TW202136503A - 擴增造血幹細胞的小分子化合物及其組合 - Google Patents

擴增造血幹細胞的小分子化合物及其組合 Download PDF

Info

Publication number
TW202136503A
TW202136503A TW109144495A TW109144495A TW202136503A TW 202136503 A TW202136503 A TW 202136503A TW 109144495 A TW109144495 A TW 109144495A TW 109144495 A TW109144495 A TW 109144495A TW 202136503 A TW202136503 A TW 202136503A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
small molecule
cells
hscs
saha
inhibitor
Prior art date
Application number
TW109144495A
Other languages
English (en)
Inventor
方日國
楊卉慧
史忠玉
袁鵬飛
于玲玲
Original Assignee
大陸商廣州輯因醫療科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商廣州輯因醫療科技有限公司 filed Critical 大陸商廣州輯因醫療科技有限公司
Publication of TW202136503A publication Critical patent/TW202136503A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A61K31/167—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide having the nitrogen of a carboxamide group directly attached to the aromatic ring, e.g. lidocaine, paracetamol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/405—Indole-alkanecarboxylic acids; Derivatives thereof, e.g. tryptophan, indomethacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本申請提供了用於擴增造血幹細胞(HSCs)的小分子抑制劑及其組合。所述小分子抑制劑及其組合均能夠很好地促進造血幹細胞(HSCs)的體外擴增，同時維持造血幹細胞的幹性，效果優於已報導的小分子抑制劑。本申請提供的小分子抑制劑及其組合可在實現HSCs的體外擴增的同時維持HSCs較高比例的幹性，為實現HSCs的臨床應用奠定基礎。

Description

擴增造血幹細胞的小分子化合物及其組合
本申請是有關於生物醫藥領域，特別是有關於一種用於擴增造血幹細胞(HSCs)的小分子化合物，具體為細胞信號通路的小分子抑制劑、其組合物，以及該小分子抑制劑及其組合物在擴增造血幹細胞中的用途。
造血幹細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)是血液系統中一群異質原始造血細胞，具有自我更新和多系分化2個重要特徵。機體處於健康狀態時，體內HSCs長期處於靜息狀態，當機體發生病變或嚴重失血狀態時，HSCs被啟動，進入自我更新、多系分化狀態，維持血液系統穩定及機體穩態。HSCs自我更新特性有利於子代HSCs保持幹性，而HSCs多系分化特性可使其分化成多種成熟血細胞，如髓系細胞(粒細胞、單核細胞、紅細胞及血小板)，淋系細胞(T細胞和B細胞)。HSCs的特性有利於HSCs在機體需要時進行分化。
HSCs的這些特性，使通過造血幹細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)治療血液系統疾病成為可能。HSCs包含長期造血幹細胞（long term HSCs，LT-HSCs）和短期造血幹細胞（short term HSCs，ST-HSCs）。前者具有高度自我更新能力，可在機體整個生命週期進行造血重建；而後者只能在有限時間內保持造血重建功能。1959年，Thomas等人利用骨髓造血幹細胞進行了人類歷史上首次造血幹細胞移植，在臨床治療白血病，以恢復病人體內正常造血功能。此後幾十年，經過科研工作者的不斷努力，造血幹細胞移植不僅應用於治療多種血液系統疾病，還被用於治療免疫缺陷疾病、神經系統退行性疾病等。
目前，HSCs主要有三個來源，骨髓(bone marrow，BM)、動員外周血(mobilized peripheral blood，mPB)、臍帶血(umbilical cord blood，CB)。採集骨髓造血幹細胞，創傷性大，採集量不足，該方法基本被淘汰。人外周血中HSCs所占比例很低(小於0.1%)，需要用粒細胞集落刺激因數(G-CSF)動員造血幹細胞從骨髓中遷移至外周血中再進行移植，臨床應用中常出現動員效果不佳、所含HSCs數量不足，致使多次動員或移植失敗。而且這兩種方法所採集的HSCs均需要進行供者和患者之間白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)配型。HLA配型比較困難，一旦發生錯配，則會產生移植物抗宿主反應(graft versus host reaction，GVHD)。發生GVHD的患者會死於免疫系統紊亂。
臍帶血作為一種新的HSCs來源具有多方面優勢，首先臍帶血HSCs對HLA配型相合程度要求低，允許HLA部分錯配，移植後GVHD發病率低，緩解了傳統HSCT配型困難；其次臍帶血採集方便，對供者無傷害且不存在倫理問題，HSCs造血能力強。這些優勢使臍帶血成為未來HSCs治療疾病的優先來源。
但由於單份臍帶血細胞量少，總體HSCs數量較少，因此僅限於兒童或體重較輕的成人移植，不能滿足較大體重成人的移植需求。當移植HSCs數量不足時，患者中性粒細胞恢復延遲，導致GVHD風險提高。這些都成為制約臍帶血臨床應用的瓶頸。
總之，造血幹細胞移植的安全性和有效性取決於移植的HSCs含量，若能體外擴增HSCs的數量，則可提高造血幹細胞移植的成功率。
研究者們不斷努力，嘗試探索不同方法實現造血幹細胞的體外擴增。其中一種HSCs體外擴增策略是利用靶向HSCs的小分子化合物(small-molecule compounds，SMCs)。SMCs來源易得，易於批量生產，性質穩定，結構明確，濃度方便調控，已廣泛應用於醫學研究中。現階段HSCs體外擴增技術中，SMCs可顯著提高HSCs擴增倍數。例如AhR芳烴受體抑制劑StemRegenin 1(SR1)，是篩選出的第一個可體外擴增HSCs的SMC。嘧啶吲哚衍生物UM171也能夠體外擴增HSCs，但它不是通過AhR細胞信號傳導通路發揮作用。轉錄組分析結果表明，UM171沒有下調AhR細胞信號傳導通路，但抑制了紅細胞、巨核細胞分化相關基因。二者組合，對HSCs的擴增倍數提高。
組蛋白去乙醯酶(histone deacetylases，HDAC)是人們已知的細胞信號傳導通路。組蛋白可以通過乙醯化或去乙醯化調節調節特定基因的轉錄過程、細胞的增殖和分化。已有的研究結果揭示了組蛋白乙醯化在HSCs自我更新和增殖方面發揮作用。HDAC抑制劑TSA、trapoxin、chlamydocin可體外調節組蛋白乙醯化從而促進HSCs的自我更新和增殖。
Src由Src原癌基因編碼，是具有酪氨酸蛋白激酶活性的非受體蛋白激酶。它存在於細胞質內，可被多種細胞表面受體啟動而參與介導多條細胞信號傳導通路，從而調控細胞的增殖、分化等過程，是多條細胞信號傳導通路的關鍵分子。例如Src啟動後與p52Shc協同啟動絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)細胞信號傳導通路，參與MAPK下游調節細胞生長、分化過程；Src也可啟動STAT細胞信號傳導通路，促進相關基因的轉錄。迄今為止，未有研究報導Src抑制劑有助於HSCs體外擴增過程中維持幹性，而在本發明的研究中我們發現Src抑制劑可促進HSCs的增殖並能維持HSCs的幹性。
儘管已經發現某些細胞信號通路的小分子抑制劑可以促進HSCs的增殖，但本領域需要繼續尋找促進HSCs增殖作用更強、並且能使增殖後的HSCs維持幹性的小分子化合物和實現這一目的的綜合策略，以滿足臨床需要。
本申請要解決的問題是，通過研究調控細胞信號傳導通路的關鍵因數來篩選出促進HSCs體外擴增同時維持HSCs較高比例幹性的最佳小分子化合物及其組合物，從而解決現有技術中HSCs體外擴增數量仍不足的問題。
首先申請人的研究發現，作用於STAT細胞信號傳導通路的Src靶點的多個小分子抑制劑可很好的維持HSCs體外培養時的幹性，Src靶點在STAT細胞信號傳導通路中對擴增造血幹細胞，以及同時維持造血幹細胞的幹性起到了重要的作用，這是以往研究未被報導過的。
進一步地，申請發現在HSCs體外培養過程中，HDAC抑制劑，例如SAHA、Valproic acid(VPA)，與Src靶點的小分子抑制劑的組合可很好的維持HSCs的幹性，其效果遠遠優於與現有技術中已發現的SR1、UM171。
因此，本申請一方面發現信號傳導及轉錄啟動因數(STAT)細胞信號傳導通路的小分子抑制劑，例如靶向Src靶點的小分子抑制劑可以促進HSCs增殖和維持HSCs的幹性特徵。在一些實施方案中，本申請提供了一種促進HSCs增殖並維持HSCs幹性的方法，包括使HSCs體外接觸含有STAT細胞信號傳導通路的小分子抑制劑或者其他細胞信號通路小分子抑制劑的培養液。在一些實施方案中，所述STAT細胞信號傳導通路的小分子抑制劑為Src靶點的小分子抑制劑。在一些實施方案中，所述Src靶點的小分子抑制劑選自如下的一種或多種：Dasatinib、Quercetin、UM-164、KX2-391和KX1-004。在一些實施方案中，所述Src靶點的小分子抑制劑選自如下的一種或多種：Dasatinib、UM-164和KX1-004。
在一些實施方案中，所述Src靶點的小分子抑制劑與其他細胞信號通路小分子抑制劑聯合使用。在一些實施方案中，所述其它細胞信號通路小分子抑制劑選自以HDAC為靶點的小分子抑制劑、以PKC為靶點的小分子抑制劑和以JNK為靶點的小分子抑制劑中的一種或兩種以上。在一些實施方案中，所述Src靶點的小分子抑制劑與以HDAC為靶點的小分子抑制劑、以PKC為靶點的小分子抑制劑或以JNK為靶點的小分子抑制劑聯合使用。在一些實施方案中，所述Src靶點的小分子抑制劑與以HDAC為靶點的小分子抑制劑VPA、以HDAC為靶點的小分子抑制劑SAHA、以PKC為靶點的小分子抑制劑Enzastaurin或以JNK為靶點的小分子抑制劑JNK-IN-8聯合使用。在一些實施方案中，所述Src靶點的小分子抑制劑Dasatinib與VPA或SAHA聯合使用。在一些實施方案中，所述信號傳導及轉錄啟動因數(STAT)細胞信號傳導通路的小分子抑制劑，例如Src靶點的小分子抑制劑，例如Dasatinib、UM-164或KX1-004維持具有CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例超過8%、10%、15%、20%、25%、30%，例如維持具有CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例為5%-35%、10%-35%、15%-35%、20%-35%、25%-35%、5%-30%、10%-30%、20%-30%、5%-25%、10%-25%、15%-25%、20%-25%、5%-20%、10%-20%、15%-20%；維持CD34+細胞占全部細胞中的比例超過65%、70%、75%、80%、85%。
在一些實施方案中，本申請提供了一種用於維持HSCs幹性的組合物，其包括含有STAT細胞信號傳導通路的小分子抑制劑。在一些實施方案中，所述含有STAT細胞信號傳導通路的小分子抑制劑為Src靶點的小分子抑制劑。在一些實施方案中，所述Src靶點的小分子抑制劑選自如下的一種或多種：Dasatinib、Quercetin、UM-164、KX2-391和KX1-004。在一些實施方案中，所述組合物還包括其它細胞信號通路小分子抑制劑。在一些實施方案中，所述其它細胞信號通路小分子抑制劑包括以HDAC為靶點的小分子抑制劑、以PKC為靶點的小分子抑制劑和以JNK為靶點的小分子抑制劑。在一些實施方案中，所述其它細胞信號通路小分子抑制劑包括以HDAC為靶點的小分子抑制劑VPA、以HDAC為靶點的小分子抑制劑SAHA、以PKC為靶點的小分子抑制劑Enzastaurin和以JNK為靶點的小分子抑制劑JNK-IN-8。在一些實施方案中，述組合物還包括SFEMII培養基、生長因數Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和生長因數IL-6。在一些實施方案中，所述組合物由含有STAT細胞信號傳導通路的小分子抑制劑和/或其它細胞信號通路小分子抑制劑、SFEMII培養基、生長因數Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和生長因數IL-6組成。在一些實施方案中，所述組合物維持具有CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例超過8%、10%、15%、20%、25%或30%，例如維持具有CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例為5%-35%、10%-35%、15%-35%、20%-35%、25%-35%、5%-30%、10%-30%、20%-30%、5%-25%、10%-25%、15%-25%、20%-25%、5%-20%、10%-20%、15%-20%。在一些實施方案中，所述組合物維持CD34+細胞占全部細胞中的比例超過65%、70%、75%、80%或85%。
在一些實施方案中，所述信號傳導及轉錄啟動因數(STAT)細胞信號傳導通路的小分子抑制劑，例如Src靶點的小分子抑制劑，例如Dasatinib、UM-164或KX1-004與其他細胞信號通路的小分子抑制劑，例如VPA或SAHA，聯合使用維持具有CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例超過8%、10%、15%、20%、25%、30%，例如維持具有CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例為5%-35%、10%-35%、15%-35%、20%-35%、25%-35%、5%-30%、10%-30%、20%-30%、5%-25%、10%-25%、15%-25%、20%-25%、5%-20%、10%-20%、15%-20%；維持CD34+細胞占全部細胞中的比例超過65%、70%、75%、80%、85%。在一些實施方案中，每種抑制劑在培養基中的濃度為：
Dasatinib: 0.1μM-50μM，優選為0.5μM-40μM，進一步優選為0.5μM-30μM，最優選為0.5μM-10μM；
SAHA: 10nM-20μM，優選為20nM-15μM，進一步優選為30nM-10μM，最優選為0.1μM-10μM；
VPA: 10μM-2000μM，優選為10μM-1500μM，進一步優選為10μM-1000μM，最優選為100μM-1000μM；
JNK-IN-8:0.1μM-20μM，優選為0.5μM-15μM，進一步優選為0.5μM-10μM，最優選為1μM-10μM；
EPZ004777:0.1μM-50μM，優選為0.5μM-40μM，進一步優選為0.5μM-30μM，最優選為0.5μM-10μM；
DZNeP：1nM-500nM，優選為5nM-400nM，進一步優選為10nM-300nM，最優選為10nM-250nM；
UM-164：0.1μM-1000μM，優選為0.5μM-500μM，進一步優選為1μM-100μM，最優選為1μM-10μM；
KX2-391：0.1nM -1000nM，優選為1nM -1000nM，進一步優選為10nM -500nM，最優選為10nM -100nM；
KX1-004：0.1μM-1000μM，優選為1μM-1000μM，進一步優選為10μM-500μM，最優選為10μM-100μM。
一方面，本申請提供了一種促進HSCs增殖並維持HSCs幹性的方法，包括使HSCs體外接觸含有如下一種或多種的小分子抑制劑的培養液：1）以HDAC為靶點的小分子抑制劑VPA；2）以HDAC為靶點的小分子抑制劑SAHA；3）以PKC為靶點的小分子抑制劑Enzastaurin；和4）以JNK為靶點的小分子抑制劑JNK-IN-8。
一方面，本申請提供了一種用於維持HSCs幹性的組合物，包含選自如下的任一組合：SAHA+EPZ004777、SAHA+DZNeP、SAHA+Dasatinib、VPA+Dasatinib、SAHA+JNK-IN-8或SAHA+VPA。在一些實施方案中，所述組合物還包括SFEMII培養基、生長因數Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和生長因數IL-6。在一些實施方案中，所述組合物由選自的任一組合SAHA+EPZ004777、SAHA+DZNeP、SAHA+Dasatinib、VPA+Dasatinib、SAHA+JNK-IN-8或SAHA+VPA以及SFEMII培養基、生長因數Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和生長因數IL-6組成。在一些實施方案中，所述維持HSCs幹性的組合物還有助於維持CD34+細胞比例。在一些實施方案中，所述組合物維持具有CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例超過8%、10%、15%、20%、25%、30%，例如維持具有CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例為5%-35%、10%-35%、15%-35%、20%-35%、25%-35%、5%-30%、10%-30%、20%-30%、5%-25%、10%-25%、15%-25%、20%-25%、5%-20%、10%-20%、15%-20%；維持CD34+細胞占全部細胞中的比例超過65%、70%、75%、80%、85%。在一些實施方案中，每種抑制劑在培養基中的濃度為：
Dasatinib: 0.1μM-50μM，優選為0.5μM-40μM，進一步優選為0.5μM-30μM，最優選為0.5μM-10μM；
SAHA: 10nM-20μM，優選為20nM-15μM，進一步優選為30nM-10μM，最優選為0.1μM-10μM；
VPA: 10μM-2000μM，優選為10μM-1500μM，進一步優選為10μM-1000μM，最優選為100μM-1000μM；
JNK-IN-8:0.1μM-20μM，優選為0.5μM-15μM，進一步優選為0.5μM-10μM，最優選為1μM-10μM；
EPZ004777:0.1μM-50μM，優選為0.5μM-40μM，進一步優選為0.5μM-30μM，最優選為0.5μM-10μM；
DZNeP：1nM-500nM，優選為5nM-400nM，進一步優選為10nM-300nM，最優選為10nM-250nM。
一方面，本申請提供了一種用於維持HSCs幹性的組合物，包含選自如下的任一組合：SAHA+EPZ004777+DZNeP或SAHA+VPA+Dasatinib。在一些實施方案中，所述組合物還包括SFEMII培養基、生長因數Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和生長因數IL-6。在一些實施方案中，所述組合物由SAHA+EPZ004777+DZNeP或SAHA+VPA+Dasatinib以及SFEMII培養基、生長因數Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和生長因數IL-6組成。在一些實施方案中，所述組合物維持具有CD34+CD45+CD90+CD45RA- CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例超過8%、10%、15%、20%、25%、30%，例如維持具有CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例為5%-35%、10%-35%、15%-35%、20%-35%、25%-35%、5%-30%、10%-30%、20%-30%、5%-25%、10%-25%、15%-25%、20%-25%、5%-20%、10%-20%、15%-20%；維持CD34+細胞占全部細胞中的比例超過65%、70%、75%、80%、85%。在一些實施方案中，每種抑制劑在培養基中的濃度為：Dasatinib: 0.1μM-50μM，優選為0.5μM-40μM，進一步優選為0.5μM-30μM，最優選為0.5μM-10μM；
SAHA: 10nM-20μM，優選為20nM-15μM，進一步優選為30nM-10μM，最優選為0.1μM-10μM；
VPA: 10μM-2000μM，優選為10μM-1500μM，進一步優選為10μM-1000μM，最優選為100μM-1000μM；
EPZ004777:0.1μM-50μM，優選為0.5μM-40μM，進一步優選為0.5μM-30μM，最優選為0.5μM-10μM；
DZNeP：1nM-500nM，優選為5nM-400nM，進一步優選為10nM-300nM，最優選為10nM-250nM。
在一些實施方案中，所述STAT細胞信號傳導通路的小分子抑制劑為Src靶點的小分子抑制劑。在一些實施方案中，所述Src靶點的小分子抑制劑選自如下的一種或多種Dasatinib、Quercetin、UM-164、KX2-391和KX1-004。在一些實施方案中，所述Src靶點的小分子抑制劑選自如下的一種或多種：Dasatinib、UM-164和KX1-004。在申請人的研究結果中，上述這些細胞信號傳導通路的小分子抑制劑，均可很好維持HSCs體外擴增時的幹性和CD34+細胞比例，而且這些小分子抑制劑的組合對於HSCs的自我更新、幹性維持等方面優於與現有技術中已報導的小分子組合的效果。
在本申請中，申請人的研究結果發現了Src的抑制劑，在HSCs體外擴增培養方面，可很好的維持HSCs的幹性；並且發現了HDAC抑制劑，與Src抑制劑進行組合，在HSCs體外擴增培養方面，效果優於已報導的小分子抑制劑和這些小分子抑制劑單獨使用效果。申請人的研究結果可以實現HSCs的體外擴增的同時維持HSCs較高比例的幹性，為實現HSCs的臨床應用奠定基礎。
上述造血幹細胞的“幹性”為造血幹細胞特性的簡稱。造血幹細胞（HSCs）主要呈現兩大方面的細胞生物學特徵：自我更新的能力（self-renewal capacity）和多能分化潛能（pluripotency）。造血幹細胞的這些特性簡稱為“幹性”（stemness）。造血幹細胞的細胞表面表達的分子表型可以某種程度上體現其是否維持了“幹性”。例如，如果造血幹細胞的表型為CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-，說明其為LT-HSCs，維持了“幹性”。在本申請中，具有CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的造血幹細胞，定義為LT-HSCs；造血幹細胞具有CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型，定義為其維持或保持了造血幹細胞特性，即“幹性”。
所述全部細胞是指最初的CD34+細胞經過培養之後的所有子代細胞。
本發明將造血幹細胞體外接觸含有STAT細胞信號傳導通路的小分子抑制劑如Src靶點的小分子抑制劑或者其他細胞信號通路小分子抑制劑如以HDAC為靶點的小分子抑制劑、以PKC為靶點的小分子抑制劑和以JNK為靶點的小分子抑制劑，能夠很好維持HSCs體外擴增時的幹性和CD34+細胞在全部HSCs中的比例，而且這些小分子抑制劑的組合對於HSCs的自我更新、幹性維持等方面優於與現有技術中已報導的小分子組合的效果，而且，使用上述小分子抑制劑處理後的細胞移植效率明顯高於現有技術中已報導的小分子抑制劑處理後的細胞移植效率。
實施例
實施例 1 ：臍帶血分選 CD34+ HSCs 用於後續小分子篩選
準備試劑H-lyse Buffer(1×)溶液和Wash Buffer(1×)溶液。取5ml H-lyse Buffer 10×儲存液(R&D，貨號：WL1000)，加45ml去離子水(Edigene，0.22μm濾膜過濾)，混勻，配製成H-lyse Buffer(1×)溶液。取5ml Wash Buffer 10× 儲存液(R&D，貨號：WL1000)，加45ml去離子水，混勻，配製成Wash Buffer(1×)溶液。
向10ml臍帶血(Edigene)中加注生理鹽水至終體積為30ml。向該稀釋血液中加入人淋巴細胞分離液(達科為，貨號：DKW-KLSH-0100)，之後400g離心30min（設置升速3，降速0），吸取白膜層，500g離心10min。將細胞沉澱集中至一個50ml離心管中，加入H-lyse Buffer(1×)10ml，常溫裂解紅細胞10min。然後加入10ml Wash Buffer(1×)終止裂解反應，補加生理鹽水至終體積為50ml。將上述50ml離心管轉移至高速離心機中，500g離心10min，棄上清，用50ml生理鹽水(1%HSA)重懸細胞，混勻，取20μL細胞懸液至細胞計數儀(Nexcelom，型號：Cellometer K2)中計數，將該離心管轉移至高速離心機中，500g離心10min。棄上清，根據計數結果加入相應體積的磁珠(100ul FcR/1*10^8 cell和100ul CD34 MicroBeads/1*10^8 cell)，其操作如下：首先加入FcR Blocking Reagent (Miltenyi Biotec，貨號：130-100-453，試劑用量根據細胞計數結果決定)重懸細胞，再加入預混勻的CD34 MicroBeads(CD34 MicroBead Kit UltraPure，human：MiltenyiBiotec，貨號：130-100-453)，混勻，4℃冰箱中孵育30min。往離心管中加生理鹽水(1%HSA)至終體積為50ml，轉移至高速離心機中，500g離心10min。準備磁力分離器(MiltenyiBiotec，型號：130-042-102)和一個磁力架(MiltenyiBiotec，型號：130-042-303)，將磁力分離器調整至合適高度，放入MS Column(MiltenyiBiotec，貨號：130-042-201)或LS Column(MiltenyiBiotec，貨號：130-042-401)(根據細胞量決定選用柱子的類型，具體參考產品相關說明書)，下方放置15ml離心管(Corning，貨號：430791)收集非目標細胞懸液，用1ml(MS柱)或者3ml(LS柱)生理鹽水(1%HSA)潤洗MS Column或LS Column。在上述高速離心機(Thermo，型號：ST40)中的離心管離心後，棄上清，用1ml(MS柱)或3ml(LS柱)生理鹽水(1%HSA)重懸細胞，往每個分選柱(分選柱的用量根據臍血的份數以及細胞量決定)中加入細胞懸液。再用1ml(MS柱)或3ml(LS柱)生理鹽水(1%HSA)洗滌離心管，洗滌液加入柱中。
用1ml(MS柱)或3ml(LS柱)生理鹽水(1%HSA)洗滌MS Column或LS Column。重複3次。將分選柱轉移至新的15ml離心管上方，加入2ml(MS柱)或3ml(LS柱)生理鹽水(1%HSA)洗脫目標細胞，再加入1ml(MS柱)或2ml(LS柱)生理鹽水(1%HSA)重複洗脫目標細胞一次。取20μL細胞懸液至細胞計數儀(Nexcelom，型號：Cellometer K2)中計數，剩餘細胞懸液400g離心5min。不完全棄上清，留1ml上清，重懸細胞。取一個新的MS Column，加入1ml生理鹽水(1%HSA)潤洗，將上述經重懸的細胞的細胞懸液轉移至該MS Column中，重複上述洗滌和洗脫步驟，獲得3ml目標細胞懸液。取20μL細胞懸液至細胞計數儀(Nexcelom，型號：Cellometer K2)中計數，根據細胞密度和細胞懸液體積，計算總細胞數，剩餘細胞懸液400g離心5min，棄上清備用。
實施例 2 ：小分子抑制劑濃度測試以及篩選
根據小分子抑制劑的說明書標明的溶解度以及所需溶劑(小分子抑制劑貨號參見表1)，進行小分子抑制劑儲存液的配置。接著進行基礎培養基的配製：SFEMII培養基(stem cell，貨號：09655)+50ng/ml生長因數Flt-3L(PeProtech，貨號：300-100UG)+50ng/ml生長因數SCF(PeProtech，貨號：300-07-100UG)+50ng/ml生長因數TPO(PeProtech，貨號：300-18-100UG)+10ng/ml生長因數IL-6(PeProtech，貨號：200-06-20UG)+1%雙抗(HyClone，貨號：sv30010)。根據設置的小分子抑制劑濃度梯度，利用儲存液和基礎培養基，配製含有不同濃度小分子抑制劑的培養基。
首先，將準備好的培養基加入到24孔板(Corning，貨號：3473)中，每孔950μl，放置在二氧化碳培養箱(Thermo，型號：3111)中預熱；將實施例1中備用的HSCs用SFEMII+50ng/ml Flt-3L+50ng/ml SCF+50ng/ml TPO+10ng/ml IL-6 +1%雙抗重懸，按照每孔50μl細胞懸液，每孔細胞密度為2*10^5/ml計算所加的培養基體積。例如每孔細胞培養液終體積為1ml，根據每孔細胞密度計算每孔細胞總量為2*10^5個細胞，每孔補加的50μl細胞懸液密度則為4*10^6/ml，將實施例1中備用的HSCs密度調整為計算所得的細胞懸液密度，進行添加；從培養箱中拿出預熱好的培養基，每孔中加入50μl細胞懸液，混勻後，顯微鏡(OLYMPUS，型號：CKX53)下觀察細胞狀態，然後放入培養箱中培養。
表1：小分子抑制劑
貨號 （以下均來自於Selleck） 小分子抑制劑名稱 作用通路/靶點
S1021 Dasatinib(Dasa) Src、c-kit、Abl
S2391 Quercetin Sirtuin、Src、PKC、PI3K
S8706 UM-164 Src、P38α/β
S2700 KX2-391 Src
S6500 KX1-004 Src
S1047 SAHA HDAC
S1999 Sodium butyrate HDAC
S3944 Valproic acid （VPA） HDAC
S7595 Santacruzamate A(SIS3 Hcl) HDAC
S7085 IWP-2 Porcn in the Wnt pathway
S7086 IWR-1-endo Wnt pathway
S8007 VE821 ATR
S7050 AZ-20 ATR
S7079 SGC 0946 DOT1L甲基轉移酶
S7353 EPZ004777 DOT1L甲基轉移酶
S7307 GSK2606414 EIF2AK3(PERK,蛋白激酶R樣內質網激酶)
S7400 ISRIB (trans-isomer) PERK
S2924 CHIR-99021 (CT99021) HCl GSK3α/β(糖原合成酶激酶)
S2621 AZD5438 CDK1/2/9(Cyclin-dependent kinases1/2/9)
S4901 JNK-IN-8 JNK pathway
S7508 JNK Inhibitor IX JNK pathway
s7483 DMOG HIF prolyl hydroxylase
s1623 Acetylcysteine ROS(reactive oxygen species)、 TNFα(tumor necrosis factor)
S3114 Vitamin C ROS
s5433 Sodium succinate ROS
s2284 Colchicine microtubule polymerization
s2775 Nocodazole microtubule polymerization、Abl
S4505 Vinblastine sulfate microtubule formation、 nAChR(亞基煙鹼型乙醯膽鹼受體)
S3633 Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium NF-κB
S4073 Sodium 4-Aminosalicylate(S-4-A) NF-κB
S1067 SB431542 TGFβRI/ALK5
S1459 Thiazovivin ROCK(Rho-associated kinase)
S1049 Y27632 ROCK(Rho-associated kinase)
S1076 SB203580 P38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)
S2449 Forskolin cAMP Activator
S7858 Dibutyryl-cAMP (Bucladesine) PKA(cAMP依賴蛋白激酶A)
s1907 Metronidazole DNA synthesis
S1992 Fluticasone propionate(FLU) Glucocorticoid receptor
s2250 (-)-EpigallocatechinGallate telomerase、DNA methyltransferase
s2923 Salubrinal eIF2α
s3925 (-)-Epicatechingallate VEGFR2(血管內皮生長因數2)
S4991 Valpromide VPA衍生物，靶點未知
S7120 3-deazaneplanocin A (DZNeP) HCl S-adenosylhomocysteine hydrolase，Histone methyltransferase
S7315 PFI-3 PB1(5) bromodomains、SMARCA4/2A/2B
S7608 UM171 未知
S8287 CPI-455 HCl KDM5(組蛋白去甲基化酶)
s8615 Sodium dichloroacetate (DCA) PDK4/2(丙酮酸脫氫酶激酶)
S5742 Deferoxamine mesylate 未知
S2858 SR1 AHR(aryl hydrocarbon receptor)
S4757 Dihydrotestosterone(DHT) Androgen Receptor(雄性激素受體)
S8280 IMR-1 Notch pathway
S2915 GW9662 PPARγ(過氧化物酶體增殖物啟動受體)
S3003 PGE2 Wnt pathway
S1055 Enzastaurin PKC
S2911 Go 6983 PKC(protein kinase C)
s2776 CPI-613 PDH(pyruvate dehydrogenase)、 α-ketoglutarate dehydrogenase
實施例 3 ：流式檢測 HSCs 幹性以及 CD34+ 的維持
本實施例中所使用的抗體及其來源參見表2。
表2：抗體
抗體名稱 廠家 貨號
APC/Cy7 anti-human CD45 Biolegend 304014
APC anti-human CD38 Biolegend 356606
Brilliant Violet 510™ anti-human CD34 Biolegend 343528
PE anti-human CD90 (Thy1) Biolegend 328110
FITC anti-human CD45RA Biolegend 304106
APC Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl Biolegend 400220
APC/Cyanine7 Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Biolegend 400128
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl Biolegend 400212
FITC Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl Biolegend 402208
Brilliant Violet 510™ Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl Biolegend 400268
將上述實施例2中培養至6-7天（D6-D7）的細胞取樣20μl計數，根據計數結果取出2*10^5個細胞的懸液至1.5ml離心管中；400g，5min離心，棄上清。取含1% HSA(人血清白蛋白，廣東雙林，貨號：S10970069)的PBS(磷酸緩衝鹽溶液，HyClone，貨號：SH30256.01)100ul，重懸細胞，渦旋混勻，備用。然後，收集對照細胞樣本。細胞數量及收集方法同待測樣本細胞操作。對照分別設定為NC組、ISO組，細胞選擇為本批次實驗中待檢樣本的任一樣本或混合細胞，視細胞數量而定。同批次實驗中各對照組不設重複檢測。組別設置參見表3。
表3 組別設置
組別 細胞數量 添加抗體名稱 抗體量
NC 2×10^5 -- --
ISO 2×10^5 APC Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl APC/Cyanine7 Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl FITC Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl Brilliant Violet 510™ Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl
FMO38 2×10^5 APC/Cy7 anti-human CD45 Brilliant Violet 510™ anti-human CD34 PE anti-human CD90 (Thy1) FITC anti-human CD45RA 2μl 2μl 2μl 2μl
FMO90 2×10^5 APC/Cy7 anti-human CD45 APC anti-human CD38 Brilliant Violet 510™ anti-human CD34 FITC anti-human CD45RA 2μl 2μl 2μl 2μl
樣本 2×10^5 APC/Cy7 anti-human CD45 APC anti-human CD38 Brilliant Violet 510™ anti-human CD34 PE anti-human CD90 (Thy1) FITC anti-human CD45RA 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl
按照上表3，向上述待檢測細胞樣本及對照細胞樣本的細胞懸液中，按組別對應加入抗體。渦旋混勻，室溫避光孵育15min。15min孵育結束後，在每個實驗樣本中加入含1% HSA的PBS 1ml，混勻，400g，5min室溫離心。離心結束後，棄上清，每個實驗樣本用100μl含1% HSA的PBS重懸細胞。上機檢測前樣本室溫避光保存。使用流式細胞儀檢測。
檢測結果按如下方法分析：1)目的細胞群為CD34+CD45+CD45RA-CD90+CD38-細胞群；2)邏輯門及門位置的確定參見圖1所示：首先圈定細胞群，P1門；來源於P1門的細胞群去除粘連細胞，為P2門；來源於P2門的細胞群用NC或ISO圈定CD34，CD45，CD45RA陰性細胞群，為Q3-LL門(CD34-/CD45-)，Q5-UL+Q5-LL門(CD45RA-)；FMO90圈定CD90陰性細胞群，為Q5-LL+Q5-LR門；FMO38圈定CD38陰性細胞群，為Q6-LR門；應用NC，ISO，FMO劃定的門，確定Q3-UR—Q5-UL—Q6-LR門圈定的細胞為CD34+CD45+CD45RA-CD90+CD38-目的細胞。
在實施例1中分選出來的臍帶血來源的CD34+細胞上，以實施例2相同的方法進行小分子抑制劑的最佳濃度以及能夠維持HSCs幹性的篩選，小分子誘導6-7天後，用與實施例3相同的方法流式細胞儀檢測長期造血幹細胞(long-term hematopoietic stem cells，LT-HSCs)細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達。
在本實施例中共進行了五輪篩選，每輪篩選的抑制劑以及測試濃度見表4、表5、表6、表7、表8，其結果分別如圖2-圖6所示。
圖2結果表明，在提高LT-HSCs比例方面，SAHA顯著優於表4中其他抑制劑，其效果是其他抑制劑的2-20倍。當SAHA為5μM時，在顯微鏡下觀察細胞狀態差，而通過細胞計數比較，增殖較差，故選用1μM的濃度進行後續的篩選。在維持CD34+細胞比例方面，SAHA(1μM)略好於對照組(Mock，0.01% DMSO)。
圖3結果表明，與表5中的已知文獻中(Fares I, et al. Science.2014；Evans T. Cell Stem Cell.2009；Boitano A E，et al.Science.2010；Guo B，et al. Nature Medicine.2018；Guo B，et al.Nature Medicine.2017)報導的小分子抑制劑UM171、PGE2、SR1、GW9662、FLU進行比較，在維持HSCs幹性方面，SAHA的效果是已報導小分子的10-20倍，且在維持CD34+細胞比例方面，SAHA與SR1並無顯著性差異，但明顯優於UM171，PGE2、GW9662、FLU。
圖4結果表明，在維持HSCs幹性方面，SAHA比表6中其他抑制劑高約2-15倍。同時SAHA在維持CD34+細胞比例方面要優於其他抑制劑。
圖5結果表明，在維持HSCs幹性方面，SAHA顯著優於表7中其他抑制劑，是其他抑制劑的1-12倍，其次是Enzastaurin低濃度使用時，LT-HSCs比例是其他抑制劑(SAHA除外)的3-10倍。在維持CD34+細胞比例方面，JNK-IN-8能夠維持CD34+比例在90%左右。除JNK-IN-8外，SAHA和Dasatinib略優於其他抑制劑。
圖6結果表明，維持LT-HSCs幹性方面，表8中Valproic acid(VPA)顯著高於其他小分子約30倍，比SAHA高約1倍。SAHA是其他小分子(VPA除外)的15倍。在維持CD34+細胞比例方面，SAHA和VPA要優於其他小分子。
綜上所述：在本實施例中，共篩選出能夠維持LT-HSCs幹性和CD34+細胞高比例的小分子共5個，分別是以HDAC為靶點的VPA、SAHA，以Src為靶點的Dasatinib，以PKC為靶點的Enzastaurin，以JNK為靶點的JNK-IN-8。
表4：第一輪篩選
小分子抑制劑名稱 測試濃度
VE821 0.1μM，1μM，5μM，10μM
AZ20 0.1μM，1μM，5μM，10μM
PFI-3 0.2μM，2μM，5μM，10μM
Sodium 4-Aminosalicylate（S-4-A） 0.1mM，1mM，5mM，10mM
PDTC 1nM，5nM，10nM，50nM
SAHA 0.1μM，1μM，5μM，10μM
Santacruzamate A(SIS3 HCL) 0.1μM，1μM，5μM，10μM
SR1 0.1μM，1μM，5μM，10μM
表5：第二輪篩選
小分子抑制劑名稱 測試濃度
SAHA 1μM
SR1 5μM
UM171 350nM
PGE2 10μM
GW9662 1μM
FLU 1μM
表6：第三輪篩選
小分子抑制劑名稱 測試濃度
SAHA 1μM
Vitamin C 5μg/ml, 25μg/ml, 50μg/ml
EPZ004777 0.5μM, 5μM, 10μM
Forskolin 5μM, 10μM, 20μM
CPI-455 1μM, 5μM, 10μM
DZNeP 10nM, 50nM, 250nM
CHIR-99021 1μM, 3μM, 10μM
Butyrate 50μM, 250μM,500μM,
SB203580 1μM, 5μM, 10μM
IWP-2 1μM, 5μM, 10μM
IWR-1-endo 1μM, 5μM, 10μM
JNK-inhibitor iX 1μM, 5μM, 10μM
Dibutyryl-cAMP 1μM, 5μM, 10μM
Thiazovivin 1μM, 5μM, 10μM
IMR-1 1μM, 5μM, 10μM
SB431542 1μM, 5μM, 10μM
Quercetin 0.5μM, 1μM, 5μM
表7：第四輪篩選
小分子抑制劑名稱 測試濃度
SAHA 1μM
Dasatinib 0.5μM 5μM 10μM
SGC0496 1μM 5μM 10μM
JNK-IN-8 1μM 2μM 10μM
Enzastaurin(LY317615) 1μM 5μM 10μM
表8：第五輪篩選
小分子抑制劑名稱 測試濃度
SAHA 1μM
Valproic acid 100μM 500μM 1000μM
Valpromide 100μM 500μM 1000μM
AZD5438 1μM 5μM 10μM
Go 6983 1μM 5μM 10μM
Sodium succinate 5μM 10μM 50μM
Sodium dichloroacetate (DCA) 0.1mM 1mM 5mM
Salubrinal 1μM 5μM 10μM
CPI-613 5μM 10μM 50μM
ISRIB(trans-isomer) 1μM 5μM 10μM
Acetylcysteine 1μM 5μM 10μM
GSK2606414 10nM 50nM 100nM
DMOG 1μM 5μM 10μM
Metronidazole 1μM 5μM 10μM
DHT 1nM 5nM 50nM
Nocodazole 1μM 5μM 10μM
Vinblastine sulfate 1μM 5μM 10μM
Epigallocatechin Gallate 1μM 5μM 10μM
Deferoxamine mesylate: 10nM 50nM 500nM
Epicatechin gallate 10nM 50nM 500nM
Colchicine 50nM 500nM 1000nM
Y27632 5μM 10μM 20μM
實施例 5 ：雙分子組合篩選
在實施例1中分選出來的臍帶血來源的CD34+細胞上，以實施例2相同的方法進行小分子抑制劑維持HSCs幹性的最佳雙分子組合篩選，小分子組合誘導6-7天後，用與實施例3相同的方法流式細胞儀檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達。
根據上述實施例4篩選的能夠顯著維持HSCs幹性的小分子SAHA，將其與其他抑制劑進行組合，具體組合及其使用濃度見相關附圖，其結果分別如圖7-圖11所示。
圖7結果表明，在HSCs幹性維持和CD34+細胞比例方面，SAHA與表4中4種造血幹細胞擴增有關的細胞信號傳導通路中作用的抑制劑的組合SAHA+SR1、SAHA+VE821、SAHA+PFI-3、SAHA+S-4-A對比沒有顯著優於SAHA單獨使用。
圖8結果表明，在維持HSCs幹性方面，前述文獻中報導的抑制劑，即表5中的抑制劑SR1，UM171，PGE2，GW9662，FLU單獨使用效果遠低於SAHA，與SAHA組合效果也低於SAHA單獨使用。在維持CD34+細胞比例方面，SAHA單獨使用與這些抑制劑和SAHA組合使用也沒有顯著差異。
圖9結果表明，在維持HSCs幹性方面，SAHA與表6中的Butyrate組合中，Butyrate低濃度使用效果不如SAHA單獨使用，Butyrate高濃度使用效果優於SAHA單獨使用，但是高濃度條件下，Butyrate對細胞毒性大，而且如實施例4中所得結果表明Butyrate單獨使用效果不如SAHA單獨使用，且其與SAHA為相同靶點抑制劑，故後續不對Butyrate做進一步研究。SAHA與表6中的EPZ004777和DZNeP分別組合，SAHA+EPZ004777和SAHA+DZNeP組合優於SAHA單獨使用。在維持CD34+細胞比例方面，這些雙分子組合與SAHA單獨使用並無顯著差異。因此，篩選出SAHA+EPZ004777和SAHA+DZNeP組合能夠很好的維持HSCs幹性和CD34+細胞比例。
圖10結果表明，在維持HSCs幹性方面，SAHA與表7中的4種小分子抑制劑分別組合，SAHA+Dasatinib組合和SAHA+JNK-IN-8組合的效果是SAHA單獨使用的3倍，是Mock組的30倍。在維持CD34+細胞比例方面，SAHA+Dasatinib組合和SAHA+JNK-IN-8組合與SAHA單獨使用無顯著差異，高於Mock組5%-10%。在單分子篩選中能夠較好維持LT-HSCs幹性的小分子Enzastaurin與SAHA組合後，其效果遠不如SAHA單獨使用，後續未再對Enzastaurin與SAHA的組合做進一步研究。因此，篩選出SAHA+Dasatinib和SAHA+JNK-IN-8組合在維持HSCs幹性方面，同時維持CD34+細胞比例方面效果較好。
圖11結果表明，在維持幹性方面，SAHA與表8中的VPA組合，SAHA+VPA組合的效果高於SAHA單獨使用約2-4倍，高於Mock組20倍。在維持CD34+細胞比例方面，SAHA+VPA組合與SAHA單獨使用無明顯差異，比Mock組高10%-20%。
綜上所述，在雙分子篩選中，共篩選出能夠維持LT-HSCs幹性和CD34+細胞比例的組合有SAHA+Dasatinib、SAHA+DZNeP、SAHA+EPZ004777、SAHA+JNK-IN-8、SAHA+VPA。
實施例 6 ：三分子組合篩選
在實施例1中分選出來的臍帶血來源的CD34+細胞上，以實施例2相同的方法進行小分子抑制劑維持HSCs幹性的最佳三分子組合篩選，小分子組合誘導6-7天後，用與實施例3相同的方法流式細胞儀檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達。
（1）將實施例5中篩選的能夠維持HSCs幹性的組合SAHA+EPZ004777，SAHA+DZNeP進行三分子組合，其結果如圖12所示。
圖12結果表明，在維持HSCs幹性方面，SAHA+EPZ004777+DZNeP三分子組合高於Mock組約20倍，高於SAHA單獨使用和SAHA+EPZ004777雙分子組合約2倍，略高於SAHA+DZNeP雙分子組合。在維持CD34+細胞比例方面，三分子組合以及雙分子組合與Mock組有顯著性差異，CD34+細胞比例均為80%左右。
（2）將實施例5中篩選的能夠維持HSCs幹性的組合SAHA+EPZ004777，SAHA+DZNeP，SAHA+JNK-IN-8，SAHA+Dasatinib進行三分子組合，其結果分別如圖13和圖14所示。
圖13結果表明，在維持HSCs幹性方面，SAHA+JNK-IN8組合效果不如SAHA+Dasatinib，後續不對SAHA+JNK-IN8做進一步研究。SAHA +Dasatinib+EPZ004777與SAHA+Dasatinib相比無顯著性差異，其他三分子組合在維持LT-HSCs幹性方面效果不如SAHA+Dasatinib。在維持CD34+細胞比例方面，SAHA+Dasatinib維持CD34+細胞比例約80%。
圖14結果表明，根據實施例5中篩選的能夠維持HSCs幹性的雙分子組合SAHA+Dasatinib、SAHA+VPA進行重新組合。在維持HSCs幹性方面，SAHA+VPA+Dasatinib三分子組合效果是Mock組的50倍，是雙分子組合的1.5-2倍。在維持CD34+細胞比例方面，SAHA+VPA+Dasatinib三分子組合高於Mock組20%。
綜上所述，大部分三分子組合在維持LT-HSCs幹性方面，其效果不如雙分子組合SAHA+Dasatinib，三分子組合中效果較好的組合是SAHA+EPZ004777+DZNeP、SAHA+Dasa+VPA。
實施例 7 ：已篩抑制劑 SAHA 、 VPA 、 Dasatinib 和文獻報導抑制劑 UM171 ， SR1 單獨使用和組合使用的比較
在實施例1中分選出來的臍帶血來源的CD34+細胞上，以實施例2相同的方法進行已篩抑制劑SAHA、VPA、Dasatinib與文獻(Fares I, et al. Science.2014； Boitano A E，et al.Science.2010；)報導抑制劑UM171，SR1單獨使用和組合使用的比較。小分子抑制劑誘導6-7天後，用與實施例3相同的方法流式細胞儀檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達，其結果如圖15所示。
圖15結果表明，在維持HSCs幹性方面，小分子單獨使用時，SAHA、VPA比SR1、UM171高2-5倍。雙分子組合中，SAHA+Dasatinib和VPA+Dasatinib比SAHA+SR1，SAHA+UM171高1.5-2倍。三分子組合SAHA+DZNeP+EPZ004777略低於SAHA+Dasatinib和VPA+Dasatinib。在維持CD34+細胞比例方面，單分子SAHA、VPA與雙分子組合SAHA+Dasatinib、VPA+Dasatinib之間無顯著差異，CD34+細胞比例均在80%左右。
綜上所述，在維持LT-HSCs幹性方面和CD34+細胞比例方面，雙分子組合SAHA+Dasatinib和VPA+Dasatinib效果優於小分子單獨使用、雙分子組合SAHA+SR1和SAHA+UM171以及三分子組合SAHA+DZNeP+EPZ004777。
實施例 8 ： CD34+ 造血幹細胞集落形成培養
本實施例通過集落形成單位(Colony-Forming Unit，CFU)檢測臍血來源的造血幹細胞經過小分子抑制劑誘導後的體外功能進行定性和定量檢測，驗證其體外分化潛能。
首先，分裝100mL培養基MethoCult™ H4034 Optimum(stem cell,貨號：04034)，然後在2-8℃過夜解凍。劇烈搖晃1-2 min後靜置10 min，待氣泡浮升至液面。將50mL注射器針頭緊套在5mL一次性注射器後，吸取培養基至1mL，全部推出注射器以排盡注射器內氣體，重新吸取3mL分裝至每個15mL離心管(Corning，貨號：430791)。2-8℃保存1個月，-20℃長期保存，切勿反復凍融。
準備3mL培養基MethoCult™ H4034 Optimum，然後在室溫(15-25℃)或2-8℃過夜解凍。
進行細胞接種。取小分子抑制劑誘導後擴增培養7天後的細胞 (臍血來源的經小分子抑制劑誘導後的CD34+造血幹細胞)懸液細胞計數，根據計數結果吸取100倍接種密度的細胞懸液 (例如，接種密度100 cells/孔/3ml，應收集10000 cells)，加入到1ml的2% FBS (Gibco，貨號：16000-044)-IMDM(Gibco，貨號：12440-053)培養基中，混勻備用。將上述細胞混勻後吸取50μl細胞懸液加入到0.5mL IMDM (2% FBS)重懸細胞 (相當於將細胞懸液稀釋10倍)，混勻後，取出100μl細胞懸液(100個細胞)加入到3mL MethoCult™ H4034 Optimum中。渦旋至少4s後靜置10min，待氣泡浮升至液面。3 cc Syringes (Stem cell, 貨號：28240)與Blunt-End Needles 16 Gauge (Stemcell，貨號：28110)配合使用，吸取所得細胞懸液至1mL，全部推出注射器以排盡注射器內氣體，重新吸取所得全部細胞懸液，向SmsrtDishTM-6 (stem cell，貨號：27370，6孔板)一個孔注入3mL，緩慢傾斜6孔板使細胞懸液均勻鋪滿孔底部。按上述接種完所有細胞後，將6孔板各孔間隙內補加無菌PBS 3ml，防止培養基乾涸。將6孔板蓋好蓋子後放入二氧化碳培養箱 (Thermo，型號：3111)，37℃，5%CO2，95%相對濕度，培養14天。
於培養第7, 14天進行觀察集落，培養14天後用STEMgridTM-6計數網格(stem cell，貨號：27000)進行克隆計數。集落的判定標準如下（不同分類的集落可反應出HSCs集落形成能力，維持幹性的能力）：
CFU-GEMM(CFU-G、CFU-E、CFU-MM)：粒細胞-紅細胞-巨噬細胞-巨核細胞集落形成單位。一個集落內包含紅細胞和20個或更多個非紅細胞(粒細胞、巨噬細胞和/或巨核細胞)，通常集落中心有紅細胞，周圍有非紅細胞，非紅細胞也可以集中在紅細胞的一側。CFU-GEMM的集落通常比CFU-GM或BFU-E的集落大。在大多數細胞樣本中比較少見(通常占集落總數的10%)。
CFU-GM：含有超過20個以上粒細胞(CFU-G)和/或巨噬細胞(CFU-M)的集落。不顯現紅色或棕色，集落內個體細胞通常可以區分，特別是在集落邊緣，大的集落可能有一個或多個密集的暗核。該集落生長及分化不需要促紅細胞生成素(EPO)。
BFU-E：爆發紅細胞集落形成單位，形成單個或多個細胞簇組成的集落，每個集落包含＞200個成熟紅細胞。當細胞被血紅蛋白化時呈現紅色或棕色，難以區分每簇內的單個細胞，BFU-E是更加不成熟的祖細胞，它的生長需要紅細胞生成素(EPO)和其他細胞因數，尤其是白介素3(IL-3)和幹細胞因數(SCF)，以促進其集落的最佳生長。
CFU-E：紅細胞集落形成單位，可形成1-2個包含有8-200個紅細胞的細胞簇，當細胞被血紅蛋白化時呈現紅色或棕色，在集落內難區分單個細胞。CFU-E是成熟的紅細胞系的祖細胞，需要促紅細胞生成素(EPO)促進其分化。
實施例 9 ：已篩抑制劑 SAHA 、 VPA 、 Dasatinib 和文獻報導抑制劑 UM171 ， SR1 單獨使用和組合使用的體外克隆形成能力的比較
在實施例1中分選出來的臍帶血來源的CD34+細胞上進行已篩抑制劑SAHA、VPA、Dasatinib與文獻報導抑制劑UM171，SR1單獨使用和組合使用的體外克隆形成能力的比較。小分子抑制劑處理細胞，7天後，以實施例8相同的方法進行體外克隆(CFU)形成檢測，接種細胞14天後統計克隆數目，並對CFU-GEMM進行分析，其結果如圖16所示，其中，BFU-E、CFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM代表紅系、髓系、淋巴系等血液系統不同譜系的克隆。
圖16結果表明，在總克隆數量方面，VPA+Dasatinib組合效果明顯優於其他組合。在由LT-HSCs分化形成的GEMM克隆數目方面，VPA+Dasatinib組合顯著優於已知文獻(Fares I, et al. Science.2014； Boitano A E，et al.Science.2010；)中報導的小分子抑制劑單獨和與SAHA組合使用（優於SR1、UM171、SAHA+SR1、SAHA+UM171）。VPA+Dasatinib與SAHA+Dasatinib相比，前者效果更好。SAHA+DZNeP+EPZ004777在總克隆和GEMM克隆數量上遠不如VPA+Dasatinib和SAHA+Dasatinib。
綜上所述，在體外克隆形成能力方面，VPA+Dasatinib和SAHA+ Dasatinib組合優於已知文獻報導的小分子SR1，UM171單獨和與SAHA的組合使用。
實施例 10 ： Src通路抑制劑效果驗證
在實施例1中分選出來的臍帶血來源的CD34+細胞上，以實施例2相同的方法進行Src靶點的其他小分子抑制劑的篩選，小分子組合誘導6-7天後，用與實施例3相同的方法上機流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達，其結果如圖17所示，其中，本輪篩選的小分子抑制劑及濃度見表9。
表9：Src通路抑制劑及選用濃度
小分子抑制劑名稱 測試濃度
SAHA 1μM
UM-164 1μM 5μM 10μM
KX2-391 10nM 50nM 100nM
KX1-004 10μM 50μM 100μM
圖17結果表明，在維持LT-HSCs幹性方面，Src靶點的抑制劑UM-164的效果是SAHA的5倍，Src靶點的其他抑制劑KX1-004效果與SAHA無明顯差異。在維持CD34+細胞比例方面，UM164和SAHA無明顯差異，CD34+比例維持在80%左右。以上結果說明Src作為一個新的靶點在維持HSCs幹性方面起到了很重要的作用。與HDAC靶點的抑制劑組合，Src靶點抑制劑在維持HSCs幹性以及促進HSCs擴增方面的作用進一步加強。
實施例 11 ： 已篩抑制劑Dasatinib和文獻報導抑制劑UM171，SR1對造血幹細胞體外擴增以及幹性維持能力的比較
在實施例1中分選出來的臍帶血來源的CD34+細胞上進行已篩抑制劑Dasatinib與文獻報導抑制劑UM171，SR1體外擴增以及幹性維持能力的比較。小分子抑制劑誘導6-8天後，用與實施例3相同的方法流式細胞儀檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達，分別在培養2天、4天、6天、8天時取20μL細胞懸液至細胞計數儀(Nexcelom，型號：Cellometer K2)中計數，並計算第8天最終的CD34+細胞以及LT細胞的絕對數量（細胞絕對數量=細胞比例*總細胞數量），其結果如圖18所示。
圖18的結果表明，在維持幹性方面，Dasatinib顯著好於SR1和UM171,其效果是SR1的1.2倍左右，UM171的2.8倍左右。LT細胞的絕對數量Dasatinib組沒有明顯好於SR1組，與UM171組差不多。在維持CD34+細胞比例方面，Dasatinib在處理細胞8天後CD34+細胞比例維持在40%左右，而SR1維持在65%左右，UM171維持在40%左右，Dasatinib組CD34+細胞的絕對數量並沒有顯著好於SR1和UM171。
實施例 12 ：已篩抑制劑Dasatinib和文獻報導抑制劑SR1對造血幹細胞體內移植效果驗證
在實施例1中分選出來的臍帶血來源的CD34+細胞上，進行已篩選小分子抑制劑Dasatinib，以及文獻報導抑制劑SR1單獨使用的體內造血系統重建能力的比較。本實施例中所使用的小分子抑制劑濃度及分組見表10。
表10 小分子抑制劑濃度
組別 小分子抑制劑使用濃度
Mock ——
SR1 5μM
Dasatinib 50nM
配製細胞培養基：SFEMII培養基+50ng/ml生長因數Flt-3L+50ng/ml生長因數SCF+50ng/ml生長因數TPO+10ng/ml生長因數IL-6+1%雙抗，所用培養基、生長因數、雙抗等貨號與實施例2中所述一致，根據表10中設置的組別，加入不同的小分子抑制劑。
將配製好的細胞培養基加入到24孔板中，每孔950μl，放置在二氧化碳培養箱中預熱；將實施例1中備用的HSCs用SFEMII+50ng/ml Flt-3L+50ng/ml SCF+50ng/ml TPO+10ng/ml IL-6 +1%雙抗重懸，按照每孔50ul細胞懸液，每孔細胞密度為1*10^5/ml計算所加的培養基體積；從培養箱中拿出預熱好的培養基，每孔中加入50μl細胞懸液，混勻後，顯微鏡下觀察細胞狀態，然後放入培養箱中培養。每只小鼠移植的起始培養細胞量為1*10^5/只，則24孔板中每個孔所擴增的細胞可移植一隻小鼠。細胞培養過程中隔天計數，技術方法及細胞計數儀與實施例1一致，保證細胞密度不超過8*10^5/ml，如細胞過密，則及時分孔，並添加新鮮培養基。
小分子抑制劑處理細胞7天後，用與實施例3相同的方法上機流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達。
準備小鼠，每個組別設置8只小鼠。小鼠購自北京維通達生物技術有限公司，品系為NPG（NOD-Prkdcscid ll2rgnull /Vst），6周齡，雌鼠，小鼠之間體重克差控制在3g內。小鼠進行細胞移植之前經過半致死劑量輻照，輻照劑量為1.6Gy。
收集培養的細胞懸液（起始培養細胞量為1*10^5/ml），400g離心5min，棄上清，用100μl生理鹽水（1%HSA）重懸，尾靜脈注射一隻經輻照的NPG小鼠，不同組別小鼠做好標記。
細胞移植小鼠後，分別在第4周、第8周、第12周採集小鼠外周血，進行流式檢測human CD45比例；第16周處死小鼠，採集小鼠外周血、骨髓細胞和脾臟細胞，進行流式檢測human CD45、human CD19、human CD3、human CD33和human CD56比例。本實施例中所用抗體、7-AAD染料及來源參見表11。
表11：抗體及7-AAD
抗體名稱 廠家 貨號
FITC anti-mouse CD45 Biolegend 103108
APC/Cy7 anti-human CD45 Biolegend 304014
Brilliant Violet 510™ anti-human CD3 Biolegend 300448
PE anti-human CD19 Biolegend 363004
Brilliant Violet 421™ anti-human CD33 Biolegend 303416
APC anti-human CD56 Biolegend 304610
7-AAD Viability Staining Solution Biolegend 420404
流式檢測小鼠外周血human CD45比例，設置的細胞檢測組別參見表12。
表12：
組別 細胞數量 添加抗體名稱 抗體量
NC 2×10^5 -- --
樣本 2×10^5 APC/Cy7 anti-human CD45 FITC anti-mouse CD45 2μl 2μl
準備1X紅細胞裂解液：取5ml RBC Lysis/Fixation Solution 10×儲存液（Biolegend，貨號：422401），加45ml去離子水(Edigene，0.22μm濾膜過濾)，混勻，配製成1X紅細胞裂解液。
採集小鼠外周血（約100μl），按照表12設置的組別加入抗體。渦旋混勻，室溫避光孵育15min。孵育結束後，在NC和每個樣本中加入1X紅細胞裂解液1.2ml，渦旋混勻，室溫避光裂解15min，期間每隔3min上下顛倒一次樣本離心管。裂解結束後，400g，室溫離心5min。離心結束後，棄上清，在每個實驗樣本中加入1ml含1% HSA的PBS，混勻，400g，室溫離心5min。離心結束後，棄上清，在每個實驗樣本中加入100μl含1% HSA的PBS和5μl 7-AAD染料，渦旋混勻，室溫避光孵育5min。孵育結束後，在NC和每個樣本中加入1ml含1% HSA的PBS，混勻，400g，室溫離心5min。離心結束後，棄上清，在每個實驗樣本中加入100ul含1% HSA的PBS重懸細胞，上機檢測前樣本室溫避光保存。使用流式細胞儀檢測。
檢測結果按如下方法分析：1)目的細胞群為human CD45+細胞群；2)邏輯門及門位置的確定參見圖19所示：首先圈定細胞群，為P1門；來源於P1門的細胞群去除粘連細胞，為P2門；來源於P2門的細胞群用7-AAD圈定活細胞群，為P3門；來源於P3門的細胞群用NC圈定mouse CD45-和human CD45-細胞群（Q2-LL門）；應用NC劃定的門，確定Q2-UL門圈定的細胞為human CD45+目的細胞。人造血幹細胞移植效率用human CD45細胞比例表示，計算方法為human CD45%/（human CD45%+mouse CD45%）。
流式檢測小鼠外周血、骨髓細胞和脾臟細胞human CD45、human CD19、human CD3、human CD33和human CD56比例，設置的細胞檢測組別參見表13。
表13：
組別 細胞數量 添加抗體名稱 抗體量
NC 2×10^5 -- --
樣本 2×10^5 APC/Cy7 anti-human CD45 FITC anti-mouse CD45 Brilliant Violet 510™ anti-human CD3 PE anti-human CD19 Brilliant Violet 421™ anti-human CD33 APC anti-human CD56 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl
採集小鼠外周血（約100μl），按照表13設置的組別加入抗體。後續血樣處理與前述檢測小鼠外周血human CD45比例操作一致。操作結束後使用流式細胞儀進行檢測。
斷頸處死小鼠，取小鼠一側後腿的脛骨和股骨。用眼科剪和眼科鑷操作，分別剪斷脛骨和股骨兩端，露出骨髓腔。用1ml注射器吸取預冷的含1% HSA的PBS，將針頭刺入骨髓腔的一端，用力推注PBS，將骨髓細胞從骨髓腔另一端沖出。脛骨和股骨骨髓腔分別用2ml PBS沖洗。反復吹吸骨髓細胞懸液，用40um細胞篩網（BD，貨號：352340）過濾，400g，室溫離心5min。離心結束後，棄上清，骨髓細胞備用。
斷頸處死小鼠，取小鼠脾臟，置於預冷的含1% HSA的PBS中。用眼科剪剪碎脾臟，用移液器反復吹吸脾臟組織懸液，用40μm細胞篩網過濾，400g，室溫離心5min。離心結束後，棄上清，脾臟細胞備用。
在備用的骨髓細胞和脾臟細胞中加入1X紅細胞裂解液1ml，渦旋混勻，室溫裂解15min，期間每隔3min上下顛倒一次樣本離心管。裂解結束後，在每個樣本中加入4ml含1% HSA的PBS，400g，室溫離心5min。離心結束後，棄上清，在每個樣本中加入1ml含1% HSA的PBS，渦旋混勻。每個樣本中各取100μl細胞懸液，按照表13的組別加入抗體，渦旋混勻，室溫避光孵育15min。孵育結束後，在每個實驗樣本中加入5μl 7-AAD染料，渦旋混勻，室溫避光孵育5min。孵育結束後，在NC和每個樣本中加入1ml含1% HSA的PBS，混勻，400g，室溫離心5min。離心結束後，棄上清，在每個實驗樣本中加入100μl含1% HSA的PBS重懸細胞，上機檢測前樣本室溫避光保存，使用流式細胞儀檢測。
檢測結果按如下方法分析：1)目的細胞群為human CD45+細胞群，human CD19+細胞群，human CD3+細胞群，human CD33+細胞群，以及human CD56+細胞群；2)邏輯門及門位置的確定參見圖20所示：首先圈定細胞群，P1門；來源於P1門的細胞群去除粘連細胞，為P2門；來源於P2門的細胞群用7-AAD圈定活細胞群，為P3門；來源於P3門的細胞群用NC圈定mouse CD45+（P4門）和human CD45+細胞群（P5門）；來源於P5門的細胞群用NC圈定human CD33+（P6門）和human CD56+細胞群（P7門）；來源於P5門的細胞群用NC圈定human CD19+（P8門）和human CD3+細胞群（P9門）。人造血幹細胞移植效率用human CD45細胞比例表示，計算方法為human CD45%/（human CD45%+mouse CD45%）。人造血幹細胞在小鼠體內分化為各譜系血細胞的效率用human CD19%（代表B細胞），human CD3%（代表T細胞），human CD33%（代表髓系細胞），human CD56%（代表NK細胞）表示。
圖21結果表明，小鼠移植的起始培養細胞量一致的情況下，Dasatinib處理的細胞在第8周、第12周、第16周外周血檢測中，移植效率顯著高於Mock組和SR1組。在第16周的骨髓和脾臟檢測中，Dasatinib處理的細胞組移植效率顯著高於SR1組。證明Dasatinib可提高造血幹細胞的移植能力，效果優於文獻報導的小分子SR1。
圖22結果表明，小鼠移植後第16周外周血、骨髓、脾臟中，可以檢測到人源的T細胞、B細胞、髓系細胞和NK細胞，各譜系細胞在每組中的比例差別不明顯，證明人源造血幹細胞不僅成功移植，還能分化生成各譜系細胞，具有正常的分化功能。
無
圖1顯示了目的細胞群CD34+CD45+CD45RA-CD90+CD38-細胞群的邏輯門及門位置的確定。 圖2顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子抑制劑的最佳濃度以及能夠維持HSCs幹性的第一輪篩選，表4中小分子抑制劑(每種小分子測試4個濃度)誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。 圖3顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子抑制劑的最佳濃度以及能夠維持HSCs幹性的第二輪篩選，表5中小分子抑制劑誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。 圖4顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子抑制劑的最佳濃度以及能夠維持HSCs幹性的第三輪篩選，表6中小分子抑制劑(除SAHA-1μM外，每個抑制劑測試3個濃度)誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。 圖5顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子抑制劑的最佳濃度以及能夠維持HSCs幹性的第四輪篩選，表7中小分子抑制劑(除SAHA-1μM外，每個抑制劑測試3個濃度)誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。 圖6顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子抑制劑的最佳濃度以及能夠維持HSCs幹性的第五輪篩選，表8中小分子抑制劑(除SAHA-1μM外，每個抑制劑測試3個濃度)誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。 圖7顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子抑制劑維持HSCs幹性的最佳雙分子組合的第一輪篩選，小分子組合SAHA+SR1、SAHA+VE821、SAHA+PFI3、SAHA+S-4-A誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。 圖8顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子抑制劑維持HSCs幹性的最佳雙分子組合的第二輪篩選，小分子組合SAHA+SR1，SAHA+UM171，SAHA+PGE2，SAHA+GW9662，SAHA+FLU誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。 圖9顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子抑制劑維持HSCs幹性的最佳雙分子組合的第三輪篩選，小分子組合SAHA+Butyrate，SAHA+EPZ004777，SAHA+DZNeP，SAHA+Vitamin C(除SAHA外，每個抑制劑測試3個濃度)誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。S代表SAHA(1μM)。 圖10顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子抑制劑維持HSCs幹性的最佳雙分子組合的第四輪篩選，小分子組合SAHA+Dasatinib，SAHA+SGC0496，SAHA+JNK-IN-8，SAHA+Enzastaurin(LY317615) (除SAHA外，每個抑制劑測試3個濃度)誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。S代表SAHA(1μM)。 圖11顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子抑制劑維持HSCs幹性的最佳雙分子組合的第五輪篩選，小分子組合SAHA+VPA、SAHA+Go6983、SAHA+DCA、SAHA+GSK2606414(除SAHA外，每個抑制劑測試2-3個濃度)誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。S代表SAHA(1μM)。 圖12顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子抑制劑維持HSCs幹性的最佳三分子組合的第一輪篩選，小分子組合SAHA+EPZ004777+DZNeP誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。每組3個重複，*代表具有顯著性差異。 圖13顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子抑制劑維持HSCs幹性的最佳三分子組合的第二輪篩選，小分子組合SAHA+Dasatinib+EPZ004777、SAHA+JNK-IN-8+EPZ004777、SAHA+JNK-IN-8+DZNeP、SAHA+JNK-IN-8+Dasatinib、SAHA+JNK-IN-8+EPZ004777+DZNeP誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑的組合名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。每組3個重複，*代表具有顯著性差異。 圖14顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子抑制劑維持HSCs幹性的最佳三分子組合的第三輪篩選，小分子組合SAHA+VPA+Dasatinib誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45 RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑的組合名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。每組3個重複，*代表具有顯著性差異。 圖15顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行已篩選小分子抑制劑與文獻報導小分子抑制劑SR1、UM171的比較。小分子抑制劑誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑組合名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。每組3個重複，*代表具有顯著性差異。 圖16顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行已篩選小分子抑制劑與文獻報導小分子抑制劑SR1、UM171體外克隆形成能力的分析圖。BFU-E、CFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM代表紅系、髓系、淋巴系等血液系統不同譜系的克隆。其中，橫坐標代表抑制劑組合名稱以及使用濃度，縱坐標colonies number代表總克隆數，colonies number of GEMM代表CFU-GEMM克隆數量。每組3個重複，*代表具有顯著性差異。S代表SAHA(1μM)。 圖17顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子抑制劑的最佳濃度以及能夠維持HSCs幹性的篩選，表9中小分子抑制劑(除SAHA-1μM外，每個抑制劑測試3個濃度)誘導6-7天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+/CD45+/CD90+/CD45 RA-/CD38-)表達分析圖，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。 圖18A、圖18C顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子Mock（DMSO）、SR1(5μM)、UM171(350nM)、Dasatinib(50nM)處理8天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，其中，橫坐標代表抑制劑的名稱，縱坐標CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表LT-HSCs占所有細胞的比例，CD34+CD45+(%)代表HSCs純度。圖18B、圖18D顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子Mock（DMSO）、SR1(5μM)、UM171(350nM)、Dasatinib(50nM)處理8天後LT-HSCs以及CD34+細胞增殖的絕對數量，其中，橫坐標代表抑制劑的名稱，縱坐標代表細胞的數量。 圖19顯示了hCD45+以及mCD45+細胞群的邏輯門及門位置的確定。其中，NC代表未加抗體的對照，33代表加入抗體的第33號樣本，hCD45代表人源的CD45+細胞，mCD45代表鼠源的CD45+細胞。 圖20顯示了hCD45+、hCD3+、hCD33+、hCD56+、hCD19+以及mCD45+細胞群的邏輯門及門位置的確定。其中，hCD3+代表人源的CD3+細胞，是T淋巴細胞的一種表面標誌物。hCD33+代表人源的CD33+細胞，是髓系細胞的一種表面標誌物。hCD56+代表人源的CD56+細胞，是自然殺傷細胞（NK細胞）的一種表面標誌物。hCD19+代表人源的CD19+細胞，是B淋巴細胞的一種表面標誌物。mCD45代表鼠源的CD45+細胞。 圖21顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子Mock（DMSO）、SR1（5μM）、Dasatinib(50nM)處理7天後，收集所有細胞並移植小鼠體內，在移植後第4周、8周、12周和16周流式檢測小鼠外周血中人源的CD45細胞比例，在移植後第16周流式檢測小鼠骨髓和脾臟中人源的CD45細胞比例。圖21A橫坐標代表抑制劑的名稱以及移植時間，縱坐標hCD45-PB(%)代表在小鼠外周血中檢測到的人源的CD45+細胞的比例。PB代表外周血（Peripheral Blood），hCD45代表人源的CD45+細胞。圖21B橫坐標代表抑制劑的名稱，縱坐標hCD45-BM(%)代表在小鼠骨髓中檢測到的人源的CD45+細胞的比例。BM代表骨髓（Bone Marrow），hCD45代表人源的CD45+細胞。圖21C橫坐標代表抑制劑的名稱，縱坐標hCD45-SP(%)代表在小鼠脾臟中檢測到的人源的CD45+細胞的比例。SP代表脾臟（Spleen），hCD45代表人源的CD45+細胞。 圖22顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子Mock（DMSO）、SR1（5μM）、Dasatinib(50nM)處理7天後，收集所有細胞並移植小鼠體內，在移植後16周流式檢測小鼠外周血、骨髓、脾臟中人源的hCD3+、hCD33+、hCD56+、hCD19+細胞比例，分別代表人源的T淋巴細胞（T）、髓系細胞（My）、自然殺傷細胞（NK）、B淋巴細胞（B）。其中，橫坐標代表抑制劑的名稱，圖22A縱坐標代表在外周血中不同譜系細胞占hCD45+細胞的比例。圖22B縱坐標代表在骨髓中不同譜系細胞占hCD45+細胞的比例。圖22C縱坐標代表在脾臟中不同譜系細胞占hCD45+細胞的比例。

Claims (31)

  1. 一種促進HSCs增殖並維持HSCs幹性的方法，包括使HSCs體外接觸含有STAT細胞信號傳導通路的小分子抑制劑或者其它細胞信號通路小分子抑制劑的培養液。
  2. 如請求項1所述的方法，所述含有STAT細胞信號傳導通路的小分子抑制劑為Src靶點的小分子抑制劑。
  3. 如請求項2所述的方法，所述Src靶點的小分子抑制劑選自如下的一種或多種：Dasatinib、Quercetin、UM-164、KX2-391和KX1-004。
  4. 如請求項2或請求項3所述的方法，其中所述Src靶點的小分子抑制劑與所述其它細胞信號通路小分子抑制劑聯合使用。
  5. 如請求項4所述的方法，其中，所述其它細胞信號通路小分子抑制劑選自以HDAC為靶點的小分子抑制劑、以PKC為靶點的小分子抑制劑和以JNK為靶點的小分子抑制劑中的一種或兩種以上。
  6. 如請求項5所述的方法，其中，所述Src靶點的小分子抑制劑與以HDAC為靶點的小分子抑制劑、以PKC為靶點的小分子抑制劑或以JNK為靶點的小分子抑制劑聯合使用。
  7. 如請求項6所述的方法，其中，所述Src靶點的小分子抑制劑與以HDAC為靶點的小分子抑制劑VPA、以HDAC為靶點的小分子抑制劑SAHA、以PKC為靶點的小分子抑制劑Enzastaurin或以JNK為靶點的小分子抑制劑JNK-IN-8聯合使用。
  8. 如請求項7所述的方法，其中，所述Src靶點的小分子抑制劑為Dasatinib。
  9. 如請求項8所述的方法，其中，Dasatinib與VPA或SAHA聯合使用。
  10. 如請求項2至請求項8中任一項所述的方法，其中所述Src靶點的小分子抑制劑單獨或與其它抑制劑的聯合使用維持具有CD34+CD45+CD90+CD45 RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例超過8%、10%、15%、20%、25%或30%。
  11. 如請求項2至請求項9中任一項所述的方法，其中所述Src靶點的小分子抑制劑單獨或與其它抑制劑的聯合使用維持CD34+細胞占全部細胞中的比例超過65%、70%、75%、80%或85%。
  12. 一種用於維持HSCs幹性的組合物，包括含有STAT細胞信號傳導通路的小分子抑制劑。
  13. 如請求項12所述的組合物，其中，所述含有STAT細胞信號傳導通路的小分子抑制劑為Src靶點的小分子抑制劑。
  14. 如請求項13所述的組合物，其中，所述Src靶點的小分子抑制劑選自如下的一種或多種：Dasatinib、Quercetin、UM-164、KX2-391和KX1-004。
  15. 如請求項13至請求項14中任一項所述的組合物，所述組合物更包括其它細胞信號通路小分子抑制劑。
  16. 如請求項15所述的組合物，其中，所述其它細胞信號通路小分子抑制劑包括以HDAC為靶點的小分子抑制劑、以PKC為靶點的小分子抑制劑和以JNK為靶點的小分子抑制劑。
  17. 如請求項16所述的組合物，其中，所述其它細胞信號通路小分子抑制劑包括以HDAC為靶點的小分子抑制劑VPA、以HDAC為靶點的小分子抑制劑SAHA、以PKC為靶點的小分子抑制劑Enzastaurin和以JNK為靶點的小分子抑制劑JNK-IN-8。
  18. 如請求項12至請求項17中任一項所述的組合物，其中，所述組合物更包括SFEMII培養基、生長因數Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和生長因數IL-6。
  19. 如請求項12至請求項18中任一項所述的組合物，其中，所述組合物維持具有CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例超過8%、10%、15%、20%、25%或30%。
  20. 如請求項12至請求項19中任一項所述的組合物，其中，所述組合物維持CD34+細胞占全部細胞中的比例超過65%、70%、75%、80%或85%。
  21. 一種用於維持HSCs幹性的組合物，包含選自如下的任一組合：SAHA+EPZ004777、SAHA+DZNeP、SAHA+Dasatinib、VPA+Dasatinib、SAHA+JNK-IN-8或SAHA+VPA。
  22. 如請求項21所述的組合物，其中所述組合物維持具有CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例超過8%、10%、15%、20%、25%或30%。
  23. 如請求項21或請求項22所述的組合物，其中所述組合物維持CD34+細胞占全部細胞中的比例超過65%、70%、75%、80%或85%。
  24. 如請求項21至請求項23中任一項所述的組合物，其中，所述組合物更包括SFEMII培養基、生長因數Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和生長因數IL-6。
  25. 一種用於維持HSCs幹性的組合物，包含選自如下的任一組合：SAHA+EPZ004777+DZNeP或SAHA+VPA+Dasatinib。
  26. 如請求項25所述的組合物，其中，所述組合物維持具有CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例超過8%、10%、15%、20%、25%或30%。
  27. 如請求項25或請求項26所述的組合物，其中所述組合物維持CD34+細胞占全部細胞中的比例超過65%、70%、75%、80%或85%。
  28. 如請求項25至請求項27中任一項所述的組合物，其中，所述組合物更包括SFEMII培養基、生長因數Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和生長因數IL-6。
  29. 如請求項17至請求項19中任一項所述的組合物，其中每種抑制劑在培養基中的濃度為： Dasatinib: 0.1μM-50μM，優選為0.5μM-40μM，進一步優選為0.5μM-30μM，最優選為0.5μM-10μM； SAHA: 10nM-20μM，優選為20nM-15μM，進一步優選為30nM-10μM，最優選為0.1μM-10μM； VPA: 10μM-2000μM，優選為10μM-1500μM，進一步優選為10μM-1000μM，最優選為100μM-1000μM； JNK-IN-8:0.1μM-20μM，優選為0.5μM-15μM，進一步優選為0.5μM-10μM，最優選為1μM-10μM； EPZ004777:0.1μM-50μM，優選為0.5μM-40μM，進一步優選為0.5μM-30μM，最優選為0.5μM-10μM； DZNeP：1nM-500nM，優選為5nM-400nM，進一步優選為10nM-300nM，最優選為10nM-250nM； UM-164：0.1μM-1000μM，優選為0.5μM-500μM，進一步優選為1μM-100μM，最優選為1μM-10μM； KX2-391：0.1nM -1000nM，優選為1nM -1000nM，進一步優選為10nM -500nM，最優選為10nM -100nM； KX1-004：0.1μM-1000μM，優選為1μM-1000μM，進一步優選為10μM-500μM，最優選為10μM-100μM。
  30. 如請求項21至請求項24中任一項所述的組合物，其中每種抑制劑在培養基中的濃度為： Dasatinib: 0.1μM-50μM，優選為0.5μM-40μM，進一步優選為0.5μM-30μM，最優選為0.5μM-10μM； SAHA: 10nM-20μM，優選為20nM-15μM，進一步優選為30nM-10μM，最優選為0.1μM-10μM； VPA: 10μM-2000μM，優選為10μM-1500μM，進一步優選為10μM-1000μM，最優選為100μM-1000μM； JNK-IN-8:0.1μM-20μM，優選為0.5μM-15μM，進一步優選為0.5μM-10μM，最優選為1μM-10μM； EPZ004777:0.1μM-50μM，優選為0.5μM-40μM，進一步優選為0.5μM-30μM，最優選為0.5μM-10μM； DZNeP：1nM-500nM，優選為5nM-400nM，進一步優選為10nM-300nM，最優選為10nM-250nM。
  31. 如請求項25至請求項28中任一項所述的組合物，其中每種抑制劑在培養基中的濃度為： Dasatinib: 0.1μM-50μM，優選為0.5μM-40μM，進一步優選為0.5μM-30μM，最優選為0.5μM-10μM； SAHA: 10nM-20μM，優選為20nM-15μM，進一步優選為30nM-10μM，最優選為0.1μM-10μM； VPA: 10μM-2000μM，優選為10μM-1500μM，進一步優選為10μM-1000μM，最優選為100μM-1000μM； EPZ004777:0.1μM-50μM，優選為0.5μM-40μM，進一步優選為0.5μM-30μM，最優選為0.5μM-10μM； DZNeP：1nM-500nM，優選為5nM-400nM，進一步優選為10nM-300nM，最優選為10nM-250nM。
TW109144495A 2019-12-16 2020-12-16 擴增造血幹細胞的小分子化合物及其組合 TW202136503A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2019125687 2019-12-16
WOPCT/CN2019/125687 2019-12-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202136503A true TW202136503A (zh) 2021-10-01

Family

ID=76478496

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109144495A TW202136503A (zh) 2019-12-16 2020-12-16 擴增造血幹細胞的小分子化合物及其組合

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230027247A1 (zh)
EP (1) EP4079842A4 (zh)
JP (1) JP2023507486A (zh)
KR (1) KR20220116508A (zh)
CN (1) CN114787342A (zh)
AU (1) AU2020404285A1 (zh)
CA (1) CA3162030A1 (zh)
TW (1) TW202136503A (zh)
WO (1) WO2021121266A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20212214A1 (es) 2019-04-15 2021-11-19 Edigene Inc Metodos y composiciones para editar acidos ribonucleicos (arn)
AU2020313143B2 (en) 2019-07-12 2024-04-04 Peking University Targeted RNA editing by leveraging endogenous adar using engineered RNAs
KR20230050123A (ko) * 2021-10-07 2023-04-14 삼성전자주식회사 전자 장치 및 그 제어 방법
WO2024200276A1 (en) * 2023-03-29 2024-10-03 Aarhus Universitet Heat-inactivated mesenchymal stem cells and uses thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006298881A1 (en) * 2005-09-21 2007-04-12 4Sc Ag Sulphonylpyrrole hydrochloride salts as histone deacetylases inhibitors
WO2014189781A1 (en) * 2013-05-20 2014-11-27 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Enriched and expanded human cord blood stem cells for treatment of hematological disorders
CN104278008B (zh) * 2013-07-12 2020-08-21 北京宏冠再生医学科技有限公司 一种通过小分子化合物处理来制备多潜能干细胞的方法、试剂盒和用途
CN108060120B (zh) * 2016-11-07 2022-11-04 云南济慈再生医学研究院有限公司 用于分化的细胞重编程的小分子化合物组合、试剂盒及应用
IL273978B2 (en) * 2017-10-27 2024-09-01 Immunebridge Inc Preparations and methods for the production of expanded hematopoietic stem cells using fluorene annealing

Also Published As

Publication number Publication date
EP4079842A1 (en) 2022-10-26
US20230027247A1 (en) 2023-01-26
EP4079842A4 (en) 2024-01-24
CA3162030A1 (en) 2021-06-24
KR20220116508A (ko) 2022-08-23
WO2021121266A1 (zh) 2021-06-24
CN114787342A (zh) 2022-07-22
AU2020404285A1 (en) 2022-07-07
JP2023507486A (ja) 2023-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW202136503A (zh) 擴增造血幹細胞的小分子化合物及其組合
WO2021149799A1 (ja) ヒト造血幹細胞などの血球系細胞を培養するために適した無血清培地および培養方法
CN112980789A (zh) 扩增造血干细胞的小分子化合物及其组合
CN108478599A (zh) 间充质基质细胞及其相关用途
WO2021049617A1 (ja) ヒト造血幹細胞を培養するために適したアルブミンフリーの無血清培地およびアルブミンフリーの培養方法
CN114075547A (zh) 扩增造血干细胞的方法及其组合物
JP2024128116A (ja) 細胞群及びその取得方法
CN110551688B (zh) 一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞且促进造血干/祖细胞体外扩增的组合物及其应用
WO2016117139A1 (ja) 神経系細胞の製造方法
IL256093A (en) Method for proliferation and / or differentiation of hematopoietic stem cells for progenitors and their uses
US20240058387A1 (en) Culture medium composition for amplifying and maintaining self-renewal capacity and differentiation potential of hscs and application thereof
WO2022063226A1 (zh) 化合物用于提高人造血干细胞移植效率的用途
KR20220113422A (ko) 내피에서 조혈로의 이행 동안 최종 계통 선별화를 유도하는 대사작용
KR20110087674A (ko) 내피전구세포의 체외 증폭방법
CN109468277A (zh) 扩增造血干细胞的培养体系、方法及其用途
FI130749B1 (en) USE OF VAP-1 INHIBITOR IN THE EX VIVO CULTURE OF HEMATOPOEITIC STEM CELLS AND IN THE TREATMENT OF BONE Marrow Loss or BONE Marrow Dysfunction
WO2024018018A1 (fr) Utilisation d'un composé vitisine pour la production de cellules hématopoïétiques
Panuganti Towards large-scale production of platelets for transfusion based on ex vivo expansion of megakaryocytes from hematopoietic stem cells
Ghosh Role of S6K1 in regulating self-renewal of hematopoietic stem cells and propagation of leukemia
CN116855450A (zh) 一种体外促进血小板分化的方法
CN109536447A (zh) 扩增造血干细胞的培养体系、方法及其用途
CN109593716A (zh) 扩增造血干细胞的培养体系、方法及其用途
Mostafa Effects of culture oxygen tension on human megakaryocytes: A phenotypic and mechanistic study
Csete Less is more: Oxygen and stem cell regeneration
KR20090065865A (ko) 생착능이 증가된 조혈줄기세포의 제조방법