CN116855450A - 一种体外促进血小板分化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是一种体外促进血小板分化的方法，是在体外人诱导干细胞(hiPSC)生成血小板过程中，在培养基中添加人血浆(hp)或人高血脂血浆(hlp)。本发明结果表明，体内血小板计数与高脂血症相关，体外hiPSCs生成血小板过程中，人血浆(hp)主要促进CD34+造血细胞在8‑14天分化为巨核细胞‑祖细胞(MKPs)。脂肪酸(FA)是促进hipsc来源的巨核细胞(MK)和血小板生成的活性成分，在第14天，FA通过JAK2/STAT/AKT通路激活MKPs中的MK和血小板生成。本发明扩展了血小板分化理论，并提供了一种体外促进血小板分化的方法。

Description

一种体外促进血小板分化的方法
技术领域
本发明涉及医学技术领域，具体地说，是一种体外促进血小板分化的方法。
背景技术
血小板(PLTs)是由骨髓(BM)中的巨核细胞(MKs)及其祖细胞产生的血液中的微小细胞成分，主要负责促进血液凝固和血栓形成，维持血管完整性，参与伤口愈合。临床上输注PLT是预防和治疗血小板减少症的主要手段。但由于储存时间短、供应依赖于献血者等问题导致目前临床PLT输注供需失衡。同时，由于血小板分化机制不明确，体外大量生成血小板的技术受到很大限制。
在经典模型中，造血干细胞(HSCs)逐渐失去自我更新能力，成为多能祖细胞(MPPs)，从而产生造血祖细胞(HPCs)。然后，骨髓谱系中的双能巨核细胞-红细胞(MEP)产生红系祖细胞和单能巨核细胞前体细胞(MKP)。然而最近，这种分化模式引起了争议，而MKP的起源是争论最多的话题之一。已经表明，MK可以从多种途径产生，其中一些途径无需经过必要的多能或双能MEP阶段就可以分化。这些研究表明，HSC包含一个偏向MK潜能的细胞子集，这些潜能直接来自HSC。其他几项研究也提出了造血干细胞(HSC)的MK谱系偏向亚群的概念。Jacobsen小组证明，vWF阳性HSC表现出明显的谱系偏倚重建模式，并具有令人信服的血小板偏倚。Rao组表明JAK2-V617F和干扰素-α可以诱导巨核细胞偏向干细胞。是否还有其他因素影响造血干细胞偏向巨核细胞和血小板分化尚需进一步研究。
BM由造血岛和脂肪细胞组成，周围环绕着血管窦。研究表明，骨髓脂肪细胞(BMAds)可通过调节造血干祖细胞(HSPCs)的生成影响正常的骨髓造血过程，并支持CD34+HSCs向骨髓和淋巴免疫细胞分化。同时，骨髓生成与脂肪生成增加和成骨细胞生成减少呈正相关。在饮食诱导的肥胖小鼠中，造血和淋巴细胞BM细胞群的增加与BM脂肪增加有关。BM中的脂肪分解在运动刺激的成骨和淋巴生成中起着至关重要的作用。考虑到这一关键影响，一些研究关注脂肪细胞增多的BM肥胖是否会影响BM巨核发生。脂肪细胞与骨髓造血祖细胞体外共培养表明，脂肪细胞脱脂可通过促进多倍体、扩大边界膜系统、促进前血小板形成等直接支持MK成熟。
目前，临床对血小板的需求越来越大，迫切需要探索在体内和体外制备血小板的新方法。但到目前为止，对血小板分化和形成的机制还不是很透彻，这也是对人工生成血小板的一大阻力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种体外促进血小板分化的方法。
本发明分析临床数据，利用体外人诱导干细胞(hiPSC)产生的血小板平台检测血浆、高脂血浆和脂肪酸对HSCs、HPCs、MKPs和血小板。本发明的研究结果表明，体内血小板计数与高脂血症相关，体外hiPSCs生成血小板过程中，添加人血浆(hp)主要促进CD34+造血细胞在8-14天分化为巨核细胞-祖细胞(MKPs)。脂肪酸(FA)是促进hiPSC来源的巨核细胞(MK)和血小板生成的活性成分，在第14天，FA通过JAK2/STAT/AKT通路激活MKPs中的MK和血小板生成。本发明扩展了血小板分化理论，并提供了一种体外促进血小板分化的方法。
本发明的第一方面，提供一种体外促进血小板分化的方法，是在体外人诱导干细胞hiPSC生成血小板过程中，在培养基中添加人血浆hp。
进一步的，所述的体外促进血小板分化的方法，具体是在人诱导干细胞hiPSCs分化生成巨核细胞及血小板的过程中，于分化培养第8-14天，在基础分化培养基APEL的基础上添加占培养基的体积比例为20％的人血浆hp，促进人诱导干细胞hiPSC分化为造血祖细胞(HPC)和单能巨核细胞前体细胞(MKP)。
本发明的第二方面，提供一种体外促进血小板分化的方法，是在体外人诱导干细胞(hiPSC)生成血小板过程中，在培养基中添加人高血脂血浆(hlp)。
进一步的，所述的体外促进血小板分化的方法，具体是在hiPSCs分化培养第8-14天，在基础分化培养基APEL的基础上添加占培养基的体积比例为20％的甘油三脂升高为主的人高血脂血浆(TG-hlp)，促进造血祖细胞(HPC)偏向巨核细胞(MK)和血小板分化。
本发明实验发现，TG-hlp的添加可以刺激HPC、MKP的产生、MK的成熟和前血小板的形成。TG-hlp可促进HPC偏向MK和血小板分化。
本发明的第三方面，提供一种体外促进血小板分化的方法，是在体外人诱导干细胞(hiPSC)生成血小板过程中，在培养基中添加脂肪酸。
进一步的，所述的体外促进血小板分化的方法，具体是在hiPSCs分化生成巨核细胞及血小板的过程中，于分化培养第8-14天，在基础分化培养基APEL添加占培养基的体积比例为20％的人血浆(hp)的基础上，添加脂肪酸FA(0.25ml/L)或棕榈酸PA(10μM)，促进hiPSCs来源造血祖细胞(HPC)和巨核细胞(MK)在体外的成熟。
本发明的第四方面，提供人血浆(hp)或人高血脂血浆(hlp)在制备体外促进血小板分化的试剂的应用。
本发明的第五方面，提供脂肪酸在制备体外促进血小板分化的试剂的应用。
本发明优点在于：
本发明提供一种体外促进血小板分化的方法，本发明发现血浆中的脂质促进了HPCs向巨核细胞偏向性的分化，从而促进了血小板的生成，为血小板分化偏向性理论提供了新的证据，为体外生成血小板提供了新的培养条件。
附图说明
图1.血小板与高脂血症相关；
(A)与正常人群(NS)相比，高甘油三酯血症(hyper-TG)、高胆固醇血症(hyper-TC)和混合性高脂血症(HPL)人群中的血小板计数(***P<0.001)；
(B)与NS相比，hyper-TG、hyper-TC和HPL人群中的RBC计数(**P<0.01)；
(C)与NS相比，hyper-TG、hyper-TC和HPL人群中的WBC计数(***P<0.001,**P<0.01)。
图2.人血浆(hp)促进CD34+造血细胞体外分化为MKs；
(A)基于EB的hiPSCs生成MKs方法流程图。
(B)第3-8天来自对照组和不同浓度hp处理(5％、10％、15％、20％、25％、30％和35％)组的CD34+CD45-细胞比例；
(C)第3-8天来自对照组和不同浓度hp处理组(分别为5％、10％、15％、20％、25％、30％和35％)的CD34+CD45+细胞比例；
(D)第14天，hp处理组(5％、10％、15％、20％、25％、30％和35％)和未处理组的相对CD34+CD45+、CD34+CD45-和CD41+细胞计数(***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)；
(E)hp(5％、10％、15％、20％、25％、30％和35％)处理组和未处理组在第14天时，相对CD41+、CD41+CD42a+CD42b-和CD41+CD42a+CD42b+细胞计数。(***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)；
(F)第19天，未经处理、20％hp(第0-4天)处理、20％hp(第0-8天)处理、20％hp(第0-14天)处理、20％hp(第0-19天)处理、20％hp(第8-14天)处理组、20％hp(第8-19天)处理组和20％hp(第14-19天)处理组的总细胞计数(***P<0.001；**P<0.01)；
(G)第19天，未经处理、20％hp(第0-4天)处理、20％hp(第0-8天)处理、20％hp(第0-14天)处理、20％hp(第0-19天)处理、20％hp(第8-14天)处理组、20％hp(第8-19天)处理组和20％hp(第14-19天)处理组的CD41+CD42a+CD42b-相对细胞计数(***P<0.001；**P<0.01)。
图3.人TG高血脂血浆(TG-hlp)在体外促进hiPSC来源MK和潜血小板形成，其中脂肪酸是活性成分；
(A)第14天，对照组、hp处理组和hlp处理组的相对总细胞数、CD34+CD45-、CD34+CD45+和CD41+细胞计数。(***P<0.001；**P<0.01)；
(B)第19天对照组、hp处理组和hlp处理组的相对总细胞数、CD41+和CD41+CD42a+CD42b+细胞计数(***P<0.001；**P<0.01)；
(C)体内血小板计数和TG水平的相关性分析；
(D)hp和hlp中血脂检测的TG水平；
(E)第19天hp(第8-14天)处理组和hlp(第8-14天)处理组的总细胞计数(*P<0.05)；
(F)hp(第8-14天)处理组和hlp(第8-14天)处理组在第19天的相对CD41+CD42a+CD42b+细胞计数(*P<0.05)；
(G)hp(第8-14天)-治疗组和hlp(第8-14天)治疗组在第19天DNA倍性分析(***P<0.001；**P<0.01)；
(H)第14天的PA治疗组、FA治疗组、SSO治疗组和对照组中的相对CD34+CD45+、CD34+CD45-和CD41+细胞计数(***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)；
(I)第19天PA处理组、FA处理组、SSO处理组和对照组的相对总细计数，CD41+和CD41+CD42a+CD42b+细胞计数(***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)。
图4.第14天脂肪酸激活MK祖细胞中的MK和血小板生成相关通路；
(A)第14天来自对照、hp未处理组和hlp处理组的HSC/HPC/MK谱系调节因子表达的热图(FDR<0.05且倍数变化>2)；
(B)KEGG分析第14天来自对照、hp未处理组和hlp处理组的HSC/HPC/MK谱系中基因集的差异表达分子通路(FDR<0.05)；
(C)DEG的散点图，包括CD38、TEK、NGFR、CD44、CD34、KDR、GP5和CD9；
(D-E)Western blotting检测第8天和第14天对照组、hp处理组和hlp处理组CD34+CD45+细胞AKT、ERK1/2、JAK2和STAT3的表达水平。
图5.体外人iPS细胞分化巨核细胞过程中添加不同浓度hp后，流式细胞分析及光学显微镜观察补充数据；
(A)流式细胞仪分析，第14天培养生成的CD34+CD45+、CD34+CD45-和CD41+细胞的门控策略；
(B)第19天，未经处理、20％hp(第0-4天)处理、20％hp(第0-8天)处理、20％hp(第0-14天)处理组，20％hp(第0-19天)处理组、20％hp(第8-14天)处理组、20％hp(第8-19天)处理组和20％hp(第14-19天)处理组的CD41+CD42a+CD42b+的百分比(***P<0.001)；
(C)第14天和第19天未处理组和hp处理组在光学显微镜下EB和细胞的代表性图像。(比例尺＝100μm)。
图6.体外人iPS细胞分化巨核细胞过程中，添加hp或者hlp后第19天流式细胞分析补充数据；
(A)第19天，培养产生的CD41+、CD42a+CD42b-和CD42a+CD42b+细胞的门控策略，如流式细胞仪分析的那样；
(B)第19天，在hp处理组和hlp处理组中产生的CD41+CD42a+CD42b+细胞的百分比。
图7.体外人iPS细胞分化巨核细胞过程中，添加hp或者hlp后第19天流式细胞分子及细胞形态观察补充数据；
(A)Wright-Giemsa染色MKP、MK和血小板hiPSC的代表性图像(比例尺＝10μm)；
(B)第19天，对照组、hp未处理组和hlp处理组中hiPSC来源MK中vWF和CD42b的表达。细胞用vWF(红色)和CD42b(绿色)抗体染色)和DAPI(蓝色)(比例尺＝10μm)；
(C)第19天，ADP处理组和非ADP处理组中产生的CD62P+细胞百分比(***P<0.001)；
(D)第19天，培养的CD62P+细胞的门控策略，如通过流式细胞术分析的那样；
(E)在光学显微镜下培养条件下血小板的灰度和彩色图像观察(比例尺＝50μm)；
(F)在显微镜下观察到的聚集细胞(比例尺＝100μm)。
图8.体外人iPS细胞分化巨核细胞过程第14天基因分析补充数据；
(A)第14天，对照、hp未处理和hlp处理组获得的细胞基因表达的PCA；
(B)对照-hp组和hp-hlp组中共享和差异表达基因数量的维恩图(FDR<0.05和倍数变化>2)；
(C)第14天来自对照、hp未处理和hlp处理组的HSC/HPC/MK谱系基因表达的热图(FDR<0.05和倍数变化>0)；
(D)PPI网络和枢纽基因图；
(E)高血脂血浆对MK和血小板生成的作用机制图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：
1.材料和方法
1.1数据收集
所有患者资料和临床资料均来自海军军医大学第一附属医院2010年9月至2015年7月，包括健康体检中心抽取的400名健康人或个体确诊的高脂血症患者。年龄中位数(四分位距)为58岁(17-75岁)，其中男性282人(70.5％)。详细临床资料见表1。
研究纳入和排除标准见表2。所有参与者都在入院当天或第二天接受了常规血液检查。收集患者的年龄、性别、病史(高血压、糖尿病)、实验室检查(PLT计数、TG、TC等)等基本资料进行统计分析。
表1.基本信息(x±s)
表2.纳入和排除标准
1.2血液制品和细胞培养
1.2.1血液制品
人血浆和高脂血浆来自健康献血志愿者。
1.2.2hiPSC培养
hiPSC是通过MEF细胞的诱导重编程获得的。5-10×104个hiPSC在Matrigel(BDBiosciences)预处理的六孔板中用II培养基(Cellapy)培养。达到70％～80％融合后，用0.05mM EDTA(Invitrogen)消化细胞以1:6分流比传代，然后在37℃、5％ CO2下孵育。
1.2.3hiPSCs分化为MKs和前血小板
使用基于EB的方案对hiPSCs进行造血分化。首先，将hiPSCs集落用TrypLETMExpress(Gibco)消化成单细胞，并用STEMdiffTMAPELTM2培养基(APEL，STEMCELLTechnologies)重悬，其中添加ROCK抑制剂(Y27632，10μM，STEMCELL Technologies)，BMP4(10ng/ml，R&D Systems)和bFGF(10ng/ml，Peprotech)。将细胞(每孔3500个)接种到未经处理的圆底96孔板(Costar 3788)中，然后在室温下以300×g离心5分钟，并在37℃、5％CO2条件下培养。从第2天到第14天，细胞在含有BMP4(10ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、VEGF(10ng/ml,PeproTech)和SCF(50ng/ml,PeproTech)的APEL中培养。在第11天向培养基中加入TPO(20ng/ml，PeproTech)。在第14天，收集EB分泌的悬浮细胞，然后通过100-μm细胞过滤器(BDBiosciences)过滤以去除EB。将细胞转移到6孔板中培养，培养基为含有SCF(20ng/ml)、IL11(10ng/ml,PeproTech)和TPO(50ng/ml)的APEL(2ml/孔)，继续培养5天收集巨核细胞和前血小板。在不同时间点在有或没有hp或hlp的情况下培养细胞。脂肪酸(FA；产品F7050，Sigma Aldrich)、棕榈酸(PA；产品P0500，Sigma Aldrich)和磺基琥珀酰亚胺油酸钠(SSO；产品ab145039，Abcam)分别以0.25ml/L、10μM和200μM进行测试。
1.2.4流式细胞仪分析
收集细胞并用PBS洗涤一次，在4℃的流式细胞术缓冲液中用抗体或同种型对照染色30分钟。在FACS Calibur(BD Canto Plus)上分析样品，并使用FlowJo v10(FlowJo,LLC)分析数据。细胞用以下抗体标记(来自eBioscience)：CD42a-450(GR-P、IgG1450)、CD42b-PE-Cyanine7(HIP1、IgG1κ-PE-Cyanine7)和CD62P(P-选择素)-PE(Psel.KO2.3、IgG1κ-PE)。
1.2.5形态学分析
使用Cytospin 4离心机(Thermo Scientific)将第14天和第19天收集的细胞细胞离心到载玻片上，用Wright-Giemsa(产品G1020，Solarbio Life Sciences)染色，并用配备相机的徕卡倒置对比显微镜观察(DFC420,Leica Camera)。
1.2.6激光共聚焦
在第19天，通过荧光显微镜分析培养细胞。将细胞旋转到载玻片上，随后用4％多聚甲醛固定并用0.3％ Triton X-100破膜。然后用抗vWF抗体(Proteintech)、抗CD42b抗体(eBioscience)和4'6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对载玻片进行染色。使用Leica TCS166SP8激光共聚焦显微镜拍摄图像。
1.2.7DNA倍性分析
DNA倍性分析是通过FACS对所有样品进行的。在培养第19天分析巨核细胞倍性。细胞用APC偶联的抗CD41抗体标记，在冰上孵育20分钟，在室温下用预冷的70％乙醇固定2小时，然后用PBS洗涤。接下来，将细胞用20mg/ml碘化丙啶(PI；Sigma-Aldrich)和100mg/mlRNase A(Thermo Fisher Scientific)在37℃的黑暗中处理30分钟。然后，通过FACSCalibur(BD Canto Plus)分析细胞DNA含量。
1.2.8蛋白质提取
细胞被收获并悬浮在全细胞裂解缓冲液中(50mM KCl、1％ NP-40、25mM HEPES pH7.8、10μg/ml亮肽素、20μg/ml抑肽酶、125μM DTT、1mM PMSF、1mM Na3VO4)。通过在4℃下以12,000g离心5分钟去除剩余的碎片。最后，收集上清液并根据制造商的说明使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。
1.2.9蛋白质印迹
细胞蛋白提取物用于蛋白质印迹，如前所述。简而言之，蛋白质样品在8％SDS-PAGE凝胶中分离并转移到硝酸纤维素膜上。在含有0.05％ Tween-20的5％脱脂牛奶缓冲液中封闭后，将膜与一抗孵育。抗体购自Cell Signaling Technology(AKT抗体：#4685；p44/42MAPK(Erk1/2)抗体：#9102；Jak2抗体：#3230；STAT3抗体：#12640和GAPDH抗体：#5174)。GAPDH用作蛋白质上样对照。暴露于化学发光后，信号在胶片中可视化，并使用图像处理和分析系统分析每个波段的光密度。
1.2.10总RNA提取
根据手册说明，使用Trizol(Invitrogen)从组织中提取总RNA。收集约1×106个细胞于2mL试管中，直接向细胞沉淀中加入1ml TRIZOL(约1×106个/1ml)，匀浆2分钟，静置5分钟。将混合物在4℃下以12,000rpm离心5分钟，然后将上清液转移到新的2.0EP管中，其中装有0.2mL氯仿/异戊醇(24:1)。将混合物剧烈震荡15秒，然后在4℃下以12,000rpm离心10分钟。离心后，将保留RNA的上层水相转移至装有等体积异丙醇上清液的新管中，4℃、13600rpm离心20分钟。去除上清液后，用1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀两次，然后将混合物在4℃下以13,600rpm离心3分钟以收集残留的乙醇，然后将沉淀在空气中干燥5-10分钟生物安全柜。最后加入25μL～100μLDEPC处理水溶解RNA。随后，使用Nano Drop和Agilent 2100生物分析仪(Thermo Fisher Scientific)对总RNA进行了鉴定和定量。测序数据分析SOAPnuke(V1.5.2)用于过滤测序数据。使用HISAT2(V2.0.4)将干净读数映射到参考基因组。使用Bowtie2(V2.2.5)将Clean reads与参考编码基因集对齐，然后通过RSEM(V1.2.12)计算基因表达水平。热图由PheATMap(V1.0.8)根据不同样本的基因表达绘制而成。本质上，差异表达分析是使用Q值≤0.05的DESeq2(V1.4.5)进行的。为了深入了解表型变化，Phyper(https://en.wikipedia.org/wiki/Hypergeometric_distribution)基于超几何检验对注释的不同表达基因进行KEGG(https://www.kegg.jp/)富集分析。
1.3统计分析
两组之间的比较通过未配对Student’s t-test(双尾)进行评估，而多组分析通过单向方差分析(ANOVA)检验(双尾)进行评估。数据表示为平均值±方差(SD)，显着性水平设置为0.05(双侧)。使用DESeq R包(1.10.1)对两个条件/组(每个条件三个生物复制)进行差异表达分析。使用Benjamini和Hochberg控制错误发现率的方法调整所得P值。通过DESeq发现调整后的P<0.05且Log2倍数变化大于±1的基因被指定为差异表达。
2.结果
2.1血小板与体内高脂血症有相关性
我们收集了临床数据来研究高脂血症与血小板计数之间的关系。首先，我们分别比较了高甘油三酯血症、高胆固醇血症和混合性高脂血症人群与正常人群的血小板、红细胞(RBC)和白细胞(WBC)计数。结果显示，在所有三个高血脂组的个体中，血小板计数均显着高于正常组(图1A；分别为P<0.001、P<0.001、P<0.001)，与WBC计数相同(图1C；分别为P<0.001、P<0.001、P<0.001)。除TG组外，其余两组RBC计数均显着高于对照组。更多参数如表1所示。这些结果表明高血脂环境可以有效促进体内血细胞包括血小板的增殖。
2.2人血浆(hp)在体外促进CD34+造血细胞分化为MKs
为了研究高脂血浆是否能促进巨核细胞和血小板分化，我们首先研究了hp在体外对巨核细胞形成的作用。hp的许多成分及其功能尚未得到充分探索。因此，我们的研究将体外hiPSCs的血小板生成分为三个阶段，HPC生成(第0-8天)，CD41+MKPs生成(第8-14天)，MK成熟和proplatelet生成(第14-19天)，观察hp的影响。我们首先分析了hp在第0-8天的功能。我们通过之前描述的基于EB的方法区分MKs和血小板，流程图如图2A所示。通过流式细胞术分析CD34+CD45-HSC和CD34+CD45+HPC的比例(图5A)。以APEL培养基为基础培养基，辅以不同浓度的hp(分别为5％、10％、15％、20％、25％、30％和35％)。在第3-8天，我们发现造血标记CD34在EB细胞中表达，并随着培养天数的增加而增加。与对照组相比，CD34+CD45-HSC在hp未处理的培养基中生长并不高，因此CD34+CD45+HPC在hp处理的培养基中显着增加(图2B-C)。这表明hp有利于HPC与hiPSC的分化。
然后将细胞继续与补充有各种hp浓度的APEL培养基一起孵育8-14天。CD34+CD45+HPC和CD41+MKP生成首先在20％和25％hp治疗组达到峰值(图2D；分别为P＜0.01；P＜0.05)，尽管CD34+CD45-HSC的生成似乎没有多于未经处理的控制条件(图2D)。我们在第14-19天继续使用上述浓度梯度，并在第19天通过CD41、CD42a和CD42b表达测量MK的生成(图2E，图5A)。结果显示，当hp浓度为5％时，CD41+MK生长最高(P＜0.05)。同样，5％hp对CD41+CD42a+CD42b-和CD41+CD42a+CD42b+MKs的生长也具有同等效力(分别为P＜0.05；P＜0.05)。
我们进一步研究了hp对MK生成发挥最佳刺激作用的添加阶段。细胞在补充有20％hp的APEL培养基中培养0至14天；14至19天补充5％hp，并分为七个不同处理组(第0-4、0-8、0-14、0-19、8-14、8-19、14-19天分别添加hp添加)。在第19天进行CD41、CD42a和CD42b表达的流式细胞术分析。结果显示，hp添加组中CD41+CD42a+CD42b+MKs的百分比均高于对照组(图5B；P＜0.001)。而仅在第8-14天hp添加组，总细胞计数和CD41+CD42a+CD42b+细胞计数高于未处理组(图2F-G；分别为P＜0.001；P＜0.001)。在光学显微镜下第14天和第19天来自hp未处理和处理组的细胞的典型图像显示在图5C中。我们的结果表明，在第8-14天增加20％hp可以促进总细胞增殖和CD41+CD42a+CD42b+细胞增殖，这一添加模式可以最好地促进hiPSC的MK生成和成熟。
总之，这些结果表明hp促进HPC和MK从hiPSC分化。并且不同的hp浓度在不同的阶段产生不同的反应。在MKs的生成和成熟过程中，hp主要工作在第8-14天，即从HPC到MKP生成的阶段。
2.3TG-人高血脂血浆(TG-hlp)促进hiPSCs来源MK和前血小板的体外生成
目前hiPSCs体外生成血小板的效率还比较低，以上分析表明hp可能促进血小板分化。人体高血脂血浆(hlp)中含有大量脂肪。其中，甘油三酯(TG)是主要的脂肪。我们收集的临床数据表明，血小板计数与体内TG水平呈正相关(图3C；P＝0.0014)。我们还检测了正常和hlp的血脂水平，我们使用的高血脂血浆主要是TG增高(TG-hlp)(图3D)。
为了探讨TG-hlp是否在MK和proplatelet生成中发挥相关作用，我们在第8-14天向APEL分化培养基中加入20％TG-hlp，研究脂肪在造血细胞、MK和proplatelet生成过程中的影响形成。我们使用流式细胞术分别在第14天和第19天识别细胞类型(图6A)。结果表明，添加hlp可以增加CD34+CD45-HSC、CD34+CD45+HPC和CD41+MKP的细胞计数，与上文第14天讨论的hp添加结果相似(图3A)。同时，在第19天的hlp添加环境中，总的CD 41+和CD41+CD42a+CD42b+细胞计数也有所增加(图3B)。通过流式细胞术检测不同组中CD41+CD42a+CD42b+细胞的百分比，导致两组没有差异(图6B)。TG-hlp处理组产生的总细胞数和CD41+CD42a+CD42b+细胞数显着高于hp处理组(图3E-F；分别为P<0.05，P<0.05)。如方法中所述，通过CD41+细胞的流式细胞术进行DNA倍性分析。与hp处理组相比，TG-hlp处理组的CD41+MK具有更高的DNA倍性水平(4N和≥8N)(图3G；分别为P<0.01，P<0.001)。通过Wright-Giemsa染色分析悬浮细胞，并通过光学显微镜拍摄MK祖细胞、MK和血小板的图像(图7A)。还观察了来自用TG-hlp和hp处理的hiPSC的MK和proplatelet相关细胞内因子vWF和CD42b的代表性免疫荧光显微图像(图7B)。以上发现表明，TG-hlp的添加可以刺激HPC、MKP的产生、MK的成熟和前血小板的形成。TG-hlp可能促进HPC偏向MK和血小板分化。
2.4脂肪酸是促进hiPSC来源的MK和前血小板生成的活性成分
为了进一步验证TG-hlp脂质成分释放的脂肪酸是否对MK的产生和成熟以及前血小板的产生起到部分促进作用，我们选择了FA(0.25ml/L)和PA(10μM)在第8-14天代替高血脂成分用于下一个实验。我们的研究结果表明，分化14天后，FA处理组和PA处理组产生的细胞总数高于对照组(图3H；分别为P<0.001，P<0.05)，这TG-hlp治疗组高于hp治疗组的研究结果与以往研究结果一致。流式分析结果显示，PA处理组产生的CD34+CD45-细胞数与对照组无显着差异，但PA处理组产生的CD34+CD45+和CD41+细胞数高于对照组控制(图3H；P<0.05，P<0.01，分别)。FA处理组产生的CD34+CD45-、CD34+CD45+和CD41+细胞数量均高于未处理组(图3G；分别为P<0.001、P<0.001)。这些结果与相关的TG-hlp添加研究一致。为了进一步研究，第19天的流式细胞术分析显示，FA处理组(图3I；分别为P<0.001，P<0.001)和PA处理组(图3I；与未治疗组相比，P<0.01，P<0.01)。这部分的结果与前面描述的结果一致，表明脂肪酸的添加可能促进HPC和MK在体外的成熟。所以与正常血浆相比，hlp在体外可以促进MKs的分化，hlp中的脂肪酸成分是活性成分。
为了证实上述假设，我们使用脂肪酸转运抑制剂SSO(200μM)在MKs分化过程中的8-14天抑制脂肪酸转座酶CD36的脂肪酸转移。在第14天，SSO添加组产生的细胞总数明显低于对照组(图3H；P<0.001)。流式分析显示，SSO添加组产生的CD34+CD45+和CD41+细胞计数显着低于对照组(图3H；分别为P<0.001，P<0.001)。由此可见，SSO可抑制hlp的促造血过程。在第19天，SSO添加组产生的细胞总数明显低于对照组(图3I；P<0.001)。分析显示，SSO处理组中CD41+和CD41+CD42a+CD42b+细胞总数显着低于对照组(图3I；分别为P<0.05、P<0.01)。这些结果表明，SSO可以抑制FA的摄取，从而减少MK的生成和成熟。这表明脂肪酸是促进hiPSC衍生的MK和前血小板形成的活性成分。
然后，同时，我们将250μM ADP用于第19天从TG-hlp添加条件下收集的细胞中，并通过流式细胞术分析评估静息和预激活血小板中的CD62P表达水平。观察到与抗CD62P抗体孵育的ADP激活血小板的血小板表面上CD62P表达的增加(图7C-D；P<0.001)。该结果表明在19天培养时存在可被激活的血小板。血小板可以在光学显微镜下可视化(20×；图7E)。在第14-19天，单个细胞倾向于在板中聚集成团块(图7F；P<0.001)，这也表明存在具有聚集功能的血小板。这些结果表明抑制脂肪酸摄取可以阻断hiPSCs来源的造血细胞和MKs的分化，说明脂肪酸是促进HPC和MKs增殖、分化的重要因素。
2.5第14天MK祖细胞中脂肪酸激活MK及血小板生成相关通路
为了进一步研究TG-hlp处理组促进HPC产生偏向MK的信号通路，我们对第14天产生的造血细胞进行测序和分析。对9个细胞样本(对照)进行RNA测序分析:n＝3；hp:n＝3；TG-hlp:n＝3)在第14天收集的结果产生了1378个差异表达基因(DEG)。PCA得分图和Wayne重叠图显示在图8A-B中。下载CellMarker数据库中HSC、HPC和MK的标记基因作为细胞鉴定的基础，映射到从我们的样本中筛选的所有基因，并获得65个基因(图8C)。然后我们将HSCs、HPCs和MKs的标记基因映射到1378个以上的DEGs上，筛选出14个重叠的DEGs，包括8个HSC的maker基因(CXCR4、CD38、PROM1、GFl1、TEK、NGFR、CD44、ACE)，2个HSC的maker基因HPC(CD34、KDR)和4个MKs制造者基因(SRGN、GP5、PF4、CD9)。14个DEG的热图如图4A所示。显示与MKs相关的基因的热图在hp和hlp添加组中与对照相比显着上调。与对照组相比，与HPC相关的基因在hp和hlp添加组中显着下调。这些结果表明，添加hp或hlp促进了MK偏离HPC。在KEGG分析后，DEG被映射到41个KEGG通路，并显示了前13个上调的KEGG通路(图4B)。KEGG富集表明造血细胞谱系途径占主导地位。PPI网络和中心基因显示在图8D中。且Rap1信号通路、Ras信号通路、ECM-受体相互作用、MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路均富集在KEGG通路中，均与MK和血小板生成相关。这些富集途径中的DEG包括CD38、TEK、NGFR、CD44、CD34、KDR、GP5和CD9，在散点图中突出显示(图4C)。接下来，我们通过蛋白质印迹分析检测了MAPK和PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达(图4D)。我们的结果表明在第14天，FA通过JAK2/STAT/AKT通路激活MKPs中的MK和血小板生成，图8E显示了高血脂血浆对MK和血小板生成的作用机制图。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (8)

1.一种体外促进血小板分化的方法，其特征在于，是在体外人诱导干细胞hiPSC生成血小板过程中，在培养基中添加人血浆hp。
2.根据权利要求1所述的体外促进血小板分化的方法，其特征在于，是在人诱导干细胞hiPSCs分化生成巨核细胞及血小板的过程中，于分化培养第8-14天，在基础分化培养基APEL的基础上添加占培养基的体积比例为20％的人血浆hp，促进人诱导干细胞hiPSC分化为造血祖细胞和单能巨核细胞前体细胞。
3.一种体外促进血小板分化的方法，其特征在于，是在体外人诱导干细胞hiPSC生成血小板过程中，在培养基中添加人高血脂血浆TG-hlp。
4.根据权利要求3所述的体外促进血小板分化的方法，其特征在于，是在人诱导干细胞hiPSC分化培养第8-14天，在基础分化培养基APEL的基础上添加占培养基的体积比例为20％的甘油三脂升高为主的人高血脂血浆TG-hlp，促进造血祖细胞偏向巨核细胞和血小板分化。
5.一种体外促进血小板分化的方法，其特征在于，是在体外人诱导干细胞hiPSC生成血小板过程中，在培养基中添加脂肪酸。
6.根据权利要求5所述的体外促进血小板分化的方法，其特征在于，具体是在hiPSCs分化生成巨核细胞及血小板的过程中，于分化培养第8-14天，在基础分化培养基APEL添加占培养基的体积比例为20％的人血浆hp的基础上，添加脂肪酸FA 0.25ml/L或棕榈酸PA 10μM，促进hiPSCs来源造血祖细胞和巨核细胞在体外的成熟。
7.人血浆hp或人高血脂血浆hlp在制备体外促进血小板分化的试剂的应用。
8.脂肪酸在制备体外促进血小板分化的试剂的应用。
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