JP2023521487A - ハーラー症候群を治療するための方法及び薬物 - Google Patents

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Abstract

ＬＥＡＰＥＲ技術に基づく核酸薬物、及び核酸薬物を使用してＲＮＡを標的として編集してハーラー症候群（Ｈｕｒｌｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）などの疾患を治療する方法である。この方法は、核酸薬物を使用したＲＮＡ上のアデノシンからヒポキサンチン塩基への編集、ハーラー症候群（Ｈｕｒｌｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）などの病原性Ｇ＞Ａ変異部位の正確な修復、インビボでのＩＤＵＡなどの、ＲＮＡによってコードされたタンパク質の正常発現の回復を含む。【選択図】図１３

Description

本願は、遺伝子編集治療の分野に属し、特に、ＬＥＡＰＥＲ（Ｌｅｖｅｒａｇｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ；ＲＮＡのプログラム可能な編集のための内因性ＡＤＡＲの活用）技術に基づいてＲＮＡをターゲティング編集し、病原性変異を修復する方法に関し、該方法は、ハーラー症候群などのＧ＞Ａ変異による疾患を予防または治療するために、ＬＥＡＰＥＲ技術を使用してＲＮＡのＡからＩ塩基への部位特異的編集を含む。
ムコ多糖症ＩＨ（Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ ＩＨ，ＭＰＳ ＩＨ）としても知られるハーラー症候群（Ｈｕｒｌｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、ＭＰＳＩの、ＩＨ、ＩＨ／Ｓ、及びＩＳの３つのサブタイプの中で最も重篤な１つであり、これは、この疾患の患者体内のα－Ｌ－イズロニダーゼ（α－Ｌ－ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ，ＩＤＵＡ）の欠如によって引き起こされる、障害を起こし致命的な遺伝性代謝疾患であり、常染色体劣性遺伝性疾患（ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ，ＡＲ，ＡＲ）である。ハーラー症候群の根本的な原因は、ＩＤＵＡタンパク質をコードするヒト４番染色体上の４ｐ１６．３でのＩＤＵＡ遺伝子変異であり、これまでに２００余りの病原性変異があり、その中で最も一般的なタイプはα－Ｌ－イズロニダーゼｃＤＮＡの１２０５位でのＧからＡへの変異である。この変異により、元のトリプトファンが終止コドンに変化し、最終的に翻訳されたタンパク質は、この部位以降のすべてのアミノ酸（ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ－Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ））を欠き、ＩＤＵＡのすべての酵素活性を失う。この突然変異タイプは、人口の総発生率の６３％を占め得る（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ＩＤＵＡ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ，Ｐｏｌｅｔｔｏ， Ｅｄｉｎａ （２０１８）． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． ９４． １０．１１１１／ｃｇｅ．１３２２４．）。ＩＤＵＡは、細胞のリソソーム（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）におけるグリコサミノグリカン（Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ、ＧＡＧ）の分解に関与している。ハーラー症候群の患者は個人によって大きく異なり、出生時には正常である可能性があり、３～６か月の初期の兆候は、顔の輪郭が粗く、その後に前頭骨の突出、骨格の変形、成長停止、言語の壁などの症状が続き、患者は通常１０歳以上生きていない。
現在ハーラー症候群を治癒する方法はなく、酵素補充療法（ＥＲＴ）と造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）との、承認されている２つの治療法が知られている。ＥＲＴは、肝臓のサイズの縮小、呼吸機能の改善、患者の可動性の全体的な改善など、内臓の表現型に関して良好な結果を達成している。不利なことに、それは中枢神経系に到達することができないため、認知障害を防ぐことができない。一方、ＨＳＣＴが成功すると、神経系症状を含むほとんどの臨床症状が予防され得るが、臨床症状が現れる前に（できれば生後８か月前に）治療する必要がある。この治療法の死亡率が高いため、重症患者のみに適している（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｓ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｈｕｒｌｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｔｏｌａｒ， Ｊ （２００８）． Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． ４１． ５３１－５． １０．１０３８／ｓｊ．ｂｍｔ．１７０５９３４）。
現在、ハーラー症候群の治療のために研究されている遺伝子編集技術の原理は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ＺＦＮ）及びアデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）を使用して、正常なＩＤＵＡタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を肝細胞のゲノムに部位特異的に挿入することであるが、この方法ではハーラー症候群の脳や骨格系の症状を解決することはできない。
また、ＤＮＡ編集による治療は治療法の開発にとって比較的有望なアイデアであるが、それによって発生し得るオフターゲット（оｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）は注意が必要な問題である。理論的には、急速に発展しているゲノム編集技術ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）もハーラー症候群の治療に使用できる。多くの研究者やバイオテクノロジー企業も、この技術を臨床に持ち込むために努力している。例えば、２０１９年９月に、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して幹細胞を編集し、ＡＩＤＳと白血病の治療のために患者に再注入する臨床試験の結果が初めて報告され、ＣＲＩＳＰＲ技術の遺伝子治療の方向への変換に大きく貢献した。ＣＲＩＳＰＲ技術には大きな潜在的な応用の見通しがあるが、一連の欠陥もあり、科学研究段階から臨床治療応用へのこの技術の変換を困難にしている。問題の１つは、ＣＲＩＳＰＲ技術に使用する核心的な酵素Ｃａｓである。ＣＲＩＳＰＲに基づくＤＮＡ編集技術では、Ｃａｓ９または同様の機能を持つ他のヌクレアーゼの外因性発現が必要であり、これにより以下の問題が発生する。第一に、通常外因性発現を必要とするヌクレアーゼは、通常、高分子量を有し、これは、ウイルスベクターを介した体内へのそれらの送達の効率を劇的に低下させる。第二に、ヌクレアーゼの外因性発現のために、潜在的なヌクレアーゼのオフターゲットの可能性があり、それによりその適用には潜在的な発癌性のリスクがあるのであろう。最後に、外因的に発現されたヌクレアーゼは細菌に見られ、ヒトや哺乳動物には自然に存在しないため、患者に免疫応答を誘発し得、患者自身に損傷を与える可能性がある一方、外因的に発現されたヌクレアーゼが中和され、それによってその本来の活性を失うか、またはさらなる介入療法を妨げる可能性がある。
２０１７年、張鋒のグループは、ＲＥＰＡＩＲ（プログラム可能なＡからＩへの置換のためのＲＮＡ編集、ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ａ ｔｏ Ｉ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）と呼ばれるＲＮＡ編集技術を報告した（ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３，Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。この技術は、Ｃａｓ１３－ＡＤＡＲ融合タンパク質とシングルガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）の外因性発現により、ＡからＩへの標的ターゲットＲＮＡの編集も実現できるが、ＣＲＩＳＰＲ技術と同様に、この方法でも外因性タンパク質の編集が必要であり、外来タンパク質の発現による問題を解決できない。
２０１７年、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７１９１２は、インビボ編集により適した方法を開示した。この方法は外因性タンパク質を必要とせず、標的部位の配列に相補的なＲＮＡの短い断片を細胞に導入することのみにより、ＡＤＡＲタンパク質を動員してＲＮＡ標的部位を編集することができる。この方法で使用される相補的ＲＮＡは短い（５４ｎｔ未満）が、複雑な化学修飾を必要とし、編集効率は高くない。
２０１９年１月、Ｔｈｏｒｓｔｅｎ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔのグループは、ＲＥＳＴＯＲＥと呼ばれる核酸編集技術を報告した（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ， Ｍｅｒｋｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。この技術は、外来タンパク質への依存を取り除くことができる。しかし、まず第一に、ＲＥＳＴＯＲＥ技術はＩＦＮ－γの存在下でしか高い編集効率を備えることができず、ＩＦＮ－γは自己免疫の発達と重症度を決定する重要な要素であり（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ， Ｐｏｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、医療分野でのこの技術の適用を大幅に減らす。
ＲＮＡ編集方法は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１１０１０５、ＰＣＴ／ＣＮ／２０１９／０８２７１３、ＰＣＴ／ＣＮ／２０１９／１１０７８２に記載されており、「ＬＥＡＰＥＲ」（Ｌｅｖｅｒａｇｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ；ＲＮＡのプログラム可能な編集のための内因性ＡＤＡＲの活用）技術と呼ばれ、標的部位の配列に相補的なＲＮＡを細胞に導入することにより、ＡＤＡＲタンパク質を動員してＲＮＡ標的部位を編集する技術である。この技術で使用される標的部位の配列に相補的なＲＮＡは、修飾を加えることなく、標的部位のより効率的なＲＮＡ編集を刺激することができる。
従来技術には異なる遺伝子またはＲＮＡ編集方法があるが、ハーラー症候群などの特定の疾患について、どの方法が実際に病原性突然変異の修復を達成し、臨床応用のレベルに達することができるかがこの分野で探求されてきた。
本願は、α－Ｌ－イズロニダーゼ（α－Ｌ－ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ，ＩＤＵＡ）遺伝子のＧ＞Ａ変異によって引き起こされるハーラー症候群に対して、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づく細胞内の変異を含む標的ＲＮＡのターゲティング編集のための方法を提供する。本出願の方法により、ＩＤＵＡ遺伝子のＧ＞Ａ変異の高い編集効率を達成し、病原性Ｇ＞Ａ変異を修正し、ＩＤＵＡのレベルと活性をある程度回復させることが可能であり、ハーラー症候群の効果的な治療に全く新しい道を開く。
具体的には、本願は下記の項に関する。
１、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づく細胞中の標的ＲＮＡのターゲティング編集のための方法であって、前記標的ＲＮＡが、グアノシン（Ｇ）からアデノシン（Ａ）への変異部位（標的アデノシン）を含むα－Ｌ－イズロニダーゼ（α－Ｌ－ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ，ＩＤＵＡ）遺伝子転写物配列を含み、前記方法が、
ａｒＲＮＡまたは前記ａｒＲＮＡコード配列を含む構築物を前記細胞に導入することを含み、前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは前記標的ＲＮＡにハイブリダイズした後、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる、
方法。
２、標的アデノシンに対向する前記ａｒＲＮＡ上のヌクレオシド（ターゲティングヌクレオシド）が、シチジン（Ｃ）、アデノシン（Ａ）、またはウリジン（Ｕ）である、項１に記載の方法。一部の実施形態では、標的アデノシンに対向する前記ヌクレオシドがＣである。
３、前記標的アデノシンが、その５’最近傍ヌクレオシド及び３’最近傍ヌクレオシドと標的トリプレットを形成し、前記標的トリプレットが５'－ＵＡＧ－３’である、項１または２に記載の方法。
４、前記ターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオシドがＣ、ＧまたはＵである、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
５、前記ターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオシドがＡである、項１～４のいずれか一項に記載の方法。
６、前記ターゲティングヌクレオシドが、その５’最近傍ヌクレオシド及び３’最近傍ヌクレオシドとターゲティングトリプレットを形成し、前記ターゲティングトリプレットが５'－ＣＣＡ－３’である、項１～５のいずれか一項に記載の方法。
７、前記ａｒＲＮＡの長さが６１ｎｔを超え、例えば、前記ａｒＲＮＡの長さが６２ｎｔ～１２１ｎｔ、６２～１１１ｎｔ、６２～１０１ｎｔ、６２～９１ｎｔ、６２～８１ｎｔまたは６２～７６ｎｔである、項１～６のいずれか一項に記載の方法。一部の実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さが６２～１２１ｎｔから選択される任意の整数のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さが６２ｎｔ、６３ｎｔ、６４ｎｔ、６５ｎｔ、６６ｎｔ、６７ｎｔ、６８ｎｔ、６９ｎｔ、７０ｎｔ、７１ｎｔ、７２ｎｔ、７３ｎｔ、７４ｎｔ、７５ｎｔ、７６ｎｔ、７７ｎｔ、７８ｎｔ、７９ｎｔ、８０ｎｔ、８１ｎｔ、８２ｎｔ、８３ｎｔ、８４ｎｔ、８５ｎｔ、８６ｎｔ、８７ｎｔ、８８ｎｔ、８９ｎｔ、９０ｎｔ、９２ｎｔ、９５ｎｔ、９８ｎｔ、１００ｎｔ、１０３ｎｔまたは１０６ｎｔである。
８、前記ａｒＲＮＡの３’末端からの前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドの距離が、前記ａｒＲＮＡの５’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離よりも短い、項１～７のいずれか一項に記載の方法。一部の実施形態では、前記ａｒＲＮＡの３’末端からの前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドの距離が、前記ａｒＲＮＡの５’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離に等しい。一部の実施形態では、前記ａｒＲＮＡの３’末端からの前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドの距離が、前記ａｒＲＮＡの５’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離よりも長い。
９、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その３’末端からの距離が８ｎｔを超え、例えば、９～６０ｎｔ、好ましくは９～４５ｎｔまたは９～３５ｎｔである、項１～８のいずれか一項に記載の方法。一部の実施形態では、非常に長いｐоｌｙ Ｇ構造をなるべく避けるために、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その３’末端からの距離が、９～２５ｎｔ、９～２６ｎｔまたは９～２７ｎｔから選択される。好ましくは、一部の実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その３’末端からの距離が、９～２０ｎｔ、９～２１ｎｔまたは９～２２ｎｔから選択される。特定の実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その３’末端からの距離が、９～２５ｎｔから選択される任意の整数のヌクレオチドであり、例えば、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、または２４ｎｔである。
１０、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その５’末端からの距離が２５ｎｔを超え、例えば、２６～６０ｎｔ、３５～６０ｎｔ、または４５～６０ｎｔである、項１～９のいずれか一項に記載の方法。一部の実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その５’末端からの距離が、４５ｎｔ、４５ｎｔ、４６ｎｔ、４７ｎｔ、４８ｎｔ、４９ｎｔ、５０ｎｔ、５１ｎｔ、５２ｎｔ、５３ｎｔ、５４ｎｔ、５５ｎｔ、５６ｎｔ、５７ｎｔ、５８ｎｔ、または５９ｎｔから選ばれる。
１１、前記ａｒＲＮＡの５’末端からの前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドの距離が、前記ａｒＲＮＡの３’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離よりも短い、項１～７のいずれか一項に記載の方法。
１２、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その５’末端からの距離が３５ｎｔを超え、例えば、３６～６０ｎｔまたは３６～５５ｎｔである、項１１に記載の方法。好ましくは、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その５’末端からの距離が、５４ｎｔ、５３ｎｔ、５２ｎｔ、５１ｎｔ、５０ｎｔ、４９ｎｔ、４８ｎｔ、４７ｎｔ、４６ｎｔ、４５ｎｔ、４４ｎｔ、４３ｎｔ、４２ｎｔ、４１ｎｔ、４０ｎｔ、３９ｎｔ、３８ｎｔ、または３６ｎｔから選択される。
１３、前記ａｒＲＮＡが、
５５ｎｔ－ｃ－３５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２１ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１９ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１８ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１７ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１３ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１２ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１１ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－９ｎｔ、５０ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５０ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、または４５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔから選択されるいずれかの長さ特徴を有するａｒＲＮＡである、項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
１４、前記ａｒＲＮＡが、５５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔから選択されるいずれかの長さ特徴を有するａｒＲＮＡである、項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
１５、前記ａｒＲＮＡが１つまたは複数の化学修飾を含む、項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
１６、前記化学修飾が、
２'－Ｏ－メチル化修飾、ホスホロチオエート修飾、デオキシリボヌクレオシド置換修飾、ＬＮＡ修飾、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾から選択される１つまたは複数である、項１５に記載の方法。
１７、前記化学修飾が、
１）最初の２、３、４または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
２）最後の２、３、４、または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
３）ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの２’－Ｏ－メチル化修飾、
４）最初の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
５）最後の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
６）最初の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
７）最後の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
８）最初の１、２、３、４または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
９）最後の１、２、３、４、または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
１０）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、及び
１１）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、１、２、３、または４ヌクレオチドの間隔でのヌクレオチド間結合ホスホロチオエート修飾
から選択される１つまたは複数である、項１５または１６に記載の方法。
１８、前記化学修飾が、
１）最初の２、３、４または５ヌクレオチド及び最後の２、３、４、または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
２）ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの２’－Ｏ－メチル化修飾、
３）最初の２、３または４ヌクレオチド及び最後の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
４）最初の２、３または４ヌクレオチド及び最後の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
５）最初の１、２、３、４または５ヌクレオチド間結合及び最後の１、２、３、４、または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
６）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合または多くとも１ヌクレオチド間結合の間隔でのホスホロチオエート修飾
から選択される１つまたは複数である、項１７に記載の方法。
１９、前記ａｒＲＮＡは、以下から選択されるいずれかの化学修飾を含む：
ＣＭ０：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートよって修飾されている；
ＣＭ１：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、配列内のすべてのＵは、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている；
ＣＭ２：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオシドは２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている；
ＣＭ３：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオシドは２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている；
ＣＭ４：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングトリプレットの３つの塩基とそれらの３’最近傍ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている；
ＣＭ６：配列の最初の５ヌクレオチド及び最後の５ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の５ヌクレオチドと最後の５ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている；
ＣＭ１４８：配列の最初の４ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の３ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１４９：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１５０：配列の最初の２ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の１ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１５１：配列の最初の４ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の３ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１５２：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１５３：配列の最初の２ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ９４：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端からの４番目のヌクレオチド間結合から３’末端からの３番目のヌクレオチド間結合まで、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’最近傍ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されている；
ＣＭ１１９：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端からの４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合及び３’末端からの３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチドまで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる；
ＣＭ１２０：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端からの４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオチド間結合及び３’末端からの３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合まで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる；
ＣＭ１２３：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端からの４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合及び３’末端からの３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチドまで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる；
ＣＭ１２５：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合及び標的ヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエートで修飾されており、５’末端からの４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオチドの５’最近傍ヌクレオチドまで、及び３’末端からの３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチドまで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる、
項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
２０、前記ａｒＲＮＡの標的となるＧからＡへの変異部位は、ハーラー症候群患者のゲノムにおけるＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）の変異部位、またはそれに対応する変異部位である、項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
２１、前記ａｒＲＮＡが、下記のものから選択されるいずれかの配列を含む、
１）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ＊Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
２）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊－Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｇ＊－Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｃｄ－Ｃｄ＊Ａｄ＊－Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
３）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊－Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊－Ｃｍ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ－Ｃｄ－Ｃｄ＊Ａｄ＊Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
４）Ｇｍｏｅ＊Ａｍｏｅ＊Ｃｍｏｅ＊Ｇｍｏｅ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｕｍ－ＧＣ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｃ＊Ｃｍｏｅ＊Ｕｍｏｅ＊Ｃｍｏｅ＊Ａｍｏｅ（配列番号３１）；または
５）Ｇ＋＊Ａ＋＊Ｃ＋＊Ｇ＋Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｕｍ－ＧＣ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｃ＊Ｃ＋＊Ｕ＋＊Ｃ＋＊Ａ＋（配列番号３１）
項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
２２、前記ａｒＲＮＡが、エレクトロトランスフェクション、リポフェクション、エクソソーム送達、または脂質－ナノ粒子送達（ＬＮＰ）からなる群から選択されるいずれかの方法によって前記細胞に導入される、項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
２３、前記ａｒＲＮＡが、一回あたり５ｎＭ以上、好ましくは１０ｎＭ以上、より好ましくは２０ｎＭ以上の量で細胞に導入される、項１～２２のいずれか一項に記載の方法。特定の実施形態では、前記ａｒＲＮＡが、一回あたり５～１６０ｎＭ、例えば、１０～１６０ｎＭ、２０～１６０ｎＭ、４０～１６０ｎＭ、２０～８０ｎＭ、４０～８０ｎＭ、または２０～４０ｎＭの量で細胞に導入される。特定の実施形態では、前記ａｒＲＮＡが、一回あたり１５ｎＭ、１７ｎＭ、１９ｎＭ、２１ｎＭ、２２ｎＭ、２３ｎＭ、２４ｎＭ、２５ｎＭ、２６ｎＭ、２７ｎＭ、２８ｎＭ、２９ｎＭ、３０ｎＭ、３１ｎＭ、３２ｎＭ、３３ｎＭ、３４ｎＭ、３５ｎＭ、３６ｎＭ、３７ｎＭ、３８ｎＭ、３９ｎＭ、４１ｎＭ、４３ｎＭ、４５ｎＭ、５５ｎＭ、６５ｎＭ、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭまたは１５５ｎＭの量で細胞に導入される。
２４、前記ａｒＲＮＡが前記細胞に複数回導入され、２回の導入が２１日以上、例えば、１７日以上、１４日以上、１２日以上、１１日以上、または１０日以上に隔てられている、項１～２３のいずれか一項に記載の方法。一部の実施形態では、前記２回の導入が９～２０日、９～１６日、９～１４日、１２～１９日、１２～１５日、または１２～１３日に隔てられている。一部の実施形態では、前記２回の導入が７日、８日、１１日、１５日、１８日、１９日、２０日に隔てられている。
２５、項１～２４のいずれか一項に記載の方法を使用して、ハーラー症候群の病原性Ｇ＞Ａ突然変異を修正することを含む、ハーラー症候群を予防または治療する方法。
２６、ＬＥＡＰＥＲテクノロジーに基づいて細胞中の標的ＲＮＡをターゲティング編集するために操作されたａｒＲＮＡであって、前記標的ＲＮＡはＧからＡへの変異部位（標的アデノシン）を含むＩＤＵＡ遺伝子転写物配列を含み、前記ａｒＲＮＡは前記標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは前記標的ＲＮＡにハイブリダイズした後、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、前記ａｒＲＮＡの標的となるＧからＡへの変異部位は、ハーラー症候群患者のゲノムにおけるＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）の変異部位、またはそれに対応する変異部位である、ａｒＲＮＡ。
２７、標的アデノシンに対向する前記ヌクレオシド（ターゲティングヌクレオシド）が、シチジン（Ｃ）、アデノシン（Ａ）、またはウリジン（Ｕ）である、項２６に記載のａｒＲＮＡ。
２８、前記標的アデノシンが、その５’最近傍ヌクレオシド及び３’最近傍ヌクレオシドと標的トリプレットを形成し、前記標的トリプレットが５'－ＣＣＡ－３’である、項２７に記載のａｒＲＮＡ。
２９、前記ａｒＲＮＡが、
５５ｎｔ－ｃ－３５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２１ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１９ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１８ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１７ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１３ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１２ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１１ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－９ｎｔ、５０ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５０ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、または４５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔから選択されるいずれかの長さ特徴を有するａｒＲＮＡであり、ＣはａｒＲＮＡの標的アデノシンに対向するターゲティングヌクレオシドであり、ａｒＲＮＡの方向は５’から３’の方向である、項２６～２８のいずれか一項に記載のａｒＲＮＡ。
３０、前記ａｒＲＮＡが１つまたは複数の化学修飾を含む、項２６～２９のいずれか一項に記載のａｒＲＮＡ。
３１、前記化学修飾が、
２'－Ｏ－メチル化修飾、ホスホロチオエート修飾、デオキシリボヌクレオシド置換修飾、ＬＮＡ修飾、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾から選択される１つまたは複数である、項２６～３０のいずれか一項に記載のａｒＲＮＡ。
３２、前記化学修飾が、
１）最初の２、３、４または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
２）最後の２、３、４、または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
３）ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの２’－Ｏ－メチル化修飾、
４）最初の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
５）最後の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
６）最初の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
７）最後の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
８）最初の１、２、３、４または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
９）最後の１、２、３、４、または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
１０）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、及び
１１）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、１、２、３、または４ヌクレオチドごとのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾
から選択される１つまたは複数である、項２６～３１のいずれか一項に記載のａｒＲＮＡ。
３３、前記ａｒＲＮＡは、以下から選択されるいずれかの化学修飾を含む：
ＣＭ０：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートよって修飾されている；
ＣＭ１：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、配列内のすべてのＵは、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている；
ＣＭ２：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオシドは２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている；
ＣＭ３：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオシドは２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている；
ＣＭ４：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングトリプレットの３つの塩基とそれらの３’最近傍ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている；
ＣＭ６：配列の最初の５ヌクレオチド及び最後の５ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の５ヌクレオチドと最後の５ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている；
ＣＭ１４８：配列の最初の４ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の３ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１４９：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１５０：配列の最初の２ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の１ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１５１：配列の最初の４ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の３ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１５２：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１５３：配列の最初の２ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ９４：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端からの４番目のヌクレオチド間結合から３’末端からの３番目のヌクレオチド間結合まで、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’最近傍ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されている；
ＣＭ１１９：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端からの４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合及び３’末端からの３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチドまで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる；
ＣＭ１２０：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端からの４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオチド間結合及び３’末端からの３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合まで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる；
ＣＭ１２３：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端からの４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合及び３’末端からの３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチドまで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる；
ＣＭ１２５：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合及び標的ヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエートで修飾されており、５’末端からの４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオチドの５’最近傍ヌクレオチドまで、及び３’末端ｋらの３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチドまで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる、
項２６～３２のいずれか一項に記載のａｒＲＮＡ。
３４、前記ａｒＲＮＡが、下記のものから選択されるいずれかの配列を含む、
１）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ＊Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
２）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊－Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｇ＊－Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｃｄ－Ｃｄ＊Ａｄ＊－Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
３）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊－Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊－Ｃｍ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ－Ｃｄ－Ｃｄ＊Ａｄ＊Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
４）Ｇｍｏｅ＊Ａｍｏｅ＊Ｃｍｏｅ＊Ｇｍｏｅ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｕｍ－ＧＣ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｃ＊Ｃｍｏｅ＊Ｕｍｏｅ＊Ｃｍｏｅ＊Ａｍｏｅ（配列番号３１）；または
５）Ｇ＋＊Ａ＋＊Ｃ＋＊Ｇ＋Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｕｍ－ＧＣ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｃ＊Ｃ＋＊Ｕ＋＊Ｃ＋＊Ａ＋（配列番号３１）
項２６～３３のいずれか一項に記載のａｒＲＮＡ。
３５、項２６～２９のいずれか一項に記載のａｒＲＮＡコード配列を含む構築物。
３６、項２６～３４のいずれか一項に記載のａｒＲＮＡまたは項３５に記載の構築物を含む組成物、リポソーム、エクソソーム、脂質ナノ粒子、細胞、ライブラリーまたはキット。
３７、ハーラー症候群を予防または治療する薬物、製品、キットの調製における、項２６～３４のいずれか一項に記載のａｒＲＮＡ、項３５に記載の構築物、項３６に記載の組成物、リポソーム、エクソソーム、脂質ナノ粒子、細胞、ライブラリーまたはキットの使用。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、ＩＤＵＡをコードするＲＮＡ配列に相補的な配列を含み、さらに、１つまたは複数のミスマッチ、ウォブル（Ｗｏｂｂｌｅ）及び／または片側バルジ（Ｂｕｌｇｅ）を含む。
本願では、ａｒＲＮＡはＸｎｔ－ｃ－Ｙｎｔ（方向は５’から３’端）の形式で表すことができる。ここで、Ｘは、前記ターゲティングヌクレオシド（含まない）から前記ａｒＲＮＡの５’端の最後のヌクレオチド（含む）までのヌクレオチド数を表し、Ｙは、ターゲティングヌクレオチド（含まない）から前記ａｒＲＮＡの３’端の最後のヌクレオチド（含む）までのヌクレオチド数を表す。たとえば、前記ａｒＲＮＡが５５ｎｔ－ｃ－３５ｎｔの場合、前記ターゲティングヌクレオシドは前記ａｒＲＮＡの５’末端から５５ヌクレオチド、前記ａｒＲＮＡの３’末端から３５ヌクレオチドであり、ａｒＲＮＡ全体の長さは、５５ｎｔ＋３５ｎｔ＋１ｎｔ＝９１ｎｔであることを表す。
いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、ＡＤＡＲ酵素を動員するための分子内ステムループ構造を形成することができる領域を含まない。いくつかの実施形態において、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づく細胞中の標的ＲＮＡのターゲティング編集のための方法は、細胞に外因性ＡＤＡＲ酵素タンパク質を導入することを含まない。いくつかの実施形態では、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づく細胞中の標的ＲＮＡのターゲティング編集のための方法は、外因性ＡＤＡＲ酵素タンパク質を細胞に導入することを含む。
本発明のａｒＲＮＡを使用して、細胞レベルで検証すると分かるように、標的とするＩＤＵＡ遺伝子をコードするＲＮＡ上のｃ．１２０５Ｇ＞Ａ突然変異部位の回復率（Ａ＞Ｇ編集効率）が少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれ以上である。
本発明のハーラー症候群を治療または予防するための方法において、前記ａｒＲＮＡが体内で強い免疫応答を引き起こさない。
要約すると、本出願は、ハーラー症候群の治療に使用できるａｒＲＮＡ、当該ａｒＲＮＡを含む構築物、組成物、細胞、ライブラリーまたはキット、ならびに、前記ａｒＲＮＡ、構築物、組成物、細胞、ライブラリーまたはキットを使用してハーラー症候群を予防及び治療するための方法を提供する。本出願の技術構成には、少なくとも以下の利点がある。
１．外因性タンパク質の発現に依存しないため、外因性タンパク質の導入による細胞の損傷はない。外因性タンパク質の過剰発現によるオフターゲット効果はない。外因性タンパク質によって引き起こされる体の免疫応答はない。また、体内に存在する抗体による外因性タンパク質の中和によって遺伝子編集が失敗することはない。導入されるタンパク質の分子量が高すぎて送達ビヒクルの選択を制限することはない。
２．本願は、ＤＮＡ編集とは異なり、可逆的かつ制御可能なＲＮＡ編集方法を提供するので、ゲノムＤＮＡに不可逆的な損傷を引き起こすことはなく、より安全である。
３．インビボ遺伝子編集に適した他の治療スキームと比較して、本願で提供される技術構成は、より高い編集効率を持っている。
図１は、ＧＭ０６２１４細胞でのＩＤＵＡ遺伝子型の検出（ｃ１２０５Ｇ＞Ａ）を示す図である。 図２Ａ～２Ｂは、ＩＤＵＡ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡに対するａｒＲＮＡの設計を示す図である。これらのａｒＲＮＡ編集後（ａｒＲＮＡがエレクトロポレーションによって細胞に入る）の細胞機能をテストし、編集部位Ａ＞Ｇの編集効率を検出した。 図２Ａ～２Ｂは、ＩＤＵＡ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡに対するａｒＲＮＡの設計を示す図である。これらのａｒＲＮＡ編集後（ａｒＲＮＡがエレクトロポレーションによって細胞に入る）の細胞機能をテストし、編集部位Ａ＞Ｇの編集効率を検出した。 図３Ａ～３Ｂは、ＩＤＵＡ－レポーター細胞株の設計（３Ａ）、及び２９３Ｔ－ＩＤＵＡ－レポーターで異なる長さのａｒＲＮＡ（対称的なトランケーション）の編集効率（ａｒＲＮＡがエレクトロポレーションによって細胞に入る）の編集効率を検出すること（３Ｂ）を示す図である。 図３Ａ～３Ｂは、ＩＤＵＡ－レポーター細胞株の設計（３Ａ）、及び２９３Ｔ－ＩＤＵＡ－レポーターで異なる長さのａｒＲＮＡ（対称的なトランケーション）の編集効率（ａｒＲＮＡがエレクトロポレーションによって細胞に入る）の編集効率を検出すること（３Ｂ）を示す図である。 図４Ａ～４Ｂは、ＧＭ０６２１４細胞に異なる長さ（対称的なトランケーション）のａｒＲＮＡをトランスフェクトした後のさまざまな時点での酵素活性と編集効率を示す図である。 図４Ａ～４Ｂは、ＧＭ０６２１４細胞に異なる長さ（対称的なトランケーション）のａｒＲＮＡをトランスフェクトした後のさまざまな時点での酵素活性と編集効率を示す図である。 図５は、ＧＭ０６２１４細胞におけるｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸによるａｒＲＮＡのトランスフェクション（対称トランケーション、３’トランケーション及び５’トランケーション）後のＩＤＵＡ酵素活性の検出と編集効率を示す図である。 図６Ａ～６Ｂは、５５ｎｔ－ｃ－２５ｎｔから５５ｎｔ－ｃ－５ｎｔまでの好ましいａｒＲＮＡ（３’末端の塩基が１つずつ減少している）が、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸによってＧＭ０６２１４細胞にトランスフェクトされ、好ましい３末端の長さの範囲を酵素活性検出により選択したことを示す図である。図６Ａは、５５ｎｔ－ｃ－２５ｎｔから５５ｎｔ－ｃ－１０ｎｔまでのａｒＲＮＡの検出結果を示す図である。図６Ｂは、合成された５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔから５５ｎｔ－ｃ－５ｎｔまでのａｒＲＮＡの別のバッチを使用している。 図６Ａ～６Ｂは、５５ｎｔ－ｃ－２５ｎｔから５５ｎｔ－ｃ－５ｎｔまでの好ましいａｒＲＮＡ（３’末端の塩基が１つずつ減少している）が、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸによってＧＭ０６２１４細胞にトランスフェクトされ、好ましい３末端の長さの範囲を酵素活性検出により選択したことを示す図である。図６Ａは、５５ｎｔ－ｃ－２５ｎｔから５５ｎｔ－ｃ－１０ｎｔまでのａｒＲＮＡの検出結果を示す図である。図６Ｂは、合成された５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔから５５ｎｔ－ｃ－５ｎｔまでのａｒＲＮＡの別のバッチを使用している。 図７は、３’末端が同じ長さ（２つの好ましい長さに固定）で５’末端が異なる長さ（５５ｎｔから徐々に減少）のａｒＲＮＡがｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸによってＧＭ０６２１４細胞にトランスフェクトされ、好ましい５’末端の長さ範囲を酵素活性検出によりスクリーニングしたことを示す図である。この図は、ａｒＲＮＡが６０ｎｔ未満の場合、編集効率が大幅に低下したことも示す。 図８は、３つの好ましい長さのａｒＲＮＡの編集部位の限られた移動によって、３つの群のａｒＲＮＡを産生することを示す図である。各群のａｒＲＮＡの長さは同じであり、編集部位は異なっている。これらのａｒＲＮＡはｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクションによってそれぞれＧＭ０６２１４細胞にトランスフェクトされ、長さと編集位置の最適な組み合わせを酵素活性検出によってスクリーニングした。 図９Ａ～９Ｃは、３つのａｒＲＮＡ長さでのａｒＲＮＡ編集効率に対するＣＭ１及びＣＭ０修飾の影響を比較し（図９Ａ）、異なる化学修飾を含む７１ｎｔ及び７６ｎｔのａｒＲＮＡをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸによってＧＭ０６２１４細胞にトランスフェクトし、酵素活性検出（図９Ｂ）及び標的部位Ａ＞Ｇ突然変異率検出（図９Ｃ）によって好ましい化学修飾をスクリーニングしたことを示す図である。 図９Ａ～９Ｃは、３つのａｒＲＮＡ長さでのａｒＲＮＡ編集効率に対するＣＭ１及びＣＭ０修飾の影響を比較し（図９Ａ）、異なる化学修飾を含む７１ｎｔ及び７６ｎｔのａｒＲＮＡをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸによってＧＭ０６２１４細胞にトランスフェクトし、酵素活性検出（図９Ｂ）及び標的部位Ａ＞Ｇ突然変異率検出（図９Ｃ）によって好ましい化学修飾をスクリーニングしたことを示す図である。 図９Ａ～９Ｃは、３つのａｒＲＮＡ長さでのａｒＲＮＡ編集効率に対するＣＭ１及びＣＭ０修飾の影響を比較し（図９Ａ）、異なる化学修飾を含む７１ｎｔ及び７６ｎｔのａｒＲＮＡをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸによってＧＭ０６２１４細胞にトランスフェクトし、酵素活性検出（図９Ｂ）及び標的部位Ａ＞Ｇ突然変異率検出（図９Ｃ）によって好ましい化学修飾をスクリーニングしたことを示す図である。 図１０Ａ～１０Ｂは、ＣＭ１修飾の５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１１ｎｔの濃度勾配実験を示す図である。ａｒＲＮＡの効果は、酵素活性（図１０Ａ）と標的部位の変異率（図１０Ｂ）の観点から観察した。 図１０Ａ～１０Ｂは、ＣＭ１修飾の５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１１ｎｔの濃度勾配実験を示す図である。ａｒＲＮＡの効果は、酵素活性（図１０Ａ）と標的部位の変異率（図１０Ｂ）の観点から観察した。 図１１Ａ～１１Ｂは、ａｒＲＮＡをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸでＧＭ０６２１４細胞にトランスフェクトし、ＣＭ１修飾の効果を酵素活性検出によってさらに検証したことを示す図である。 図１１Ａ～１１Ｂは、ａｒＲＮＡをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸでＧＭ０６２１４細胞にトランスフェクトし、ＣＭ１修飾の効果を酵素活性検出によってさらに検証したことを示す図である。 図１２は、ヒト肝臓初代細胞における野生型ＩＤＵＡ遺伝子編集のＡ＞Ｇ変異の編集効率を示す図である。 図１３は、ＩＤＵＡ酵素活性によって、ＧＭ０６２１４細胞におけるｃ．１２３９ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）変異部位での転写産物の編集効率について、本出願の方法の編集効率をと従来技術の好ましい方法との比較を示す図である。 図１４Ａ～１４Ｂは、２日目（図１４Ａ）と７日目（図１４Ｂ）のレポーターサブシステムを備えた細胞の蛍光発現量によって、ａｒＲＮＡのＧ＞Ａ遺伝子編集の結果に対する異なるタイプと数の末端修飾の影響を示す図である。 図１４Ａ～１４Ｂは、２日目（図１４Ａ）と７日目（図１４Ｂ）のレポーターサブシステムを備えた細胞の蛍光発現量によって、ａｒＲＮＡのＧ＞Ａ遺伝子編集の結果に対する異なるタイプと数の末端修飾の影響を示す図である。 図１５Ａ～１５Ｃは、３日目（図１５Ａ）、５日目（図１５Ｂ）、及び７日目（図１５Ｃ）のレポーターサブシステムを備えた細胞の蛍光発現量によって、ａｒＲＮＡのＧ＞Ａ遺伝子編集の結果に対する、異なる数及び異なる塩基位置のホスホロチオエート修飾、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾、及びデオキシリボヌクレオシド置換の組み合わせの影響を示す図である。 図１５Ａ～１５Ｃは、３日目（図１５Ａ）、５日目（図１５Ｂ）、及び７日目（図１５Ｃ）のレポーターサブシステムを備えた細胞の蛍光発現量によって、ａｒＲＮＡのＧ＞Ａ遺伝子編集の結果に対する、異なる数及び異なる塩基位置のホスホロチオエート修飾、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾、及びデオキシリボヌクレオシド置換の組み合わせの影響を示す図である。 図１５Ａ～１５Ｃは、３日目（図１５Ａ）、５日目（図１５Ｂ）、及び７日目（図１５Ｃ）のレポーターサブシステムを備えた細胞の蛍光発現量によって、ａｒＲＮＡのＧ＞Ａ遺伝子編集の結果に対する、異なる数及び異なる塩基位置のホスホロチオエート修飾、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾、及びデオキシリボヌクレオシド置換の組み合わせの影響を示す図である。
定義
本発明は、実施例を使用し、添付の図面を参照して本明細書に記載されるが、本発明は、それに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。請求項内の参照記号は、範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。「含む」または「含有する」という用語が本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、それは他の構成部分、要素またはステップを除外しない。ヌクレオチドの数値範囲が本明細書で使用される場合、当該範囲の２つの端点及び端点間に介在するすべての整数が含まれる。例えば、６０から２００ヌクレオチドの範囲については、４０ヌクレオチド及び２６０ヌクレオチドの数に加えて、６０から２００ヌクレオチドの間の任意の整数が含まれる。
以下の用語または定義は、本発明の理解を助けるためにのみ提供されている。本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、本発明の当業者によって使用されるのと同じ意味を有する。従業者は、「分子クローニング：実験室マニュアル（第四版）」（２０１７年３月、科学出版社有限責任公司が発行、著者Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ、翻訳者、賀福初）などの書籍に基づいて本分野の定義及び用語を理解できる。本明細書で提供される定義は、当業者によって理解されるよりも狭い範囲と解釈されるべきではない。
本明細書で使用される場合、「標的部位」とは、ＲＮＡ配列中の編集されるヌクレオチド部位を指す。
「ｄＲＮＡ」（Ｄｅａｍｉｎａｓｅ Ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ＲＮＡ、デアミナーゼ動員ＲＮＡ）という用語は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）などのデアミナーゼ酵素を動員して標的アデノシンを脱アミノ化することができる操作されたＲＮＡを指す。ｄＲＮＡは、アデノシンデアミナーゼを動員する役割のため、「ａｒＲＮＡ」（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ Ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ＲＮＡ、アデノシンデアミナーゼ動員ＲＮＡ）と呼ばれることもある。本願では、ｄＲＮＡとａｒＲＮＡは同じ意味を表し、置き換えて使用できる。たとえば、本願のコンテキストでは、ａｒＲＮＡは相補的な塩基対を介して細胞内の一部のＲＮＡに結合し、ＡＤＡＲなどのデアミナーゼを動員して、ＲＮＡ配列の標的部位にあるアデノシン（Ａ）などのヌクレオシドを脱アミノ化してクレアチニンなどに変換し、これによって編集を達成する。ここで、標的ヌクレオシドがアデノシンである場合、標的ヌクレオシドは「標的アデノシン」または「標的Ａ」とも呼ばれる。前記標的ヌクレオシドを含むＲＮＡは「標的ＲＮＡ」または「目的ＲＮＡ」と呼ばれ、標的ヌクレオシドを含む配列は「標的配列」または「目的配列」と呼ばれる。
本発明において、使用されるａｒＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズして結合する場合、ａｒＲＮＡ配列中の１つのヌクレオシドは、標的ＲＮＡにおいて編集される標的アデノシンに直接に対向する。ａｒＲＮＡ配列のこのヌクレオシドは、シチジン（Ｃ）、アデノシン（Ａ）、またはウリジン（Ｕ）であり得る。標的アデノシンの真向かいにあるこのシチジン（Ｃ）、アデノシン（Ａ）、及びウリジン（Ｕ）は、まとめて「ターゲティングヌクレオシド」と呼ばれ、またはそれぞれ「ターゲティングシチジン（Ｃ）」、「ターゲティングアデノシン（Ａ）」及び「ターゲティングウリジン（Ｕ）」と呼ばれる。
本願では、すべての核酸配列は５’から３’の端までの順で書き込まれる。したがって、本明細書で「前」及び「後」を使用してある配列を修飾する場合、それらは、それぞれ、当該配列の「５’末端」及び「３’末端」を指す。ここで、任意のヌクレオチドの５’末端に最も近いヌクレオチドは、ヌクレオチドの「５’最近傍ヌクレオチド」または「５’最近傍ヌクレオシド」と呼ばれる；任意のヌクレオチド３’ 末端に最も近いヌクレオチドは、ヌクレオチドの「３’最近傍ヌクレオチド」または「３’最近傍ヌクレオシド」と呼ばれる。前記任意のヌクレオチドとその５’最近傍ヌクレオチドとの間の結合は「５’最近傍ヌクレオチド間結合」と呼ばれ、前記任意ヌクレオチドとその３’最近傍ヌクレオチドとの間の結合は「３’最近傍ヌクレオチド間結合」と呼ばれる。例えば、標的ＲＮＡの標的ヌクレオシドの５’及び３’末端に最も近いヌクレオチドは、それぞれ「標的ヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオシド」及び「標的ヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオシド」と呼ばれる。標的ヌクレオシドはその５’最近傍ヌクレオシド及び３’最近傍ヌクレオシドと連結することによって形成されるヌクレオシドトリプレットは、「標的トリプレット」と呼ばれる。同様に、ターゲティングヌクレオシドの５’及び３’末端に最も近いヌクレオチドは、それぞれ「ターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオシド」及び「ターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオシド」と呼ばれ、ａｒＲＮＡ中のターゲティングヌクレオシドはその５’最近傍ヌクレオシド及び３’最近傍ヌクレオシドと連結することによって形成されるヌクレオシドトリプレットは、「ターゲティングトリプレット」と呼ばれる。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」及び「核酸」という用語は交換可能に使用される。それらは、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、すなわち、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはそれらの類似体を指す。前記デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドは、「ヌクレオチド」または「ヌクレオシド」と呼ばれ得る。本出願では、特に明記しない限り、「ヌクレオチド」及び「ヌクレオシド」は交換可能に使用される。ヌクレオチドはホスホジエステル結合によって結合されている。複数のヌクレオチドがホスホジエステル結合によって連結されて、ポリヌクレオチドまたは核酸を形成する。ヌクレオチド間のホスホジエステル結合は、チオによって修飾することができ、ホスホジエステル結合の二重結合酸素の１つを二重結合硫黄で置き換えて「ホスホロチオエート結合」を形成する。このプロセスは「ホスホロチオエート修飾」と呼ばれる。
本願において、「２’－Ｏ－Ｍｅ」または「２’－ＯＭｅ」は、２－Ｏ’－メチルであり、これは、ヌクレオチドリボースの第２位のヒドロキシル基の水素原子がメチル基によって置き換えられて形成した基を指し、このメチル置換プロセスは、「２’－Ｏ－メチル化」、「２’－Ｏ－メチル化修飾」、「２’－ＯＭｅ修飾」または「２’－Ｏ－Ｍｅ修飾」と呼ばれる。本明細書で使用される場合、「ＬＮＡ」または「ロック核酸」は、リボースの２’及び４’が脱水縮合によってオキシメチレンブリッジを形成し、環状構造を形成する特別な二環式ヌクレオチド誘導体を指す。したがって、本出願で言及される「ロック核酸修飾」または「ＬＮＡ修飾」は、修飾されたヌクレオチドがロック核酸であることを意味する。
本明細書で使用される場合、「デオキシリボヌクレオシド置換」修飾とは、対応するデオキシリボヌクレオチドによるＲＮＡ中のリボヌクレオチドの置換を指す。
「２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）」とは、修飾されたヌクレオチドリボースの第２位のヒドロキシル基の水素原子が２－メトキシエチルによって置換されて形成される基を指し、この２－メトキシエチルによる置換は２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾と呼ばれる。
ここで、核酸配列に注釈を付ける場合、「＊」はホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を表し、「ｍ」はそのすぐ左のヌクレオシドが２’－Ｏ－メチル化によって修飾されることを表し、「ｍｏｅ」はそのすぐ左のヌクレオシドが２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）によって修飾されることを表し、「＋」はすぐ左側のヌクレオシドがＬＮＡで修飾されていることを表し、「ｄ」はすぐ左側のヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドに置き換えられルことを表す。本明細書で使用される場合、ヌクレオチド、ヌクレオシドまたは塩基を表す２つの文字の間に「＞」が使用される場合、それは、左側の文字で表されるヌクレオシドが修飾されて、右側の文字で表されるヌクレオシドに転換した変異を意味する。たとえば、「Ｇ＞Ａ」は、グアノシンからアデノシンへの変異を意味する。
本明細書で使用される場合、「相補」とは、核酸が、従来のワトソン-クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成原理によって別の核酸と水素結合を形成することを指す。本明細書に記載の相補とは、すべてのヌクレオチドが相補的であるということなく、２つの核酸のヌクレオチドの大部分が相補的であることを指し得る。
「ＲＮＡ編集」とは、真核細胞に存在する自然なプロセスを指す。ＲＮＡ編集は、ＤＮＡ転写後、タンパク質翻訳前にＲＮＡレベルで発生する塩基Ａ（アデノシン）からＩ（クレアチニン）への編集であり、クレアチニンは翻訳の過程でＧ（グアノシン）として認識されるため、Ａ＞Ｇの変換を達成する。この編集は、ＡＤＡＲ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）プロテアーゼがＡの脱アミノ化を触媒してＩを形成することによって起こり、最後に単一ヌクレオチドの部位特異的編集をもたらす。編集は、イントロン及びエキソン配列を含むコーディング領域に発生することもあるし、非コーディング領域で発生することもあり、コーディング領域での編集は、タンパク質コード配列を再定義することができる。
本明細書で使用される場合、「構築物」とは、ＲＮＡコード配列またはアミノ酸コード配列を含む核酸を指し、ここで、コード配列は、転写または翻訳によって前記ＲＮＡまたはアミノ酸を発現する。前記構築物は、環状または線状、二本鎖または一本鎖、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド分子であり得、化学的に合成または生合成され得る。いくつかの特定の実施形態では、前記構築物はプラスミドである。いくつかの特定の実施形態では、前記構築物はオリゴヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、細胞への「取り込み」または「導入」は、トランスフェクション、感染、エンドサイトーシスなどによって、タンパク質または前記タンパク質をコードする核酸、ＲＮＡまたは前記ＲＮＡをコードする構築物、プラスミドまたは他の線状もしくは環状のＤＮＡなどが細胞膜を通過して細胞に入るプロセスを指す。
ハーラー症候群の信頼できる治療法がないという現状を解決するために、本発明は、ハーラー症候群の個別の特徴を目指し、ＩＤＵＡ病原性遺伝子の割合が最も高い変異型（ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ））を選択し、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づいて、ａｒＲＮＡの長さとターゲティングヌクレオチドの位置を最適化し、適切な化学修飾を導入して、本発明の機能性ＲＮＡ、すなわちａｒＲＮＡ、及びその使用方法を開発し、ハーラー症候群の治療に使用した。前記ａｒＲＮＡは、塩基配列の相補的ペアリングを介して、Ｇ＞Ａ変異部位を含むα－Ｌ－イズロニダーゼ（α－Ｌ－ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ、ＩＤＵＡ）をコードするＲＮＡ配列を標的にして結合し、デアミナーゼを動員し、その変異部位のアデノシン（Ａ）（標的アデノシン）を脱アミノ化してクレアチニン（Ｉ）を形成する。Ｉは翻訳の過程でＧ（グアノシン）として認識されるため、Ａ＞Ｇの転換を達成する。本発明のａｒＲＮＡ及び方法を使用して、ＩＤＵＡ遺伝子によって転写されたｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡは、ＵＧＧ＞ＵＡＧ突然変異のために事前に生じる終止コドンを、トリプトファンをコードするコドンＵＧＧに回復させることができ、その結果、ＩＤＵＡ酵素の合成が継続し、ＩＤＵＡ酵素の機能が回復する。
ＩＤＵＡ病原性変異（ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ）を有するレポーターシステムを構築し、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入したＧＭ０６２１４細胞（ハーラー症候群患者由来の線維芽細胞（エキソン９ ＩＤＵＡ遺伝子１２９３位はＴＧＧ＞ＴＡＧ［Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ（Ｗ４０２Ｘ）］ホモ接合変異である）を使用し、ＧＭ０１３２３細胞（シェーム症候群の患者に由来する線維芽細胞、エキソン６の－７位内、つまりイントロン５にはひとつのＧ＞Ａ変換（ＩＶＳ５ＡＳ－７Ｇ＞Ａ）が含まれる）を対照とし、本願のａｒＲＮＡの機能と特性を検証した。その検証は、ａｒＲＮＡを上記のレポーターシステムを含む細胞、またはＧＭ０６２１４細胞にトランスフェクトし、レポーターシステムの蛍光強度、ＩＤＵＡ酵素の機能の比較、またはＮＧＳ（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、次世代シーケンシング技術）などの方法によってＡ＞Ｇ編集効率または変異率を検出して、ａｒＲＮＡの編集の有効性を検出する。
ＲＮＡ編集方法
一態様では、本願は、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づく細胞内の標的ＲＮＡのターゲティング編集のための方法を提供し、前記標的ＲＮＡが、グアノシン（Ｇ）からアデノシン（Ａ）への変異部位（標的アデノシン）を含むＩＤＵＡ遺伝子転写物配列を含み、前記方法が、ａｒＲＮＡまたは前記ａｒＲＮＡコード配列を含む構築物を前記細胞に導入することを含み、前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは前記標的ＲＮＡにハイブリダイズした後、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる。
いくつかの実施形態では、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンの５’最近傍ヌクレオシドが、Ｕ、Ｃ、Ａ、及びＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、前記標的ＲＮＡにおける前記標的アデノシンの３’最近傍ヌクレオシドが、Ｇ、Ｃ、Ａ、及びＵから選ばれるヌクレオシドであり、優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。いくつかの実施形態では、前記標的ＲＮＡにおける前記標的アデノシンは、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵからなる群より選ばれるトリプレットに位置する。いくつかの実施形態において、前記標的アデノシン及びその５’最近傍ヌクレオシド及び３’最近傍ヌクレオシドからなる標的トリプレットは５’－ＵＡＧ－３’である。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡは、ＩＤＵＡ遺伝子から転写されたｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡから選択される。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡは、ＩＤＵＡ遺伝子から転写されたｐｒｅ－ｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、相補的ＩＤＵＡをコードするＲＮＡ配列との１つ以上のミスマッチ、ウォブル（Ｗｏｂｂｌｅ）及び／またはバルジ（Ｂｕｌｇｅ）を含む。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、ＡＤＡＲ酵素を動員するための分子内ステムループ構造を形成することができる領域を含まない。
いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡ上の標的アデノシンに対向するヌクレオシド（ターゲティングヌクレオシド）は、シチジン（Ｃ）、アデノシン（Ａ）またはウリジン（Ｕ）であり、好ましくはＣである。いくつかの実施形態において、前記ターゲティングアデノシンの５’最近傍ヌクレオシドは、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態において、前記ターゲティングアデノシンの３’最近傍ヌクレオシドはＡである。いくつかの実施形態において、前記ターゲティングヌクレオシドは、その５’最近傍ヌクレオシド及び３’最近傍ヌクレオシドとターゲティングトリプレットを形成し、このターゲティングトリプレットは５’－ＣＣＡ－３’である。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは６１ｎｔを超え、例えば、前記ａｒＲＮＡの長さは６２～１２１ｎｔ、６２～１１１ｎｔ、６２～１０１ｎｔ、６２～１００ｎｔ、６２～９１ｎｔ、６２～７６ｎｔ、または６２～７０ｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、６２～１２１ｎｔから選択されるいずれかの整数のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、６２ｎｔ、６３ｎｔ、６４ｎｔ、６５ｎｔ、６６ｎｔ、６７ｎｔ、６８ｎｔ、６９ｎｔ、７０ｎｔ、７１ｎｔ、７２ｎｔ、７３ｎｔ、７４ｎｔ、７５ｎｔ、７６ｎｔ、７７ｎｔ、７８ｎｔ、７９ｎｔ、８０ｎｔ、８１ｎｔ、８２ｎｔ、８３ｎｔ、８４ｎｔ、８５ｎｔ、８６ｎｔ、８７ｎｔ、８８ｎｔ、８９ｎｔ、９０ｎｔ、９２ｎｔ、９５ｎｔ、９８ｎｔ、１００ｎｔ、１０３ｎｔ、または１０６ｎｔである。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの３’末端からの前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドの距離は、前記ａｒＲＮＡの５’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離より短い。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その３’末端からの距離が８ｎｔを超え、例えば、９～６０ｎｔ、好ましくは９～４５ｎｔまたは９～３５ｎｔである。一部の実施形態では、非常に長いｐоｌｙ Ｇ構造をなるべく避けるために、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その３’末端からの距離が、９～２５ｎｔ、９～２６ｎｔまたは９～２７ｎｔから選択される。好ましくは、一部の実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その３’末端からの距離が、９～２０ｎｔ、９～２１ｎｔまたは９～２２ｎｔから選択される。特定の実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その３’末端からの距離が、９～２５ｎｔから選択される任意の整数のｎｔであり、例えば、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、または２４ｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その５’末端からの距離が２５ｎｔを超え、例えば、２６～６０ｎｔ、３５～６０ｎｔ、または４５～６０ｎｔである。一部の実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その５’末端からの距離が、４５ｎｔ、４５ｎｔ、４６ｎｔ、４７ｎｔ、４８ｎｔ、４９ｎｔ、５０ｎｔ、５１ｎｔ、５２ｎｔ、５３ｎｔ、５４ｎｔ、５５ｎｔ、５６ｎｔ、５７ｎｔ、５８ｎｔ、または５９ｎｔから選ばれる。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの５’末端からの前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドの距離が、前記ａｒＲＮＡの３’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離よりも短い。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その５’末端からの距離が３５ｎｔを超え、例えば、３６～６０ｎｔまたは３６～５５ｎｔである。好ましくは、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、ａｒＲＮＡの５’末端からの距離が、５４ｎｔ、５３ｎｔ、５２ｎｔ、５１ｎｔ、５０ｎｔ、４９ｎｔ、４８ｎｔ、４７ｎｔ、４６ｎｔ、４５ｎｔ、４４ｎｔ、４３ｎｔ、４２ｎｔ、４１ｎｔ、４０ｎｔ、３９ｎｔ、３８ｎｔ、または３６ｎｔから選択される。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが、５５ｎｔ－ｃ－３５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２１ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１９ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１８ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１７ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１３ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１２ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１１ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－９ｎｔ、５０ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５０ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、または４５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔから選択されるいずれかの長さ特徴を有するａｒＲＮＡである。好ましくは、前記ａｒＲＮＡが、５５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔから選択されるいずれかの長さ特徴を有するａｒＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡはオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、１つまたは複数の化学修飾を含む。当業者は、いくつかの適切な化学修飾が、編集効率を確保しながら、細胞内またはインビボでのＲＮＡの安定性を改善し、それによってａｒＲＮＡの編集効率を改善できることを知っているのであろう。たとえば、２’－Ｏ－メチル化修飾をＲＮＡの両端のヌクレオシドに添加するか、ヌクレオチド間結合をホスホロチオエートによって修飾する。本願の実施形態から分かるように、本願のａｒＲＮＡ配列は、２'－Ｏ－メチル化修飾、ホスホロチオエート修飾、デオキシリボヌクレオシド置換修飾、ＬＮＡ修飾、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾から選択される１つまたは複数の化学修飾によってａｒＲＮＡの安定性及び編集効率を高めることができる。具体的には、いくつかの実施形態では、前記化学修飾は、
１）最初の２、３、４または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
２）最後の２、３、４、または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
３）ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの２’－Ｏ－メチル化修飾、
４）最初の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
５）最後の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
６）最初の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
７）最後の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
８）最初の１、２、３、４または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
９）最後の１、２、３、４、または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
１０）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、及び
１１）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、１、２、３、または４ヌクレオチドの間隔でのヌクレオチド間結合ホスホロチオエート修飾、
から選択される１つまたは複数である。
好ましくは、いくつかの特定の実施形態では、前記化学修飾は、
１）最初の２、３、４または５ヌクレオチド及び最後の２、３、４、または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
２）ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの２’－Ｏ－メチル化修飾、
３）最初の２、３または４ヌクレオチド及び最後の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
４）最初の２、３または４ヌクレオチド及び最後の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
５）最初の１、２、３、４または５ヌクレオチド間結合及び最後の１、２、３、４、または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
６）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合または多くとも１ヌクレオチド間結合の間隔でのホスホロチオエート修飾、
から選択される１つまたは複数である。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、以下から選択されるいずれかの化学修飾を含む：
ＣＭ０、ＣＭ１、ＣＭ２、ＣＭ３、ＣＭ４、ＣＭ６、ＣＭ１４８、ＣＭ１４９、ＣＭ１５０、ＣＭ１５１、ＣＭ１５２、ＣＭ１５３、ＣＭ９４、ＣＭ１１９、ＣＭ１２０、ＣＭ１２３、ＣＭ１２５。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの標的となるＧからＡへの変異部位は、ハーラー症候群患者のゲノムにおけるＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）の変異部位、またはそれに対応する変異部位である。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが、下記のものから選択される任意の配列を含む、
１）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ＊Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
２）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊－Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｇ＊－Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｃｄ－Ｃｄ＊Ａｄ＊－Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
３）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊－Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊－Ｃｍ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ－Ｃｄ－Ｃｄ＊Ａｄ＊Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
４）Ｇｍｏｅ＊Ａｍｏｅ＊Ｃｍｏｅ＊Ｇｍｏｅ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｕｍ－ＧＣ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｃ＊Ｃｍｏｅ＊Ｕｍｏｅ＊Ｃｍｏｅ＊Ａｍｏｅ（配列番号３１）；または
５）Ｇ＋＊Ａ＋＊Ｃ＋＊Ｇ＋Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｕｍ－ＧＣ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｃ＊Ｃ＋＊Ｕ＋＊Ｃ＋＊Ａ＋（配列番号３１）。
いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、エレクトロトランスフェクション、リポフェクション、エクソソーム送達、または脂質ナノ粒子送達（ＬＮＰ）から選択される方法によって細胞に導入される。好ましくは、前記ａｒＲＮＡはリポフェクションによって細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、幹細胞、軟骨細胞、骨膜細胞、間葉系細胞、心筋細胞、神経細胞、または肝細胞から選択される。いくつかの実施形態では、前記細胞は好ましくは肝細胞である。
いくつかの実施形態では、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づく細胞内の標的ＲＮＡのターゲティング編集のための方法は、複数の、例えば、２、３、４またはそれ以上の異なる配列及び／または異なる化学修飾を有するａｒＲＮＡを細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、前記細胞に、複数回、例えば、２回、３回、４回、またはそれ以上、ａｒＲＮＡが導入される。いくつかの実施形態では、同じ方法、例えば、リポフェクション、または脂質ナノ粒子送達を使用して、各ａｒＲＮＡを導入する。いくつかの実施形態において、ａｒＲＮＡの各導入に使用される方法は、細胞の状態に応じて異なる。
いくつかの実施形態では、前記細胞は、ａｒＲＮＡに１回のみ導入される。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、一回あたり５ｎＭ以上、好ましくは１０ｎＭ以上、より好ましくは２０ｎＭ以上の量で細胞に導入される。特定の実施形態では、前記ａｒＲＮＡが、一回あたり５～１６０ｎＭ、例えば、１０～１６０ｎＭ、２０～１６０ｎＭ、４０～１６０ｎＭ、２０～８０ｎＭ、４０～８０ｎＭ、または２０～４０ｎＭの量で細胞に導入される。特定の実施形態では、前記ａｒＲＮＡが、一回あたり１５ｎＭ、１７ｎＭ、１９ｎＭ、２１ｎＭ、２２ｎＭ、２３ｎＭ、２４ｎＭ、２５ｎＭ、２６ｎＭ、２７ｎＭ、２８ｎＭ、２９ｎＭ、３０ｎＭ、３１ｎＭ、３２ｎＭ、３３ｎＭ、３４ｎＭ、３５ｎＭ、３６ｎＭ、３７ｎＭ、３８ｎＭ、３９ｎＭ、４１ｎＭ、４３ｎＭ、４５ｎＭ、５５ｎＭ、６５ｎＭ、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭまたは１５５ｎＭの量で細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが前記細胞に複数回導入され、２つの導入が２１日以上、例えば、１７日以上、１４日以上、１２日以上、１１日以上、または１０日以上に隔てられている。一部の実施形態では、前記２つの導入が９～２０日、９～１６日、９～１４日、１２～１９日、１２～１５日、または１２～１３日に隔てられている。一部の実施形態では、前記２つの導入が７日、８日、１１日、１５日、１８日、１９日、２０日に隔てられている。
いくつかの実施形態では、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づく細胞内の標的ＲＮＡのターゲティング編集のための方法は、前記細胞に外因性タンパク質または外因性タンパク質のコード配列を導入することを含まない。いくつかの実施形態では、この方法は、外因性ＡＤＡＲを患者細胞に導入することをさらに含む。 いくつかの特定の実施形態では、前記外因性ＡＤＡＲは、Ｅ１００８突然変異を含むＡＤＡＲ１である。いくつかの実施形態において、この方法はまた、ＡＤＡＲ３の阻害剤を宿主細胞に導入することを含み得る。いくつかの実施形態において、この方法は、インターフェロンの刺激因子を宿主細胞に導入することをさらに含む。
本願の実施例のデータ結果から分かるように、本願で説明されている方法を使用すると、前記標的アデノシン（Ｇ＞Ａ）変異部位の回復率（Ａ＞Ｇ編集効率）は少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれ以上である。
ａｒＲＮＡ
一態様では、本願はａｒＲＮＡをさらに提供し、前記ａｒＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは前記標的ＲＮＡにハイブリダイズした後、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる。前記標的ＲＮＡは、グアノシン（Ｇ）からアデノシン（Ａ）への突然変異部位（標的アデノシン）を含む。いくつかの実施形態において、前記標的アデノシンは、その５’最近傍ヌクレオシド及び３’最近傍ヌクレオシドと標的トリプレットを形成し、この標的トリプレットは５’－ＵＡＧ－３’である。
いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、相補的ＩＤＵＡをコードするＲＮＡ配列との１つ以上のミスマッチ、ウォブル（Ｗｏｂｂｌｅ）及び／またはバルジ（Ｂｕｌｇｅ）を含む。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、ＡＤＡＲ酵素を動員するための分子内ステムループ構造を形成することができる領域を含まない。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡ上の標的アデノシンに対向するヌクレオシド（ターゲティングヌクレオシド）は、シチジン（Ｃ）、アデノシン（Ａ）またはウリジン（Ｕ）であり、好ましくはＣである。いくつかの実施形態において、前記ターゲティングアデノシンの５’最近傍ヌクレオシドは、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態において、前記ターゲティングアデノシンの３’最近傍ヌクレオシドはＡである。いくつかの実施形態において、前記ターゲティングヌクレオシドとその５’最近傍ヌクレオシド及び３’最近傍ヌクレオシドが形成したターゲティングトリプレットは５’－ＣＣＡ－３’である。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、それぞれが前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシン以外の他のアデノシン（非標的アデノシン）とは対向する、１つ以上のグアノシンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの反対側にある２つ以上の連続したミスマッチヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは６１ｎｔを超え、例えば、前記ａｒＲＮＡの長さは６２～１２１ｎｔ、６２～１１１ｎｔ、６２～１０１ｎｔ、６２～１００ｎｔ、６２～９１ｎｔ、６２～７６ｎｔ、または６２～７０ｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、６２～１２１ｎｔから選択されるいずれかの整数のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、６２ｎｔ、６３ｎｔ、６４ｎｔ、６５ｎｔ、６６ｎｔ、６７ｎｔ、６８ｎｔ、６９ｎｔ、７０ｎｔ、７１ｎｔ、７２ｎｔ、７３ｎｔ、７４ｎｔ、７５ｎｔ、７６ｎｔ、７７ｎｔ、７８ｎｔ、７９ｎｔ、８０ｎｔ、８１ｎｔ、８２ｎｔ、８３ｎｔ、８４ｎｔ、８５ｎｔ、８６ｎｔ、８７ｎｔ、８８ｎｔ、８９ｎｔ、９０ｎｔ、９２ｎｔ、９５ｎｔ、９８ｎｔ、１００ｎｔ、１０３ｎｔ、または１０６ｎｔである。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの３’末端からの前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドの距離は、前記ａｒＲＮＡの５’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離より短い。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その３’末端からの距離が８ｎｔを超え、例えば、９～６０ｎｔ、好ましくは９～４５ｎｔまたは９～３５ｎｔである。一部の実施形態では、非常に長いｐоｌｙ Ｇ構造をなるべく避けるために、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その３’末端からの距離が、９～２５ｎｔ、９～２６ｎｔまたは９～２７ｎｔから選択される。好ましくは、一部の実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その３’末端からの距離が、９～２０ｎｔ、９～２１ｎｔまたは９～２２ｎｔから選択される。特定の実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その３’末端からの距離が、９～２５ｎｔから選択される任意の整数のｎｔであり、例えば、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、または２４ｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その５’末端からの距離が２５ｎｔを超え、例えば、２６～６０ｎｔ、３５～６０ｎｔ、または４５～６０ｎｔである。一部の実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その５’末端からの距離が、４５ｎｔ、４５ｎｔ、４６ｎｔ、４７ｎｔ、４８ｎｔ、４９ｎｔ、５０ｎｔ、５１ｎｔ、５２ｎｔ、５３ｎｔ、５４ｎｔ、５５ｎｔ、５６ｎｔ、５７ｎｔ、５８ｎｔ、または５９ｎｔである。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの５’末端からの前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドの距離が、前記ａｒＲＮＡの３’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離よりも短い。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その５’末端からの距離が３５ｎｔを超え、例えば、３６～６０ｎｔまたは３６～５５ｎｔである。好ましくは、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、ａｒＲＮＡの５’末端からの距離が、５４ｎｔ、５３ｎｔ、５２ｎｔ、５１ｎｔ、５０ｎｔ、４９ｎｔ、４８ｎｔ、４７ｎｔ、４６ｎｔ、４５ｎｔ、４４ｎｔ、４３ｎｔ、４２ｎｔ、４１ｎｔ、４０ｎｔ、３９ｎｔ、３８ｎｔ、または３６ｎｔから選択される。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが、５５ｎｔ－ｃ－３５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２１ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１９ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１８ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１７ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１３ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１２ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１１ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－９ｎｔ、５０ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５０ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、または４５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔから選択されるいずれかの長さ特徴を有するａｒＲＮＡである。好ましくは、前記ａｒＲＮＡが、５５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔから選択されるいずれかの長さ特徴を有するａｒＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡはオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、１つまたは複数の化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記化学修飾、２'－Ｏ－メチル化修飾、ホスホロチオエート修飾、デオキシリボヌクレオシド置換修飾、ＬＮＡ修飾、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾から選択される１つまたは複数である。いくつかの実施形態では、前記化学修飾は、
１）最初の２、３、４または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
２）最後の２、３、４、または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
３）ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの２’－Ｏ－メチル化修飾、
４）最初の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
５）最後の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
６）最初の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
７）最後の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
８）最初の１、２、３、４または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
９）最後の１、２、３、４、または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
１０）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、及び
１１）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、１、２、３、または４ヌクレオチドの間隔でのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾
から選択される１つまたは複数である。
好ましくは、いくつかの特定の実施形態では、前記化学修飾は、
１）最初の２、３、４または５ヌクレオチド及び最後の２、３、４、または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
２）ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの２’－Ｏ－メチル化修飾、
３）最初の２、３または４ヌクレオチド及び最後の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
４）最初の２、３または４ヌクレオチド及び最後の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
５）最初の１、２、３、４または５ヌクレオチド間結合及び最後の１、２、３、４、または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
６）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合または多くとも１ヌクレオチド間結合の間隔でのホスホロチオエート修飾
から選択される１つまたは複数である。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、以下から選択されるいずれかの化学修飾を含む：
ＣＭ０、ＣＭ１、ＣＭ２、ＣＭ３、ＣＭ４、ＣＭ６、ＣＭ１４８、ＣＭ１４９、ＣＭ１５０、ＣＭ１５１、ＣＭ１５２、ＣＭ１５３、ＣＭ９４、ＣＭ１１９、ＣＭ１２０、ＣＭ１２３、ＣＭ１２５。
いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡの標的となる標的ＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡまたはスモールＲＮＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡである。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡは、ＩＤＵＡ遺伝子の転写配列である。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡは、ＩＤＵＡ遺伝子から転写されたｐｒｅ－ｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡは、ＩＤＵＡ遺伝子から転写されたｐｒｅ－ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記標的ＲＮＡは、ハーラー症候群患者のゲノムにおけるＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）に対応する変異部位を含み、前記ａｒＲＮＡが前記標的ＲＮＡにハイブリダイズすると、前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは前記標的ＲＮＡの前記変異部位の反対側になる。この場合、前記変異部位はａｒＲＮＡの標的ヌクレオシドである。いくつかの実施形態において、前記ａｒＲＮＡは、前述のＲＮＡ編集方法に使用し得る。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが、下記のものから選択される任意の配列を含む、
１）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ＊Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
２）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊－Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｇ＊－Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｃｄ－Ｃｄ＊Ａｄ＊－Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
３）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊－Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊－Ｃｍ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ－Ｃｄ－Ｃｄ＊Ａｄ＊Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
４）Ｇｍｏｅ＊Ａｍｏｅ＊Ｃｍｏｅ＊Ｇｍｏｅ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｕｍ－ＧＣ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｃ＊Ｃｍｏｅ＊Ｕｍｏｅ＊Ｃｍｏｅ＊Ａｍｏｅ（配列番号３１）；または
５）Ｇ＋＊Ａ＋＊Ｃ＋＊Ｇ＋Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｕｍ－ＧＣ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｃ＊Ｃ＋＊Ｕ＋＊Ｃ＋＊Ａ＋（配列番号３１）。
構築物、組成物、粒子、細胞、ライブラリーまたはキット
本発明の一態様はまた、前述のａｒＲＮＡコード配列を含む構築物を提供する。いくつかの実施形態において、前述構築物は一本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、前述構築物は二本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、前述構築物は、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッド分子である。いくつかの実施形態において、前述構築物は二本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、前述構築物は、前述ａｒＲＮＡのアンチセンス核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前述構築物は環状である。いくつかの実施形態では、前述構築物は線形である。
いくつかの実施形態において、前述構築物はプラスミドである。いくつかの実施形態では、前述構築物は、ウイルスのゲノムの全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、前述ウイルスは、ＡＡＶ、レンチウイルス、ファージ、またはバキュロウイルスから選択される。したがって、本出願はまた、前述構築物を含むウイルスを提供する。本出願の一態様は、前述のａｒＲＮＡまたは前述の構築物を含む組成物、リポソーム、エクソソーム、脂質ナノ粒子、細胞、ライブラリーまたはキットを提供する。いくつかの実施形態において、前述組成物、リポソーム、エクソソーム、脂質ナノ粒子、細胞、ライブラリーまたはキットは、前述のａｒＲＮＡのうちの１つのみ、または前述ａｒＲＮＡコード配列を含む構築物を含む。いくつかの実施形態では、前述組成物、リポソーム、エクソソーム、脂質ナノ粒子、細胞、ライブラリーまたはキットは、２つ以上の前述のａｒＲＮＡまたは前述ａｒＲＮＡコード配列を含む構築物を含む。
いくつかの実施形態では、前述組成物は医薬組成物であり、したがって、前述組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
いくつかの実施形態では、前述細胞は前述構築物を含み、前述構築物は細胞質に位置する。いくつかの実施形態では、前述細胞は構築物を含み、前述構築物はゲノムＤＮＡの一部である。
ハーラー症候群を予防または治療する方法
本発明の一態様はまた、ハーラー症候群を治療または予防するための方法を提供し、その方法は、ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）に相当する突然変異部位を有するハーラー症候群患者に、前述のａｒＲＮＡ、または前述の構築物、リポソーム、エクソソーム、脂質ナノ粒子または細胞を投与すること、または前述のＲＮＡ編集法によってハーラー症候群に関連する症状を予防または治療することを含む。
いくつかの実施形態において、前述投与は、静脈内注射、皮下注射、動脈注入、筋肉内注射、単一器官局所注射、または頭蓋内注射から選択される。いくつかの実施形態において、前述投与は、単回投与、例えば、患者への前述ａｒＲＮＡコード配列を含む細胞の単回注入であり、前述細胞は、特定の組織にコロニーを形成する（定植する）。
いくつかの実施形態において、前述投与は、２回、３回またはそれ以上の投与である。いくつかの実施形態において、２回の投与の間の間隔は、２１日より長い。いくつかの実施形態において、各２回の投与の期間は、１７日以上、１４日以上、１２日以上、１１日以上、または１０日以上である。いくつかの実施形態では、前述２回の導入の間隔は、９～２０日、９～１６日、９～１４日、１２～１９日、１２～１５日、または１２～１３日である。いくつかの実施形態では、前述２回の導入の間隔は、７日、８日、１１日、１５日、１８日、１９日、２０日である。
いくつかの実施形態では、前述投与は、標的組織中のａｒＲＮＡ濃度を５ｎＭ以上、好ましくは１０ｎＭ以上、より好ましくは２０ｎＭ以上に維持することができる。いくつかの特定の実施形態では、前述投与は、標的組織中のａｒＲＮＡ濃度を、５～１６０ｎＭ、たとえば１０～１６０ｎＭ、２０～１６０ｎＭ、４０～１６０ｎＭ、２０～８０ｎＭ、４０～８０ｎＭ、または２０～４０ｎＭに維持し得る。いくつかの特定の実施形態では、前述投与は、標的組織中のａｒＲＮＡ濃度を１５ｎＭ、１７ｎＭ、１９ｎＭ、２１ｎＭ、２２ｎＭ、２３ｎＭ、２４ｎＭ、２５ｎＭ、２６ｎＭ、２７ｎＭ、２８ｎＭ、２９ｎＭ、３０ｎＭ、３１ｎＭ、３２ｎＭ、３３ｎＭ、３４ｎＭ、３５ｎＭ、３６ｎＭ、３７ｎＭ、３８ｎＭ、３９ｎＭ、４１ｎＭ、４３ｎＭ、４５ｎＭ、５５ｎＭ、６５ｎＭ、７５ｎＭ、８５ｎＭ、９５ｎＭ、１０５ｎＭ、１１５ｎＭ、１２５ｎＭ、１３５ｎＭ、１４５ｎＭまたは１５５ｎＭに維持し得る。
本発明の技術構成は、具体的な実施例を参照して以下でさらに詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されない。特に指定のない限り、下記の試薬はすべて市販されている。簡潔にするために、いくつかの操作については、使用されるパラメータ、ステップ、及び機器を詳述していないが、これらは、当業者によってよく知られており、再現可能であることを理解されたい。
本明細書で使用されている細胞ＧＭ０６２１４及びＧＭ０１３２３は、米国のＣｏｒｉｅｌｌ社から購入した。その中で、ＧＭ０６２１４はハーラー症候群の患者に由来する線維芽細胞であり、そのＩＤＵＡ遺伝子のエキソン９の１２９３番目のヌクレオチドはＧからＡに変異し、そのコドンはＴＧＧからＴＡＧに変異している（［Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ（Ｗ４０２Ｘ）］）（細胞についての上記の説明は、製品仕様書によるものであり、前記変異がＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）変異に相当する）。ＧＭ０１３２３はシャイエ症候群（Ｓｃｈｅｉｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の患者に由来する線維芽細胞であり、健康なヒト由来の線維芽細胞と比較して、そのＩＤＵＡ活性は０．３％である。ハーラー症候群と比較して、シャイエ症候群は比較的軽度の症状を示す。したがって、以下の実施例では、ＧＭ０１３２３をＩＤＵＡ酵素活性の陽性対照として使用し、ＧＭ０６２１４を疾患モデル及び試験細胞として使用した。
実施例１：ＧＭ０６２１４変異遺伝子型の検出
ＧＭ０６２１４細胞を、１５％血清を含む線維芽細胞培養培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、ＦＭ培地、カタログ番号：２３０１）に入れ、１％線維芽細胞増殖サプリメント（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、ＧＦＳ、カタログ番号：２３０１）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２～３日間培養した。細胞のコンフルエンスが９０％に達したら、０．２５％のトリプシンで消化し、１５％の血清を含む線維芽細胞培地で消化を停止させた。ＤＮＡ抽出は、ＴｉａｎＧｅｎｅ（登録商標）（ＴＩＡＮＧＥＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）細胞ＤＮＡ抽出キット（カタログ番号：ＤＰ３０４－０３）を使用して、取扱説明書に従って実施した。
ＮＣＢＩ－Ｐｒｉｍｅｒ ｂｌａｓｔ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ－ｂｌａｓｔ／）を使用して、ＩＤＵＡ標的部位の上流及び下流配列のプライマーを設計した。配列番号１：ＣＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣＡＡＣＡＣ（フォワードプライマーｈＩＤＵＡ－Ｆ１）；配列番号２：ＣＴＣＧＣＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＡＣＣＧ（リバースプライマーｈＩＤＵＡ－Ｒ１）。ＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ産物をサンガーシーケンシングにかけた。図１に示すように、検証した結果、上記のＧＭ０６２１４細胞の変異型は、ＩＤＵＡゲノムの１５７０４位でＧがＡに変化した病原型変異、すなわち、ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）変異であると確定された。
実施例２：ＧＭ０６２１４細胞へのａｒＲＮＡのエレクトロトランスフェクション後のＩＤＵＡ酵素活性及び編集効率の検出
転写後のＩＤＵＡ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）及び成熟ｍＲＮＡ標的部位の上流及び下流配列について、以下のａｒＲＮＡ配列を設計及び合成した。
ｐｒｅ－ｍＲＮＡに対するターゲティングａｒＲＮＡ：
ＧＡＣＧＣＣＣＡＣＣＧＵＧＵＧＧＵＵＧＣＵＧＵＣＣＡＧＧＡＣＧＧＵＣＣＣＧＧＣＣＵＧＣＧＡＣＡＣＵＵＣＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＵＧＣＵＣＣＵＣＡＵＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＵＧＧＣＣＧＵＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＵＵ（配列番号３、Ｐｒｅ－５５ｎｔ－ｃ－５５ｎｔ）；
成熟ｍＲＮＡに対するターゲティングａｒＲＮＡ：
ＧＡＣＧＣＣＣＡＣＣＧＵＧＵＧＧＵＵＧＣＵＧＵＣＣＡＧＧＡＣＧＧＵＣＣＣＧＧＣＣＵＧＣＧＡＣＡＣＵＵＣＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＵＧＣＵＣＣＵＣＡＵＣＵＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣＧＵＣＧＣＣＧＣＧＵＧＧＧＧＵＣＧＵＵＧ（配列番号４、ｍ－５５ｎｔ－ｃ－５５ｎｔ）；
ランダムに設計した非ターゲティングａｒＲＮＡ：
ＵＡＣＣＧＣＵＡＣＡＧＣＣＡＣＧＣＵＧＡＵＵＵＣＡＧＣＵＡＵＡＣＣＵＧＣＣＣＧＧＵＡＵＡＡＡＧＧＧＡＣＧＵＵＣＡＣＡＣＣＧＣＧＡＵＧＵＵＣＵＣＵＧＣＵＧＧＧＧＡＡＵＵＧＣＧＣＧＡＵＡＵＵＣＡＧＧＡＵＵＡＡＡＡＧＡＡＧＵＧＣ（配列番号５、Ｒａｎｄｏｍ－１１１ｎｔ）。
その中で、ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）及び成熟ｍＲＮＡに対する変異部位に対応するａｒＲＮＡ中の変異部位（標的配列の標的アデノシン）の塩基はＣであるので、標的アデノシンと、標的アデノシンに対応するａｒＲＮＡの塩基との間はＡ－Ｃミスマッチを形成する。合成されたａｒＲＮＡの長さは好ましくは１１１ｎｔである。合成されたａｒＲＮＡは、ＣＭ０（配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾され、最初３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾される）で化学修飾された。次のステップで細胞をエレクトロトランスフェクトした。
ＧＭ０６２１４細胞が約９０％のコンフルエンスに成長したら細胞を消化し、消化を停止してカウントした。エレクトロトランスフェクション中に、６００万個の細胞を４００μｌのプレミックスエレクトロトランスフェクション溶液（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：Ｖ４ＸＰ－３０２４）で再懸濁し、２０μｇのａｒＲＮＡを追加し、均一に混合した後、各２０μｌを１つのエレクトロトランスフェクションシステムとして使用し、ＬｏｎｚａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒエレクトロトランスフェクション機器を使用してエレクトロポレーション条件を予め設定してエレクトロトランスフェクションした。エレクトロトランスフェクション後、細胞を１５％血清を含む２ｍｌの線維芽細胞培養液（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、ＦＭ培地、カタログ番号：２３０１）に迅速に移し、６ウェルプレートに播種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
エレクトロトランスフェクションの４８時間後、細胞を収集し、酵素活性アッセイ及びＩＤＵＡ ｍＲＮＡのＡからＧへの変異率を検出した。
ＩＤＵＡ ｍＲＮＡのＡからＧへの変異率の検出：
設計及び合成したａｒＲＮＡをＲＮＡ酵素フリー水（ＴｒａｎｓＧｅｎ、カタログ番号：ＧＩ２０１－０１）で必要な濃度に溶解し、－８０℃で保存した。ＧＭ０６２１４細胞が約９０％のコンフルエンスに成長したら細胞を消化し、消化を停止してカウントした。１００万個の細胞を取り、２００ｐｍｏｌのａｒＲＮＡを加えて、１００μｌの容量の条件でエレクトロトランスフェクトした。エレクトロトランスフェクションの４８時間後、細胞をカウントし、生存率を測定した。細胞をＲＮＡ酵素フリーの遠心チューブに移し、遠心分離した後に上清を捨て、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮＡ抽出キットを使用してＲＮＡを抽出した（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号７４１３４）。取扱説明書に従って、０．３５ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴ Ｐｌｕｓを５×１０５細胞に加え、ピペッティングにより均一に混合した（凍結保存した細胞からＲＮＡを直接抽出する場合は、ＰＢＳで１回洗浄する）。溶解した細胞溶液をｇＤＮＡ Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒスピンカラムに加え、８０００ｇ以上で３０秒間遠心分離し、カラムを捨てて液体を残した。７０％エタノールを１倍量加え、ピペッティングで均一に混合し、すぐに次のステップに進んだ。液体をＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに加え、８０００ｇ以上で１５秒間遠心分離し、廃液を捨てた。７００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＷ１をＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに加え、８０００ｇ以上で１５秒間遠心分離し、廃液を捨てた。５００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥをＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに加え、８０００ｇ以上で１５秒間遠心分離し、廃液を捨てた。５００μｌの８０％エタノールをＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに加え、８０００ｇ以上で２分間遠心分離し、廃液を捨てた。ＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを２ｍｌコレクションチューブに入れ、キャップを開いた状態で最高速度で５分間遠心分離し、カラムを乾燥させた。ＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを１．５ｍｌコレクションチューブに入れ、カラムメンブレンの中央に１４μｌのＲＮＡ酵素フリー水を滴下し、最高速度で１分間遠心分離してＲＮＡを溶出した。
抽出したＲＮＡの濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００）で測定し、１μｇのＲＮＡを逆転写（Ｔｈｅｒｍｏ、逆転写酵素カタログ番号：２８０２５０１３）に使用した。逆転写システムは表１に示すように構成し、６５℃で５分間インキュベートした後、すぐに氷浴で冷却した。次に、表２に示すシステムを使用して、インキュベーションを３７℃で５０分間続けた。逆転写酵素を７０℃で１５分間不活性化した。表３に示す条件下で、実施例１のＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲを実施した。ＰＣＲの終了後、２μｌのＰＣＲ産物を取ってアガロースゲル電気泳動に使用し、電気泳動の結果からＰＣＲ産物の濃度及びバンドのサイズが正しいかどうかを初歩的に確認した。精製後、ＰＣＲ産物についてライブラリーを構築し、次世代シーケンシングに送った。
その後の逆転写に係るすべての実験では、本実施例の逆転写システム及びプログラムを使用した。
Figure 2023521487000002
Figure 2023521487000003
Figure 2023521487000004
酵素活性の検出：
ＧＭ０６２１４細胞を消化し、遠心分離し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む２８μｌの１×ＰＢＳに再懸濁し、氷上で３０分間溶解した。次に、２５μｌの細胞溶解物を１９０μｍの４－メチルウンベリフェリル－α－Ｌ－イズロニダーゼ（４－ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｉｆｅｒｙｌ－α－Ｌ－ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ）を含む２５μｌの基質（Ｃａｙｍａｎ、２Ａ－１９５４３－５００、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含有、ｐＨ３．５、０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液に溶解）に添加した。暗所で３７℃で９０分間インキュベートした。２００μｌの０．５Ｍ ＮａＯＨ／グリシン溶液（北京化工、ＮａＯＨ、カタログ番号：ＡＲ５００Ｇ；Ｓｏｌａｂｒｉо、Ｇｌｙｃｉｎｅ、カタログ番号：Ｇ８２００）、ｐＨ１０．３を加えて、触媒反応を不活性化した。４℃で２分間遠心した。上清を９６ウェルプレートに移し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００機器（ＴＥＣＡＮ）を使用して３６５ｎｍの励起波長及び４５０ｎｍの励起波長を使用して蛍光値を測定した。
本実施例の結果は図２に示すように、ａｒＲＮＡがｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とする場合、より高い酵素活性及び編集効率を示すことができるのに対し、成熟ｍＲＮＡを標的とするａｒＲＮＡが著しく低い酵素活性及び編集効率を示す。したがって、以下の実施例に係るａｒＲＮＡはすべてｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするａｒＲＮＡである。
実施例３：ＩＤＵＡレポーター細胞株でのａｒＲＮＡのエレクトロトランスフェクション後のＩＤＵＡ標的部位編集効率の検出
図３Ａに示すように、レンチウイルスプラスミド上のｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰタンパク質を発現する配列の間に、ヒト（ＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ））（ＩＤＵＡ）＿ｃ．１２３９ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）変異部位を有し、且つ上流及び下流に各１００ｂｐ程度のＩＤＵＡ遺伝子転写配列を挿入して、プラスミドを構築した。上記のように構築されたプラスミドをウイルスにパッケージし、２９３Ｔ細胞に感染し、ゲノムに組み込んた後、ＩＤＵＡ－レポーターモノクローナル細胞をスクリーニングした。このモノクローナル細胞は、挿入配列のＩＤＵＡ標的アデノシンでのＴＡＧ終止コドンの影響を受けるため、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質のみを発現するが、細胞をａｒＲＮＡで編集すると、ＴＡＧからＴＧＧへの転換が発生し、その後にあるＧＦＰタンパク質を正常に発現させることができる。ＧＦＰタンパク質の陽性細胞比率は、ａｒＲＮＡで細胞を編集する編集効率を反映できる。５１ｎｔから１１１ｎｔまでの長さが異なる４つのａｒＲＮＡ（２５ｎｔ－ｃ－２５ｎｔ、３５ｎｔ－ｃ－３５ｎｔ、４５ｎｔ－ｃ－４５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－５５ｎｔ）を好ましく設計し、また４つの非ターゲティングランダム対照ａｒＲＮＡ（１１１ｎｔ－ｒａｎｄｏｍ、９１ｎｔ－ｒａｎｄｏｍ、７１ｎｔ－ｒａｎｄｏｍ、及び５１ｎｔ－ｒａｎｄｏｍ）を設計した。各ａｒＲＮＡについてＣＭ０で化学修飾をした。本実施例で使用されたａｒＲＮＡは、以下の表４に示す。
細胞について実施例２のエレクトロトランスフェクション条件で異なるａｒＲＮＡをトランスフェクトした後、それぞれ１日目から７日目にＧＦＰ陽性細胞の比率を検出し、編集効率を初歩的に比較した。図３Ｂから分かるように、編集の最高ピークは２日目（４８時間）に現れ、編集効率が最も高い配列は全長９１ｎｔの４５ｎｔ－ｃ－４５ｎｔであり、全長５１ｎｔのａｒＲＮＡの編集効率は非常に低かった。これによって、ａｒＲＮＡの長さが小さすぎてはならないが、配列が長いほど編集効率が高くなるわけではないことがわかる。
Figure 2023521487000005
実施例４：ＧＭ０６２１４細胞における異なる長さのａｒＲＮＡのエレクトロトランスフェクション後の異なる時点でのＲＮＡ編集効率の検出
実施例２のエレクトロトランスフェクション条件を使用して、ＧＭ０６２１４細胞に異なる長さのａｒＲＮＡをエレクトロトランスフェクトし（表４を参照、各ａｒＲＮＡについてＣＭ０で化学修飾をした）、実施例３の方法により、エレクトロトランスフェクションの２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、１２日目、及び１４日目に、それぞれ細胞内酵素活性を検出し、２日目と４日目に細胞内ＲＮＡ標的部位のＡからＧへの変異率を検出した。その結果、図４Ａ及び４Ｂに示すように、ａｒＲＮＡが９１ｎｔである場合（４５－ｃ－４５）、酵素活性が最も高く、エレクトロトランスフェクション後６日目もＩＤＵＡ酵素活性は高いレベルを維持した。ＡからＧへの変異率に関しては、１１１ｎｔと９１ｎｔはほぼ同じ編集効率を示したが、５１ｎｔのａｒＲＮＡはなかなか理想的な編集効率を達成できなかった。
実施例５：ａｒＲＮＡの最適化
文献研究を通じて、エレクトロトランスフェクションの方法は将来の疾患治療の目的を完全に満たすことができないと考える。したがって、リポフェクションの方法をテストした。たとえば、本実施例では、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １３７７８－１５０）を使用してａｒＲＮＡをトランスフェクトした。まず、１１１ｎｔに基づいて両端から配列を同時にトランケートして新しいａｒＲＮＡを設計し、次にそれらの一端を固定してもう一方の端からトランケートした。このような設計方法によって、１４のａｒＲＮＡ配列が生成された。同時に、４つのランダム配列（ｒａｎｄｏｍ）を対照として設計した。本実施例で使用されているａｒＲＮＡ配列は、以下の表５に示されている。各ａｒＲＮＡはＣＭ０方式で化学的に修飾された。トランスフェクションの４８時間後にＩＤＵＡの酵素活性をテストすることにより（方法は実施例３と同じ）、ａｒＲＮＡの長さが１１１ｎｔ以上の場合、編集効率が低下することが分かった。また、同じ長さのａｒＲＮＡの場合、ヌクレオシドＣを標的とする両端の配列の長さが一致していない場合、編集効率が高くなることが多く、５’の長さが３’の長さよりも大きい場合、編集効率が高くなることが多い（図５）。その中で、ａｒＲＮＡの３’末端は好ましくは５ｎｔより長く、５ｎｔ～４５ｎｔの範囲で編集効率の最高値に達し、５’末端は好ましくは２５ｎｔより長く、３５ｎｔを超えると編集効率が大幅に向上する。なお、全長が６１ｎｔと５１ｎｔと短いａｒＲＮＡの酵素活性は常に低い。
さらに、本実施例で試験されたａｒＲＮＡのうち、１０１ｎｔの４５ｎｔ－ｃ－５５ｎｔ（配列番号１７）、９１ｎｔの５５ｎｔ－ｃ－３５ｎｔ（配列番号１３）、８１ｎｔの５５ｎｔ－ｃ－２５ｎｔ（配列番号２４）及び７１ｎｔの５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ（配列番号２５）で編集された細胞は、より優れたＩＤＵＡ酵素活性を示した。
Figure 2023521487000006
Figure 2023521487000007
実施例６：３’端からの編集部位の最適な長さの選別
ＩＤＵＡ遺伝子ＲＮＡには、標的部位の近くに複数の連続したＣが含まれている。したがって、標的ＲＮＡ配列に相補的なａｒＲＮＡを設計する場合、複数の連続するＣは複数のＧに対応する。複数のＧで構成されるＰｏｌｙ Ｇは、現在の化学合成技術では合成が難しいため、なるべく避ける必要がある。前記複数のＧは、標的部位からターゲティングヌクレオシドの３’末端の方向に２０ｎｔ（４つの連続するＧ）及び２５ｎｔ（９つの連続するＧ）に位置しているため、以下の実施例では、設計されたａｒＲＮＡの３’末端を２５ｎｔ未満にして、Ｐｏｌｙ Ｇ構造を可能な限り回避しようとする。また、好ましい３’末端は２０ｎｔ未満である。
実施例６では、８１ｎｔ：５５－ｃ－２５、７１ｎｔ：５５－ｃ－１５配列において、高いＩＤＵＡ酵素活性及びＡからＧへの変異率が検出され、より高い編集効率が表された。３’末端の最短で最適な長さを見つけるために、３’末端の編集部位からの２５ｎｔ（８１ｎｔ：５５－ｃ－２５）から１０ｎｔ（６６ｎｔ：５５ｎｔ－ｃ－１０ｎｔ）までの配列を設計及び検出した。ａｒＲＮＡの配列は表６に示す。各ａｒＲＮＡはＣＭ０方式で化学的に修飾された。ＧＭ０６２１４細胞をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸでトランスフェクトし、トランスフェクションの前日に６ウェルプレートに１ウェルあたり３＊１０５細胞を播種し、トランスフェクションの日に細胞に新鮮な培地を交換した。細胞を２０ｎＭの濃度のａｒＲＮＡでトランスフェクトした。酵素活性の検出のために、トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収した。
酵素活性の検出方法は次の通りである。ＧＭ０６２１４細胞を消化し、遠心分離し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む３３μｌの１×ＰＢＳに再懸濁し、氷上で３０分間溶解した後、４℃で２分間遠心分離した。次に、２５μｌの細胞溶解物を１９０μｍの４－メチルウンベリフェリル－α－Ｌ－イズロニダーゼ（４－ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｉｆｅｒｙｌ－α－Ｌ－ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ）を含む２５μｌの基質（Ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈ、４４０７６）に添加した。この基質は、０．４Ｍギ酸ナトリウム及び０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する、ｐＨ３．５の緩衝液に溶解した。暗所で３７℃で３０分間インキュベートした。２００μｌの０．５Ｍ ＮａＯＨ／グリシン溶液（北京化工、ＮａＯＨ、カタログ番号：ＡＲ５００Ｇ；Ｓｏｌａｂｒｉо、Ｇｌｙｃｉｎｅ、カタログ番号：Ｇ８２００）、ｐＨ１０．３を加えて、触媒反応を不活性化した。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００機器（ＴＥＣＡＮ）を使用して蛍光値を測定した。励起光は３６５ｎｍ及び４５０ｎｍの波長を使用した。細胞溶解物を取り、タンパク質濃度を測定した。
図６Ａに示すように、ＩＤＵＡ酵素活性の検出（結果はＧＭ０１３２３細胞のＩＤＵＡ酵素活性に対する倍数として示されている）により、３’末端からのターゲティングヌクレオシドの距離が２５ｎｔ－１０ｎｔであるａｒＲＮＡは、いずれも理想的な編集効率を達成できることが分かった。３’の長さをさらに短くするために、新しいバッチ、すなわち、配列の編集部位が３’末端から１６ｎｔ－５ｎｔの長さであるａｒＲＮＡのバッチを再合成した。ＩＤＵＡ酵素活性の結果を図６Ｂに示す。２つの実験では、同じａｒＲＮＡ配列をＧＭ０６２１４細胞にトランスフェクトして４８時間後、得られた酵素活性の結果は基本的に同じであった。さらに、３’末端の長さが７ｎｔ－１０ｎｔのａｒＲＮＡも比較的理想的な編集効率を示し、３’末端の長さが９ｎｔ－１０ｎｔのａｒＲＮＡの方がより効果的であった。図６Ｂの結果から、全長が６１ｎｔ未満のａｒＲＮＡの編集効果が理想的ではないこともわかった。
実施例６のデータ及び図６Ａと６Ｂの結果と組み合わせると、ａｒＲＮＡの３’末端の長さが９ｎｔ～２５ｎｔの範囲内に制御することがよいことが分かる。また、ａｒＲＮＡの全長は６１ｎｔ以上であるのがよい。
Figure 2023521487000008
Figure 2023521487000009
Figure 2023521487000010
実施例７：好ましい３’端長さが固定されている条件下で、最適な５’端長さの選別
異なる長さの２つのａｒＲＮＡ：７６ｎｔ：５５－ｃ－２０、７１ｎｔ：５５－ｃ－１５を選択し、表７に示すように、３’末端の固定長に基づいて、５’末端は徐々にトランケートされた。各ａｒＲＮＡはＣＭ０方式で化学的に修飾された。ＧＭ０６２１４細胞をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸでトランスフェクトした後、ＩＤＵＡ酵素活性を実験によって測定した。その結果、図７に示すように、ａｒＲＮＡの全長は６１ｎｔ未満の場合、その編集効率は大幅に低下したが、全長は６１ｎｔより大きい場合、３’末端が１５ｎｔまたは２０ｎｔであり、５’末端の長さが４０ｎｔを超える場合、図７に示すように、ａｒＲＮＡ編集後の細胞のＩＤＵＡ酵素活性が有意に向上した。
Figure 2023521487000011
Figure 2023521487000012
実施例８：標的部位の編集効率に対するターゲティングヌクレオシド位置シフトの影響に関する研究
前述の実施例から、標的部位の編集効率に対するターゲティングヌクレオシド位置シフトの影響を研究するために、３つの長さのａｒＲＮＡを好ましく選択した。ターゲティングヌクレオシドを中心位置から３’末端に徐々に移動しながら、ａｒＲＮＡの合成に適さないいくつかの構造の回避の必要性を考慮して一連のａｒＲＮＡ配列を設計した。ａｒＲＮＡを表８に示す。各ａｒＲＮＡはＣＭ０方式で化学的に修飾された。ＧＭ０６２１４細胞をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸでトランスフェクトしてから４８時間後、酵素活性の検出のためにサンプルを収集した（酵素活性検出法は実施例７と同じであり、結果はＧＭ０１３２３中のＩＤＵＡ酵素活性の倍数として示された）。実験結果は、図８に示すように、ターゲティングヌクレオシドの位置を６７ｎｔ、７０ｎｔ、及び７２ｎｔ ａｒＲＮＡ上で移動すると、全長は変化せず、５’末端の長さは４３ｎｔ～５５ｎｔであり、３’末端の長さは９ｎｔ～２５ｎｔである場合、ターゲティングヌクレオシド位置の移動は酵素活性に有意な影響を及ぼさなかった。すなわち、本実施例は、前述の好ましいａｒＲＮＡの長さ、５’の長さ、及び３’の長さの範囲内で、各ａｒＲＮＡが比較的良好な編集効率を達成できることを証明している。
Figure 2023521487000013
Figure 2023521487000014
Figure 2023521487000015
実施例９：編集効率に対するａｒＲＮＡ化学修飾の影響
まず、３つの長さのａｒＲＮＡ（５５－ｃ－１６（配列番号３０）、５５－ｃ－１４（配列番号３１）及び５５－ｃ－１１（配列番号３４）において、ａｒＲＮＡ編集効率に関するＣＭ１とＣＭ０の修飾の影響を比較した。前記ＣＭ１の修飾方法は次のとおりである。
ＣＭ１：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、配列内のすべてのＵは、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている。
その結果、図９Ａに示すように、ＣＭ１によって修飾されたａｒＲＮＡの編集効率は、ＣＭ０によって修飾されたａｒＲＮＡの編集効率よりも一般的に優れている。
そして、７１ｎｔと７６ｎｔの２つの好ましい長さのａｒＲＮＡを選択し、異なる修飾の組み合わせが編集効率に与える影響を調べた。具体的な修飾方法を以下に示し、具体的な配列及び修飾アノテーションを表９に示す。
ＣＭ２：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオシドは２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている；
ＣＭ３：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオシドは２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている；
ＣＭ４：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングトリプレットの３つの塩基とそれらの３’最近傍ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている；
ＣＭ５：ターゲティングヌクレオシド、５’末端及び５’末端に隣接する５つの塩基、ならびに３’末端及び３’末端に隣接する５つの塩基を除いて、すべてのヌクレオチドは２’－ＯＭｅによって修飾されるとともに、配列の最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエートによって修飾されている；
ＣＭ６：配列の最初の５ヌクレオチド及び最後の５ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の５ヌクレオチドと最後の５ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている。
異なるａｒＲＮＡをそれぞれｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸでＧＭ０６２１４細胞にトランスフェクトしてＩＤＵＡ ｍＲＮＡを編集した。トランスフェクション後４８時間の細胞を収集してＩＤＵＡ酵素活性の検出をした（酵素活性検出法は実施例７と同じであり、結果はＧＭ０１３２３中の酵素活性の倍数として示された）。図９Ｂに示す実験結果から見て、ＣＭ５を除いて、他の修飾の組み合わせの編集効率は、ＣＭ１修飾よりも優れている。
ＩＤＵＡ酵素活性の検出は、タンパク質レベルでＩＤＵＡタンパク質機能を回復するさまざまな長さのａｒＲＮＡの能力を比較できる。ＲＮＡレベルからａｒＲＮＡの編集能力を迅速に調査するために、本実施例では酵素切断法を使用してａｒＲＮＡの編集効率を検出した。具体的な方法は次のとおりである。ＩＤＵＡのｍＲＮＡ点突然変異の近くの部位の正常な配列にはＣＴＧＧが含まれており、それは突然変異後にＣＴＡＧになる。ＣＴＡＧの４つの塩基は制限エンドヌクレアーゼＢｆａＩ酵素切断部位であるため、導入されたａｒＲＮＡが細胞内で標的部位ＡからＧへの編集を実施した場合、制限エンドヌクレアーゼＢｆａＩ酵素切断部位ＣＴＡＧはＣＴＧＧに変換され、ＢｆａＩ酵素切断は発生しなくなる。細胞にａｒＲＮＡをトランスフェクトしてから４８時間後、細胞ゲノムを抽出して逆転写した。サンプルは、プライマーｈＩＤＵＡ－６２Ｆ：ＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＴＡＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号７８）及びｈＩＤＵＡ－６２Ｒ：ＣＣＡＧＧＧＣＴＣＧＡＡＣＴＣＧＧＴＡＧ（配列番号７９）を使用してＰＣＲに供した。ＰＣＲ産物を精製し、酵素切断のために回収した。酵素切断された生成物を２％アガロースを用いたゲル電気泳動にかけ、全体のグレー値に対するゲル画像上の未切断フラグメントのパーセンテージを計算することによって編集効率を計算した。図９Ｃに示すように、編集効率の結果は、ａｒＲＮＡ酵素活性の結果と一致する傾向を示している。
Figure 2023521487000016
Figure 2023521487000017
Figure 2023521487000018
実施例１０：ＣＭ１で修飾された５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１１ｎｔの濃度勾配実験
さまざまな濃度でのａｒＲＮＡの編集能力を調べるために、本実施例では、ＣＭ１で修飾された５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔ、及び５５ｎｔ－ｃ－１１ｎｔをテスト用に選択した。１６０ｎＭ、８０ｎＭ、４０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭ、０．６２５ｎＭの９種類の希釈濃度のａｒＲＮＡを取り、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを使用してＧＭ０６２１４細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞の酵素活性をテストし、遺伝子編集効率を次世代シーケンシングでテストした。図１０Ａに示すように、３つのａｒＲＮＡの酵素活性は全体的な傾向が基本的に同じであり、トランスフェクション濃度が１０ｎＭより高い場合、５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔ－ＣＭ１の酵素活性は他の２つのａｒＲＮＡの酵素活性よりも高かった。しかし、酵素活性の変曲点濃度は２０ｎＭ～５ｎＭの間であった。５ｎＭ未満である場合、編集効率は理想的ではなかった。図１０Ｂに示すように、次世代シーケンシングによって検出された編集効率の全体的な傾向は、酵素活性と一致していた。リポソームでトランスフェクトされたａｒＲＮＡの濃度は、好ましくは５ｎＭ以上、好ましくは１０ｎＭ以上、より好ましくは２０ｎＭ以上であることが分かる。
実施例１１：ＩＤＵＡはａｒＲＮＡ編集後にプロテアーゼ活性を維持可能
この実験では、ヒトＩＤＵＡの変異部位を標的とする３つの好ましいａｒＲＮＡを使用し、ＣＭ１方式で化学的に修飾し、ＧＭ０６２１４細胞で有意に増加したＩＤＵＡ酵素活性が得られ、約３週間以上持続した。
異なる時間でのＩＤＵＡ酵素活性及び編集効率の比較のために２０ｎＭの濃度を選択した。図１１Ａに示すように、ＧＭ０６２１４細胞のａｒＲＮＡトランスフェクション後、１４日間ＩＤＵＡ酵素活性を継続的に検出した。結果は、トランスフェクション後の酵素活性のピークが４日目から１０日目であり、主に４日目から９日目に集中することを示した。また、１４日目の酵素活性は２日目よりも高いので、１７日目と２１日目の酵素活性を検出した。図１２Ａから、２１日目の酵素活性は依然としてトランスフェクション後１日目より高く、酵素活性はＧＭ０１３２３の約６～１０倍であることが分かる。図１１ＢはＩＤＵＡ標的部位の編集効率を示している。図から、ａｒＲＮＡトランスフェクション後の編集効率は高いものから低いものまであり、最高のピークはトランスフェクション後の初日であり、約７０％の編集であり、トランスフェクション後１０日目の編集効率は対照群と同じであることが分かる。
したがって、２回目のトランスフェクションを１０～１４日目に行うと、ＩＤＵＡ酵素活性は１回目のトランスフェクションの２日目よりも高いレベルに維持されると推測しやすい。ただし、２回目のトランスフェクションを１７日目から２１日目に行うと、ＩＤＵＡ酵素の活性はＧＭ０１３２３の酵素の活性よりも少なくとも高くなり、細胞のＩＤＵＡ酵素活性は比較的正常なレベルに維持できる。
実施例１２：ヒト初代肝細胞上のａｒＲＮＡによるＩＤＵＡ（ｃ．１２０５－５ｂｐ）野生部位のインビトロ編集
この実験では、初代培養ヒト肝細胞でＬＥＡＰＥＲ技術を使用して野生型ＩＤＵＡ遺伝子座を編集する。本実施例では、ＣＡＧのＡを標的として編集し、本願の方法による肝細胞のＩＤＵＡの編集効率をテストした。ａｒＲＮＡの配列を表１０に示す。
ヒト肝臓初代細胞はＬＯＮＺＡ（カタログ番号：ＨＵＣＰＩ）から購入し、製造元の説明書に従って細胞を回復して培養した（回復培地カタログ番号：ＭＣＨＴ５０、プレーティング培地カタログ番号：ＭＰ１００）。細胞が付着した後、肝細胞維持培地５Ｃに変更した（参考文献：Ｘｉａｎｇ Ｃ， Ｄｕ Ｙ， Ｍｅｎｇ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１９， ３６４（６４３８）：３９９－４０２）。
ヒト肝細胞の付着培養の２４時間後、ａｒＲＮＡをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸでトランスフェクトした。ａｒＲＮＡのトランスフェクション濃度はそれぞれ２０ｎＭと４０ｎＭであった。サンプルは、トランスフェクションの０時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後にそれぞれ収集した。サンプル収集後、次世代シーケンシングによってサンプルの編集効率を検出した。図１２に示すように、ａｒＲＮＡトランスフェクション後のＩＤＵＡの編集効率が最大４０％に達せる。これは、本願の方法を使用して、ヒト肝細胞のＩＤＵＡ転写物の標的アデノシンを編集することの実現可能性と有効性を示している。
Figure 2023521487000019
実施例１３：化学修飾法及び長さの組み合わせの比較
本実施例では、ＧＭ０６２１４細胞のｃ．１２３９ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）変異部位を編集することにより、本願の方法を従来技術の好ましい方法と比較した。本願で説明されている方法の利点がさらに示されている。
配列及び修飾方法を表１１に示す。本出願に記載の方法の代表的な配列は５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ－ＣＭ１であり、先行技術（ＣＮ１１０３５２２４４Ａ）から選択された陽性対照配列は３６ｎｔ－ｃ－１３ｎｔ－ＣＭ１１である。その中で、３６ｎｔ－ｃ－１３ｎｔ－ＣＭ１１は、編集部位「ＣＣＡ」を除き、すべてのヌクレオチドは２’－Ｏ－Ｍｅによって修飾され、最初と最後の各４ヌクレオチド間はホスホロチオエート化された。さらに、本実施例では、本出願のＣＭ０修飾配列（５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ）及びＣＭ０修飾ランダム配列（Ｒａｎｄｏｍ－７０）も比較された。
本実施例では、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸを使用してａｒＲＮＡをＧＭ０６２１４細胞にトランスフェクトしてから４８時間後に、実施例７に示す方法を使用してＩＤＵＡ酵素活性を検出した。結果を図１３に示す。５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ－ＣＭ１は、３６ｎｔ－ｃ－１３ｎｔ－ＣＭ１１よりも有意に高い編集効率を持っていることがわかる。
Figure 2023521487000020
実施例１４：ａｒＲＮＡ編集効率に対する末端修飾の影響
本実施例では、ＣＭ１に基づいて、ａｒＲＮＡの両端に異なる量の２’ＭＯＥ及びＬＮＡ修飾を行い、ＣＭ１修飾と比較した。ここで、２’ＭＯＥは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾を指す。
表１２に示すように、配列５５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ（配列番号２６）は、それぞれＣＭ１、ＣＭ１４８、ＣＭ１４９、ＣＭ１５０、ＣＭ１５１、ＣＭ１５２及びＣＭ１５３によって修飾され、本実施例の試験に使用された。本実施例では、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸを使用してａｒＲＮＡをＩＤＵＡレポーター細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション濃度は２０ｎＭであった。蛍光強度は、それぞれ４８時間（２日目）及び１６８時間（７日目）後にフローサイトメトリーによって測定された。結果を図１４に示す。ＣＭ１５１の編集効率が有意に高く、ＣＭ１４８がそれに続き、さらに、ＣＭ１４８、ＣＭ１４９、ＣＭ１５０、ＣＭ１５１、ＣＭ１５２、及びＣＭ１５３はすべて、ＣＭ１の修飾方法よりも優れていることが分かる。
本実施例で使用されている具体的な修飾方法（ＣＭ１は上記のとおり）は次のとおりである。
ＣＭ１４８：配列の最初の４ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の３ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１４９：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１５０：配列の最初の２ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の１ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１５１：配列の最初の４ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の３ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１５２：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
ＣＭ１５３：配列の最初の２ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている。
Figure 2023521487000021
Figure 2023521487000022
実施例１５：ａｒＲＮＡ編集効率に対するチオ、ジメトキシ、及びデオキシリボヌクレオシド置換の組み合わせの修飾の影響
本実施例では、ａｒＲＮＡにより多くのホスホロチオエートと２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を追加し、デオキシリボヌクレオシド置換を導入しようとしている。
具体的な配列修飾は次の通りである。
ＣＭ７１：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－ＯＭｅで修飾され、配列のすべてのＵと、ターゲティングトリプレットを除くすべてのＣは２’－ＯＭｅで修飾され、最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートによって修飾されている。
ＣＭ９４：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端の４番目のヌクレオチド間結合から３’末端の３番目のヌクレオチド間結合まで、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’最近傍ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されている。
ＣＭ１０４：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル化によって修飾され、配列のすべてのＵと、ターゲティングトリプレットを除くすべてのＣは配列内で２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’最近傍ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合はホスホロチオエートで修飾されている。
ＣＭ１０５：ＣＭ１０４のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングヌクレオチドＣはデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
ＣＭ１０６：ＣＭ１０４のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
ＣＭ１０７：ＣＭ９４のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングヌクレオチドＣはデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
ＣＭ１０８：ＣＭ９４のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
ＣＭ１１４：ＣＭ９４のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’最近傍ヌクレオチド間結合もホスホロチオエートで修飾されている。
ＣＭ１１５：ＣＭ９４のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの３’最近傍ヌクレオチド間結合もホスホロチオエートで修飾されている。
ＣＭ１１６：ＣＭ９４のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングヌクレオチドの５’最近傍ヌクレオチドの５’最近傍ヌクレオチド間結合もホスホロチオエートで修飾されている。
ＣＭ１１７：ＣＭ９４のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングヌクレオチドの３’最近傍ヌクレオチド間結合もホスホロチオエートで修飾されている。
ＣＭ１１８：ＣＭ１１５のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングヌクレオチドＣはデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
ＣＭ１１９：ターゲティングヌクレオチドＣの５’末端ヌクレオチド間結合はホスホロチオエートで修飾されていないこと以外に、その他の修飾はＣＭ１１８と同じである。
ＣＭ１２０：ＣＭ１１６のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングヌクレオチドＣはデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
ＣＭ１２１：ＣＭ１１７のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングヌクレオチドＣはデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
ＣＭ１２２：ＣＭ１１４のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングトリプレットヌクレオチドはいずれもデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
ＣＭ１２３：ターゲティングトリプレットヌクレオチドはいずれもデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている他、その他の修飾はＣＭ１１９と同じである。
ＣＭ１２４：ＣＭ１１６のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングトリプレットヌクレオチドはいずれもデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
ＣＭ１２５：ＣＭ１１７のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングトリプレットヌクレオチドはいずれもデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
本実施例で使用されている配列５５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ（配列番号２６）及び修飾アノテーションを表１３に示す。本実施例では、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸを使用してａｒＲＮＡをＩＤＵＡ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション濃度は２０ｎＭであった。そして、７２、１２０、及び１６８時間後、フローサイトメトリーによって蛍光強度を測定した。結果を図１５に示す。ＣＭ９４、ＣＭ１２３、ＣＭ１２５は編集効率が有意に高く、ＣＭ１１９とＣＭ１２０はＣＭ１よりも安定しており、高い編集効率を長期間維持できる。
Figure 2023521487000023
Figure 2023521487000024
Figure 2023521487000025
Figure 2023521487000026

Claims (31)

  1. ＬＥＡＰＥＲ技術に基づく細胞中の標的ＲＮＡのターゲティング編集のための方法であって、前記標的ＲＮＡが、グアノシン（Ｇ）からアデノシン（Ａ）への変異部位（標的アデノシン）を含むα－Ｌ－イズロニダーゼ（α－Ｌ－ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ，ＩＤＵＡ）の遺伝子転写配列を含み、前記方法が、
    ａｒＲＮＡまたは前記ａｒＲＮＡコード配列を含む構築物を前記細胞に導入することを含み、前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは前記標的ＲＮＡにハイブリダイズした後、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる、
    前記方法。
  2. 標的アデノシンに対向する前記ａｒＲＮＡ上のヌクレオシド（ターゲティングヌクレオシド）が、シチジン（Ｃ）、アデノシン（Ａ）、またはウリジン（Ｕ）である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記標的アデノシンが、その５’最近傍ヌクレオシド及び３’最近傍ヌクレオシドと標的トリプレットを形成し、前記標的トリプレットが５'－ＵＡＧ－３’である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオシドがＣ、ＧまたはＵである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオシドがＡである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ターゲティングヌクレオシドが、その５’最近傍ヌクレオシド及び３’最近傍ヌクレオシドとターゲティングトリプレットを形成し、前記ターゲティングトリプレットが５'－ＣＣＡ－３’である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ａｒＲＮＡの長さが６１ｎｔ～１２１ｎｔから選択される任意の整数のｎｔである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ａｒＲＮＡの３’末端からの前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドの距離が、前記ａｒＲＮＡの５’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離よりも短い、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その３’末端からの距離が、９ｎｔ～６０ｎｔから選択される任意の整数のｎｔである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記ａｒＲＮＡのターゲティングヌクレオシドは、その５’末端からの距離が、２５ｎｔ～６０ｎｔから選択される任意の整数のｎｔである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ａｒＲＮＡが、
    ５５ｎｔ－ｃ－３５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２１ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１９ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１８ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１７ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１３ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１２ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１１ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－９ｎｔ、５０ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５０ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、または４５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔから選択されるいずれかの長さ特徴を有するａｒＲＮＡであり、ＣはａｒＲＮＡの標的アデノシンに対向するターゲティングヌクレオシドであり、ａｒＲＮＡの方向は５’から３’の方向である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ａｒＲＮＡが、５５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔから選択されるいずれかの長さ特徴を有するａｒＲＮＡである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ａｒＲＮＡが１つまたは複数の化学修飾を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記化学修飾が、
    ２'－Ｏ－メチル化修飾、ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、デオキシリボヌクレオシド置換修飾、ＬＮＡ修飾、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾から選択される１つまたは複数である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記化学修飾が、
    １）最初の２、３、４または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
    ２）最後の２、３、４、または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
    ３）ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの２’－Ｏ－メチル化修飾、
    ４）最初の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
    ５）最後の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
    ６）最初の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
    ７）最後の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
    ８）最初の１、２、３、４または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
    ９）最後の１、２、３、４、または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
    １０）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、及び
    １１）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、１、２、３、または４ヌクレオチドの間隔でのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾
    から選択される１つまたは複数である、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 前記ａｒＲＮＡは、以下の群から選択されるいずれかの化学修飾を含む：
    ＣＭ０：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートよって修飾されている；
    ＣＭ１：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、配列内のすべてのＵは、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている；
    ＣＭ２：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオシドは２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている；
    ＣＭ３：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオシドは２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている；
    ＣＭ４：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングトリプレットの３つの塩基とそれらの３’最近傍ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている；
    ＣＭ６：配列の最初の５ヌクレオチド及び最後の５ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の５ヌクレオチドと最後の５ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている；
    ＣＭ１４８：配列の最初の４ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の３ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
    ＣＭ１４９：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
    ＣＭ１５０：配列の最初の２ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の１ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
    ＣＭ１５１：配列の最初の４ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の３ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
    ＣＭ１５２：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
    ＣＭ１５３：配列の最初の２ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
    ＣＭ９４：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端の４番目のヌクレオチド間結合から３’末端の３番目のヌクレオチド間結合まで、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’最近傍ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されている；
    ＣＭ１１９：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端の４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合及び３’末端の３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチドまで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる；
    ＣＭ１２０：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端の４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオチド間結合及び３’末端の３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合まで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる；
    ＣＭ１２３：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端の４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合及び３’末端の３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチドまで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる；
    ＣＭ１２５：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合及び標的ヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエートで修飾されており、５’末端の４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオチドの５’最近傍ヌクレオチドまで、及び３’末端の３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチドまで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる、
    請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ａｒＲＮＡの標的となるＧからＡへの変異部位は、ハーラー症候群患者のゲノムにおけるＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）の変異部位、またはそれに対応する変異部位である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ａｒＲＮＡが、下記のものから選択される任意の配列を含み、＊はホスホロチオエート修飾を表し、ｍは２’－Ｏ－メチル化修飾を表し、ｍｏｅは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾を表し、＋はＬＮＡ修飾を表し、ｄはデオキシリボヌクレオシド置換を表す、
    １）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ＊Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
    ２）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊－Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｇ＊－Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｃｄ－Ｃｄ＊Ａｄ＊－Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
    ３）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊－Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊－Ｃｍ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ－Ｃｄ－Ｃｄ＊Ａｄ＊Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
    ４）Ｇｍｏｅ＊Ａｍｏｅ＊Ｃｍｏｅ＊Ｇｍｏｅ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｕｍ－ＧＣ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｃ＊Ｃｍｏｅ＊Ｕｍｏｅ＊Ｃｍｏｅ＊Ａｍｏｅ（配列番号３１）；または
    ５）Ｇ＋＊Ａ＋＊Ｃ＋＊Ｇ＋Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｕｍ－ＧＣ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｃ＊Ｃ＋＊Ｕ＋＊Ｃ＋＊Ａ＋（配列番号３１）
    請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ａｒＲＮＡが、エレクトロトランスフェクション、リポフェクション、エクソソーム送達、または脂質－ナノ粒子送達（ＬＮＰ）からなる群から選択されるいずれかの方法によって前記細胞に導入される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記ａｒＲＮＡが一回あたり５～１６０ｎＭの量で細胞に導入される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記ａｒＲＮＡが前記細胞に複数回導入され、２つの導入が２１日以内に隔てられている、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法を使用して、ハーラー症候群の病原性Ｇ＞Ａ突然変異を修正することを含む、ハーラー症候群を予防または治療する方法。
  23. ＬＥＡＰＥＲテクノロジーに基づいて細胞中の標的ＲＮＡをターゲティング編集するために操作されたａｒＲＮＡであって、前記標的ＲＮＡはグアノシン（Ｇ）からアデノシン（Ａ）への変異部位（標的アデノシン）を含むα－Ｌ－イデュロニダーゼ（α－Ｌ－ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ、ＩＤＵＡ）の遺伝子転写配列を含み、前記ａｒＲＮＡは前記標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡは前記標的ＲＮＡにハイブリダイズした後、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができ、前記ａｒＲＮＡの標的となるＧからＡへの変異部位は、ハーラー症候群患者のゲノムにおけるＮＭ＿０００２０３．４（ＩＤＵＡ）－ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）の変異部位、またはそれに対応する変異部位である、前記ａｒＲＮＡ。
  24. 前記ａｒＲＮＡが、
    ５５ｎｔ－ｃ－３５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２１ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１９ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１８ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１７ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１６ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１４ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１３ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１２ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１１ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－１０ｎｔ、５５ｎｔ－ｃ－９ｎｔ、５０ｎｔ－ｃ－２０ｎｔ、５０ｎｔ－ｃ－１５ｎｔ、または４５ｎｔ－ｃ－２０ｎｔから選択されるいずれかの長さ特徴を有するａｒＲＮＡであり、ＣはａｒＲＮＡの標的アデノシンに対向するターゲティングヌクレオシドであり、ａｒＲＮＡの方向は５’から３’の方向である、請求項２３に記載のａｒＲＮＡ。
  25. 前記ａｒＲＮＡが１つまたは複数の化学修飾を含む、請求項２３または２４に記載のａｒＲＮＡ。
  26. 前記化学修飾が、
    ２'－Ｏ－メチル化修飾、ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、デオキシリボヌクレオシド置換修飾、ＬＮＡ修飾、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾から選択される１つまたは複数である、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のａｒＲＮＡ。
  27. 前記化学修飾が、
    １）最初の２、３、４または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
    ２）最後の２、３、４、または５ヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化修飾、
    ３）ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの２’－Ｏ－メチル化修飾、
    ４）最初の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
    ５）最後の２、３または４ヌクレオチドの２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾、
    ６）最初の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
    ７）最後の２、３または４ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
    ８）最初の１、２、３、４または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
    ９）最後の１、２、３、４、または５ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
    １０）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、及び
    １１）ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’または３’最近傍ヌクレオチド間結合の１つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、１、２、３、または４ヌクレオチドの間隔でのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾
    から選択される１つまたは複数である、請求項２３～２６のいずれか一項に記載のａｒＲＮＡ。
  28. 前記ａｒＲＮＡは、以下から選択されるいずれかの化学修飾を含む：
    ＣＭ０：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートよって修飾されている；
    ＣＭ１：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、配列内のすべてのＵは、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている；
    ＣＭ２：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオシドは２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている；
    ＣＭ３：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオシドは２’－Ｏ－メチル化によって修飾されている；
    ＣＭ４：配列の最初の３ヌクレオチド及び最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の３つ及び最後の３つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングトリプレットの３つの塩基とそれらの３’最近傍ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている；
    ＣＭ６：配列の最初の５ヌクレオチド及び最後の５ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の５ヌクレオチドと最後の５ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている；
    ＣＭ１４８：配列の最初の４ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の３ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
    ＣＭ１４９：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
    ＣＭ１５０：配列の最初の２ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチドはそれぞれ２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）で修飾されており、最初の１ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのＵは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
    ＣＭ１５１：配列の最初の４ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の３ヌクレオチドと最後の４ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
    ＣＭ１５２：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
    ＣＭ１５３：配列の最初の２ヌクレオチドと最後の２ヌクレオチドはそれぞれＬＮＡで修飾されており、最初の２ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されている；
    ＣＭ９４：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端の４番目のヌクレオチド間結合から３’末端の３番目のヌクレオチド間結合まで、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの５’最近傍ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されている；
    ＣＭ１１９：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端の４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合及び３’末端の３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチドまで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる；
    ＣＭ１２０：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端の４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオチド間結合及び３’末端の３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合まで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる；
    ＣＭ１２３：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、５’末端の４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合及び３’末端の３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチドまで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる；
    ＣＭ１２５：配列の最初の３ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド、配列のすべてのＵ、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのＣはいずれも、２’－Ｏ－メチル化によって修飾されており、最初の４ヌクレオチドと最後の３ヌクレオチド間結合及び標的ヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエートで修飾されており、５’末端の４番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの５’最近傍ヌクレオチドの５’最近傍ヌクレオチドまで、及び３’末端の３番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの３’最近傍ヌクレオチドまで、１ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる、
    請求項２３～２７のいずれか一項に記載のａｒＲＮＡ。
  29. 前記ａｒＲＮＡが、下記のものから選択される任意の配列を含み、＊はホスホロチオエート修飾を表し、ｍは２’－Ｏ－メチル化修飾を表し、ｍｏｅは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾を表し、＋はＬＮＡ修飾を表し、ｄはデオキシリボヌクレオシド置換を表す、
    １）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ＊Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
    ２）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊－Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｇ＊－Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｃｄ－Ｃｄ＊Ａｄ＊－Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
    ３）Ｇｍ＊Ａｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ａ＊Ｇ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊－Ｇ－Ｇ＊Ｕｍ－Ｃｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｇ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊－Ｃｍ－Ｇ＊Ａ－Ｃｍ＊Ａ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｇ＊Ｇ－Ｃｍ－Ｃｄ－Ｃｄ＊Ａｄ＊Ｇ－Ａ＊Ｇ－Ｃｍ＊Ｕｍ－Ｇ＊Ｃｍ－Ｕｍ＊Ｃｍ－Ｃｍ＊Ｕｍ＊Ｃｍ＊Ａｍ（配列番号３１）；
    ４）Ｇｍｏｅ＊Ａｍｏｅ＊Ｃｍｏｅ＊Ｇｍｏｅ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｕｍ－ＧＣ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｃ＊Ｃｍｏｅ＊Ｕｍｏｅ＊Ｃｍｏｅ＊Ａｍｏｅ（配列番号３１）；または
    ５）Ｇ＋＊Ａ＋＊Ｃ＋＊Ｇ＋Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｕｍ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｕｍ－ＧＣ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｕｍ－Ｕｍ－Ｃ－Ｇ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｇ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｇ－Ｃ－Ｕｍ－Ｃ＊Ｃ＋＊Ｕ＋＊Ｃ＋＊Ａ＋（配列番号３１）
    請求項２３～２８のいずれか一項に記載のａｒＲＮＡ。
  30. 請求項２３または２４に記載のａｒＲＮＡコード配列を含む構築物。
  31. 請求項２３～２９のいずれか一項に記載のａｒＲＮＡまたは請求項３０に記載の構築物を含む組成物、リポソーム、エクソソーム、脂質ナノ粒子、細胞、ライブラリーまたはキット。
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