 효과의 양성 대조군으로 사용하였다. 변형되지 않은 D2 올리고뉴클레오타이드 처리(D2 Tr)은 음성 대조군으로 사용하였다. LMV는 lamivudine이다.
HBV 단백질 발현 분석결과, 도 12(b) 및(c)에 나타난 바와 같이 PS로 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드(PS, PS-OMe, PS-LNA)가 HBV 감염이 가능한 세포주인 HepG2-NTCP에서도 HBV를 저해함을 확인하여, 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드를 처리하였을 때 항바이러스 효과를 확인하였다.
4-3: 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드가 PHH (primary human hepatocyte)에서 HBV를 저해함
PS로 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드가 PHH(primary human hepatocyte)에서 HBV를 저해함을 확인하기 위해, 간 수술 후 남은 사람의 간 조직으로부터 PHH를 분리 후 여기에 HBV를 감염시킨 후 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드의 항바이러스 효과를 조사하였다. 구체적으로, 도 13(a)의 PHHs의 HBV 감염과 바이럴 단백질 분석 과정을 모식도에 나타낸 것과 같이 실험과정은 다음과 같다:
PHHs는 2% DMSO 와 4% PEG8000를 함유한 PMM (PHH maintain media, Gibco)에서 16~20시간 동안 배양된 5000 HBV genome equivalent per cell(Geq/cell)로 감염시켰다. 그 다음, 세포는 PBS 500ul로 세 번 세척하고, PMM(2% DMSO)에 유지시켰으며, 감염 후 7일 동안 배양시켰다. HBV 단백질 발현을 분석하기 위해, 분비된 HBeAg 및 HBsAg를 측정하였다. 배양 배지 내의 HBeAg 및 HBsAg는 HBeAg 및 HBsAg ELISA 키트(Wantai Pharm Inc, Beijing, China)를 이용하여 분석하였다. 변형되지 않은 D2는 음성 대조군으로 사용하였다. LMV는 lamivudine이다.
HBV 단백질 발현 분석 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드는 항바이러스 효과가 우수하였고, 특히 PS-LNA로 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드가 90% 이상 바이러스를 저해하는 결과를 보임으로써 가장 강력한 저해 효과를 나타내었다. 이러한 결과를 통해, 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드를 인간 세포에 처리하였을 때도 항바이러스 효과가 나타남을 확인하였다.
4-4: D2 올리고뉴클레오타이드의 분석
가장 최적의 효과를 나타내는 변형 형태를 찾기 위해 D2 올리고뉴클레오타이드의 말단을 3개씩 (3,3), 4개씩 (4,4), 또는 5개씩 (5,5)을 변형하였다. 분석을 위해, HBV 인핸서 I.II 플라즈미드를 HepG2 세포에 트렌스펙션시켰다. 트렌스펙션 후에, 다수의 변형된 D2(PS, PS-Ome(4,4), PS-Ome(5,5), PS-Ome(all), PS-LNA(2,2), PS-LNA(3,3), PS-LNA(4,4), PS-LNA(5,5), PS-LNA(all))를 HepG2 세포(500nM 최종 농도)로 전처리하였다. 그 다음 날, 세포들을 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드 500nM을 포함하는 새로운 배지(DMEM)로 바꾸어주었다. 트렌스펙션 2일 후에, luciferase assay system(Promega; madison, WI)을 이용하여 프로토콜에 따라 HBV 인핸서 루시퍼라아제 활성을 분석하였다. [339] 그 결과 도 14에 나타난 것과 같이, 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드들은 우수한 항바이러스 효과를 나타내었다. 그 중, 5' 말단과 3' 말단이 모두 4개의 LNA로 변형된 PS-LNA(4,4)가 가장 강력한 항바이러스 효과를 보여주었다.
4-5: HepG2 세포에서 변형된 올리고뉴클레오타이드의 항바이러스 효과 확인
4-5-1: 1-8-2에서 제작한 변형된 올리고뉴클레오타이드의 항바이러스 효과
1-8-2에서 제작한 올리고뉴클레오타이드를 HepG2 세포에 HBV와 함께 트렌스펙션하였다. 58개의 올리고뉴클레오타이드는 50nM의 농도로 사용하였고, HBV 1ug과 함께 2ml의 media에 넣어서 트렌스펙션시켰다. 그 다음날, media를 새로운 배지(DMEM)으로 바꾸어 준 후, 72시간동안 세포를 배양하였다. 이후 배양 배지 내의 HBeAg 및 HBsAg를 HBeAg 및 HBsAg ELISA 키트(Wantai Pharm Inc., Beijing, China)를 이용하여 분석하였다. HBeAg에 대한 결과를 도 15에, HBsAg에 대한 결과를 도 16에 나타내었다.
그 결과, 도 15에 나타난 것과 같이, 다수의 올리고뉴클레오타이드가 HBeAg를 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 HepG2 세포에서 HBeAg을 효과적으로 줄인 물질은 9, 17, 18, 20, 21, 34, 37, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 50, 51, 54, 55, (3,3),(4,4)로 나타났다.
또한, 도 16에서는 다수의 올리고뉴클레오타이드가 HBsAg를 저해하는 것을
확인할 수 있었다. 특히 HepG2 세포에서 HBsAg을 효과적으로 줄인 물질은 9, 10, 18, 20, 21, 24, 28, 34, 37, 40, 41, 44, 48, (3,3)로 나타났다.
4-5-2: 올리고뉴클레오타이드 (3,3) 및 63의 항바이러스 효과
상기 1-8-2에서 제작한 올리고뉴클레오티드 (3,3) 및 1-8-3에서 제작한 올리고뉴클레오티드 63의 HepG2 세포에서의 항바이러스 활성을 확인하였다.
구체적으로, HepG2 세포를 6 well plate에 seeding한 후, 다음날 1 μg의 pHBV-1.2 plasmid와 동일한 농도의 올리고뉴클레오티드를 lipofectamin2000 reagent를 이용하여 co-transfection(공동-감염) 시켰다. 3일 후, 세포와 media를 harvest하여 media 내의 HBsAg과 HBeAg의 수준을 ELISA를 통해 확인하였으며, cell 내의 rcDNA의 수준을 southern blot을 통해 검출하였다(도 34 참조).
그 결과, 올리고뉴클레오티드 (3,3) 및 올리고뉴클레오티드 63와 HBV의 공동 감염을 통해, HBsAg, HBeAg, 및 rcDNA의 수준을 감소시킬 수 있음을 확인하였다 (도 34).
4-5-3: 올리고뉴클레오타이드 (3,3) 및 63의 항바이러스 효과
상기 1-8-3에서 제작한 올리고뉴클레오티드 63의 HepG2 세포에서의 항바이러스 활성을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, HepG2 세포를 6 well plate에 seeding한 후, 다음날 해당 농도의 올리고뉴클레오티드 63을 media에 미리 첨가하고, 2시간 후, 1 μg의 pHBV-1.2 plasmid를 lipofectamin2000 reagent를 이용하여 감염시켰다. 3일 후, 세포와 media를 harvest하여 media 내의 HBsAg과 HBeAg의 수준을 ELISA를 통해 확인하였다(도 35 참조).
그 결과, 올리고뉴클레오티드 63의 전-처리(treatment)를 통해 HBsAg과 HBeAg의 수준을 감소시킴으로써, 항바이러스 활성을 나타낼 수 있음을 확인하였다 (도 35).
4-5-4: 다양한 올리고뉴클레오타이드의 항바이러스 효과
상기 1-8-2 및 1-8-3에서 제작한 올리고뉴클레오티드 8, 67, 15, 및 72의 HepG2 세포에서의 항바이러스 활성을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, HepG2 세포를 6 well plate에 seeding한 후, 다음날 해당 농도의 올리고뉴클레오티드 8, 67, 15, 및 72을 각각 media에 미리 첨가하고, 2시간 후, 1 μg의 pHBV-1.2 plasmid를 lipofectamin2000 reagent를 이용하여 감염시켰다. 3일 후, 세포와 media를 harvest하여 media 내의 HBsAg과 HBeAg의 수준을 ELISA를 통해 확인하였다(도 36 참조).
그 결과, 올리고뉴클레오티드 8, 67, 15, 및 72의 전-처리(treatment)를 통해 HBsAg과 HBeAg의 수준을 감소시킴으로써, 항바이러스 활성을 나타낼 수 있음을 확인하였다 (도 36).
4-6: HepG2-NTCP 세포에서의 변형된 올리고뉴클레오타이드 효과 확인
1-8-2에서 제작한 올리고뉴클레오타이드의 HBV 감염 모델에서의 효과를 확인하기 위해, 감염이 가능한 HepG2-NTCP 세포를 이용하였다. 구체적으로, HBV를 2% DMSO와 4% PEG8000를 함유한 PMM(PHH maintain media, Gibco)에서 16~20시간동안 배양된 2000 HBV genome equivalent per cell(Geq/cell)로 감염시켰다. 그 다음, 세포는 PBS 500ul로 세 번 세척하고, PMM(2% DMSO)에 유지시킨 후, 7일동안 배양하였다. 감염 후 3일 뒤부터 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드를 매일 처리하였다. 이때 처리 농도는 500nM이다. 감염 후 7일차가 되었을 때 분비된 HBeAg 및 HBsAg를 측정하여 HBV 단백질 발현을 분석하였다. 배양 배지 내 HBeAg 및 HBsAg는 HBeAg 및 HBsAg ELISA 키트를 이용하여 분석하였다. HBeAg에 대한 결과를 도 17에,
HBsAg에 대한 결과를 도 18에 나타내었다.
그 결과, 도 17에서 보는 것과 같이, 다수의 올리고뉴클레오타이드가 HBeAg을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 HepG2-NTCP 세포의 HBeAg를 효과적으로 줄인 물질은 8, 17, 18, 19, 20, 21, 27, 40, 44, 47, 55, (3,3), (4,4)로 나타났다. 또한, 도 18에서와 같이, HBsAg 역시 다수 올리고뉴클레오타이드에 의해 저해되는 것을 확인할 수 있었다. HepG2-NTCP 세포의 HBsAg를 효과적으로 줄인 물질은 7, 8, 9, 18, 19, 20, 40, 42, 44, 45, (3,3), (4,4)로 나타났다.
4-7: PHH(Primary human hepatocyte) 세포에서의 변형된 올리고뉴클레오타이드 효과 확인
실시예 1-8-2에서 제작한 올리고뉴클레오타이드가 PHH(Primary human hepatocyte)에서도 HBV를 저해할 수 있는지 확인하기 위해, 간 수술 후 남은 간 조직으로부터 PHH를 분리하여 HBV를 감염시키고, 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드의 항바이러스 효과를 확인하였다. 구체적으로, PHHs의 HBV 감염과 바이럴 단백질 분석 과정은 다음과 같다: HBV를 2% DMSO와 4% PEG8000를 함유한 PMM(PHH maintain media, Gibco)에서 16~20시간동안 배양된 2000 HBV genome equivalent per cell(Geq/cell)로 감염시켰다. 그 다음 HepG2-NTCP 세포와 마찬가지로 PHHs는 PBS 500ul로 세 번 세척하고, PMM(2% DMSO)에 유지시킨 후 11일 동안 배양하였다. 감염 후 5일 뒤부터 58개의 변형된 올리고뉴클레오타이드를 매일 처리하였고, 이때 처리농도는 500nM으로 하였다. 감염 후 11일차가 되었을 때, HBV 단백질 발현을 분석하기 위해 배양 배지 내 HBeAg 및 HBsAg를 측정하였다. HBeAg에 대한 결과를 도 19에, HBsAg에 대한 결과를 도 20에 나타내었다.
그 결과, 도 19에서 보는 것과 같이, 다수의 올리고뉴클레오타이드가 HBeAg을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 PHH 세포의 HBeAg를 효과적으로 줄인 물질은 7, 8, 18, 19, 20, 52, (3,3), (4,4)로 나타났다. 또한, 도 20에서와 같이, HBsAg 역시 다수 올리고뉴클레오타이드에 의해 저해되는 것을 확인할 수 있었다. PHH 세포의 HBsAg를 효과적으로 줄인 물질은 6, 7, 8, 15, 16, 18, 19, 42, (3,3), (4,4)로 나타났다.
HBV 단백질 발현 분석 결과, 각각의 결과에 나타난 것과 같이, 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드의 항바이러스 효과가 우수하였으며, 특히 다양한 형태의 gap mer 중 PS-LNA로 부분 변형된 D2가 가장 강력한 저해 효과를 보이는 것을 확인하였다. 특히 (3,3) 또는 (4,4)와 같이 G가 연속적으로 있는 부분이 변형되지 않은 경우에 HBeAg 및 HBsAg 저해 효과가 우수하였다. 이는 올리고뉴클레오타이드 합성에 필요한 단가를 낮출 수 있으며, 부분 또는 완전히 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드를 인간 세포에 처리하였을 때 항바이러스 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 5: in vivo 모델
5-1: D2 올리고뉴클레오타이드가 마우스 in vivo 모델에서 HBV를 저해함
D2 올리고뉴클레오타이드가 in vivo에서도 작용하는지를 보기 위해서 HBV 마우스 모델을 사용하여 실험하였다. 실험은 도 21(a)에 따라 수행하였다. 6주령 수컷 마우스들을 각 그룹으로 이용하였다. PBS를 대조군으로 주사하였다(Mock). hydrodynamic injection(HDI) 방법으로 주사된 DNA는 다음과 같다:
25ug HBV 1.2mer, 25ug의 공벡터(empty vector) 또는 D2 올리고뉴클레오타이드, 그리고 5ug의 b-gal. b-gal은 주사 대조군으로 사용하였다. 마우스들을 희생시켜서 혈액 샘플을 얻었다. 마우스 혈청은 PBS로 희석시켰다(HBeAg의 경우 1:50 및 HBsAg의 경우 1:2000). 바이럴 단백질(HBeAg 및 HBsAg)은 ELISA 키트로 측정하였다.
그 결과 도 21(b) 및 (c)에 나타난 것과 같이, D2 올리고뉴클레오타이드를 주사한 마우스에서 강력한 항바이러스 효과를 나타내었다. 또한 도 21(d)에 나타난 것과 같이, 써던 블랏을 이용하여 D2 올리고뉴클레오타이드를 주사한 마우스에서 HBV DNA가 매우 크게 줄어들어있음을 확인하였다.
5-2: 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드를 마우스 in vivo 모델에 정맥주사하였을 때 HBV를 저해함
5-2-1: PS, PS-OMe 및 PS-LNA의 HBV 저해 효과 확인
변형된 D2 올리고뉴클레오타이드를 주사하였을 때 in vivo에서도 작용하는지를 알아보기 위해 HBV 마우스 모델을 사용하여 실험하였다. in vivo 실험은 도 22(a)에 따라 수행하였다. 6주령 수컷 마우스들을 각 그룹으로 이용하였다. HBV만 HDI로 주사한 것을 대조군으로 하였다. 25ug의 HBV 1.2mer 및 5ug의 b-gal 플라스미드가 HDI 방법으로 주사되었다. 그 다음 50ug의 변형된 DNA(PS, PS-OMe 및 PS-LNA)를 3일 동안 정맥주사하였다. 주사 4일 후 마우스들을 희생시켜서 혈액 샘플을 얻었다. b-gal은 주사 대조군으로 사용하였다. 마우스 혈청은 PBS로 희석시켰다(HBeAg의 경우 1:50 및 HBsAg의 경우 1:2000). 바이럴 단백질(HBeAg 및 HBsAg)은 ELISA 키트로 측정하였다.
그 결과, 도 22(b) 및(c)에 나타난 것과 같이, 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드를 주사한 마우스에서 항바이러스 효과를 나타내었다. 도 22(d)에 나타난 것과 같이, 서던 블랏으로 확인하였을 때 HBV DNA 수준에서도 항바이러스 효과가 나타내었다. 이는 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드를 주사하였을 때 마우스의 간에 전달되어 바이러스 저해작용을 나타냄을 확인한 결과이다.
5-2-2: 올리고뉴클레오티드 63 및 65의 HBV 저해 효과 확인
상기 1-8-3에서 제조한 올리고뉴클레오티드 63 및 65의 HBV 저해 활성을 in vivo에서 확인하고자 다음과 같이 확인하였다.
6주령 C57BL6 수컷 마우스에 1x1011 copies의 rAAV_HBV 재조합 바이러스를 정맥주사(i.v.)를 통해 감염 시키고, 감염 2주 후부터 PLGA로 제제화한 올리고뉴클레오티드 63 및 65를 주 2회, 2 mg/kg 용량으로 정맥주사를 통해 투여하였다. 총 8회의 주사 후, 혈청(serum) 내 HBsAg의 수준을 ELISA로 검출하였다.
그 결과, PLGA로 제제화한 올리고뉴클레오티드 63에 의해 HBsAg의 수준이 의미 있게 감소하는 것을 확인하였다.
5-3: 나노입자(키토산)으로 D2 올리고뉴클레오타이드를 감싸준 후 마우스 in
vivo 모델에 정맥주사하였을 때 HBV를 저해함
나노입자(키토산)로 D2 올리고뉴클레오타이드를 감싸준 후 주사하였을 때 in
vivo에서도 작용하는지를 알아보기 위해 HBV 마우스 모델을 사용하여 실험하였다. 나노입자를 이용해 D2 올리고뉴클레오타이드를 감싸주게 되면 효율적으로 간에 전달된다. 도 23(a)에 따라 in vivo 실험을 수행하였다. 6주령 수컷 마우스들을 각 그룹으로 이용하였다. 25ug의 HBV 1.2mer 및 5ug의 b-gal 플라스미드가 hydrodynamic injection 방법으로 주사되었다. 그 다음 8ug의 나노입자 D2를 HBV에 감염시킨 뒤 1회 정맥주사하였다. 주사 4일 후 마우스들을 희생시켜서 혈액 샘플을 얻었다. b-gal은 주사 대조군으로 사용하였다. 마우스 혈청은 PBS로 희석시켰다(HBeAg의 경우 1:50 및 HBsAg의 경우 1:2000). 바이럴 단백질(HBeAg 및 HBsAg)은ELISA 키트로 측정하였다.
그 결과, 도 23(b) 및 (c)에 나타난 것과 같이, 나노입자 D2를 주사한 마우스에서 항바이러스 효과를 나타내었다. 이때 첫번째 막대는 mock, 두번째 막대는 HBV, 세번째 막대는 HBV와 키토산 나노입자 D2, 네번째 막대는 HBV와 키토산 나노입자 D4를 의미한다. 키토산 나노입자 D4는 HBV를 전혀 저해하지 못하는 음성 대조군으로 사용하였다. 도 23(d)에 나타난 것과 같이, 써던 블랏으로 확인하였을 때 HBV DNA 수준에서도 항바이러스 효과가 나타났다. 이는 키토산 나노입자 D2를 주사하였을 때 마우스의 간에 전달되어 매우 강력하게 바이러스 활성을 저해한 것임을 확인하였다.
실시예 6: PHH(primary human hepatocyte)에서의 HBV cccDNA 저해
6-1: 변형된 D2가 처음부터 처리되어 HBV를 저해함
D2 올리고뉴클레오타이드가 PHH에서 HBV cccDNA를 제거하는지를 보기 위해서 PHH에 HBV를 감염시켜 실험하였다. 본 실험은 HBV 감염 후 다음날부터 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드를 처리하였고, 이 방법은 도 24(a)는 PHH에 HBV를 감염시키는 절차에 대하여 모식화하였다. 이때, IFN-α는 양성 대조군으로 사용하였고, 변형되지 않은 일반 D2 올리고뉴클레오타이드를 처리하였을 경우는 HBV를 전혀 저해하지 못하므로 음성 대조군으로 사용하였다. 도 24(d)와 (E)는 real time PCR을 이용하여 정량적으로 수행하였다.
그 결과, 도 24(b)와 (c) 에서는 PS-LNA(3,3), PS-LNA(4,4), PS-LNA(all)로 부분 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드를 처리하였을 경우 HBeAg과 HBsAg이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 도 24(d)에서 나타나듯이 HBV rcDNA가 PS-LNA(3,3), PS-LNA(4,4), PS-LNA(all)로 부분 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드에서 효율적으로 감소함을 나타내었다. 중요한 결과로 HBV를 궁극적으로 치료하기 위해서는 cccDNA를 제거해야 하는데, 도 24(e)에서 나타난 것과 같이 HBV cccDNA가 PS-LNA(3,3), PS-LNA(4,4), PS-LNA(all)로 부분 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드가 처리되었을 때 감소됨을 알 수 있었다.
6-2: 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드가 cccDNA가 이미 충분히 생성되어 있는 경우에도 HBV를 저해함
HBV 감염 후 5일동안 충분히 cccDNA가 만들어지도록 한 감염 조건에서도 D2 올리고뉴클레오타이드가 PHH에서 HBV cccDNA를 제거하는지를 보기 위해서 실험을 수행하였다. 본 실험은 HBV 감염 후 5일 후부터 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드(PS-LNA(all) 0.5uM, PS-LNA(all) 1uM)를 처리하였고, 이 방법은 도 25(a)는 PHH에 HBV를 감염시키는 절차에 대하여 모식화하였다. 이때 IFN-α는 HBeAg, HBsAg, rcDNA, cccDNA를 감소시키는 양성 대조군으로 사용하였고, 변형되지 않은 일반 D2 올리고뉴클레오타이드를 처리하였을 경우는 HBV를 전혀 저해하지 못하므로 음성 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 도 25(b) 와 (c)에서는 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드를 농도 별로 처리하였을 경우 HBeAg과 HBsAg이 감소하는 것을 알 수 있었다. 도 25(d)는 일반 PCR을 수행 후 DNA 전기영동으로 HBV DNA 및 cccDNA의 양 차이를 확인하였다. 또한 도 25(d)에서 나타나듯이 HBV rcDNA와 cccDNA가 부분 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드에서 농도 의존적으로 감소함을 나타내었다.
실시예 7: HepG2-NTCP에서 D2 올리고뉴클레오타이드와 HBV cccDNA가 형성하는 G-quadrueplex 확인
PS-LNA로 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드가 HepG2-NTCP에서 HBV cccDNA를 효율적으로 인식하고 G-quadruplex를 형성하는지를 알아보기 위해서, NTCP에 HBV를 감염시키고 D2 올리고뉴클레오타이드를 처리하여 현미경을 이용해 보았다. 본 실험은 HBV 감염 후 5일차부터 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드를 처리하였고, 7일차에 세포를 고정시켰다. 이후 BG4 antibody를 이용해 G-quadruplex를 볼 수 있도록 red signal이 나오도록 슬라이드 글라스를 제작하였다.
그 결과, 도 26(a)는 NTCP에서 감염되어 생성된 HBV cccDNA와 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드를 처리하였을때, G-quadruplex를 인식하는 BG4 항체에 의해 D2 올리고뉴클레오타이드와 cccDNA가 구아닌-사중합체를 형성하는 것을 확인하였다. 또한 HBeAg level이 HBV에서는 정상적으로 발현하고, 변형된 D2를 처리하였을 경우 감소하는 결과를 확인함으로써 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드에 의한 항바이러스 효과도 같이 검정할 수 있었다. 도 26(b)에 정리된 그래프 및 도 26(a)의 하단에 정리한 BG4에 의한 foci 개수를 보았을때 Mock의 경우는 일반적인 세포의 조건에서 약 5개의 endogenus한 형태의 구아닌-사중합체 signal이 확인되었다. 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드만 처리하였을 경우 약 6개의 signal이 확인되었다. HBV만 감염된 경우 약 7개의 signal이 확인되었다. 무엇보다도, HBV와 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드를 처리하였을 때 약 16개의 signal이 확인되었다. 이 결과는 HBV cccDNA가 변형된 D2 올리고뉴클레오타이드에 의해 구아닌-사중합체를 형성함을 나타내는 결과이다.
실시예 8: D2 올리고뉴클레오타이드의 HBV pan-genotype에 대한 저해 효과 확인
변형되지 않은 D2 올리고뉴클레오타이드를 서로 다른 genotype의 HBV에 트랜스팩션하고, 각각에서 HBeAg 및 HBsAg의 발현 수준을 측정하여 D2 올리고뉴클레오타이드가 pan-genotype HBV 저해 효과가 있는지 확인하였다.
그 결과, D2 올리고뉴클레오타이드는 HBV Genotype A, C 및 D에서 HBeAg 및 HBsAg의 발현 수준을 현저히 감소시켰으며(도 32a, 32b 및 32c), AAV 벡터를 사용하여 트랜스팩션한 실험에서도 HBV Genotype A, B 및 C에서 HBeAg 및 HBsAg의 발현 수준을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다(도 33a, 33b 및 33c). 이는 본 발명의 변형되지 않은 D2 올리고뉴클레오타이드가 HBV의 genotype과 무관하게 동일하거나 상응하는 저해 효과가 있음을 나타내는 결과이다.
실시예 9: D2 올리고뉴클레오타이드의 핵산 서열 변화에 따른 효과
D2 올리고뉴클레오타이드의 핵산 서열 변화에 따른 항바이러스 효과를 바이러스의 단백질(HBsAg 및 HBeAg) 생성 저해 여부로 확인하였다. 구체적인 실험 재료 및 방법은 상기 실시예 2 또는 4에 기재된 것과 동일하게 수행하였다. 본 실시예에서 핵산 서열의 길이를 달리하거나, 다른 genotype의 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열로 일부 치환시킨 D2 올리고뉴클레오타이드는 하기 표 8 및 표 9에 나타내었다. 하기 표 8에 나타낸 올리고뉴클레오타이드는 D2를 제외하고 순서대로 SEQ ID NO: 78 내지 SEQ ID NO: 89로 나타내었고, 하기 표 9에 나타낸 올리고뉴클레오타이드는 D2를 제외하고 순서대로 SEQ ID NO: 90 내지 SEQ ID NO: 93으로 나타내었다.
그 결과, 도 27 및 도 28로부터 알 수 있듯이, D2 올리고뉴클레오타이드의 경우 (G)6 서열을 중심으로 5' 또는 3' 말단으로부터 핵산 서열의 길이가 줄어들 경우 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 수준이 감소하나, 여전히 유의한 수준의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 효과를 나타냄을 확인하였다. 또한, 도 29로부터 알 수 있듯이, D2 올리고뉴클레오타이드를 포함하며 (G)6 서열을 중심으로 5' 또는 3' 말단에 핵산 서열이 추가된 올리고뉴클레오타이드의 경우, D2 올리고뉴클레오타이드와 동등하거나 유사한 수준의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 효과를 나타냄을 확인하였다. 아울러, 도 30으로부터 알 수 있듯이, D2 올리고뉴클레오타이드의 (G)6 서열 중 하나를 C로 치환한 경우 및 (G)6 서열 이외의 핵산 서열을 다른 genotype의 B형 간염 바이러스 유래의 서열로 일부 치환한 경우에도 HBbeAg 및 HBsAg의 생성 저해 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 서열에 따른 항바이러스 효과 경향을 보기위한 것으로써 개별적인 항바이러스 효과의 정도는 트렌스펙션하는 올리고뉴클레오타이드의 양에 의해 조절 될 수 있다.
즉, 이는 D2 올리고뉴클레오타이드의 HBeAg 및 HBbsAg의 생성 저해에 최적화된 최소 길이는 바람직하게는 16mer이며, 그 길이가 일정 수준 줄어들거나 늘어난 경우 및 서열 일부를 다른 염기로 치환한 경우에도, B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열이라면 우수한 항 바이러스 효과가 있음을 나타내는 결과이다.
실시예 10: D6 올리고뉴클레오타이드의 핵산 서열 변화에 따른 효과
D6 올리고뉴클레오타이드의 핵산 서열 변화에 따른 항바이러스 효과를 바이러스의 단백질(HBsAg 및 HBeAg) 생성 저해 여부로 확인하였다. 구체적인 실험 재료 및 방법은 상기 실시예 2 또는 4에 기재된 것과 동일하게 수행하였다. 본 실시예에서 핵산 서열의 길이를 달리하거나 다른 genotype의 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열로 일부 치환된 D6 올리고뉴클레오타이드는 하기 표 8에 나타내었다. 하기 표 10에 나타낸 올리고뉴클레오타이드는 D6을 제외하고 순서대로 SEQ ID NO: 94 내지 103으로 나타내었다.
그 결과, 아래 도 31로부터 알 수 있듯이, D6 올리고뉴클레오타이드의 (G)5 서열을 중심으로 5' 또는 3' 말단으로부터 핵산 서열의 길이가 일부 줄어들거나 추가된 경우; 및 (G)5 서열 이외의 핵산 서열을 다른 genotype의 B형 간염 바이러스 유래의 서열로 일부 치환한 경우 모두 유의한 수준의 HBeAg 및 HBsAg의 생성 저해 효과가 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 서열에 따른 항바이러스 효과 경향을 보기위한 것으로써 개별적인 항바이러스 효과의 정도는 트렌스펙션하는 올리고뉴클레오타이드의 양에 의해 조절 될 수 있다.
즉, 이는 D6 올리고뉴클레오타이드의 길이가 일정 수준 줄어들거나 늘어난 경우 및 서열 일부를 다른 염기로 치환한 경우에도, B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열이라면 우수한 항 바이러스 효과가 있음을 나타내는 결과이다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> AM SCIENCE Inc.
<120> Composition For Preventing Or Treating Hepatitis B
<130> KPA180427-KR-P1
<150> KR 10-2018-0067650
<151> 2018-06-12
<160> 127
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 1
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> D3
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<213> Artificial Sequence
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<223> D4
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> D8
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D9
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> RC DNA primer_R
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<213> Artificial sequence
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<223> hybridization probe with cccDNA prime_F
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> hybridization probe with cccDNA primer_R
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<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> hybridization probe with RC DNA primer_F
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cactcaccaa cctcctgtcc tccaa 25
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> hybridization probe with RC DNA primer_R
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tgtcctggtt atcgctggat gtgtct 26
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> enhancer I
<400> 18
aaattgcctg taaatagacc tattgattgg aaagtatgtc aaagaattgt gggtcttttg 60
ggctttgctg ccccttttac acaatgtggc tatcctgctt tgatgccttt atatgcatgt 120
atacaatcta agcaggcttt cactttctcg ccaacttaca aggcctttct gtgtaaacaa 180
tatctgcacc tttaccccgt tgcccggcaa cggtcaggtc tctgccaagt gtttgctgac 240
gcaaccccca ctggatgggg cttggccatt ggccatcggc gcatgcgtgg aacctttgtg 300
gctcctctgc cgatccatac cgcggaactc ctagcggctt gttttgctcg cagccggtct 360
ggagcgaaac ttatcgggac tgacaactct gttgtcct 398
<210> 19
<211> 212
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> enhancer II
<400> 19
cgcttcacct ctgcacgtcg catggagacc accgtgaacg cccaccaggt cttgcccaag 60
gtcttacata agaggactct tggactctca gcaatgtcaa cgaccgacct tgaggcatac 120
ttcaaagact gtttgtttaa agactgggag gagttggggg aggagattag gttaaaggtc 180
tttgtattag gaggctgtag gcataaattg gt 212
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo modification#1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a 2'OMe thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a 2'OMe cytidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 20
tgctgggggg aattga 16
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a 2'OMe thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a 2'OMe cytidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(8)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> A represents a 2'OMe adenosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 21
tgctgggggg aattga 16
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a 2'OMe thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a 2'OMe cytidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> A represents a 2'OMe adenosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 22
tgctgggggg aattga 16
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#4
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a 2'OMe thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a 2'OMe cytidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> A represents a 2'OMe adenosin.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 23
tgctgggggg aattga 16
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#5
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a 2'OMe thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a 2'OMe cytidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 24
tgctgggggg aattga 16
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Oligo modification#6
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<222> (1)..(1)
<223> T represents a 2'OMe thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
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<220>
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<222> (3)..(3)
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<220>
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<222> (4)..(4)
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<220>
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<222> (5)..(10)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
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<222> (11)..(12)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid.
<220>
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<222> (13)..(14)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
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tgctgggggg aattga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Oligo modification#7
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<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid wherein phosphate
of T is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a 2'OMe cytidine.
<220>
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<222> (4)..(4)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
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<222> (5)..(10)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> A represents a 2'OMe adenosine.
<220>
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<222> (13)..(14)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
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<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid wherein phosphate
of A is modified as phosphorothioate.
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<213> Artificial sequence
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<223> Oligo modification#8
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<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid wherein phosphate
of T is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a cytidine of locked nucleic acid.
<220>
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<222> (4)..(4)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
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<222> (5)..(10)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
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<223> A represents a 2'OMe adenosine.
<220>
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<222> (12)..(12)
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<220>
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<222> (13)..(14)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid.
<220>
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<222> (15)..(15)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
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<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid wherein phosphate
of A is modified as phosphorothioate.
<400> 27
tgctgggggg aattga 16
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#9
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid wherein phosphate
of T is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a cytidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
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<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid wherein phosphate
of A is modified as phosphorothioate.
<400> 28
tgctgggggg aattga 16
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#10
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid wherein phosphate
of T is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a cytidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
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<222> (6)..(9)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
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<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> A represents a adenosine wherein phosphate of A is modified as
phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine wherein phosphate of A is modified as
phosphorothioate.
<400> 64
tgctgggggg aattga 16
<210> 65
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#16
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a 2'OMe thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a 2'OMe cytidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a 2'OMe thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid wherein phosphate
of A is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid wherein phosphate
of A is modified as phosphorothioate.
<400> 65
tgctgggggg aattga 16
<210> 66
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#47
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine wherein phosphate of T is modified as
phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a thymidine wherein phosphate of T is modified as
phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> A represents a 2'OMe adenosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is modified
as phosphorothioate.
<400> 66
tgctgggggg aattga 16
<210> 67
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#48
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine wherein phosphate of T is modified as
phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a thymidine wherein phosphate of T is modified as
phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
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of A is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid wherein phosphate
of A is modified as phosphorothioate.
<400> 67
tgctgggggg aattga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid wherein phosphate
of T is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid wherein phosphate
of T is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> A represents a adenosine wherein phosphate of A is modified as
phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine wherein phosphate of A is modified as
phosphorothioate.
<400> 68
tgctgggggg aattga 16
<210> 69
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#50
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid wherein phosphate
of T is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a cytidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid wherein phosphate
of T is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is modified
as phosphorothioate.
<400> 69
tgctgggggg aattga 16
<210> 70
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#51
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid wherein phosphate
of G is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(9)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid wherein phosphate
of G is modified as phosphorothioate.
<400> 70
tgctgggggg aattga 16
<210> 71
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#52
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a 2'OMe cytidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> u represents a 2'OMe uridine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> u represents a 2'OMe uridine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is modified
as phosphorothioate.
<400> 71
ugcugggggg aauuga 16
<210> 72
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#53
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid wherein phosphate
of A is modified as phosphorothioate.
<400> 72
ugcugggggg aauuga 16
<210> 73
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#54
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> u represents a uridine of locked nucleic acid wherein phosphate
of u is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> u represents a 2'OMe uridine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> A represents a 2'OMe adenosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> u represents a uridine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> u represents a 2'OMe uridine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid wherein phosphate
of A is modified as phosphorothioate.
<400> 73
ugcugggggg aauuga 16
<210> 74
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#55
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> u represents a uridine of locked nucleic acid wherein phosphate
of u is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> u represents a uridine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid wherein phosphate
of A is modified as phosphorothioate.
<400> 74
ugcugggggg aauuga 16
<210> 75
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#56
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> u represents a 2'OMe uridine wherein phosphate of u is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a 2'OMe cytidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> u represents a 2'OMe uridine wherein phosphate of u is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> A represents a adenosine wherein phosphate of A is modified as
phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine wherein phosphate of A is modified as
phosphorothioate.
<400> 75
ugcugggggg aauuga 16
<210> 76
<211> 16
<212> DNA
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<220>
<223> Oligo modification#(3,3)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid wherein phosphate
of T is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a cytidine of locked nucleic acid wherein phosphate
of C is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid wherein phosphate
of T is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid wherein phosphate
of A is modified as phosphorothioate.
<400> 76
tgctgggggg aattga 16
<210> 77
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#(4,4)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid wherein phosphate
of T is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a cytidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid wherein phosphate
of T is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid wherein phosphate
of T is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid wherein phosphate
of A is modified as phosphorothioate.
<400> 77
tgctgggggg aattga 16
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<223> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 79
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 80
tggggggaat tga 13
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<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 81
ggggggaatt ga 12
<210> 82
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 82
tgctgggggg aattg 15
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<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 83
tgctgggggg aatt 14
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 84
tctttgctgg ggggaattga tgac 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 85
ctttgctggg gggaattgat ga 22
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 86
tttgctgggg ggaattgatg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 87
ttgctggggg gaattgat 18
<210> 88
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 88
caattctttg ctggggggaa ttga 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 89
tgctgggggg aattgatgac tcta 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 90
tgctcggggg aattga 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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tgctgggggc aattga 16
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<212> DNA
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<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 92
tgctgggggg agttga 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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tgctgggggg aactaa 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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ttctaggggg aac 13
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> Artificial Sequence
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ttctaggggg aactaccacg tg 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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ttctaggggg aactaccacg tgt 23
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 98
attttctagg gggaactac 19
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 99
tcaattttct agggggaact ac 22
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 100
ctcaattttc tagggggaac tac 23
<210> 101
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 101
ctcaattttc tagggggaac taccacgtgt 30
<210> 102
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 102
ttctaggggg atctac 16
<210> 103
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 103
ttctaggggg agcacc 16
<210> 104
<211> 3221
<212> DNA
<400> 104
ttccacagct ttccaccaag ctctgcaaga tcccagagtc aggggcctgt attttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cactcaaccc tgttccaact attgcctctc acatctcgtc 120
aatctcctcg aggattgggg accctgcacc gaacatggag aacatcacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
gcagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcctgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttattgg ttcttctgga ttatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcaacaacaa ccagcacggg accctgcaaa acctgcacga ctcctgctca 540
aggcaactct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct acggatggaa attgcacctg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagctatat ggatgatgtg gtactggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt ataccgctgt taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
aacaaaacaa agagatgggg ttattccctg aatttcatgg gttatgtaat tggaagttgg 900
ggtacattgc cacaggatca tattgtacaa aaaatcaaac actgttttag aaaacttcct 960
gttaatcgac ctattgattg gaaagtatgt cagagacttg taggtctttt aggctttgcc 1020
gctccattta cacaatgtgg ttaccctgca ttaatgcctt tgtatgcatg tatacaagcg 1080
aaacaggctt ttactttctc gccaacttac aaggcctttc taagtaaaca gtatatgaac 1140
ctttaccccg ttgcccggca acggcctggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggctggg gcttggccat cggccatcag cgcatgcgtg aaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcagaact cctagccgct tgttttgctc gcagccggtc tggagcaaaa 1320
ctcatcggga ctgacaattc tgtcgtcctt tctcagaaat atacatcctt tccatagctg 1380
ctaggttgta ctgccaacta gattcttcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctcgcgaggc cgcttgggac tgtatcgtcc ccttctccgt 1500
ctgccgtacc gtccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggtccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgttgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca tcaggtcctg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctctcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcctacttca aagactgtgt gtttaaagac tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tattaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gcgcaccatt atcatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcttgta catgtcccac 1860
ttttcaagcc tccaagctgt gccttggatg gctttggggc atggacattg acccttataa 1920
agaatttgga gctactgtgg agttactctc atttttgcct tctgacttct ttccttccgt 1980
ccgggatcta ctagatacag cctcagctct atatcgggaa gccttagagt ctcctgagca 2040
ttgctcacct caccatacag cactcaggca agccattctc tgctggggga aattaatgac 2100
tctagctacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca tccagggatc tagtagtcaa 2160
ttatgttaat actaacatgg gcctaaagat caggcaatta ttgtggtttc atatttcttg 2220
ccttactttt ggaagagaaa ctgtccttga gtatttggtc tctttcggag tgtggattcg 2280
cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgagacc gaggcaggtc ccctagaaga agaactccct cgcctcgcag 2400
acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct cgggaatctc aatgttagta 2460
ttccttggac tcataaggtg ggaaatttta ctgggcttta ttcttctact gtccctatct 2520
ttaatcctga atggcaaaca ccttcttttc ctaaaattca tttacatgaa gacattgcta 2580
ataggtgtca gcaatttgta ggccctctca ctgtaaatga aaaaagaaga ctgaaattaa 2640
ttatgcctgc taggttttat cctaacagca caaaatattt gcccttagac aaagggatta 2700
aaacttatta tcctgatcat gtagttaatc attactttca aacccgacat tatttacata 2760
ctctttggaa ggctgggatt ctatataaga gggaaactac acgtagcgcc tcattttgcg 2820
ggtcaccata ttcttgggaa caagagctac atcatgggag gttggtcatc aaaacctcgc 2880
aaaggcatgg ggacgaacct ttctgttccc aaccctctgg gattctttcc cgatcatcag 2940
ttggaccctg cattcggagc caattcaaac aatccagatt gggacttcaa ccccatcaag 3000
gaccactggc cacaagccaa ccaggtagga gtgggagcat ttgggccagg gttcactccc 3060
ccacacggag gtgttttggg gtggagccct caggctcagg gcatattggc caccgtgcca 3120
gcgatgcctc ctcctgcctc caccaatcgg cagtcaggaa ggcagcctac tcccatctct 3180
ccacctctaa gagacagtca tcctcaggcc atgcagtgga a 3221
<210> 105
<211> 3215
<212> DNA
<400> 105
ctccaccact ttccaccaaa ctcttcaaga tcccagagtc agggctctgt actttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cagtaagccc tgctcagaat actgtctcag ccatatcgtc 120
aatcttatcg aagactgggg accctgtgcc gaacatggag aacatcgcat caggactcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaaaaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggaacac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc aaatctccag tcactcacca acctgttgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctctgca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcatcaacca ccagcacggg accatgcaag acctgcacaa ctcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct acggatggaa actgcacctg 600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtctggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt atgccgctgt tacccatttt cttttgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
aacaaaacaa aaagatgggg atattccctt aacttcatgg gatatgtaat tgggagttgg 900
ggcacttggc cacaggatca tattgtacaa aaaatcaaac tatgttttag aaaacttcct 960
gtaaacaggc ctattgattg gaaagtatgt caacgaattg tgggtctttt ggggtttgct 1020
gcccctttta cgcaatgtgg atatcctgct ttaatgcctt tatatgcatg tatacaagca 1080
aaacaggcat ttactttctc gccaacttat aaggcctttc taagtaaaca gtatctgacc 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggcctggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggttggg gcttggccat aggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt gtctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagcaggtc tggagcgaaa 1320
ctcatcggga ctgacaattc tgtcgtgctc tcccgcaagt atacatcgtt tccatggctg 1380
ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctcccggggc cgcttggggc tctaccgccc gcttctccgt 1500
ctgccgtacc gtccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggactcccc gtctgtgcct 1560
tctcgtctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca ccggaacctg cccaaggtct tgcataagag gactcttgga ctttcagcaa 1680
tgtcaacaac cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt gtttaatgag tgggaggagc 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctagtc atctcttgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccttataa 1920
agaatttgga gctactgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccgtcggt 1980
gcgagacctc ctagataccg ccgctgctct gtatcgggaa gcattagaat ctcctgaaca 2040
ttgctcacct caccacacag cactaaggca agctattctg tgctgggggg aattaatgac 2100
tctagctacc tgggtgggta ataatttaga agatccagca tccagggatc tagtagtcaa 2160
ttatgttaac actaacatgg gcctaaagat caggcaatta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga atacttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctcct gcctacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatca ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtatacctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttacggggc tctattcttc tacagtacct gtctttaatc 2520
ctgaatggca aactccttct tttccagaca ttcatttgca ggaggatatt attgatagat 2580
gtaagcaatt tgtgggaccc cttacagtaa atgaaaacag gagactaaaa ataataatgc 2640
ctgctagatt ttatcctaat gttaccaaat atttgccctt agataaaggg atcaaacctt 2700
attatccaga gcatgtagtt aatcattact tccagacaag acattatttg catactcttt 2760
ggaaggcggg tatcttatat aaaagagagt caacacatag cgcctcattt tgcgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagat ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgaaaaggc 2880
atggggacaa atctttctgt ccccaatccc ctgggattct tccccgatca tcagttggac 2940
cctgcattca aagccaactc agaaaatcca gattgggacc tcaacccaca caaggacaac 3000
tggccggacg ctcacaaggt gggagtggga gcattcgggc cagggttcac ccctccccat 3060
gggggactgt tggggtggag ccctcaggct cagggcatac tcacatctgt gccagcagct 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaaggcagc ctactccctt atctccacct 3180
ctaagggaca ctcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 106
<211> 3215
<212> DNA
<400> 106
ctccacaaca ttccaccaag ctctgctaga tcccagagtg aggggcctat attttcctgc 60
tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact actgcctcac ccatatcgtc 120
aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaacatggag agcacaacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccacgtgtcc 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaatttg 360
tcctggctat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctaccaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
acttccagga acatcaacta ccagcacggg accatgcaag acctgcacga ttcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct cttgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcacttg 600
tattcccatc ccatcatcct gggctttcgc aagattccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcctgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgcagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagttatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt ttacctctat taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttgaaccct 840
aataaaacca aacgttgggg ctactccctt aacttcatgg gatatgtaat tggaagttgg 900
ggtgctttac cacaggaaca tattgtacaa aaactaaagc aatgttttcg gaaattgcct 960
gtaaatagac ctattgattg gaaagtatgt caaagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020
gcccctttta cacaatgtgg ctatcctgct ttgatgcctt tatatgcatg tatacaatct 1080
aagcaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc tgtgtaaaca atatctgcac 1140
ctttaccccg ttgcccggca acggtcaggt ctctgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggatggg gcttggccat tggccatcgg cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ccgcggaact cctagcggct tgttttgctc gcagccggtc tggagcgaaa 1320
cttatcggga ctgacaactc tgttgtcctc tctcggaaat acacctcctt cccatggctg 1380
ctcgggtgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc gtctcggggc cgtttggggc tctaccgtcc ccttcttcat 1500
ctgccgttcc ggccaaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca ccaggtcttg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctctcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgttt gtttaaagac tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tattaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa 1920
aaaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat 1980
tcgagatctc cttgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg tgttggggtg agttgatgaa 2100
tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagtagtcag 2160
ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220
tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga gtatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtatccctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttactgggc tttattcttc tactgtacct gtctttaatc 2520
ctgagtggca aactccctcc tttcctaaca ttcatttaca ggaggatatt attaatagat 2580
gtcaacaata tgtgggccct cttacagtta atgaaaaaag gagattaaaa ttaattatgc 2640
ctgctaggtt ctatcctaac cttaccaaat atttgccctt ggataaaggc attaaacctt 2700
attatcctga acatgcagtt aatcattact tcaaaactag gcattattta aatactctgt 2760
ggaaggctgg cattctatat aagagagaaa ctacacacag cgcttcattt tgtgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgacaaggc 2880
atggggacga atctttctgt tcccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 2940
cctgcgttcg gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcat 3000
tggccagagg caaatcaggt aggagcggga gcattcgggc cagggttcac cccacctcac 3060
ggcggtcttt tgaggtggag ccctcaggct cagggcatat tgacaacagt gccagcagcg 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaagacagc ctactcccat ctctccacct 3180
ctaagagaca gtcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 107
<211> 3182
<212> DNA
<400> 107
aactccacaa ccttccacca aactctgcaa gatcccagag tgagaggcct gtatttccct 60
gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgttccga ctactgtctc tcccatatcg 120
tcaatcttct cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg agaacatcac atcaggattc 180
ctaggacccc tgctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata 240
ccgcagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggaac taccgtgtgt 300
cttggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcctg tcctccaact 360
tgtcctggtt atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tcttcctctt catcctgctg 420
ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct 480
ctaattccag gatcttcaac taccagcacg ggaccatgca gaacctgcac gactcctgct 540
caaggaacct ctatgtatcc ctcctgttgc tgtaccaaac cttcggacgg aaattgcacc 600
tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc ggaaaattcc tatgggagtg ggcctcagcc 660
cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 720
actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc 780
ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttctgtc tttgggtata catttaaacc 840
ctaacaaaac aaaaagatgg ggttactctt tacatttcat gggctatgtc attggatgtt 900
atgggtcatt gccacaagat cacatcatac agaaaatcaa agaatgcttt agaaaacttc 960
ctgttaacag gcctattgat tggaaagtct gtcaacgtat tgtgggtctt ttgggttttg 1020
ctgccccttt tacacaatgt ggttatcctg ctttaatgcc tttgtatgca tgtattcagt 1080
cgaagcaggc ttttactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga 1140
acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc 1200
ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcatgcg tggaaccttt ctggctcgtc 1260
tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa 1320
acattctcgg gacggataac tctgttgttc tctcccgcaa atatacatcg tatccatggc 1380
tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 1440
cgctgaatcc cgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc 1500
gtctgccgtt tcgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 1560
cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 1620
cgtgaaagcc caaccattct tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctctgt 1680
aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga 1740
gttgggggag gagattagat taaaggtctt tgtattagga ggctgtaggc ataaattggt 1800
ctgcgcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcttg ttcatgtcct 1860
actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat tgatccttat 1920
aaagaatttg gagctactgt ggagttactc tcgtttttgc cttctgactt ctttccttca 1980
gtacgagatc ttctagataa cgcctcagct ctgtatcggg aagccttaga gtctcctgag 2040
cattgttcac ctcaccatac tgcactcagg caagcaatac tgtgctgggg ggaactaatg 2100
actctagcta cctgggtggg tggtaatttg gaagatccaa tatccaggga cctagtagtc 2160
agttatgtca acactaatat gggcctaaaa ttcaggcaac tattgtggtt tcacatttct 2220
tgtctcactt ttggaagaga aacagttata gagtatttgg tgtcttttgg agtgtggatt 2280
cgcactcctc cagcttatag accaccaaat gcccctatct tatcaacact tccggagact 2340
actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga 2400
aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aatctcaatg ttagtattcc 2460
ttggactcat aaggtgggaa actttacggg gctttattct tctactgtac ctgtctttaa 2520
ccctcattgg aaaacaccct cttttcctaa tatacattta caccaagaca ttatcaaaaa 2580
atgtgaacaa tttgtaggcc cactcacagt caatgagaaa agaagactgc aattgattat 2640
gccagctagg ttttatccaa atgttaccaa atatttgcca ttggataagg gtattaaacc 2700
ttattatcca gaatatttag ttaatcatta cttccaaact agacattatt tacacactct 2760
atggaaggcg ggtatattat acaagagaga aactacacat agcgcctcat tttgtgggtc 2820
accatattct tgggaacaag agctacagca tggggcagaa tctttccacc agcaatcctc 2880
tgggattctt tcccgaccac cagttggatc cagccttcag agcaaacacc gcaaatccag 2940
attgggactt caatcccaac aaggacacct ggccagacgc caacaaggta ggagctggag 3000
cattcgggct gggattcacc ccaccacacg gaggcctttt ggggtggagc cctcaggctc 3060
agggcatact agaaacgttg ccagcaaatc cgcctcctgc ctctaccaat cgccagtcag 3120
gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt tgagaaacac tcatcctcag gccatgcagt 3180
gg 3182
<210> 108
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo modification#63
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a 2'OMe thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a 2'OMe cytidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
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modified as phosphorothioate.
<400> 108
tgctgggggg aattga 16
<210> 109
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#67
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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of T is modified as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> T represents a thymidine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a guanosine of locked nucleic acid.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine of locked nucleic acid wherein phosphate
of A is modified as phosphorothioate.
<400> 109
tgctgggggg aattga 16
<210> 110
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Oligo modification#72
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<400> 110
tgctgggggg aattga 16
<210> 111
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo modification#74
<220>
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<222> (1)..(1)
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as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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modified as phosphorothioate.
<400> 111
tgctgggggg aattga 16
<210> 112
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo modification#75
<220>
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<222> (1)..(1)
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as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<222> (15)..(15)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 112
tgctgggggg aattga 16
<210> 113
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo modification#76
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a 2'OMe thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 113
tgctgggggg aattga 16
<210> 114
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<220>
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<222> (1)..(1)
<223> T represents a 2'OMe thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
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<220>
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<222> (5)..(5)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 114
tgctgggggg aattga 16
<210> 115
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo modification#78
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a 2'OMe thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a 2'OMe cytidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 115
tgctgggggg aattga 16
<210> 116
<211> 16
<212> DNA
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<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> C represents a 2'OMe cytidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
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modified as phosphorothioate.
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tgctgggggg aattga 16
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<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 117
tgctgggggg aattga 16
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 118
tgctgggggg aattga 16
<210> 119
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<222> (1)..(1)
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as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
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modified as phosphorothioate.
<400> 119
tgctgggggg aattga 16
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<213> Artificial Sequence
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<222> (1)..(1)
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as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 120
tgctgggggg aattga 16
<210> 121
<211> 16
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<213> Artificial Sequence
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<222> (1)..(1)
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as phosphorothioate.
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<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 121
tgctgggggg aattga 16
<210> 122
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo modification#85
<220>
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<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<222> (6)..(6)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
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<220>
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<222> (16)..(16)
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modified as phosphorothioate.
<400> 122
tgctgggggg aattga 16
<210> 123
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo modification#86
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a 2'OMe thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 123
tgctgggggg aattga 16
<210> 124
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo modification#87
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
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<222> (3)..(3)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
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<222> (11)..(12)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 124
tgctgggggg aattga 16
<210> 125
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo modification#88
<220>
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<222> (1)..(1)
<223> T represents a thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
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<222> (5)..(10)
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<222> (11)..(12)
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<220>
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<222> (16)..(16)
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modified as phosphorothioate.
<400> 125
tgctgggggg aattga 16
<210> 126
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo modification#89
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<222> (1)..(1)
<223> T represents a 2'OMe thymidine wherein phosphate of T is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> G represents a 2'OMe guanosine.
<220>
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<222> (3)..(3)
<223> C represents a 2'OMe cytidine.
<220>
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<222> (4)..(4)
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<222> (13)..(14)
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<222> (15)..(15)
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<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 126
tgctgggggg aattga 16
<210> 127
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo modification#65
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is modified
as phosphorothioate.
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> C represents a 2'OMe cytidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> T represents a 2'OMe thymidine.
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
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<222> (15)..(15)
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<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> A represents a 2'OMe adenosine wherein phosphate of A is a
modified as phosphorothioate.
<400> 127
actagacact atttaa 16
Claims (44)
- B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나의 화학적 변형(chemical modification)을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로서,
상기 B형 간염 바이러스 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열은 SEQ ID NO: 78 내지 103의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드이고,
상기 적어도 하나의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 20 내지 77, 및 서열번호 108 내지 126의 핵산 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스는 genotype A, B, C 또는 D인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나 이상의 뉴클레오시드간 링키지가 화학적 변형된 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 뉴클레오시드간 링키지가 화학적 변형된 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형된 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나 이상의 슈가 모이어티가 화학적 변형된 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 슈가 모이어티는 뉴클레오타이드 내 5 탄당의 2'번 위치의 -H기가 메톡시에틸(MOE), 디메틸아미노옥시에톡시(DMAOE), 디메틸아미노에톡시에틸(DMAEOE), 메틸(Ome), 아미노프로폭시(AP) 또는 플루오르(F)로 치환되어 변형되거나, 상기 슈가 모이어티가 F-ANA로 치환되어 변형된 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 슈가 모이어티는 LNA(locked nucleic acid) 또는 PNA(peptide nucleic acid) 형태로 화학적 변형된 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 3' 또는 5' 말단에 링커를 통해 GalNAc(N-acetylgalactosamine)이 결합되어 있는 형태인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오시드간 링키지의 화학적 변형 및 슈가 모이어티의 화학적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형되고, 추가로 뉴클레오타이드 내 5 탄당의 2'번 위치의 -H기가 메톡시에틸(MOE), 디메틸아미노옥시에톡시(DMAOE), 디메틸아미노에톡시에틸(DMAEOE), 메틸(Ome), 아미노프로폭시(AP) 또는 플루오르(F)로 치환되어 변형되거나, 뉴클레오타이드의 슈가 모이어티가 F-ANA로 치환되어 변형된 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형되고, 추가로 슈가 모이어티가 LNA(locked nucleic acid) 또는 PNA(peptide nucleic acid) 형태로 화학적 변형된 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 HBV cccDNA (covalently closed circular DNA) 또는 바이러스 RNA와 구아닌-사중합체(G-quadruplex)를 형성하는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 HBV의 cccDNA를 감소시키거나 그 기능을 저해하는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 키토산 나노입자, 콜로이드 분산 시스템, 고분자 복합체, 나노캡슐, 나노입자, 미소구체, 비드, 수중유 에멀전, 미셀, 혼합 미셀, 또는 리포솜을 포함하는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 키토산 나노입자이고, 상기 키토산은 50 내지 190 kDa의 분자량을 가지는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 개체에 투여되는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 복막내, 정맥내, 경피, 설하, 근육내, 비강내 또는 피하로 개체에 투여되는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 삭제
- 제1항, 제2항, 및 제5항 내지 제20항 중 어느 한 항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나 이상의 뉴클레오시드간 링키지가 화학적 변형된 것인, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 뉴클레오시드간 링키지가 화학적 변형된 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형된 것인, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나 이상의 슈가 모이어티가 화학적 변형된 것인, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 슈가 모이어티는 뉴클레오타이드 내 5 탄당의 2'번 위치의 -H기가 메톡시에틸(MOE), 디메틸아미노옥시에톡시(DMAOE), 디메틸아미노에톡시에틸(DMAEOE), 메틸(Ome), 아미노프로폭시(AP) 또는 플루오르(F)로 치환되어 변형되거나, 상기 슈가 모이어티가 F-ANA로 치환되어 변형된 것인, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 슈가 모이어티는 LNA(locked nucleic acid) 또는 PNA(peptide nucleic acid) 형태로 화학적 변형된 것인, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오시드간 링키지의 화학적 변형 및 슈가 모이어티의 화학적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형되고, 추가로 뉴클레오타이드 내 5 탄당의 2'번 위치의 -H기가 메톡시에틸(MOE), 디메틸아미노옥시에톡시(DMAOE), 디메틸아미노에톡시에틸(DMAEOE), 메틸(Ome), 아미노프로폭시(AP) 또는 플루오르(F)로 치환되어 변형되거나, 뉴클레오타이드의 슈가 모이어티가 F-ANA로 치환되어 변형된 것인, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 2종 이상의 화학적 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 인산기가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트로 화학적 변형되고, 추가로 슈가 모이어티가 LNA(locked nucleic acid) 또는 PNA(peptide nucleic acid) 형태로 화학적 변형된 것인, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 HBV cccDNA (covalently closed circular DNA) 또는 바이러스 RNA와 구아닌-사중합체(G-quadruplex)를 형성하는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 HBV의 cccDNA(covalently closed circular DNA)를 감소시키거나 그 기능을 저해하는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 B형 간염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방
방법.
- 제33항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 키토산 나노입자, 콜로이드 분산 시스템, 고분자 복합체, 나노캡슐, 나노입자, 미소구체, 비드, 수중유 에멀전, 미셀, 혼합 미셀, 또는 리포솜을 포함하는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 키토산 나노입자이고, 상기 키토산은 50 내지 190 kDa의 분자량을 가지는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 B형 간염 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 개체에 투여되는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 B형 간염 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 복막내, 정맥내, 경피, 설하, 근육내, 비강내 또는 피하로 개체에 투여되는 것인, B형 간염의 치료 또는 예방 방법.
- B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 유래의 핵산 서열에서 (G)5 서열을 포함하는 5 내지 30개의 연속적인 핵산 서열 또는 이의 상보적인 핵산 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오타이드; 및 상기 올리고뉴클레오타이드 상에 적어도 하나의 화학적 변형(chemical modification)을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드로서,
상기 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 2, 6, 20 내지 103, 및 108 내지 126의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드인 것인, 올리고뉴클레오타이드.
- 삭제
- 서열번호 20 내지 103, 및 108 내지 126의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염에 의한 숙주세포 내의 cccDNA를 감소시키거나 그 기능을 저해하는 조성물.
- 제40항에 있어서, 상기 조성물은 B형 간염 바이러스의 전사를 억제하거나, B형 간염 바이러스가 감염된 숙주세포에서 생성된 ccc DNA를 제거하는 것인, 조성물.
- 서열번호 20 내지 103, 및 108 내지 126의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염에 의한 바이러스 RNA 및 단백질의 감소용 조성물
- 서열번호 20 내지 103, 및 108 내지 126의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염 바이러스의 증식 억제용 조성물.
- 서열번호 20 내지 103, 및 108 내지 126의 핵산 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, B형 간염 바이러스의 진단용 조성물.
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