KR20220116508A - 조혈 줄기 세포의 증폭을 위한 저분자 화합물 및 이의 조합 - Google Patents

조혈 줄기 세포의 증폭을 위한 저분자 화합물 및 이의 조합 Download PDF

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KR20220116508A
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Abstract

조혈 줄기 세포(HSCs)의 증폭을 위한 저분자 억제제 및 이의 조합을 제공한다. 상기 저분자 억제제 및 이의 조합은 조혈 줄기 세포(HSCs)의 시험관 내 증폭을 잘 촉진하면서 조혈 줄기 세포의 줄기성을 유지할 수 있다.

Description

조혈 줄기 세포의 증폭을 위한 저분자 화합물 및 이의 조합
본 발명은 생물의약 분야에 관한 것으로, 구체적으로 조혈 줄기 세포(HSCs)의 증폭을 위한 저분자 화합물에 관한 것이며, 구체적으로 세포 신호 전달 경로의 저분자 억제제, 이의 조성물 및 조혈 줄기 세포의 증폭에서 상기 저분자 억제제 및 이의 조성물의 용도이다.
조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cells, HSCs)는 자가 재생 및 다계통 분화의 두 가지 중요한 특징을 갖는 혈액 시스템의 이질적인 원시 조혈 세포 그룹이다. 신체가 건강한 상태일 때 체내의 HSCs는 오랫 동안 정지 상태에 있고, 신체가 병변이 나타나거나 심각한 실혈 상태일 때 HSCs는 활성화되어 자가 재생 및 다계통 분화 상태에 진입함으로써, 혈액 시스템의 안정성과 신체의 항상성을 유지한다. HSCs의 자가 재생 특성은 자손 HSCs의 줄기성을 유지하는 데 도움이 되는 반면, HSCs의 다계통 분화 특성은 골수성 세포(과립구, 단핵구, 적혈구 및 혈소판), 림프구(T 세포 및 B 세포)와 같은 다양한 성숙한 혈액 세포로 분화될 수 있다. HSCs의 특성은 신체가 필요로 할때 HSCs의 분화에 도움이 된다.
HSCs의 이러한 특성은 조혈 줄기 세포 이식(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)을 통해 혈액 시스템 질환을 치료하는 것을 가능하게 한다. HSCs는 장기 조혈 줄기 세포(long term HSCs, LT-HSCs) 및 단기 조혈 줄기 세포(short term HSCs, ST-HSCs)를 포함한다. 전자는 신체의 전체 생명 주기에서 조혈 재건을 수행할 수 있는 고도의 자가 재생 능력을 갖고; 후자는 제한된 시간 동안만 조혈 재건 기능을 유지할 수 있다. 1959년, Thomas 등은 골수 조혈 줄기 세포를 이용하여 인류 역사상 최초의 조혈 줄기 세포 이식을 수행하였고, 환자 체내의 정상적인 조혈 기능을 회복시키기 위해 임상에서 백혈병을 치료하였다. 그후 수십년 동안 과학연구자들의 끊임없는 노력으로 조혈 줄기 세포 이식은 다양한 혈액 시스템 질환의 치료뿐만 아니라 면역 결핍성 질환, 신경 퇴행성 질환 등의 치료에도 적용되었다.
현재, HSCs의 세 가지 주요 유래는 골수(bone marrow, BM), 가동화된 말초 혈액(mobilized peripheral blood, mPB), 제대혈(umbilical cord blood, CB)이다. 골수조혈 줄기 세포의 채취는 외상성이 크고 채취량이 불충분하므로, 이 방법은 기본적으로 탈락되었다. 인간 말초 혈액에서 HSCs의 비율은 매우 낮(0.1%보다 작음)으므로, 과립구 집락 자극 인자(G-CSF)를 이용하여 조혈 줄기 세포가 골수에서 말초 혈액으로 이동하도록 가동화한 다음 이식을 수행해야 하며, 임상 적용에서는 가동화 효과가 좋지 않고 HSCs의 개수가 불충분하여, 가동화 또는 이식 실패가 반복되는 경우가 많다. 또한, 이 두 가지 방법으로 채취된 HSCs는 모두 기증자와 환자 간의 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA) 매칭을 수행해야 한다. HLA 매칭은 어렵고, 일단 미스매칭이 발생하면 이식편대숙주반응(graft versus host reaction, GVHD)이 발생한다. GVHD가 발생하는 환자들은 면역 시스템 장애로 사망하게 된다.
제대혈은 새로운 HSCs의 유래로서 다양한 장점이 있는 바, 첫째, 제대혈 HSCs는 HLA 매칭의 일치 정도에 대한 요구사항이 낮고, 부분적인 HLA 미스매칭을 허용하며, 이식 후 GVHD 발병률이 낮고, 전통적인 HSCT 매칭의 난이도를 완화하며; 둘째, 제대혈은 채취가 용이하고, 기증자에게 무해하고 윤리적인 문제가 없으며, HSCs 조혈 능력이 강하다. 이러한 장점은 제대혈을 질환의 치료를 위한 미래 HSCs의 바람직한 유래가 되도록 한다.
그러나, 단일 제대혈의 세포량이 적고 전체 HSCs의 개수가 적기 때문에, 소아 또는 체중이 가벼운 성인의 이식에 한정되어 있고, 체중이 많이 나가는 성인의 이식 수요를 충족시킬 수 없다. 이식된 HSCs 개수가 불충분한 경우, 환자의 호중구 회복이 지연되어 GVHD 위험이 높아진다. 이는 제대혈의 임상 적용을 제한하는 걸림돌이 된다.
결론적으로, 조혈 줄기 세포 이식의 안전성과 유효성은 이식된 HSCs의 함량에 의해 결정되고, 시험관 내에서 HSCs의 개수를 증폭할 수 있다면 조혈 줄기 세포 이식의 성공률을 높일 수 있다.
연구자들은 끊임없는 노력으로 조혈 줄기 세포의 시험관 내 증폭을 구현하기 위해 상이한 방법을 모색하려고 한다. HSCs의 시험관 내 증폭 전략 중 하나는 HSCs 표적화 저분자 화합물(small-molecule compounds, SMCs)을 사용하는 것이다. SMCs는 유래가 용이하고 대량 생산이 용이하며 성질이 안정적이고 구조가 명확하며 농도 조절이 용이하므로, 의학 연구에 이미 널리 적용되었다. 현단계 HSCs의 시험관 내 증폭 기술에서, SMCs는 HSCs의 증폭 배수를 현저히 증가시킬 수 있다. 예를 들어, AhR 아릴 탄화수소 수용체 억제제 StemRegenin1(SR1)은 시험관 내에서 HSCs를 증폭시킬 수 있는 스크리닝된 최초의 SMC이다. 피리미딘 인돌 유도체 UM171도 시험관 내에서 HSCs를 증폭시킬 수 있지만, AhR 세포 신호 전달 경로를 통해 작용을 발휘하지 않는다. 전사체 분석 결과, UM171은 AhR 세포 신호 전달 경로를 하향 조절하지 않았지만, 적혈구 및 거핵구 분화 관련 유전자를 억제하는 것을 보여준다. 양자의 조합은 HSCs의 증폭 배수를 향상시킨다.
히스톤 탈아세틸화효소(histone deacetylases, HDAC)는 사람들에게 잘 알려진 세포 신호 전달 경로이다. 히스톤은 아세틸화 또는 탈아세틸화 조절을 통해 특정 유전자의 전사 과정, 세포의 증식 및 분화를 조절할 수 있다. 기존의 연구 결과는 히스톤 아세틸화가 HSCs 자가 재생 및 증식 측면에서 작용을 발휘한다는 것을 나타냈다. HDAC 억제제 TSA, trapoxin, chlamydocin은 시험관 내에서 히스톤 아세틸화를 조절하여 HSCs의 자가 재생 및 증식을 촉진할 수 있다.
Src는 Src 원암유전자에 의해 코딩되는 것으로, 티로신 단백질 키나아제 활성을 갖는 비수용체 단백질 키나아제이다. 이는 세포질 내에 존재하고, 다양한 세포 표면 수용체에 의해 활성화되어 여러 세포 신호 전달 경로의 매개에 관여함으로써, 세포의 증식 및 분화 등 과정을 조절할 수 있으며, 여러 세포 신호 전달 경로의 핵심 분자이다. 예를 들어, Src가 활성화된 후 p52Shc와 협력하여 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 세포 신호 전달 경로를 활성화하고, 세포 성장 및 분화 과정에서 MAPK 다운스트림 조절에 관여하며; Src는 또한 STAT 세포 신호 전달 경로를 활성화하고, 관련 유전자의 전사를 촉진할 수 있다. 지금까지 Src 억제제가 HSCs의 시험관 내 증폭 과정에서 줄기성을 유지하는 데 도움이 된다는 연구는 없었지만, 본 발명의 연구에서 우리는 Src 억제제가 HSCs의 증식을 촉진하고 HSCs의 줄기성을 유지할 수 있음을 발견하였다.
일부 세포 신호 전달 경로의 저분자 억제제가 HSCs의 증식을 촉진할 수 있다는 것을 발견하였지만, 본 기술분야에서는 HSCs의 증식을 촉진하는 작용이 더 강하고 증식된 HSCs의 줄기성을 유지할 수 있는 저분자 화합물 및 이러한 목적을 구현하는 종합적인 전략을 찾아 임상 요구사항을 충족해야 한다.
본 발명이 해결해야 할 문제는 연구를 통해 세포 신호 전달 경로의 핵심 인자를 조절하여 HSCs의 시험관 내 증폭을 촉진하면서 HSCs의 높은 비율의 줄기성을 유지하는 최적의 저분자 화합물 및 이의 조성물을 스크리닝함으로써, 선행기술의 HSCs의 시험관 내 증폭 개수가 불충분한 문제를 해결하는 것이다.
우선, 본 출원인의 연구는 STAT 세포 신호 전달 경로에 작용하는 Src 표적의 다수의 저분자 억제제가 시험관 내 배양시 HSCs의 줄기성을 잘 유지할 수 있고, STAT 세포 신호 전달 경로에서 Src 표적이 조혈 줄기 세포를 증폭하면서 조혈 줄기 세포의 줄기성을 유지하는 데 중요한 작용을 일으킨다는 것을 발견하였고, 이는 이전 연구에서 보고되지 않은 것이다.
또한, 본 발명은 HSCs의 시험관 내 배양 과정에서 SAHA, Valproic acid(VPA)와 같은 HDAC 억제제와 Src 표적의 저분자 억제제의 조합이 HSCs의 줄기성을 잘 유지할 수 있고, 그 효과가 선행기술에서 발견된 SR1 및 UM171보다 훨씬 우수함을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 일 양태에서 Src 표적을 표적화하는 저분자 억제제와 같은 신호변환자-전사활성자(STAT) 세포 신호 전달 경로의 저분자 억제제는 HSCs의 증식을 촉진하고 HSCs의 줄기성을 유지할 수 있음을 발견하였다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 시험관 내에서 HSCs를 STAT 세포 신호 전달 경로를 포함하는 저분자 억제제 또는 다른 세포 신호 전달 경로 저분자 억제제의 배양액에 접촉시키는 단계를 포함하는 HSCs 증식 촉진 및 HSCs 줄기성 유지 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 STAT 세포 신호 전달 경로의 저분자 억제제는 Src 표적의 저분자 억제제이다. 일부 실시형태에서, 상기 Src 표적의 저분자 억제제는 Dasatinib, Quercetin, UM-164, KX2-391 및 KX1-004 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 Src 표적의 저분자 억제제는 Dasatinib, UM-164 및 KX1-004 중 하나 이상으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 Src 표적의 저분자 억제제는 다른 세포 신호 전달 경로 저분자 억제제와 병용된다. 일부 실시형태에서, 상기 다른 세포 신호 전달 경로 저분자 억제제는 HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제, PKC를 표적으로 하는 저분자 억제제 및 JNK를 표적으로 하는 저분자 억제제 중 하나 또는 둘 이상으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 Src 표적의 저분자 억제제는 HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제, PKC를 표적으로 하는 저분자 억제제 또는 JNK를 표적으로 하는 저분자 억제제와 병용된다. 일부 실시형태에서, 상기 Src 표적의 저분자 억제제는 HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제 VPA, HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제 SAHA, PKC를 표적으로 하는 저분자 억제제 Enzastaurin 또는 JNK를 표적으로 하는 저분자 억제제 JNK-IN-8과 병용된다. 일부 실시형태에서, 상기 Src 표적의 저분자 억제제Dasatinib은 VPA 또는 SAHA와 병용된다. 일부 실시형태에서, 상기 신호변환자-전사활성자(STAT)세포 신호 전달 경로의 저분자 억제제, 예를 들어 Src 표적의 저분자 억제제, 예를 들어 Dasatinib, UM-164 또는 KX1-004는 전체 세포에서 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 HSCs의 세포의 비율이 8％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％를 초과하도록 유지하고, 예를 들어 전체 세포에서 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 HSCs의 세포의 비율이 5％ ~ 35％, 10％ ~ 35％, 15％ ~ 35％, 20％ ~ 35％, 25％ ~ 35％, 5％ ~ 30％, 10％ ~ 30％, 20％ ~ 30％, 5％ ~ 25％, 10％ ~ 25％, 15％ ~ 25％, 20％ ~ 25％, 5％ ~ 20％, 10％ ~ 20％, 15％ ~ 20％이도록 유지하며; 전체 세포에서 CD34+ 세포의 비율이 65％, 70％, 75％, 80％, 85％를 초과하도록 유지한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 STAT 세포 신호 전달 경로를 포함하는 저분자 억제제를 포함하는 HSCs 줄기성을 유지하기 위한 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 STAT 세포 신호 전달 경로를 포함하는 저분자 억제제는 Src 표적의 저분자 억제제이다. 일부 실시형태에서, 상기 Src 표적의 저분자 억제제는 Dasatinib, Quercetin, UM-164, KX2-391 및 KX1-004 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 다른 세포 신호 전달 경로 저분자 억제제를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 다른 세포 신호 전달 경로 저분자 억제제는 HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제, PKC를 표적으로 하는 저분자 억제제 및 JNK를 표적으로 하는 저분자 억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 다른 세포 신호 전달 경로 저분자 억제제는 HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제 VPA, HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제 SAHA, PKC를 표적으로 하는 저분자 억제제 Enzastaurin 및 JNK를 표적으로 하는 저분자 억제제 JNK-IN-8을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 SFEMII 배지, 성장 인자 Flt-3L, 성장 인자 SCF, 성장 인자 TPO 및 성장 인자 IL-6을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 STAT 세포 신호 전달 경로를 포함하는 저분자 억제제 및/또는 다른 세포 신호 전달 경로 저분자 억제제, SFEMII 배지, 성장 인자 Flt-3L, 성장 인자 SCF, 성장 인자 TPO 및 성장 인자 IL-6으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 전체 세포에서 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 HSCs의 세포의 비율이 8％, 10％, 15％, 20％, 25％ 또는 30％를 초과하도록 유지하고, 예를 들어 전체 세포에서 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 HSCs의 세포의 비율이 5％ ~ 35％, 10％ ~ 35％, 15％ ~ 35％, 20％ ~ 35％, 25％ ~ 35％, 5％ ~ 30％, 10％ ~ 30％, 20％ ~ 30％, 5％ ~ 25％, 10％ ~ 25％, 15％ ~ 25％, 20％ ~ 25％, 5％ ~ 20％, 10％ ~ 20％, 15％ ~ 20％이도록 유지한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 전체 세포에서 CD34+ 세포의 비율이 65％, 70％, 75％, 80％ 또는 85％를 초과하도록 유지한다.
일부 실시형태에서, 상기 신호변환자-전사활성자(STAT) 세포 신호 전달 경로의 저분자 억제제, 예를 들어 Src 표적의 저분자 억제제, 예를 들어 Dasatinib, UM-164 또는 KX1-004와 다른 세포 신호 전달 경로의 저분자 억제제, 예를 들어 VPA 또는 SAHA의 병용은 전체 세포에서 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 HSCs의 세포의 비율이 8％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％를 초과하도록 유지하고, 예를 들어 전체 세포에서 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 HSCs의 세포의 비율이 5％ ~ 35％, 10％ ~ 35％, 15％ ~ 35％, 20％ ~ 35％, 25％ ~ 35％, 5％ ~ 30％, 10％ ~ 30％, 20％ ~ 30％, 5％ ~ 25％, 10％ ~ 25％, 15％ ~ 25％, 20％ ~ 25％, 5％ ~ 20％, 10％ ~ 20％, 15％ ~ 20％이도록 유지하며; 전체 세포에서 CD34+ 세포의 비율이 65％, 70％, 75％, 80％, 85％를 초과하도록 유지한다. 일부 실시형태에서, 배지에서 각 억제제의 농도는,
Dasatinib: 0.1 μM ~ 50 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 40 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 30 μM, 가장 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM이고;
SAHA: 10 nM ~ 20 μM, 바람직하게는 20 nM ~ 15 μM, 더 바람직하게는 30 nM ~ 10 μM, 가장 바람직하게는 0.1 μM ~ 10 μM이며;
VPA: 10 μM ~ 2000 μM, 바람직하게는 10 μM ~ 1500 μM, 더 바람직하게는 10 μM ~ 1000 μM, 가장 바람직하게는 100 μM ~ 1000 μM이고;
JNK-IN-8: 0.1 μM ~ 20 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 15 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM, 가장 바람직하게는 1 μM ~ 10 μM이며;
EPZ004777: 0.1 μM ~ 50 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 40 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 30 μM, 가장 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM이고;
DZNeP: 1 nM ~ 500 nM, 바람직하게는 5 nM ~ 400 nM, 더 바람직하게는 10 nM ~ 300 nM, 가장 바람직하게는 10 nM ~ 250 nM이며;
UM-164: 0.1 μM ~ 1000 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 500 μM, 더 바람직하게는 1 μM ~ 100 μM, 가장 바람직하게는 1 μM ~ 10 μM이고;
KX2-391: 0.1 nM ~ 1000 nM, 바람직하게는 1 nM ~ 1000 nM, 더 바람직하게는 10 nM ~ 500 nM, 가장 바람직하게는 10 nM ~ 100 nM이며;
KX1-004: 0.1 μM ~ 1000 μM, 바람직하게는 1 μM ~ 1000 μM, 더 바람직하게는 10 μM ~ 500 μM, 가장 바람직하게는 10 μM ~ 100 μM이다.
일 양태에서, 본 발명은 시험관 내에서 HSCs를 1) HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제 VPA; 2) HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제 SAHA; 3) PKC를 표적으로 하는 저분자 억제제 Enzastaurin; 및 4)JNK를 표적으로 하는 저분자 억제제 JNK-IN-8 중 하나 이상의 저분자 억제제를 포함하는 배양액에 접촉시키는 단계를 포함하는 HSCs 증식 촉진 및 HSCs 줄기성 유지 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 SAHA+EPZ004777, SAHA+DZNeP, SAHA+Dasatinib, VPA+Dasatinib, SAHA+JNK-IN-8 또는 SAHA+VPA로부터 선택되는 어느 하나의 조합을 포함하는 HSCs 줄기성을 유지하기 위한 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 SFEMII 배지, 성장 인자 Flt-3L, 성장 인자 SCF, 성장 인자 TPO 및 성장 인자 IL-6을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 SAHA+EPZ004777, SAHA+DZNeP, SAHA+Dasatinib, VPA+Dasatinib, SAHA+JNK-IN-8 또는 SAHA+VPA로부터 선택되는 어느 하나의 조합, SFEMII 배지, 성장 인자 Flt-3L, 성장 인자 SCF, 성장 인자 TPO 및 성장 인자 IL-6으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 상기 HSCs 줄기성을 유지하기 위한 조성물은 또한 CD34+ 세포의 비율을 유지하는 데 도움이 된다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 전체 세포에서 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 HSCs의 세포의 비율이 8％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％를 초과하도록 유지하고, 예를 들어 전체 세포에서 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 HSCs의 세포의 비율이 5％ ~ 35％, 10％ ~ 35％, 15％ ~ 35％, 20％ ~ 35％, 25％ ~ 35％, 5％ ~ 30％, 10％ ~ 30％, 20％ ~ 30％, 5％ ~ 25％, 10％ ~ 25％, 15％ ~ 25％, 20％ ~ 25％, 5％ ~ 20％, 10％ ~ 20％, 15％ ~ 20％이도록 유지하며; 전체 세포에서 CD34+ 세포의 비율이 65％, 70％, 75％, 80％, 85％를 초과하도록 유지한다. 일부 실시형태에서, 배지에서 각 억제제의 농도는,
Dasatinib: 0.1 μM ~ 50 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 40 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 30 μM, 가장 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM이고;
SAHA: 10 nM ~ 20 μM, 바람직하게는 20 nM ~ 15 μM, 더 바람직하게는 30 nM ~ 10 μM, 가장 바람직하게는 0.1 μM ~ 10 μM이며;
VPA: 10 μM ~ 2000 μM, 바람직하게는 10 μM ~ 1500 μM, 더 바람직하게는 10 μM ~ 1000 μM, 가장 바람직하게는 100 μM ~ 1000 μM이고;
JNK-IN-8: 0.1 μM ~ 20 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 15 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM, 가장 바람직하게는 1 μM ~ 10 μM이며;
EPZ004777: 0.1 μM ~ 50 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 40 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 30 μM, 가장 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM이고;
DZNeP: 1 nM ~ 500 nM, 바람직하게는 5 nM ~ 400 nM, 더 바람직하게는 10 nM ~ 300 nM, 가장 바람직하게는 10 nM ~ 250 nM이다.
일 양태에서, 본 발명은 SAHA+EPZ004777+DZNeP 또는 SAHA+VPA+Dasatinib으로부터 선택되는 어느 하나의 조합을 포함하는 HSCs 줄기성을 유지하기 위한 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 SFEMII 배지, 성장 인자 Flt-3L, 성장 인자 SCF, 성장 인자 TPO 및 성장 인자 IL-6을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 SAHA+EPZ004777+DZNeP 또는 SAHA+VPA+Dasatinib 및 SFEMII 배지, 성장 인자 Flt-3L, 성장 인자 SCF, 성장 인자 TPO 및 성장 인자 IL-6으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 전체 세포에서 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 HSCs의 세포의 비율이 8％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％를 초과하도록 유지하고, 예를 들어 전체 세포에서 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 HSCs의 세포의 비율이 5％ ~ 35％, 10％ ~ 35％, 15％ ~ 35％, 20％ ~ 35％, 25％ ~ 35％, 5％ ~ 30％, 10％ ~ 30％, 20％ ~ 30％, 5％ ~ 25％, 10％ ~ 25％, 15％ ~ 25％, 20％ ~ 25％, 5％ ~ 20％, 10％ ~ 20％, 15％ ~ 20％이도록 유지하며; 전체 세포에서 CD34+ 세포의 비율이 65％, 70％, 75％, 80％, 85％를 초과하도록 유지한다. 일부 실시형태에서, 배지에서 각 억제제의 농도는 Dasatinib: 0.1 μM ~ 50 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 40 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 30 μM, 가장 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM이고;
SAHA: 10 nM ~ 20 μM, 바람직하게는 20 nM ~ 15 μM, 더 바람직하게는 30 nM ~ 10 μM, 가장 바람직하게는 0.1 μM ~ 10 μM이며;
VPA: 10 μM ~ 2000 μM, 바람직하게는 10 μM ~ 1500 μM, 더 바람직하게는 10 μM ~ 1000 μM, 가장 바람직하게는 100 μM ~ 1000 μM이고;
EPZ004777: 0.1 μM ~ 50 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 40 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 30 μM, 가장 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM이며;
DZNeP: 1 nM ~ 500 nM, 바람직하게는 5 nM ~ 400 nM, 더 바람직하게는 10 nM ~ 300 nM, 가장 바람직하게는 10 nM ~ 250 nM이다.
일부 실시형태에서, 상기 STAT 세포 신호 전달 경로의 저분자 억제제는 Src 표적의 저분자 억제제이다. 일부 실시형태에서, 상기 Src 표적의 저분자 억제제는 Dasatinib, Quercetin, UM-164, KX2-391 및 KX1-004 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 Src 표적의 저분자 억제제는 Dasatinib, UM-164 및 KX1-004 중 하나 이상으로부터 선택된다. 본 출원인의 연구 결과에서, 상기 이러한 세포 신호 전달 경로의 저분자 억제제는 시험관 내 증폭시 HSCs의 줄기성 및 CD34+ 세포의 비율을 잘 유지할 수 있고, 이러한 저분자 억제제의 조합은 HSCs의 자가 재생 및 줄기성 유지 등 측면에서 선행기술에서 보고된 저분자 조합의 효과보다 우수하다.
본 발명에서, 본 출원인의 연구 결과에서는 HSCs의 시험관 내 증폭 배양 측면에서 Src의 억제제가 HSCs의 줄기성을 잘 유지할 수 있다는 것을 발견하였고; 또한, HSCs의 시험관 내 증폭 배양 측면에서 HDAC 억제제와 Src 억제제의 조합은 그 효과가 보고된 저분자 억제제 및 이러한 저분자 억제제의 단독 사용 효과보다 우수한 것을 발견하였다. 본 출원인의 연구 결과는 HSCs의 시험관 내 증폭을 구현하면서 HSCs의 높은 비율의 줄기성을 유지할 수 있으며, HSCs의 임상 적용을 위한 기반을 마련할 수 있다.
상기 조혈 줄기 세포의 “줄기성”은 조혈 줄기 세포 특성의 약칭이다. 조혈 줄기 세포(HSCs)는 자가 재생 능력(self-renewal capacity) 및 다능성(pluripotency)의 두 가지 주요 세포 생물학적 특성을 나타낸다. 조혈 줄기 세포의 이러한 특성은 “줄기성”(stemness)이라고 약칭한다. 조혈 줄기 세포의 세포 표면에 발현된 분자 표현형은 어느 정도로 “줄기성”을 유지하는지 여부를 반영할 수 있다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포의 표현형이 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-인 경우, 이는 LT-HSCs로 “줄기성”을 유지한다는 것을 나타낸다. 본 발명에서, CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 조혈 줄기 세포는 LT-HSCs로 정의되며; 조혈 줄기 세포는 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖고, 이는 조혈 줄기 세포 특성, 즉 “줄기성”을 유지하거나 보유하는 것으로 정의된다.
상기 전체 세포는 초기 CD34+ 세포가 배양된 후의 모든 자손 세포를 의미한다.
본 발명은 시험관 내에서 조혈 줄기 세포를 Src 표적의 저분자 억제제와 같은 STAT 세포 신호 전달 경로를 포함하는 저분자 억제제 또는 HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제, PKC를 표적으로 하는 저분자 억제제 및 JNK를 표적으로 하는 저분자 억제제와 같은 다른 세포 신호 전달 경로 저분자 억제제에 접촉시켜, 시험관 내 증폭시 HSCs의 줄기성 및 전체 HSCs에서 CD34+ 세포의 비율을 잘 유지할 수 있고, 이러한 저분자 억제제의 조합은 HSCs의 자가 재생 및 줄기성 유지 등 측면에서 선행기술에서 보고된 저분자 조합의 효과보다 우수하며, 또한 상기 저분자 억제제 처리 후의 세포 이식 효율은 선행기술에서 보고된 저분자 억제제 처리 후의 세포 이식 효율보다 현저히 높다.
도 1은 표적 세포 집단 CD34+CD45+CD45RA-CD90+CD38-세포 집단의 논리 게이트 및 게이트 위치의 결정을 보여준다.
도 2는 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 저분자 억제제의 최적 농도 및 HSCs 줄기성 유지 능력에 대한 1차 스크리닝을 수행하고, 표4의 저분자 억제제(각 저분자는 4개의 농도로 테스트됨)로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다.
도 3은 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 저분자 억제제의 최적 농도 및 HSCs 줄기성 유지 능력에 대한 2차 스크리닝을 수행하고, 표 5의 저분자 억제제로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다.
도 4는 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 저분자 억제제의 최적 농도 및 HSCs 줄기성 유지 능력에 대한 3차 스크리닝을 수행하고, 표 6의 저분자 억제제(SAHA-1 μM 외에, 각 억제제는 3개의 농도로 테스트됨)로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다.
도 5는 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 저분자 억제제의 최적 농도 및 HSCs 줄기성 유지 능력에 대한 4차 스크리닝을 수행하고, 표 7의 저분자 억제제(SAHA-1 μM 외에, 각 억제제는 3개의 농도로 테스트됨)로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다.
도 6은 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 저분자 억제제의 최적 농도 및 HSCs 줄기성 유지 능력에 대한 5차 스크리닝을 수행하고, 표 8의 저분자 억제제(SAHA-1 μM 외에, 각 억제제는 3개의 농도로 테스트됨)로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다.
도 7은 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 HSCs 줄기성을 유지하는 저분자 억제제의 최적 이분자 조합에 대한 1차 스크리닝을 수행하고, 저분자 조합 SAHA+SR1, SAHA+VE821, SAHA+PFI3, SAHA+S-4-A로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다.
도 8은 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 HSCs 줄기성을 유지하는 저분자 억제제의 최적 이분자 조합에 대한 2차 스크리닝을 수행하고, 저분자 조합 SAHA+SR1, SAHA+UM171, SAHA+PGE2, SAHA+GW9662, SAHA+FLU로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다.
도 9는 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 HSCs 줄기성을 유지하는 저분자 억제제의 최적 이분자 조합에 대한 3차 스크리닝을 수행하고, 저분자 조합 SAHA+Butyrate, SAHA+EPZ004777, SAHA+DZNeP, SAHA+Vitamin C(SAHA 외에, 각 억제제는 3개의 농도로 테스트됨)로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다. S는 SAHA(1 μM)를 나타낸다.
도 10은 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 HSCs 줄기성을 유지하는 저분자 억제제의 최적 이분자 조합에 대한 4차 스크리닝을 수행하고, 저분자 조합 SAHA+Dasatinib, SAHA+SGC0496, SAHA+JNK-IN-8, SAHA+Enzastaurin(LY317615)(SAHA 외에, 각 억제제는 3개의 농도로 테스트됨)로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다. S는 SAHA(1 μM)를 나타낸다.
도 11은 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 HSCs 줄기성을 유지하는 저분자 억제제의 최적 이분자 조합에 대한 5차 스크리닝을 수행하고, 저분자 조합 SAHA+VPA, SAHA+Go6983, SAHA+DCA, SAHA+GSK2606414(SAHA 외에, 각 억제제는 2 ~ 3개의 농도로 테스트됨)로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커 (CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다. S는 SAHA(1 μM)를 나타낸다.
도 12는 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 HSCs 줄기성을 유지하는 저분자 억제제의 최적 삼분자 조합에 대한 1차 스크리닝을 수행하고, 저분자 조합 SAHA+EPZ004777+DZNeP로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다. 각 그룹에서 3회 반복되고, *는 현저한 차이를 나타낸다.
도 13은 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 HSCs 줄기성을 유지하는 저분자 억제제의 최적 삼분자 조합에 대한 2차 스크리닝을 수행하고, 저분자 조합 SAHA+Dasatinib+EPZ004777, SAHA+JNK-IN-8+EPZ004777, SAHA+JNK-IN-8+DZNeP, SAHA+JNK-IN-8+Dasatinib, SAHA+JNK-IN-8+EPZ004777+DZNeP로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 조합 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다. 각 그룹에서 3회 반복되고, *는 현저한 차이를 나타낸다.
도 14는 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 HSCs 줄기성을 유지하는 저분자 억제제의 최적 삼분자 조합에 대한 3차 스크리닝을 수행하고, 저분자 조합 SAHA+VPA+Dasatinib로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 조합 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다. 각 그룹에서 3회 반복되고, *는 현저한 차이를 나타낸다.
도 15는 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 스크리닝된 저분자 억제제와 문헌에서 보고된 저분자 억제제 SR1, UM171을 비교하고, 저분자 억제제로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 조합 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다. 각 그룹에서 3회 반복되고, *는 현저한 차이를 나타낸다.
도 16은 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 스크리닝된 저분자 억제제 및 문헌에서 보고된 저분자 억제제 SR1, UM171의 시험관 내 클론 형성 능력의 분석도를 보여준다. BFU-E, CFU-E, CFU-GM, CFU-GEMM은 적혈구계, 골수계, 림프계와 같은 혈액 시스템의 다양한 혈통의 클론을 나타낸다. 여기서, 횡좌표는 억제제의 조합 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 Colonies number는 총 클론 수를 나타내며, colonies number of GEMM은 CFU-GEMM의 클론 개수를 나타낸다. 각 그룹에서 3회 반복되고, *는 현저한 차이를 나타낸다. S는 SAHA(1 μM)를 나타낸다.
도 17은 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 저분자 억제제의 최적 농도 및 HSCs 줄기성 유지 능력에 대한 스크리닝을 수행하고, 표 9의 저분자 억제제(SAHA-1 μM 외에, 각 억제제는 3개의 농도로 테스트됨)로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+/CD45+/CD90+/CD45RA-/CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 횡좌표는 억제제의 명칭 및 사용 농도를 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다.
도 18의 도 18a, 도 18c는 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 저분자 Mock(DMSO), SR1(5 μM), UM171(350 nM), Dasatinib(50 nM)로 8일 동안 처리한 후 유세포 분석에 의한 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현 분석도를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 명칭을 나타내고, 종좌표 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(％)는 전체 세포에서 LT-HSCs의 비율을 나타내며, CD34+CD45+(％)는 HSCs 순도를 나타낸다. 도 18b, 도 18d는 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 저분자 Mock(DMSO), SR1(5 μM), UM171(350 nM), Dasatinib(50 nM)로 8일 동안 처리한 후 LT-HSCs 및 CD34+ 세포 증식의 절대 수를 보여주며, 여기서 횡좌표는 억제제의 명칭을 나타내고, 종좌표는 세포의 개수를 나타낸다.
도 19는 hCD45+ 및 mCD45+ 세포 집단의 논리 게이트 및 게이트 위치의 결정을 보여준다. 여기서, NC는 항체가 없는 대조군을 나타내고, 33은 항체가 첨가된 33번 샘플을 나타내며, hCD45는 인간 CD45+ 세포를 나타내고, mCD45는 뮤린 CD45+ 세포를 나타낸다.
도 20은 hCD45+, hCD3+, hCD33+, hCD56+, hCD19+ 및 mCD45+ 세포 집단의 논리 게이트 및 게이트 위치의 결정을 보여준다. 여기서, hCD3+는 T 림프구의 표면 마커로 인간 CD3+ 세포를 나타낸다. hCD33+는 골수 세포의 표면 마커로 인간 CD33+ 세포를 나타낸다. hCD56+는 자연 살해 세포(NK 세포)의 표면 마커로 인간 CD56+ 세포를 나타낸다. hCD19+는 B 림프구의 표면 마커로 인간 CD19+ 세포를 나타낸다. mCD45는 뮤린 CD45+ 세포를 나타낸다.
도 21은 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 저분자 Mock(DMSO), SR1(5 μM), Dasatinib(50 nM)로 7일 동안 처리한 후, 모든 세포를 수집하여 마우스 체내에 이식하고, 이식 후 제4주, 8주, 12주 및 16주에 유세포 분석으로 마우스 말초 혈액의 인간 CD45 세포의 비율을 검출하며, 이식 후 제16주에 유세포 분석으로 마우스 골수 및 비장의 인간 CD45 세포의 비율을 검출한 것을 보여준다. 도 21a의 횡좌표는 억제제의 명칭 및 이식 시간을 나타내고, 종좌표 hCD45-PB(％)는 마우스 말초 혈액에서 검출된 인간 CD45+ 세포의 비율을 나타낸다. PB는 말초 혈액(Peripheral Blood)을 나타내고, hCD45는 인간 CD45+ 세포를 나타낸다. 도 21b의 횡좌표는 억제제의 명칭을 나타내고, 종좌표 hCD45-BM(％)은 마우스 골수에서 검출된 인간 CD45+ 세포의 비율을 나타낸다. BM은 골수(Bone Marrow)를 나타내고, hCD45는 인간 CD45+ 세포를 나타낸다. 도 21c의 횡좌표는 억제제의 명칭을 나타내고, 종좌표 hCD45-SP(％)는 마우스 비장에서 검출된 인간 CD45+ 세포의 비율을 나타낸다. SP는 비장(Spleen)을 나타내고, hCD45는 인간 CD45+ 세포를 나타낸다.
도 22는 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 저분자 Mock(DMSO), SR1(5 μM), Dasatinib(50 nM)로 7일 동안 처리한 후, 모든 세포를 수집하여 마우스 체내에 이식하고, 이식 16주 후에 유세포 분석으로 마우스 말초 혈액, 골수, 비장의 인간 hCD3+, hCD33+, hCD56+, hCD19+ 세포의 비율을 검출한 것을 보여주며, 각각 인간 T 림프구(T), 골수성 세포(My), 자연 살해 세포(NK), B 림프구(B)를 나타낸다. 여기서, 횡좌표는 억제제의 명칭을 나타내고, 도 22a의 종좌표는 말초 혈액 중 hCD45+ 세포에서 상이한 계통의 세포의 비율을 나타낸다. 도 22b의 종좌표는 골수 중 hCD45+ 세포에서 상이한 계통의 세포의 비율을 나타낸다. 도 22c의 종좌표는 비장 중 hCD45+ 세포에서 상이한 계통의 세포의 비율을 나타낸다.
실시예
실시예 1: 후속 저분자 스크리닝을 위한 제대혈 분리 CD34+HSCs
시약 H-lyse Buffer(1×) 용액 및 Wash Buffer(1×) 용액을 준비하였다. 5 ml의 H-lyse Buffer 10× 저장액(R&D, 제품 번호: WL1000)을 취하고, 45 ml의 탈이온수(Edigene, 0.22 μM 여과막 여과)를 첨가한 다음, 골고루 혼합하여 H-lyse Buffer(1×) 용액으로 조제하였다. 5 ml의 Wash Buffer 10× 저장액(R&D, 제품 번호: WL1000)을 취하고, 45 ml의 탈이온수를 첨가한 다음, 골고루 혼합하여 Wash Buffer(1×) 용액으로 조제하였다.
10 ml의 제대혈(Edigene)에 생리식염수를 첨가하여 최종 부피가 30 ml가 되도록 하였다. 희석된 혈액에 인간 림프구 분리액(Dakewe, 제품 번호: DKW-KLSH-0100)을 첨가한 다음, 400 g에서 30 min 동안 원심분리(설정 가속 3, 감속 0)하고, 버피코트를 흡인하며, 500 g에서 10 min 동안 원심분리하였다. 세포 침전물을 하나의 50 ml의 원심분리관에 모으고, 10 ml의 H-lyse Buffer(1×)를 첨가한 다음, 상온에서 10 min 동안 적혈구를 용해하였다. 그런 다음 10 ml의 Wash Buffer(1×)를 첨가하여 용해 반응을 중지시키고, 생리식염수를 첨가하여 최종 부피가 50 ml가 되도록 하였다. 상기 50 ml의 원심분리관을 고속 원심분리기에 옮기고, 500 g에서 10 min 동안 원심분리하며, 상층액을 버리고, 50 ml의 생리식염수(1％ HSA)로 세포를 재현탁하고 골고루 혼합한 다음, 20 μL의 세포 현탁액을 취하여 세포 계수기(Nexcelom, 모델: Cellometer K2)에서 계수하며, 상기 원심분리관을 고속 원심분리기에 옮기고, 500 g에서 10 min 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 계수 결과에 따라 상응한 부피의 자기 비드(100 ul FcR/1*10^8cell 및100 ul CD34 MicroBeads/1*10^8cell)를 첨가하며, 그 작업은 다음과 같다. 우선 FcR Blocking Reagent(Miltenyi Biotec, 제품 번호: 130-100-453, 시약의 사용량은 세포 계수 결과에 따라 결정됨)를 첨가하여 세포를 재현탁한 다음, 사전 혼합된 CD34 MicroBeads(CD34MicroBead Kit UltraPure, human: MiltenyiBiotec, 제품 번호: 130-100-453)를 첨가하고 골고루 혼합하며, 4℃의 냉장고에서 30 min 동안 배양하였다. 원심분리관에 생리식염수(1％ HSA)를 첨가하여 최종 부피가 50 ml가 되도록 한 다음, 고속 원심분리기에 옮기고, 500 g에서 10 min 동안 원심분리하였다. 자기 분리기(MiltenyiBiotec, 모델: 130-042-102) 및 하나의 자기 스탠드(MiltenyiBiotec, 모델: 130-042-303)를 준비하고, 자기 분리기를 적당한 높이로 조정하며, MS Column(MiltenyiBiotec, 제품 번호: 130-042-201) 또는 LS Column(MiltenyiBiotec, 제품 번호: 130-042-401)(세포량에 따라 컬럼의 유형을 결정하고, 구체적으로 제품 관련 사용설명서를 참조 바람)에 넣고, 아래에 15 ml의 원심분리관(Corning, 제품 번호: 430791)을 놓아 비타겟 세포 현탁액을 수집하며, 1 ml(MS 컬럼) 또는 3 ml(LS 컬럼)의 생리식염수(1％ HSA)로 MS Column 또는 LS Column을 세척하였다. 상기 고속 원심분리기(Thermo, 모델: ST40)의 원심분리관에서 원심분리한 후, 상층액을 버리고, 1 ml(MS 컬럼) 또는 3 ml(LS 컬럼)의 생리식염수(1％ HSA)로 세포를 재현탁하며, 각 분리 컬럼(분리 컬럼의 사용량은 제대혈의 분량 및 세포량에 따라 결정됨)에 세포 현탁액을 첨가하였다. 1 ml(MS 컬럼) 또는 3 ml(LS 컬럼)의 생리식염수(1％ HSA)로 원심분리관을 세척하고, 세척액을 컬럼에 첨가하였다.
1 ml(MS 컬럼) 또는 3 ml(LS 컬럼)의 생리식염수(1％ HSA)로 MS Column 또는 LS Column을 세척하였다. 3회 반복하였다. 분리 컬럼을 새로운 15 ml의 원심분리관의 위로 옮기고, 2 ml(MS 컬럼) 또는 3 ml(LS 컬럼)의 생리식염수(1％ HSA)를 첨가하여 타겟 세포를 용출시킨 다음, 1 ml(MS 컬럼) 또는 2 ml(LS 컬럼)의 생리식염수(1％ HSA)를 첨가하여 타겟 세포의 용출을 1회 반복하였다. 20 μL의 세포 현탁액을 취하여 세포 계수기(Nexcelom, 모델: Cellometer K2)에서 계수하고, 나머지 세포 현탁액을 400 g에서 5 min 동안 원심분리하였다. 상층액을 완전히 버리지 않고 1 ml의 상층액을 남겨 세포를 재현탁하였다. 하나의 새로운 MS Column을 취하고, 1 ml의 생리식염수(1％ HSA)를 첨가하여 세척하며, 상기 재현탁된 세포의 세포 현탁액을 상기 MS Column으로 옮기고, 상기 세척 및 용출 단계를 반복하여, 3 ml의 타겟 세포 현탁액을 얻었다. 20 μL의 세포 현탁액을 취하여 세포 계수기(Nexcelom, 모델: Cellometer K2)에서 계수하고, 세포 밀도 및 세포 현탁액 부피에 따라 총 세포 수를 계산하고, 나머지 세포 현탁액을 400 g에서 5 min 동안 원심분리하며, 상층액을 버리고 비축하였다.
실시예 2: 저분자 억제제 농도 테스트 및 스크리닝
저분자 억제제의 사용설명서에 표시된 용해도 및 필요한 용매(저분자 억제제제품 번호는 표 1을 참조 바람)에 따라, 저분자 억제제 저장액의 제조를 수행하였다. 이어서 하기와 같은 기본 배지를 조제하였다. SFEMII 배지(stem cell, 제품 번호: 09655)+50 ng/ml의 성장 인자 Flt-3L(PeProtech, 제품 번호: 300-100UG)+50 ng/ml의 성장 인자 SCF(PeProtech, 제품 번호: 300-07-100UG)+50 ng/ml의 성장 인자 TPO(PeProtech, 제품 번호: 300-18-100UG)+10 ng/ml의 성장 인자 IL-6(PeProtech, 제품 번호: 200-06-20UG)+1％ 이중 항체(HyClone, 제품 번호: sv30010). 설정된 저분자 억제제 농도 구배에 따라 저장액 및 기본 배지를 이용하여 상이한 농도의 저분자 억제제를 포함하는 배지를 조제하였다.
우선, 준비된 배지를 24웰 플레이트(Corning, 제품 번호: 3473)에 웰당 950 μl씩 첨가하고, 이산화탄소 인큐베이터(Thermo, 모델: 3111)에 넣어 예열하며; 실시예 1에서 비축한 HSCs를 SFEMII+50 ng/ml의 Flt-3L+50 ng/ml의 SCF+50 ng/ml의 TPO+10 ng/ml의 IL-6+1％ 이중 항체로 재현탁하고, 웰당 50μl의 세포 현탁액에 따라, 웰당 세포 밀도를 2*10^5/ml로 하여 첨가된 배지 부피를 계산하였다. 예를 들어, 웰당 세포 배양액의 최종 부피는 1 ml이고, 웰당 세포 밀도에 따라 웰당 총 세포 수는 2*10^5개의 세포이며, 각 웰에 첨가된 50 μl의 세포 현탁액 밀도는 4*10^6/ml이고, 실시예 1에서 비축한 HSCs 밀도를 계산된 세포 현탁액 밀도로 조정하여 첨가하며; 인큐베이터에서 예열된 배지를 꺼내고, 각 웰에 50 μl의 세포 현탁액을 첨가하여 골고루 혼합하며, 현미경(OLYMPUS, 모델: CKX53)으로 세포 상태를 관찰한 다음, 인큐베이터에 넣고 배양하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 3: 유세포 분석에 의한 HSCs 줄기성 및 CD34+ 유지
본 실시예에서 사용된 항체 및 이의 유래는 표 2와 같다.
Figure pct00003
상기 실시예 2에서 6 ~ 7일(D6 ~ D7) 동안 배양한 세포 20μl를 샘플링하여 계수하고, 계수 결과에 따라 2*10^5개의 세포의 현탁액을 취하여 1.5 ml의 원심분리관에 넣으며; 400 g에서 5 min 동안 원심분리하고 상층액을 버렸다. 1％ HSA(인간 혈청 알부민, 광동 솽린, 제품 번호: S10970069) 함유 PBS(인산 완충 생리식염수, HyClone, 제품 번호: SH30256.01) 100 ul를 취하고 세포를 재현탁하며, 볼텍스로 골고루 혼합하여 비축하였다. 그런 다음 대조군 세포 샘플을 수집하였다. 세포 개수 및 수집 방법은 테스트할 샘플의 세포 조작과 동일하다. 대조군은 각각 NC군 및 ISO군으로 설정하고, 세포는 본 배치의 실험에서 테스트할 샘플 중 어느 하나의 샘플 또는 혼합 세포를 선택하고, 세포 개수에 따라 결정하였다. 동일한 배치의 실험에서 각 대조군은 반복 검출하지 않는다. 그룹 설정은 표 3과 같다.
Figure pct00004
상기 표 3에 따라, 상기 검출할 세포 샘플 및 대조군 세포 샘플의 세포 현탁액에 그룹별로 항체를 대응되게 첨가하였다. 볼텍스로 골고루 혼합하고, 실온에서 빛을 피하여 15 min 동안 배양하였다. 15 min 배양 후, 각 실험 샘플에 1ml의 1％ HSA 함유 PBS를 첨가하고 골고루 혼합한 다음, 실온에서 400 g에서 5 min 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 버리고, 각 실험 샘플은 100 μl의 1％ HSA 함유 PBS로 세포를 재현탁하였다. 테스트하기 전에 샘플을 실온에서 빛을 피하여 보관하였다. 유세포 분석기로 검출하였다.
검출 결과는 하기 방법에 따라 분석된다. 1) 표적 세포 집단은 CD34+CD45+CD45RA-CD90+CD38-세포 집단이고; 2) 논리 게이트 및 게이트 위치의 결정은 도 1에 도시된 바와 같은 바, 먼저 세포 집단을 P1 게이트로 확정하고; P1 게이트에서 유래된 세포 집단은 부착 세포가 제거되어 P2 게이트로 되며; P2 게이트에서 유래된 세포 집단은 NC 또는 ISO로 CD34, CD45, CD45RA 음성 세포 집단을 Q3-LL 게이트(CD34-/CD45-), Q5-UL+Q5-LL 게이트(CD45RA-)로 확정하고; FMO90은 CD90 음성 세포 집단을 Q5-LL+Q5-LR 게이트로 확정하며; FMO38은 CD38 음성 세포 집단을 Q6-LR 게이트로 확정하고; NC, ISO, FMO로 정한 게이트를 사용하여, Q3-UR―Q5-UL―Q6-LR 게이트로 확정된 세포가 CD34+CD45+CD45RA-CD90+CD38-표적 세포로 결정되었다.
실시예 4: 단일 분자 스크리닝
실시예 1에서 분리된 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 실시예 2와 동일한 방법으로 저분자 억제제의 최적 농도 및 HSCs 줄기성 유지 능력에 대한 스크리닝을 수행하고, 저분자로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 실시예 3과 동일한 방법으로 유세포 분석기를 통해 장기 조혈 줄기 세포(long-term hematopoietic stem cells, LT-HSCs) 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현을 검출하였다.
본 실시예에서는 총 5회의 스크리닝을 수행하였고, 각 스크리닝의 억제제 및 테스트 농도는 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8과 같으며, 이의 결과는 각각 도 2 ~ 도 6에 도시된 바와 같다.
도 2의 결과에 따르면, LT-HSCs의 비율 증가 측면에서, SAHA는 표 4의 다른 억제제보다 현저히 우수하고, 이의 효과는 다른 억제제의 2 ~ 20배이다. SAHA가 5 μM인 경우, 현미경으로 관찰된 세포 상태는 좋지 않고, 세포 계수를 통해 비교하면 증식이 좋지 않으므로, 1 μM의 농도를 선택하여 후속 스크리닝을 수행하였다. CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서, SAHA(1 μM)는 대조군(Mock, 0.01％DMSO)보다 약간 더 우수하다.
도 3의 결과에 따르면, 표 5의 공지된 문헌(Fares I,et al.Science.2014; Evans T.Cell Stem Cell.2009; Boitano A E, et al.Science.2010; Guo B, et al.Nature Medicine.2018; Guo B, et al.Nature Medicine.2017)에서 보고된 저분자 억제제 UM171, PGE2, SR1, GW9662, FLU와 비교하면, HSCs 줄기성 유지 측면에서 SAHA의 효과는 보고된 저분자의 10 ~ 20배이고, CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서 SAHA는 SR1과 현저한 차이가 없지만, UM171, PGE2, GW9662, FLU보다 현저히 우수하다.
도 4의 결과에 따르면, HSCs 줄기성 유지 측면에서 SAHA는 표 6의 다른 억제제보다 약 2 ~ 15배 높다. 동시에, SAHACD34+ 세포의 비율 유지 측면에서 다른 억제제보다 우수하다.
도 5의 결과에 따르면, HSCs 줄기성 유지 측면에서, SAHA는 다른 억제제의 1 ~ 12배로 표 7의 다른 억제제보다 현저히 우수하고, 그 다음 Enzastaurin이 저농도로 사용되는 경우, LT-HSCs 비율은 다른 억제제(SAHA 제외)의 3 ~ 10배이다. CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서, JNK-IN-8은 CD34+ 비율을 약 90％로 유지할 수 있다. JNK-IN-8 외에, SAHA 및 Dasatinib은 다른 억제제보다 약간 더 우수하다.
도 6의 결과에 따르면, LT-HSCs 줄기성 유지 측면에서, 표 8의 Valproic acid(VPA)는 다른 저분자보다 약 30배로 현저히 높고, SAHA보다 약 1배 높다. SAHA는 다른 저분자(VPA 제외)의 15배이다. CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서, SAHA 및 VPA는 다른 저분자보다 우수하다.
상술한 바를 종합하면, 본 실시예에서 LT-HSCs 줄기성 및 CD34+ 세포의 높은 비율을 유지할 수 있는 저분자를 총 5개 스크리닝하였고, 각각 HDAC를 표적으로 하는 VPA, SAHA, Src를 표적으로 하는 Dasatinib, PKC를 표적으로 하는 Enzastaurin 및 JNK를 표적으로 하는 JNK-IN-8이다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
실시예 5: 이분자 조합 스크리닝
실시예 1에서 분리된 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 실시예 2와 동일한 방법으로 HSCs 줄기성을 유지하는 저분자 억제제의 최적 이분자 조합에 대한 스크리닝을 수행하고, 저분자 조합으로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 실시예 3과 동일한 방법으로 유세포 분석기를 통해 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현을 검출하였다.
상기 실시예 4에서 스크리닝된 HSCs 줄기성을 현저히 유지할 수 있는 저분자 SAHA를 다른 억제제와 조합하고, 구체적인 조합 및 이의 사용 농도는 관련 도면을 참조 바라며, 이의 결과는 각각 도 7 ~ 도 11에 도시된 바와 같다.
도 7의 결과에 따르면, HSCs 줄기성 유지 및 CD34+ 세포의 비율 측면에서, SAHA와 표 4의 네 가지 조혈 줄기 세포 증식과 관련된 세포 신호 전달 경로에서 작용하는 억제제의 조합 SAHA+SR1, SAHA+VE821, SAHA+PFI-3, SAHA+S-4-A를 비교하면 SAHA 단독 사용보다 현저히 우수하지 않다.
도 8의 결과에 따르면, HSCs 줄기성 유지 측면에서, 전술한 문헌에서 보고된 억제제, 즉 표 5의 억제제 SR1, UM171, PGE2, GW9662, FLU의 단독 사용 효과는 SAHA보다 훨씬 낮고, SAHA와의 조합 효과도 SAHA 단독 사용 효과보다 낮다. CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서, SAHA 단독 사용과 이러한 억제제와 SAHA의 조합 사용도 현저한 차이가 없다.
도 9의 결과에 따르면, HSCs 줄기성 유지 측면에서, SAHA와 표 6의 Butyrate의 조합에서, 저농도 Butyrate의 사용 효과는 SAHA의 단독 사용 효과보다 좋지 않고, 고농도 Butyrate의 사용 효과는 SAHA의 단독 사용 효과보다 우수하지만, 고농도 조건에서 Butyrate는 세포 독성이 크며, 실시예 4에서 얻은 결과에 따르면 Butyrate의 단독 사용 효과는 SAHA의 단독 사용 효과보다 좋지 않고, SAHA와 동일한 표적 억제제이기 때문에, 후속적으로 Butyrate에 대해 더 연구하지 않았다. SAHA는 각각 표 6의 EPZ004777 및 DZNeP와 조합되고, SAHA+EPZ004777 및 SAHA+DZNeP 조합은 SAHA의 단독 사용보다 우수하다. CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서, 이러한 이분자 조합과 SAHA 단독 사용은 현저한 차이가 없다. 따라서, HSCs 줄기성 및 CD34+ 세포의 비율을 잘 유지할 수 있는 SAHA+EPZ004777 및 SAHA+DZNeP 조합을 스크리닝하였다.
도 10의 결과에 따르면, HSCs 줄기성 유지 측면에서, SAHA는 각각 표 7의 네 가지 저분자 억제제와 조합되고, SAHA+Dasatinib 조합 및 SAHA+JNK-IN-8 조합의 효과는 SAHA 단독 사용 효과의 3배이며, Mock군의 30배이다. CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서, SAHA+Dasatinib 조합 및 SAHA+JNK-IN-8 조합과 SAHA 단독 사용은 현저한 차이가 없고, Mock군보다 5％ ~ 10％ 높다. 단일 분자 스크리닝에서 LT-HSCs 줄기성을 잘 유지할 수 있는 저분자 Enzastaurin과 SAHA의 조합은 그 효과가 SAHA 단독 사용 효과보다 훨씬 낮고, 후속적으로 Enzastaurin과 SAHA의 조합에 대해 더 연구하지 않았다. 따라서, HSCs 줄기성 유지 측면과 CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서 효과가 우수한 SAHA+Dasatinib 및 SAHA+JNK-IN-8 조합을 스크리닝하였다.
도 11의 결과에 따르면, 줄기성 유지 측면에서 SAHA는 표 8의 VPA와 조합되고, SAHA+VPA 조합의 효과는 SAHA 단독 사용 효과보다 약 2 ~ 4배 높으며, Mock군보다 20배 높다. CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서, SAHA+VPA 조합과 SAHA 단독 사용은 현저한 차이가 없고, Mock군보다 10％ ~ 20％ 높다.
상술한 바를 종합하면, 이분자 스크리닝에서 LT-HSCs 줄기성 및 CD34+ 세포의 비율을 유지할 수 있는 조합 SAHA+Dasatinib, SAHA+DZNeP, SAHA+EPZ004777, SAHA+JNK-IN-8, SAHA+VPA를 스크리닝하였다.
실시예 6: 삼분자 조합 스크리닝
실시예 1에서 분리된 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 실시예 2와 동일한 방법으로 HSCs 줄기성을 유지하는 저분자 억제제의 최적 삼분자 조합에 대한 스크리닝을 수행하고, 저분자로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 실시예 3과 동일한 방법으로 유세포 분석기를 통해 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현을 검출하였다.
(1) 실시예 5에서 스크리닝된 HSCs 줄기성을 유지할 수 있는 조합 SAHA+EPZ004777, SAHA+DZNeP에 대해 삼분자 조합을 수행하고, 이의 결과는 도 12에 도시된 바와 같다.
도 12의 결과에 따르면, HSCs 줄기성 유지 측면에서, SAHA+EPZ004777+DZNeP 삼분자 조합은 Mock군보다 약 20배 높고, SAHA 단독 사용 및 SAHA+EPZ004777 이분자 조합보다 약 2배 높으며, SAHA+DZNeP 이분자 조합보다 약간 높다. CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서, 삼분자 조합 및 이분자 조합과 Mock군은 현저한 차이가 없고, CD34+ 세포의 비율은 모두 약 80%이다.
(2) 실시예 5에서 스크리닝된 HSCs 줄기성을 유지할 수 있는 조합 SAHA+EPZ004777, SAHA+DZNeP, SAHA+JNK-IN-8, SAHA+Dasatinib에 대해 삼분자 조합을 수행하고, 이의 결과는 각각 도 13 및 도 14에 도시된 바와 같다.
도 13의 결과에 따르면, HSCs 줄기성 유지 측면에서, SAHA+JNK-IN8 조합의 효과는 SAHA+Dasatinib보다 좋지 않고, 후속적으로 SAHA+JNK-IN8에 대해 더 연구하지 않았다. SAHA+Dasatinib+EPZ004777과 SAHA+Dasatinib을 비교하면 현저한 차이가 없고, LT-HSCs 줄기성 유지 측면에서 다른 삼분자 조합의 효과는 SAHA+Dasatinib보다 좋지 않다. CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서, SAHA+Dasatinib은 CD34+ 세포의 비율을 약 80％로 유지한다.
도 14의 결과에 따르면, 실시예 5에서 스크리닝된 HSCs 줄기성을 유지할 수 있는 이분자 조합 SAHA+Dasatinib, SAHA+VPA에 대해 재조합하였다. HSCs 줄기성 유지 측면에서, SAHA+VPA+Dasatinib 삼분자 조합의 효과는 Mock군의 50배이고, 이분자 조합의 1.5 ~ 2배이다. CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서, SAHA+VPA+Dasatinib 삼분자 조합은 Mock군보다 20% 높다.
상술한 바를 종합하면, LT-HSCs 줄기성 유지 측면에서 대부분의 삼분자 조합은 그 효과가 이분자 조합 SAHA+Dasatinib보다 좋지 않고, 삼분자 조합에서 효과가 비교적 좋은 조합은 SAHA+EPZ004777+DZNeP, SAHA+Dasa+VPA이다.
실시예 7: 스크리닝된 억제제 SAHA, VPA, Dasatinib과 문헌에서 보고된 억제제 UM171, SR1의 단독 사용 및 조합 사용의 비교
실시예 1에서 분리된 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 실시예 2와 동일한 방법으로 스크리닝된 억제제 SAHA, VPA, Dasatinib와 문헌(Fares I,et al.Science.2014; Boitano A E, et al.Science.2010)에서 보고된 억제제 UM171, SR1의 단독 사용 및 조합 사용을 비교하였다. 저분자 억제제로 6 ~ 7일 동안 유도한 후, 실시예 3과 동일한 방법으로 유세포 분석기를 통해 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현을 검출하고, 이의 결과는 도 15에 도시된 바와 같다.
도 15의 결과에 따르면, HSCs 줄기성 유지 측면에서, 저분자가 단독으로 사용되는 경우, SAHA, VPA는 SR1, UM171보다 2 ~ 5배 높다. 이분자 조합에서, SAHA+Dasatinib 및 VPA+Dasatinib은 SAHA+SR1, SAHA+UM171보다 1.5 ~ 2배 높다. 삼분자 조합 SAHA+DZNeP+EPZ004777은 SAHA+Dasatinib 및 VPA+Dasatinib보다 약간 더 낮다. CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서, 단일 분자 SAHA, VPA와 이분자 조합 SAHA+Dasatinib, VPA+Dasatinib 사이는 현저한 차이가 없고, CD34+ 세포의 비율은 모두 약 80％이다.
상술한 바를 종합하면, LT-HSCs 줄기성 유지 측면 및 CD34+ 세포의 비율 측면에서, 이분자 조합 SAHA+Dasatinib 및 VPA+Dasatinib의 효과는 저분자의 단독 사용, 이분자 조합 SAHA+SR1 및 SAHA+UM171, 삼분자 조합 SAHA+DZNeP+EPZ004777보다 우수하다.
실시예 8: CD34+ 조혈 줄기 세포 콜로니 형성 배양
본 실시예는 콜로니 형성 단위(Colony-Forming Unit, CFU)를 통해 저분자 억제제 유도 후 제대혈 유래 조혈 줄기 세포의 시험관 내 기능을 검출하여 정성적 및 정량적 검출을 수행함으로써, 시험관 내 분화 잠재력을 검증하였다.
우선, 100 mL의 배지 MethoCultTM H4034 Optimum(stem cell,제품 번호: 04034)를 서브패키징한 다음, 2 ~ 8℃에서 밤새 해동하였다. 1 ~ 2 min 동안 세게 흔든 다음 기포가 액체 표면에 떠오를 때까지 10 min 동안 정치하였다. 50 mL의 주사기 바늘을 5 mL의 일회용 주사기에 단단히 끼운 후, 1 mL의 배지를 흡인하고, 주사기를 완전히 밀어 주사기 내 가스를 완전히 배출한 다음, 3 mL를 다시 흡인하여 각 15 mL의 원심분리관(Corning, 제품 번호: 430791)에 서브패키징하였다. 2 ~ 8℃에서 1개월 보관하고, -20℃에서 장기간 보관하며, 반복적으로 동결 및 해동을 하지 않는다.
3 mL의 배지 MethoCultTM H4034 Optimum을 준비한 다음, 실온(15 ~ 25℃) 또는 2 ~ 8℃에서 밤새 해동하였다.
세포를 접종하였다. 저분자 억제제로 유도한 후 7일 동안 증폭 배양한 세포(제대혈 유래 저분자 억제제로 유도한 후의 CD34+조혈 줄기 세포)를 취하여 세포를 계수하고, 계수 결과에 따라 100배의 접종 밀도의 세포 현탁액(예를 들어, 접종 밀도 100 cells/웰/3 ml, 10000 cells를 수집해야 함)을 흡인하여 1 ml의 2％ FBS(Gibco, 제품 번호: 16000-044)-IMDM(Gibco, 제품 번호: 12440-053) 배지에 첨가한 다음, 골고루 혼합하여 비축하였다. 상기 세포를 골고루 혼합한 후 50 μl의 세포 현탁액을 흡인하여 0.5 mL의 IMDM(2％FBS)에 첨가하고 세포를 재현탁(10배로 희석된 세포 현탁액에 해당됨)하며, 골고루 혼합한 후 100 μl의 세포 현탁액(100개의 세포)을 취하여 3 mL의 MethoCultTM H4034 Optimum에 첨가하였다. 볼텍스로 적어도 4 s동안 혼합한 후 기포가 액체 표면에 떠오를 때까지 10 min 동안 정치하였다. 3 cc Syringes(Stem cell,제품 번호: 28240)와 Blunt-End Needles 16 Gauge(Stemcell, 제품 번호: 28110)를 함께 사용하며, 얻은 세포 현탁액을 1 mL 흡인하고, 주사기를 완전히 밀어 주사기 내 가스를 완전히 배출한 다음, 얻은 전체 세포 현탁액을 흡인하며, SmsrtDishTM-6(stem cell, 제품 번호: 27370, 6웰 플레이트)의 하나의 웰에 3 mL를 주입하고, 6웰 플레이트를 천천히 기울여 세포 현탁액이 웰의 바닥을 고르게 덮도록 하였다. 모든 세포를 상기와 같이 접종한 후, 배지가 건조되는 것을 방지하기 위해 6웰 플레이트의 각 웰 간극에 3 ml의 멸균 PBS를 첨가하였다. 6웰 플레이트를 덮개로 덮은 다음 이산화탄소 인큐베이터(Thermo, 모델: 3111)에 넣고, 37℃, 5％ CO2, 95％의 상대 습도에서 14일 동안 배양하였다.
배양 7일째, 14일째에 콜로니를 관찰하고, 배양 14일 후 STEMgridTM-6 계수 그리드(stem cell, 제품 번호: 27000)로 콜로니를 계수하였다. 콜로니의 결정 기준은 하기와 같다(상이한 유형의 콜로니는 HSCs의 콜로니 형성 능력 및 줄기성 유지 능력을 반영할 수 있음).
CFU-GEMM(CFU-G, CFU-E, CFU-MM): 과립구-적혈구-대식 세포-거핵구 콜로니 형성 단위. 하나의 콜로니는 적혈구 및 20개 이상의 비적혈구(과립구, 대식 세포 및/또는 거핵구)를 포함하고, 통상적으로 콜로니의 중앙에 적혈구가 있고, 주변에 비적혈구가 있으며, 비적혈구는 또한 적혈구의 일측에 집중될 수 있다. CFU-GEMM의 콜로니는 통상적으로 CFU-GM 또는 BFU-E의 콜로니보다 크다. 대부분의 세포 샘플에서 보기 드물다(통상적으로 총 콜로니 수의 10%).
CFU-GM: 20개 이상의 과립구(CFU-G) 및/또는 대식 세포(CFU-M)를 포함하는 콜로니. 적색 또는 갈색으로 나타나지 않고, 콜로니 내 개체 세포는 특히 콜로니 가장자리에서 통상적으로 구별 가능하며, 큰 콜로니는 하나 이상의 밀집된 어두운 핵을 가질 수 있다. 상기 콜로니 성장 및 분화는 에리스로포이에틴(EPO)을 필요로 하지 않는다.
BFU-E: 적아구군형성단위, 다수의 세포 클러스터로 구성된 콜로니를 형성하고, 각 콜로니는 >200개의 성숙한 적혈구를 포함한다. 세포가 헤모글로빈화되면 적색 또는 갈색을 나타내므로, 각 클러스터 내의 단일 세포를 구별하기 어렵고, BFU-E는 미성숙 전구 세포로, 이의 성장은 콜로니의 최적의 성장을 촉진하기 위한 에리스로포이에틴(EPO) 및 다른 사이토카인, 특히 인터루킨 3(IL-3) 및 줄기 세포 인자(SCF)를 필요로 한다.
CFU-E: 적혈구 콜로니 형성 단위, 8 ~ 200개의 적혈구를 포함하는 1 ~ 2개의 세포 클러스터를 형성할 수 있고, 세포가 헤모글로빈화되면 적색 또는 갈색을 나타내므로, 콜로니 내에서 단일 세포를 구별하기 어렵다. CFU-E는 성숙한 적혈구의 전구 세포로, 이의 분화를 촉진하도록 에리스로포이에틴(EPO)을 필요로 한다.
실시예 9: 스크리닝된 억제제 SAHA, VPA, Dasatinib 및 문헌에서 보고된 억제제 UM171, SR1의 단독 사용 및 조합 사용의 시험관 내 클론 형성 능력의 비교
실시예 1에서 분리된 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 스크리닝된 억제제 SAHA, VPA, Dasatinib와 문헌에서 보고된 억제제 UM171, SR1의 단독 사용 및 조합 사용의 시험관 내 클론 형성 능력을 비교하였다. 저분자 억제제로 세포를 처리하고, 7일 후 실시예 8과 동일한 방법으로 시험관 내 클론(CFU) 형성을 검출하며, 세포 접종 14일 후 클론 개수를 집계하고, CFU-GEMM을 분석하며, 이의 결과는 도 16에 도시된 바와 같고, 여기서 BFU-E, CFU-E, CFU-GM, CFU-GEMM은 적혈구계, 골수계, 림프계와 같은 혈액 시스템의 상이한 계통의 클론을 나타낸다.
도 16의 결과에 따르면, 총 클론 수 측면에서 VPA+Dasatinib 조합의 효과는 다른 조합보다 현저히 우수하다. LT-HSCs의 분화에 의해 형성된 GEMM 클론 수 측면에서, VPA+Dasatinib 조합은 공지된 문헌(Fares I,et al.Science.2014; Boitano A E, et al.Science.2010; )에서 보고된 저분자 억제제의 단독 사용 및 SAHA와의 조합 사용(SR1, UM171, SAHA+SR1, SAHA+UM171보다 우수함)보다 현저히 우수하다. VPA+Dasatinib과 SAHA+Dasatinib을 비교하면, 전자의 효과가 더 우수하다. 총 클론 수 및 GEMM 클론 수 측면에서 SAHA+DZNeP+EPZ004777은 VPA+Dasatinib 및 SAHA+Dasatinib보다 훨씬 낮다.
상술한 바를 종합하면, 시험관 내 클론 형성 능력 측면에서, VPA+Dasatinib 및 SAHA+Dasatinib 조합은 공지된 문헌에서 보고된 저분자 SR1, UM171의 단독 사용 및 SAHA와의 조합 사용보다 우수하다.
실시예 10: Src 경로 억제제의 효과 검증
실시예 1에서 분리된 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 실시예 2와 동일한 방법으로 Src 표적의 다른 저분자 억제제에 대한 스크리닝을 수행하고, 저분자 조합으로 6 ~ 7일 동안 유도한 후 실시예 3과 동일한 방법으로 유세포 분석기를 통해 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현을 검출하며, 이의 결과는 도 17에 도시된 바와 같고, 여기서 본 스크리닝의 저분자 억제제 및 농도는 표 9와 같다.
Figure pct00010
도 17의 결과에 따르면, LT-HSCs 줄기성 유지 측면에서 Src 표적의 억제제 UM-164의 효과는 SAHA의 5배이고, Src 표적의 다른 억제제 KX1-004의 효과는 SAHA와 현저한 차이가 없다. CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서, UM164와 SAHA는 현저한 차이가 없고, CD34+ 비율은 약 80%로 유지된다. 상기 결과는 새로운 표적으로서의 Src가 HSCs 줄기성 유지 측면에서 매우 중요한 작용을 일으킴을 나타낸다. HDAC 표적의 억제제와 조합하면, HSCs 줄기성 유지 및 HSCs 증식 촉진 측면에서 Src 표적 억제제의 작용은 더 향상된다.
실시예 11: 조혈 줄기 세포의 시험관 내 증폭 및 줄기성 유지 능력에 대한 스크리닝된 억제제 Dasatinib과 문헌에서 보고된 억제제 UM171, SR1의 비교
실시예 1에서 분리된 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 스크리닝된 억제제 Dasatinib과 문헌에서 보고된 억제제 UM171, SR1의 시험관 내 증폭 및 줄기성 유지 능력을 비교하였다. 저분자 억제제로 6 ~ 8일 동안 유도한 후, 실시예 3과 동일한 방법으로 유세포 분석기를 통해 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현을 검출하고, 배양 2일째, 4일째, 6일째, 8일째에 각각 20 μL의 세포 현탁액을 취하여 세포 계수기(Nexcelom, 모델: Cellometer K2)에서 계수하며, 8일째에 CD34+ 세포 및 LT 세포의 최종 절대 수(세포 절대 수=세포의 비율×총 세포 수)를 계산하고, 이의 결과는 도 18에 도시된 바와 같다.
도 18의 결과에 따르면, 줄기성 유지 측면에서 Dasatinib은 SR1 및 UM171보다 현저히 우수하며, 그 효과는 SR1의 약 1.2배이고, UM171의 약 2.8배이다. LT 세포 절대 수의 Dasatinib군은 SR1보다 현저히 좋지 않고, UM171군과 유사하다. CD34+ 세포의 비율 유지 측면에서, 세포 처리 8일 후 Dasatinib의 CD34+ 세포의 비율은 약 40%를 유지하고, SR1은 약 65%를 유지하며, UM171은 약 40%로 유지하고, Dasatinib군의 CD34+ 세포의 절대 수는 SR1 및 UM171보다 현저히 좋지 않다.
실시예 12: 조혈 줄기세포의 체내 이식 효과에 대한 스크리닝된 억제제 Dasatinib과 문헌에서 보고된 억제제 SR1의 검증
실시예 1에서 분리된 제대혈 유래 CD34+ 세포에서 스크리닝된 저분자 억제제 Dasatinib 및 문헌에서 보고된 억제제 SR1의 단독 사용에 의한 체내 조혈 시스템 재건 능력을 비교하였다. 본 실시예에서 사용된 저분자 억제제의 농도 및 그룹은 표 10과 같다.
Figure pct00011
세포 배지의 조제: SFEMII 배지+50 ng/ml의 성장 인자 Flt-3L+50n g/ml의 성장 인자 SCF+50 ng/ml의 성장 인자 TPO+10 ng/ml의 성장 인자 IL-6+1％ 이중 항체, 사용된 배지, 성장 인자, 이중 항체 등의 제품 번호는 실시예 2에 기재된 바와 일치하고, 표 10에 설정된 그룹에 따라 상이한 저분자 억제제를 첨가하였다.
조제된 세포 배지를 24웰 플레이트에 웰당 950 μl씩 첨가하고, 이산화탄소 인큐베이터에 넣어 예열하며; 실시예 1에서 비축한 HSCs를 SFEMII+50 ng/ml의 Flt-3L+50 ng/ml의 SCF+50 ng/ml의 TPO+10 ng/ml의 IL-6+1％ 이중 항체로 재현탁하고, 웰당 50 ul의 세포 현탁액에 따라, 웰당 세포 밀도를 1*10^5/ml로 하여 첨가된 배지 부피를 계산하며; 인큐베이터에서 예열된 배지를 꺼내고, 각 웰에 50 μl의 세포 현탁액을 첨가하여 골고루 혼합하며, 현미경으로 세포 상태를 관찰한 다음, 인큐베이터에 넣고 배양하였다. 각 마우스에 이식된 초기 배양 세포량이 1*10^5/마리이면, 24웰 플레이트의 각 웰에서 증폭된 세포를 한마리의 마우스에 이식할 수 있다. 세포 배양 과정에서 격일로 계수하고, 기술방법 및 세포 계수기는 실시예 1과 일치하며, 세포 밀도가 8*10^5/ml를 초과하지 않도록 보장하고, 예를 들어 세포의 밀도가 과도한 경우 즉시 웰을 나누고 신선한 배지를 첨가한다.
저분자 억제제로 세포를 처리한 7일 후, 실시예 3과 동일한 방법으로 유세포 분석을 통해 LT-HSCs 세포 표면 마커(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)의 발현을 검출하였다.
그룹당 8마리의 마우스로 마우스를 준비하였다. 마우스는 Beijing Weitongda Biotechnology Co., Ltd.에서 구입하였고, 품종은 NPG(NOD-Prkdcscidll2rgnull/Vst), 6주령, 암컷 마우스이며, 마우스 간의 체중 차이는 3 g 이내로 조절하였다. 세포 이식 전에 마우스를 반치사량으로 조사하였고, 조사량은 1.6 Gy이다.
배양된 세포 현탁액(초기 배양 세포량은 1*10^5/ml임)을 수집하고, 400 g에서 5 min 동안 원심분리한 다음, 상층액을 버리며, 100 μl의 생리식염수(1％ HSA)로 재현탁하고, 조사된 한마리의 NPG 마우스에 꼬리 정맥 주사하며, 상이한 그룹의 마우스를 표기하였다.
마우스의 세포 이식 후, 4주차, 8주차, 12주차에 각각 마우스의 말초 혈액을 채취하고, 유세포 분석으로 human CD45 비율을 검출하며; 16주차에 마우스를 희생시키고, 마우스의 말초 혈액, 골수 세포 및 비장 세포를 수집한 다음, 유세포 분석으로 human CD45, human CD19, human CD3, human CD33 및 human CD56 비율을 검출하였다. 본 실시예에서 사용된 항체, 7-AAD 염로 및 유래는 표 11과 같다.
Figure pct00012
유세포 분석으로 마우스 말초 혈액의 human CD45 비율을 검출하고, 설정된 세포 검출 그룹은 표 12와 같다.
Figure pct00013
1X 적혈구 용해액의 준비: 5 ml의 RBC Lysis/Fixation Solution 10× 저장액(Biolegend, 제품 번호: 422401)을 취하고, 45 ml의 탈이온수(Edigene, 0.22 μM 여과막 여과)를 첨가하여 골고루 혼합하여, 1X 적혈구 용해액으로 조제하였다.
마우스 말초 혈액(약 100 μl)을 채취하고, 표 12에 설정된 그룹에 따라 항체를 첨가하였다. 볼텍스로 골고루 혼합한 다음 실온에서 빛을 피하여 15 min 동안 배양하였다. 배양 후, NC 및 각 샘플에 1.2 ml의 1X 적혈구 용해액을 첨가하고, 볼텍스로 골고루 혼합하며, 실온에서 빛을 피하여 15 min 동안 용해하고, 그 동안 3 min마다 샘플 원심분리관을 위아래로 뒤집었다. 용해 후, 실온에서 400 g에서 5 min 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 버리고 각 실험 샘플에 1 ml의 1％ HSA 함유 PBS를 첨가한 다음 골고루 혼합하며, 실온에서 400 g에서 5 min 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 버리고 각 실험 샘플에 100 μl의 1％ HSA 함유 PBS 및 5 μl의 7-AAD 염료를 첨가한 다음 볼텍스로 골고루 혼합하며, 실온에서 빛을 피하여 5 min 동안 배양하였다. 배양 후, NC 및 각 샘플에 1 ml의 1％ HSA 함유 PBS를 첨가한 다음 골고루 혼합하고, 실온에서 400 g에서 5 min 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 버리고 각 실험 샘플에 100 μl의 1％ HSA 함유 PBS를 첨가하여 세포를 재현탁하며, 검출하기 전에 샘플을 실온에서 빛을 피하여 보관하였다. 유세포 분석기로 검출하였다.
검출 결과는 하기 방법에 따라 분석된다. 1) 표적 세포 집단은 human CD45+ 세포 집단이고; 2) 논리 게이트 및 게이트 위치의 결정은 도 19에 도시된 바와 같은 바, 먼저 세포 집단을 P1 게이트로 확정하고; P1 게이트에서 유래된 세포 집단은 부착 세포가 제거되어 P2 게이트로 되며; P2 게이트에서 유래된 세포 집단은 7-AAD로 살아있는 세포 집단을 P3 게이트로 확정하고; P3 게이트에서 유래된 세포 집단은 NC로 mouse CD45- 및 human CD45-세포 집단(Q2-LL 게이트)을 확정하며; NC로 정한 게이트를 사용하여, Q2-UL 게이트로 확정된 세포가 human CD45+ 표적 세포로 결정되었다. 인간 조혈 줄기 세포 이식 효율은 human CD45 세포의 비율로 나타내고, 계산 방법은 human CD45％/(human CD45％+mouse CD45％)이다.
유세포 분석으로 마우스 말초 혈액, 골수 세포 및 비장 세포 human CD45, human CD19, human CD3, human CD33 및 human CD56 비율을 검출하고, 설정된 세포 검출 그룹은 표 13과 같다.
Figure pct00014
마우스 말초 혈액(약 100 μl)을 채취하고, 표 13에 설정된 그룹에 따라 항체를 첨가하였다. 후속 혈액 샘플 처리는 전술한 마우스 말초 혈액 human CD45 비율의 검출 조작과 일치하다. 조작 후 유세포 분석기로 검출하였다.
마우스를 경추 탈구로 희생시키고, 마우스 뒷다리의 경골과 대퇴골을 취하였다. 안과용 가위와 안과용 집게로 조작하는데, 각각 경골과 대퇴골의 양단을 잘라 골수강을 노출시켰다. 1 ml의 주사기로 미리 냉각된 1％ HSA 함유 PBS를 흡인하고, 바늘을 골수강의 일단에 삽입한 다음 PBS를 주입시키며, 골수 세포는 골수강의 타단에서 흘러나왔다. 경골 및 대퇴골 골수강을 각각 2 ml의 PBS로 세척하였다. 골수 세포 현탁액을 반복적으로 피펫팅하고, 40 um의 세포 메쉬망(BD, 제품 번호: 352340)으로 여과한 다음, 실온에서 400 g에서 5 min 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 버리고 골수 세포를 비축하였다.
마우스를 경추 탈구로 희생시키고, 마우스 비장을 취하여 미리 냉각된 1％ HSA 함유 PBS에 넣었다. 안과용 가위로 비장을 자르고, 피펫으로 비장 조직 현탁액을 반복적으로 피펫팅하며, 40 μm의 세포 메쉬망으로 여과하고, 실온에서 400 g에서 5 min 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 버리고 비장 세포를 비축하였다.
비축된 골수 세포 및 비장 세포에 1 ml의 1X 적혈구 용해액을 첨가하고, 볼텍스로 골고루 혼합하며, 실온에서 15 min 동안 용해하고, 그 동안 3 min마다 샘플 원심분리관을 위아래로 뒤집었다. 용해 후, 각 샘플에 4 ml의 1％ HSA 함유 PBS를 첨가하고, 실온에서 400 g에서 5 min 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 버리고 각 샘플에 1 ml의 1％ HSA 함유 PBS를 첨가한 다음 볼텍스로 골고루 혼합하였다. 각 샘플에서 100 μl의 세포 현탁액을 취하고, 표 13의 그룹에 따라 항체를 첨가한 다음 볼텍스로 골고루 혼합하며, 실온에서 빛을 피하여 15 min 동안 배양하였다. 배양 후, 각 실험 샘플에 5 μl의 7-AAD 염료를 첨가하고 볼텍스로 골고루 혼합한 다음, 실온에서 빛을 피하여 5 min 동안 배양하였다. 배양 후, NC 및 각 샘플에 1 ml의 1％ HSA 함유 PBS를 첨가한 다음 골고루 혼합하고, 실온에서 400 g에서 5 min 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 버리고 각 실험 샘플에 100 μl의 1％ HSA 함유 PBS를 첨가하여 세포를 재현탁하며, 검출하기 전에 샘플을 실온에서 빛을 피하여 보관하였다. 유세포 분석기로 검출하였다.
검출 결과는 하기 방법에 따라 분석된다. 1) 표적 세포 집단은 human CD45+ 세포 집단, human CD19+ 세포 집단, human CD3+ 세포 집단, human CD33+ 세포 집단 및 human CD56+ 세포 집단이고; 2) 논리 게이트 및 게이트 위치의 결정은 도 20에 도시된 바와 같은 바, 먼저 세포 집단을 P1 게이트로 확정하고; P1 게이트에서 유래된 세포 집단은 부착 세포가 제거되어 P2 게이트로 되며; P2 게이트에서 유래된 세포 집단은 7-AAD로 살아있는 세포 집단을 P3 게이트로 확정하고; P3 게이트에서 유래된 세포 집단은 NC로 mouse CD45+(P4 게이트) 및 human CD45+ 세포 집단(P5 게이트)을 확정하며; P5 게이트에서 유래된 세포 집단은 NC로 human CD33+(P6 게이트) 및 human CD56+ 세포 집단(P7 게이트)을 확정하며; P5 게이트에서 유래된 세포 집단은 NC로 human CD19+(P8 게이트) 및 human CD3+ 세포 집단(P9 게이트)를 확정하였다. 인간 조혈 줄기 세포 이식 효율은 human CD45 세포의 비율로 나타내고, 계산 방법은 human CD45％/(human CD45％+mouse CD45％)이다. 마우스 체내에서 인간 조혈 줄기 세포가 각 계통의 혈액 세포로 분화되는 효율은 human CD19％(B 세포), human CD3％(T 세포), human CD33％(골수성 세포), human CD56％(NK 세포)로 나타낸다.
도 21의 결과에 따르면, 마우스에 이식된 초기 배양 세포량이 일치한 경우, 8주차, 12주차, 16주차의 말초 혈액 검출에서 Dasatinib 처리 세포의 이식 효율은 Mock군 및 SR1군보다 현저히 높다. 16주차의 골수 및 비장 검출에서, Dasatinib 처리 세포군의 이식 효율은 SR1군보다 현저히 높다. 이는 Dasatinib이 조혈 줄기 세포의 이식 능력을 향상시킬 수 있고, 효과가 문헌에서 보고된 저분자 SR1보다 우수함을 증명한다.
도 22의 결과에 따르면, 마우스 이식 후 16주차의 말초 혈액, 골수, 비장에서 인간 T 세포, B 세포, 골수성 세포 및 NK 세포를 검출할 수 있고, 각 군에서 각 계통의 세포의 비율은 현저한 차이가 없으며, 이는 인간 조혈 줄기 세포가 성공적으로 이식되었을 뿐만 아니라 각 계통의 세포를 분화 및 생성하고 정상적인 분화 기능을 가짐을 증명한다.

Claims (31)

  1. HSCs 증식 촉진 및 HSCs 줄기성 유지 방법으로서,
    시험관 내에서 HSCs를 STAT 세포 신호 전달 경로를 포함하는 저분자 억제제 또는 다른 세포 신호 전달 경로 저분자 억제제의 배양액에 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 STAT 세포 신호 전달 경로를 포함하는 저분자 억제제는 Src 표적의 저분자 억제제인 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 Src 표적의 저분자 억제제는 Dasatinib, Quercetin, UM-164, KX2-391 및 KX1-004 중 하나 이상으로부터 선택인 방법.
  4. 제2항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Src 표적의 저분자 억제제는 상기 다른 세포 신호 전달 경로 저분자 억제제와 병용되는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 다른 세포 신호 전달 경로 저분자 억제제는 HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제, PKC를 표적으로 하는 저분자 억제제 및 JNK를 표적으로 하는 저분자 억제제 중 하나 또는 둘 이상으로부터 선택되는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 Src 표적의 저분자 억제제는 HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제, PKC를 표적으로 하는 저분자 억제제 또는 JNK를 표적으로 하는 저분자 억제제와 병용되는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 Src 표적의 저분자 억제제는 HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제 VPA, HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제 SAHA, PKC를 표적으로 하는 저분자 억제제 Enzastaurin 또는 JNK를 표적으로 하는 저분자 억제제 JNK-IN-8과 병용되는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 Src 표적의 저분자 억제제는 Dasatinib인 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    Dasatinib은 VPA 또는 SAHA와 병용되는 방법.
  10. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Src 표적의 저분자 억제제의 단독 사용 또는 다른 억제제와의 병용은 전체 세포에서 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 HSCs의 세포의 비율이 8％, 10％, 15％, 20％, 25％ 또는 30％를 초과하도록 유지하는 방법.
  11. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Src 표적의 저분자 억제제의 단독 사용 또는 다른 억제제와의 병용은 전체 세포에서 CD34+ 세포의 비율이 65％, 70％, 75％, 80％ 또는 85％를 초과하도록 유지하는 방법.
  12. HSCs 줄기성을 유지하기 위한 조성물로서,
    STAT 세포 신호 전달 경로를 포함하는 저분자 억제제를 포함하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 STAT 세포 신호 전달 경로를 포함하는 저분자 억제제는 Src 표적의 저분자 억제제인 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 Src 표적의 저분자 억제제는 Dasatinib, Quercetin, UM-164, KX2-391 및 KX1-004 중 하나 이상으로부터 선택되는 조성물.
  15. 제13항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 다른 세포 신호 전달 경로 저분자 억제제를 더 포함하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 다른 세포 신호 전달 경로 저분자 억제제는 HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제, PKC를 표적으로 하는 저분자 억제제 및 JNK를 표적으로 하는 저분자 억제제를 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 다른 세포 신호 전달 경로 저분자 억제제는 HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제 VPA, HDAC를 표적으로 하는 저분자 억제제 SAHA, PKC를 표적으로 하는 저분자 억제제 Enzastaurin 및 JNK를 표적으로 하는 저분자 억제제 JNK-IN-8을 포함하는 조성물.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 SFEMII 배지, 성장 인자 Flt-3L, 성장 인자 SCF, 성장 인자 TPO 및 성장 인자 IL-6을 더 포함하는 조성물.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 전체 세포에서 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 HSCs의 세포의 비율이 8％, 10％, 15％, 20％, 25％ 또는 30％를 초과하도록 유지하는 조성물.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 전체 세포에서 CD34+ 세포의 비율이 65％, 70％, 75％, 80％ 또는 85％를 초과하도록 유지하는 조성물.
  21. HSCs 줄기성을 유지하기 위한 조성물로서,
    SAHA+EPZ004777, SAHA+DZNeP, SAHA+Dasatinib, VPA+Dasatinib, SAHA+JNK-IN-8 또는 SAHA+VPA로부터 선택되는 어느 하나의 조합을 포함하는 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 조성물은 전체 세포에서 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 HSCs의 세포의 비율이 8％, 10％, 15％, 20％, 25％ 또는 30％를 초과하도록 유지하는 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    상기 조성물은 전체 세포에서 CD34+ 세포의 비율이 65％, 70％, 75％, 80％ 또는 85％를 초과하도록 유지하는 조성물.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 SFEMII 배지, 성장 인자 Flt-3L, 성장 인자 SCF, 성장 인자 TPO 및 성장 인자 IL-6을 더 포함하는 조성물.
  25. HSCs 줄기성을 유지하기 위한 조성물로서,
    SAHA+EPZ004777+DZNeP 또는 SAHA+VPA+Dasatinib로부터 선택되는 어느 하나의 조합을 포함하는 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 조성물은 전체 세포에서 CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-표현형을 갖는 HSCs의 세포의 비율이 8％, 10％, 15％, 20％, 25％ 또는 30％를 초과하도록 유지하는 조성물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    상기 조성물은 전체 세포에서 CD34+ 세포의 비율이 65％, 70％, 75％, 80％ 또는 85％를 초과하도록 유지하는 조성물.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 SFEMII 배지, 성장 인자 Flt-3L, 성장 인자 SCF, 성장 인자 TPO 및 성장 인자 IL-6을 더 포함하는 조성물.
  29. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    배지에서 각 억제제의 농도는,
    Dasatinib: 0.1 μM ~ 50 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 40 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 30 μM, 가장 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM이고;
    SAHA: 10 nM ~ 20 μM, 바람직하게는 20 nM ~ 15 μM, 더 바람직하게는 30 nM ~ 10 μM, 가장 바람직하게는 0.1 μM ~ 10 μM이며;
    VPA: 10 μM ~ 2000 μM, 바람직하게는 10 μM ~ 1500 μM, 더 바람직하게는 10 μM ~ 1000 μM, 가장 바람직하게는 100 μM ~ 1000 μM이고;
    JNK-IN-8: 0.1 μM ~ 20 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 15 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM, 가장 바람직하게는 1 μM ~ 10 μM이며;
    EPZ004777: 0.1 μM ~ 50 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 40 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 30 μM, 가장 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM이고;
    DZNeP: 1 nM ~ 500 nM, 바람직하게는 5 nM ~ 400 nM, 더 바람직하게는 10 nM ~ 300 nM, 가장 바람직하게는 10 nM ~ 250 nM이며;
    UM-164: 0.1 μM ~ 1000 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 500 μM, 더 바람직하게는 1 μM ~ 100 μM, 가장 바람직하게는 1 μM ~ 10 μM이고;
    KX2-391: 0.1 nM ~ 1000 nM, 바람직하게는 1 nM ~ 1000 nM, 더 바람직하게는 10 nM ~ 500 nM, 가장 바람직하게는 10 nM ~ 100 nM이며;
    KX1-004: 0.1 μM ~ 1000 μM, 바람직하게는 1 μM ~ 1000 μM, 더 바람직하게는 10 μM ~ 500 μM, 가장 바람직하게는 10 μM ~ 100 μM인 조성물.
  30. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    배지에서 각 억제제의 농도는,
    Dasatinib: 0.1 μM ~ 50 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 40 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 30 μM, 가장 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM이고;
    SAHA: 10 nM ~ 20 μM, 바람직하게는 20 nM ~ 15 μM, 더 바람직하게는 30 nM ~ 10 μM, 가장 바람직하게는 0.1 μM ~ 10 μM이며;
    VPA: 10 μM ~ 2000 μM, 바람직하게는 10 μM ~ 1500 μM, 더 바람직하게는 10 μM ~ 1000 μM, 가장 바람직하게는 100 μM ~ 1000 μM이고;
    JNK-IN-8: 0.1 μM ~ 20 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 15 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM, 가장 바람직하게는 1 μM ~ 10 μM이며;
    EPZ004777: 0.1 μM ~ 50 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 40 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 30 μM, 가장 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM이고;
    DZNeP: 1 nM ~ 500 nM, 바람직하게는 5 nM ~ 400 nM, 더 바람직하게는 10 nM ~ 300 nM, 가장 바람직하게는 10 nM ~ 250 nM인 조성물.
  31. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    배지에서 각 억제제의 농도는,
    Dasatinib: 0.1 μM ~ 50 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 40 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 30 μM, 가장 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM이고;
    SAHA: 10 nM ~ 20 μM, 바람직하게는 20 nM ~ 15 μM, 더 바람직하게는 30 nM ~ 10 μM, 가장 바람직하게는 0.1 μM ~ 10 μM이며;
    VPA: 10 μM ~ 2000 μM, 바람직하게는 10 μM ~ 1500 μM, 더 바람직하게는 10 μM ~ 1000 μM, 가장 바람직하게는 100 μM ~ 1000 μM이고;
    EPZ004777: 0.1 μM ~ 50 μM, 바람직하게는 0.5 μM ~ 40 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM ~ 30 μM, 가장 바람직하게는 0.5 μM ~ 10 μM이며;
    DZNeP: 1 nM ~ 500 nM, 바람직하게는 5 nM ~ 400 nM, 더 바람직하게는 10 nM ~ 300 nM, 가장 바람직하게는 10 nM ~ 250 nM인 조성물.
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