JP2023521487A - ハーラー症候群を治療するための方法及び薬物 - Google Patents

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Abstract

LEAPER技術に基づく核酸薬物、及び核酸薬物を使用してRNAを標的として編集してハーラー症候群(Hurler syndrome)などの疾患を治療する方法である。この方法は、核酸薬物を使用したRNA上のアデノシンからヒポキサンチン塩基への編集、ハーラー症候群(Hurler syndrome)などの病原性G>A変異部位の正確な修復、インビボでのIDUAなどの、RNAによってコードされたタンパク質の正常発現の回復を含む。【選択図】図13

Description

本願は、遺伝子編集治療の分野に属し、特に、LEAPER(Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA;RNAのプログラム可能な編集のための内因性ADARの活用)技術に基づいてRNAをターゲティング編集し、病原性変異を修復する方法に関し、該方法は、ハーラー症候群などのG>A変異による疾患を予防または治療するために、LEAPER技術を使用してRNAのAからI塩基への部位特異的編集を含む。
ムコ多糖症IH(Mucopolysaccharidoses IH,MPS IH)としても知られるハーラー症候群(Hurler syndrome)は、MPSIの、IH、IH/S、及びISの3つのサブタイプの中で最も重篤な1つであり、これは、この疾患の患者体内のα-L-イズロニダーゼ(α-L-iduronidase,IDUA)の欠如によって引き起こされる、障害を起こし致命的な遺伝性代謝疾患であり、常染色体劣性遺伝性疾患(autosomal recessive,AR,AR)である。ハーラー症候群の根本的な原因は、IDUAタンパク質をコードするヒト4番染色体上の4p16.3でのIDUA遺伝子変異であり、これまでに200余りの病原性変異があり、その中で最も一般的なタイプはα-L-イズロニダーゼcDNAの1205位でのGからAへの変異である。この変異により、元のトリプトファンが終止コドンに変化し、最終的に翻訳されたタンパク質は、この部位以降のすべてのアミノ酸(NM_000203.4(IDUA)-c.1205G-A(p.Trp402Ter))を欠き、IDUAのすべての酵素活性を失う。この突然変異タイプは、人口の総発生率の63%を占め得る(Worldwide distribution of common IDUA pathogenic variants,Poletto, Edina (2018). Clinical Genetics. 94. 10.1111/cge.13224.)。IDUAは、細胞のリソソーム(lysosome)におけるグリコサミノグリカン(Glycosaminoglycan、GAG)の分解に関与している。ハーラー症候群の患者は個人によって大きく異なり、出生時には正常である可能性があり、3~6か月の初期の兆候は、顔の輪郭が粗く、その後に前頭骨の突出、骨格の変形、成長停止、言語の壁などの症状が続き、患者は通常10歳以上生きていない。
現在ハーラー症候群を治癒する方法はなく、酵素補充療法(ERT)と造血幹細胞移植(HSCT)との、承認されている2つの治療法が知られている。ERTは、肝臓のサイズの縮小、呼吸機能の改善、患者の可動性の全体的な改善など、内臓の表現型に関して良好な結果を達成している。不利なことに、それは中枢神経系に到達することができないため、認知障害を防ぐことができない。一方、HSCTが成功すると、神経系症状を含むほとんどの臨床症状が予防され得るが、臨床症状が現れる前に(できれば生後8か月前に)治療する必要がある。この治療法の死亡率が高いため、重症患者のみに適している(Combination of enzyme replacement and hematopoietic stem cell transplantation as therapy for Hurler Syndrome. Tolar, J (2008). Bone marrow transplantation. 41. 531-5. 10.1038/sj.bmt.1705934)。
現在、ハーラー症候群の治療のために研究されている遺伝子編集技術の原理は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(zinc finger nuclease,ZFN)及びアデノ随伴ウイルス(Adeno-associated virus、AAV)を使用して、正常なIDUAタンパク質をコードするcDNA配列を肝細胞のゲノムに部位特異的に挿入することであるが、この方法ではハーラー症候群の脳や骨格系の症状を解決することはできない。
また、DNA編集による治療は治療法の開発にとって比較的有望なアイデアであるが、それによって発生し得るオフターゲット(оff-target)は注意が必要な問題である。理論的には、急速に発展しているゲノム編集技術CRISPR(クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート、Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)もハーラー症候群の治療に使用できる。多くの研究者やバイオテクノロジー企業も、この技術を臨床に持ち込むために努力している。例えば、2019年9月に、CRISPR技術を使用して幹細胞を編集し、AIDSと白血病の治療のために患者に再注入する臨床試験の結果が初めて報告され、CRISPR技術の遺伝子治療の方向への変換に大きく貢献した。CRISPR技術には大きな潜在的な応用の見通しがあるが、一連の欠陥もあり、科学研究段階から臨床治療応用へのこの技術の変換を困難にしている。問題の1つは、CRISPR技術に使用する核心的な酵素Casである。CRISPRに基づくDNA編集技術では、Cas9または同様の機能を持つ他のヌクレアーゼの外因性発現が必要であり、これにより以下の問題が発生する。第一に、通常外因性発現を必要とするヌクレアーゼは、通常、高分子量を有し、これは、ウイルスベクターを介した体内へのそれらの送達の効率を劇的に低下させる。第二に、ヌクレアーゼの外因性発現のために、潜在的なヌクレアーゼのオフターゲットの可能性があり、それによりその適用には潜在的な発癌性のリスクがあるのであろう。最後に、外因的に発現されたヌクレアーゼは細菌に見られ、ヒトや哺乳動物には自然に存在しないため、患者に免疫応答を誘発し得、患者自身に損傷を与える可能性がある一方、外因的に発現されたヌクレアーゼが中和され、それによってその本来の活性を失うか、またはさらなる介入療法を妨げる可能性がある。
2017年、張鋒のグループは、REPAIR(プログラム可能なAからIへの置換のためのRNA編集、RNA Editing for Programmable A to I Replacement)と呼ばれるRNA編集技術を報告した(RNA editing with CRISPR-Cas13,Cox et al., 2017)。この技術は、Cas13-ADAR融合タンパク質とシングルガイドRNA(single guide RNA、sgRNA)の外因性発現により、AからIへの標的ターゲットRNAの編集も実現できるが、CRISPR技術と同様に、この方法でも外因性タンパク質の編集が必要であり、外来タンパク質の発現による問題を解決できない。
2017年、国際出願PCT/EP2017/071912は、インビボ編集により適した方法を開示した。この方法は外因性タンパク質を必要とせず、標的部位の配列に相補的なRNAの短い断片を細胞に導入することのみにより、ADARタンパク質を動員してRNA標的部位を編集することができる。この方法で使用される相補的RNAは短い(54nt未満)が、複雑な化学修飾を必要とし、編集効率は高くない。
2019年1月、Thorsten Stafforstのグループは、RESTOREと呼ばれる核酸編集技術を報告した(recruiting endogenous ADAR to specific trans for oligonucleotide-mediated RNA editing, Merkle et al., 2019)。この技術は、外来タンパク質への依存を取り除くことができる。しかし、まず第一に、RESTORE技術はIFN-γの存在下でしか高い編集効率を備えることができず、IFN-γは自己免疫の発達と重症度を決定する重要な要素であり(Interferon-γ and systemic autoimmunity, Pollard et al., 2013)、医療分野でのこの技術の適用を大幅に減らす。
RNA編集方法は、PCT/CN2018/110105、PCT/CN/2019/082713、PCT/CN/2019/110782に記載されており、「LEAPER」(Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA;RNAのプログラム可能な編集のための内因性ADARの活用)技術と呼ばれ、標的部位の配列に相補的なRNAを細胞に導入することにより、ADARタンパク質を動員してRNA標的部位を編集する技術である。この技術で使用される標的部位の配列に相補的なRNAは、修飾を加えることなく、標的部位のより効率的なRNA編集を刺激することができる。
従来技術には異なる遺伝子またはRNA編集方法があるが、ハーラー症候群などの特定の疾患について、どの方法が実際に病原性突然変異の修復を達成し、臨床応用のレベルに達することができるかがこの分野で探求されてきた。
本願は、α-L-イズロニダーゼ(α-L-iduronidase,IDUA)遺伝子のG>A変異によって引き起こされるハーラー症候群に対して、LEAPER技術に基づく細胞内の変異を含む標的RNAのターゲティング編集のための方法を提供する。本出願の方法により、IDUA遺伝子のG>A変異の高い編集効率を達成し、病原性G>A変異を修正し、IDUAのレベルと活性をある程度回復させることが可能であり、ハーラー症候群の効果的な治療に全く新しい道を開く。
具体的には、本願は下記の項に関する。
1、LEAPER技術に基づく細胞中の標的RNAのターゲティング編集のための方法であって、前記標的RNAが、グアノシン(G)からアデノシン(A)への変異部位(標的アデノシン)を含むα-L-イズロニダーゼ(α-L-iduronidase,IDUA)遺伝子転写物配列を含み、前記方法が、
arRNAまたは前記arRNAコード配列を含む構築物を前記細胞に導入することを含み、前記arRNAは、前記標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記arRNAは前記標的RNAにハイブリダイズした後、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することができる、
方法。
2、標的アデノシンに対向する前記arRNA上のヌクレオシド(ターゲティングヌクレオシド)が、シチジン(C)、アデノシン(A)、またはウリジン(U)である、項1に記載の方法。一部の実施形態では、標的アデノシンに対向する前記ヌクレオシドがCである。
3、前記標的アデノシンが、その5’最近傍ヌクレオシド及び3’最近傍ヌクレオシドと標的トリプレットを形成し、前記標的トリプレットが5'-UAG-3’である、項1または2に記載の方法。
4、前記ターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオシドがC、GまたはUである、項1~3のいずれか一項に記載の方法。
5、前記ターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオシドがAである、項1~4のいずれか一項に記載の方法。
6、前記ターゲティングヌクレオシドが、その5’最近傍ヌクレオシド及び3’最近傍ヌクレオシドとターゲティングトリプレットを形成し、前記ターゲティングトリプレットが5'-CCA-3’である、項1~5のいずれか一項に記載の方法。
7、前記arRNAの長さが61ntを超え、例えば、前記arRNAの長さが62nt~121nt、62~111nt、62~101nt、62~91nt、62~81ntまたは62~76ntである、項1~6のいずれか一項に記載の方法。一部の実施形態では、前記arRNAの長さが62~121ntから選択される任意の整数のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、前記arRNAの長さが62nt、63nt、64nt、65nt、66nt、67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、77nt、78nt、79nt、80nt、81nt、82nt、83nt、84nt、85nt、86nt、87nt、88nt、89nt、90nt、92nt、95nt、98nt、100nt、103ntまたは106ntである。
8、前記arRNAの3’末端からの前記arRNAのターゲティングヌクレオシドの距離が、前記arRNAの5’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離よりも短い、項1~7のいずれか一項に記載の方法。一部の実施形態では、前記arRNAの3’末端からの前記arRNAのターゲティングヌクレオシドの距離が、前記arRNAの5’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離に等しい。一部の実施形態では、前記arRNAの3’末端からの前記arRNAのターゲティングヌクレオシドの距離が、前記arRNAの5’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離よりも長い。
9、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その3’末端からの距離が8ntを超え、例えば、9~60nt、好ましくは9~45ntまたは9~35ntである、項1~8のいずれか一項に記載の方法。一部の実施形態では、非常に長いpоly G構造をなるべく避けるために、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その3’末端からの距離が、9~25nt、9~26ntまたは9~27ntから選択される。好ましくは、一部の実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その3’末端からの距離が、9~20nt、9~21ntまたは9~22ntから選択される。特定の実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その3’末端からの距離が、9~25ntから選択される任意の整数のヌクレオチドであり、例えば、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、または24ntである。
10、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その5’末端からの距離が25ntを超え、例えば、26~60nt、35~60nt、または45~60ntである、項1~9のいずれか一項に記載の方法。一部の実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その5’末端からの距離が、45nt、45nt、46nt、47nt、48nt、49nt、50nt、51nt、52nt、53nt、54nt、55nt、56nt、57nt、58nt、または59ntから選ばれる。
11、前記arRNAの5’末端からの前記arRNAのターゲティングヌクレオシドの距離が、前記arRNAの3’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離よりも短い、項1~7のいずれか一項に記載の方法。
12、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その5’末端からの距離が35ntを超え、例えば、36~60ntまたは36~55ntである、項11に記載の方法。好ましくは、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その5’末端からの距離が、54nt、53nt、52nt、51nt、50nt、49nt、48nt、47nt、46nt、45nt、44nt、43nt、42nt、41nt、40nt、39nt、38nt、または36ntから選択される。
13、前記arRNAが、
55nt-c-35nt、55nt-c-25nt、55nt-c-24nt、55nt-c-21nt、55nt-c-20nt、55nt-c-19nt、55nt-c-18nt、55nt-c-17nt、55nt-c-16nt、55nt-c-15nt、55nt-c-14nt、55nt-c-13nt、55nt-c-12nt、55nt-c-11nt、55nt-c-10nt、55nt-c-9nt、50nt-c-20nt、50nt-c-15nt、または45nt-c-20ntから選択されるいずれかの長さ特徴を有するarRNAである、項1~12のいずれか一項に記載の方法。
14、前記arRNAが、55nt-c-20nt、55nt-c-15nt、55nt-c-14ntから選択されるいずれかの長さ特徴を有するarRNAである、項1~13のいずれか一項に記載の方法。
15、前記arRNAが1つまたは複数の化学修飾を含む、項1~14のいずれか一項に記載の方法。
16、前記化学修飾が、
2'-O-メチル化修飾、ホスホロチオエート修飾、デオキシリボヌクレオシド置換修飾、LNA修飾、2’-O-(2-メトキシエチル)修飾から選択される1つまたは複数である、項15に記載の方法。
17、前記化学修飾が、
1)最初の2、3、4または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
2)最後の2、3、4、または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
3)ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの2’-O-メチル化修飾、
4)最初の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
5)最後の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
6)最初の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
7)最後の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
8)最初の1、2、3、4または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
9)最後の1、2、3、4、または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
10)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、及び
11)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、1、2、3、または4ヌクレオチドの間隔でのヌクレオチド間結合ホスホロチオエート修飾
から選択される1つまたは複数である、項15または16に記載の方法。
18、前記化学修飾が、
1)最初の2、3、4または5ヌクレオチド及び最後の2、3、4、または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
2)ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの2’-O-メチル化修飾、
3)最初の2、3または4ヌクレオチド及び最後の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
4)最初の2、3または4ヌクレオチド及び最後の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
5)最初の1、2、3、4または5ヌクレオチド間結合及び最後の1、2、3、4、または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
6)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合または多くとも1ヌクレオチド間結合の間隔でのホスホロチオエート修飾
から選択される1つまたは複数である、項17に記載の方法。
19、前記arRNAは、以下から選択されるいずれかの化学修飾を含む:
CM0:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートよって修飾されている;
CM1:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、配列内のすべてのUは、2’-O-メチル化によって修飾されている;
CM2:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオシドは2’-O-メチル化によって修飾されている;
CM3:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオシドは2’-O-メチル化によって修飾されている;
CM4:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングトリプレットの3つの塩基とそれらの3’最近傍ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている;
CM6:配列の最初の5ヌクレオチド及び最後の5ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の5ヌクレオチドと最後の5ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている;
CM148:配列の最初の4ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の3ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
CM149:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
CM150:配列の最初の2ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の1ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
CM151:配列の最初の4ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の3ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている;
CM152:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている;
CM153:配列の最初の2ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている;
CM94:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端からの4番目のヌクレオチド間結合から3’末端からの3番目のヌクレオチド間結合まで、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’最近傍ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されている;
CM119:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端からの4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合及び3’末端からの3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチドまで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる;
CM120:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端からの4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオチド間結合及び3’末端からの3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合まで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる;
CM123:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端からの4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合及び3’末端からの3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチドまで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる;
CM125:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合及び標的ヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエートで修飾されており、5’末端からの4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオチドの5’最近傍ヌクレオチドまで、及び3’末端からの3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチドまで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる、
項15~18のいずれか一項に記載の方法。
20、前記arRNAの標的となるGからAへの変異部位は、ハーラー症候群患者のゲノムにおけるNM_000203.4(IDUA)-c.1205G>A(p.Trp402Ter)の変異部位、またはそれに対応する変異部位である、項1~19のいずれか一項に記載の方法。
21、前記arRNAが、下記のものから選択されるいずれかの配列を含む、
1)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*Cm-G*A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm-C-C-A*G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
2)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*-Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*Cm-G*-A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm*Cd-Cd*Ad*-G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
3)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*-G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*-Cm-G*A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm-Cd-Cd*Ad*G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
4)Gmoe*Amoe*Cmoe*Gmoe-C-C-C-A-C-C-G-Um-G-Um-G-G-Um-Um-G-C-Um-G-Um-C-C-A-G-G-A-C-G-G-Um-C-C-C-G-G-C-C-Um-GC-G-A-C-A-C-Um-Um-C-G-G-C-C-C-A-G-A-G-C-Um-G-C-Um-C*Cmoe*Umoe*Cmoe*Amoe(配列番号31);または
5)G+*A+*C+*G+C-C-C-A-C-C-G-Um-G-Um-G-G-Um-Um-G-C-Um-G-Um-C-C-A-G-G-A-C-G-G-Um-C-C-C-G-G-C-C-Um-GC-G-A-C-A-C-Um-Um-C-G-G-C-C-C-A-G-A-G-C-Um-G-C-Um-C*C+*U+*C+*A+(配列番号31)
項1~20のいずれか一項に記載の方法。
22、前記arRNAが、エレクトロトランスフェクション、リポフェクション、エクソソーム送達、または脂質-ナノ粒子送達(LNP)からなる群から選択されるいずれかの方法によって前記細胞に導入される、項1~21のいずれか一項に記載の方法。
23、前記arRNAが、一回あたり5nM以上、好ましくは10nM以上、より好ましくは20nM以上の量で細胞に導入される、項1~22のいずれか一項に記載の方法。特定の実施形態では、前記arRNAが、一回あたり5~160nM、例えば、10~160nM、20~160nM、40~160nM、20~80nM、40~80nM、または20~40nMの量で細胞に導入される。特定の実施形態では、前記arRNAが、一回あたり15nM、17nM、19nM、21nM、22nM、23nM、24nM、25nM、26nM、27nM、28nM、29nM、30nM、31nM、32nM、33nM、34nM、35nM、36nM、37nM、38nM、39nM、41nM、43nM、45nM、55nM、65nM、75nM、85nM、95nM、105nM、115nM、125nM、135nM、145nMまたは155nMの量で細胞に導入される。
24、前記arRNAが前記細胞に複数回導入され、2回の導入が21日以上、例えば、17日以上、14日以上、12日以上、11日以上、または10日以上に隔てられている、項1~23のいずれか一項に記載の方法。一部の実施形態では、前記2回の導入が9~20日、9~16日、9~14日、12~19日、12~15日、または12~13日に隔てられている。一部の実施形態では、前記2回の導入が7日、8日、11日、15日、18日、19日、20日に隔てられている。
25、項1~24のいずれか一項に記載の方法を使用して、ハーラー症候群の病原性G>A突然変異を修正することを含む、ハーラー症候群を予防または治療する方法。
26、LEAPERテクノロジーに基づいて細胞中の標的RNAをターゲティング編集するために操作されたarRNAであって、前記標的RNAはGからAへの変異部位(標的アデノシン)を含むIDUA遺伝子転写物配列を含み、前記arRNAは前記標的RNAとハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記arRNAは前記標的RNAにハイブリダイズした後、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することができ、前記arRNAの標的となるGからAへの変異部位は、ハーラー症候群患者のゲノムにおけるNM_000203.4(IDUA)-c.1205G>A(p.Trp402Ter)の変異部位、またはそれに対応する変異部位である、arRNA。
27、標的アデノシンに対向する前記ヌクレオシド(ターゲティングヌクレオシド)が、シチジン(C)、アデノシン(A)、またはウリジン(U)である、項26に記載のarRNA。
28、前記標的アデノシンが、その5’最近傍ヌクレオシド及び3’最近傍ヌクレオシドと標的トリプレットを形成し、前記標的トリプレットが5'-CCA-3’である、項27に記載のarRNA。
29、前記arRNAが、
55nt-c-35nt、55nt-c-25nt、55nt-c-24nt、55nt-c-21nt、55nt-c-20nt、55nt-c-19nt、55nt-c-18nt、55nt-c-17nt、55nt-c-16nt、55nt-c-15nt、55nt-c-14nt、55nt-c-13nt、55nt-c-12nt、55nt-c-11nt、55nt-c-10nt、55nt-c-9nt、50nt-c-20nt、50nt-c-15nt、または45nt-c-20ntから選択されるいずれかの長さ特徴を有するarRNAであり、CはarRNAの標的アデノシンに対向するターゲティングヌクレオシドであり、arRNAの方向は5’から3’の方向である、項26~28のいずれか一項に記載のarRNA。
30、前記arRNAが1つまたは複数の化学修飾を含む、項26~29のいずれか一項に記載のarRNA。
31、前記化学修飾が、
2'-O-メチル化修飾、ホスホロチオエート修飾、デオキシリボヌクレオシド置換修飾、LNA修飾、2’-O-(2-メトキシエチル)修飾から選択される1つまたは複数である、項26~30のいずれか一項に記載のarRNA。
32、前記化学修飾が、
1)最初の2、3、4または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
2)最後の2、3、4、または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
3)ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの2’-O-メチル化修飾、
4)最初の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
5)最後の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
6)最初の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
7)最後の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
8)最初の1、2、3、4または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
9)最後の1、2、3、4、または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
10)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、及び
11)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、1、2、3、または4ヌクレオチドごとのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾
から選択される1つまたは複数である、項26~31のいずれか一項に記載のarRNA。
33、前記arRNAは、以下から選択されるいずれかの化学修飾を含む:
CM0:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートよって修飾されている;
CM1:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、配列内のすべてのUは、2’-O-メチル化によって修飾されている;
CM2:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオシドは2’-O-メチル化によって修飾されている;
CM3:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオシドは2’-O-メチル化によって修飾されている;
CM4:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングトリプレットの3つの塩基とそれらの3’最近傍ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている;
CM6:配列の最初の5ヌクレオチド及び最後の5ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の5ヌクレオチドと最後の5ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている;
CM148:配列の最初の4ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の3ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
CM149:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
CM150:配列の最初の2ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の1ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
CM151:配列の最初の4ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の3ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている;
CM152:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている;
CM153:配列の最初の2ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている;
CM94:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端からの4番目のヌクレオチド間結合から3’末端からの3番目のヌクレオチド間結合まで、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’最近傍ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されている;
CM119:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端からの4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合及び3’末端からの3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチドまで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる;
CM120:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端からの4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオチド間結合及び3’末端からの3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合まで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる;
CM123:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端からの4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合及び3’末端からの3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチドまで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる;
CM125:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合及び標的ヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエートで修飾されており、5’末端からの4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオチドの5’最近傍ヌクレオチドまで、及び3’末端kらの3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチドまで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる、
項26~32のいずれか一項に記載のarRNA。
34、前記arRNAが、下記のものから選択されるいずれかの配列を含む、
1)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*Cm-G*A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm-C-C-A*G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
2)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*-Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*Cm-G*-A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm*Cd-Cd*Ad*-G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
3)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*-G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*-Cm-G*A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm-Cd-Cd*Ad*G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
4)Gmoe*Amoe*Cmoe*Gmoe-C-C-C-A-C-C-G-Um-G-Um-G-G-Um-Um-G-C-Um-G-Um-C-C-A-G-G-A-C-G-G-Um-C-C-C-G-G-C-C-Um-GC-G-A-C-A-C-Um-Um-C-G-G-C-C-C-A-G-A-G-C-Um-G-C-Um-C*Cmoe*Umoe*Cmoe*Amoe(配列番号31);または
5)G+*A+*C+*G+C-C-C-A-C-C-G-Um-G-Um-G-G-Um-Um-G-C-Um-G-Um-C-C-A-G-G-A-C-G-G-Um-C-C-C-G-G-C-C-Um-GC-G-A-C-A-C-Um-Um-C-G-G-C-C-C-A-G-A-G-C-Um-G-C-Um-C*C+*U+*C+*A+(配列番号31)
項26~33のいずれか一項に記載のarRNA。
35、項26~29のいずれか一項に記載のarRNAコード配列を含む構築物。
36、項26~34のいずれか一項に記載のarRNAまたは項35に記載の構築物を含む組成物、リポソーム、エクソソーム、脂質ナノ粒子、細胞、ライブラリーまたはキット。
37、ハーラー症候群を予防または治療する薬物、製品、キットの調製における、項26~34のいずれか一項に記載のarRNA、項35に記載の構築物、項36に記載の組成物、リポソーム、エクソソーム、脂質ナノ粒子、細胞、ライブラリーまたはキットの使用。
いくつかの実施形態では、前記arRNAは、IDUAをコードするRNA配列に相補的な配列を含み、さらに、1つまたは複数のミスマッチ、ウォブル(Wobble)及び/または片側バルジ(Bulge)を含む。
本願では、arRNAはXnt-c-Ynt(方向は5’から3’端)の形式で表すことができる。ここで、Xは、前記ターゲティングヌクレオシド(含まない)から前記arRNAの5’端の最後のヌクレオチド(含む)までのヌクレオチド数を表し、Yは、ターゲティングヌクレオチド(含まない)から前記arRNAの3’端の最後のヌクレオチド(含む)までのヌクレオチド数を表す。たとえば、前記arRNAが55nt-c-35ntの場合、前記ターゲティングヌクレオシドは前記arRNAの5’末端から55ヌクレオチド、前記arRNAの3’末端から35ヌクレオチドであり、arRNA全体の長さは、55nt+35nt+1nt=91ntであることを表す。
いくつかの実施形態において、前記arRNAは、ADAR酵素を動員するための分子内ステムループ構造を形成することができる領域を含まない。いくつかの実施形態において、LEAPER技術に基づく細胞中の標的RNAのターゲティング編集のための方法は、細胞に外因性ADAR酵素タンパク質を導入することを含まない。いくつかの実施形態では、LEAPER技術に基づく細胞中の標的RNAのターゲティング編集のための方法は、外因性ADAR酵素タンパク質を細胞に導入することを含む。
本発明のarRNAを使用して、細胞レベルで検証すると分かるように、標的とするIDUA遺伝子をコードするRNA上のc.1205G>A突然変異部位の回復率(A>G編集効率)が少なくとも約30%、例えば、少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%またはそれ以上である。
本発明のハーラー症候群を治療または予防するための方法において、前記arRNAが体内で強い免疫応答を引き起こさない。
要約すると、本出願は、ハーラー症候群の治療に使用できるarRNA、当該arRNAを含む構築物、組成物、細胞、ライブラリーまたはキット、ならびに、前記arRNA、構築物、組成物、細胞、ライブラリーまたはキットを使用してハーラー症候群を予防及び治療するための方法を提供する。本出願の技術構成には、少なくとも以下の利点がある。
1.外因性タンパク質の発現に依存しないため、外因性タンパク質の導入による細胞の損傷はない。外因性タンパク質の過剰発現によるオフターゲット効果はない。外因性タンパク質によって引き起こされる体の免疫応答はない。また、体内に存在する抗体による外因性タンパク質の中和によって遺伝子編集が失敗することはない。導入されるタンパク質の分子量が高すぎて送達ビヒクルの選択を制限することはない。
2.本願は、DNA編集とは異なり、可逆的かつ制御可能なRNA編集方法を提供するので、ゲノムDNAに不可逆的な損傷を引き起こすことはなく、より安全である。
3.インビボ遺伝子編集に適した他の治療スキームと比較して、本願で提供される技術構成は、より高い編集効率を持っている。
図1は、GM06214細胞でのIDUA遺伝子型の検出(c1205G>A)を示す図である。 図2A~2Bは、IDUA pre-mRNA及びmRNAに対するarRNAの設計を示す図である。これらのarRNA編集後(arRNAがエレクトロポレーションによって細胞に入る)の細胞機能をテストし、編集部位A>Gの編集効率を検出した。 図2A~2Bは、IDUA pre-mRNA及びmRNAに対するarRNAの設計を示す図である。これらのarRNA編集後(arRNAがエレクトロポレーションによって細胞に入る)の細胞機能をテストし、編集部位A>Gの編集効率を検出した。 図3A~3Bは、IDUA-レポーター細胞株の設計(3A)、及び293T-IDUA-レポーターで異なる長さのarRNA(対称的なトランケーション)の編集効率(arRNAがエレクトロポレーションによって細胞に入る)の編集効率を検出すること(3B)を示す図である。 図3A~3Bは、IDUA-レポーター細胞株の設計(3A)、及び293T-IDUA-レポーターで異なる長さのarRNA(対称的なトランケーション)の編集効率(arRNAがエレクトロポレーションによって細胞に入る)の編集効率を検出すること(3B)を示す図である。 図4A~4Bは、GM06214細胞に異なる長さ(対称的なトランケーション)のarRNAをトランスフェクトした後のさまざまな時点での酵素活性と編集効率を示す図である。 図4A~4Bは、GM06214細胞に異なる長さ(対称的なトランケーション)のarRNAをトランスフェクトした後のさまざまな時点での酵素活性と編集効率を示す図である。 図5は、GM06214細胞におけるlipofectamineRNAiMAXによるarRNAのトランスフェクション(対称トランケーション、3’トランケーション及び5’トランケーション)後のIDUA酵素活性の検出と編集効率を示す図である。 図6A~6Bは、55nt-c-25ntから55nt-c-5ntまでの好ましいarRNA(3’末端の塩基が1つずつ減少している)が、lipofectamineRNAiMAXによってGM06214細胞にトランスフェクトされ、好ましい3末端の長さの範囲を酵素活性検出により選択したことを示す図である。図6Aは、55nt-c-25ntから55nt-c-10ntまでのarRNAの検出結果を示す図である。図6Bは、合成された55nt-c-16ntから55nt-c-5ntまでのarRNAの別のバッチを使用している。 図6A~6Bは、55nt-c-25ntから55nt-c-5ntまでの好ましいarRNA(3’末端の塩基が1つずつ減少している)が、lipofectamineRNAiMAXによってGM06214細胞にトランスフェクトされ、好ましい3末端の長さの範囲を酵素活性検出により選択したことを示す図である。図6Aは、55nt-c-25ntから55nt-c-10ntまでのarRNAの検出結果を示す図である。図6Bは、合成された55nt-c-16ntから55nt-c-5ntまでのarRNAの別のバッチを使用している。 図7は、3’末端が同じ長さ(2つの好ましい長さに固定)で5’末端が異なる長さ(55ntから徐々に減少)のarRNAがlipofectamineRNAiMAXによってGM06214細胞にトランスフェクトされ、好ましい5’末端の長さ範囲を酵素活性検出によりスクリーニングしたことを示す図である。この図は、arRNAが60nt未満の場合、編集効率が大幅に低下したことも示す。 図8は、3つの好ましい長さのarRNAの編集部位の限られた移動によって、3つの群のarRNAを産生することを示す図である。各群のarRNAの長さは同じであり、編集部位は異なっている。これらのarRNAはlipofectamineRNAiMAXトランスフェクションによってそれぞれGM06214細胞にトランスフェクトされ、長さと編集位置の最適な組み合わせを酵素活性検出によってスクリーニングした。 図9A~9Cは、3つのarRNA長さでのarRNA編集効率に対するCM1及びCM0修飾の影響を比較し(図9A)、異なる化学修飾を含む71nt及び76ntのarRNAをlipofectamineRNAiMAXによってGM06214細胞にトランスフェクトし、酵素活性検出(図9B)及び標的部位A>G突然変異率検出(図9C)によって好ましい化学修飾をスクリーニングしたことを示す図である。 図9A~9Cは、3つのarRNA長さでのarRNA編集効率に対するCM1及びCM0修飾の影響を比較し(図9A)、異なる化学修飾を含む71nt及び76ntのarRNAをlipofectamineRNAiMAXによってGM06214細胞にトランスフェクトし、酵素活性検出(図9B)及び標的部位A>G突然変異率検出(図9C)によって好ましい化学修飾をスクリーニングしたことを示す図である。 図9A~9Cは、3つのarRNA長さでのarRNA編集効率に対するCM1及びCM0修飾の影響を比較し(図9A)、異なる化学修飾を含む71nt及び76ntのarRNAをlipofectamineRNAiMAXによってGM06214細胞にトランスフェクトし、酵素活性検出(図9B)及び標的部位A>G突然変異率検出(図9C)によって好ましい化学修飾をスクリーニングしたことを示す図である。 図10A~10Bは、CM1修飾の55nt-c-16nt、55nt-c-14nt、55nt-c-11ntの濃度勾配実験を示す図である。arRNAの効果は、酵素活性(図10A)と標的部位の変異率(図10B)の観点から観察した。 図10A~10Bは、CM1修飾の55nt-c-16nt、55nt-c-14nt、55nt-c-11ntの濃度勾配実験を示す図である。arRNAの効果は、酵素活性(図10A)と標的部位の変異率(図10B)の観点から観察した。 図11A~11Bは、arRNAをlipofectamineRNAiMAXでGM06214細胞にトランスフェクトし、CM1修飾の効果を酵素活性検出によってさらに検証したことを示す図である。 図11A~11Bは、arRNAをlipofectamineRNAiMAXでGM06214細胞にトランスフェクトし、CM1修飾の効果を酵素活性検出によってさらに検証したことを示す図である。 図12は、ヒト肝臓初代細胞における野生型IDUA遺伝子編集のA>G変異の編集効率を示す図である。 図13は、IDUA酵素活性によって、GM06214細胞におけるc.1239 G>A(p.Trp402Ter)変異部位での転写産物の編集効率について、本出願の方法の編集効率をと従来技術の好ましい方法との比較を示す図である。 図14A~14Bは、2日目(図14A)と7日目(図14B)のレポーターサブシステムを備えた細胞の蛍光発現量によって、arRNAのG>A遺伝子編集の結果に対する異なるタイプと数の末端修飾の影響を示す図である。 図14A~14Bは、2日目(図14A)と7日目(図14B)のレポーターサブシステムを備えた細胞の蛍光発現量によって、arRNAのG>A遺伝子編集の結果に対する異なるタイプと数の末端修飾の影響を示す図である。 図15A~15Cは、3日目(図15A)、5日目(図15B)、及び7日目(図15C)のレポーターサブシステムを備えた細胞の蛍光発現量によって、arRNAのG>A遺伝子編集の結果に対する、異なる数及び異なる塩基位置のホスホロチオエート修飾、2’-O-Me修飾、及びデオキシリボヌクレオシド置換の組み合わせの影響を示す図である。 図15A~15Cは、3日目(図15A)、5日目(図15B)、及び7日目(図15C)のレポーターサブシステムを備えた細胞の蛍光発現量によって、arRNAのG>A遺伝子編集の結果に対する、異なる数及び異なる塩基位置のホスホロチオエート修飾、2’-O-Me修飾、及びデオキシリボヌクレオシド置換の組み合わせの影響を示す図である。 図15A~15Cは、3日目(図15A)、5日目(図15B)、及び7日目(図15C)のレポーターサブシステムを備えた細胞の蛍光発現量によって、arRNAのG>A遺伝子編集の結果に対する、異なる数及び異なる塩基位置のホスホロチオエート修飾、2’-O-Me修飾、及びデオキシリボヌクレオシド置換の組み合わせの影響を示す図である。
定義
本発明は、実施例を使用し、添付の図面を参照して本明細書に記載されるが、本発明は、それに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。請求項内の参照記号は、範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。「含む」または「含有する」という用語が本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、それは他の構成部分、要素またはステップを除外しない。ヌクレオチドの数値範囲が本明細書で使用される場合、当該範囲の2つの端点及び端点間に介在するすべての整数が含まれる。例えば、60から200ヌクレオチドの範囲については、40ヌクレオチド及び260ヌクレオチドの数に加えて、60から200ヌクレオチドの間の任意の整数が含まれる。
以下の用語または定義は、本発明の理解を助けるためにのみ提供されている。本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、本発明の当業者によって使用されるのと同じ意味を有する。従業者は、「分子クローニング:実験室マニュアル(第四版)」(2017年3月、科学出版社有限責任公司が発行、著者J.Sambrook、M.R.Green、翻訳者、賀福初)などの書籍に基づいて本分野の定義及び用語を理解できる。本明細書で提供される定義は、当業者によって理解されるよりも狭い範囲と解釈されるべきではない。
本明細書で使用される場合、「標的部位」とは、RNA配列中の編集されるヌクレオチド部位を指す。
「dRNA」(Deaminase Recruiting RNA、デアミナーゼ動員RNA)という用語は、アデノシンデアミナーゼ(ADAR)などのデアミナーゼ酵素を動員して標的アデノシンを脱アミノ化することができる操作されたRNAを指す。dRNAは、アデノシンデアミナーゼを動員する役割のため、「arRNA」(Adenosine Deaminase Recruiting RNA、アデノシンデアミナーゼ動員RNA)と呼ばれることもある。本願では、dRNAとarRNAは同じ意味を表し、置き換えて使用できる。たとえば、本願のコンテキストでは、arRNAは相補的な塩基対を介して細胞内の一部のRNAに結合し、ADARなどのデアミナーゼを動員して、RNA配列の標的部位にあるアデノシン(A)などのヌクレオシドを脱アミノ化してクレアチニンなどに変換し、これによって編集を達成する。ここで、標的ヌクレオシドがアデノシンである場合、標的ヌクレオシドは「標的アデノシン」または「標的A」とも呼ばれる。前記標的ヌクレオシドを含むRNAは「標的RNA」または「目的RNA」と呼ばれ、標的ヌクレオシドを含む配列は「標的配列」または「目的配列」と呼ばれる。
本発明において、使用されるarRNAが標的RNAにハイブリダイズして結合する場合、arRNA配列中の1つのヌクレオシドは、標的RNAにおいて編集される標的アデノシンに直接に対向する。arRNA配列のこのヌクレオシドは、シチジン(C)、アデノシン(A)、またはウリジン(U)であり得る。標的アデノシンの真向かいにあるこのシチジン(C)、アデノシン(A)、及びウリジン(U)は、まとめて「ターゲティングヌクレオシド」と呼ばれ、またはそれぞれ「ターゲティングシチジン(C)」、「ターゲティングアデノシン(A)」及び「ターゲティングウリジン(U)」と呼ばれる。
本願では、すべての核酸配列は5’から3’の端までの順で書き込まれる。したがって、本明細書で「前」及び「後」を使用してある配列を修飾する場合、それらは、それぞれ、当該配列の「5’末端」及び「3’末端」を指す。ここで、任意のヌクレオチドの5’末端に最も近いヌクレオチドは、ヌクレオチドの「5’最近傍ヌクレオチド」または「5’最近傍ヌクレオシド」と呼ばれる;任意のヌクレオチド3’ 末端に最も近いヌクレオチドは、ヌクレオチドの「3’最近傍ヌクレオチド」または「3’最近傍ヌクレオシド」と呼ばれる。前記任意のヌクレオチドとその5’最近傍ヌクレオチドとの間の結合は「5’最近傍ヌクレオチド間結合」と呼ばれ、前記任意ヌクレオチドとその3’最近傍ヌクレオチドとの間の結合は「3’最近傍ヌクレオチド間結合」と呼ばれる。例えば、標的RNAの標的ヌクレオシドの5’及び3’末端に最も近いヌクレオチドは、それぞれ「標的ヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオシド」及び「標的ヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオシド」と呼ばれる。標的ヌクレオシドはその5’最近傍ヌクレオシド及び3’最近傍ヌクレオシドと連結することによって形成されるヌクレオシドトリプレットは、「標的トリプレット」と呼ばれる。同様に、ターゲティングヌクレオシドの5’及び3’末端に最も近いヌクレオチドは、それぞれ「ターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオシド」及び「ターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオシド」と呼ばれ、arRNA中のターゲティングヌクレオシドはその5’最近傍ヌクレオシド及び3’最近傍ヌクレオシドと連結することによって形成されるヌクレオシドトリプレットは、「ターゲティングトリプレット」と呼ばれる。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」及び「核酸」という用語は交換可能に使用される。それらは、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、すなわち、デオキシリボヌクレオチド(DNA)またはリボヌクレオチド(RNA)またはそれらの類似体を指す。前記デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドは、「ヌクレオチド」または「ヌクレオシド」と呼ばれ得る。本出願では、特に明記しない限り、「ヌクレオチド」及び「ヌクレオシド」は交換可能に使用される。ヌクレオチドはホスホジエステル結合によって結合されている。複数のヌクレオチドがホスホジエステル結合によって連結されて、ポリヌクレオチドまたは核酸を形成する。ヌクレオチド間のホスホジエステル結合は、チオによって修飾することができ、ホスホジエステル結合の二重結合酸素の1つを二重結合硫黄で置き換えて「ホスホロチオエート結合」を形成する。このプロセスは「ホスホロチオエート修飾」と呼ばれる。
本願において、「2’-O-Me」または「2’-OMe」は、2-O’-メチルであり、これは、ヌクレオチドリボースの第2位のヒドロキシル基の水素原子がメチル基によって置き換えられて形成した基を指し、このメチル置換プロセスは、「2’-O-メチル化」、「2’-O-メチル化修飾」、「2’-OMe修飾」または「2’-O-Me修飾」と呼ばれる。本明細書で使用される場合、「LNA」または「ロック核酸」は、リボースの2’及び4’が脱水縮合によってオキシメチレンブリッジを形成し、環状構造を形成する特別な二環式ヌクレオチド誘導体を指す。したがって、本出願で言及される「ロック核酸修飾」または「LNA修飾」は、修飾されたヌクレオチドがロック核酸であることを意味する。
本明細書で使用される場合、「デオキシリボヌクレオシド置換」修飾とは、対応するデオキシリボヌクレオチドによるRNA中のリボヌクレオチドの置換を指す。
「2’-O-(2-メトキシエチル)」とは、修飾されたヌクレオチドリボースの第2位のヒドロキシル基の水素原子が2-メトキシエチルによって置換されて形成される基を指し、この2-メトキシエチルによる置換は2’-O-(2-メトキシエチル)修飾と呼ばれる。
ここで、核酸配列に注釈を付ける場合、「*」はホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を表し、「m」はそのすぐ左のヌクレオシドが2’-O-メチル化によって修飾されることを表し、「moe」はそのすぐ左のヌクレオシドが2’-O-(2-メトキシエチル)によって修飾されることを表し、「+」はすぐ左側のヌクレオシドがLNAで修飾されていることを表し、「d」はすぐ左側のヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドに置き換えられルことを表す。本明細書で使用される場合、ヌクレオチド、ヌクレオシドまたは塩基を表す2つの文字の間に「>」が使用される場合、それは、左側の文字で表されるヌクレオシドが修飾されて、右側の文字で表されるヌクレオシドに転換した変異を意味する。たとえば、「G>A」は、グアノシンからアデノシンへの変異を意味する。
本明細書で使用される場合、「相補」とは、核酸が、従来のワトソン-クリック(Watson-Crick)塩基対形成原理によって別の核酸と水素結合を形成することを指す。本明細書に記載の相補とは、すべてのヌクレオチドが相補的であるということなく、2つの核酸のヌクレオチドの大部分が相補的であることを指し得る。
「RNA編集」とは、真核細胞に存在する自然なプロセスを指す。RNA編集は、DNA転写後、タンパク質翻訳前にRNAレベルで発生する塩基A(アデノシン)からI(クレアチニン)への編集であり、クレアチニンは翻訳の過程でG(グアノシン)として認識されるため、A>Gの変換を達成する。この編集は、ADAR(Adenosine Deaminase Acting on RNA、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ)プロテアーゼがAの脱アミノ化を触媒してIを形成することによって起こり、最後に単一ヌクレオチドの部位特異的編集をもたらす。編集は、イントロン及びエキソン配列を含むコーディング領域に発生することもあるし、非コーディング領域で発生することもあり、コーディング領域での編集は、タンパク質コード配列を再定義することができる。
本明細書で使用される場合、「構築物」とは、RNAコード配列またはアミノ酸コード配列を含む核酸を指し、ここで、コード配列は、転写または翻訳によって前記RNAまたはアミノ酸を発現する。前記構築物は、環状または線状、二本鎖または一本鎖、DNAまたはRNA、あるいはDNAとRNAのハイブリッド分子であり得、化学的に合成または生合成され得る。いくつかの特定の実施形態では、前記構築物はプラスミドである。いくつかの特定の実施形態では、前記構築物はオリゴヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、細胞への「取り込み」または「導入」は、トランスフェクション、感染、エンドサイトーシスなどによって、タンパク質または前記タンパク質をコードする核酸、RNAまたは前記RNAをコードする構築物、プラスミドまたは他の線状もしくは環状のDNAなどが細胞膜を通過して細胞に入るプロセスを指す。
ハーラー症候群の信頼できる治療法がないという現状を解決するために、本発明は、ハーラー症候群の個別の特徴を目指し、IDUA病原性遺伝子の割合が最も高い変異型(NM_000203.4(IDUA)-c.1205G>A(p.Trp402Ter))を選択し、LEAPER技術に基づいて、arRNAの長さとターゲティングヌクレオチドの位置を最適化し、適切な化学修飾を導入して、本発明の機能性RNA、すなわちarRNA、及びその使用方法を開発し、ハーラー症候群の治療に使用した。前記arRNAは、塩基配列の相補的ペアリングを介して、G>A変異部位を含むα-L-イズロニダーゼ(α-L-iduronidase、IDUA)をコードするRNA配列を標的にして結合し、デアミナーゼを動員し、その変異部位のアデノシン(A)(標的アデノシン)を脱アミノ化してクレアチニン(I)を形成する。Iは翻訳の過程でG(グアノシン)として認識されるため、A>Gの転換を達成する。本発明のarRNA及び方法を使用して、IDUA遺伝子によって転写されたpre-mRNAまたはmRNAは、UGG>UAG突然変異のために事前に生じる終止コドンを、トリプトファンをコードするコドンUGGに回復させることができ、その結果、IDUA酵素の合成が継続し、IDUA酵素の機能が回復する。
IDUA病原性変異(c.1205G>A)を有するレポーターシステムを構築し、Coriell Instituteから購入したGM06214細胞(ハーラー症候群患者由来の線維芽細胞(エキソン9 IDUA遺伝子1293位はTGG>TAG[Trp402Ter(W402X)]ホモ接合変異である)を使用し、GM01323細胞(シェーム症候群の患者に由来する線維芽細胞、エキソン6の-7位内、つまりイントロン5にはひとつのG>A変換(IVS5AS-7G>A)が含まれる)を対照とし、本願のarRNAの機能と特性を検証した。その検証は、arRNAを上記のレポーターシステムを含む細胞、またはGM06214細胞にトランスフェクトし、レポーターシステムの蛍光強度、IDUA酵素の機能の比較、またはNGS(Next Generation Sequencing、次世代シーケンシング技術)などの方法によってA>G編集効率または変異率を検出して、arRNAの編集の有効性を検出する。
RNA編集方法
一態様では、本願は、LEAPER技術に基づく細胞内の標的RNAのターゲティング編集のための方法を提供し、前記標的RNAが、グアノシン(G)からアデノシン(A)への変異部位(標的アデノシン)を含むIDUA遺伝子転写物配列を含み、前記方法が、arRNAまたは前記arRNAコード配列を含む構築物を前記細胞に導入することを含み、前記arRNAは、前記標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記arRNAは前記標的RNAにハイブリダイズした後、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することができる。
いくつかの実施形態では、前記標的RNA中の前記標的アデノシンの5’最近傍ヌクレオシドが、U、C、A、及びGから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がU>C≒A>Gであり、前記標的RNAにおける前記標的アデノシンの3’最近傍ヌクレオシドが、G、C、A、及びUから選ばれるヌクレオシドであり、優先度がG>C>A≒Uである。いくつかの実施形態では、前記標的RNAにおける前記標的アデノシンは、UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA、及びGAUからなる群より選ばれるトリプレットに位置する。いくつかの実施形態において、前記標的アデノシン及びその5’最近傍ヌクレオシド及び3’最近傍ヌクレオシドからなる標的トリプレットは5’-UAG-3’である。いくつかの実施形態において、前記標的RNAは、IDUA遺伝子から転写されたpre-mRNAまたはmRNAから選択される。いくつかの実施形態において、前記標的RNAは、IDUA遺伝子から転写されたpre-mRNAである。
いくつかの実施形態において、前記arRNAは、相補的IDUAをコードするRNA配列との1つ以上のミスマッチ、ウォブル(Wobble)及び/またはバルジ(Bulge)を含む。いくつかの実施形態において、前記arRNAは、ADAR酵素を動員するための分子内ステムループ構造を形成することができる領域を含まない。
いくつかの実施形態において、前記arRNA上の標的アデノシンに対向するヌクレオシド(ターゲティングヌクレオシド)は、シチジン(C)、アデノシン(A)またはウリジン(U)であり、好ましくはCである。いくつかの実施形態において、前記ターゲティングアデノシンの5’最近傍ヌクレオシドは、C、G、またはUである。いくつかの実施形態において、前記ターゲティングアデノシンの3’最近傍ヌクレオシドはAである。いくつかの実施形態において、前記ターゲティングヌクレオシドは、その5’最近傍ヌクレオシド及び3’最近傍ヌクレオシドとターゲティングトリプレットを形成し、このターゲティングトリプレットは5’-CCA-3’である。
いくつかの実施形態では、前記arRNAの長さは61ntを超え、例えば、前記arRNAの長さは62~121nt、62~111nt、62~101nt、62~100nt、62~91nt、62~76nt、または62~70ntである。いくつかの実施形態では、前記arRNAの長さは、62~121ntから選択されるいずれかの整数のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、前記arRNAの長さは、62nt、63nt、64nt、65nt、66nt、67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、77nt、78nt、79nt、80nt、81nt、82nt、83nt、84nt、85nt、86nt、87nt、88nt、89nt、90nt、92nt、95nt、98nt、100nt、103nt、または106ntである。
いくつかの実施形態では、前記arRNAの3’末端からの前記arRNAのターゲティングヌクレオシドの距離は、前記arRNAの5’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離より短い。いくつかの実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その3’末端からの距離が8ntを超え、例えば、9~60nt、好ましくは9~45ntまたは9~35ntである。一部の実施形態では、非常に長いpоly G構造をなるべく避けるために、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その3’末端からの距離が、9~25nt、9~26ntまたは9~27ntから選択される。好ましくは、一部の実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その3’末端からの距離が、9~20nt、9~21ntまたは9~22ntから選択される。特定の実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その3’末端からの距離が、9~25ntから選択される任意の整数のntであり、例えば、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、または24ntである。いくつかの実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その5’末端からの距離が25ntを超え、例えば、26~60nt、35~60nt、または45~60ntである。一部の実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その5’末端からの距離が、45nt、45nt、46nt、47nt、48nt、49nt、50nt、51nt、52nt、53nt、54nt、55nt、56nt、57nt、58nt、または59ntから選ばれる。
いくつかの実施形態では、前記arRNAの5’末端からの前記arRNAのターゲティングヌクレオシドの距離が、前記arRNAの3’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離よりも短い。いくつかの実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その5’末端からの距離が35ntを超え、例えば、36~60ntまたは36~55ntである。好ましくは、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、arRNAの5’末端からの距離が、54nt、53nt、52nt、51nt、50nt、49nt、48nt、47nt、46nt、45nt、44nt、43nt、42nt、41nt、40nt、39nt、38nt、または36ntから選択される。
いくつかの実施形態では、前記arRNAが、55nt-c-35nt、55nt-c-25nt、55nt-c-24nt、55nt-c-21nt、55nt-c-20nt、55nt-c-19nt、55nt-c-18nt、55nt-c-17nt、55nt-c-16nt、55nt-c-15nt、55nt-c-14nt、55nt-c-13nt、55nt-c-12nt、55nt-c-11nt、55nt-c-10nt、55nt-c-9nt、50nt-c-20nt、50nt-c-15nt、または45nt-c-20ntから選択されるいずれかの長さ特徴を有するarRNAである。好ましくは、前記arRNAが、55nt-c-20nt、55nt-c-15nt、55nt-c-14ntから選択されるいずれかの長さ特徴を有するarRNAである。
いくつかの実施形態では、前記arRNAはオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、前記arRNAは、1つまたは複数の化学修飾を含む。当業者は、いくつかの適切な化学修飾が、編集効率を確保しながら、細胞内またはインビボでのRNAの安定性を改善し、それによってarRNAの編集効率を改善できることを知っているのであろう。たとえば、2’-O-メチル化修飾をRNAの両端のヌクレオシドに添加するか、ヌクレオチド間結合をホスホロチオエートによって修飾する。本願の実施形態から分かるように、本願のarRNA配列は、2'-O-メチル化修飾、ホスホロチオエート修飾、デオキシリボヌクレオシド置換修飾、LNA修飾、2’-O-(2-メトキシエチル)修飾から選択される1つまたは複数の化学修飾によってarRNAの安定性及び編集効率を高めることができる。具体的には、いくつかの実施形態では、前記化学修飾は、
1)最初の2、3、4または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
2)最後の2、3、4、または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
3)ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの2’-O-メチル化修飾、
4)最初の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
5)最後の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
6)最初の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
7)最後の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
8)最初の1、2、3、4または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
9)最後の1、2、3、4、または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
10)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、及び
11)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、1、2、3、または4ヌクレオチドの間隔でのヌクレオチド間結合ホスホロチオエート修飾、
から選択される1つまたは複数である。
好ましくは、いくつかの特定の実施形態では、前記化学修飾は、
1)最初の2、3、4または5ヌクレオチド及び最後の2、3、4、または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
2)ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの2’-O-メチル化修飾、
3)最初の2、3または4ヌクレオチド及び最後の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
4)最初の2、3または4ヌクレオチド及び最後の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
5)最初の1、2、3、4または5ヌクレオチド間結合及び最後の1、2、3、4、または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
6)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合または多くとも1ヌクレオチド間結合の間隔でのホスホロチオエート修飾、
から選択される1つまたは複数である。
いくつかの実施形態では、前記arRNAは、以下から選択されるいずれかの化学修飾を含む:
CM0、CM1、CM2、CM3、CM4、CM6、CM148、CM149、CM150、CM151、CM152、CM153、CM94、CM119、CM120、CM123、CM125。
いくつかの実施形態では、前記arRNAの標的となるGからAへの変異部位は、ハーラー症候群患者のゲノムにおけるNM_000203.4(IDUA)-c.1205G>A(p.Trp402Ter)の変異部位、またはそれに対応する変異部位である。いくつかの実施形態では、前記arRNAが、下記のものから選択される任意の配列を含む、
1)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*Cm-G*A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm-C-C-A*G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
2)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*-Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*Cm-G*-A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm*Cd-Cd*Ad*-G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
3)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*-G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*-Cm-G*A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm-Cd-Cd*Ad*G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
4)Gmoe*Amoe*Cmoe*Gmoe-C-C-C-A-C-C-G-Um-G-Um-G-G-Um-Um-G-C-Um-G-Um-C-C-A-G-G-A-C-G-G-Um-C-C-C-G-G-C-C-Um-GC-G-A-C-A-C-Um-Um-C-G-G-C-C-C-A-G-A-G-C-Um-G-C-Um-C*Cmoe*Umoe*Cmoe*Amoe(配列番号31);または
5)G+*A+*C+*G+C-C-C-A-C-C-G-Um-G-Um-G-G-Um-Um-G-C-Um-G-Um-C-C-A-G-G-A-C-G-G-Um-C-C-C-G-G-C-C-Um-GC-G-A-C-A-C-Um-Um-C-G-G-C-C-C-A-G-A-G-C-Um-G-C-Um-C*C+*U+*C+*A+(配列番号31)。
いくつかの実施形態において、前記arRNAは、エレクトロトランスフェクション、リポフェクション、エクソソーム送達、または脂質ナノ粒子送達(LNP)から選択される方法によって細胞に導入される。好ましくは、前記arRNAはリポフェクションによって細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、幹細胞、軟骨細胞、骨膜細胞、間葉系細胞、心筋細胞、神経細胞、または肝細胞から選択される。いくつかの実施形態では、前記細胞は好ましくは肝細胞である。
いくつかの実施形態では、LEAPER技術に基づく細胞内の標的RNAのターゲティング編集のための方法は、複数の、例えば、2、3、4またはそれ以上の異なる配列及び/または異なる化学修飾を有するarRNAを細胞に導入することを含む。
いくつかの実施形態において、前記細胞に、複数回、例えば、2回、3回、4回、またはそれ以上、arRNAが導入される。いくつかの実施形態では、同じ方法、例えば、リポフェクション、または脂質ナノ粒子送達を使用して、各arRNAを導入する。いくつかの実施形態において、arRNAの各導入に使用される方法は、細胞の状態に応じて異なる。
いくつかの実施形態では、前記細胞は、arRNAに1回のみ導入される。いくつかの実施形態では、前記arRNAは、一回あたり5nM以上、好ましくは10nM以上、より好ましくは20nM以上の量で細胞に導入される。特定の実施形態では、前記arRNAが、一回あたり5~160nM、例えば、10~160nM、20~160nM、40~160nM、20~80nM、40~80nM、または20~40nMの量で細胞に導入される。特定の実施形態では、前記arRNAが、一回あたり15nM、17nM、19nM、21nM、22nM、23nM、24nM、25nM、26nM、27nM、28nM、29nM、30nM、31nM、32nM、33nM、34nM、35nM、36nM、37nM、38nM、39nM、41nM、43nM、45nM、55nM、65nM、75nM、85nM、95nM、105nM、115nM、125nM、135nM、145nMまたは155nMの量で細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記arRNAが前記細胞に複数回導入され、2つの導入が21日以上、例えば、17日以上、14日以上、12日以上、11日以上、または10日以上に隔てられている。一部の実施形態では、前記2つの導入が9~20日、9~16日、9~14日、12~19日、12~15日、または12~13日に隔てられている。一部の実施形態では、前記2つの導入が7日、8日、11日、15日、18日、19日、20日に隔てられている。
いくつかの実施形態では、LEAPER技術に基づく細胞内の標的RNAのターゲティング編集のための方法は、前記細胞に外因性タンパク質または外因性タンパク質のコード配列を導入することを含まない。いくつかの実施形態では、この方法は、外因性ADARを患者細胞に導入することをさらに含む。 いくつかの特定の実施形態では、前記外因性ADARは、E1008突然変異を含むADAR1である。いくつかの実施形態において、この方法はまた、ADAR3の阻害剤を宿主細胞に導入することを含み得る。いくつかの実施形態において、この方法は、インターフェロンの刺激因子を宿主細胞に導入することをさらに含む。
本願の実施例のデータ結果から分かるように、本願で説明されている方法を使用すると、前記標的アデノシン(G>A)変異部位の回復率(A>G編集効率)は少なくとも約20%、例えば、少なくとも約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%またはそれ以上である。
arRNA
一態様では、本願はarRNAをさらに提供し、前記arRNAは、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記arRNAは前記標的RNAにハイブリダイズした後、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することができる。前記標的RNAは、グアノシン(G)からアデノシン(A)への突然変異部位(標的アデノシン)を含む。いくつかの実施形態において、前記標的アデノシンは、その5’最近傍ヌクレオシド及び3’最近傍ヌクレオシドと標的トリプレットを形成し、この標的トリプレットは5’-UAG-3’である。
いくつかの実施形態において、前記arRNAは、相補的IDUAをコードするRNA配列との1つ以上のミスマッチ、ウォブル(Wobble)及び/またはバルジ(Bulge)を含む。いくつかの実施形態において、前記arRNAは、ADAR酵素を動員するための分子内ステムループ構造を形成することができる領域を含まない。いくつかの実施形態において、前記arRNA上の標的アデノシンに対向するヌクレオシド(ターゲティングヌクレオシド)は、シチジン(C)、アデノシン(A)またはウリジン(U)であり、好ましくはCである。いくつかの実施形態において、前記ターゲティングアデノシンの5’最近傍ヌクレオシドは、C、G、またはUである。いくつかの実施形態において、前記ターゲティングアデノシンの3’最近傍ヌクレオシドはAである。いくつかの実施形態において、前記ターゲティングヌクレオシドとその5’最近傍ヌクレオシド及び3’最近傍ヌクレオシドが形成したターゲティングトリプレットは5’-CCA-3’である。いくつかの実施形態において、前記arRNAは、それぞれが前記標的RNA中の標的アデノシン以外の他のアデノシン(非標的アデノシン)とは対向する、1つ以上のグアノシンをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記arRNAは、前記標的RNA中の非標的アデノシンの反対側にある2つ以上の連続したミスマッチヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、前記arRNAの長さは61ntを超え、例えば、前記arRNAの長さは62~121nt、62~111nt、62~101nt、62~100nt、62~91nt、62~76nt、または62~70ntである。いくつかの実施形態では、前記arRNAの長さは、62~121ntから選択されるいずれかの整数のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、前記arRNAの長さは、62nt、63nt、64nt、65nt、66nt、67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、77nt、78nt、79nt、80nt、81nt、82nt、83nt、84nt、85nt、86nt、87nt、88nt、89nt、90nt、92nt、95nt、98nt、100nt、103nt、または106ntである。
いくつかの実施形態では、前記arRNAの3’末端からの前記arRNAのターゲティングヌクレオシドの距離は、前記arRNAの5’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離より短い。いくつかの実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その3’末端からの距離が8ntを超え、例えば、9~60nt、好ましくは9~45ntまたは9~35ntである。一部の実施形態では、非常に長いpоly G構造をなるべく避けるために、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その3’末端からの距離が、9~25nt、9~26ntまたは9~27ntから選択される。好ましくは、一部の実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その3’末端からの距離が、9~20nt、9~21ntまたは9~22ntから選択される。特定の実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その3’末端からの距離が、9~25ntから選択される任意の整数のntであり、例えば、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、または24ntである。いくつかの実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その5’末端からの距離が25ntを超え、例えば、26~60nt、35~60nt、または45~60ntである。一部の実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その5’末端からの距離が、45nt、45nt、46nt、47nt、48nt、49nt、50nt、51nt、52nt、53nt、54nt、55nt、56nt、57nt、58nt、または59ntである。
いくつかの実施形態では、前記arRNAの5’末端からの前記arRNAのターゲティングヌクレオシドの距離が、前記arRNAの3’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離よりも短い。いくつかの実施形態では、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その5’末端からの距離が35ntを超え、例えば、36~60ntまたは36~55ntである。好ましくは、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、arRNAの5’末端からの距離が、54nt、53nt、52nt、51nt、50nt、49nt、48nt、47nt、46nt、45nt、44nt、43nt、42nt、41nt、40nt、39nt、38nt、または36ntから選択される。
いくつかの実施形態では、前記arRNAが、55nt-c-35nt、55nt-c-25nt、55nt-c-24nt、55nt-c-21nt、55nt-c-20nt、55nt-c-19nt、55nt-c-18nt、55nt-c-17nt、55nt-c-16nt、55nt-c-15nt、55nt-c-14nt、55nt-c-13nt、55nt-c-12nt、55nt-c-11nt、55nt-c-10nt、55nt-c-9nt、50nt-c-20nt、50nt-c-15nt、または45nt-c-20ntから選択されるいずれかの長さ特徴を有するarRNAである。好ましくは、前記arRNAが、55nt-c-20nt、55nt-c-15nt、55nt-c-14ntから選択されるいずれかの長さ特徴を有するarRNAである。
いくつかの実施形態では、前記arRNAはオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、前記arRNAは、1つまたは複数の化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記化学修飾、2'-O-メチル化修飾、ホスホロチオエート修飾、デオキシリボヌクレオシド置換修飾、LNA修飾、2’-O-(2-メトキシエチル)修飾から選択される1つまたは複数である。いくつかの実施形態では、前記化学修飾は、
1)最初の2、3、4または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
2)最後の2、3、4、または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
3)ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの2’-O-メチル化修飾、
4)最初の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
5)最後の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
6)最初の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
7)最後の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
8)最初の1、2、3、4または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
9)最後の1、2、3、4、または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
10)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、及び
11)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、1、2、3、または4ヌクレオチドの間隔でのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾
から選択される1つまたは複数である。
好ましくは、いくつかの特定の実施形態では、前記化学修飾は、
1)最初の2、3、4または5ヌクレオチド及び最後の2、3、4、または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
2)ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの2’-O-メチル化修飾、
3)最初の2、3または4ヌクレオチド及び最後の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
4)最初の2、3または4ヌクレオチド及び最後の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
5)最初の1、2、3、4または5ヌクレオチド間結合及び最後の1、2、3、4、または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
6)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合または多くとも1ヌクレオチド間結合の間隔でのホスホロチオエート修飾
から選択される1つまたは複数である。
いくつかの実施形態では、前記arRNAは、以下から選択されるいずれかの化学修飾を含む:
CM0、CM1、CM2、CM3、CM4、CM6、CM148、CM149、CM150、CM151、CM152、CM153、CM94、CM119、CM120、CM123、CM125。
いくつかの実施形態において、前記arRNAの標的となる標的RNAは、pre-mRNA、成熟mRNA、リボソームRNA、転移RNA、長鎖ノンコーディングRNAまたはスモールRNAからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記標的RNAは、プレメッセンジャーRNAである。いくつかの実施形態において、前記標的RNAは、IDUA遺伝子の転写配列である。いくつかの実施形態において、前記標的RNAは、IDUA遺伝子から転写されたpre-mRNAまたは成熟mRNAである。いくつかの実施形態において、前記標的RNAは、IDUA遺伝子から転写されたpre-mRNAである。いくつかの実施形態では、前記標的RNAは、ハーラー症候群患者のゲノムにおけるNM_000203.4(IDUA)-c.1205G>A(p.Trp402Ter)に対応する変異部位を含み、前記arRNAが前記標的RNAにハイブリダイズすると、前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは前記標的RNAの前記変異部位の反対側になる。この場合、前記変異部位はarRNAの標的ヌクレオシドである。いくつかの実施形態において、前記arRNAは、前述のRNA編集方法に使用し得る。
いくつかの実施形態では、前記arRNAが、下記のものから選択される任意の配列を含む、
1)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*Cm-G*A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm-C-C-A*G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
2)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*-Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*Cm-G*-A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm*Cd-Cd*Ad*-G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
3)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*-G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*-Cm-G*A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm-Cd-Cd*Ad*G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
4)Gmoe*Amoe*Cmoe*Gmoe-C-C-C-A-C-C-G-Um-G-Um-G-G-Um-Um-G-C-Um-G-Um-C-C-A-G-G-A-C-G-G-Um-C-C-C-G-G-C-C-Um-GC-G-A-C-A-C-Um-Um-C-G-G-C-C-C-A-G-A-G-C-Um-G-C-Um-C*Cmoe*Umoe*Cmoe*Amoe(配列番号31);または
5)G+*A+*C+*G+C-C-C-A-C-C-G-Um-G-Um-G-G-Um-Um-G-C-Um-G-Um-C-C-A-G-G-A-C-G-G-Um-C-C-C-G-G-C-C-Um-GC-G-A-C-A-C-Um-Um-C-G-G-C-C-C-A-G-A-G-C-Um-G-C-Um-C*C+*U+*C+*A+(配列番号31)。
構築物、組成物、粒子、細胞、ライブラリーまたはキット
本発明の一態様はまた、前述のarRNAコード配列を含む構築物を提供する。いくつかの実施形態において、前述構築物は一本鎖DNAである。いくつかの実施形態において、前述構築物は二本鎖DNAである。いくつかの実施形態において、前述構築物は、RNAとDNAのハイブリッド分子である。いくつかの実施形態において、前述構築物は二本鎖RNAである。いくつかの実施形態において、前述構築物は、前述arRNAのアンチセンス核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前述構築物は環状である。いくつかの実施形態では、前述構築物は線形である。
いくつかの実施形態において、前述構築物はプラスミドである。いくつかの実施形態では、前述構築物は、ウイルスのゲノムの全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、前述ウイルスは、AAV、レンチウイルス、ファージ、またはバキュロウイルスから選択される。したがって、本出願はまた、前述構築物を含むウイルスを提供する。本出願の一態様は、前述のarRNAまたは前述の構築物を含む組成物、リポソーム、エクソソーム、脂質ナノ粒子、細胞、ライブラリーまたはキットを提供する。いくつかの実施形態において、前述組成物、リポソーム、エクソソーム、脂質ナノ粒子、細胞、ライブラリーまたはキットは、前述のarRNAのうちの1つのみ、または前述arRNAコード配列を含む構築物を含む。いくつかの実施形態では、前述組成物、リポソーム、エクソソーム、脂質ナノ粒子、細胞、ライブラリーまたはキットは、2つ以上の前述のarRNAまたは前述arRNAコード配列を含む構築物を含む。
いくつかの実施形態では、前述組成物は医薬組成物であり、したがって、前述組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
いくつかの実施形態では、前述細胞は前述構築物を含み、前述構築物は細胞質に位置する。いくつかの実施形態では、前述細胞は構築物を含み、前述構築物はゲノムDNAの一部である。
ハーラー症候群を予防または治療する方法
本発明の一態様はまた、ハーラー症候群を治療または予防するための方法を提供し、その方法は、NM_000203.4(IDUA)-c.1205G>A(p.Trp402Ter)に相当する突然変異部位を有するハーラー症候群患者に、前述のarRNA、または前述の構築物、リポソーム、エクソソーム、脂質ナノ粒子または細胞を投与すること、または前述のRNA編集法によってハーラー症候群に関連する症状を予防または治療することを含む。
いくつかの実施形態において、前述投与は、静脈内注射、皮下注射、動脈注入、筋肉内注射、単一器官局所注射、または頭蓋内注射から選択される。いくつかの実施形態において、前述投与は、単回投与、例えば、患者への前述arRNAコード配列を含む細胞の単回注入であり、前述細胞は、特定の組織にコロニーを形成する(定植する)。
いくつかの実施形態において、前述投与は、2回、3回またはそれ以上の投与である。いくつかの実施形態において、2回の投与の間の間隔は、21日より長い。いくつかの実施形態において、各2回の投与の期間は、17日以上、14日以上、12日以上、11日以上、または10日以上である。いくつかの実施形態では、前述2回の導入の間隔は、9~20日、9~16日、9~14日、12~19日、12~15日、または12~13日である。いくつかの実施形態では、前述2回の導入の間隔は、7日、8日、11日、15日、18日、19日、20日である。
いくつかの実施形態では、前述投与は、標的組織中のarRNA濃度を5nM以上、好ましくは10nM以上、より好ましくは20nM以上に維持することができる。いくつかの特定の実施形態では、前述投与は、標的組織中のarRNA濃度を、5~160nM、たとえば10~160nM、20~160nM、40~160nM、20~80nM、40~80nM、または20~40nMに維持し得る。いくつかの特定の実施形態では、前述投与は、標的組織中のarRNA濃度を15nM、17nM、19nM、21nM、22nM、23nM、24nM、25nM、26nM、27nM、28nM、29nM、30nM、31nM、32nM、33nM、34nM、35nM、36nM、37nM、38nM、39nM、41nM、43nM、45nM、55nM、65nM、75nM、85nM、95nM、105nM、115nM、125nM、135nM、145nMまたは155nMに維持し得る。
本発明の技術構成は、具体的な実施例を参照して以下でさらに詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されない。特に指定のない限り、下記の試薬はすべて市販されている。簡潔にするために、いくつかの操作については、使用されるパラメータ、ステップ、及び機器を詳述していないが、これらは、当業者によってよく知られており、再現可能であることを理解されたい。
本明細書で使用されている細胞GM06214及びGM01323は、米国のCoriell社から購入した。その中で、GM06214はハーラー症候群の患者に由来する線維芽細胞であり、そのIDUA遺伝子のエキソン9の1293番目のヌクレオチドはGからAに変異し、そのコドンはTGGからTAGに変異している([Trp402Ter(W402X)])(細胞についての上記の説明は、製品仕様書によるものであり、前記変異がNM_000203.4(IDUA)-c.1205G>A(p.Trp402Ter)変異に相当する)。GM01323はシャイエ症候群(Scheie syndrome)の患者に由来する線維芽細胞であり、健康なヒト由来の線維芽細胞と比較して、そのIDUA活性は0.3%である。ハーラー症候群と比較して、シャイエ症候群は比較的軽度の症状を示す。したがって、以下の実施例では、GM01323をIDUA酵素活性の陽性対照として使用し、GM06214を疾患モデル及び試験細胞として使用した。
実施例1:GM06214変異遺伝子型の検出
GM06214細胞を、15%血清を含む線維芽細胞培養培地(ScienCell、FM培地、カタログ番号:2301)に入れ、1%線維芽細胞増殖サプリメント(ScienCell、GFS、カタログ番号:2301)を添加し、37℃、5%COインキュベーターで2~3日間培養した。細胞のコンフルエンスが90%に達したら、0.25%のトリプシンで消化し、15%の血清を含む線維芽細胞培地で消化を停止させた。DNA抽出は、TianGene(登録商標)(TIANGEN Biotech(Beijing)Co.,Ltd.)細胞DNA抽出キット(カタログ番号:DP304-03)を使用して、取扱説明書に従って実施した。
NCBI-Primer blast(URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)を使用して、IDUA標的部位の上流及び下流配列のプライマーを設計した。配列番号1:CGCTTCCAGGTCAACAACAC(フォワードプライマーhIDUA-F1);配列番号2:CTCGCGTAGATCAGCACCG(リバースプライマーhIDUA-R1)。PCR反応を行い、PCR産物をサンガーシーケンシングにかけた。図1に示すように、検証した結果、上記のGM06214細胞の変異型は、IDUAゲノムの15704位でGがAに変化した病原型変異、すなわち、c.1205G>A(p.Trp402Ter)変異であると確定された。
実施例2:GM06214細胞へのarRNAのエレクトロトランスフェクション後のIDUA酵素活性及び編集効率の検出
転写後のIDUA遺伝子のmRNA前駆体(pre-mRNA)及び成熟mRNA標的部位の上流及び下流配列について、以下のarRNA配列を設計及び合成した。
pre-mRNAに対するターゲティングarRNA:
GACGCCCACCGUGUGGUUGCUGUCCAGGACGGUCCCGGCCUGCGACACUUCGGCCCAGAGCUGCUCCUCAUCCAGCAGCGCCAGCAGCCCCAUGGCCGUGAGCACCGGCUU(配列番号3、Pre-55nt-c-55nt);
成熟mRNAに対するターゲティングarRNA:
GACGCCCACCGUGUGGUUGCUGUCCAGGACGGUCCCGGCCUGCGACACUUCGGCCCAGAGCUGCUCCUCAUCUGCGGGGCGGGGGGGGGCCGUCGCCGCGUGGGGUCGUUG(配列番号4、m-55nt-c-55nt);
ランダムに設計した非ターゲティングarRNA:
UACCGCUACAGCCACGCUGAUUUCAGCUAUACCUGCCCGGUAUAAAGGGACGUUCACACCGCGAUGUUCUCUGCUGGGGAAUUGCGCGAUAUUCAGGAUUAAAAGAAGUGC(配列番号5、Random-111nt)。
その中で、mRNA前駆体(pre-mRNA)及び成熟mRNAに対する変異部位に対応するarRNA中の変異部位(標的配列の標的アデノシン)の塩基はCであるので、標的アデノシンと、標的アデノシンに対応するarRNAの塩基との間はA-Cミスマッチを形成する。合成されたarRNAの長さは好ましくは111ntである。合成されたarRNAは、CM0(配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾され、最初3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾される)で化学修飾された。次のステップで細胞をエレクトロトランスフェクトした。
GM06214細胞が約90%のコンフルエンスに成長したら細胞を消化し、消化を停止してカウントした。エレクトロトランスフェクション中に、600万個の細胞を400μlのプレミックスエレクトロトランスフェクション溶液(Lonza、カタログ番号:V4XP-3024)で再懸濁し、20μgのarRNAを追加し、均一に混合した後、各20μlを1つのエレクトロトランスフェクションシステムとして使用し、LonzaNucleofectorエレクトロトランスフェクション機器を使用してエレクトロポレーション条件を予め設定してエレクトロトランスフェクションした。エレクトロトランスフェクション後、細胞を15%血清を含む2mlの線維芽細胞培養液(ScienCell、FM培地、カタログ番号:2301)に迅速に移し、6ウェルプレートに播種した。細胞を37℃、5%COインキュベーターで培養した。
エレクトロトランスフェクションの48時間後、細胞を収集し、酵素活性アッセイ及びIDUA mRNAのAからGへの変異率を検出した。
IDUA mRNAのAからGへの変異率の検出:
設計及び合成したarRNAをRNA酵素フリー水(TransGen、カタログ番号:GI201-01)で必要な濃度に溶解し、-80℃で保存した。GM06214細胞が約90%のコンフルエンスに成長したら細胞を消化し、消化を停止してカウントした。100万個の細胞を取り、200pmolのarRNAを加えて、100μlの容量の条件でエレクトロトランスフェクトした。エレクトロトランスフェクションの48時間後、細胞をカウントし、生存率を測定した。細胞をRNA酵素フリーの遠心チューブに移し、遠心分離した後に上清を捨て、QIAGEN RNA抽出キットを使用してRNAを抽出した(QIAGEN、カタログ番号74134)。取扱説明書に従って、0.35mlのBuffer RLT Plusを5×10細胞に加え、ピペッティングにより均一に混合した(凍結保存した細胞からRNAを直接抽出する場合は、PBSで1回洗浄する)。溶解した細胞溶液をgDNA Eliminatorスピンカラムに加え、8000g以上で30秒間遠心分離し、カラムを捨てて液体を残した。70%エタノールを1倍量加え、ピペッティングで均一に混合し、すぐに次のステップに進んだ。液体をRNeasyMinEluteスピンカラムに加え、8000g以上で15秒間遠心分離し、廃液を捨てた。700μlのBuffer RW1をRNeasyMinEluteスピンカラムに加え、8000g以上で15秒間遠心分離し、廃液を捨てた。500μlのBuffer RPEをRNeasyMinEluteスピンカラムに加え、8000g以上で15秒間遠心分離し、廃液を捨てた。500μlの80%エタノールをRNeasyMinEluteスピンカラムに加え、8000g以上で2分間遠心分離し、廃液を捨てた。RNeasyMinEluteスピンカラムを2mlコレクションチューブに入れ、キャップを開いた状態で最高速度で5分間遠心分離し、カラムを乾燥させた。RNeasyMinEluteスピンカラムを1.5mlコレクションチューブに入れ、カラムメンブレンの中央に14μlのRNA酵素フリー水を滴下し、最高速度で1分間遠心分離してRNAを溶出した。
抽出したRNAの濃度をNanodrop(Thermo、カタログ番号:Nanodrop2000)で測定し、1μgのRNAを逆転写(Thermo、逆転写酵素カタログ番号:28025013)に使用した。逆転写システムは表1に示すように構成し、65℃で5分間インキュベートした後、すぐに氷浴で冷却した。次に、表2に示すシステムを使用して、インキュベーションを37℃で50分間続けた。逆転写酵素を70℃で15分間不活性化した。表3に示す条件下で、実施例1のPCRプライマーを使用してPCRを実施した。PCRの終了後、2μlのPCR産物を取ってアガロースゲル電気泳動に使用し、電気泳動の結果からPCR産物の濃度及びバンドのサイズが正しいかどうかを初歩的に確認した。精製後、PCR産物についてライブラリーを構築し、次世代シーケンシングに送った。
その後の逆転写に係るすべての実験では、本実施例の逆転写システム及びプログラムを使用した。
Figure 2023521487000002
Figure 2023521487000003
Figure 2023521487000004
酵素活性の検出:
GM06214細胞を消化し、遠心分離し、0.1%Triton X-100を含む28μlの1×PBSに再懸濁し、氷上で30分間溶解した。次に、25μlの細胞溶解物を190μmの4-メチルウンベリフェリル-α-L-イズロニダーゼ(4-methylumbeliferyl-α-L-iduronidase)を含む25μlの基質(Cayman、2A-19543-500、0.2%Triton X-100含有、pH3.5、0.4Mギ酸ナトリウム緩衝液に溶解)に添加した。暗所で37℃で90分間インキュベートした。200μlの0.5M NaOH/グリシン溶液(北京化工、NaOH、カタログ番号:AR500G;Solabriо、Glycine、カタログ番号:G8200)、pH10.3を加えて、触媒反応を不活性化した。4℃で2分間遠心した。上清を96ウェルプレートに移し、Infinite M200機器(TECAN)を使用して365nmの励起波長及び450nmの励起波長を使用して蛍光値を測定した。
本実施例の結果は図2に示すように、arRNAがpre-mRNAを標的とする場合、より高い酵素活性及び編集効率を示すことができるのに対し、成熟mRNAを標的とするarRNAが著しく低い酵素活性及び編集効率を示す。したがって、以下の実施例に係るarRNAはすべてpre-mRNAを標的とするarRNAである。
実施例3:IDUAレポーター細胞株でのarRNAのエレクトロトランスフェクション後のIDUA標的部位編集効率の検出
図3Aに示すように、レンチウイルスプラスミド上のmCherry及びGFPタンパク質を発現する配列の間に、ヒト(NM_000203.4(IDUA)-c.1205G>A(p.Trp402Ter))(IDUA)_c.1239 G>A(p.Trp402Ter)変異部位を有し、且つ上流及び下流に各100bp程度のIDUA遺伝子転写配列を挿入して、プラスミドを構築した。上記のように構築されたプラスミドをウイルスにパッケージし、293T細胞に感染し、ゲノムに組み込んた後、IDUA-レポーターモノクローナル細胞をスクリーニングした。このモノクローナル細胞は、挿入配列のIDUA標的アデノシンでのTAG終止コドンの影響を受けるため、mCherryタンパク質のみを発現するが、細胞をarRNAで編集すると、TAGからTGGへの転換が発生し、その後にあるGFPタンパク質を正常に発現させることができる。GFPタンパク質の陽性細胞比率は、arRNAで細胞を編集する編集効率を反映できる。51ntから111ntまでの長さが異なる4つのarRNA(25nt-c-25nt、35nt-c-35nt、45nt-c-45nt、55nt-c-55nt)を好ましく設計し、また4つの非ターゲティングランダム対照arRNA(111nt-random、91nt-random、71nt-random、及び51nt-random)を設計した。各arRNAについてCM0で化学修飾をした。本実施例で使用されたarRNAは、以下の表4に示す。
細胞について実施例2のエレクトロトランスフェクション条件で異なるarRNAをトランスフェクトした後、それぞれ1日目から7日目にGFP陽性細胞の比率を検出し、編集効率を初歩的に比較した。図3Bから分かるように、編集の最高ピークは2日目(48時間)に現れ、編集効率が最も高い配列は全長91ntの45nt-c-45ntであり、全長51ntのarRNAの編集効率は非常に低かった。これによって、arRNAの長さが小さすぎてはならないが、配列が長いほど編集効率が高くなるわけではないことがわかる。
Figure 2023521487000005
実施例4:GM06214細胞における異なる長さのarRNAのエレクトロトランスフェクション後の異なる時点でのRNA編集効率の検出
実施例2のエレクトロトランスフェクション条件を使用して、GM06214細胞に異なる長さのarRNAをエレクトロトランスフェクトし(表4を参照、各arRNAについてCM0で化学修飾をした)、実施例3の方法により、エレクトロトランスフェクションの2日目、4日目、6日目、8日目、10日目、12日目、及び14日目に、それぞれ細胞内酵素活性を検出し、2日目と4日目に細胞内RNA標的部位のAからGへの変異率を検出した。その結果、図4A及び4Bに示すように、arRNAが91ntである場合(45-c-45)、酵素活性が最も高く、エレクトロトランスフェクション後6日目もIDUA酵素活性は高いレベルを維持した。AからGへの変異率に関しては、111ntと91ntはほぼ同じ編集効率を示したが、51ntのarRNAはなかなか理想的な編集効率を達成できなかった。
実施例5:arRNAの最適化
文献研究を通じて、エレクトロトランスフェクションの方法は将来の疾患治療の目的を完全に満たすことができないと考える。したがって、リポフェクションの方法をテストした。たとえば、本実施例では、lipofectamineRNAiMAX(Invitrogen 13778-150)を使用してarRNAをトランスフェクトした。まず、111ntに基づいて両端から配列を同時にトランケートして新しいarRNAを設計し、次にそれらの一端を固定してもう一方の端からトランケートした。このような設計方法によって、14のarRNA配列が生成された。同時に、4つのランダム配列(random)を対照として設計した。本実施例で使用されているarRNA配列は、以下の表5に示されている。各arRNAはCM0方式で化学的に修飾された。トランスフェクションの48時間後にIDUAの酵素活性をテストすることにより(方法は実施例3と同じ)、arRNAの長さが111nt以上の場合、編集効率が低下することが分かった。また、同じ長さのarRNAの場合、ヌクレオシドCを標的とする両端の配列の長さが一致していない場合、編集効率が高くなることが多く、5’の長さが3’の長さよりも大きい場合、編集効率が高くなることが多い(図5)。その中で、arRNAの3’末端は好ましくは5ntより長く、5nt~45ntの範囲で編集効率の最高値に達し、5’末端は好ましくは25ntより長く、35ntを超えると編集効率が大幅に向上する。なお、全長が61ntと51ntと短いarRNAの酵素活性は常に低い。
さらに、本実施例で試験されたarRNAのうち、101ntの45nt-c-55nt(配列番号17)、91ntの55nt-c-35nt(配列番号13)、81ntの55nt-c-25nt(配列番号24)及び71ntの55nt-c-15nt(配列番号25)で編集された細胞は、より優れたIDUA酵素活性を示した。
Figure 2023521487000006
Figure 2023521487000007
実施例6:3’端からの編集部位の最適な長さの選別
IDUA遺伝子RNAには、標的部位の近くに複数の連続したCが含まれている。したがって、標的RNA配列に相補的なarRNAを設計する場合、複数の連続するCは複数のGに対応する。複数のGで構成されるPoly Gは、現在の化学合成技術では合成が難しいため、なるべく避ける必要がある。前記複数のGは、標的部位からターゲティングヌクレオシドの3’末端の方向に20nt(4つの連続するG)及び25nt(9つの連続するG)に位置しているため、以下の実施例では、設計されたarRNAの3’末端を25nt未満にして、Poly G構造を可能な限り回避しようとする。また、好ましい3’末端は20nt未満である。
実施例6では、81nt:55-c-25、71nt:55-c-15配列において、高いIDUA酵素活性及びAからGへの変異率が検出され、より高い編集効率が表された。3’末端の最短で最適な長さを見つけるために、3’末端の編集部位からの25nt(81nt:55-c-25)から10nt(66nt:55nt-c-10nt)までの配列を設計及び検出した。arRNAの配列は表6に示す。各arRNAはCM0方式で化学的に修飾された。GM06214細胞をlipofectamineRNAiMAXでトランスフェクトし、トランスフェクションの前日に6ウェルプレートに1ウェルあたり3*10細胞を播種し、トランスフェクションの日に細胞に新鮮な培地を交換した。細胞を20nMの濃度のarRNAでトランスフェクトした。酵素活性の検出のために、トランスフェクションの48時間後に細胞を回収した。
酵素活性の検出方法は次の通りである。GM06214細胞を消化し、遠心分離し、0.1%Triton X-100を含む33μlの1×PBSに再懸濁し、氷上で30分間溶解した後、4℃で2分間遠心分離した。次に、25μlの細胞溶解物を190μmの4-メチルウンベリフェリル-α-L-イズロニダーゼ(4-methylumbeliferyl-α-L-iduronidase)を含む25μlの基質(Glycosynth、44076)に添加した。この基質は、0.4Mギ酸ナトリウム及び0.2%Triton X-100を含有する、pH3.5の緩衝液に溶解した。暗所で37℃で30分間インキュベートした。200μlの0.5M NaOH/グリシン溶液(北京化工、NaOH、カタログ番号:AR500G;Solabriо、Glycine、カタログ番号:G8200)、pH10.3を加えて、触媒反応を不活性化した。Infinite M200機器(TECAN)を使用して蛍光値を測定した。励起光は365nm及び450nmの波長を使用した。細胞溶解物を取り、タンパク質濃度を測定した。
図6Aに示すように、IDUA酵素活性の検出(結果はGM01323細胞のIDUA酵素活性に対する倍数として示されている)により、3’末端からのターゲティングヌクレオシドの距離が25nt-10ntであるarRNAは、いずれも理想的な編集効率を達成できることが分かった。3’の長さをさらに短くするために、新しいバッチ、すなわち、配列の編集部位が3’末端から16nt-5ntの長さであるarRNAのバッチを再合成した。IDUA酵素活性の結果を図6Bに示す。2つの実験では、同じarRNA配列をGM06214細胞にトランスフェクトして48時間後、得られた酵素活性の結果は基本的に同じであった。さらに、3’末端の長さが7nt-10ntのarRNAも比較的理想的な編集効率を示し、3’末端の長さが9nt-10ntのarRNAの方がより効果的であった。図6Bの結果から、全長が61nt未満のarRNAの編集効果が理想的ではないこともわかった。
実施例6のデータ及び図6Aと6Bの結果と組み合わせると、arRNAの3’末端の長さが9nt~25ntの範囲内に制御することがよいことが分かる。また、arRNAの全長は61nt以上であるのがよい。
Figure 2023521487000008
Figure 2023521487000009
Figure 2023521487000010
実施例7:好ましい3’端長さが固定されている条件下で、最適な5’端長さの選別
異なる長さの2つのarRNA:76nt:55-c-20、71nt:55-c-15を選択し、表7に示すように、3’末端の固定長に基づいて、5’末端は徐々にトランケートされた。各arRNAはCM0方式で化学的に修飾された。GM06214細胞をlipofectamineRNAiMAXでトランスフェクトした後、IDUA酵素活性を実験によって測定した。その結果、図7に示すように、arRNAの全長は61nt未満の場合、その編集効率は大幅に低下したが、全長は61ntより大きい場合、3’末端が15ntまたは20ntであり、5’末端の長さが40ntを超える場合、図7に示すように、arRNA編集後の細胞のIDUA酵素活性が有意に向上した。
Figure 2023521487000011
Figure 2023521487000012
実施例8:標的部位の編集効率に対するターゲティングヌクレオシド位置シフトの影響に関する研究
前述の実施例から、標的部位の編集効率に対するターゲティングヌクレオシド位置シフトの影響を研究するために、3つの長さのarRNAを好ましく選択した。ターゲティングヌクレオシドを中心位置から3’末端に徐々に移動しながら、arRNAの合成に適さないいくつかの構造の回避の必要性を考慮して一連のarRNA配列を設計した。arRNAを表8に示す。各arRNAはCM0方式で化学的に修飾された。GM06214細胞をlipofectamineRNAiMAXでトランスフェクトしてから48時間後、酵素活性の検出のためにサンプルを収集した(酵素活性検出法は実施例7と同じであり、結果はGM01323中のIDUA酵素活性の倍数として示された)。実験結果は、図8に示すように、ターゲティングヌクレオシドの位置を67nt、70nt、及び72nt arRNA上で移動すると、全長は変化せず、5’末端の長さは43nt~55ntであり、3’末端の長さは9nt~25ntである場合、ターゲティングヌクレオシド位置の移動は酵素活性に有意な影響を及ぼさなかった。すなわち、本実施例は、前述の好ましいarRNAの長さ、5’の長さ、及び3’の長さの範囲内で、各arRNAが比較的良好な編集効率を達成できることを証明している。
Figure 2023521487000013
Figure 2023521487000014
Figure 2023521487000015
実施例9:編集効率に対するarRNA化学修飾の影響
まず、3つの長さのarRNA(55-c-16(配列番号30)、55-c-14(配列番号31)及び55-c-11(配列番号34)において、arRNA編集効率に関するCM1とCM0の修飾の影響を比較した。前記CM1の修飾方法は次のとおりである。
CM1:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、配列内のすべてのUは、2’-O-メチル化によって修飾されている。
その結果、図9Aに示すように、CM1によって修飾されたarRNAの編集効率は、CM0によって修飾されたarRNAの編集効率よりも一般的に優れている。
そして、71ntと76ntの2つの好ましい長さのarRNAを選択し、異なる修飾の組み合わせが編集効率に与える影響を調べた。具体的な修飾方法を以下に示し、具体的な配列及び修飾アノテーションを表9に示す。
CM2:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオシドは2’-O-メチル化によって修飾されている;
CM3:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオシドは2’-O-メチル化によって修飾されている;
CM4:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングトリプレットの3つの塩基とそれらの3’最近傍ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている;
CM5:ターゲティングヌクレオシド、5’末端及び5’末端に隣接する5つの塩基、ならびに3’末端及び3’末端に隣接する5つの塩基を除いて、すべてのヌクレオチドは2’-OMeによって修飾されるとともに、配列の最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエートによって修飾されている;
CM6:配列の最初の5ヌクレオチド及び最後の5ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の5ヌクレオチドと最後の5ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている。
異なるarRNAをそれぞれlipofectamineRNAiMAXでGM06214細胞にトランスフェクトしてIDUA mRNAを編集した。トランスフェクション後48時間の細胞を収集してIDUA酵素活性の検出をした(酵素活性検出法は実施例7と同じであり、結果はGM01323中の酵素活性の倍数として示された)。図9Bに示す実験結果から見て、CM5を除いて、他の修飾の組み合わせの編集効率は、CM1修飾よりも優れている。
IDUA酵素活性の検出は、タンパク質レベルでIDUAタンパク質機能を回復するさまざまな長さのarRNAの能力を比較できる。RNAレベルからarRNAの編集能力を迅速に調査するために、本実施例では酵素切断法を使用してarRNAの編集効率を検出した。具体的な方法は次のとおりである。IDUAのmRNA点突然変異の近くの部位の正常な配列にはCTGGが含まれており、それは突然変異後にCTAGになる。CTAGの4つの塩基は制限エンドヌクレアーゼBfaI酵素切断部位であるため、導入されたarRNAが細胞内で標的部位AからGへの編集を実施した場合、制限エンドヌクレアーゼBfaI酵素切断部位CTAGはCTGGに変換され、BfaI酵素切断は発生しなくなる。細胞にarRNAをトランスフェクトしてから48時間後、細胞ゲノムを抽出して逆転写した。サンプルは、プライマーhIDUA-62F:CCTTCCTGAGCTACCACCCG(配列番号78)及びhIDUA-62R:CCAGGGCTCGAACTCGGTAG(配列番号79)を使用してPCRに供した。PCR産物を精製し、酵素切断のために回収した。酵素切断された生成物を2%アガロースを用いたゲル電気泳動にかけ、全体のグレー値に対するゲル画像上の未切断フラグメントのパーセンテージを計算することによって編集効率を計算した。図9Cに示すように、編集効率の結果は、arRNA酵素活性の結果と一致する傾向を示している。
Figure 2023521487000016
Figure 2023521487000017
Figure 2023521487000018
実施例10:CM1で修飾された55nt-c-16nt、55nt-c-14nt、55nt-c-11ntの濃度勾配実験
さまざまな濃度でのarRNAの編集能力を調べるために、本実施例では、CM1で修飾された55nt-c-16nt、55nt-c-14nt、及び55nt-c-11ntをテスト用に選択した。160nM、80nM、40nM、20nM、10nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nMの9種類の希釈濃度のarRNAを取り、lipofectamine RNAiMAXを使用してGM06214細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞の酵素活性をテストし、遺伝子編集効率を次世代シーケンシングでテストした。図10Aに示すように、3つのarRNAの酵素活性は全体的な傾向が基本的に同じであり、トランスフェクション濃度が10nMより高い場合、55nt-c-16nt-CM1の酵素活性は他の2つのarRNAの酵素活性よりも高かった。しかし、酵素活性の変曲点濃度は20nM~5nMの間であった。5nM未満である場合、編集効率は理想的ではなかった。図10Bに示すように、次世代シーケンシングによって検出された編集効率の全体的な傾向は、酵素活性と一致していた。リポソームでトランスフェクトされたarRNAの濃度は、好ましくは5nM以上、好ましくは10nM以上、より好ましくは20nM以上であることが分かる。
実施例11:IDUAはarRNA編集後にプロテアーゼ活性を維持可能
この実験では、ヒトIDUAの変異部位を標的とする3つの好ましいarRNAを使用し、CM1方式で化学的に修飾し、GM06214細胞で有意に増加したIDUA酵素活性が得られ、約3週間以上持続した。
異なる時間でのIDUA酵素活性及び編集効率の比較のために20nMの濃度を選択した。図11Aに示すように、GM06214細胞のarRNAトランスフェクション後、14日間IDUA酵素活性を継続的に検出した。結果は、トランスフェクション後の酵素活性のピークが4日目から10日目であり、主に4日目から9日目に集中することを示した。また、14日目の酵素活性は2日目よりも高いので、17日目と21日目の酵素活性を検出した。図12Aから、21日目の酵素活性は依然としてトランスフェクション後1日目より高く、酵素活性はGM01323の約6~10倍であることが分かる。図11BはIDUA標的部位の編集効率を示している。図から、arRNAトランスフェクション後の編集効率は高いものから低いものまであり、最高のピークはトランスフェクション後の初日であり、約70%の編集であり、トランスフェクション後10日目の編集効率は対照群と同じであることが分かる。
したがって、2回目のトランスフェクションを10~14日目に行うと、IDUA酵素活性は1回目のトランスフェクションの2日目よりも高いレベルに維持されると推測しやすい。ただし、2回目のトランスフェクションを17日目から21日目に行うと、IDUA酵素の活性はGM01323の酵素の活性よりも少なくとも高くなり、細胞のIDUA酵素活性は比較的正常なレベルに維持できる。
実施例12:ヒト初代肝細胞上のarRNAによるIDUA(c.1205-5bp)野生部位のインビトロ編集
この実験では、初代培養ヒト肝細胞でLEAPER技術を使用して野生型IDUA遺伝子座を編集する。本実施例では、CAGのAを標的として編集し、本願の方法による肝細胞のIDUAの編集効率をテストした。arRNAの配列を表10に示す。
ヒト肝臓初代細胞はLONZA(カタログ番号:HUCPI)から購入し、製造元の説明書に従って細胞を回復して培養した(回復培地カタログ番号:MCHT50、プレーティング培地カタログ番号:MP100)。細胞が付着した後、肝細胞維持培地5Cに変更した(参考文献:Xiang C, Du Y, Meng G, et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro[J]. Science, 2019, 364(6438):399-402)。
ヒト肝細胞の付着培養の24時間後、arRNAをlipofectamine RNAiMAXでトランスフェクトした。arRNAのトランスフェクション濃度はそれぞれ20nMと40nMであった。サンプルは、トランスフェクションの0時間後、12時間後、24時間後、48時間後、72時間後にそれぞれ収集した。サンプル収集後、次世代シーケンシングによってサンプルの編集効率を検出した。図12に示すように、arRNAトランスフェクション後のIDUAの編集効率が最大40%に達せる。これは、本願の方法を使用して、ヒト肝細胞のIDUA転写物の標的アデノシンを編集することの実現可能性と有効性を示している。
Figure 2023521487000019
実施例13:化学修飾法及び長さの組み合わせの比較
本実施例では、GM06214細胞のc.1239 G>A(p.Trp402Ter)変異部位を編集することにより、本願の方法を従来技術の好ましい方法と比較した。本願で説明されている方法の利点がさらに示されている。
配列及び修飾方法を表11に示す。本出願に記載の方法の代表的な配列は55nt-c-15nt-CM1であり、先行技術(CN110352244A)から選択された陽性対照配列は36nt-c-13nt-CM11である。その中で、36nt-c-13nt-CM11は、編集部位「CCA」を除き、すべてのヌクレオチドは2’-O-Meによって修飾され、最初と最後の各4ヌクレオチド間はホスホロチオエート化された。さらに、本実施例では、本出願のCM0修飾配列(55nt-c-15nt)及びCM0修飾ランダム配列(Random-70)も比較された。
本実施例では、LipofectamineRNAiMAXを使用してarRNAをGM06214細胞にトランスフェクトしてから48時間後に、実施例7に示す方法を使用してIDUA酵素活性を検出した。結果を図13に示す。55nt-c-15nt-CM1は、36nt-c-13nt-CM11よりも有意に高い編集効率を持っていることがわかる。
Figure 2023521487000020
実施例14:arRNA編集効率に対する末端修飾の影響
本実施例では、CM1に基づいて、arRNAの両端に異なる量の2’MOE及びLNA修飾を行い、CM1修飾と比較した。ここで、2’MOEは2’-O-(2-メトキシエチル)修飾を指す。
表12に示すように、配列55nt-c-20nt(配列番号26)は、それぞれCM1、CM148、CM149、CM150、CM151、CM152及びCM153によって修飾され、本実施例の試験に使用された。本実施例では、LipofectamineRNAiMAXを使用してarRNAをIDUAレポーター細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション濃度は20nMであった。蛍光強度は、それぞれ48時間(2日目)及び168時間(7日目)後にフローサイトメトリーによって測定された。結果を図14に示す。CM151の編集効率が有意に高く、CM148がそれに続き、さらに、CM148、CM149、CM150、CM151、CM152、及びCM153はすべて、CM1の修飾方法よりも優れていることが分かる。
本実施例で使用されている具体的な修飾方法(CM1は上記のとおり)は次のとおりである。
CM148:配列の最初の4ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の3ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
CM149:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
CM150:配列の最初の2ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の1ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
CM151:配列の最初の4ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の3ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている;
CM152:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている;
CM153:配列の最初の2ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている。
Figure 2023521487000021
Figure 2023521487000022
実施例15:arRNA編集効率に対するチオ、ジメトキシ、及びデオキシリボヌクレオシド置換の組み合わせの修飾の影響
本実施例では、arRNAにより多くのホスホロチオエートと2’-O-Me修飾を追加し、デオキシリボヌクレオシド置換を導入しようとしている。
具体的な配列修飾は次の通りである。
CM71:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-OMeで修飾され、配列のすべてのUと、ターゲティングトリプレットを除くすべてのCは2’-OMeで修飾され、最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートによって修飾されている。
CM94:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端の4番目のヌクレオチド間結合から3’末端の3番目のヌクレオチド間結合まで、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’最近傍ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されている。
CM104:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチドは2’-O-メチル化によって修飾され、配列のすべてのUと、ターゲティングトリプレットを除くすべてのCは配列内で2’-O-メチル化によって修飾されており、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’最近傍ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合はホスホロチオエートで修飾されている。
CM105:CM104のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングヌクレオチドCはデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
CM106:CM104のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
CM107:CM94のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングヌクレオチドCはデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
CM108:CM94のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
CM114:CM94のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’最近傍ヌクレオチド間結合もホスホロチオエートで修飾されている。
CM115:CM94のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの3’最近傍ヌクレオチド間結合もホスホロチオエートで修飾されている。
CM116:CM94のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングヌクレオチドの5’最近傍ヌクレオチドの5’最近傍ヌクレオチド間結合もホスホロチオエートで修飾されている。
CM117:CM94のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングヌクレオチドの3’最近傍ヌクレオチド間結合もホスホロチオエートで修飾されている。
CM118:CM115のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングヌクレオチドCはデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
CM119:ターゲティングヌクレオチドCの5’末端ヌクレオチド間結合はホスホロチオエートで修飾されていないこと以外に、その他の修飾はCM118と同じである。
CM120:CM116のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングヌクレオチドCはデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
CM121:CM117のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングヌクレオチドCはデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
CM122:CM114のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングトリプレットヌクレオチドはいずれもデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
CM123:ターゲティングトリプレットヌクレオチドはいずれもデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている他、その他の修飾はCM119と同じである。
CM124:CM116のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングトリプレットヌクレオチドはいずれもデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
CM125:CM117のすべての修飾を含めることに加えて、ターゲティングトリプレットヌクレオチドはいずれもデオキシリボヌクレオシドによって置換修飾されている。
本実施例で使用されている配列55nt-c-20nt(配列番号26)及び修飾アノテーションを表13に示す。本実施例では、LipofectamineRNAiMAXを使用してarRNAをIDUA Reporter細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション濃度は20nMであった。そして、72、120、及び168時間後、フローサイトメトリーによって蛍光強度を測定した。結果を図15に示す。CM94、CM123、CM125は編集効率が有意に高く、CM119とCM120はCM1よりも安定しており、高い編集効率を長期間維持できる。
Figure 2023521487000023
Figure 2023521487000024
Figure 2023521487000025
Figure 2023521487000026

Claims (31)

  1. LEAPER技術に基づく細胞中の標的RNAのターゲティング編集のための方法であって、前記標的RNAが、グアノシン(G)からアデノシン(A)への変異部位(標的アデノシン)を含むα-L-イズロニダーゼ(α-L-iduronidase,IDUA)の遺伝子転写配列を含み、前記方法が、
    arRNAまたは前記arRNAコード配列を含む構築物を前記細胞に導入することを含み、前記arRNAは、前記標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記arRNAは前記標的RNAにハイブリダイズした後、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することができる、
    前記方法。
  2. 標的アデノシンに対向する前記arRNA上のヌクレオシド(ターゲティングヌクレオシド)が、シチジン(C)、アデノシン(A)、またはウリジン(U)である、請求項1に記載の方法。
  3. 前記標的アデノシンが、その5’最近傍ヌクレオシド及び3’最近傍ヌクレオシドと標的トリプレットを形成し、前記標的トリプレットが5'-UAG-3’である、請求項1または2に記載の方法。
  4. 前記ターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオシドがC、GまたはUである、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオシドがAである、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ターゲティングヌクレオシドが、その5’最近傍ヌクレオシド及び3’最近傍ヌクレオシドとターゲティングトリプレットを形成し、前記ターゲティングトリプレットが5'-CCA-3’である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記arRNAの長さが61nt~121ntから選択される任意の整数のntである、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記arRNAの3’末端からの前記arRNAのターゲティングヌクレオシドの距離が、前記arRNAの5’末端からの前記ターゲティングヌクレオシドの距離よりも短い、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その3’末端からの距離が、9nt~60ntから選択される任意の整数のntである、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記arRNAのターゲティングヌクレオシドは、その5’末端からの距離が、25nt~60ntから選択される任意の整数のntである、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記arRNAが、
    55nt-c-35nt、55nt-c-25nt、55nt-c-24nt、55nt-c-21nt、55nt-c-20nt、55nt-c-19nt、55nt-c-18nt、55nt-c-17nt、55nt-c-16nt、55nt-c-15nt、55nt-c-14nt、55nt-c-13nt、55nt-c-12nt、55nt-c-11nt、55nt-c-10nt、55nt-c-9nt、50nt-c-20nt、50nt-c-15nt、または45nt-c-20ntから選択されるいずれかの長さ特徴を有するarRNAであり、CはarRNAの標的アデノシンに対向するターゲティングヌクレオシドであり、arRNAの方向は5’から3’の方向である、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記arRNAが、55nt-c-20nt、55nt-c-15nt、55nt-c-14ntから選択されるいずれかの長さ特徴を有するarRNAである、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記arRNAが1つまたは複数の化学修飾を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記化学修飾が、
    2'-O-メチル化修飾、ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、デオキシリボヌクレオシド置換修飾、LNA修飾、2’-O-(2-メトキシエチル)修飾から選択される1つまたは複数である、請求項13に記載の方法。
  15. 前記化学修飾が、
    1)最初の2、3、4または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
    2)最後の2、3、4、または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
    3)ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの2’-O-メチル化修飾、
    4)最初の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
    5)最後の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
    6)最初の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
    7)最後の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
    8)最初の1、2、3、4または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
    9)最後の1、2、3、4、または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
    10)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、及び
    11)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、1、2、3、または4ヌクレオチドの間隔でのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾
    から選択される1つまたは複数である、請求項13または14に記載の方法。
  16. 前記arRNAは、以下の群から選択されるいずれかの化学修飾を含む:
    CM0:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートよって修飾されている;
    CM1:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、配列内のすべてのUは、2’-O-メチル化によって修飾されている;
    CM2:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオシドは2’-O-メチル化によって修飾されている;
    CM3:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオシドは2’-O-メチル化によって修飾されている;
    CM4:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングトリプレットの3つの塩基とそれらの3’最近傍ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている;
    CM6:配列の最初の5ヌクレオチド及び最後の5ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の5ヌクレオチドと最後の5ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている;
    CM148:配列の最初の4ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の3ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
    CM149:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
    CM150:配列の最初の2ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の1ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
    CM151:配列の最初の4ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の3ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている;
    CM152:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている;
    CM153:配列の最初の2ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている;
    CM94:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端の4番目のヌクレオチド間結合から3’末端の3番目のヌクレオチド間結合まで、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’最近傍ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されている;
    CM119:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端の4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合及び3’末端の3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチドまで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる;
    CM120:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端の4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオチド間結合及び3’末端の3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合まで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる;
    CM123:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端の4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合及び3’末端の3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチドまで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる;
    CM125:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合及び標的ヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエートで修飾されており、5’末端の4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオチドの5’最近傍ヌクレオチドまで、及び3’末端の3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチドまで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる、
    請求項13~15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記arRNAの標的となるGからAへの変異部位は、ハーラー症候群患者のゲノムにおけるNM_000203.4(IDUA)-c.1205G>A(p.Trp402Ter)の変異部位、またはそれに対応する変異部位である、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記arRNAが、下記のものから選択される任意の配列を含み、*はホスホロチオエート修飾を表し、mは2’-O-メチル化修飾を表し、moeは2’-O-(2-メトキシエチル)修飾を表し、+はLNA修飾を表し、dはデオキシリボヌクレオシド置換を表す、
    1)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*Cm-G*A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm-C-C-A*G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
    2)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*-Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*Cm-G*-A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm*Cd-Cd*Ad*-G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
    3)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*-G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*-Cm-G*A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm-Cd-Cd*Ad*G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
    4)Gmoe*Amoe*Cmoe*Gmoe-C-C-C-A-C-C-G-Um-G-Um-G-G-Um-Um-G-C-Um-G-Um-C-C-A-G-G-A-C-G-G-Um-C-C-C-G-G-C-C-Um-GC-G-A-C-A-C-Um-Um-C-G-G-C-C-C-A-G-A-G-C-Um-G-C-Um-C*Cmoe*Umoe*Cmoe*Amoe(配列番号31);または
    5)G+*A+*C+*G+C-C-C-A-C-C-G-Um-G-Um-G-G-Um-Um-G-C-Um-G-Um-C-C-A-G-G-A-C-G-G-Um-C-C-C-G-G-C-C-Um-GC-G-A-C-A-C-Um-Um-C-G-G-C-C-C-A-G-A-G-C-Um-G-C-Um-C*C+*U+*C+*A+(配列番号31)
    請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記arRNAが、エレクトロトランスフェクション、リポフェクション、エクソソーム送達、または脂質-ナノ粒子送達(LNP)からなる群から選択されるいずれかの方法によって前記細胞に導入される、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記arRNAが一回あたり5~160nMの量で細胞に導入される、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記arRNAが前記細胞に複数回導入され、2つの導入が21日以内に隔てられている、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 請求項1~21のいずれか一項に記載の方法を使用して、ハーラー症候群の病原性G>A突然変異を修正することを含む、ハーラー症候群を予防または治療する方法。
  23. LEAPERテクノロジーに基づいて細胞中の標的RNAをターゲティング編集するために操作されたarRNAであって、前記標的RNAはグアノシン(G)からアデノシン(A)への変異部位(標的アデノシン)を含むα-L-イデュロニダーゼ(α-L-iduronidase、IDUA)の遺伝子転写配列を含み、前記arRNAは前記標的RNAとハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記arRNAは前記標的RNAにハイブリダイズした後、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することができ、前記arRNAの標的となるGからAへの変異部位は、ハーラー症候群患者のゲノムにおけるNM_000203.4(IDUA)-c.1205G>A(p.Trp402Ter)の変異部位、またはそれに対応する変異部位である、前記arRNA。
  24. 前記arRNAが、
    55nt-c-35nt、55nt-c-25nt、55nt-c-24nt、55nt-c-21nt、55nt-c-20nt、55nt-c-19nt、55nt-c-18nt、55nt-c-17nt、55nt-c-16nt、55nt-c-15nt、55nt-c-14nt、55nt-c-13nt、55nt-c-12nt、55nt-c-11nt、55nt-c-10nt、55nt-c-9nt、50nt-c-20nt、50nt-c-15nt、または45nt-c-20ntから選択されるいずれかの長さ特徴を有するarRNAであり、CはarRNAの標的アデノシンに対向するターゲティングヌクレオシドであり、arRNAの方向は5’から3’の方向である、請求項23に記載のarRNA。
  25. 前記arRNAが1つまたは複数の化学修飾を含む、請求項23または24に記載のarRNA。
  26. 前記化学修飾が、
    2'-O-メチル化修飾、ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、デオキシリボヌクレオシド置換修飾、LNA修飾、2’-O-(2-メトキシエチル)修飾から選択される1つまたは複数である、請求項23~25のいずれか一項に記載のarRNA。
  27. 前記化学修飾が、
    1)最初の2、3、4または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
    2)最後の2、3、4、または5ヌクレオチドの2’-O-メチル化修飾、
    3)ターゲティングトリプレットを除くすべてのシチジンの2’-O-メチル化修飾、
    4)最初の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
    5)最後の2、3または4ヌクレオチドの2’-O-(2-メトキシエチル)修飾、
    6)最初の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
    7)最後の2、3または4ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオシド置換修飾、
    8)最初の1、2、3、4または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
    9)最後の1、2、3、4、または5ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、
    10)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、すべてのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾、及び
    11)ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’または3’最近傍ヌクレオチド間結合の1つまたは複数がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、1、2、3、または4ヌクレオチドの間隔でのヌクレオチド間結合のホスホロチオエート修飾
    から選択される1つまたは複数である、請求項23~26のいずれか一項に記載のarRNA。
  28. 前記arRNAは、以下から選択されるいずれかの化学修飾を含む:
    CM0:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートよって修飾されている;
    CM1:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、配列内のすべてのUは、2’-O-メチル化によって修飾されている;
    CM2:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオシドは2’-O-メチル化によって修飾されている;
    CM3:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオシドは2’-O-メチル化によって修飾されている;
    CM4:配列の最初の3ヌクレオチド及び最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の3つ及び最後の3つのヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されており、ターゲティングトリプレットの3つの塩基とそれらの3’最近傍ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている;
    CM6:配列の最初の5ヌクレオチド及び最後の5ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の5ヌクレオチドと最後の5ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートによって修飾されている;
    CM148:配列の最初の4ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の3ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
    CM149:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
    CM150:配列の最初の2ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチドはそれぞれ2’-O-(2-メトキシエチル)で修飾されており、最初の1ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのUは2’-O-Meで修飾されている;
    CM151:配列の最初の4ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の3ヌクレオチドと最後の4ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている;
    CM152:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている;
    CM153:配列の最初の2ヌクレオチドと最後の2ヌクレオチドはそれぞれLNAで修飾されており、最初の2ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はそれぞれホスホロチオエートで修飾されており、すべてのウリジンは2’-O-Meで修飾されている;
    CM94:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端の4番目のヌクレオチド間結合から3’末端の3番目のヌクレオチド間結合まで、ターゲティングトリプレットの各ヌクレオチドの5’最近傍ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾を受けないことを除いて、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されている;
    CM119:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端の4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合及び3’末端の3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチドまで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる;
    CM120:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端の4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオチド間結合及び3’末端の3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合まで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、標的ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる;
    CM123:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合はすべてホスホロチオエートで修飾されており、5’末端の4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合及び3’末端の3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチドまで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる;
    CM125:配列の最初の3ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド、配列のすべてのU、及びターゲティングトリプレットを除くすべてのCはいずれも、2’-O-メチル化によって修飾されており、最初の4ヌクレオチドと最後の3ヌクレオチド間結合及び標的ヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチド間結合はいずれもホスホロチオエートで修飾されており、5’末端の4番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの5’最近傍ヌクレオチドの5’最近傍ヌクレオチドまで、及び3’末端の3番目のヌクレオチド間結合からターゲティングヌクレオシドの3’最近傍ヌクレオチドまで、1ヌクレオチド間結合ごとにホスホロチオエートで修飾されており、ターゲティントリプレットの各ヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドに置き換えられる、
    請求項23~27のいずれか一項に記載のarRNA。
  29. 前記arRNAが、下記のものから選択される任意の配列を含み、*はホスホロチオエート修飾を表し、mは2’-O-メチル化修飾を表し、moeは2’-O-(2-メトキシエチル)修飾を表し、+はLNA修飾を表し、dはデオキシリボヌクレオシド置換を表す、
    1)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*Cm-G*A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm-C-C-A*G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
    2)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*-Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*Cm-G*-A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm*Cd-Cd*Ad*-G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
    3)Gm*Am*Cm-G*Cm-Cm*Cm-A*Cm-Cm*G-Um*G-Um*G-G*Um-Um*G-Cm*Um-G*Um-Cm*Cm-A*G-G*A-Cm*-G-G*Um-Cm*Cm-Cm*G-G*Cm-Cm*Um-G*-Cm-G*A-Cm*A-Cm*Um-Um*Cm-G*G-Cm-Cd-Cd*Ad*G-A*G-Cm*Um-G*Cm-Um*Cm-Cm*Um*Cm*Am(配列番号31);
    4)Gmoe*Amoe*Cmoe*Gmoe-C-C-C-A-C-C-G-Um-G-Um-G-G-Um-Um-G-C-Um-G-Um-C-C-A-G-G-A-C-G-G-Um-C-C-C-G-G-C-C-Um-GC-G-A-C-A-C-Um-Um-C-G-G-C-C-C-A-G-A-G-C-Um-G-C-Um-C*Cmoe*Umoe*Cmoe*Amoe(配列番号31);または
    5)G+*A+*C+*G+C-C-C-A-C-C-G-Um-G-Um-G-G-Um-Um-G-C-Um-G-Um-C-C-A-G-G-A-C-G-G-Um-C-C-C-G-G-C-C-Um-GC-G-A-C-A-C-Um-Um-C-G-G-C-C-C-A-G-A-G-C-Um-G-C-Um-C*C+*U+*C+*A+(配列番号31)
    請求項23~28のいずれか一項に記載のarRNA。
  30. 請求項23または24に記載のarRNAコード配列を含む構築物。
  31. 請求項23~29のいずれか一項に記載のarRNAまたは請求項30に記載の構築物を含む組成物、リポソーム、エクソソーム、脂質ナノ粒子、細胞、ライブラリーまたはキット。
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