CN114269919A - 采用工程化rna利用内源adar进行靶向的rna编辑 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了通过在宿主细胞中引入脱氨酶募集RNA以使靶RNA中的腺苷脱氨来编辑RNA的方法。本申请还提供了用于RNA编辑方法的脱氨酶募集RNA以及包含其的组合物和试剂盒。
Description
相关申请的交叉引用
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发明领域
本公开总体涉及使用工程化的RNA来编辑RNA的方法和组合物，所述工程化的RNA能够募集腺苷脱氨酶以使靶RNA中的一个或多个腺苷脱氨。
发明背景
基因组编辑是用于疾病的生物医学研究和治疗开发的强大工具。使用工程化的核酸酶(如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR系统的Cas蛋白)的编辑技术，已被应用于操纵多种生物体中的基因组。最近，利用脱氨酶蛋白，如RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，开发了用于RNA编辑的新工具。在哺乳动物细胞中，存在三种类型的ADAR蛋白：Adar1(两种同种型，p110和p150)、Adar2和Adar3(无催化活性)。ADAR蛋白的催化底物是双链RNA，而ADAR可以从腺苷(A)核碱基中除去-NH2基团，从而将A变为肌苷(I)。(I)被识别为鸟苷(G)，并在随后的细胞转录和翻译过程中与胞苷(C)配对。为了实现靶向的RNA编辑，将ADAR蛋白或其催化结构域与λN肽、SNAP标签或Cas蛋白(dCas13b)融合，并设计了一个指导RNA来将嵌合的ADAR蛋白募集到靶位点。或者，也有报道称过表达的ADAR1或ADAR2蛋白与带有R/G基序的指导RNA一起可以进行靶向的RNA编辑。
但是，当前可用的ADAR介导的RNA编辑技术具有一定的局限性。例如，对于基因治疗而言，最有效的体内递送是通过病毒载体，但高度理想的腺相关病毒(AAV)载体受到负荷大小(～4.5kb)的限制，使其难以同时容纳蛋白质和指导RNA。此外，最近有报道称，由于针对RNA的异常过度编辑，ADAR1的过表达可赋予多发性骨髓瘤致癌性，并产生大量的全面脱靶编辑。另外，蛋白质或其非人类来源的结构域的异位表达具有引发免疫原性的潜在风险。而且，预先存在的适应性免疫和p53介导的DNA损伤应答可损害治疗性蛋白(如Cas9)的功效。
发明概述
本申请提供了使用ADAR募集的RNA(“dRNA”或“arRNA”)进行RNA编辑的方法，所述RNA能够利用内源的RNA特异性腺苷脱氨酶(“ADAR”)蛋白来进行RNA编辑。本文还提供了工程化的dRNA或包含编码用于这些方法中的工程化的dRNA的核酸的构建体，以及包含它们的组合物和试剂盒。本文还提供了治疗或预防个体的疾病或病况的方法，其包括编辑与个体的细胞中的疾病或病况相关的靶RNA。
在一方面，本文提供了在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中：
(1)所述dRNA包含与靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，
(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且
(3)所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，所述dRNA是能够形成环状RNA的线性RNA。在一些实施方案中，所述dRNA还包含3'连接序列和5'连接序列。在一些实施方案中，所述3'连接序列和所述5'连接序列至少部分地彼此互补。在一些实施方案中，所述3'连接序列和所述5'连接序列的长度为约20至约75个核苷酸。在一些实施方案中，所述dRNA被RNA连接酶环化。在一些实施方案中，所述RNA连接酶是RNA连接酶RtcB。在一些实施方案中，所述RNA连接酶RtcB在宿主细胞中内源性表达。在一些实施方案中，所述dRNA是环状RNA。
在一些实施方案中，所述方法包括将包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞。在一些实施方案中，所述构建体还包含连接至编码所述dRNA的核酸3'端的3'扭转酶(twister)核酶序列和连接至编码dRNA的核酸5'端的5'扭转酶核酶序列。在一些实施方案中，所述3′扭转酶序列是扭转酶P3 U2A，并且所述5′扭转酶序列是扭转酶P1。在一些实施方案中，所述5′扭转酶序列是扭转酶P3 U2A，并且所述3′扭转酶序列是扭转酶P1。
另一方面，本文提供了在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中所述dRNA包含：
(1)与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，以及
(2)连接至所述靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列；
其中所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)。
在一些实施方案中，所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列5'端的snoRNA序列(“5'snoRNA序列”)。在一些实施方案中，所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列3'端的snoRNA序列(3'snoRNA序列”)。在一些实施方案中，所述snoRNA序列的长度为至少约70个核苷酸。在一些实施方案中，所述3'snoRNA序列包含SEQ ID NO:1的核酸序列。在一些实施方案中，所述5'snoRNA序列包含SEQ ID NO:2的核酸序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是C/D盒snoRNA序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是H/ACA盒snoRNA序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是复合的C/D盒和H/ACA盒snoRNA序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是孤儿snoRNA序列。在一些实施方案中，所述方法包括将包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞。在一些实施方案中，所述构建体还包含与编码所述dRNA的核酸可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，所述启动子是聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。在一些实施方案中，所述构建体是病毒载体或质粒。在一些实施方案中，所述构建体是AAV载体。
在另一方面，本文提供了在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将包含编码脱氨酶募集RNA(dRNA)的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中：
(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，
(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且
(3)所述构建体包含与编码所述dRNA的核酸可操作地连接的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述pol II启动子是CMV启动子。在一些实施方案中，所述CMV启动子包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
以下实施方案适用于上述所有三个方面。在一些实施方案中，所述构建体是病毒载体或质粒。在一些实施方案中，所述构建体是AAV载体。在一些实施方案中，所述ADAR由所述宿主细胞内源性表达。在一些实施方案中，所述宿主细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述靶向RNA序列的长度大于50个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶向RNA序列的长度为约100至约180个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶向RNA序列的长度为约100至约150个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶向RNA序列包含与所述靶RNA中的靶腺苷正对的胞苷、腺苷或尿苷。在一些实施方案中，所述靶向RNA序列包含与所述靶RNA中的靶腺苷正对的胞苷错配。在一些实施方案中，所述胞苷错配位于距所述靶向RNA序列3'端至少20个核苷酸，并且距所述靶向RNA序列5'端至少5个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶向RNA序列还包含一个或多个鸟苷，其各自与所述靶RNA中的非靶腺苷相对。在一些实施方案中，所述靶向RNA序列包含与所述靶RNA中的非靶腺苷相对的两个或更多个连续的错配核苷酸。
在一些实施方案中，所述靶RNA中靶腺苷的5'最近邻是选自U、C、A和G的核苷酸，优先级为U＞C≈A＞G，并且所述靶RNA中靶腺苷的3'最近邻是选自G、C、A和U的核苷酸，优先级为G＞C＞A≈U。在一些实施方案中，所述靶RNA中所述靶腺苷在选自下组的三碱基基序中：UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA和GAU。在一些实施方案中，所述三碱基基序是UAG，并且所述靶向RNA包含与所述三碱基基序中的尿苷正对的A，与所述靶腺苷正对的胞苷，以及与所述三碱基基序中的鸟苷正对的胞苷、鸟苷或尿苷。在一些实施方案中，所述靶RNA是选自下组的RNA：前信使RNA、信使RNA、核糖体RNA、转移RNA、长非编码RNA和小RNA。在一些实施方案中，所述靶RNA是前信使RNA。
在一些实施方案中，所述方法还包括将ADAR3的抑制剂引入所述宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括将干扰素刺激物引入所述宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法包括引入分别靶向不同靶RNA的多个dRNA或构建体。在一些实施方案中，所述方法还包括将ADAR(例如外源ADAR)引入所述宿主细胞。在一些实施方案中，编辑所述靶RNA的效率为至少40％。在一些实施方案中，所述构建体或所述dRNA不诱导免疫应答。在一些实施方案中，所述ADAR是包含E1008突变的ADAR1。
在一些实施方案中，所述靶RNA中靶腺苷的脱氨导致由所述靶RNA中的错义突变、提前终止密码子、异常剪接或选择性剪接，或者所述靶RNA中错义突变、提前终止密码子、异常剪接或选择性剪接的逆转。在一些实施方案中，所述靶RNA中靶腺苷的脱氨导致由所述靶RNA编码的蛋白的点突变、截短、延伸和/或错误折叠，或者通过所述靶RNA中错义突变、提前终止密码子、异常剪接或选择性剪接的逆转产生功能性的、全长的、正确折叠的和/或野生型的蛋白。在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是人或小鼠细胞。本文还提供了通过上述三个方面提供的任何一种方法产生的经编辑的RNA或具有所述经编辑的RNA的宿主细胞。
另一方面，本文提供了治疗或预防个体的疾病或病况的方法，其包括根据以上提供的任何一种方法在所述个体的细胞中编辑与所述疾病或病况相关的靶RNA。在一些实施方案中，所述疾病或病况是遗传性基因疾病或与一种或多种获得性基因突变相关的疾病或病况。在一些实施方案中，所述靶RNA具有G至A突变。在一些实施方案中，所述疾病或病况是单基因疾病或病况。在一些实施方案中，所述疾病或病况是多基因疾病或病况。
在一些实施方案中，所述靶RNA是TP53，并且所述疾病或病况是癌症。在一些实施方案中，所述靶RNA是IDUA，并且所述疾病或病况是I型粘多糖贮积症(MPS I)。在一些实施方案中，所述靶RNA是COL3A1，并且所述疾病或病况是埃勒斯-当洛(Ehlers-Danlos)综合征。在一些实施方案中，所述靶RNA是BMPR2，并且所述疾病或病况是朱伯特(Joubert)综合征。在一些实施方案中，所述靶RNA是FANCC，并且所述疾病或病况是范可尼(Fanconi)贫血。在一些实施方案中，所述靶RNA是MYBPC3，并且所述疾病或病况是原发性家族性肥厚型心肌病。在一些实施方案中，所述靶RNA是IL2RG，并且所述疾病或病况是X连锁的严重联合免疫缺陷。
另一方面，本文提供了用于编辑靶RNA的脱氨酶募集RNA(dRNA)，所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且其中所述dRNA是环状的或能够形成环状RNA。在一些实施方案中，所述dRNA是能够形成环状RNA的线性RNA。在一些实施方案中，所述dRNA还包含3'连接序列和5'连接序列。在一些实施方案中，所述3'连接序列和所述5'连接序列至少部分地彼此互补。在一些实施方案中，所述3'连接序列和所述5'连接序列的长度为约20至约75个核苷酸。在一些实施方案中，所述dRNA是环状RNA。在一些实施方案中，所述靶RNA是选自下组的RNA：前信使RNA、信使RNA、核糖体RNA、转移RNA、长非编码RNA和小RNA。本文还提供了包含编码该方面中所述的dRNA的核酸的构建体。在一些实施方案中，所述构建体还包含连接至编码所述dRNA的核酸3'端的3'扭转酶核酶序列和连接至编码所述dRNA的核酸5'端的5'扭转酶核酶序列。在一些实施方案中，所述3′扭转酶序列是扭转酶P3 U2A，并且所述5′扭转酶序列是扭转酶P1。在一些实施方案中，所述其中所述5′扭转酶序列是扭转酶P3 U2A，并且所述3′扭转酶序列是扭转酶P1。本文还提供了包含该方面中所述的构建体或dRNA的宿主细胞。本文还提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的试剂盒，所述宿主细胞包含该方面中所述的构建体或dRNA。
在另一方面，本文还提供了用于编辑靶RNA的脱氨酶募集RNA(dRNA)，其包括：
(1)与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，以及
(2)所述靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列；
其中所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)。
在一些实施方案中，所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列5'端的snoRNA序列(“5'snoRNA序列”)。在一些实施方案中，所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列3'端的snoRNA序列(3'snoRNA序列”)。在一些实施方案中，所述snoRNA序列的长度为至少约70个核苷酸。在一些实施方案中，所述3'snoRNA序列包含SEQ ID NO:1的核酸序列。在一些实施方案中，所述5'snoRNA序列包含SEQ ID NO:2的核酸序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是C/D盒snoRNA序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是H/ACA盒snoRNA序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是复合的C/D盒和H/ACA盒snoRNA序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是孤儿snoRNA序列。本文还提供了包含编码该方面中所述的dRNA的核酸的构建体。在一些实施方案中，所述构建体还包含与编码所述dRNA的核酸可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，所述启动子是聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。在一些实施方案中，所述靶RNA是选自下组的RNA：前信使RNA、信使RNA、核糖体RNA、转移RNA、长非编码RNA和小RNA。本文还提供了包含该方面中所述的构建体或dRNA的宿主细胞。本文还提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的试剂盒，所述宿主细胞包含该方面中所述的构建体或dRNA。
在另一方面，本文提供了一种构建体，其包含编码进入所述宿主细胞的脱氨酶募集RNA(dRNA)的核酸，其中：
(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，
(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且
(3)所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述pol II启动子是CMV启动子。在一些实施方案中，所述CMV启动子包含SEQ ID NO:3的核酸序列。在一些实施方案中，所述构建体是病毒载体或质粒。在一些实施方案中，所述构建体是AAV载体。在一些实施方案中，所述靶RNA是选自下组的RNA：前信使RNA、信使RNA、核糖体RNA、转移RNA、长非编码RNA和小RNA。本文还提供了包含如该方面所述的构建体的宿主细胞。本文还提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的试剂盒，所述宿主细胞包含该方面中所述的构建体。
应理解，本文所述的多种实施方案的一个、一些或全部特性可以组合以形成本申请的其他实施方案。通过下面的详细描述进一步描述本申请的这些和其他实施方案。
附图说明
图1描绘了将由pol II启动子(CMV)驱动的表达arRNA的质粒和由pol III启动子(U6)驱动的表达arRNA的质粒转染48小时后的FACS分析。通过转染效率对EGFP阳性百分比进行归一化，转染效率由mCherry阳性比率确定。数据是平均值±s.d.(n＝3)。
图2A-2C描绘了侧翼为snoRNA末端的sno-arRNA151介导在报道分子(Reporter)mRNA上的靶向的RNA编辑。图2A显示了表达arRNA的质粒的示意图。在人U6启动子下表达靶向荧光报道分子-1的151-nt arRNA。图2B显示了sno-arRNA或arRNA转染结果的FACS结果。sno-arRNA151、arRNA151、sno-Ctrl RNA151或Ctrl RNA151与表达报道分子的质粒一起转染到HEK293T细胞中。图2C显示了图2B中的FACS结果的量化。
图3A-3C描绘了用CMV启动子表达的sno-arRNA和hU6启动子表达的sno-arRNA的编辑效力。图3A显示了hU6衍生的sno-arRNA或arRNA在不同时间点的定量FACS结果。图3B显示了CMV或hU6衍生的arRNA在不同时间点的定量FACS结果。图3C显示了CMV或hU6衍生的sno-arRNA在不同时间点的定量FACS结果。
图4A-4E描绘了在LEAPER系统中使用环状arRNA的编辑效力。图4A显示了环状arRNA表达的示意图。环状arRNA转录物侧翼为5'和3'连接序列，其分别经过自我切割后侧翼为5'-扭转酶P3 U2A和3'-扭转酶P1核酶。由RtcB识别所得的RNA末端以进行连接。图4B示出了报道分子-1和报道分子-3的示意图。mCherry和EGFP基因通过包含3×(对于报道分子-1)或1×(对于报道分子-3)GGGGS编码区和一个框内UAG终止密码子的序列被连接起来。报道分子表达的细胞仅产生mCherry蛋白，而对报道分子转录物的UAG终止密码子进行靶向的编辑可以将UAG转化为UIG，从而允许下游EGFP表达。图4C显示了实验结果，其中分别用1μg表达环状arRNA71、环状arRNA25-71-25、环状arRNA50-71-50、环状arRNA111、环状arRNA25-111-25、环状arRNA50-111-50、环状Ctrl RNA123(非靶序列)、arRNA71、Ctrl RNA71、arRNA111、Ctrl RNA111的质粒转染接种在12-孔板(3×105个细胞/孔)的稳定表达报道分子-1的HEK293T细胞。转染后2天和7天进行FACS分析。通过转染效率将EGFP+细胞的比例归一化。图4D显示了实验结果，其中分别用1μg表达Ctrl RNA151(环状)，31-、51-、71-、91-、111-、131-、151-nt环状arRNA的质粒，转染接种在12-孔板(3×105个细胞/孔)的稳定表达的报道分子-3的HEK293T细胞。转染后2天进行FACS分析。通过转染效率将EGFP+细胞的比例归一化。图4E显示了实验结果，其中分别用0.5μg表达报道分子-1的质粒和0.5μg表达环状arRNA111的质粒，共转染接种在12孔板(2×105个细胞/孔)的HeLa和A549细胞。转染后2天进行FACS分析。通过转染效率将EGFP+细胞的比例归一化。
图5描绘了将多种环状arRNA共转染48小时和96小时后的FACS分析，并且通过由mCherry阳性确定的转染效率将EGFP阳性百分比归一化。数据是平均值±s.d.(n＝3)。
图6A-6B描绘了在HEK293T细胞中共转染多种环状arRNA 48小时和96小时后的FACS分析。通过由mCherry阳性确定的转染效率将EGFP阳性百分比归一化。数据是平均值±s.d.(n＝3)。
图7描绘了EGFP阳性(EGFP+)细胞的定量。用多种Tornado-arRNA慢病毒，包括不同长度的Tornado-Ctrl RNA111病毒和靶向Tornado-arRNA病毒，感染稳定表达报道分子-1的细胞，然后在感染后2天进行FACS。数据是平均值±s.e.m.(n＝2)。
发明详述
本说明书提供了RNA编辑方法(本文称为“改良的LEAPER”方法)和经特殊设计的RNA，本文称为脱氨酶募集RNA(“dRNA”)或ADAR募集RNA(“arRNA”)或包含编码这些dRNA的核酸的构建体，以编辑宿主细胞中的靶RNA。
本申请的发明人先前已经开发了“LEAPER”(利用内源性ADAR对RNA进行可编程编辑)，其利用内源性ADAR通过使用dRNA(也称为“arRNA”)来编辑靶RNA。LEAPER方法描述于PCT/CN2018/110105和PCT/CN2020/084922，其内容通过引用以其整体并入本文。具体地，使用与靶标转录物部分互补的靶向RNA来募集天然ADAR1或ADAR2，以在靶RNA中的特定位点将腺苷变为肌苷。这样，可以在某些系统中实现RNA编辑，而不会在宿主细胞中异位或过表达ADAR蛋白。
本申请提供了改进的LEAPER方法，其允许例如通过增加靶细胞中dRNA的水平来提高RNA编辑的效率。一方面，改进的LEAPER方法涉及使用环状dRNA或能够形成环状RNA的dRNA。在另一方面，所述改进的LEAPER方法涉及使用dRNA，所述dRNA包含连接至靶向RNA序列3′或5′端的一个或多个小核仁RNA(snoRNA)。在另一方面，改进的LEAPER方法涉及置于聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)控制下的dRNA。我们证明，与LEAPER方法相比，改进的LEAPER方法显著提高了dRNA的编辑效率。不受理论的束缚，据信在改进的LEAPER方法中使用的dRNA的稳定性或量的增加有助于RNA编辑效率的这样的提高。
因此，本申请一方面提供了通过一种或多种改进的LEAPER方法来编辑靶RNA的方法。
另一方面，提供了用于改进的LEAPER方法的dRNA和构建体。
本文还提供了使用所述RNA编辑方法来治疗或预防个体的疾病或病况的方法和组合物。
I.定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文引用的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物均通过引用以其整体并入本文。如果本节中所列出的定义与通过引用并入本文的专利、申请或其他出版物中所列出的定义相反或不一致，则本节中所列出的定义优先于通过引用并入本文的定义。
应当理解，为清楚起见，在单独的实施方案上下文中描述的本公开的某些特征，也可以在单个实施方案中以组合的方式提供。相反，为简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本公开的多种特征，也可以单独地或以任何合适的子组合方式提供。与特定方法步骤、试剂或条件有关的实施方案的所有组合被本公开明确地涵盖并且在本文中公开，就好像其各自和每个组合均被单独地且明确地公开了一样。
如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数对象，除非上下文另有明确表述。还应注意，权利要求书可以被撰写为排除任何可选元件。这样，该陈述旨在作为与权利要求元件的叙述结合使用诸如“唯一”，“仅”等排他性术语的先行基础，或使用“负”限制。
术语“脱氨酶募集RNA”、“dRNA”、“ADAR募集RNA”和“arRNA”在本文中可互换使用，是指能够募集ADAR以使RNA中的靶腺苷脱氨的工程化RNA。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸、或核糖核苷酸、或其类似物。
如本文所用，术语“腺嘌呤”、“鸟嘌呤”、“胞嘧啶”、“胸腺嘧啶”、“尿嘧啶”和“次黄嘌呤”本身是指核碱基。术语“腺苷”、“鸟苷”、“胞苷”、“胸苷”、“尿苷”和“肌苷”是指与核糖或脱氧核糖部分相连的核碱基。术语“核苷”是指与核糖或脱氧核糖连接的核碱基。术语“核苷酸”是指各自的核碱基-核糖基-磷酸，或核碱基-脱氧核糖基-磷酸。有时，术语腺苷和腺嘌呤(缩写为“A”)，鸟苷和鸟嘌呤(缩写为“G”)，胞嘧啶和胞苷(缩写为“C”)，尿嘧啶和尿苷(缩写为“U”)，胸腺嘧啶和胸苷(缩写为“T”)，肌苷和次黄嘌呤(缩写为“I”)可互换使用，以指代相应的核碱基、核苷或核苷酸。有时，术语核碱基、核苷和核苷酸可以互换使用，除非上下文明确要求不同。
如本文所用，术语“引入(introducing/introduction)”是指将一种或多种多核苷酸(如dRNA，或一种或多种构建体，其包括本文所述的载体)、其一种或多种转录物，递送至宿主细胞。本发明用作能够靶向的编辑RNA的基本平台，所述RNA例如，前信使RNA、信使RNA、核糖体RNA、转移RNA、长非编码RNA和小RNA(如miRNA)。本申请的方法可以采用许多递送系统，包括但不限于：病毒、脂质体、电穿孔、显微注射和缀合，以实现将本文所述的dRNA或构建体引入宿主细胞。常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法，可用于将核酸引入哺乳动物细胞或靶组织。此类方法可用于向培养物或宿主生物体中的细胞施用编码本申请的dRNA的核酸。非病毒载体递送系统包括：DNA质粒、RNA(例如本文所述的构建体的转录物)、裸核酸以及与诸如脂质体的递送载体复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其具有游离的或整合的基因组以递送至宿主细胞。
在本申请的上下文中，“靶RNA”是指针对其将脱氨酶募集RNA序列设计成具有完全互补性或基本上互补性的RNA序列，并且靶序列与dRNA之间的杂交形成含有靶腺苷的双链RNA(dsRNA)区域，该区域募集使所述靶腺苷脱氨的RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)。在一些实施方案中，所述ADAR天然存在于宿主细胞，如真核细胞(如哺乳动物细胞，例如人细胞)。在一些实施方案中，所述ADAR被引入宿主细胞。
如本文所用，“互补性”是指核酸通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与另一种核酸形成氢键的能力。互补性百分数表示核酸分子中可以与第二核酸形成氢键(即沃森-克里克碱基配对)的残基百分比(例如，约十分之五、六、七、八、九、十，即互补性分别为约50％、60％、70％、80％、90％和100％)。“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基与第二核酸序列中的相同数目的连续残基形成氢键。如本文所用，“基本上互补”是指在约40、50、60、70、80、100、150、200、250或更多个核苷酸的区域中，互补性的程度为至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％中的任何一种，或指在严格条件下杂交的两种核酸。
如本文所用，杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的核酸主要与所述靶序列杂交而基本上不与非靶序列杂交的条件。严格条件通常是序列依赖性的，并且根据许多因素而变化。一般而言，序列越长，序列与其靶序列特异性杂交的温度越高。严格条件的非限制性实例详细描述于Tijssen(1993),Laboratory Techniques In Biochemistry AndMolecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I,SecondChapter"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid probe assay,”Elsevier,N,Y。
“杂交”是指一种或多种多核苷酸反应形成复合物的反应，该复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键而稳定。氢键结合可以通过沃森-克里克碱基配对、霍格斯坦(Hoogstein)结合或以任何其他序列特异性方式发生。能够与给定序列杂交的序列称为给定序列的“补体”。
如本文所用，术语“包括”、“含有”和“包含”以其开放的、非限制性的意义使用。还应理解，本文描述的本申请的方面和实施方案，可包括“由…组成”和/或“基本上由…组成”的方面和实施方案。
应当理解，无论是否明确使用术语“约”，本文给出的每个数量均指代实际给定值，并且还指代可基于本领域普通技术人员合理地推断出的针对该给定值的近似值，包括基于该给定值的实验和/或测量条件的等值和近似值。
如本文所用，“载体”包括以所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。生理上可接受的载体通常是pH缓冲水溶液。生理上可接受的载体的非限制性实例包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
如本文所用，物质的术语“有效量”或“治疗有效量”至少是产生特定疾病的可测量改善或预防所需的最小浓度。本文的有效量可以根据诸如疾病状态、患者的年龄、性别和体重，以及该物质在个体中引起所希望望的应答的能力等因素而变化。有效量也是治疗上的有益作用超过治疗的任何有毒或有害作用的量。关于癌症，有效量包括足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤的生长速率(如抑制肿瘤生长)或预防或延迟癌症中其他不想要的细胞增殖的量。在一些实施方案中，有效量是足以延迟癌症发展的量。在一些实施方案中，有效量是足以预防或延迟复发的量。在一些实施方案中，有效量是足以降低个体复发率的量。有效量可以以一次或多次施用来施用。药物或组合物的有效量可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)缩小肿瘤大小；(iii)抑制、延迟、减慢至某种程度，并优选停止癌细胞浸润到周围器官中；(iv)抑制(即，在一定程度上减慢并且优选停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；(vii)降低肿瘤的复发率，和/或(viii)在某种程度上减轻与癌症有关的一种或多种症状。可以用一次或多次施用的方式来施用有效量。为了本公开的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量是足以直接或间接地实现预防或治疗的量。如在临床上下文中所理解的，与另一种药物、化合物或药物组合物结合，可以达到或不能达到有效量的药物、化合物或药物组合物。因此，可以在施用一种或多种治疗剂的情况下考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他药剂结合可以获得或获得了所希望的结果，则可以认为是给予了有效量的单个药剂。
如本文所述，“宿主细胞”是指可以用作宿主细胞的任何细胞类型，只要其可以如本文所述进行修饰即可。例如，所述宿主细胞可以是具有内源性表达的RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)的宿主细胞，或者可以是通过本领域已知方法将RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)引入其中的宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是原核细胞、真核细胞或植物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞衍生自预先建立的细胞系，如哺乳动物细胞系，包括人细胞系或非人细胞系。在一些实施方案中，所述宿主细胞衍生自个体，如人类个体。
“重组AAV载体(rAAV载体)”是指包含一个或多个异源序列(即非AAV来源的核酸序列)的多核苷酸载体，所述异源序列侧翼为至少一个(在某些实施方案中为两个)AAV反向末端重复序列(ITR)。当存在于已被合适的辅助病毒(或其表达合适的辅助功能)感染且表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主细胞中时，这种rAAV载体可以复制并包装成感染性病毒颗粒。当将rAAV载体整合到更大的多核苷酸中时(例如，在染色体中或在另一种载体，如用于克隆或转染的质粒中)，则rAAV载体可以称为“原载体(pro-vector)”，其可以在AAV包装功能和合适的辅助功能存在下通过复制和衣壳化来“挽救”。rAAV载体可以是多种形式中的任一种，包括但不限于：质粒、线性人工染色体、与脂质复合、封装在脂质体中和衣壳化在病毒颗粒，特别是AAV颗粒中。可以将rAAV载体包装到AAV病毒衣壳中，以生成“重组腺相关病毒颗粒(rAAV颗粒)”。
术语“AAV反向末端重复(ITR)”序列在本领域中广为人知，是天然单链AAV基因组的两个末端都存在的一个约145个-核苷酸的序列。ITR的最外侧125个核苷酸可以两种可选方向之一存在，从而导致不同AAV基因组之间以及单个AAV基因组两端之间的异质性。最外侧的125个核苷酸还包含几个较短的自我互补区域(称为A、A'、B、B'、C、C'和D区域)，从而允许在ITR的这一部分内发生链内碱基配对。
“包装插页”是指通常包含在商业药品包装中的说明，其包含有关通常包含在商业药品包装中的适应症的信息，这些信息包含有关适应症、用法、剂量、施用方式、禁忌症、与该包装产品结合使用的其他药物，和/或有关此类药物使用的警告等信息。
“受试者”、“患者”或“个体”包括哺乳动物，如人类或其他动物，并且通常是人类。在一些实施方案中，向其施用治疗剂和组合物的所述受试者如患者是哺乳动物，通常是灵长类动物如人。在一些实施方案中，所述灵长类动物是猴子或猿。所述受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成人和老年受试者。在一些实施方案中，所述受试者是非灵长类哺乳动物，例如，啮齿动物、狗、猫、农场动物如牛或马等。
如本文所用，术语“治疗”是指被设计成在临床病理过程中对被治疗的个体或细胞的自然过程具有有益和所希望的效果的临床干预。为了本公开的目的，治疗的所希望的效果，包括但不限于：降低疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。例如，如果减轻或消除了与癌症有关的一种或多种症状，包括但不限于：减少癌细胞的增殖(或破坏癌细胞)，增加癌细胞杀伤，减轻该疾病引起的症状，预防疾病的传播，预防疾病的复发，增加罹患该疾病的人们的生活质量，减少治疗该疾病所需的其他药物的剂量，延缓该疾病的进展，和/或延长个体的生存，则个体得以成功地“治疗”。
II.RNA编辑方法
本文提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞(例如，真核细胞)，其中：(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)。
环状dRNA
一方面，本文提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞(例如，真核细胞)，其中：(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列；(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，以及(3)所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，本文提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入宿主细胞，其中：(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列；(2)所述dRNA能够募集所述宿主细胞内源性表达的ADAR，以使所述靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，以及(3)所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。在一些实施方案中，所述方法不包括将任何蛋白质或包含编码该蛋白质(例如，Cas、ADAR，或ADAR和Cas的融合蛋白)的核酸的构建体引入所述宿主细胞。
在一些实施方案中，本文提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中：(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，(2)所述dRNA能够募集所述宿主细胞内源性表达的ADAR，以使所述靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，以及(3)所述dRNA是环状RNA。在一些实施方案中，所述方法不包括将任何蛋白质或包含编码该蛋白质(例如，Cas、ADAR，或ADAR和Cas的融合蛋白)的核酸的构建体引入所述宿主细胞。
在一些实施方案中，本文提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞中，其中：(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，(2)所述dRNA能够募集所述宿主细胞内源性表达的ADAR，以使所述靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，以及(3)所述dRNA是能够形成环状RNA的线性RNA。在一些实施方案中，所述方法不包括将任何蛋白质或包含编码该蛋白质(例如，Cas、ADAR，或ADAR和Cas的融合蛋白)的核酸的构建体引入所述宿主细胞。
在一些实施方案中，本文提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞，以及将ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中：(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，(2)所述dRNA能够募集ADAR，以使所述靶RNA中的靶腺苷(“A”)残基脱氨，以及(3)所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。在一些实施方案中，所述ADAR是宿主细胞的内源编码的ADAR，其中所述ADAR的引入包括在所述宿主细胞中过表达ADAR。在一些实施方案中，所述ADAR对于宿主细胞是外源的。在一些实施方案中，所述包含编码ADAR的核酸的构建体是载体，如质粒或病毒载体(例如，AAV或慢病毒载体)。
一方面，本申请提供了用于通过将多种dRNA或一种或多种编码所述dRNA的构建体引入宿主细胞，来编辑所述宿主细胞中的多个靶RNA(例如，至少约2、3、4、5、10、20、50、100、1000个或更多个)的方法。
一方面，所述dRNA是能够形成环状RNA的线性RNA。在一些实施方案中，使用Tornado表达系统(“用于持久过表达的扭转酶优化的RNA”)进行循环，其描述于Litke,J.L.和Jaffrey,S.R.Highly efficient expression of circular RNA aptamers in cellsusing autocatalytic transcripts.Nat Biotechnol 37,667-675(2019)，其通过引用以其整体并入本文。简而言之，Tornado表达的转录物包含侧翼为扭转酶核酶的目标RNA。扭转酶核酶是能够自我切割的任何催化RNA序列。该核酶迅速经历自催化裂解，剩下末端被RNA连接酶连接。
在一些实施方案中，通过包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述dRNA。在一些实施方案中，所述构建体还包含连接至编码所述dRNA的核酸3'端的3'扭转酶核酶序列。在一些实施方案中，所述构建体还包含连接至编码所述dRNA的核酸5'端的5'扭转酶核酶序列。在一些实施方案中，所述构建体还包含连接至编码所述dRNA的核酸3'端的3'扭转酶核酶序列和连接至编码所述dRNA的核酸5'端的5'扭转酶核酶序列。在一些实施方案中，所述3′扭转酶序列是扭转酶P3 U2A，并且所述5′扭转酶序列是扭转酶P1。在一些实施方案中，其中所述5′扭转酶序列是扭转酶P3 U2A，并且所述3′扭转酶序列是扭转酶P1。在一些实施方案中，所述dRNA经历自催化裂解。在一些实施方案中，所述催化的dRNA产物在3'端包含5'-羟基基团和2'，3'-环状磷酸酯。在一些实施方案中，通过普遍存在的内源RNA连接酶(例如，RNA连接酶RtcB)连接所述催化的dRNA产物。在一些实施方案中，所述构建体是质粒或病毒载体。
在一些实施方案中，所述dRNA转录物还侧翼为5'和/或3'连接序列，然后其分别侧翼为5'-扭转酶核酶和/或3'-扭转酶核酶。在一些实施方案中，所述dRNA包含3′连接序列。在一些实施方案中，所述dRNA包含5'连接序列。在一些实施方案中，所述dRNA还包含3'连接序列和5'连接序列。在一些实施方案中，所述3'连接序列和所述5'连接序列至少部分地彼此互补。在一些实施方案中，所述3'连接序列和所述5'连接序列至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％彼此互补。在一些实施方案中，所述3'连接序列和所述5'连接序列彼此完全互补。
在一些实施方案中，所述3'连接序列和所述5'连接序列的长度独立地为：至少约20个核苷酸，至少约25个核苷酸，至少约30个核苷酸，至少约35个核苷酸，至少约40个核苷酸，至少约45个核苷酸，至少约50个核苷酸，至少约55个核苷酸，至少约60个核苷酸，至少约65个核苷酸，至少约70个核苷酸，至少约75个核苷酸，至少约80个核苷酸，至少约85个核苷酸，至少约90个核苷酸，至少约95个核苷酸，或至少约100个核苷酸。在一些实施方案中，所述3'连接序列和所述5'连接序列的长度独立地为：约20-30个核苷酸，约30-40个核苷酸，约40-50个核苷酸，约50-60个核苷酸，约60-70个核苷酸，约70-80个核苷酸，约80-90个核苷酸，约90-100个核苷酸，约100-125个核苷酸，约125-150个核苷酸，约20-50个核苷酸，约50-100个核苷酸，或约100-150个核苷酸。
在一些实施方案中，所述dRNA被RNA连接酶环化。RNA连接酶的非限制性实例包括：RtcB、T4 RNA连接酶1、T4 RNA连接酶2、Rnl3和Trl1。在一些实施方案中，所述RNA连接酶在所述宿主细胞中内源性表达。在一些实施方案中，所述RNA连接酶是RNA连接酶RtcB。在一些实施方案中，所述方法还包括将RNA连接酶(例如，RtcB)引入所述宿主细胞。
在一些实施方案中，所述dRNA在引入宿主细胞之前被环化。在一些实施方案中，所述dRNA是化学合成的。在一些实施方案中，通过体外酶促连接(例如，使用RNA或DNA连接酶)或化学连接(例如，使用溴化氰或类似的缩合剂)使所述dRNA环化。
具有一个或两个snoRNA末端的dRNA
另一方面，本文提供了用于在宿主细胞(例如，真核细胞)中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶-募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中所述dRNA包含：(1)与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，和(2)连接至所述靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列；其中所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)。
在一些实施方案中，本文提供了用于在宿主细胞(例如，真核细胞)中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶-募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中所述dRNA包含：(1)与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，和(2)连接至所述靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列；其中所述dRNA能够募集宿主细胞的内源性表达的RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，以使所述靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。在一些实施方案中，所述方法不包括将任何蛋白质或包含编码蛋白质(例如，Cas、ADAR，或ADAR和Cas的融合蛋白)的核酸的构建体引入所述宿主细胞。
在一些实施方案中，本文提供了用于在宿主细胞(例如，真核细胞)中编辑靶RNA的方法，其包括将(a)脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，以及(b)ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中所述dRNA包含：(1)与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，和(2)连接至所述靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列；并且其中所述dRNA能够募集所述ADAR，以使所述靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。在一些实施方案中，所述ADAR是所述宿主细胞的内源编码的ADAR，其中ADAR的引入包括在所述宿主细胞中过表达所述ADAR。在一些实施方案中，所述ADAR对于宿主细胞是外源的。在一些实施方案中，包含编码所述ADAR的核酸的构建体是载体，如质粒或病毒载体(例如，AAV或慢病毒载体)。
一方面，本申请提供了用于通过将多种dRNA或一种或多种编码所述dRNA的构建体引入宿主细胞，来编辑宿主细胞中的多个靶RNA(例如，至少约2、3、4、5、10、20、50、100、1000个或更多个)的方法。
小核仁RNA(snoRNA)是小的非编码RNA分子，已知其可指导其他RNA(如核糖体RNA、转移RNA和小核RNA)的化学修饰。根据其特定的二级结构特征，snoRNA分为两大类：盒(box)C/D和盒H/ACA。snoRNA的两个结构特征使其能够与辅助蛋白一起结合到相应的RNA结合蛋白(RBP)，形成功能性小核仁核糖核蛋白(snoRNP)复合物。盒C/D snoRNA被认为与甲基化有关，而H/ACA盒snoRNA被认为与假尿苷化有关。snoRNA的其他家族包括，例如，复合H/ACA和C/D盒snoRNA以及孤立的snoRNA。本文所述的snoRNA序列可包含天然存在的snoRNA、其一部分或其变体。
在一些实施方案中，所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列5'端的snoRNA序列(“5'snoRNA序列”)。在一些实施方案中，所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列3'端的snoRNA序列(“3'snoRNA序列”)。在一些实施方案中，所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列5'端的snoRNA序列(“5'snoRNA序列”)和连接至所述靶向RNA序列3'端的snoRNA序列(“3'snoRNA序列”)。在一些实施方案中，所述snoRNA序列的长度为至少约50个核苷酸，至少约60个核苷酸，至少约70个核苷酸，至少约80个核苷酸，至少约90个核苷酸，至少约100个核苷酸，至少约110个核苷酸，至少约120个核苷酸，至少约130个核苷酸，至少约140个核苷酸，至少约150个核苷酸，至少约160个核苷酸，至少约170个核苷酸，至少约180个核苷酸，至少约190个核苷酸，或至少约200个核苷酸。在一些实施方案中，所述snoRNA序列的长度为约50-75个核苷酸，约75-100个核苷酸，约100-125个核苷酸，约125-150个核苷酸，约150-175个核苷酸，约175-200个核苷酸，约50-100个核苷酸，约100-150个核苷酸，约150-200个核苷酸，约125-175个核苷酸，或约100-200个核苷酸。
在一些实施方案中，所述3′snoRNA序列包含SEQ ID NO:1的核酸序列(5′-AAGATTGTGTGTGGATCGATGATGACTTCCATATATACATTCCTTGGAAAGCTGAACAAAATGAGTGAAAACTCTATACCGTCATTCTCGTCGAACTGAGGTCCAGCACATTACTCCAACAG-3′)。在一些实施方案中，所述5′snoRNA序列包含SEQ ID NO:2的核酸序列(5′-GAGTGAGATCTTGGACCAATGATGACTTCCATACATGCATTCCTTGGAAAGCTGAACAAAATGAGTGGGAACTCTGTACTATCATCTTAGTTGAACTGAGGTCCACCGGGGGCTAA-3′)。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是C/D盒snoRNA序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是H/ACA盒snoRNA序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是复合的C/D盒和H/ACA盒snoRNA序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是孤儿snoRNA序列。
具有Pol II启动子的构建体
在另一方面，本文提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将包含编码脱氨酶募集RNA(dRNA)的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中：(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，和(3)所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将包含编码脱氨酶募集RNA(dRNA)的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中：(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，(2)所述dRNA能够募集所述宿主细胞的内源性表达的RNA特异性的腺苷脱氨酶(ADAR)，以使所述靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，以及(3)所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。在一些实施方案中，所述方法不包括将任何蛋白质或包含编码蛋白质(例如，Cas、ADAR，或ADAR和Cas的融合蛋白)的核酸的构建体引入所述宿主细胞。
在一些实施方案中，本文提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将(a)包含编码脱氨酶募集RNA(dRNA)的核酸的构建体，和(b)ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中：(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)以使所述靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，以及(3)所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。在一些实施方案中，所述ADAR是宿主细胞的内源编码的ADAR，其中ADAR的引入包括在所述宿主细胞中过表达ADAR。在一些实施方案中，所述ADAR对于宿主细胞是外源的。在一些实施方案中，所述包含编码ADAR的核酸的构建体是载体，例如质粒或病毒载体(例如，AAV或慢病毒载体)。
一方面，本申请提供了通过将多种dRNA或一种或多种编码所述dRNA的构建体引入宿主细胞，来编辑所述宿主细胞中的多个靶RNA(例如，至少约2、3、4、5、10、20、50、100、1000个或更多个)的方法。在一些实施方案中，一个Pol II启动子(例如，CMV)正在驱动两个或更多个dRNA的表达。
Pol II启动子的非限制性实例包括：CMV、SV40、EF-1α、CAG和RSV。在一些实施方案中，所述Pol II启动子是CMV启动子。在一些实施方案中，所述CMV启动子包含SEQ ID NO:3的核酸序列：(5'-CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT-3')。
在根据本文描述的任何一种方法的一些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是鼠细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是植物细胞，或真菌细胞。
在根据本文描述的任何一种方法或用途的一些实施方案中，所述宿主细胞是细胞系，如HEK293T、HT29、A549、HepG2、RD、SF268、SW13和HeLa细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原代细胞，如成纤维细胞、上皮细胞或免疫细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是有丝分裂后细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是中枢神经系统(CNS)的细胞，如脑细胞，例如小脑细胞。
在根据本文描述的任何一种方法的一些实施方案中，所述ADAR对于宿主细胞是内源的。在一些实施方案中，所述RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)天然或内源地存在于宿主细胞中，例如天然或内源地存在于真核细胞中。在一些实施方案中，所述ADAR由宿主细胞内源性表达。在某些实施方案中，将所述ADAR外源地引入宿主细胞。在一些实施方案中，所述ADAR是ADAR1和/或ADAR2。在某些实施方案中，所述ADAR是选自下组的一种或多种ADAR：hADAR1、hADAR2、小鼠ADAR1和ADAR2。在一些实施方案中，所述ADAR是ADAR1，如ADAR1的p110同种型(“ADAR1p110”)和/或ADAR1的p150同种型(“ADAR1p150”)。在一些实施方案中，所述ADAR是ADAR2。在一些实施方案中，所述ADAR是宿主细胞表达的ADAR2，例如，小脑细胞表达的ADAR2。
在一些实施方案中，所述ADAR是宿主细胞外源的ADAR。在一些实施方案中，所述ADAR是天然存在的ADAR的过度活跃的突变体。在一些实施方案中，所述ADAR是包含E1008Q突变的ADAR1。在一些实施方案中，所述ADAR不是包含结合结构域的融合蛋白。在一些实施方案中，所述ADAR不包含工程化的双链核酸结合结构域。在一些实施方案中，所述ADAR不包含与MS2发夹结合的MCP结构域，所述MS2发夹融合到所述dRNA中的互补RNA序列。在一些实施方案中，所述ADAR不包含DSB。
在根据本文描述的任何一种方法的一些实施方案中，所述宿主细胞具有高的ADAR1表达水平(如ADAR1p110和/或ADAR1p150)，例如，相对于β-微管蛋白的蛋白质表达水平，至少约10％、20％、50％、100％、2x、3x、5x或更高的任一种。在一些实施方案中，所述宿主细胞具有高的ADAR2表达水平，例如，相对于β-微管蛋白的蛋白质表达水平，至少约10％、20％、50％、100％、2x、3x、5x或更高的任一种。在一些实施方案中，所述宿主细胞具有低的ADAR3表达水平，例如，相对于β-微管蛋白的蛋白质表达水平，不超过约5x、3x、2x、100％、50％、20％或更少。
在根据本文描述的任何一种方法的某些实施方案中，所述dRNA包含以下中任一种的核苷酸数目：至少约40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个核苷酸。在根据本文描述的任何一种方法的某些实施方案中，所述dRNA包含以下中任一种的核苷酸数目：不超过约40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个核苷酸。在某些实施方案中，所述dRNA长度为以下中任一种的核苷酸数目：约40-260、45-250、50-240、60-230、65-220、70-220、70-210、70-200、70-190、70-180、70-170、70-160、70-150、70-140、70-130、70-120、70-110、70-100、70-90、70-80、75-200、80-190、85-180、90-170、95-160、100-200、100-150、100-175、110-200、110-175、110-150或105-140个核苷酸。
在根据本文描述的任何一种方法或用途的一些实施方案中，所述dRNA不包含ADAR-募集结构域。“ADAR募集结构域”可以是与ADAR高亲和力结合的核苷酸序列或结构，或与融合至工程化的ADAR构建体中的ADAR的结合伴侣结合的核苷酸序列。示例性的ADAR募集结构域，包括但不限于：GluR-2、GluR-B(R/G)、GluR-B(Q/R)、GluR-6(R/G)、5HT2C和FlnA(Q/R)结构域；参见，例如，Wahlstedt,Helene,和Marie,"Site-selective versuspromiscuous A-to-I editing."Wiley Interdisciplinary Reviews:RNA2.6(2011):761-771，其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，所述dRNA不包含双链部分。在一些实施方案中，所述dRNA不包含发夹，如MS2茎环。在一些实施方案中，所述dRNA是单链的。在一些实施方案中，所述dRNA不包含DSB结合结构域。在一些实施方案中，所述dRNA由互补RNA序列组成(或基本上由其组成)。
在根据本文描述的任何一种方法的一些实施方案中，所述dRNA不包含化学修饰。在一些实施方案中，所述dRNA不包含化学修饰的核苷酸，如2’-O-甲基核苷酸或具有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一些实施方案中，所述dRNA仅在前三个残基和后三个残基上包含2′-O-甲基和硫代磷酸酯键修饰。在一些实施方案中，所述dRNA不是反义寡核苷酸(ASO)。
本文所述的dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列。在根据本文描述的任何一种方法的某些实施方案中，所述dRNA中的靶向RNA序列包含以下中任一种的核苷酸数目：至少约40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个核苷酸。在根据本文所述的任何一种方法的某些实施方案中，所述dRNA中的靶向RNA序列包含以下中任一种的核苷酸数目：不超过约40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100，110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个核苷酸。在某些实施方案中，所述dRNA中的靶向RNA序列的核苷酸长度为以下中任一种的核苷酸数目：约40-260、45-250、50-240、60-230、65-220、70-220、70-210、70-200、70-190、70-180、70-170、70-160、70-150、70-140、70-130、70-120、70-110、70-100、70-90、70-80、75-200、80-190、85-180、90-170、95-160、100-200、100-150、100-175、110-200、110-160、110-175、110-150、140-160、105-140或105-155个核苷酸。在一些实施方案中，所述dRNA中的靶向RNA序列长约71个核苷酸。在一些实施方案中，所述dRNA长约111个核苷酸。在一些实施方案中，所述dRNA长约151个核苷酸。
在一些实施方案中，所述靶向RNA序列包含与靶RNA中的靶腺苷残基正对的胞苷、腺苷或尿苷。在一些实施方案中，所述靶向RNA序列包含与靶RNA中的靶腺苷残基正对的胞苷错配。在一些实施方案中，所述胞苷错配位于距所述靶向RNA序列5'端至少5个核苷酸，例如至少10、15、20、25、30或更多个核苷酸。在一些实施方案中，所述胞苷错配位于距所述互补RNA序列3'端至少20个核苷酸，例如至少25、30、35或更多个核苷酸。在一些实施方案中，所述胞苷错配不位于距所述靶向RNA序列3'端20个(例如15、10、5个或更少)核苷酸内。在一些实施方案中，所述胞苷错配位于距所述靶向RNA序列3'端至少20个核苷酸(例如，至少25、30、35或更多个核苷酸)和距所述靶向RNA序列5'端至少5个核苷酸(例如，至少10、15、20、25、30或更多个核苷酸)。在一些实施方案中，所述胞苷错配位于所述靶向RNA序列的中心。在一些实施方案中，所述胞苷错配位于所述dRNA中靶向序列中心的20个核苷酸(例如15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸)内。
在根据本文描述的任何一种方法的一些实施方案中，所述靶向RNA序列还包含一个或多个鸟苷(G)，如1、2、3、4、5、6或多个G，即每个G在所述靶RNA中与非靶腺苷正对。在一些实施方案中，所述靶向RNA序列包含与靶RNA中的非靶腺苷(A)相对的两个或更多个连续错配核苷酸(例如2、3、4、5或更多个错配核苷酸)。
在一些实施方案中，所述靶RNA包含不超过约20个非靶A，如不超过以下中任一种的非靶A数目：约15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个非靶A。与非靶A相对的G和连续错配核苷酸可降低ADAR的脱靶编辑作用。
在根据本文描述的任何一种方法的某些实施方案中，所述靶腺苷残基的5'最近邻是选自U、C、A和G的核苷酸，优先级为U＞C≈A＞G，并且所述靶腺苷残基的3'最近邻是选自G、C、A和U的核苷酸，优先级为G＞C＞A≈U。在某些实施方案中，所述靶腺苷残基在所述靶RNA中在选自下组的三碱基基序中：UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA和GAU。在某些实施方案中，所述三碱基基序是UAG，并且所述dRNA在三碱基基序中包含与U正对的A，与靶A正对的C，以及在三碱基基序中与G正对的C、G或U。在一些实施方案中，所述三碱基基序是所述靶RNA中的UAG，并且所述dRNA包含与靶RNA的UAG相对的ACC、ACG或ACU。在某些实施方案中，所述三碱基基序是靶RNA中的UAG，并且所述dRNA包含与靶RNA的UAG相对的ACC。
在根据本文描述的任何一种方法的一些实施方案中，所述靶RNA是选自下组的任一种RNA：前信使RNA、信使RNA、核糖体RNA、转移RNA、长非编码RNA和小RNA(例如miRNA)。在一些实施方案中，所述靶RNA是前信使RNA。在一些实施方案中，所述靶RNA是信使RNA。
在根据本文描述的任何一种方法的某些实施方案中，所述方法还包括将ADAR3的抑制剂引入宿主细胞。在一些实施方案中，ADAR3的抑制剂是针对ADAR3的RNAi，如针对ADAR3的shRNA，或针对ADAR3的siRNA。在一些实施方案中，所述方法还包括将干扰素刺激物引入宿主细胞。在一些实施方案中，所述ADAR可由干扰素诱导，例如，所述ADAR是ADARp150。在一些实施方案中，干扰素的刺激物是IFNα。在一些实施方案中，ADAR3的抑制剂和/或干扰素的刺激物由编码所述dRNA的相同构建体(例如载体)编码。
在根据本文描述的任何一种方法的某些实施方案中，所述靶RNA的编辑效率为至少约10％，如以下中的任何一个：至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更高。在一些实施方案中，所述靶RNA的编辑效率为至少约40％。在一些实施方案中，所述编辑效率通过桑格(Sanger)测序来确定。在一些实施方案中，所述编辑效率由下一代测序确定。在一些实施方案中，所述编辑效率通过评估报道分子基因(如荧光报道分子，例如EGFP)的表达来确定。
在根据本文描述的任何一种方法的某些实施方案中，所述该方法具有低的脱靶编辑率。在一些实施方案中，所述方法对靶RNA中的非靶A具有低于约1％(例如，不超过约0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.001％或更低中任一个)的编辑效率。在一些实施方案中，所述方法不编辑靶RNA中的非靶A。在一些实施方案中，所述方法对非靶RNA中的A具有低于约0.1％(例如，不超过约0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.001％或更低中任一个)的编辑效率。
在根据本文描述的任何一种方法的某些实施方案中，所述方法不诱导免疫应答，如先天免疫应答。在一些实施方案中，所述方法不诱导宿主细胞中的干扰素和/或白介素表达。在一些实施方案中，所述方法在宿主细胞中的不诱导IFN-β和/或IL-6表达。
还提供了通过本文所述的任何一种方法产生的经编辑的RNA或具有经编辑的RNA的宿主细胞。在一些实施方案中，所述经编辑的RNA包含肌苷。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含具有错义突变、提前终止密码子、可变剪接位点或异常剪接位点的RNA。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含突变、截短或错误折叠的蛋白质。
核酸的非病毒递送方法包括脂质转染、核转染、显微注射、生物弹道术、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、电穿孔、纳米颗粒、外泌体、微泡或基因枪、裸露的DNA和人造病毒粒子。
基于RNA或DNA病毒的系统用于递送核酸，在将病毒靶向特定细胞和将病毒有效载荷运输到细胞核方面具有高效率。
在根据本文描述的任何一种方法的某些实施方案中，所述方法包括将编码所述dRNA的病毒载体(如AAV或慢病毒载体)引入宿主细胞。在一些实施方案中，所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。在一些实施方案中，所述构建体侧翼为一个或多个AAV反向末端重复序列(ITR)序列。在一些实施方案中，所述构建体侧翼为两个AAV ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR是AAV2 ITR。在一些实施方案中，所述载体还包含填充核酸。在一些实施方案中，所述填充核酸位于编码所述dRNA的核酸的上游或下游。在一些实施方案中，所述载体是自互补rAAV载体。在一些实施方案中，所述载体包含编码所述dRNA的第一核酸序列和编码所述dRNA的互补序列的第二核酸序列，其中第一核酸序列可沿着其大部分或全部长度与第二核酸序列形成链内碱基对。在一些实施方案中，所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的AAV ITR连接，其中所述突变的AAV ITR包含D区的缺失，并包含末端解离序列的突变。在一些实施方案中，所述载体被衣壳包裹在rAAV颗粒中。在一些实施方案中，所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、AAV2-HBKO、AAVDJ8、AAVPHP.B、AAVPHP.eB、AAVBR1、AAVHSC15、AAVHSC17、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合体、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣壳。
在一些实施方案中，所述方法包括将编码所述dRNA的质粒引入宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法包括将所述dRNA(例如，合成dRNA)电穿孔到宿主细胞中。在一些实施方案中，所述方法包括将所述dRNA转染到宿主细胞中。
脱氨后，可以根据靶RNA中靶向的腺苷的位置，使用不同的方法来确定靶RNA和/或所述靶RNA编码的蛋白质的修饰。例如，为了确定靶RNA中“A”是否已被编辑为“I”，可以使用本领域已知的RNA测序方法来检测所述RNA序列的修饰。当靶腺苷位于mRNA的编码区时，所述RNA编辑可导致所述mRNA编码的氨基酸序列发生变化。例如，由于“A”到“I”的转化，可以将点突变引入先天的mRNA或可将mRNA中的获得性点突变逆转以产生野生型基因产物。通过本领域已知方法进行的氨基酸测序，可用于发现编码蛋白中氨基酸残基的任何变化。终止密码子的修饰可以通过评估功能性、延伸的、截短的、全长和/或野生型蛋白的存在来确定。例如，当所述靶腺苷位于UGA、UAG或UAA终止密码子中时，对靶腺苷残基(UGA或UAG)或A(UAA)的修饰可产生通读突变和/或延伸的蛋白质，或者所述靶RNA编码的截短蛋白可以被逆转以产生功能性、全长和/或野生型蛋白。靶RNA的编辑还可在所述靶RNA中产生异常的剪接位点和/或可变剪接位点，从而导致延伸的、截短的、或错误折叠的蛋白质，或所述靶RNA中编码的异常剪接或可变剪接位点可以被逆转以产生功能性、正确折叠的、全长和/或野生型蛋白质。在一些实施方案中，本申请考虑了先天和后天遗传改变的编辑，例如，错义突变、提前终止密码子、由靶RNA编码的异常剪接或可变剪接位点。使用已知的方法评估所述靶RNA编码的蛋白质的功能，可以发现所述RNA编辑是否达到所希望的效果。因为将腺苷(A)脱氨成肌苷(I)可以纠正编码蛋白质的突变RNA中靶位的突变的A，所以鉴定所述脱氨成肌苷可以评估是否存在功能蛋白，或由突变的腺苷的存在引起的与疾病或药物抗性相关的RNA是否被逆转或部分逆转。同样，由于腺苷(A)脱氨成肌苷(I)可在所得蛋白质中引入点突变，因此鉴定所述脱氨成肌苷可为鉴定疾病原因或疾病的相关因素提供功能指示。
当靶腺苷的存在引起异常剪接时，该读出(read-out)可以是异常剪接的发生和频率的评估。另一方面，当希望将靶腺苷脱氨以引入剪接位点时，则可以使用类似的方法来检查是否发生了所需的剪接类型。使用本领域技术人员公知的方法，在靶腺苷脱氨后鉴定肌苷存在的示例性合适方法是RT-PCR和测序。
靶腺苷脱氨的作用包括例如点突变、提前终止密码子、异常剪接位点、可变剪接位点和所得蛋白质的错误折叠。这些作用可以诱导与疾病相关的RNA和/或蛋白质的结构和功能改变，无论它们是基因遗传的还是由获得性基因突变引起的，或者可以诱导与耐药性发生相关的RNA和/或蛋白质的结构和功能改变。因此，本申请的dRNA、编码所述dRNA的构建体和RNA编辑方法，可用于通过改变与疾病有关的RNA和/或蛋白质的结构和/或功能来预防或治疗遗传性基因疾病或病况，或与获得性基因突变有关的疾病或病况。
在一些实施方案中，所述靶RNA是调节RNA。在一些实施方案中，所述待编辑的靶RNA是核糖体RNA、转移RNA、长非编码RNA或小RNA(例如，miRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、piRNA、siRNA、snoRNA、snRNA、exRNA或scaRNA)。靶腺苷的脱氨作用包括例如核糖体RNA、转移RNA、长非编码RNA或小RNA(例如miRNA)的结构和功能变化，包括三维结构的变化和/或所述靶RNA的功能丢失或功能获得。在一些实施方案中，靶RNA中靶A的脱氨改变了所述靶RNA的一种或多种下游分子(例如，蛋白质、RNA和/或代谢物)的表达水平。下游分子表达水平的变化可以是表达水平的增加或降低。
本申请的一些实施方案涉及宿主细胞中靶RNA的多重编辑，其对于筛选靶基因的不同变体或宿主细胞中的不同基因是有用的。在一些实施方案中，其中所述方法包括将多个dRNA引入宿主细胞，所述多个dRNA中的至少两个dRNA具有不同的序列和/或具有不同的靶RNA。在一些实施方案中，每个dRNA具有不同的序列和/或不同的靶RNA。在一些实施方案中，所述方法在宿主细胞中的单个靶RNA中生成多个(例如，至少2、3、5、10、50、100、1000个或更多个)修饰。在一些实施方案中，所述方法在宿主细胞中的多个(例如，至少2、3、5、10、50、100、1000或更多个)靶RNA中生成修饰。在一些实施方案中，所述方法包括编辑多个宿主细胞群中的多个靶RNA。在一些实施方案中，宿主细胞的每个群体接收与其他宿主细胞群体不同的dRNA或具有不同靶RNA的dRNA。
III.脱氨酶募集RNA、构建体和文库
本文还提供了可用于本文所述的任何一种方法的脱氨酶募集RNA或构建体。本节中所述的任何一种dRNA或构建体均可用于本文所述的RNA编辑和处理方法。意图是本文所述的针对dRNA或构建体的任何特征和参数可以彼此组合，就好像每种组合都被单独描述一样。本文所述的dRNA不包含用于CRISPR/Cas系统的tracrRNA、crRNA或gRNA。在一些实施方案中，提供了用于通过募集ADAR来使靶RNA中的靶腺苷脱氨的脱氨酶募集RNA(dRNA)，其包含与所述靶RNA杂交的互补RNA序列。
一方面，本发明提供了一种构建体，其包含本文所述的任何一种脱氨酶-募集RNA。在某些实施方案中，所述构建体是病毒载体(如慢病毒载体)或质粒。在一些实施方案中，所述构建体编码单个dRNA。在一些实施方案中，所述构建体编码多个(例如，约1、2、3、4、5、10、20或更多个中的任一种)dRNA。
一方面，本申请提供了一种文库，其包含多个脱氨酶募集RNA或本文所述的多个构建体。
一方面，本申请提供了一种组合物或宿主细胞，所述组合物或宿主细胞包含脱氨酶-招聘RNA或本文所述的构建体。在某些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是人细胞。
环状dRNA和构建体
一方面，本文提供了用于编辑靶RNA的脱氨酶募集RNA(dRNA)，所述靶RNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且其中所述dRNA是环状的或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，所述dRNA是能够形成环状RNA的线性RNA。在一些实施方案中，所述dRNA通过Tornado方法循环。在一些实施方案中，所述dRNA转录物侧翼也为5'和/或3'连接序列，然后侧翼分别为5'-扭转酶核酶和/或3'-扭转酶核酶。在一些实施方案中，所述3'连接序列和所述5'连接序列至少部分地彼此互补。在一些实施方案中，所述3'连接序列和所述5'连接序列为至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％彼此互补。在一些实施方案中，所述3'连接序列和所述5'连接序列彼此完全互补。
在一些实施方案中，所述3'连接序列和所述5'连接序列的长度独立地为：至少约20个核苷酸，至少约25个核苷酸，至少约30个核苷酸，至少约35个核苷酸，至少约40个核苷酸，至少约45个核苷酸，至少约50个核苷酸，至少约55个核苷酸，至少约60个核苷酸，至少约65个核苷酸，至少约70个核苷酸，至少约75个核苷酸，至少约80个核苷酸，至少约85个核苷酸，至少约90个核苷酸，至少约95个核苷酸，或至少约100个核苷酸。在一些实施方案中，所述3'连接序列和所述5'连接序列的长度独立地为：约20-30个核苷酸，约30-40个核苷酸，约40-50个核苷酸，约50-60个核苷酸，约60-70个核苷酸，约70-80个核苷酸，约80-90个核苷酸，约90-100个核苷酸，约100-125个核苷酸，约125-150个核苷酸，约20-50个核苷酸，约50-100个核苷酸，或约100-150个核苷酸。
在一些实施方案中，所述dRNA被RNA连接酶环化。在一些实施方案中，所述RNA连接酶在宿主细胞中内源性表达。在一些实施方案中，所述RNA连接酶是RNA连接酶RtcB。在一些实施方案中，所述RNA连接酶RtcB在宿主细胞中内源性表达。在一些实施方案中，通过体外酶促连接(例如，使用RNA或DNA连接酶)或化学连接(例如，使用溴化氰或类似的缩合剂)使所述dRNA环化。
本文还提供了包含编码所述dRNA的核酸的构建体。在一些实施方案中，通过包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述dRNA。在一些实施方案中，所述构建体还包含连接至编码所述dRNA的核酸3'端的3'扭转酶核酶序列。在一些实施方案中，所述构建体还包含连接至编码所述dRNA的核酸5'端的5'扭转酶核酶序列。在一些实施方案中，所述构建体还包含连接至编码所述dRNA的核酸3'端的3'扭转酶核酶序列和连接至编码所述dRNA的核酸5'端的5'扭转酶核酶序列。在一些实施方案中，所述3′扭转酶序列是扭转酶P3 U2A，并且所述5′扭转酶序列是扭转酶P1。在一些实施方案中，其中所述5′扭转酶序列是扭转酶P3 U2A，并且所述3′扭转酶序列是扭转酶P1。在一些实施方案中，所述dRNA经历自催化剪切。在一些实施方案中，所述催化的dRNA产物在3'末端包含5'-羟基和2',3'-环状磷酸酯。在一些实施方案中，通过普遍存在的内源RNA连接酶(例如，RNA连接酶RtcB)连接所述催化的dRNA产物。在一些实施方案中，所述构建体是质粒或病毒载体。
具有一个或两个snoRNA末端的dRNA和构建体
在另一方面，本文提供了用于编辑靶RNA的脱氨酶募集RNA(dRNA)，其包括：(1)与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，和(2)位于所述靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列；其中所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)。
在一些实施方案中，所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列5'端的snoRNA序列(“5'snoRNA序列”)。在一些实施方案中，所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列3'端的snoRNA序列(“3'snoRNA序列”)。在一些实施方案中，所述snoRNA序列的长度为：至少约50个核苷酸，至少约60个核苷酸，至少约70个核苷酸，至少约80个核苷酸，至少约90个核苷酸，至少约100个核苷酸，至少约110个核苷酸，至少约120个核苷酸，至少约130个核苷酸，至少约140个核苷酸，至少约150个核苷酸，至少约160个核苷酸，至少约170个核苷酸，至少约180个核苷酸，至少约190个核苷酸或至少约200个核苷酸。在一些实施方案中，所述snoRNA序列的长度为：约50-75个核苷酸，约75-100个核苷酸，约100-125个核苷酸，约125-150个核苷酸，约150-175个核苷酸，约175-200个核苷酸，约50-100个核苷酸，约100-150个核苷酸，约150-200个核苷酸，约125-175个核苷酸，或约100-200个核苷酸。
在一些实施方案中，所述3'snoRNA序列包含SEQ ID NO:1的核酸序列。在一些实施方案中，所述5'snoRNA序列包含SEQ ID NO:2的核酸序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是C/D盒snoRNA序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是H/ACA盒snoRNA序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是复合的C/D盒和H/ACA盒snoRNA序列。在一些实施方案中，所述snoRNA序列是孤儿snoRNA序列。
具有Pol II启动子的构建体
在另一方面，本文提供了一种构建体，其包含编码进入宿主细胞的脱氨酶募集RNA(dRNA)的核酸，其中：(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且(3)所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，将Pol II启动子可操作地连接至编码核苷酸序列，使得所述启动子控制所述编码核苷酸序列的转录或表达。所述Pol II启动子可以位于其控制下的编码核苷酸序列5'(上游)。所述Pol II启动子与编码序列之间的距离，可以与该启动子和所述启动子所源自的基因中其控制的基因之间的距离大致相同。如本领域中已知的，可以适应该距离的变化而不会丢失启动子功能。在一些实施方案中，所述构建体包含调节所述编码核苷酸序列的转录或表达的5'UTR和/或3'UTR。在一些实施方案中，所述Pol II启动子是CMV启动子。在一些实施方案中，所述CMV启动子包含SEQ ID NO:3的核酸序列。在一些实施方案中，一个Pol II启动子(例如，CMV)驱动两个或多个dRNA的表达。
在根据本文所述的dRNA、构建体、文库或组合物中任一项的一些实施方案中，所述靶向RNA序列包含与靶RNA中待编辑的靶腺苷正对的胞苷、腺苷或尿苷。在一些实施方案中，所述靶向RNA序列还包含一个或多个鸟苷，其各自与靶RNA中的非靶腺苷正对。在某些实施方案中，所述靶腺苷残基的5'最近邻是选自U、C、A和G的核苷酸，优先级为U＞C≈A＞G，并且所述靶腺苷残基的3'最近邻是选自G、C、A和U的核苷酸，优先级为G＞C＞A≈U。在一些实施方案中，所述靶腺苷残基的5'最近邻为U。在一些实施方案中，所述靶腺苷残基的5'最近邻为C或A。在一些实施方案中，所述靶腺苷残基的3'最近邻为G。在一些实施方案中，所述靶腺苷残基的3'最近邻为C。
在根据本文所述的dRNA、构建体、文库或组合物中任一项的一些实施方案中，所述靶RNA中所述靶腺苷残基在选自下组的三碱基基序中：UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA和GAU。在一些实施方案中，所述三碱基基序是UAG，并且所述dRNA包含与所述三碱基基序中的U正对的A，与靶A正对的C，以及与所述三碱基基序中的G正对的C、G或U。在某些实施方案中，所述靶RNA中的三碱基基序是UAG，并且所述dRNA包含与靶RNA中的UAG相对的ACC、ACG或ACU。
在一些实施方案中，所述dRNA包含与靶RNA中的靶腺苷残基正对的胞苷错配。在一些实施方案中，所述胞苷错配靠近互补RNA序列的中心，如在距所述互补RNA序列的中心20、15、10、5、4、3、2或1个核苷酸内。在一些实施方案中，所述胞苷错配距互补RNA序列5'端至少5个核苷酸。在一些实施方案中，所述胞苷错配距互补RNA序列3'端至少20个核苷酸。
在根据本文所述的dRNA、构建体、文库或组合物中任一项的一些实施方案中，所述dRNA包含以下中任一种的核苷酸数目：多于约40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个核苷酸。在某些实施方案中，所述dRNA的长度为以下中任一种的核苷酸数目：约40-260、45-250、50-240、60-230、65-220、70-210、70-200、70-190、70-180、70-170、70-160、70-150、70-140、70-130、70-120、70-110、70-100、70-90、70-80、75-200、80-190、85-180、90-170、95-160、100-150或105-140个核苷酸。
本申请的dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列。所述靶向RNA序列与靶RNA完全互补或基本互补，以允许所述靶向RNA序列与靶RNA杂交。在一些实施方案中，所述靶向RNA序列与靶RNA具有100％的序列互补性。在一些实施方案中，所述靶向RNA序列与靶RNA中至少约20、40、60、80、100、150、200或更多个核苷酸的连续延伸中的至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多中的任一个互补。在一些实施方案中，通过所述靶向RNA序列与靶RNA之间的杂交形成的dsRNA具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)非沃森-克里克碱基对配对(即错配)。
ADAR，例如，人ADAR酶根据许多因素以不同的特异性编辑双链RNA(dsRNA)结构。一个重要因素是组成dsRNA序列的两条链的互补程度。dRNA与靶RNA之间的完全互补通常导致ADAR的催化结构域以非区分性方式使腺苷脱氨。可以通过在dsRNA区域引入错配来修饰ADAR的特异性和效率。例如，优选推荐A-C错配以增加待编辑的腺苷进行脱氨的特异性和效率。相反，在靶腺苷残基以外的其他A(腺苷)位置(即“非靶A”)，G-A错配可以减少脱靶编辑。dRNA与其靶RNA之间的dsRNA形成不一定需要完全的互补性，前提是dRNA与靶RNA之间的dsRNA杂交和形成具有基本的互补性。在一些实施方案中，所述dRNA序列或其单链RNA区域在最佳比对时，与靶RNA具有70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一种的序列互补性。可以使用任何合适的用于比对序列的算法来确定最佳比对，其非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wimsch算法、基于Burrows-Wheeler变换的算法(例如，Burrows Wheeler Aligner)。
与靶腺苷相邻的核苷酸也影响脱氨的特异性和效率。例如，就腺苷脱氨的特异性和效率而言，靶RNA序列中的待编辑靶腺苷的5'最近邻具有优先级U＞C≈A＞G，而靶RNA序列中的待编辑靶腺苷的3'最近邻具有优先级G＞C＞A≈U。在一些实施方案中，当靶RNA中所述靶腺苷可以在选自下组的三碱基基序中：UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA和GAU，腺苷脱氨的特异性和效率均高于其他三碱基基序中的腺苷。在一些实施方案中，其中待编辑的靶腺苷在选自下组的三碱基基序中：UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、AAG、AAC或AAA，腺苷的脱氨效率比其他基序中的腺苷高得多。对于相同的三碱基基序，dRNA的不同设计也可能导致不同的脱氨效率。以三碱基基序UAG为例，在一些实施方案中，当dRNA包含与待编辑的靶腺苷正对的胞苷(C)，与尿苷正对的腺苷(A)，以及与鸟苷正对的胞苷(C)、鸟苷(G))或尿苷(U)，所述靶腺苷的脱氨效率高于使用其他dRNA序列的脱氨效率。在一些实施方案中，当dRNA包含与靶RNA的UAG相对的ACC、ACG或ACU时，所述靶RNA的UAG中的A的编辑效率可以达到约25％-90％(例如，约25％-80％，25％-70％，25％-60％，25％-50％，25％-40％，或25％-30％)。
除了靶腺苷外，靶RNA中可存在一种或多种不希望被编辑的腺苷。对于这些腺苷，优选尽可能降低它们的编辑效率。通过本公开发现，在靶RNA中鸟苷与腺苷正对的情况下，脱氨效率显著降低。因此，为了减少脱靶脱氨，可以将dRNA设计成包含与靶RNA中待编辑的靶腺苷以外的一个或多个腺苷正对的一个或多个鸟苷。
编辑靶RNA序列的特异性和效率的所需水平可取决于不同的应用。遵循本专利申请中的指示，本领域技术人员将能够根据其需要设计与靶RNA序列具有互补或基本互补序列的dRNA，并且经过一些尝试和错误，可获得其所希望的结果。如本文所用，术语“错配”是指双链RNA(dsRNA)中相对的核苷酸，根据沃森-克里克碱基配对规则，其不形成完全的碱基对。错配碱基对包括例如G-A、C-A、U-C、A-A、G-G、C-C、U-U碱基对。以A-C匹配为例，其中在靶RNA中要编辑靶腺苷残基，将dRNA设计成包含与要编辑的A相对的C，从而在由靶RNA和dRNA之间的杂交形成的dsRNA中生成A-C错配。
在一些实施方案中，通过dRNA和靶RNA之间的杂交形成的dsRNA不包含错配。在一些实施方案中，通过dRNA和靶RNA之间的杂交形成的dsRNA包含一个或多个，如1、2、3、4、5、6、7或更多个错配中的任一种(例如，不同类型错配的相同类型)。在一些实施方案中，通过dRNA和靶RNA之间的杂交形成的dsRNA包含一种或多种错配，例如选自G-A、C-A、U-C、A-A、G-G、C-C和U-U的1、2、3、4、5、6、7种错配。
通过dRNA和靶RNA之间的杂交形成的dsRNA中的错配核苷酸可以形成凸起，这可以促进靶RNA的编辑效率。可能有由所述错配形成的一个(仅在靶腺苷上形成)或多个凸起。其他凸起诱导的错配可以在靶腺苷的上游和/或下游。所述凸起可以是单错配凸起(由一个错配的碱基对引起)或多错配凸起(由不止一个连续的错配碱基对，例如两个或三个连续的错配碱基对引起)。
所述dRNA中的靶向RNA序列是单链的。所述dRNA可以完全是单链的或具有一个或多个(例如1、2、3或更多个)双链区和/或一个或多个茎环区。在一些实施方案中，所述靶向RNA序列为至少约40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个核苷酸中的任一种。在某些实施方案中，所述靶向RNA序列的长度为约40-260、45-250、50-240、60-230、65-220、70-220、70-210、70-200、70-190、70-180、70-170、70-160、70-150、70-140、70-130、70-120、70-110、70-100、70-90、70-80、75-200、80-190、85-180、90-170、95-160、100-200、100-150、100-175、110-200、110-160、110-175、110-150、140-160、105-140或105-155个核苷酸中的任一种。在一些实施方案中，所述dRNA中的靶向RNA序列长约71个核苷酸。在一些实施方案中，所述dRNA长约111个核苷酸。在一些实施方案中，所述dRNA长约151个核苷酸。
在一些实施方案中，除了靶向RNA序列以外，所述dRNA还包含用于稳定所述dRNA的区域，例如，一个或多个双链区域和/或茎环区域。在一些实施方案中，所述dRNA的双链区或茎环区包含以下碱基对中的任一种：不超过约200、150、100、50、40、30、20、10个或更少的碱基对。在一些实施方案中，所述dRNA不包含茎环或双链区。在一些实施方案中，所述dRNA包含ADAR募集结构域。在一些实施方案中，所述dRNA不包含ADAR募集结构域。
所述dRNA可包含一种或多种修饰。在一些实施方案中，所述dRNA具有一个或多个修饰的核苷酸，包括核碱基修饰和/或骨架修饰。RNA的示例性修饰，包括但不限于：硫代磷酸酯骨架修饰、核糖中的2'-取代(如2'-O-甲基和2'-氟取代)、LNA和L-RNA。在一些实施方案中，所述dRNA不具有对核碱基或骨架的修饰。
本申请还考虑了包含本文所述的dRNA的构建体，包括但不限于以上各节中描述的任何构建体。如本文所用，术语“构建体”是指DNA或RNA分子，其包含可被转录为RNA或表达为蛋白质的编码核苷酸序列。在一些实施方案中，所述构建体包含可操作地连接至编码RNA或蛋白质的核苷酸序列的一种或多种调节元件。当将所述构建体引入宿主细胞中时，在合适的条件下，可以转录或表达所述构建体中的编码核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述构建体包含与编码核苷酸序列可操作地连接的启动子，使得所述启动子控制所述编码核苷酸序列的转录或表达。启动子可以位于其控制下的编码核苷酸序列5'(上游)。所述启动子与编码序列之间的距离，可以与该启动子和所述启动子所源自的基因中其控制的基因之间的距离大致相同。如本领域中已知的，可以适应该距离的变化而不会丢失启动子功能。在一些实施方案中，所述构建体包含调节编码核苷酸序列的转录或表达的5'UTR和/或3'UTR。在一些实施方案中，所述启动子是U6启动子。在一些实施方案中，所述启动子是如上所述的部分中所述的Poly II启动子。
在一些实施方案中，所述构建体是编码本申请中公开的任何一种dRNA的载体。术语“载体”是指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。载体包括但不限于：单链、双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个自由端、无自由端(例如，环状)的核酸分子；包含DNA、RNA或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多核苷酸变体。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环，如通过标准分子克隆技术可以在其中插入其他DNA区段。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体(episomal mammalian vector))。在导入宿主细胞后，将其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的编码核苷酸序列的转录或表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
重组表达载体可以包含本申请的核酸，其形式适合于在宿主细胞中转录或表达该核酸。在一些实施方案中，所述重组表达载体包括一种或多种调控元件，其可以基于用于转录或表达的宿主细胞进行选择，且其可操作地连接至待转录或表达的核酸序列。在重组表达载体中，“可操作地连接”是指目的核苷酸序列以允许该核苷酸序列表达的方式(例如在体外转录/翻译系统中，或将载体导入宿主细胞后在宿主细胞中)与调控元件连接。
在一些实施方案中，所述载体是rAAV载体。在一些实施方案中，所述rAAV载体是源自AAV血清型的载体，包括但不限于AAV ITR为：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣壳血清型等。在一些实施方案中，所述AAV中的核酸包含以下各项的ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣壳血清型等。在一些实施方案中，所述AAV中的核酸还编码如本文所述的dRNA。在本公开的范围内考虑了使用任何AAV血清型。在一些实施方案中，所述载体被衣壳包裹在rAAV颗粒中。在一些实施方案中，所述AAV病毒颗粒包含：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2V708K、AAV2-HBKO、AAVDJ8、AAVPHP.B、AAVPHP.eB、AAVBR1、AAVHSC15、AAVHSC17、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合体、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣壳。
在一些实施方案中，提供了包含编码所述dRNA的核苷酸序列的构建体(例如载体，如病毒载体)。在一些实施方案中，提供了包含编码所述ADAR的核苷酸序列的构建体(例如载体，如病毒载体)。在一些实施方案中，提供了包含编码所述dRNA的第一核苷酸序列和编码所述ADAR的第二核苷酸序列的构建体。在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可操作地连接至相同的启动子。在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可操作地连接至不同的启动子。在一些实施方案中，所述启动子是可诱导的。在一些实施方案中，所述构建体不编码所述ADAR。在一些实施方案中，所述载体还包含编码ADAR3的抑制剂(例如，ADAR3 shRNA或siRNA)和/或干扰素的刺激物(例如，IFN-α)的核酸序列。
IV.治疗方法
本文所述的RNA编辑方法和组合物可用于治疗或预防个体的疾病或病况，包括但不限于遗传性基因疾病和耐药性。
在一些实施方案中，提供了离体编辑个体(例如，人个体)的细胞中靶RNA的方法，其包括使用任一种本文所述的RNA编辑方法的来编辑靶RNA。
在一些实施方案中，提供了离体编辑个体(例如，人个体)的细胞中靶RNA的方法，其包括将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的细胞中，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了离体编辑个体(例如，人个体)的细胞中靶RNA的方法，其包括将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的细胞中，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)与靶向RNA序列3'和/或5'端连接的小核仁RNA(snoRNA)序列，且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了离体编辑个体(例如人个体)的细胞中靶RNA的方法，其包括将包含编码dRNA的核酸的构建体引入所述个体的细胞中，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(”Pol II启动子”)。在一些实施方案中，所述ADAR是内源性表达的。在一些实施方案中，所述方法还包括将ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体引入到细胞中。
在一些实施方案中，所述靶RNA与个体的疾病或病况相关。在一些实施方案中，所述疾病或病况是遗传性基因疾病，或与一种或多种获得性基因突变(例如，抗药性)相关的疾病或病况。在一些实施方案中，所述方法还包括从个体获得细胞。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体(例如，人个体)的疾病或病况的方法，其包括使用任何一种本文所述的RNA编辑方法在所述个体的细胞中编辑与所述疾病或病况相关的靶RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体(例如，人个体)的疾病或病况的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与所述疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述dRNA是和其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体(例如，人个体)的疾病或病况的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)与靶向RNA序列3'和/或5'端连接的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体(例如人个体)的疾病或病况的方法，其包括在离体下将包含编码dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是分离的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括将ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括培养具有编辑的RNA的细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括将具有编辑的RNA的细胞施用于个体。在一些实施方案中，所述疾病或病况是遗传性基因疾病，或与一种或多种获得性基因突变(例如，抗药性)相关的疾病或病况。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体(例如人个体)的疾病或病况的方法，其包括向所述个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体(例如人个体)的疾病或病况的方法，其包括向所述个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体(例如人个体)的疾病或病况的方法，其包括向该个体施用有效量的包含编码dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是个体的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体。在一些实施方案中，所述疾病或病况是遗传性基因疾病，或与一种或多种获得性基因突变(例如，耐药性)相关的疾病或病况。
适用于使用本申请的方法治疗的疾病和病症，包括与突变相关的疾病，如G至A突变，例如导致RNA转录物中的错义突变、提前终止密码子、异常剪接或可变剪接的G至A突变。可以通过本申请的方法恢复的与疾病相关的突变的实例，包括但不限于：与癌症相关的TP53W53X(例如158G>A)，与I型粘多糖贮积症(MPS I)相关的IDUAW402X(例如外显子9中的TGG>TAG突变)，与埃勒斯-当洛综合征相关的COL3A1W1278X(例如3833G>A突变)，与原发性肺动脉高压相关的BMPR2W298X(例如893G>A)，与朱伯特(Joubert)综合征相关的AHI1W725X(例如2174G>A)，与范可尼贫血相关的FANCCW506X(例如1517G>A)，与原发性家族性肥厚型心肌病相关的MYBPC3W1098X(例如3293GA)，以及与X连锁重症联合免疫缺陷相关的IL2RGW237X(例如710G>A)。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症。在一些实施方案中，所述疾病或病况是单基因疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况是多基因疾病。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的癌症的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA有关的癌症的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的癌症的方法，其包括在离体下将包含编码dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是分离细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括在离体下将ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，所述靶RNA是TP53W53X(例如158G>A)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQ ID NO:4的核酸序列(5’-GGGAGCAGCCUCUGGCAUUCUGGGAGCUUCAUCUGGACCUGGGUCU UCAGUGAACCAUUGUUCAAUAUCGUCCGGGGACAGCAUCAAAUCAU CCAUUGCUUGGGACGGCAA-3’)。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的癌症的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的癌症的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的癌症的方法，其包括向个体施用有效量的包含编码dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是个体的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体。在一些实施方案中，所述靶RNA是TP53W53X(例如158G>A)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQ ID NO:4的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的MPS I(例如，赫勒(Hurler)综合征或希氏(Scheie)综合征)的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的MPS I(例如，赫勒综合征或希氏综合征)的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的MPS I(例如，赫勒综合征或希氏综合征)的方法，其包括在离体下将包含编码dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是分离的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括将ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体引入分离的细胞中。在一些实施方案中，所述靶RNA是IDUAW402X(例如，外显子9中的TGG＞TAG突变)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQ ID NO:5的核酸序列(5’-GACGCCCACCGUGUGGUUGCUGUCCAGGACGGUCCCGGCCUGCGACACUUCGGCCCAGAGCUGCUCCUCAUCUGCGGGGCGGGGGGGGGCCGUCGCCGCGUGGGGUCGUUG-3’)。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的MPS I(例如，赫勒综合征或希氏综合征)的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的MPS I(例如，赫勒综合征或希氏综合征)的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的MPS I(例如，赫勒综合征或希氏综合征)的方法，其包括向个体施用有效量的包含编码dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是个体的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体。在一些实施方案中，所述靶RNA是IDUAW402X(例如，外显子9中的TGG＞TAG突变)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQ ID NO:5的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA有关的疾病或病况埃勒斯-当洛综合征的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的疾病或病况埃勒斯-当洛综合征的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的疾病或病况埃勒斯-当洛综合征的方法，其包括在离体下将包含编码dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是分离细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括将ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，所述靶RNA是COL3A1W1278X(例如3833G>A突变)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQ ID NO:6的核酸序列(5’-CAUAUUACAGAAUACCUUGAUAGCAUCCAAUUUGCAUCCUUGGUUA GGGUCAACCCAGUAUUCUCCACUCUUGAGUUCAGGAUGGCAGAAUU UCAGGUCUCUGCAGUUUCU-3’)。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的埃勒斯-当洛综合征的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的埃勒斯-当洛综合征的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的埃勒斯-当洛综合征的方法，其包括向个体施用有效量的包含编码dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是个体的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体。在一些实施方案中，所述靶RNA是COL3A1W1278X(例如3833G>A突变)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQID NO:6的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的原发性肺动脉高压的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的原发性肺动脉高压的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的原发性肺动脉高压的方法，其包括在离体下将包含编码dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是分离的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括将ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，所述靶RNA是BMPR2W298X(例如，893G>A)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQID NO:7的核酸序列(5’-GUGAAGAUAAGCCAGUCCUCUAGUAACAGAAUGAGCAAGACGGCAAGAGCUUACCCAGUCACUUGUGUGGAGACUUAAAUACUUGCAUAAAGAUCCAUUGGGAUAGUACUC-3’)。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的原发性肺动脉高压的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的原发性肺动脉高压的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的原发性肺动脉高压的方法，其包括对个体施用有效量的dRNA，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是个体的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体。在一些实施方案中，所述靶RNA是BMPR2W298X(例如，893G>A)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQ ID NO:7的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA有关的朱伯特综合征的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA有关的朱伯特综合征的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的朱伯特综合征的方法，其包括在离体下将包含编码dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是分离的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括将ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，所述靶RNA是AHI1W725X(例如2174G>A)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQID NO:8的核酸序列(5′-GUGAACGUCAAACUGUCGGACCAAUAUGGCAGAAUCUUCUCUCAUCUCAACUUUCCAUAUCCGUAUCAUGGAAUCAUAGCAUCCUGUAACUACUAGCUCUCUUACAGCUGG-3′)。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的朱伯特(Joubert)综合征的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的朱伯特综合征的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的朱伯特综合征的方法，其包括向个体施用有效量的包含编码dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是个体的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体。在一些实施方案中，所述靶RNA是AHI1W725X(例如2174G>A)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQ ID NO:8的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的范可尼贫血的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的范可尼贫血的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的范可尼贫血的方法，其包括在离体下将包含编码dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是分离的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括将ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，所述靶RNA是FANCCW506X(例如1517G>A)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQID NO:9的核酸序列(5’-GCCAAUGAUCUCGUGAGUUAUCUCAGCAGUGUGAGCCAUCAGGGUGAUGACAUCCCAGGCGAUCGUGUGGCCUCCAGGAGCCCAGAGCAGGAAGUUGAGGAGAAGGUGCCU-3’)。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的范可尼贫血的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的范可尼贫血的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的范可尼贫血的方法，其包括向个体施用有效量的包含编码dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是个体的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体。在一些实施方案中，所述靶RNA是FANCCW506X(例如1517G>A)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQ ID NO:9的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的原发性家族性肥厚型心肌病的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA有关的原发性家族性肥厚型心肌病的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的原发性家族性肥厚型心肌病的方法，其包括在离体下将包含编码dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是分离的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括将ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，所述靶RNA是MYBPC3W1098X(例如3293G>A)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQ ID NO:10的核酸序列(5’-CAAGACGGUGAACCACUCCAUGGUCUUCUUGUCGGCUUUCUGCACUGUGUACCCCCAGAGCUCCGUGUUGCCGACAUCCUGGGGUGGCUUCCACUCCAGAGCCACAUUAAG-3’)。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的原发性家族性肥厚型心肌病的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的原发性家族性肥厚型心肌病的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的原发性家族性肥厚型心肌病的方法，其包括向个体施用有效量的包含编码dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是个体的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体。在一些实施方案中，所述靶RNA是MYBPC3W1098X(例如3293G>A)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQ IDNO:10的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的X连锁重症联合免疫缺陷的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的X连锁重症联合免疫缺陷的方法，其包括在离体下将dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶RNA相关的X-连锁的严重联合免疫缺陷的方法，其包括在离体下将包含编码dRNA的核酸的构建体引入到个体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是分离的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括将ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，所述靶RNA是IL2RGW237X(例如710G>A)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQID NO:11的核酸序列(5′-AGGAUUCUCUUUUGAAGUAUUGCUCCCCCAGUGGAUUGGGUGGCUCCAUUCACUCCAAUGCUGAGCACUUCCACAGAGUGGGUUAAAGCGGCUCCGAACACGAAACGUGUA-3′)。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的X连锁重症联合免疫缺陷的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的X连锁重症联合免疫缺陷的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或包含编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了一种治疗或预防个体中的具有含有突变(例如，G>A突变)的靶RNA的X连锁重症联合免疫缺陷的方法，其包括向个体施用有效量的包含编码dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述ADAR是个体的细胞中内源性表达的ADAR。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用ADAR或包含编码所述ADAR的核酸的构建体。在一些实施方案中，所述靶RNA是IL2RGW237X(例如710G>A)。在一些实施方案中，所述dRNA包含SEQ ID NO:11的核酸序列。
通常，所述组合物(例如，dRNA或包含编码dRNA的核酸的构建体)的施用的剂量、日程安排和途径可以根据个体的大小和病况并根据标准药学实践来确定。示例性施用途径包括：静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、囊内、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内或透皮。
本申请的RNA编辑方法不仅可以用于动物细胞(例如哺乳动物细胞)，而且可以用于修饰植物或真菌的RNA，例如在具有内源性表达的ADAR的植物或真菌中。本文所述的方法可用于生成具有改良特性的基因工程植物和真菌。
还提供了本文所述dRNA、构建体、具有经编辑的RNA的细胞和组合物中的任一种，其用于本文所述的任何一种治疗方法，以及本文所述dRNA、构建体、经编辑的细胞和组合物中的任一种，其用于制备治疗疾病或病况的药物。
V.组合物、试剂盒和制品
本文还提供了包含如本文所述任一种dRNA、构建体、文库或具有编辑的RNA的宿主细胞的组合物(例如药物组合物)。
在一些实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的任一种dRNA或编码所述dRNA的构建体，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，其包括：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，提供了冻干制剂。用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这很容易通过例如经过无菌滤膜过滤来实现。
还提供了可用于本文所述的RNA编辑方法或治疗方法中的任一种的试剂盒，其包含本文所述的dRNA、构建体、组合物、文库或经编辑的宿主细胞中的任一种。
在一些实施方案中，提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的试剂盒，其包含dRNA或含有编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，其中所述dRNA是并且其中所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
在一些实施方案中，提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的试剂盒，其包含dRNA或含有编码所述dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含：(1)与靶RNA杂交的靶向RNA序列，和(2)连接至靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列，并且其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨。
在一些实施方案中，提供了用于在宿主细胞中编辑靶RNA的试剂盒，其包含含有编码dRNA的核酸的构建体，其中所述dRNA包含与靶RNA杂交的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集ADAR以使靶RNA中的靶腺苷残基脱氨，并且其中所述构建体包含可操作地连接至编码所述dRNA的核酸的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含ADAR或含有编码ADAR的核酸的构建体。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含ADAR3的抑制剂或其构建体。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含干扰素的刺激物或其构建体。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于进行本文所述的RNA编辑方法或治疗方法中任一种的说明书。
本申请的试剂盒在合适的包装中。合适的包装，包括但不限于：小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供其他组分，如转染或转导试剂、细胞培养基、缓冲液和解释性信息。
因此，本申请还提供了制品。该制品可以包括容器以及在容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括：小瓶(例如密封的小瓶)、瓶子、广口瓶、软包装等。在一些实施方案中，所述容器保存药物组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。保存所述药物组合物的容器可以是多次使用的小瓶，其允许重复施用(例如2-6次)重构制剂。包装插页是指通常包含在治疗产品的商业包装中的说明，其包含有关使用此类产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。另外，该制品还可以包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户需求的角度来看，它还可以包括其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
所述试剂盒或制品可包括多单位剂量的药物组合物和使用说明书，所包装的量足以在药房(例如医院药房和复方药房)中储存和使用。
下面的示例性实施方案和实施例旨在作为本申请的纯粹示例，因此不应被认为以任何方式限制本发明。通过说明而非限制的方式提供以下示例性实施方案和实施例以及详细描述。
示例性实施方案
本申请提供以下实施方案：
1.一种在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中：
(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，
(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且
(3)所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述dRNA还包含3′连接序列和5′连接序列。
3.根据实施方案2所述的方法，其中所述3′连接序列和所述5′连接序列至少部分地彼此互补。
4.根据实施方案2或实施方案3的方法，其中所述3′连接序列和所述5′连接序列的长度为约20至约75个核苷酸。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述dRNA被RNA连接酶RtcB环化。
6.根据实施方案4的方法，其中所述RNA连接酶RtcB在所述宿主细胞中内源性表达。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述dRNA是环状RNA。
8.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述dRNA是能够形成环状RNA的线性RNA。
9.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述方法包括将包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞。
10.根据权利要求9的方法，其中所述构建体还包含连接至编码所述dRNA的核酸3'端的3'扭转酶核酶序列和连接至编码所述dRNA的核酸5'端的5'扭转酶核酶序列。
11.根据实施方案10所述的方法，其中所述3′扭转酶序列是扭转酶P3U2A，并且所述5′扭转酶序列是扭转酶P1。
12.根据实施方案10所述的方法，其中所述5′扭转酶序列是扭转酶P3U2A，并且所述3′扭转酶序列是扭转酶P1。
13.一种在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中所述dRNA包含：
(1)与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，以及
(2)连接至所述靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列；
其中所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)。
14.根据实施方案13所述的方法，其中所述dRNA包括连接至所述靶向RNA序列5'端的snoRNA序列(“5'snoRNA序列”)。
15.根据实施方案13或14所述的方法，其中所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列3'端的snoRNA序列(3'snoRNA序列”)。
16.根据实施方案13-15中任一项所述的方法，其中所述snoRNA序列的长度为至少约70个核苷酸。
17.根据实施方案13-16中任一项所述的方法，其中所述3'snoRNA序列包含SEQ IDNO:1的核酸序列。
18.根据实施方案13-17中任一项所述的方法，其中所述5'snoRNA序列包含SEQ IDNO:2的核酸序列。
19.根据实施方案13-18中任一项所述的方法，其中所述snoRNA序列是C/D盒snoRNA序列。
20.根据实施方案13-18中任一项所述的方法，其中所述snoRNA序列是H/ACA盒snoRNA序列。
21.根据实施方案13-18中任一项所述的方法，其中所述snoRNA序列是复合的C/D盒和H/ACA盒snoRNA序列。
22.根据实施方案13-18中任一项所述的方法，其中所述snoRNA序列是孤儿snoRNA序列。
23.根据实施方案13-22中任一项所述的方法，其中所述方法包括将包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞。
24.根据实施方案9-12和23中任一项所述的方法，其中所述构建体还包含与编码所述dRNA的核酸可操作地连接的启动子。
25.根据实施方案24的方法，其中所述启动子是聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
26.一种在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将包含编码脱氨酶募集RNA(dRNA)的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中：
(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，
(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且
(3)所述构建体包含与编码所述dRNA的核酸可操作地连接的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
27.根据实施方案25或26的方法，其中所述Pol II启动子是CMV启动子。
28.根据实施方案27的方法，其中所述CMV启动子包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
29.根据实施方案9-12和23-28中任一项所述的方法，其中所述构建体是病毒载体或质粒。
30.根据实施方案29的方法，其中所述构建体是AAV载体。
31.根据实施方案1-30中任一项所述的方法，其中所述ADAR由所述宿主细胞内源性表达。
32.根据实施方案31所述的方法，其中所述宿主细胞是T细胞。
33.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中所述靶向RNA序列的长度大于50个核苷酸。
34.根据实施方案33的方法，其中所述靶向RNA序列的长度为约100至约150个核苷酸。
35.根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中所述靶向RNA序列包含与所述靶RNA中的靶腺苷正对的胞苷、腺苷或尿苷。
36.根据实施方案35的方法，其中所述靶向RNA序列包含与所述靶RNA中的靶腺苷正对的胞苷错配。
37.根据实施方案36的方法，其中所述胞苷错配位于距所述靶向RNA序列3'端至少20个核苷酸，并且距所述靶向RNA序列5'端至少5个核苷酸。
38.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中所述靶向RNA序列还包含一个或多个鸟苷，其各自与所述靶RNA中的非靶腺苷相对。
39.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中所述靶向RNA序列包含与所述靶RNA中的非靶腺苷相对的两个或更多个连续的错配核苷酸。
40.根据实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述靶RNA中靶腺苷的5'最近邻是选自U、C、A和G的核苷酸，优先级为U＞C≈A＞G，并且所述靶RNA中靶腺苷的3'最近邻是选自G、C、A和U的核苷酸，优先级为G＞C＞A≈U。
41.根据实施方案1-40中任一项所述的方法，其中所述靶RNA中所述靶腺苷在选自下组的三碱基基序中：UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA和GAU。
42.根据实施方案41的方法，其中所述三碱基基序是UAG，并且其中所述靶向RNA包含与所述三碱基基序中的尿苷正对的A，与所述靶腺苷正对的胞苷，以及与所述三碱基基序中的鸟苷正对的胞苷、鸟苷或尿苷。
43.根据实施方案1-42中任一项所述的方法，其中所述靶RNA是选自下组的RNA：前信使RNA、信使RNA、核糖体RNA、转移RNA、长非编码RNA和小RNA。
44.根据实施方案43的方法，其中所述靶RNA是前信使RNA。
45.根据实施方案1-44中任一项所述的方法，其还包括将ADAR3抑制剂和/或引入所述宿主细胞。
46.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，其还包括将干扰素刺激物引入所述宿主细胞。
47.根据实施方案1-46中任一项所述的方法，其包括引入多个dRNA或构建体，每个dRNA或构建体靶向不同的靶RNA。
48.根据实施方案1-47中任一项所述的方法，其中编辑所述靶RNA的效率为至少40％。
49.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述构建体或所述dRNA不诱导免疫应答。
50.根据实施方案1-49中任一项所述的方法，其还包括将ADAR(如外源ADAR)引入所述宿主细胞。
51.根据实施方案50所述的方法，其中所述ADAR是包含E1008突变的ADAR1。
52.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述靶RNA中靶腺苷的脱氨导致由所述靶RNA中的错义突变、提前终止密码子、异常剪接或选择性剪接，或者所述靶RNA中错义突变、提前终止密码子、异常剪接或选择性剪接的逆转。
53.根据实施方案52的方法，其中所述靶RNA中靶腺苷的脱氨导致由所述靶RNA编码的蛋白的点突变、截短、延伸和/或错误折叠，或者通过所述靶RNA中错义突变、提前终止密码子、异常剪接或选择性剪接的逆转产生功能性的、全长的、正确折叠的和/或野生型的蛋白。
54.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。
55.根据实施方案54的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
56.根据实施方案55的方法，其中所述宿主细胞是人细胞或小鼠细胞。
57.经编辑的RNA或具有通过实施方案1-56中任一项所述的方法产生的经编辑的RNA的宿主细胞。
58.一种治疗或预防个体的疾病或病况的方法，其包括根据实施方案1-57中任一项所述的方法在所述个体的细胞中编辑与所述疾病或病况相关的靶RNA。
59.根据实施方案58的方法，其中所述疾病或病况是遗传性基因疾病或与一种或多种获得性基因突变相关的疾病或病况。
60.根据实施方案58或59的方法，其中所述靶RNA具有G至A突变。
61.根据实施方案58-60中任一项所述的方法，其中疾病或病况是单基因疾病或病况。
62.根据实施方案58-61中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况是多基因疾病或病况。
63.根据实施方案58-62中任一项所述的方法，其中：
(i)所述靶RNA是TP53，并且所述疾病或病况是癌症；
(ii)所述靶RNA是IDUA，并且所述疾病或病况是I型粘多糖贮积症(MPS I)；
(iii)所述靶RNA是COL3A1，并且所述疾病或病况是埃勒斯-当洛(Ehlers-Danlos)综合征；
(iv)所述靶RNA是BMPR2，并且所述疾病或病况是朱伯特综合征；
(v)所述靶RNA是FANCC，并且所述疾病或病况是范可尼(Fanconi)贫血；
(vi)所述靶RNA是MYBPC3，并且所述疾病或病况是原发性家族性肥厚型心肌病；或
(vii)所述靶RNA是IL2RG，并且所述疾病或病况是X连锁的严重联合免疫缺陷。
64.一种用于编辑靶RNA的脱氨酶募集RNA(dRNA)，所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且其中所述dRNA是环状的或能够形成环状RNA。
65.根据实施方案64的dRNA，其中所述dRNA还包含3′连接序列和5′连接序列。
66.根据实施方案65的dRNA，其中所述3'连接序列和所述5'连接序列至少部分地彼此互补。
67.根据实施方案65或66的dRNA，其中所述3'连接序列和所述5'连接序列的长度为约20至约75个核苷酸。
68.根据实施方案64-67中任一项所述dRNA，其中所述dRNA是环状RNA。
69.根据实施方案64-67中任一项所述dRNA，其中所述dRNA是能够形成环状RNA的线性RNA。
70.一种构建体，其包含编码实施方案64-69中任一项所述dRNA的核酸。
71.根据实施方案70的构建体，其中所述构建体还包含连接至编码所述dRNA的核酸3'端的3'扭转酶核酶序列和连接至编码所述dRNA的核酸5'端的5'扭转酶核酶序列。
72.根据实施方案71的构建体，其中所述3'扭转酶序列是扭转酶P3U2A，并且所述5'扭转酶序列是扭转酶P1。
73.根据实施方案72的构建体，其中所述5'扭转酶序列是扭转酶P3U2A，并且所述3'扭转酶序列是扭转酶P1。
74.一种用于编辑靶RNA的脱氨酶募集RNA(dRNA)，其包括：
(1)与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，以及
(2)在所述靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列；
其中所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)。
75.根据实施方案74所述的dRNA，其中所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列5'端的snoRNA序列(“5'snoRNA序列”)。
76.根据实施方案75所述的dRNA，其中所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列3'端的snoRNA序列(3'snoRNA序列”)。
77.根据实施方案74-76中任一项所述dRNA，其中所述snoRNA序列的长度为至少约70个核苷酸。
78.根据实施方案76-77中任一项所述dRNA，其中所述3'snoRNA序列包含SEQ IDNO:1的核酸序列。
79.根据实施方案75-78中任一项所述dRNA，其中所述5'snoRNA序列包含SEQ IDNO:2的核酸序列。
80.根据实施方案74-79中任一项所述dRNA，其中所述snoRNA序列是C/D盒snoRNA序列。
81.根据实施方案74-79中任一项所述dRNA，其中所述snoRNA序列是H/ACA盒snoRNA序列。
82.根据实施方案74-79中任一项所述dRNA，其中所述snoRNA序列是复合的C/D盒和H/ACA盒snoRNA序列。
83.根据实施方案74-79中任一项所述dRNA，其中所述snoRNA序列是孤儿snoRNA序列。
84.一种构建体，其包含编码实施方案74-83中任一项所述dRNA的核酸。
85.根据实施方案70-73和84中任一项所述构建体，其中所述构建体还包含与编码所述dRNA的核酸可操作地连接的启动子。
86.根据实施方案85的构建体，其中所述启动子是聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
87.一种构建体，其包含编码进入宿主细胞的脱氨酶募集RNA(dRNA)的核酸，其中：
(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，
(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且
(3)所述构建体包含与编码所述dRNA的核酸可操作地连接的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
88.根据实施方案86或87的构建体，其中所述Pol II启动子是CMV启动子。
89.根据实施方案88的构建体，其中所述CMV启动子包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
90.根据实施方案70-73和84-89中任一项所述构建体，其中所述构建体是病毒载体或质粒。
91.根据实施方案90的构建体，其中所述构建体是AAV载体。
92.根据实施方案64-91中任一项所述构建体或所述dRNA，其中所述靶RNA是选自下组的RNA：前信使RNA、信使RNA、核糖体RNA、转移RNA、长非编码RNA和小RNA。
93.一种宿主细胞，其包含实施方案64-91中任一项所述构建体或所述dRNA。
94.一种在宿主细胞中编辑靶RNA的试剂盒，其包含实施方案64-91中任一项所述构建体或所述dRNA。
实施例
材料和方法
质粒构建
通过PCR扩增mCherry和EGFP(EGFP第一密码子ATG缺失)编码DNA来克隆双荧光报道分子，在PCR期间通过引物添加3×GS接头和靶向DNA序列。然后通过II型限制酶BsmB1(Thermo)和T4 DNA连接酶(NEB)切割和连接PCR产物，然后将其插入pLenti骨架中(pLenti-CMV-MCS-SV-Bsd,Stanley Cohen Lab,Stanford University)。
从Lbu质粒(Addgene#83485)PCR扩增dLbuCas13 DNA。从Adar1(p150)cDNA和Adar2cDNA中扩增ADAR1DD和ADAR2DD，这两种cDNA都来自厦门大学的韩氏(Han)实验室的惠赠。通过重叠PCR将ADAR1DD或ADAR2DD与dLbuCas13 DNA融合，并将融合的PCR产物插入pLenti骨架中。
为了在哺乳动物细胞中表达dRNA，直接合成dRNA序列(针对短dRNA)，并通过合成重叠的ssDNA进行退火或PCR扩增，并通过金门克隆(Golden-gate)将产物在U6表达下克隆到相应的载体中。
从Adar1(p150)cDNA PCR扩增全长Adar1(p110)和Adar1(p150)，从Adar2 cDNAPCR扩增全长Adar2，然后分别克隆至pLenti骨架。
对于两种版本的双荧光报道分子(报道分子-1和-3)，PCR扩增了mCherry和EGFP(EGFP起始密码子ATG缺失)，并使用BsmBI(Thermo Fisher Scientific，ER0452)进行消化，然后通过T4 DNA连接酶(NEB，M0202L)介导与GGGGS接头的连接。随后将连接产物插入pLenti-CMV-MCS-PURO骨架。
对于表达dLbuCas13-ADAR DD(E1008Q)的构建体，从ADAR1p150构建体(由厦门大学韩家淮实验室惠赠)扩增得到ADAR1DD基因。通过PCR从Lbu_C2c2_R472A_H477A_R1048A_H1053A质粒(Addgene#83485)扩增dLbuCas13基因。通过重叠PCR产生ADAR1DD(高活性E1008Q变体)，然后融合至dLbuCas13。将连接产物插入pLenti-CMV-MCS-BSD骨架。
对于表达arRNA的构建体，合成arRNA的序列并将其金门(golden-gate)克隆到pLenti-sgRNA-lib 2.0(Addgene#89638)骨架中，并且由hU6启动子驱动arRNA的转录。对于表达ADAR的构建体，从ADAR1p150构建体PCR扩增出全长ADAR1p110和ADAR1p150，并从ADAR2构建体(由厦门大学韩家淮实验室惠赠)PCR扩增出全长ADAR2。然后将扩增的产物克隆到pLenti-CMV-MCS-BSD骨架中。
对于表达具有致病性突变的基因的构建体，TP53的全长编码序列(订购自Vigenebio)和其他6种与疾病相关的基因(COL3A1、BMPR2、AHI1、FANCC、MYBPC3和IL2RG，由中国医学科学院病原生物学研究所的王建伟实验室惠赠)，通过诱变PCR从编码具有引入G>A突变的相应基因的构建体扩增。通过Gibson克隆方法将扩增产物克隆到pLenti-CMV-MCS-mCherry骨架中。
哺乳动物细胞系和细胞培养
在37℃、5％CO2下培养哺乳动物细胞系，采用达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，10-013-CV，Corning，Tewksbury，MA，USA)，加入10％胎牛血清(兰州百灵生物技术有限公司，中国兰州)，补充有1％青霉素-链霉素。ADAR1-KO细胞系购自中国博雅基因(EdiGene)公司，基因分型结果也由该公司提供。
HeLa和B16细胞系来自Z.Jiang的实验室(北京大学)。HEK293T细胞系来自C.Zhang的实验室(北京大学)。RD细胞系来自J.Wang的实验室(北京协和医学院&中国医学科学院，病原生物学研究所)。SF268细胞系来自中国医学科学院基础医学研究所的细胞中心。A549和SW13细胞系来自博雅基因公司。HepG2、HT29、NIH3T3和MEF细胞系在我们北京大学的实验室中维护。将这些哺乳动物细胞系在37℃于5％CO2下培养于含10％胎牛血清(CellMax，SA201.02)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Corning，10-013-CV)，并另外补充有1％青霉素-链霉素。除非另有说明，按照制造商的说明用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(Roche，06366546001)转染细胞。
人原代肺成纤维细胞(#3300)和人原代支气管上皮细胞(#3210)购自ScienCellResearch Laboratories，Inc.，并分别培养于成纤维细胞培养基(ScienCell，#2301)和支气管上皮细胞培养基(ScienCell,#3211)。两种培养基均补充有15％的胎牛血清(BI)和1％的青霉素-链霉素。原代GM06214和GM01323细胞订购自科里尔(Coriell)医学研究所，并培养于含15％胎牛血清(BI)和1％青霉素-链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(Corning，10-013-CV)。将所有细胞在37℃、5％CO2下培养。
报道分子系统转染、FACS分析和Sanger测序
对于双荧光报道分子编辑实验，将293T-WT细胞或293T-Adar1-KO细胞接种在6孔板(6×105个细胞/孔)中，24小时后，根据供应商的方案，使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(06366546001；Roche，Mannheim，德国)共转染1.5μg报道分子质粒和1.5μg dRNA质粒。48-72小时后，收集细胞并进行FACS分析。为了进一步确认报道分子mRNA编辑，我们使用FACS Aria流式细胞仪(BD Biosciences)分选来自用报道分子和dRNA质粒转染的293T-WT细胞的EGFP阳性细胞，然后进行总RNA分离(TIANGEN，DP430)。然后通过RT-PCR(TIANGEN，KR103-04)将RNA逆转录成cDNA，并用相应的引物对(23个PCR循环)PCR扩增靶向的基因座，并纯化PCR产物用于Sanger测序。
对于Adar1(p110)、Adar1(p150)或Adar2的拯救(RESCUE)和过表达实验，将293T-WT细胞或293T-Adar1-KO细胞接种于12孔板(2.5×105个细胞/孔)中，24小时后，使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(06366546001，Roche，Mannheim，德国)共转染0.5μg的报道分子质粒，0.5μg的dRNA质粒和0.5μg的Adar1/2质粒(pLenti骨架作为对照)。48-72小时后，收集细胞并进行FACS分析。
对于内源mRNA实验，将293T-WT细胞接种在6孔板(6×105个细胞/孔)中，当约70％汇合时，使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(06366546001，Roche，Mannheim，德国)转染3μg的dRNA质粒。72小时后，收集细胞并通过FACS分选GFP阳性或BFP阳性细胞(根据相应的荧光标记物)，用于后续的RNA分离。
人原代T细胞的分离与培养
从健康人供体的白细胞清除产物中分离出原代人T细胞。简而言之，通过Ficoll离心(Dakewei，AS1114546)分离外周血单核细胞(PBMC)，并使用EasySep人T细胞分离试剂盒(STEMCELL，17951)，通过磁阴性选择从PBMC分离T细胞。分离后，将T细胞培养于X-vivo15培养基，10％FBS和IL2(1000U/ml)，并用CD3/CD28 DynaBeads(ThermoFisher，11131D)刺激2天。健康供体的白细胞清除产物购自中国AllCells LLC。所有健康的供体均提供了知情同意。
慢病毒包装和报道分子细胞系的构建
通过X-tremeGENE HP DNA转染试剂，将表达质粒与两种病毒包装质粒pR8.74和pVSVG(Addgene)一起共转染到HEK293T-WT细胞中。72小时后，收集上清液病毒并储存在-80℃。用慢病毒感染HEK293T-WT细胞，72小时后，通过FACS分选mCherry阳性细胞，并培养以通过有限稀释方法选择出稳定表达具有很低EGFP背景的双荧光报道分子系统的单克隆细胞系。
对于稳定的报道分子细胞系，将报道分子构建体(pLenti-CMV-MCS-PURO骨架)与两个病毒包装质粒pR8.74和pVSVG一起共转染到HEK293T细胞中。72小时后，收集上清病毒并保存在-80℃。用慢病毒感染HEK293T细胞，然后通过FACS分选mCherry阳性细胞，并培养以选择稳定表达无可检测EGFP背景的双荧光报道分子系统的单克隆细胞系。HEK293TADAR1–/–和TP53–/–细胞系是根据以前报道的方法60生成的。将靶向ADAR1的sgRNA和PCR扩增的含有CMV驱动的嘌呤霉素抗性基因的供体DNA共转染到HEK293T细胞中。然后在转染后7天用嘌呤霉素处理细胞。从嘌呤霉素抗性细胞中分离出单个克隆，然后通过测序和蛋白质印迹进行验证。
内源或外源表达的转录物的RNA编辑
为了评估在双荧光报道分子上的RNA编辑，将HEK293T细胞或HEK293T ADAR1-/-细胞接种在6孔板中(6×105个细胞/孔)。24小时后，将细胞用1.5μg报道分子质粒和1.5μgarRNA质粒共转染。为了检查ADAR1p110、ADAR1p150或ADAR2蛋白表达的影响，通过EGFP阳性比率和深度测序来测定编辑效率。
将HEK293T ADAR1-/-细胞接种在12孔板中(2.5×105个细胞/孔)。24小时后，将细胞与0.5μg报道分子质粒、0.5μg arRNA质粒和0.5μgADAR1/2质粒(pLenti骨架作为对照)共转染。通过EGFP阳性比率和深度测序测定编辑效率。
为了评估内源mRNA转录物上的RNA编辑，将HEK293T细胞接种在6孔板中(6×105个细胞/孔)。24小时后，将细胞用3μg arRNA质粒转染。通过深度测序分析编辑效率。
为了评估多个细胞系中的RNA编辑效率，将8-9×104(RD，SF268，HeLa)或1.5×105(HEK293T)个细胞接种在12孔板中。对于难以转染的细胞，如HT29、A549、HepG2、SW13、NIH3T3、MEF和B16，将2-2.5×105个细胞接种在6孔板中。24小时后，将报道分子和arRNA质粒共转染到这些细胞中。通过EGFP阳性比率测定编辑效率。
为了评价EGFP阳性比率，在转染后48-72小时，通过荧光激活细胞分选(FACS)分析来分选并收集细胞。mCherry信号用作表达报道分子/arRNA的细胞的荧光选择标志物，计算EGFP+/mCherry+细胞的百分比作为编辑效率的读数。
为了对A至I编辑率进行NGS定量，在转染后48-72小时，通过FACS测定来分选并收集细胞，然后进行RNA分离(TIANGEN，DP420)。然后，通过RT-PCR(TIANGEN，KR103-04)将总RNA逆转录为cDNA，并使用下表中列出的相应引物PCR扩增靶向的基因座。
将PCR产物纯化用于Sanger测序或NGS(Illumina HiSeq X Ten)。
在多个细胞系中进行测试
除了HEK293T(阳性对照)和HEK293T ADAR1-/-(阴性对照)细胞，选择一种小鼠细胞系(NIH3T3)以及源自不同组织和器官的7种人细胞系(RD、HeLa、SF268、A549、HepG2、HT-29和SW13)进行实验。对于具有较高转染效率的细胞系，将约8-9×104个细胞(RD、HeLa、SF268)或1.5×105个(HEK293T)细胞接种到12孔板的每个孔上，至于难以转染的那些细胞(A549、HepG2、HT-29、SW13、NIH3T3)，把2-2.5×105个细胞接种于6孔板中。并且将所有这些细胞在37℃、5％CO2维持在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，Corning)，其补充有10％胎牛血清(FBS，CellMax)。24小时后，用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(Roche)将CG2报道分子和71nt dRNA(35-C-35)质粒共转染到不同类型的细胞中。转染后48小时，胰蛋白酶化细胞，并通过FACS(BD)进行分析。因为低转染效率的细胞具有相当少的mCherry和BFP阳性细胞，对于那些接种在6孔板上的细胞，我们将用于FACS分析的总细胞数增加至1×105个。
实施例1：通过使用CMV启动子驱动arRNA表达来优化LEAPER
为了测试RNA聚合酶II(Pol II)是否可以提高编辑效率，构建了表达由Pol II启动子(CMV)驱动的arRNA的质粒。使用基于EGFP表达的报道分子系统(报道分子1，图4B)，比较了由CMV驱动的arRNA和U6启动子之间的RNA编辑效率(arRNA51)。将未经处理的细胞用作模拟(mock)对照(Mock)。用非靶向RNA转染的细胞也用作对照(Ctrl RNA)。结果发现，在RNA编辑中CMV-arRNA优于U6-arRNA(图1)。
实施例2：sno-arRNA介导的RNA编辑
为了稳定arRNA并增强其核定位，对arRNA进行了工程化改造以使其具有snoRNA末端。靶向荧光报道分子-1的151-nt arRNA侧翼有snoRNA末端(图2A)：
5'端：
GAGTGAGATCTTGGACCAATGATGACTTCCATACATGCATTCCTTGGAAAGCTGAACAAAATGAGTGGGAACTCTGTACTATCATCTTAGTTGAACTGAGGTCCACCGGGGGCTAA(SEQ ID NO:19)；
3'端：
AAGATTGTGTGTGGATCGATGATGACTTCCATATATACATTCCTTGGAAAGCTGAACAAAATGAGTGAAAACTCTATACCGTCATTCTCGTCGAACTGAGGTCCAGCACATTACTCCAACAG(SEQ ID NO:20)，
名称为sno-arRNA151。
双荧光报道分子-1包含：mCherry的序列(SEQ ID NO:21)、含有3×GS接头和靶向的A的序列(SEQ ID NO:22)，以及eGFP的序列(SEQ ID NO:23)。
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG(mCherry的序列)(SEQ ID NO:21)
GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(eGFP的序列)(SEQ ID NO:23)。
然后将人U6驱动的sno-arRNA151、arRNA151、sno-Ctrl RNA151或Ctrl RNA151与表达报道分子的质粒一起转染到HEK293T细胞中。转染后48小时，通过FACS分析定量EGFP阳性率。FACS结果显示，侧翼为snoRNA末端的sno-arRNA151可以以约38％的EGFP阳性率介导在报道分子mRNA上的靶向RNA编辑，该EGFP阳性率低于线性arRNA的EGFP阳性率(图2B-2C)。
为测试snoRNA末端是否稳定arRNA，在不同时间点测量了EGPF阳性率。将人U6启动子下的sno-arRNA151、arRNA151、sno-Ctrl RNA151或Ctrl RNA151转染到HEK293T-报道分子细胞中。在转染后3天、6天和12天的3个时间点测量EGFP阳性率。结果显示，在延伸的时间段内，sno-arRNA表现出比arRNA更高的编辑效率，这表明snoRNA末端可以保护arRNA免受降解并增强sno-arRNA的丰度(图3A)。
为了进一步提高arRNA的表达水平，使用了基于病毒的强启动子-CMV来表达arRNA或sno-arRNA。结果表明，CMV启动子表达的arRNA(CMV_arRNA)显示出比U6启动子表达的arRNA(U6_arRNA)更高的编辑效率。此外，U6_arRNA组的EGFP阳性率随时间延伸而下降，而CMV_arRNA的EGFP阳性率在转染后6天仍增加。类似地，CMV启动子表达的sno-arRNA(CMV_sno-arRNA)实现了比U6启动子表达的sno-arRNA(U6_sno-arRNA)更高的编辑效率(图3B和图3C)。
基于以上结果，证明snoRNA末端可以稳定arRNA，并且由CMV启动子驱动的arRNA或sno-arRNA可以增加其表达水平。这两种策略均可以显著提高arRNA的编辑效率。
实施例3：环状arRNA介导的RNA编辑
用表达均靶向报道分子-1的环状arRNA71和环状arRNA111的质粒来转染稳定地表达在mCherry和EGFP之间含有框内终止密码子的报道分子-1的HEK293T细胞(图4B)。EGFP荧光指示RNA上靶标编辑的效率。为了测试最有效的arRNA结构，将环状arRNA的侧翼有与两端连接序列相连的25-nt或50-nt接头(图4A)。为了进行比较，还同时转染了线性(非环状)arRNA71和arRNA111。结果表明，与线性arRNA相比，环状arRNA强烈地改善了EGFP+细胞的比率和EGFP强度(图4C)，而具有25-nt或50-nt接头的环状arRNA削弱了效率的提高(图4C)。
在稳定表达报道分子-3的HEK293T中(图4B)，进一步测试了长度对编辑效率的影响。基于报道分子EGFP比率，环状arRNA的长度与编辑效率正相关，在111-nt至151-nt达到峰值(图4D)；并且71-nt是环状arRNA活性的最小长度(图4D)。
双重荧光报道分子-3包含：mCherry的序列(SEQ ID NO:21)、含有1×GS接头(以斜黑体显示)和靶向的A的序列(SEQ ID NO:24)，以及eGFP的序列(SEQ ID NO:23)。
CTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTAGAGGGCTCTGCCA(含有1×GS接头(以斜黑体显示)和靶向的A(以更大的黑体A显示)的序列)(SEQ ID NO:24)
将环状arRNA用于HeLa和A549细胞中，由于ADAR1的低表达水平或ADAR3的高表达，在我们测试的多个细胞系中LEAPER效率相对较低。结果表明，基于EGFP报道分子测定，环状arRNA在两种细胞系中均显著提高了编辑效率(图4E)。
实施例4：使用带有环状arRNA的LEAPER系统校正提前终止密码子
许多疾病是由提前终止密码子(PTC)引起的。为了检查LEAPER-环状arRNA在治疗PTC相关疾病中的潜力，构建了一个框内UAA终止密码子报道分子。设计了三种版本的环状arRNA(即Tornado-arRNA111-A1、Tornado-arRNA111-A2和Tornado-arRNA111-2A)来靶向该报道分子的UAA位点，并比较了三种不同arRNA的EGFP阳性百分比。结果表明，靶向TAA密码子的第二个腺苷的Tornado-arRNA111-A2更有效(图5)。
实施例5：使用带有环状arRNA的LEAPER系统调节mRNA剪接
操纵mRNA剪接以生成新的剪接产物是一种治愈疾病的策略，如杜氏(Duchene)肌营养不良症。将RG6剪接报道分子用于检测LEAPER环状arRNA是否可以改变剪接受体位点。设计了三种版本的环状arRNA，以靶向RG6剪接受体位点，包括Tornado-arRNA71(71-nt)，Tornado-arRNA71(111-nt)和Tornado-arRNA71+BP(既靶向受体位点又靶向分支点的111-nt)。在HEK293T细胞中，如果剪接模式被LEAPER-Tornado改变，则RG6报道分子比EGFP蛋白表达更多的dsRNA蛋白(图6A)。我们发现，LEAPER-环状arRNA可以有效地靶向细胞剪接机制(图6B)。
实施例6：带有环状arRNA的LEAPER系统的慢病毒递送
治疗性RNA的连续给药对其功效是重要的。测试了用慢病毒递送带有环状arRNA的LEAPER是否可以实现RNA编辑。结果发现，带有环状arRNA的LEAPER可以通过慢病毒递送起作用，从而多种Tornado-arRNA可以整合到基因组中并稳定表达。Tornado-arRNA的长度与编辑效率正相关(图7)。
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32.Vallecillo-Viejo,I.C.,Liscovitch-Brauer,N.,Montiel-Gonzalez,M.F.,Eisenberg,E.&Rosenthal,J.J.C.Abundant off-target edits from site-directed RNAediting can be reduced by nuclear localization of the editing enzyme.RNAbiology 15,104-114(2018).
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序列表
<110> 北京大学
<120> 采用工程化RNA利用内源ADAR进行靶向的RNA编辑
<130> PE01438A
<150> PCT/CN2019/095802
<151> 2019-07-12
<160> 51
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 1
aagattgtgt gtggatcgat gatgacttcc atatatacat tccttggaaa gctgaacaaa 60
atgagtgaaa actctatacc gtcattctcg tcgaactgag gtccagcaca ttactccaac 120
ag 122
<210> 2
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 2
gagtgagatc ttggaccaat gatgacttcc atacatgcat tccttggaaa gctgaacaaa 60
atgagtggga actctgtact atcatcttag ttgaactgag gtccaccggg ggctaa 116
<210> 3
<211> 508
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 3
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480
acggtgggag gtctatataa gcagagct 508
<210> 4
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 4
gggagcagcc ucuggcauuc ugggagcuuc aucuggaccu gggucuucag ugaaccauug 60
uucaauaucg uccggggaca gcaucaaauc auccauugcu ugggacggca a 111
<210> 5
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 5
gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cugcuccuca ucugcggggc gggggggggc cgucgccgcg uggggucguu g 111
<210> 6
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 6
cauauuacag aauaccuuga uagcauccaa uuugcauccu ugguuagggu caacccagua 60
uucuccacuc uugaguucag gauggcagaa uuucaggucu cugcaguuuc u 111
<210> 7
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 7
gugaagauaa gccaguccuc uaguaacaga augagcaaga cggcaagagc uuacccaguc 60
acuugugugg agacuuaaau acuugcauaa agauccauug ggauaguacu c 111
<210> 8
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 8
gugaacguca aacugucgga ccaauauggc agaaucuucu cucaucucaa cuuuccauau 60
ccguaucaug gaaucauagc auccuguaac uacuagcucu cuuacagcug g 111
<210> 9
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 9
gccaaugauc ucgugaguua ucucagcagu gugagccauc agggugauga caucccaggc 60
gaucgugugg ccuccaggag cccagagcag gaaguugagg agaaggugcc u 111
<210> 10
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 10
caagacggug aaccacucca uggucuucuu gucggcuuuc ugcacugugu acccccagag 60
cuccguguug ccgacauccu gggguggcuu ccacuccaga gccacauuaa g 111
<210> 11
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 11
aggauucucu uuugaaguau ugcuccccca guggauuggg uggcuccauu cacuccaaug 60
cugagcacuu ccacagagug gguuaaagcg gcuccgaaca cgaaacgugu a 111
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 12
tataactagt atggtgagca agggcgagga g 31
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 13
tatacgtctc atctacagat tcttccggcg tgtatacctt c 41
<210> 14
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 14
tatacgtctc atagagatcc ccggtcgcca ccgtgagcaa gggcgaggag ctg 53
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 15
uaaaccgagg gaucauaggg gacugaaucc accauucuuc ucccaauccc u 51
<210> 16
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 16
acuacaguug cuccgauauu uaggcuacgu caauaggcac uaacuuauug gcgcugguga 60
acggacuucc ucucgaguac cagaagauga cuacaaaacu ccuuuccauu gcgaguaucg 120
gagucuggcu caguuuggcc agggaggcac u 151
<210> 17
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 17
gcccttgctc actggcagag ccctccagca tcgcgagcag gcgctgcctc c 51
<210> 18
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 18
acuacaguug cuccgauauu uaggcuacgu caauaggcac uaacuuauug gcgcugguga 60
acggacuucc ucucgaguac cagaagauga cuacaaaacu ccuuuccauu gcgaguaucg 120
gagucuggcu caguuuggcc agggaggcac u 151
<210> 19
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 19
gagtgagatc ttggaccaat gatgacttcc atacatgcat tccttggaaa gctgaacaaa 60
atgagtggga actctgtact atcatcttag ttgaactgag gtccaccggg ggctaa 116
<210> 20
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 20
aagattgtgt gtggatcgat gatgacttcc atatatacat tccttggaaa gctgaacaaa 60
atgagtgaaa actctatacc gtcattctcg tcgaactgag gtccagcaca ttactccaac 120
ag 122
<210> 21
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 21
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708
<210> 22
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 22
ctgcagggcg gaggaggcag cggcggagga ggcagcggcg gaggaggcag cagaaggtat 60
acacgccgga agaatctgta gagatccccg gtcgccacc 99
<210> 23
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 23
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180
gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600
ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaa 717
<210> 24
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 24
ctgcagggcg gaggaggcag cgcctgctcg cgatgctaga gggctctgcc a 51
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 25
aaccaugccg acugauggca g 21
<210> 26
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 26
cugccaucag ucggcgugga cuguag 26
<210> 27
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 27
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 28
<211> 121
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 28
cacacacaaa cacacacaac acaacacagc uccucgcccu ugcucacugg cagagcccuc 60
cagcaucgcg agcaggcgcu gccuccuccg ccgcugcaac acacaaaacc accacaccaa 120
c 121
<210> 29
<211> 171
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 29
accacacaca caaccaccac acacacacac acaaacacac acaacacaac acagcuccuc 60
gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgccgcu 120
gcaacacaca aaaccaccac accaacccca acaaccacac acccacacaa c 171
<210> 30
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 30
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgccgcu gccuccuccg ccgcugccuc c 111
<210> 31
<211> 161
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 31
cacacacaaa cacacacaac acaacgaugg gcaccacccc ggugaacagc uccucgcccu 60
ugcucacugg cagagcccuc cagcaucgcg agcaggcgcu gccuccuccg ccgcugccuc 120
cuccgccgcu gccucccaac acacaaaacc accacaccaa c 161
<210> 32
<211> 211
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 32
accacacaca caaccaccac acacacacac acaaacacac acaacacaac gaugggcacc 60
accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag 120
gcgcugccuc cuccgccgcu gccuccuccg ccgcugccuc ccaacacaca aaaccaccac 180
accaacccca acaaccacac acccacacaa c 211
<210> 33
<211> 123
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 33
uugccaugug uaugugggga gacggucggg uccagauauu cguaucuguc gaguagagug 60
ugggcucccc acauacucug augauccaga gacgauauua cgucucagga ucauucaugg 120
caa 123
<210> 34
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 34
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 35
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 35
uuucagcuau accugcccgg uauaaaggga cguucacacc gcgauguucu cugcugggga 60
auugcgcgau a 71
<210> 36
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 36
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgccgcu gccuccuccg ccgcugccuc c 111
<210> 37
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 37
uaccgcuaca gccacgcuga uuucagcuau accugcccgg uauaaaggga cguucacacc 60
gcgauguucu cugcugggga auugcgcgau auucaggauu aaaagaagug c 111
<210> 38
<211> 151
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 38
acuacaguug cuccgauauu uaggcuacgu caauaggcac uaacuuauug gcgcugguga 60
acggacuucc ucucgaguac cagaagauga cuacaaaacu ccuuuccauu gcgaguaucg 120
gagucuggcu caguuuggcc agggaggcac u 151
<210> 39
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 39
acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag g 31
<210> 40
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 40
gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc c 51
<210> 41
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 41
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgcccug c 71
<210> 42
<211> 91
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 42
accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag 60
gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac a 91
<210> 43
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 43
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 44
<211> 131
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 44
gcucgaccag gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag 60
cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca 120
ugccgccggu g 131
<210> 45
<211> 151
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 45
ucgccgucca gcucgaccag gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc 60
acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac 120
agcucgucca ugccgccggu ggaguggcgg c 151
<210> 46
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 46
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgccgcu gccuccuccg ccgcugccuc c 111
<210> 47
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 47
uaccgcuaca gccacgcuga uuucagcuau accugcccgg uauaaaggga cguucacacc 60
gcgauguucu cugcugggga auugcgcgau auucaggauu aaaagaagug c 111
<210> 48
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 48
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgccgcu gccuccuccg ccgcugccuc c 111
<210> 49
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 49
uaccgcuaca gccacgcuga uuucagcuau accugcccgg uauaaaggga cguucacacc 60
gcgauguucu cugcugggga auugcgcgau auucaggauu aaaagaagug c 111
<210> 50
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 50
gcagcggcgg aggaggcagc gccugcucgc gaugcuagag ggcucugcca gugagcaagg 60
gcgaggagcu guuc 74
<210> 51
<211> 87
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 51
gagcuguaca agcugcaggg cggaggaggc agcgccugcu cgcgaugcua gagggcucug 60
ccagugagca agggcgagga gcuguuc 87
Claims (43)
1.一种在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中：
(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，
(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且
(3)所述dRNA是环状RNA或能够形成环状RNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述dRNA还包含3′连接序列和5′连接序列，任选地其中：
(i)所述3′连接序列和所述5′连接序列至少部分地彼此互补；和/或
(ii)所述3′连接序列和所述5′连接序列的长度为约20个至约75个核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述dRNA是环状RNA。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述dRNA是能够形成环状RNA的线性RNA。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述dRNA被RNA连接酶RtcB环化，任选地其中所述RNA连接酶RtcB在所述宿主细胞中内源性表达。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述方法包括将包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述构建体还包含连接至编码所述dRNA的核酸3'端的3'扭转酶核酶序列和连接至编码所述dRNA的核酸5'端的5'扭转酶核酶序列，任选地其中：
(i)所述3'扭转酶序列是扭转酶P3 U2A，并且所述5'扭转酶序列是扭转酶P1；或
(ii)所述5'扭转酶序列是扭转酶P3 U2A，并且所述3'扭转酶序列是扭转酶P1。
8.一种在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将脱氨酶募集RNA(dRNA)或包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中所述dRNA包含：
(1)与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，以及
(2)连接至所述靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列；并且
其中所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中：
(i)所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列5'端的snoRNA序列(“5'snoRNA序列”)；
(ii)所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列3'端的snoRNA序列(3'snoRNA序列”)；
(iii)所述snoRNA序列的长度为至少约70个核苷酸；
(iv)所述3′snoRNA序列包含SEQ ID NO:1的核酸序列；
(v)所述5′snoRNA序列包含SEQ ID NO:2的核酸序列；和/或
(vi)所述snoRNA序列是C/D盒snoRNA序列、H/ACA盒snoRNA序列、复合的C/D盒和H/ACA盒snoRNA序列、或孤儿snoRNA序列。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述方法包括将包含编码所述dRNA的核酸的构建体引入所述宿主细胞。
11.根据权利要求6-7或10的方法，其中所述构建体还包含与编码所述dRNA的核酸可操作地连接的启动子，并且其中所述启动子是聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
12.一种在宿主细胞中编辑靶RNA的方法，其包括将包含编码脱氨酶募集RNA(dRNA)的核酸的构建体引入所述宿主细胞，其中：
(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，
(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且
(3)所述构建体包含与编码所述dRNA的核酸可操作地连接的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述Pol II启动子是CMV启动子，任选地其中所述CMV启动子包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
14.根据权利要求6-7和10-13中任一项所述的方法，其中所述构建体是病毒载体或质粒，任选地其中所述构建体是AAV载体。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述ADAR由所述宿主细胞内源性表达，任选地其中所述宿主细胞是T细胞。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中：
(i)所述靶向RNA序列的长度大于50个核苷酸，任选地其中所述靶向RNA序列的长度为约100个至约150个核苷酸；
(ii)所述靶向RNA序列包含与所述靶RNA中的靶腺苷正对的胞苷、腺苷或尿苷，任选地其中所述靶向RNA序列包含与所述靶RNA中的靶腺苷正对的胞苷错配，诸如其中所述胞苷错配位于距所述靶向RNA序列3'端至少20个核苷酸，并且距所述靶向RNA序列5'端至少5个核苷酸；
(iii)所述靶向RNA序列还包含一个或多个鸟苷，它们各自与所述靶RNA中的非靶腺苷相对；
(iv)所述靶向RNA序列包含与所述靶RNA中的非靶腺苷相对的两个或更多个连续的错配核苷酸；
(v)所述靶RNA中靶腺苷的5'最近邻是选自U、C、A和G的核苷酸，优先级为U＞C≈A＞G，并且所述靶RNA中靶腺苷的3'最近邻是选自G、C、A和U的核苷酸，优先级为G＞C＞A≈U；
(vi)所述靶RNA中所述靶腺苷在选自下组的三碱基基序中：UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA和GAU，任选地其中所述三碱基基序是UAG，并且其中所述靶向RNA包含与所述三碱基基序中的尿苷正对的A，与所述靶腺苷正对的胞苷，以及与所述三碱基基序中的鸟苷正对的胞苷、鸟苷或尿苷；和/或
(vii)所述靶RNA是选自下组的RNA：前信使RNA、信使RNA、核糖体RNA、转移RNA、长非编码RNA和小RNA，任选地其中所述靶RNA是前信使RNA。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其还包括将ADAR3抑制剂和/或干扰素刺激物引入所述宿主细胞。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其包括引入多个dRNA或构建体，它们各自靶向不同的靶RNA。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中编辑所述靶RNA的效率为至少40％。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述构建体或所述dRNA不诱导免疫应答。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其还包括将ADAR引入所述宿主细胞，任选地其中所述ADAR是包含E1008突变的ADAR1。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述靶RNA中靶腺苷的脱氨导致所述靶RNA中的错义突变、提前终止密码子、异常剪接或选择性剪接，或者所述靶RNA中错义突变、提前终止密码子、异常剪接或选择性剪接的逆转，任选地其中所述靶RNA中靶腺苷的脱氨导致由所述靶RNA编码的蛋白的点突变、截短、延伸和/或错误折叠，或者通过所述靶RNA中错义突变、提前终止密码子、异常剪接或选择性剪接的逆转产生功能性的、全长的、正确折叠的和/或野生型的蛋白。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞，任选地其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞，诸如其中所述宿主细胞是人细胞或小鼠细胞。
24.一种经编辑的RNA或一种具有通过权利要求1-23中任一项所述的方法产生的经编辑的RNA的宿主细胞。
25.一种治疗或预防个体的疾病或病况的方法，其包括根据权利要求1-23中任一项所述的方法在所述个体的细胞中编辑与所述疾病或病况相关的靶RNA。
26.根据权利要求25所述的方法，其中：
(i)所述疾病或病况是遗传性基因疾病或与一种或多种获得性基因突变有关的疾病或病况；
(ii)所述靶RNA具有G至A突变；和/或
(iii)所述疾病或病况是单基因或多基因疾病或病况。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中：
(i)所述靶RNA是TP53，并且所述疾病或病况是癌症；
(ii)所述靶RNA是IDUA，并且所述疾病或病况是I型粘多糖贮积症(MPS I)；
(iii)所述靶RNA是COL3A1，并且所述疾病或病况是埃勒斯-当洛综合征；
(iv)所述靶RNA是BMPR2，并且所述疾病或病况是朱伯特综合征；
(v)所述靶RNA是FANCC，并且所述疾病或病况是范可尼贫血；
(vi)所述靶RNA是MYBPC3，并且所述疾病或病况是原发性家族性肥厚型心肌病；或
(vii)所述靶RNA是IL2RG，并且所述疾病或病况是X连锁的严重联合免疫缺陷。
28.一种用于编辑靶RNA的脱氨酶募集RNA(dRNA)，所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，其中所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且其中所述dRNA是环状的或能够形成环状RNA。
29.根据权利要求28所述的dRNA，其中所述dRNA还包含3′连接序列和5′连接序列，任选地其中：
(i)所述3’连接序列和所述5′连接序列至少部分地彼此互补；和/或
(ii)所述3′连接序列和所述5′连接序列的长度为约20至约75个核苷酸。
30.根据权利要求28或29所述的dRNA，其中所述dRNA是环状RNA。
31.根据权利要求28或29所述的dRNA，其中所述dRNA是能够形成环状RNA的线性RNA。
32.一种构建体，其包含编码权利要求28-31中任一项所述dRNA的核酸。
33.根据权利要求32所述的构建体，其中所述构建体还包含连接至编码所述dRNA的核酸3'端的3'扭转酶核酶序列和连接至编码所述dRNA的核酸5'端的5'扭转酶核酶序列，任选地其中：
(i)所述3'扭转酶序列是扭转酶P3 U2A，并且所述5'扭转酶序列是扭转酶P1；或
(ii)所述5'扭转酶序列是扭转酶P3 U2A，并且所述3'扭转酶序列是扭转酶P1。
34.一种用于编辑靶RNA的脱氨酶募集RNA(dRNA)，其包含：
(1)与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，以及
(2)在所述靶向RNA序列3'和/或5'端的小核仁RNA(snoRNA)序列；
其中所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)。
35.根据权利要求34所述的dRNA，其中：
(i)所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列5'端的snoRNA序列(“5'snoRNA序列”)；
(ii)所述dRNA包含连接至所述靶向RNA序列3'端的snoRNA序列(“3'snoRNA序列”)；
(iii)所述snoRNA序列的长度为至少约70个核苷酸；
(iv)所述3′snoRNA序列包含SEQ ID NO:1的核酸序列；
(v)所述5′snoRNA序列包含SEQ ID NO:2的核酸序列；和/或
(vi)所述snoRNA序列是C/D盒snoRNA序列、H/ACA盒snoRNA序列、复合的C/D盒和H/ACA盒snoRNA序列、或孤儿snoRNA序列。
36.一种构建体，其包含编码权利要求34或35所述的dRNA的核酸。
37.根据权利要求32-33和36中任一项所述构建体，其中所述构建体还包含与编码所述dRNA的核酸可操作地连接的启动子，其中所述启动子是聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
38.一种构建体，其包含编码进入宿主细胞的脱氨酶募集RNA(dRNA)的核酸，其中：
(1)所述dRNA包含与所述靶RNA至少部分地互补的靶向RNA序列，
(2)所述dRNA能够募集RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)，并且
(3)所述构建体包含与编码所述dRNA的核酸可操作地连接的聚合酶II启动子(“Pol II启动子”)。
39.根据权利要求37或38所述的构建体，其中所述Pol II启动子是CMV启动子，任选地其中所述CMV启动子包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
40.根据权利要求32-33和36-39中任一项所述的构建体，其中所述构建体是病毒载体或质粒，任选地其中所述构建体是AAV载体。
41.根据权利要求28-40中任一项所述的构建体或dRNA，其中所述靶RNA是选自下组的RNA：前信使RNA、信使RNA、核糖体RNA、转移RNA、长非编码RNA和小RNA。
42.一种宿主细胞，其包含权利要求28-40中任一项所述的构建体或dRNA。
43.一种用于在宿主细胞中编辑靶RNA的试剂盒，其包含权利要求28-40中任一项所述构建体或所述dRNA。
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