CN108478599A - 间充质基质细胞及其相关用途 - Google Patents

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Abstract

本发明大体上涉及衍生自成血管细胞的间充质基质细胞(MSC)的新颖制剂、用于获得这些MSC的方法以及使用这些MSC治疗一种病变的方法。本发明的方法制造出大量具有一种保持效力的年轻表型的MSC，这些MSC可用于治疗多种病变。

Description

间充质基质细胞及其相关用途
本分案申请是基于申请号为201280067692.0，申请日为2012年11月30日，发明名称为“间充质基质细胞及其相关用途”的中国专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年11月30日提交的题为“使用成血管细胞产生间充质基质细胞的方法(METHODS OF GENERATING MESENCHYMAL STROMAL CELLS USING HEMANGIOBLASTS)”的美国临时申请序列号61/565,358(代理人案号75820.210001)的优先权权益，该案的内容通过引用以其全文结合在此。
发明领域
本发明涉及使用基于细胞的疗法来减少受试者的如以不当免疫反应为特征的病变的表现，并且还影响病变的起源，由此使确定该病变的异常回到正常状态。具体而言，本发明涉及保持“年轻”细胞的表型的间充质基质细胞(MSC)，这些“年轻”细胞在减少受试者体内的病变表现方面赋予高效力。
发明背景
许多病变在临床上通过宿主体内不想要的或过度的免疫反应来表现，例如移植物排斥、发炎及自体免疫病症。已经开发出免疫抑制疗法来治疗这些症状，但尚未研究出以过度免疫反应为特征的病变的潜在成因。这些疗法在下调免疫功能方面有效，并且因此，有可能带来严重不良事件，包括癌症和机会性感染，以及由如泼尼松、环孢霉素及他克莫司等药剂引起的如白内障、高血糖、碰伤及肾毒性等副作用。
尽管已经研究出不抑制整个免疫系统的疗法，但这些方案也存在局限。这些免疫调节治疗靶向免疫系统内的一个更窄的干预点，并因此具有不同，有时不太严重的副作用。此类免疫调节疗法的实例包括使用抗体，例如抗CD3或抗IL2R。尽管在诱导提高的无反应性状态方面取得了成功，但这些免疫调节疗法的停止使得复原到该不想要的病变。
间充质干细胞(MSC)是具有自更新能力并且能够分化成为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等间充质细胞谱系的多能干细胞。近年来，有关人MSC的多谱系分化潜能和免疫调节特性的深入研究已经指出，这些细胞可以用于治疗多种临床病状，包括免疫病症以及退化性疾病。因此，用MSC针对多种病状进行的临床研究的数量一直在稳定地增加：移植物抗宿主疾病(GVHD)、心肌梗塞以及发炎性和自体免疫疾病和病症等。目前，利用MSC进行的临床计划依赖于从成人来源和脐血分离出这些细胞。MSC临床应用所需的高细胞剂量(每公斤患者多达数百万个细胞)要求一种可靠、可再现的并且高效的扩增方案，该方案能够由从供体来源分离的那些细胞产生大量细胞。
然而，为了达到临床上有意义的细胞数量用于细胞疗法和组织工程应用，MSC离体扩增是必需遵循的。当在体内老化期间，来自脐血、胎儿及成人来源(如骨髓或脂肪组织)的MSC的连续离体细胞传代会引起复制压力、染色体异常或其他随机细胞缺陷，从而使扩增的MSC的增殖、克隆形成及分化潜能进行性丧失，此最终会危及MSC的临床安全性和功效。在治疗中衰老的MSC的使用不应当被低估，因为细胞丧失了其部分的分化潜能，并且其分泌特征也有所改变。已发现，在培养期间MSC衰老可诱导细胞生长停滞，伴随端粒变短，并且已报导随着传代增加，骨髓(BM)MSC的脂肪形成分化潜能持续降低，而分化成为成骨细胞谱系的倾向增加。
因此，在临床应用MSC之前，有一些基本问题仍有待解决。衍生自ESC的MSC可以按高度可控制的方式足量产生，由此缓和了关于供体依赖性来源的问题。由于不需要长期植入MSC，故基本上不会存在有关主要组织相容性(MHC)的错配的问题[7，8]。在本领域中，已经通过包括与鼠类OP9细胞共培养或人工挑选程序在内的不同方法获得了衍生自ESC的MSC[9-13]。然而，这些方法很冗长并且产生的MSC具有较低产率、不同的质量并且缺乏效力。此外，就能够提供一种具有较佳治疗指数的细胞产物，能够以相对于CB衍生的MSC、BM衍生的MSC或脂肪衍生的MSC减少的剂量(细胞数量)使用，和/或能够使MSC提供一种可追踪的疗法用于CB衍生的MSC、BM衍生的MSC或脂肪衍生的MSC不够有效的发炎性和自体免疫疾病来说，使注射的细胞的效力最大是所希望的。
优选实施方案的概述
本发明涉及间充质基质细胞(MSC)和用于产生MSC的方法。本发明的方法制造出大量高质量的间充质基质细胞，这些细胞以赋予一种高效力的年轻细胞的表型为特征。在本发明的一个实施例中，这些MSC是衍生自成血管细胞。这些主题MSC的制剂可用于治疗多种病变，包括不想要的免疫反应，例如自体免疫疾病和病症，以及发炎性疾病和病症。
在一个方面，本发明包含了由成血管细胞，使用改善的用于培养这些成血管细胞的方法产生的改善的MSC制剂。在示例性实施例中，与直接地衍生自胚胎干细胞(ESC)的间充质基质细胞相比，本发明的间充质基质细胞保留了更高水平的效力并且不会丛生或基本上更少地丛生。与直接地衍生自ESC的间充质基质细胞相比，根据本发明的任一种或多种方法产生的间充质基质细胞可以保留更高水平的效力，并且可以不丛生或可以基本上更少地丛生。
在一个方面，本发明提供了包含间充质基质细胞的药物制剂，其中所述间充质基质细胞能够经历至少10次的群体倍增，例如在约22-27天内发生至少10次的群体倍增。在另一个方面，本发明提供了包含间充质基质细胞的药物制剂，其中所述间充质基质细胞能够经历至少15次的群体倍增，例如在约22-27天内发生至少15次的群体倍增。这些药物制剂可以通过成血管细胞的体外分化来产生。这些间充质基质细胞可以是灵长类动物细胞，例如人类细胞。这些间充质基质细胞能够经历至少15次群体倍增。举例来说，这些间充质基质细胞经历了至少20、25、30、35、40、45、50或更多次群体倍增。该制剂可以包含不到约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％的多能细胞。优选地，该制剂不含多能细胞。该制剂可以包含至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的间充质基质细胞。
在一个方面，所述间充质基质细胞中至少50％对于以下各项呈阳性：(i)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73及CD90中的至少一种；(ii)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD 44、CD166、CD274及HLA-ABC中的至少一种；或(iii)其任何组合。在另一个方面，所述间充质基质细胞中至少50％对于以下各项呈阳性：(i)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73及CD90中的至少两种；(ii)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD 44、CD166、CD274及HLA-ABC的全部。在又另一个方面，所述间充质基质细胞中至少50％(i)对于CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD 44、CD166、CD274及HLA-ABC全部呈阳性，并且(ii)不表达或以较低水平表达CD31、34、45、133、FGFR2、CD271、Stro-1、CXCR4、TLR3中的至少一种。另外地，这些间充质基质细胞中至少60％、70％、80％或90％可能对以下各项呈阳性：(i)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73及CD90中的一种或多种；(ii)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD 44、CD166、CD274及HLA-ABC中的一种或多种。
在一个方面，该药物制剂包含了有效治疗或预防一位有需要的受试者体内的一种不想要的免疫反应的一种量的间充质基质细胞。该药物制剂可以另外包含供移植到一位有需要的接受者体内的其他细胞、组织或器官。示例性其他细胞或组织包括RPE细胞、皮肤细胞、角膜细胞、胰腺细胞、肝细胞或心脏细胞，或含有所述细胞中任一种的组织。
在另一个方面，这些间充质基质细胞不是衍生自骨髓，并且该制剂在一种免疫调控分析中的效力高于一种骨髓衍生的间充质基质细胞制剂的效力。效力可以通过一种测定EC50剂量的免疫调控分析来进行分析。
在一个方面，该制剂在十次群体倍增之后保留了介于约50％与100％之间的其增殖能力。
在另一个方面，该药物制剂的间充质基质细胞不是直接地衍生自多能细胞，并且其中所述间充质基质细胞(a)不会丛生或比直接地衍生自ESC的间充质基质细胞基本上更少地丛生；(b)与直接地衍生自ESC的间充质基质细胞相比较，当分裂时更易于分散；(c)数量比当以相等数量的ESC开始时直接地衍生自ESC的间充质基质细胞更多；和/或(d)比直接地衍生自ESC的间充质基质细胞更早地获得特征性间充质细胞表面标记物。
本发明另外涵盖了用于产生间充质基质细胞的方法，这些方法包括在产生间充质干细胞的条件下培养成血管细胞。这些成血管细胞可以在无饲养层条件下培养。另外地，可以将成血管细胞铺板于一种基质上，该基质例如包含转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、类胰岛素生长因子1、牛成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或血小板衍生的生长因子(PDGF)。该基质可以选自下组，该组由以下各项组成：层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、胶原蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、硫酸乙酰肝素、基质胶(一种来自英格布雷-霍尔姆-斯沃姆(Engelbreth-Holm-Swarm，EHS)小鼠肉瘤细胞的可溶性制剂)、人基底膜提取物及其任何组合。该基质可以包含一种来自英格布雷-霍尔姆-斯沃姆小鼠肉瘤细胞的可溶性制剂。
在一个方面，这些间充质基质细胞是哺乳动物的。优选地，这些间充质基质细胞是人类、犬科或马科的。
在一个方面，这些成血管细胞可以在一种包含αMEM的培养基中培养。在另一个方面，这些成血管细胞可以在包含血清或一种血清代用品的一种培养基中培养。举例来说，这些成血管细胞可以在包含了补充有0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％胎牛血清的αMEM的一种培养基中培养。在另外的示例性实施例中，该培养基可以包含更高百分比的胎牛血清，例如超过20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或甚至更高百分比的胎牛血清。这些成血管细胞可以在所述基质上培养至少约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。
在一个方面，这些成血管细胞或血管集落形成细胞是由多能细胞(例如iPS细胞)或卵裂球分化的。这些多能细胞可以衍生自一个或多个卵裂球，而不会破坏一个人胚胎。另外地，这些成血管细胞可以由多能细胞，通过一种方法分化，该方法包括(a)培养所述多能细胞以形成细胞簇。在一个方面，这些多能细胞是在血管内皮生长因子(VEGF)和/或骨形态发生蛋白4(BMP-4)存在下培养的。VEGF和BMP-4可以在起始所述细胞培养的0-48小时内添加到该多能细胞培养物中，并且所述VEGF任选地以20-100nm/mL的一种浓度添加，并且所述BMP-4任选地以15-100ng/mL的一种浓度添加。
在一个方面，这些成血管细胞是由多能细胞，通过一种方法分化的，该方法另外包括：(b)在至少一种生长因子存在下培养所述单细胞，该生长因子的量足以诱导所述细胞簇分化成为成血管细胞。步骤(b)中所添加的至少一种生长因子可以包含以下各项中的一种或多种：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白4(BMP-4)、干细胞因子(SCF)、Flt 3L(FL)、促血小板生成素(TPO)、EPO和/或tPTD-HOXB4。步骤(b)中添加的所述至少一种生长因子中的一种或多种可以从步骤(a)开始的36-60小时内添加到所述培养物中。优选地，步骤(b)中添加的所述至少一种生长因子中的一种或多种是从步骤(a)开始的40-48小时内添加到所述培养物中的。步骤(b)中添加的至少一种因子可以包含bFGF、VEGF、BMP-4、SCF、FL和/或tPTD-HOXB4中的一种或多种。如果在步骤(b)中添加所述生长因子，那么其浓度可以在约以下范围内：bFGF为约20-25ng/ml，VEGF为约20-100ng/ml，BMP-4为约15-100ng/ml，SCF为约20-50ng/ml，FL为约10-50ng/ml，TPO为约20-50ng/ml，并且tPTD-HOXB4为约1.5-5U/ml。
在另一个方面，该方法另外包括(c)使所述细胞簇任选地解离成多个单细胞。在另一个方面，该方法另外包括(d)在包含至少一种另外的生长因子的一种培养基中培养所述成血管细胞，其中所述至少一种另外的生长因子的量足以扩增这些成血管细胞或血管集落形成细胞。(d)的至少一种另外的生长因子可以包含以下各项中的一种或多种：胰岛素、转铁蛋白、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素(EPO)、干细胞因子(SCF)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白4(BMP-4)和/或tPTD-HOXB4。步骤(d)中的示例性浓度包括胰岛素约10-100μg/ml、转铁蛋白约200-2,000μg/ml、GM-CSF约10-50ng/ml、IL-3约10-20ng/ml、IL-6约10-1000ng/ml、G-CSF约10-50ng/ml、EPO约3-50U/ml、SCF约20-200ng/ml、VEGF约20-200ng/ml、BMP-4约15-150ng/ml和/或tPTD-HOXB4约1.5-15U/ml。步骤(a)、(b)、(c)和/或(d)中的培养基可以是一种无血清培养基。
在一个方面，该方法产生了至少8000、8500、9000、9500、10000、12500或15000万个间充质基质细胞。这些成血管细胞可以在开始诱导所述多能细胞分化的至少10、11、12、13、14、15、16、17或18天之后收集。这些间充质基质细胞可以在开始诱导所述多能细胞分化的至少25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50天内产生。在另一个方面，该方法使得在培养约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35天内由约200,000个成血管细胞产生至少8000、8500、9000、9500、10000、12500或15000万个间充质基质细胞。这些间充质基质细胞可以在培养约26、27、28、29、30、31、32、33、34或35天内由成血管细胞和/或血管集落形成细胞以一种至少1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:415、1:425、1:440、1:450、1:365、1:475、1:490及1:500的成血管细胞与间充质基质细胞比率产生。这些细胞可以是人类的。
本发明还涵盖了通过所描述的方法获得的衍生自成血管细胞的间充质基质细胞。在一个方面，本发明包括了通过成血管细胞的体外分化所衍生的间充质基质细胞。所述间充质基质细胞中至少50％可以(i)对于CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD 44、CD166、CD274及HLA-ABC全部呈阳性，并且(ii)不表达或以较低水平表达CD31、34、45、133、FGFR2、CD271、Stro-1、CXCR4、TLR3中的至少一种。作为替代方案，所述间充质基质细胞中至少50％可能对以下各项呈阳性：(i)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73及CD90的全部；或(ii)CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD44、CD166、CD274及HLA-ABC的全部。这些间充质基质细胞中至少60％、70％、80％或90％可能对以下各项呈阳性：(i)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73及CD90中的至少一种；或(ii)CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD44、CD166、CD274及HLA-ABC中的至少一种。优选地，这些间充质基质细胞不表达或以较低水平表达CD31、CD34、CD45、CD133、FGFR2、CD271、Stro-1、CXCR4、TLR3中的至少一种。
在另一个方面，本发明涵盖一种在此所描述的间充质基质细胞的制剂。该制剂可以包含不到10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％的多能细胞。优选地，该制剂不含多能细胞。该制剂可以是基本上纯化的并且任选地包含至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的人间充质基质细胞。该制剂可以包含基本上类似水平的p53和p21蛋白，或其中p53蛋白的水平比p21蛋白高出1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。这些间充质基质细胞能够在培养物中经历至少5次群体倍增。优选地，这些间充质基质细胞能够在培养物中经历至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多次群体倍增。
在一个方面，本发明的间充质基质细胞(a)不会丛生或比直接地衍生自ESC的间充质基质细胞基本上更少地丛生；(b)与直接地衍生自ESC的间充质基质细胞相比较，当分裂时更易于分散；(c)数量比当以相等数量的ESC开始时直接地衍生自ESC的间充质基质细胞更多；和/或(d)比直接地衍生自ESC的间充质基质细胞更早地获得特征性间充质细胞表面标记物。本发明涵盖了一种包含此类间充质基质细胞的药物制剂，该药物制剂包含有效治疗一种不想要的免疫反应的一种量的间充质基质细胞。该制剂可以包含有效治疗一种不想要的免疫反应的一种量的间充质基质细胞并且另外包含供移植到一位有需要的接受者体内的其他细胞或组织。示例性其他细胞包括了异基因或同基因的胰腺、神经、肝、RPE或角膜细胞，或含有前述任一种的组织。该药物制剂可以适用于治疗一种自体免疫病症或针对异基因细胞的一种免疫反应，包括但不限于，多发性硬化、系统性硬皮病、血液科恶性疾病、心肌梗塞、器官移植排斥、慢性同种移植肾病、硬化、肝衰竭、心脏衰竭、GvHD、胫骨骨折、左心室功能障碍、白血病、骨髓增生异常综合征、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、糖尿病、慢性阻塞性肺病、成骨不全症、纯合性家族性高胆固醇血症、半月板切除术后治疗、成人牙周炎、严重心肌缺血患者的血管形成、脊髓损伤、骨发育不良、重症肢体缺血、糖尿病性足病、原发性修格连氏综合征(primary Sjogren’s syndrome)、骨关节炎、软骨缺损、蹄叶炎、多系统萎缩症、肌萎缩性侧索硬化、心脏手术、全身性红斑狼疮、活体肾同种移植、非恶性红细胞病症、热烧伤、辐射烧伤、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、微骨折、大疱性表皮松解症、严重冠状动脉缺血、特发性扩张性心肌病、股骨头坏死、狼疮性肾炎、骨缺损、缺血性脑中风、中风后、急性辐射综合征、肺病、关节炎、骨再生、葡萄膜炎或其组合。该主题MSC(包括其配制物或制剂)可以用于治疗呼吸系统病状，特别是包括发炎性组分或急性损伤的那些，如成人呼吸窘迫综合征、创伤后成人呼吸窘迫综合征、移植性肺病、慢性阻塞性肺病、气肿病、慢性阻塞性支气管炎、支气管炎、过敏反应、由细菌或病毒性肺炎引起的损害、哮喘、暴露于刺激物及抽烟。另外地，该主题MSC(包括其配制物或制剂)可以用于治疗异位性皮炎、过敏性鼻炎、听力丧失(特别是自体免疫性听力丧失或噪音诱发的听力丧失)、牛皮癣。
本发明另外涵盖了包含在此所描述的间充质基质细胞或间充质基质细胞制剂的试剂盒。这些试剂盒可以包含冷冻或低温保存的间充质基质细胞或间充质基质细胞制剂。该试剂盒中所包含的间充质基质细胞或间充质基质细胞制剂可以包含在一种细胞递送媒介中。
此外，本发明涵盖了用于治疗疾病或病症的方法，这些方法包括向一位有需要的受试者给予一种有效量的在此描述的间充质基质细胞或一种间充质基质细胞制剂。该方法可以另外包括移植其他细胞或组织，例如视网膜、RPE、角膜、神经、免疫、骨髓、肝或胰腺细胞。所治疗的示例性疾病或病症包括但不限于，多发性硬化、系统性硬皮病、血液科恶性疾病、心肌梗塞、器官移植排斥、慢性同种移植肾病、硬化、肝衰竭、心脏衰竭、GvHD、胫骨骨折、左心室功能障碍、白血病、骨髓增生异常综合征、克罗恩氏病、糖尿病、慢性阻塞性肺病、成骨不全症、纯合性家族性高胆固醇血症、半月板切除术后治疗、成人牙周炎、严重心肌缺血患者的血管形成、脊髓损伤、骨发育不良、重症肢体缺血、糖尿病性足病、原发性修格连氏综合征、骨关节炎、软骨缺损、蹄叶炎、多系统萎缩症、肌萎缩性侧索硬化、心脏手术、难治性全身性红斑狼疮、活体肾同种移植、非恶性红细胞病症、热烧伤、辐射烧伤、帕金森氏病、微骨折、大疱性表皮松解症、严重冠状动脉缺血、特发性扩张性心肌病、股骨头坏死、狼疮性肾炎、骨缺损、缺血性脑中风、中风后、急性辐射综合征、肺病、关节炎、骨再生或其组合。在一个方面，该疾病或病症是葡萄膜炎。在另一个方面，该疾病或病症是一种自体免疫性病症，例如多发性硬化，或针对异基因细胞的一种免疫反应。
本发明另外涵盖了治疗骨损失或软骨损害的方法，这些方法包括一位向有需要的受试者给予一种有效量的在此描述的间充质基质细胞或间充质基质细胞制剂。这些间充质基质细胞可以与一种异基因或同基因移植的细胞或组织(例如视网膜色素上皮细胞、视网膜细胞、角膜细胞或肌细胞)组合给予。
本发明包含了对产生制剂MSC的成血管细胞进行培养的方法，这些MSC尽管群体倍增次数增加，但仍保留效力。本发明的具有间充质基质细胞的药物制剂当给予一位需要此给药的哺乳动物宿主时，呈现出改善的治疗特性。
附图简要说明
图1.由多能细胞产生FM-MA09-MSC。该图示出了从ESC经由成血管细胞产生间充质基质细胞的显微镜图。
图2.由多能细胞衍生的成血管细胞获得的FM-MA09-MSC的表型。该图示出了在初始成血管细胞群(图表左侧，第7-11天的成血管细胞)和在涂有基质胶的板上培养成血管细胞之后(图表右侧)对MSC表面标记物呈阳性的细胞的百分比以及衍生自成血管细胞的间充质基质细胞的显微镜图(右图照片)。
图3.衍生自不同培养方法的间充质基质细胞的表型。该图示出了人胚胎干细胞(ESC)在涂有明胶的板上(左图)、ESC在涂有基质胶的板上(中间图)及成血管细胞在涂有基质胶的板上(右图)进行培养之后对MSC表面标记物呈阳性的细胞的百分比。
图4.由多能细胞得到间充质基质细胞的产率。该图示出了通过ESC在涂有明胶的板上(第一栏—无产率)、ESC在涂有基质胶的板上(第二栏)及成血管细胞在涂有基质胶的板上(第三栏)进行培养所获得的对MSC表面标记物呈阳性的细胞的产率。
图5.间充质基质细胞标记物的获得。该图描绘了使用成血管细胞(顶线)和ESC(底线)获得MSC表面标记物的时间。
图6.衍生自不同培养方法的间充质基质细胞的表型。该图示出了ESC在涂有基质胶的板上(左图)和成血管细胞在涂有基质胶的板上(右图)进行培养之后对MSC标记物呈阳性并且对血细胞生成和内皮标记物呈阴性的细胞的百分比。
图7.FM-MA09-MSC展示出分化能力。该图描绘了衍生自从MA09 ESC分化的成血管细胞的间充质基质细胞分化形成脂肪细胞和骨细胞的能力。
图8.MSC的软骨形成分化。该图描绘了MA09 ESC成血管细胞衍生的间充质基质细胞通过软骨蛋白聚糖(硫酸软骨素蛋白聚糖1)和胶原蛋白IIa的mRNA表达进行的软骨形成分化。
图9.FM-MA09-MSC对CD309的短暂表达。该图示出了细胞表面标记物CD309的短暂表达。
图10A.T细胞响应于促分裂素进行的增殖受FM-MA09-MSC抑制。该图示出了成血管细胞衍生的间充质基质细胞对由化学刺激(PMA/离子霉素)所引起的T细胞增殖的抑制作用。
图10B.T细胞响应于抗原呈递细胞进行的增殖受FM-MA09-MSC抑制。该图示出了成血管细胞衍生的间充质基质细胞对由暴露于树突状细胞所引起的T细胞增殖的抑制作用。
图11.T细胞响应于抗原呈递细胞进行的增殖受FM-MA09-MSC抑制。图11A显示，成血管细胞衍生的间充质基质细胞能够使响应于IL2刺激而诱导的CD4/CD25双重阳性Treg的百分比增加。
图11B显示，成血管细胞衍生的间充质基质细胞抑制Th1的IFNγ分泌。
图12.促炎性细胞因子IFNg刺激FM-MA09-MSC表面标记物表达的变化。该图显示，干扰素γ刺激MSC表面标记物表达的变化并且可以增强MSC的免疫抑制作用。
图13.如与BM-MSC相比较，FM-MA09-MSC的效力增加、抑制作用更强。FM-MA09-MSC对T细胞增殖发挥的抑制作用比BM-MSC更大。(A.)在与PBMC共培养时增加MSC的量使T细胞响应于PMA和离子霉素进行的增殖剂量依赖性减少。年轻(p4)的FM-MA09-MSC是所测试的所有细胞类型中最有效的。(B.)FM-MA09-MSC抑制T细胞响应于PHA增殖的程度比BM-MSC更强。将5:1比率的PBMC:MSC共培养6天。(C.)FM-MA09-MSC抑制T细胞响应于递增量的树突状细胞的增殖比BM-MSC更好。在(A-C)中，T细胞增殖百分比是通过在CD4+和/或CD8+细胞群中结合BrdU来评估的。
图14.FM-MA09-MSC增强Treg诱导作用：较早的子代MSC具有的作用比较晚的子代MSC更强。在不存在或存在FM-MA09-MSC的情况下，将非粘附PBMC(不同供体)在+/-IL2下培养4天。通过流式细胞术评估CD4/CD25双重阳性Treg的百分比。使用年轻的(p6)或老的(p16-18)FM-MA09-MSC。黑色柱形指示6次实验的平均值。MSC作为整体对Treg的诱导具有统计学上显著的影响。(p＝0.02)。
图15.如与BM-MSC相比较，FM-MA09-MSC使Treg的扩增有所增强。FM-MA09-MSC诱导Treg扩增比BM-MSC更好。(A.)CD4/CD25双重阳性Treg的增加倍数。设置-IL2条件为1，并且其他组表示为超过这一水平的诱导倍数。MM＝MA09-MSC，BM＝骨髓MSC。“p”＝传代次数。(B.)FM MA09-MSC(MM)诱导CD4/CD25/FoxP3三重阳性Treg比BM-MSC更好。(C.)呈CD4+的反应性PBMC的百分比在多个不同处理组中是一致的。(D.)呈CD25+的反应性PBMC的百分比在多个不同处理组中不同。FM-MA09-MSC对CD25表达的诱导作用比BM-MSC更强。这一差异可以解释在Treg的诱导方面的差异。
图16.FM-MA09-MSC具有的增殖能力比BM-MSC更强。FM-MA09-MSC具有的增殖能力比BM-MSC更强。将累积群体倍增针对培养天数作图。在初始铺板ESC衍生的成血管细胞或骨髓衍生的单核细胞之后，将粘附细胞视为p0MSC。以7000个细胞/平方厘米的密度再铺板连续的MSC子代，并且当这些培养物为约70％汇合(每3-5天)时进行收集。
图17.产生FM-MA09-MSC的过程；基质胶作用。如与维持在基质胶上直到p6的那些相比较，在较早的子代(即，p2)时从基质胶移出细胞可以暂时地减慢MSC生长。
图18.BM-MSC和FM-MA09-MSC经历软骨形成。在21天之后，对石蜡包埋的团粒块培养物进行番红O染色(软骨基质沉积的指示)。图像是40X放大的。
图19.在基础状态下，FM-MA09-MSC分泌的PGE2比BM-MSC分泌的更少，而在IFNγ或TNFα刺激之后增加倍数更大。(A.)示出了在基础或不同刺激条件下，BM-MSC与FM-MA09-MSC的前列腺素E2分泌量(pg/ml)的比较。将P GE2量关于细胞数量归一化。(B.)基础PGE2值被设置为1(黑线)并且在不同刺激物下的PGE2分泌表示为超过基础水平的增加倍数。
图20.FM-MA09-MSC随时间而维持表型。不同MSC群的流式细胞术分析。(A.)在三种不同基质上维持FM-MA09-MSC的细胞表面标记物表达并与BM-MSC相比较。(B.)随时间(随着连续传代，如所指示的)评价FM-MA09-MSC的细胞表面标记物表达。
图21.如与BM-MSC相比较，FM-MA09-MSC表达更少的Stro-1和更多的CD10。不同MSC群的流式细胞术分析。在指定的传代次数下，Stro-1的表达在FM-MA09-MSC中比在BM-MSC中更少。CD10的表达在FM-MA09-MSC中比在BM-MSC中更多。其他标记物对于两种MSC群是相同的。
图22.在10个不同批次的较早子代FM-MA09-MSC中Stro-1和CD10的表达始终显示低Stro-1和中间范围的CD10表达。不同MSC群的流式细胞术分析。在指定的传代次数下，针对Stro-1和CD10的表达来评价十个不同批次的FM-MA09-MSC。Stro-1的表达在这些不同批次的FM-MA09-MSC中始终较低(平均为5％-10％)。CD10的表达在这些不同批次的FM-MA09-MSC中始终处在中间范围水平(平均为约40％)。
图23.FM-MA09-MSC当在培养物中老化时维持其大小，而BM-MSC的细胞大小随年龄而增加。有关流式细胞术的前向散射/侧向散射点状图(示于左侧)被用于捕获MSC的大小。对右上象限“大”细胞中的细胞百分比进行监测并展示于柱形图中。
图24.如与BM-MSC相比较，FM-MA09-MSC中CD10和CD24上调。示出了在基础状态下BM-MSC和FM-MA09-MSC的基因表达分析。用泰格曼(Taqman)探针进行的定量RT-PCR被用于评估指定基因的表达并针对两种看家基因进行归一化。示出了一式四份读数的平均值+/-标准偏差。
图25.如与BM-MSC相比较，FM-MA09-MSC中Aire-1和IL-11上调。示出了在基础状态下BM-MSC和FM-MA09-MSC的基因表达分析。用泰格曼探针进行的定量RT-PCR被用于评估指定基因的表达并针对两种看家基因进行归一化。示出了一式四份读数的平均值+/-标准偏差。
图26.如与BM-MSC相比较，FM-MA09-MSC中Ang-1和CXCL1上调。示出了在基础状态下BM-MSC和FM-MA09-MSC的基因表达分析。用泰格曼探针进行的定量RT-PCR被用于评估指定基因的表达并针对两种看家基因进行归一化。示出了一式四份读数的平均值+/-标准偏差。
图27.如与BM-MSC相比较，FM-MA09-MSC中IL6和VEGF下调。示出了在基础状态下BM-MSC和FM-MA09-MSC的基因表达分析。用泰格曼探针进行的定量RT-PCR被用于评估指定基因的表达并针对两种看家基因进行归一化。示出了一式四份读数的平均值+/-标准偏差。
图28.FM-MA09-MSC和BM-MSC响应于3天的IFNγ刺激而显示吲哚胺2,3脱氧酶(IDO)活性增加。用50ng/ml IFNg刺激3天的MSC的将色氨酸转化成犬尿氨酸(IDO活性的指标)的能力的比较。对于每个MSC群，将100万个细胞溶解并用于该分析中。
图29.FM-MA09-MSC中Aire-1和朊蛋白(Prp)表达的年龄相关性变化：两种蛋白质分别涉及到免疫抑制和增殖。在不同传代次数(p)下，FM-MA09-MSC全细胞溶解产物中Aire-1和PrP表达的蛋白质印迹分析。示出了肌动蛋白的表达作为内对照物。Aire-1与PrP表达的差异是通过参照肌动蛋白内对照物来说明。
图30.在基础状态下，FM-MA09-MSC分泌的IL6比BM-MSC分泌的更少。细胞因子阵列显示了在MSC条件培养基中归一化(左边4个点)和IL6(框图)的阳性对照物。将来自两个不同供体的BM-MSC与4个不同批次的FM-MA09-MSC相比较。
图31.在基础状态和IFNγ刺激的状态下，FM-MA09-MSC分泌的IL6比BM-MSC更少。细胞因子阵列显示了在MSC条件培养基中归一化(左边4个点)和IL6(框图)的阳性对照物。在48小时的+/-IFNγ处理之后，将第7代的BM-MSC与p7FM-MA09-MSC相比较。
图32.在基础状态和IFNγ刺激的状态下，FM-MA09-MSC分泌的VEGF比BM-MSC更少。细胞因子阵列显示了在MSC条件培养基中归一化(左边4个点)和VEGF(框图)的阳性对照物。在48小时的+/-IFNγ处理之后，将第7代的BM-MSC与p7FM-MA09-MSC相比较。
发明详细说明
本发明涉及了产生间充质基质细胞的方法、通过培养成血管细胞得到的间充质基质细胞的制剂及使用间充质基质细胞治疗一种病变的方法。
本发明的方法在产生基本上无ESC的间充质基质细胞方面比先前的工艺更有效，藉此，与先前的工艺相比较，成血管细胞培养物产生了增加的产率的间充质基质细胞。本发明的成血管细胞衍生的间充质基质细胞保留了一种新颖的年轻表型，如通过特定标记物的表达或其缺乏所确定。
在某些实施例中，该MSC制剂(如具有至少103、104、105或甚至106个MSC的培养物)具有的端粒长度平均起来可以是ESC和/或人iPS细胞的端粒长度(或ESC和/或人iPS细胞群的平均值)的至少30％，并且优选地是ESC和/或人iPS细胞的端粒长度(或ESC和/或人iPS细胞群的平均值)的至少40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％。举例来说，所述ESC和/或人iPS细胞(或所述ESC和/或人iPS细胞群)可以是分化得到所述MSC细胞的一个细胞或细胞群。
该MSC制剂作为一个群体可以具有长于4kb，并且优选地长于5、6、7、8、9、10、11、12或甚至13kb的平均末端限制性片段长度(TRF)。在一个示例性实施例中，该制剂的MSC可以具有10kb或更长的平均TRF。
在某些实施例中，该MSC制剂(如具有至少103、104、105、106、107或甚至108个MSC的培养物)具有的复制寿命比从其他来源获得的MSC制剂(例如，衍生自捐赠的人体组织，如胎儿、婴儿、儿童、青少年或成人组织的培养物)的复制寿命更长。复制寿命可以通过测定在复制衰老(即，其中培养物中超过10％、20％、30％、40％或甚至50％的细胞在下一次倍增或传代之前衰老)之前培养物中群体倍增或传代的次数来评估。举例来说，这些主题MSC制剂具有的复制寿命可以比衍生自捐赠的人体组织(特别是衍生自成人骨髓或成人脂肪组织)的MSC制剂的复制寿命多至少10次倍增，并且优选地至少20、30、40、50、60、70、80、90或甚至100次群体倍增。在某些实施例中，这些MSC制剂具有的复制寿命可以允许在超过50％的细胞衰老和/或分化成非MSC细胞类型(如成纤维细胞)之前进行至少8次传代，并且更优选地在达到该时间点之前进行至少10、12、14、16、18或甚至20次传代。在某些实施例中，该MSC制剂具有的复制寿命可以允许在超过50％的细胞衰老和/或分化成非MSC细胞类型(如成纤维细胞)之前进行相对于成人骨髓衍生的MSC制剂和/或脂肪衍生的MSC制剂(或相等的起始细胞数量)至少2倍的倍增或传代，并且更优选地至少4、6、8或甚至10倍的倍增或传代。
在某些实施例中，相对于第1代(P1)、第2代(P2)、第3代(P3)、第4代(P4)和/或第5代(P5)的衍生自其他来源的MSC制剂(例如，衍生自捐赠的人体组织，如胎儿、婴儿、儿童、青少年或成人组织的培养物)，并且特别是骨髓衍生的MSC和脂肪衍生的MSC，本发明的MSC制剂(如具有至少103、104、105、106、107或甚至108个MSC的培养物)的涉及到细胞周期调控和老化的蛋白质具有统计学上显著降低的含量和/或酶活性。举例来说，该主题MSC制剂具有的蛋白酶体26S亚基非ATP酶调控性亚基11(PSMD11)蛋白质含量低于来自捐赠的人体组织(特别是衍生自成人骨髓或成人脂肪组织)的MSC的含量的75％，并且甚至更优选地低于60％、50％、40％、30％、20％或甚至10％。
在某些实施例中，相对于第1代(P1)、第2代(P2)、第3代(P3)、第4代(P4)和/或第5代(P5)的衍生自其他来源的MSC制剂(例如，衍生自捐赠的人体组织，如胎儿、婴儿、儿童、青少年或成人组织的培养物)，并且特别是骨髓衍生的MSC和脂肪衍生的MSC，本发明的MSC制剂(如具有至少103、104、105、106、107或甚至108个MSC的培养物)的涉及到细胞能量和/或脂质代谢的蛋白质具有统计学上显著降低的含量和/或酶活性。为了说明，对于涉及到ATP或NADPH合成的代谢路径，如糖酵解(如果糖二磷酸醛缩酶A，ALDOA；醛-酮还原酶家族1成员A1，AKR1A1；甘油醛-3-磷酸，GAPDH)；三羧酸循环(TCA循环)(如异柠檬酸脱氢酶1，IDH1)、磷酸戊糖路径(如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，G6PD)及葡糖醛酸生物合成路径中UDP-葡萄糖的生物合成(如UDP-葡萄糖-6-脱氢酶，UGDH)的一种或多种蛋白质，该主题MSC制剂具有的蛋白质含量低于来自捐赠的人体组织(特别是衍生自成人骨髓或成人脂肪组织)的MSC中的含量的90％，并且甚至更优选地低于60％、50％、40％、30％、20％或甚至10％。为进一步说明，对于涉及到脂质代谢的一种或多种蛋白质，如烯酰-CoA水合酶短链1(ECHS1)和/或乙酰-CoA乙酰转移酶(ACAT2)，该主题MSC制剂具有的蛋白质含量低于来自捐赠的人体组织(特别是衍生自成人骨髓或成人脂肪组织)的MSC中的含量的90％，并且甚至更优选地低于60％、50％、40％、30％、20％或甚至10％。
在某些实施例中，相对于第1代(P1)、第2代(P2)、第3代(P3)、第4代(P4)和/或第5代(P5)的衍生自其他来源的MSC制剂(例如，衍生自捐赠的人体组织，如胎儿、婴儿、儿童、青少年或成人组织的培养物)，并且特别是骨髓衍生的MSC和脂肪衍生的MSC，本发明的MSC制剂(如具有至少103、104、105、106、107或甚至108个MSC的培养物)的涉及到细胞凋亡的蛋白质具有统计学上显著降低的含量和/或酶活性。为说明，对于一种或多种蛋白质膜联蛋白A1(ANXA1)、A2(ANXA2)、A5(ANXA5)、电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1(VDAC1)和/或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，该主题MSC制剂具有的蛋白质含量低于来自捐赠的人体组织(特别是衍生自成人骨髓或成人脂肪组织)的MSC中的含量的90％，并且甚至更优选地低于60％、50％、40％、30％、20％或甚至10％。
在不受理论束缚情况下，相信本发明的成血管细胞衍生的MSC所展示的涉及到能量和/或脂质代谢和/或细胞凋亡的蛋白质的含量和/或酶活性的统计学上显著的差异至少部分可归因于这些制剂的均质性质。举例来说，本发明的成血管细胞衍生的MSC具有均质的MHC基因表达，即，完全地MHC相配的，不像成人衍生的MSC库，其中细胞是衍生自多个不同的供体，即，MHC错配的。MSC的治疗剂量为约200-800万个细胞/公斤(或每剂约13000-50000万个细胞)。
定义
如在此所使用，“多能细胞”和“多能干细胞”在广义上是指能够在体外长期或实际上无限期的增殖，同时保持其未分化状态，展现一种稳定(优选地正常)的核型并且具有在适当条件下分化成全部三种胚层(即，外胚层、中胚层及内胚层)的能力的一种细胞。典型地，多能细胞(a)当移植到免疫缺陷(SCID)小鼠中时能够诱发畸胎瘤；(b)能够分化成全部三种胚层的细胞类型(例如，外胚层、中胚层及内胚层细胞类型)；并且(c)表达至少一种hES细胞标记物(如Oct-4、碱性磷酸酶、SSEA 3表面抗原、SSEA 4表面抗原、NANOG、TRA 1 60、TRA 1 81、SOX2、REX1)。示例性多能细胞可以表达Oct-4、碱性磷酸酶、SSEA 3表面抗原、SSEA 4表面抗原、TRA 1 60和/或TRA 1 81。另外的示例性多能细胞包括但不限于，胚胎干细胞、诱导性多能细胞(iPS)细胞、胚胎衍生的细胞、由胚胎生殖(EG)细胞(例如，通过在FGF-2、LIF及SCF存在下进行培养)所产生的多能细胞、孤雌ES细胞、由培养的内细胞团细胞产生的ES细胞、由卵裂球产生的ES细胞及通过核转移(例如，体细胞核转移到接受者卵母细胞中)产生的ES细胞。示例性多能细胞可以在不破坏胚胎的情况下产生。举例来说，诱导性多能细胞可以由在不破坏胚胎情况下获得的细胞产生。作为另一个实例，多能细胞可以由活检的卵裂球产生(这可以在不会危害剩余胚胎的情况下实现)；任选地，剩余胚胎可以被低温保存，培养和/或植入适合宿主中。多能细胞(来自无论任何来源)可以被遗传修饰或以其他方式修饰成增加寿命、效力、归巢或在由这些多能细胞分化的细胞(例如MSC和成血管细胞)中递送所希望的因子。作为其非限制性实例，这些多能细胞可以被遗传修饰成表达Sirt1(藉此增加寿命)；任选地在可诱导或可阻遏启动子的控制下表达一种或多种端粒酶亚基的基因；并入荧光标记；并入氧化铁粒子或其他此类试剂(该试剂可以经由体内成像、MRI等而用于细胞追踪，参看秋(Thu)等，《自然-医学》(Nat Med.)2012年2月26日；18(3):463-7)；表达可以改善寿命的bFGF(参看郭(Go)等，《生物化学杂志》(J.Biochem.)142,741–748(2007))；表达用于归巢的CXCR4(参看史(Shi)等，《血液学》(Haematologica.)2007年7月；92(7):897-904)；表达重组TRAIL以诱导半胱天冬酶介导的如神经胶质瘤等癌细胞的细胞凋亡(参看萨斯普塔斯(Sasportas)等，《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci US A.)2009年3月24日；106(12):4822-7)等。
如在此所使用，“胚胎”或“胚胎的”在广义上是指尚未植入母体宿主的子宫膜中的正在发育的细胞团。“胚胎细胞”是从胚胎中分离或包含在胚胎中的细胞。这还包括早在两细胞阶段获得的卵裂球，和聚集的卵裂球。
“胚胎干细胞”(ES细胞或ESC)涵盖了由胚胎细胞(如由培养的内细胞团或培养的卵裂球)产生的多能细胞，以及诱导性多能细胞(进一步描述于下)。这些细胞常常是或已经以细胞系形式连续传代的。胚胎干细胞可以在如在此所描述的产生成血管细胞的过程中用作多能干细胞。举例来说，ES细胞可以通过本领域中已知的方法产生，包括从通过任何方法(包括通过有性或无性手段)，如用精子或精子DNA对卵细胞授精、核转移(包括体细胞核转移)或孤雌生殖产生的胚胎的衍生化。作为另一个实例，胚胎干细胞还包括通过体细胞核转移产生的细胞，甚至当在该过程中使用非胚胎细胞时。举例来说，ES细胞可以衍生自囊胚阶段胚胎的ICM，以及衍生自一个或多个卵裂球的胚胎干细胞。这些胚胎干细胞可以由通过授精或通过无性手段(包括体细胞核转移(SCNT)、孤雌生殖及单雄生殖)产生的胚胎材料产生。如以上进一步论述(参看“多能细胞”)，ES细胞可以被遗传修饰或以其他方式修饰成增加寿命、效力、归巢，或在由这些多能细胞分化的细胞(例如MSC和成血管细胞)中递送所希望的因子。
可以例如通过遗传操作、针对自发杂合性丧失进行筛选等产生在一个或多个HLA基因中具有纯合性或杂合性的ES细胞。ES细胞可以被遗传修饰或以其他方式修饰成增加寿命、效力、归巢，或在由这些多能细胞分化的细胞(例如MSC和成血管细胞)中递送所希望的因子。胚胎干细胞，无论其来源或用于产生其的特定方法如何，都典型地具有以下一种或多种属性：(i)分化成全部三种胚层的细胞的能力；(ii)表达至少Oct-4和碱性磷酸酶；及(iii)当移植到免疫受损的动物体内时产生畸胎瘤的能力。可以用于本发明的实施例中的胚胎干细胞包括但不限于，人ES细胞(“ESC”或“hES细胞”)，如MA01、MA09、ACT-4、No.3、H1、H7、H9、H14及ACT30胚胎干细胞。另外的示例性细胞系包括NED1、NED2、NED3、NED4、NED5及NED7。还参看NIH人胚胎干细胞登记处(NIH Human Embryonic Stem Cell Registry)。可以使用的一种示例性人胚胎干细胞系是MA09细胞。MA09细胞的分离和制备先前描述于基利曼斯卡亚(Klimanskaya)等(2006)“衍生自单个卵裂球的人胚胎干细胞系(Human EmbryonicStem Cell lines Derived from Single Blastomeres.)”《自然》(Nature)444:481–485中。根据本发明的示例性实施例使用的人ES细胞可以根据GMP标准进行衍生化并维持。
示例性hES细胞标记物包括但不限于：如碱性磷酸酶、Oct-4、Nanog、阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、Sox2、生长和分化因子3(GDF3)、减少的表达1(REX1)、成纤维细胞生长因子4(FGF4)、胚胎细胞特异性因子1(ESG1)、多能性发育相关性2(DPPA2)、DPPA4、端粒酶逆转录酶(hTERT)、SALL4、E-CADHERIN、簇命名30(Cluster designation 30，CD30)、Cripto(TDGF-1)、GCTM-2、Genesis、生殖细胞核因子及干细胞因子(SCF或c-Kit配体)。作为一个附加实例，胚胎干细胞可以表达Oct-4、碱性磷酸酶、SSEA 3表面抗原、SSEA 4表面抗原、TRA 1 60和/或TRA 181。
这些ESC可以最初与鼠类胚胎饲养层细胞(MEF)细胞共培养。这些MEF细胞可以在将ESC接种于共培养物中之前暴露于丝裂霉素C而有丝分裂地失活，并因此这些MEF不能在培养物中繁殖。另外地，ESC细胞培养物可以通过显微镜检查，并且可以例如使用干细胞切割工具、通过激光烧蚀或其他手段拣选出含非ESC细胞形态的集落并丢弃。典型地，在收集ESC用于接种以形成类胚体的时刻之后，未再使用MEF细胞。
如在此所使用，“胚胎衍生的细胞”(EDC)在广义上是指多能桑椹胚衍生的细胞、囊胚衍生的细胞(包括具有内细胞团、胚盾或上胚层的那些)或早期胚胎的其他多能干细胞，包括原始内胚层、外胚层及中胚层，以及其衍生物。“EDC”还包括卵裂球以及来自聚集的单个卵裂球或来自不同发育阶段的胚胎的细胞团，但不包括已经以细胞系形式传代的人胚胎干细胞。
示例性ESC细胞标记物包括但不限于：如碱性磷酸酶、Oct-4、Nanog、阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、Sox2、生长和分化因子3(GDF3)、减少的表达1(REX1)、成纤维细胞生长因子4(FGF4)、胚胎细胞特异性因子1(ESG1)、多能性发育相关性2(DPPA2)、DPPA4、端粒酶逆转录酶(hTERT)、SALL4、E-CADHERIN、簇命名30(CD30)、Cripto(TDGF-1)、GCTM-2、Genesis、生殖细胞核因子及干细胞因子(SCF或c-Kit配体)。
如在此所使用，“效力”在广义上是指试剂(如成血管细胞衍生的MSC)产生确定的作用的浓度，例如摩尔浓度。效力可以依据有效浓度(EC50)进行定义，它不涉及最大效应的测量，而是在沿剂量反应曲线的浓度轴的不同位置处的效应。效力还可以由量反应(EC50)或质反应剂量反应曲线(ED50、TD50及LD50)来确定；然而，效力优选地是通过EC50度量的。术语“EC50”是指药物、抗体或有毒物在某一指定的暴露时间之后诱导介于基线与最大效应之间的一半的反应的浓度。因此，量反应剂量反应曲线的EC50表示观察到最大效应的50％的化合物浓度。质反应剂量反应曲线的EC50表示在指定的暴露持续时间之后，该群体的50％展现出反应的化合物浓度。EC50可以使用以下方式测定：动物研究，其中一种确定的动物模型响应于该药物的应用而呈现可测量的生理变化；基于细胞的分析，这些分析使用了一种指定的细胞系统，在添加药物时，该系统呈现一种可测量的生物反应；和/或酶促反应，其中该药物的生物活性可以通过在由该药物所促进的化学反应之后产物的积累来测量。优选地，提出一种免疫调控分析来测定EC50。此类免疫调控分析的非限制性实例包括细胞内细胞因子、细胞毒性、调控能力、细胞信号传导能力、增殖能力、细胞凋亡评价及其他分析。
如在此所使用，“间充质干细胞”(MSC)是指具有自我更新能力并且能够分化成为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等间充质细胞谱系的专能干细胞。除这些特征外，MSC还可以通过如在此进一步描述的一种或多种标记物的表达来鉴别。这些细胞可以用于治疗多种临床病状，包括免疫病症以及退化性疾病，如移植物抗宿主疾病(GVHD)、心肌梗塞以及发炎性和自体免疫疾病和病症等等。除非上下文另作指示，否则MSC可以包括来自成人来源和脐血的细胞。MSC(或产生其的细胞，如多能细胞)可以被遗传修饰或以其他方式修饰成增加寿命、效力、归巢，或在MSC或由这些MSC分化的细胞中递送所希望的因子。作为其非限制性实例，这些MSC细胞可以被遗传修饰成表达Sirt1(藉此增加寿命)；任选地在可诱导或可阻遏启动子的控制下表达一种或多种端粒酶亚基的基因；并入荧光标记；并入氧化铁粒子或其他此类试剂(该试剂可以经由体内成像、MRI等而用于细胞追踪，参看秋等，《自然-医学》2012年2月26日；18(3):463-7)；表达可以改善寿命的bFGF(参看郭等，《生物化学杂志》142,741–748(2007))；表达用于归巢的CXCR4(参看史等，《血液学》2007年7月；92(7):897-904)；表达重组TRAIL以诱导半胱天冬酶介导的如神经胶质瘤等癌细胞的细胞凋亡(参看萨斯普塔斯等，《美国国家科学院院刊》2009年3月24日；106(12):4822-7)等。
如在此所使用，“疗法”、“治疗性”、“治疗着(treating)”、“治疗了(treat)”或“治疗(treatment)”在广义上是指治疗疾病，使该疾病或其临床症状的发展停滞或减少，和/或减轻该疾病，使该疾病或其临床症状消退。疗法涵盖预防、防止、治疗、治愈、矫正、减少、缓解和/或使疾病、症候和/或疾病的症状减轻。疗法涵盖了具有正在进行的疾病症候和/或症状(例如肌肉无力、多发性硬化)的患者的症候和/或症状的缓解。疗法还涵盖“预防”和“防止”。预防包括了在疾病治疗之后，防止患者发生疾病，或减少患者疾病的发生率或严重程度。出于疗法的目的，术语“减少”在广义上是指症候和/或症状的临床显著减少。疗法包括了治疗复发性或再发性症候和/或症状(例如，视网膜变性、视力丧失)。疗法涵盖但不限于，在任何时候阻止症候和/或症状的出现以及减少现有症候和/或症状，和消除现有症候和/或症状。疗法包括了治疗慢性疾病(“维持”)和急性疾病。举例来说，治疗包括了治疗或防止症候和/或症状(例如肌肉无力、多发性硬化)的复发或再发。
为了维持法规遵从性，MSC库必须维持足够的细胞供应量，例如以提供足够数量的细胞来治疗至少数百到10,000名患者，MSC库必须具有至少500亿个MSC。本发明涵盖了服从GMP和/或低温保存的MSC库。在一个方面，本发明的MSC制剂包含至少1010个成血管细胞衍生的MSC。在另一个方面，本发明提供了一种MSC制剂，该制剂包含至少1011、1012、1013或1014个成血管细胞衍生的MSC。
如在此所使用，“使病变正常化”是指使由疾病引起的异常结构和/或功能恢复到更为正常的状态。正常化表明，通过对组织、器官、细胞类型等的由疾病引起的结构和/或功能异常进行校正，该病变的进展可以得到控制并改善。举例来说，在用本发明的ESC-MSC治疗之后，由自体免疫病症(例如MS)引起的免疫系统异常可以得到改善、校正和/或恢复。
诱导性多能干细胞
另外的示例性多能干细胞包括通过因子(“再编程因子”)的组合的表达或诱导表达来对体细胞再编程而产生的诱导性多能干细胞(iPS细胞)。iPS细胞可以使用胎儿、初生婴儿、新生儿、青少年或成人体细胞来产生。iPS细胞可以从细胞库获得。作为替代方案，iPS细胞可以是在开始分化成RPE细胞或另一细胞类型之前新产生的(通过本领域中已知的方法)。iPS细胞的制备可以是产生分化的细胞的一个初始步骤。iPS细胞可以使用来自特定患者或相配供体的材料特定地产生，以达到产生组织相配的RPE细胞的目标。iPS细胞可以由在预定的接受者体内基本上无免疫原性的细胞产生，例如，由自体细胞或由与预定的接受者可组织相容的细胞产生。如以上进一步论述(参看“多能细胞”)，包括iPS细胞的多能细胞可以被遗传修饰或以其他方式修饰成增加寿命、效力、归巢，或在由这些多能细胞分化的细胞(例如MSC和成血管细胞)中递送所希望的因子。
作为另一个实例，诱导性多能干细胞可以通过使体细胞或其他细胞与一种或多种再编程因子接触以对该细胞进行再编程来产生。举例来说，这一个或多个再编程因子可以通过该细胞，例如由添加到细胞中外源核酸，或由响应于促进或诱导基因表达的因子(如小分子、微RNA等)的内源基因表达(参看苏(Suh)和布罗奇(Blelloch)，《发育》(Development)138,1653-1661(2011)；三好(Miyosh)等，《细胞—干细胞》(Cell Stem Cell)(2011),doi:10.1016/j.stem.2011.05.001；萨科奥-马丁内兹(Sancho-Martinez)等，《分子细胞生物学杂志》(Journal of Molecular Cell Biology)(2011)1–3；安诺凯-丹索(Anokye-Danso)等，《细胞—干细胞》8,376–388，2011年4月8日；奥金(Orkin)和霍查林格(Hochedlinger)，《细胞》(Cell)145,835-850，2011年6月10日，这些文献各自以全文引用的方式结合于此)。再编程因子可以由外源来源，例如，通过添加到培养基中来提供，并且可以通过本领域中已知的方法，如通过偶合到细胞进入肽、蛋白质或核酸转染剂、脂转染、电穿孔、轰击粒子递送系统(基因枪)、微注射等引入细胞中。iPS细胞可以使用胎儿、初生婴儿、新生儿、青少年或成人体细胞来产生。在某些实施例中，可以用于将体细胞再编程成为多能干细胞的因子包括例如Oct4(有时称为Oct 3/4)、Sox2、c-Myc及Klf4的组合。在其他实施例中，可以用于将体细胞再编程成为多能干细胞的因子包括例如Oct-4、Sox2、Nanog及Lin28的组合。在其他实施例中，通过表达至少2种再编程因子、至少三种再编程因子或四种再编程因子来对体细胞进行再编程。在其他实施例中，鉴别出另外的再编程因子并将其单独或与一种或多种已知的再编程因子组合使用以将体细胞再编程成为多能干细胞。iPS细胞典型地可以通过与胚胎干细胞相同的标记物的表达来鉴别，不过特定iPS细胞系的表达谱可能不同。
诱导性多能干细胞可以通过在体细胞中对一种或多种再编程因子进行表达或诱导表达来产生。该体细胞是成纤维细胞，如真皮成纤维细胞、滑膜成纤维细胞或肺成纤维细胞，或非成纤维细胞的体细胞。该体细胞是通过表达至少1、2、3、4、5种再编程因子进行再编程的。这些再编程因子可以选自Oct 3/4、Sox2、NANOG、Lin28、c Myc及Klf4。这些再编程因子的表达可以通过使体细胞与至少一种诱导再编程因子表达的试剂(如小分子试剂)接触来诱导。
该体细胞还可以使用一种组合方法进行再编程，其中对该再编程因子进行表达(例如使用病毒载体、质粒等)并且诱导该再编程因子的表达(例如使用小有机分子)。举例来说，再编程因子可以通过使用病毒载体(如逆转录病毒载体或慢病毒载体)感染而在体细胞中进行表达。再编程因子也可以使用非整合型载体(如游离型质粒)在体细胞中进行表达。参看例如，余(Yu)等，《科学》(Science)，2009年5月8日；324(5928):797-801，该案以全文引用的方式结合于此。当使用非整合型载体来表达再编程因子时，这些因子可以使用电穿孔、转染或用载体转化体细胞在细胞中进行表达。举例来说，在小鼠细胞中，使用整合型病毒载体表达四种因子(Oct3/4、Sox2、c myc及Klf4)足以对体细胞进行再编程。在人类细胞中，使用整合型病毒载体表达四种因子(Oct3/4、Sox2、NANOG及Lin28)足以对体细胞进行再编程。
一旦在细胞中表达了这些再编程因子，就可以对这些细胞进行培养。随时间推移，具有ES特征的细胞出现在培养皿中。可以基于例如ES形态，或基于可选择或可检测标记物的表达对这些细胞进行选择并继代培养。这些细胞可以经过培养以产生类似ES细胞的细胞培养物—这些是推定的iPS细胞。iPS细胞典型地可以通过与其他胚胎干细胞相同的标记物的表达来鉴别，不过特定iPS细胞系的表达谱可能不同。示例性iPS细胞可以表达Oct-4、碱性磷酸酶、SSEA 3表面抗原、SSEA 4表面抗原、TRA 1 60和/或TRA 1 81。
为了确认iPS细胞的多能性，可以在一种或多种多能性分析中对这些细胞进行测试。举例来说，可以测试这些细胞中ES细胞标记物的表达；可以评价这些细胞当移植到SCID小鼠体内时产生畸胎瘤的能力；可以评价这些细胞分化产生全部三种胚层的细胞类型的能力。一旦获得了多能iPS细胞，就可以使用其来产生成血管细胞和MSC细胞。
成血管细胞
成血管细胞是专能的并且用作血细胞形成和内皮细胞谱系的常用前体。在胚胎发育期间，相信它们是作为移行细胞类型产生，该细胞类型在早期中胚层发育期间出现并且定殖原始血岛(蔡(Choi)等，《发育》125(4):725-732(1998))。一旦存在，成血管细胞就能够产生原始和确定的造血细胞、HSC及内皮细胞(米科拉(Mikkola)等，《血液疗法与干细胞研究杂志》(J.Hematother.Stem Cell Res)11(1):9-17(2002))。
成血管细胞可以在体外衍生自小鼠ESC(肯尼迪(Kennedy)等，《自然》(386):488-493(1997)；佩林杰罗(Perlingeiro)等，《干细胞》(Stem Cells)(21):272-280(2003))和人ESC(参考文献14、15，余等，《血液学》(Blood)2010 116:4786-4794)。其他研究要求从脐带血分离成血管细胞(波多尼(Bordoni)等，《肝脏学》(Hepatology)45(5)1218-1228)，从外周血液分离循环的CD34-lin-CD45-CD133-细胞(奇拉齐(Ciraci)等，《血液学》118:2105-2115)以及从小鼠子宫分离这些细胞(孙(Sun)等，《血液学》116(16):2932-2941(2010))。已经通过在液体培养物中生长的细胞簇的培养和分化，随后细胞在含有不同细胞因子和生长因子的半固体培养基中生长，获得了小鼠和人ESC衍生的成血管细胞(肯尼迪，佩林杰罗，参考文献14、15)；还参看美国专利第8,017,393号，该案以全文引用的方式结合于此。出于本申请的目的，术语成血管细胞还包括美国专利第8,017,393号中描述的血管集落形成细胞，这些细胞除能够分化成血细胞形成和内皮细胞谱系外，还能够成为平滑肌细胞并且对CD34、CD31、KDR及CD133不呈阳性。可用于在此所描述的方法中的成血管细胞可以衍生自或获自这些已知方法中的任一种。举例来说，可以通过在非附着条件下，例如在低粘附基质上或在“悬滴”中培养多能细胞来形成类胚体。在这些培养物中，ES细胞可以形成细胞丛或细胞簇，命名为类胚体。参看伊斯克维兹-爱多(Itskovitz-Eldor)等，《分子医学》(Mol Med.)2000年2月；6(2):88-95，以全文引用的方式结合于此。典型地，类胚体最初以固体多能细胞丛或簇形式形成，并且随时间推移，一些类胚体成为包括流体填充的空腔，后者的形成物在文献中称为“简单”EB并且后者称为“囊状”类胚体。同上文。这些EB(固体形式和囊状形式)中的细胞可以分化并且随时间推移而产生递增数量的细胞。任选地，EB接着可以作为粘附培养物进行培养并使其形成突起生长。同样，允许过度生长并形成多层细胞群的多能细胞可以随时间而分化。
在一个实施例中，成血管细胞是通过多个步骤产生，这些步骤包括(a)培养ESC系2、3、4、5、6或7天以形成细胞簇，并且(b)诱导所述细胞簇分化成为成血管细胞。在另一个实施例中，将步骤(b)中的细胞簇在富含细胞因子、无血清的基于甲基纤维素的培养基中培养(14，15)。
在一个实施例中，成血管细胞是通过多个步骤产生，这些步骤包括(a)培养ESC系2、3、4、5、6或7天以形成细胞簇，该ESC系选自下组，该组由以下各项组成：MA09、H7、H9、MA01、HuES3及H1gfp，并且(b)通过在富含细胞因子、无血清的基于甲基纤维素的培养基中进行培养来诱导所述细胞簇分化成为成血管细胞。
在另一个实施例中，成血管细胞是如在此所描述，通过诱导任何多能细胞来产生。在另一个实施例中，成血管细胞是通过诱导多能细胞分化而产生的，该多能细胞选自下组，该组包括囊胚、铺板的ICM、一个或多个卵裂球，或植入前阶段的胚胎或类胚胎结构的其他部分，不管是通过授精、体细胞核转移(SCNT)、孤雌生殖、单雄生殖，或者其他有性或无性手段产生的，以及通过再编程衍生化的ESC(例如，iPS细胞)。在又另一个实施例中，成血管细胞是由iPS细胞产生的，其中这些iPS细胞是使用外源地添加的因子或本领域中已知的其他方法(如蛋白质或微RNA)产生的(参看周(Zhou)等，《细胞—干细胞》(4):1-4,2009；三好等，《细胞—干细胞》(8):1-6,2011；丹索(Danso)等，《细胞—干细胞》(8):376-388,2011)。
在另一个方面，本披露提供了间充质基质细胞(MSC)的制剂以及使用成血管细胞产生MSC的方法。该MSC可以在一个或多个方面不同于现有的MSC，如在此进一步描述。在一个实施例中，成血管细胞是在使用无血清甲基纤维素培养基加一种或多种成分的培养物中至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天，通过诱导多能细胞之后收集，这一种或多种成分选自下组，该组包括青霉素/链霉素(pen/strp)、生长补充剂(一种水溶性浓缩物，包含9.0-11.0g/L的胆固醇及13.0-18.0g/L的脂蛋白和脂肪酸，pH 7-8.4)、Flt3-配体(FL)、血管内皮生长因子(VEGF)、促血小板生成素(TPO)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞衍生的因子(SCF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素3(IL3)及白细胞介素6(IL6)；该多能细胞选自下组，该组包括囊胚、铺板的ICM、一个或多个卵裂球，或植入前阶段的胚胎或类胚胎结构的其他部分，不管是通过授精、体细胞核转移(SCNT)、孤雌生殖、单雄生殖，或者其他有性或无性手段产生的，以及通过再编程衍生化的细胞(例如，iPS细胞)。在本发明的一个优选的实施例中，成血管细胞是在例如无血清甲基纤维素加前一实施例的多种成分中培养介于6-14天之间来收集的。在一个优选的实施例中，这些成分是以下列浓度存在于所述培养基中：50ng/ml的Flt3-配体(FL)、50ng/ml的血管内皮生长因子(VEGF)、50ng/ml的促血小板生成素(TPO)，及20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、50ng/ml的干细胞衍生的因子(SCF)、20ng/ml的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、20ng/ml的白细胞介素3(IL3)、20ng/ml的白细胞介素6(IL6)，50ng/ml的FL、50ng/ml的VEGF、50ng/ml的TPO及30ng/ml的bFGF。
在另一实施例中，将基本上包含成血管细胞的细胞簇再铺板并且培养至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36天，从而形成间充质基质细胞制剂。在一个实施例中，间充质基质细胞是通过多个步骤产生的，这些步骤包括(a)培养ESC 8-12天，(b)对形成细胞簇的成血管细胞进行收集，(c)对步骤(b)的成血管细胞进行再铺板，并且(d)培养步骤(c)的成血管细胞介于14-30天之间。
在一个实施例中，对这些成血管细胞进行收集，再铺板并且在液体培养基中在无饲养层条件下培养，其中在该培养物中不含饲养层细胞，如小鼠胚胎成纤维细胞、OP9细胞或本领域普通技术人员已知的其他细胞类型。在一个优选的实施例中，成血管细胞是在细胞外基质上培养的。在另一个优选的实施例中，成血管细胞是在细胞外基质上培养的，其中所述基质包含来自英格布雷-霍尔姆-斯沃姆(EHS)小鼠肉瘤细胞的可溶性制剂，该制剂在室温下胶凝以形成一种复水的基底膜(基质胶)。在又另一个优选的实施例中，成血管细胞是根据多个步骤产生的，这些步骤包括(a)在基质胶上培养所述成血管细胞至少7天，(b)将步骤(a)的成血管细胞转移到未涂布的组织培养板上并且另外培养步骤(b)的所述成血管细胞介于约7到14天。这些成血管细胞可以在包含一种或多种因子的基质上培养，该一种或多种因子选自下组，该组由以下各项组成：转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、类胰岛素生长因子1、牛成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或血小板衍生的生长因子(PDGF)、人基底膜提取物(BME)(例如，特维基公司的Cultrex BME(Cultrex BME,Trevigen))或EHS基质、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、胶原蛋白(例如，胶原蛋白I、胶原蛋白IV)及硫酸乙酰肝素。所述基质或基质组分可以是哺乳动物，或更具体地说人类起源的。在一个实施例中，将成血管细胞在涂有基质胶的板上在一种含血清液体培养基中培养，其中该培养基可以包含选自以下各项的成分：补充有10％-20％胎牛血清的αMEM(西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)(αMEM+20％FCS)、补充有10％-20％热灭活人AB血清的αMEM及补充有10％-20％热灭活人AB血清的IMDM。
通过培养成血管细胞产生的间充质基质细胞
本发明的一个实施例包含了改善的间充质基质细胞。本发明的间充质基质细胞可以由成血管细胞，使用改善的成血管细胞培养方法产生。
与直接地衍生自ESC的间充质基质细胞相比，本发明的间充质基质细胞可以保持更高水平的效力并且不会丛生或可能基本上更少地丛生。在本发明的一个实施例中，与直接地衍生自ESC的间充质基质细胞相比，根据本发明的任一种或多种方法产生的间充质基质细胞制剂保持了更高水平的效力，并且不丛生或基本上更少地丛生。
本发明的一个实施例提供了一种培养成血管细胞以产生间充质基质细胞制剂的方法，其中所述间充质基质细胞保留了一种年轻的表型。本发明的间充质基质细胞的药物制剂当给予需要治疗的哺乳动物宿主时，可以呈现出改善的治疗特性。
本发明的一个实施例提供了一种通过培养人成血管细胞产生的间充质基质细胞制剂。本发明的另一个实施例提供了一种通过培养人成血管细胞来产生间充质基质细胞制剂的方法。本发明方法的一个实施例，其中所述人成血管细胞是在无饲养层条件下培养，然后被铺板于一种基质上。本发明的又另一个实施例，其中所述基质是选自下组，该组包括转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、类胰岛素生长因子1、牛成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、胶原蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、硫酸乙酰肝素、来自英格布雷-霍尔姆-斯沃姆(EHS)小鼠肉瘤细胞的可溶性制剂、基质胶及人基底膜提取物。在再另一个实施例中，所述基质可以衍生自哺乳动物或人类起源。
在另一个实施例中，成血管细胞是在包含血清或一种血清代用品的一种培养基(如补充有20％胎牛血清的ɑMEM)中培养的。在另一个实施例中，将成血管细胞在一种基质上培养约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。.在本发明的又另一个实施例中，间充质基质细胞制剂是通过多个步骤产生的，这些步骤包括(a)在基质胶上培养成血管细胞约7天，(b)将步骤(a)的成血管细胞自基质胶移出并使这些成血管细胞在未涂布的组织培养盘上再生长9-100天，约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100天。
在本发明的一个实施例中，间充质基质细胞制剂是通过在包含血清或一种血清代用品的一种培养基(如补充有20％胎牛血清的aMEM)中培养成血管细胞而产生的。在本发明的另外的实施例中，将所述成血管细胞在一种基质上培养约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。
在本发明的一个实施例中，成血管细胞是由ESC分化的。在本发明的另一个实施例中，先前实施例的成血管细胞是由ESC分化的，其中，所述ESC是选自下组，该组包括iPS、MA09、H7、H9、MA01、HuES3、H1gfp、内细胞团细胞及卵裂球。
本发明的一个实施例包含了通过一种方法产生的一种间充质基质细胞制剂，其中成血管细胞是由ESC分化的。在本发明的另一个实施例中，先前实施例的成血管细胞是由ESC分化的，其中，所述ESC是选自下组，该组包括iPS、MA09、H7、H9、MA01、HuES3、H1gfp、内细胞团细胞及卵裂球。
在本发明的一个实施例中，成血管细胞是由ESC，通过以下多个步骤分化，这些步骤包括(a)在例如血管内皮生长因子(VEGF)和/或骨形态发生蛋白4(BMP-4)存在下培养ESC，以形成细胞簇；(b)在至少一种生长因子(例如，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)及骨形态发生蛋白4(BMP-4)、干细胞因子(SCF)、Flt 3L(FL)、促血小板生成素(TPO)和/或tPTD-HOXB4)存在下培养所述细胞簇，该生长因子的量足以诱导所述细胞簇分化成为成血管细胞；并且(c)在包含至少一种另外的生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素(EPO)、干细胞因子(SCF)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白4(BMP-4)及tPTD-HOXB4)的培养基中培养所述成血管细胞，其中所述至少一种另外的生长因子是以足以在所述培养物中扩增所述细胞簇的量提供，并且其中铜被任选地添加到步骤(a)-(c)中的任一个中。
在本发明的一个实施例中，间充质基质细胞制剂是通过培养成血管细胞产生的，其中所述成血管细胞是由ESC，通过以下多个步骤分化，这些步骤包括(a)在血管内皮生长因子(VEGF)和骨形态发生蛋白4(BMP-4)存在下培养ESC，在起始所述培养的0-48小时内形成细胞簇；(b)在至少一种生长因子存在下培养所述细胞簇，该生长因子选自下组，该组包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白4(BMP-4)、干细胞因子(SCF)、Flt 3L(FL)、促血小板生成素(TPO)及tPTD-HOXB4，其量足以诱导所述细胞簇分化成为成血管细胞；并且(c)在包含至少一种另外的生长因子的培养基中培养所述成血管细胞，该生长因子选自下组，该组包括胰岛素、转铁蛋白、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素(EPO)、干细胞因子(SCF)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白4(BMP-4)及tPTD-HOXB4，其中所述至少一种另外的生长因子是以足以在所述培养物中扩增人细胞簇的量提供。
在另一个实施例中，间充质基质细胞制剂是通过多个步骤产生的，这些步骤包括(a)在诱导ESC分化成为成血管细胞至少6、7、8、9、10、11、12、13或14天之后，收集所述成血管细胞，并且(b)收集间充质基质细胞，这些细胞是在诱导来自步骤(a)的所述成血管细胞分化成为所述间充质细胞的约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50天内产生的。
在又另一个实施例中，具有至少8000、8500、9000、9500、10000、12500或12500万个间充质基质细胞的制剂是由约200,000个成血管细胞在培养这些成血管细胞的约26、27、28、29、30、31、32、33、34或35天内产生的，其中所述间充质基质细胞制剂包含不到约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％的人胚胎干细胞。在再另一个实施例中，至少8000、8500、9000、10000、12500或15000万个间充质基质细胞是由约200,000个成血管细胞在培养这些成血管细胞的约26、27、28、29、30、31、32、33、34或35天内产生的。
在本发明方法的一个实施例中，间充质基质细胞制剂关于人胚胎干细胞是基本上纯化的。在本发明方法的另一个实施例中，间充质基质细胞制剂关于人胚胎干细胞是基本上纯化的，由此所述制剂包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的间充质基质细胞。
在本发明的另一个实施例中，通过本发明方法中的任一种或多种产生的间充质基质细胞制剂当引入宿主体内时不会形成畸胎瘤。
在本发明的另一个实施例中，间充质基质细胞制剂中至少50％在培养约7-20(例如15)天内对CD105或CD73呈阳性。在本发明的一个优选的实施例中，根据本发明的任一种或多种方法产生的间充质基质细胞制剂中至少50％在培养约7-15天之后对CD105或CD73呈阳性。在本发明的又一个实施例中，间充质基质细胞制剂中至少80％在培养约20天内对CD105和CD73呈阳性。在本发明又另一个实施例中，根据本发明方法中的任一种或多种产生的间充质基质细胞制剂中至少80％在培养约20天内对CD105和CD73呈阳性。
在一个示例性方面，本披露提供了一种适合用于哺乳动物患者的药物制剂，该药物制剂包含至少106个间充质基质细胞和一种药学上可接受的载体，其中这些间充质基质细胞具有的复制能力使得在细胞培养物中经历至少10次群体倍增，并且这些细胞中不到25％到第十次倍增时经历细胞死亡、衰老或分化成为非MSC细胞。
在一个示例性方面，本披露提供了一种适合用于哺乳动物患者的药物制剂，该药物制剂包含至少106个间充质基质细胞和一种药学上可接受的载体，其中这些间充质基质细胞具有的复制能力使得在细胞培养物中经历至少5次传代，并且这些细胞中不到25％到第5次传代时经历细胞死亡、衰老或分化成为成纤维细胞。
在一个示例性方面，本披露提供一种药物制剂，该药物制剂包含至少106个间充质基质细胞和一种药学上可接受的载体，其中这些间充质基质细胞是由成血管细胞分化的。
在一个示例性方面，本披露提供一种低温细胞库，该细胞库包含至少108个间充质基质细胞，其中这些间充质基质细胞具有的复制能力使得在细胞培养物中经历至少10次群体倍增，并且这些细胞中不到25％到第十次群体倍增时经历细胞死亡、衰老或分化成为成纤维细胞。
在一个示例性方面，本披露提供一种纯化的细胞制剂，该制剂包含至少106个间充质基质细胞和不到百分之一的任何其他细胞类型，其中这些间充质基质细胞具有的复制能力使得在细胞培养物中经历至少10次群体倍增，并且这些细胞中不到25％到第十次群体倍增时经历细胞死亡、衰老或分化成为非MSC细胞。
这些间充质基质细胞可以由一种多能干细胞来源分化，如胚胎干细胞系或诱导性多能干细胞系。举例来说，该制剂或库的所有间充质基质细胞都可以由一种常见的多能干细胞来源分化。另外地，这些间充质基质细胞可以由一种多能干细胞来源分化，在培养物中传代以扩增间充质基质细胞的数量，并且在不到二十次群体倍增之后从培养物分离。
这些间充质基质细胞可以在HLA基因型方面是相同的。这些间充质基质细胞可以在基因组方面是相同的。
这些间充质基质细胞中至少30％可能对CD10呈阳性。另外地，这些间充质基质细胞中至少60％可能对标记物CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD44以及CD166和HLA-ABC呈阳性。在一个示例性实施例中，这些间充质基质细胞中不到30％可能对标记物CD31、CD34、CD45、CD133、FGFR2、CD271、Stro-1、CXCR4及TLR3呈阳性。
这些间充质基质细胞具有的复制率可以在不到25天里在细胞培养物中经历至少10次群体倍增。这些间充质基质细胞可以具有一种平均末端限制性片段长度(TRF)，该长度可能长于8kb。相对于经历了五次群体倍增的衍生自骨髓的间充质基质细胞，这些间充质基质细胞的涉及(i)细胞周期调控和细胞老化、(ii)细胞能量和/或脂质代谢及(iii)细胞凋亡中一种或多种的蛋白质可以具有一种统计学上显著降低的含量和/或酶活性。相对于衍生自骨髓的间充质基质细胞制剂，这些间充质基质细胞的涉及细胞骨架结构及其相关细胞动力学的蛋白质可以具有一种统计学上显著增加的含量和/或酶活性。这些间充质基质细胞在培养物中经10次群体倍增可能不经历超过75％的具有通过流式细胞术测量的超过5,000,000的前向散射光值的细胞增加。这些间充质基质细胞可以处于一种休眠状态，对编码白细胞介素-6的mRNA进行表达，其表达水平可能低于处于一种休眠状态的衍生自骨髓或脂肪组织的间充质基质细胞制剂所表达的IL-6mRNA水平的百分之十。
该制剂可以适合给予人类患者。该制剂可以适合给予非人类兽类哺乳动物。
在一个示例性方面，本披露提供了一种包含间充质基质细胞的药物制剂，其中所述间充质基质细胞能够经历至少10次群体倍增，并且其中该10次群体倍增在约27天，更优选地不到约26天，优选地不到25天，更优选地不到约24天，又更优选地不到约23天，又更优选地不到约22天，或更短时间内发生。
在一个示例性方面，本披露提供了一种包含间充质基质细胞的药物制剂，其中所述间充质基质细胞能够经历至少15次群体倍增。
所述间充质基质细胞能够经历至少20、25、30、35、40、45、50或更多次群体倍增。
在一个示例性方面，本披露提供了一种包含间充质基质细胞的药物制剂，其中所述间充质基质细胞能够在培养物中经历至少15次群体倍增、至少20次群体倍增或至少25次群体倍增。
这些间充质基质细胞可以通过成血管细胞的体外分化来产生。这些间充质基质细胞可以是灵长类动物细胞或其他哺乳动物细胞。这些间充质基质细胞可以是人类细胞。
所述群体倍增在约35天内，更优选地在约34天内，优选地在33天内，更优选地在32天内，又更优选地在31天内，或又更优选地在约30天内发生。
该制剂可以包含不到约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％的多能细胞。
该制剂可以不含多能细胞。
该制剂可以包含至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的间充质基质细胞。
所述间充质基质细胞中至少50％可能对于以下各项呈阳性：(i)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73及CD90中的至少一种；(ii)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD 44、CD166、CD274及HLA-ABC中的至少一种；(iii)CD105、CD73和/或CD90；或(iv)其任何组合。所述间充质基质细胞中至少50％可能对于以下各项呈阳性：(i)CD105、CD73和/或CD90中的至少两种；(ii)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73及CD90中的至少两种；或(iii)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD44、CD166、CD274及HLA-ABC的全部。所述间充质基质细胞中至少50％(i)可能对于CD105、CD73及CD90全部呈阳性；(ii)对CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD 44、CD166、CD274及HLA-ABC全部呈阳性，和/或(ii)可能对CD31、34、45、133、FGFR2、CD271、Stro-1、CXCR4和/或TLR3呈阴性，或者不到5％或不到10％的细胞表达CD31、34、45、133、FGFR2、CD271、Stro-1、CXCR4和/或TLR3。所述间充质基质细胞中至少60％、70％、80％或90％可能对于以下各项呈阳性：(i)CD105、CD73及CD90中的一种或多种；(ii)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73及CD90中的一种或多种；或(iii)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD 44、CD166、CD274及HLA-ABC中的一种或多种。
该药物制剂可以包含有效治疗有需要的受试者体内的不想要的免疫反应的量的间充质基质细胞。
该药物制剂可以包含供移植到有需要的接受者体内的其他细胞、组织或器官。这些其他细胞或组织可以是RPE细胞、皮肤细胞、角膜细胞、胰腺细胞、肝细胞、心脏细胞，或含有所述细胞中任一种的组织。所述间充质基质细胞可以不是衍生自骨髓，并且该制剂在免疫调控分析中的效力可以高于骨髓衍生的间充质基质细胞制剂的效力。效力可以通过一种测定EC50剂量的免疫调控分析来进行分析。该制剂在十次群体倍增之后可以保留介于约50％与100％之间的其增殖能力。
所述间充质基质细胞可以不是直接地衍生自多能细胞，并且其中所述间充质基质细胞(a)不会丛生或比直接地衍生自多能细胞的间充质基质细胞基本上更少地丛生；(b)与直接地衍生自多能细胞的间充质基质细胞相比较，当分裂时更易于分散；(c)数量可以比当以相等数量的多能细胞开始时直接地衍生自多能细胞的间充质基质细胞更多；和/或(d)比直接地衍生自多能细胞的间充质基质细胞更早地获得特征性间充质细胞表面标记物。
所述间充质基质细胞可以是哺乳动物的。所述间充质基质细胞可以是人类、犬科、牛科、非人类灵长类动物、鼠类、猫科或马科的
在一个示例性方面，本披露提供了一种用于产生间充质基质细胞的方法，该方法包括在产生间充质基质细胞的条件下培养成血管细胞。所述成血管细胞可以在无饲养层条件下培养。所述成血管细胞可以被铺板于一种基质上。所述基质可以包含以下各项中的一种或多种：转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、类胰岛素生长因子1、牛成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或血小板衍生的生长因子(PDGF)。所述基质可以选自下组，该组由以下各项组成：层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、胶原蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、硫酸乙酰肝素、基质胶(一种来自英格布雷-霍尔姆-斯沃姆(EHS)小鼠肉瘤细胞的可溶性制剂)、人基底膜提取物及其任何组合。所述基质可以包含一种来自英格布雷-霍尔姆-斯沃姆小鼠肉瘤细胞的可溶性制剂。
所述间充质基质细胞可以是哺乳动物的。所述间充质基质细胞可以是人类、犬科、牛科、非人类灵长类动物、鼠类、猫科或马科的。
所述成血管细胞可以在包含αMEM的一种培养基中培养。所述成血管细胞可以在包含血清或血清代用品的一种培养基中培养。所述成血管细胞可以在包含了补充有0％、0.1％-0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％胎牛血清的αMEM的一种培养基中培养。所述成血管细胞可以在所述基质上培养至少约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。
所述成血管细胞可以由多能细胞分化。
所述多能细胞可以是由卵裂球产生的iPS细胞或多能细胞。所述多能细胞可以衍生自一个或多个卵裂球，而不会破坏人胚胎。
所述成血管细胞可以由多能细胞，通过一种方法分化，该方法包括(a)培养所述多能细胞以形成细胞簇。这些多能细胞可以在血管内皮生长因子(VEGF)和/或骨形态发生蛋白4(BMP-4)存在下培养。在步骤(a)中，这些多能细胞可以在血管内皮生长因子(VEGF)和/或骨形态发生蛋白4(BMP-4)存在下培养。所述VEGF和BMP-4可以在起始所述细胞培养的0-48小时内添加到该多能细胞培养物中，并且所述VEGF可以任选地以20-100nm/mL的浓度添加，并且所述BMP-4可以任选地以15-100ng/mL的浓度添加。所述VEGF和BMP-4可以在起始所述细胞培养的0-48小时内添加到步骤(a)的细胞培养物中，并且所述VEGF可以任选地以20-100nm/mL的浓度添加，并且所述BMP-4可以任选地以15-100ng/mL的浓度添加。所述成血管细胞可以由多能细胞，通过一种方法分化，该方法可以另外包括：(b)在至少一种生长因子存在下培养所述细胞簇，该生长因子的量足以诱导所述细胞簇分化成为成血管细胞。步骤(b)中添加的所述至少一种生长因子可以包含以下各项中的一种或多种：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白4(BMP-4)、干细胞因子(SCF)、Flt 3L(FL)、促血小板生成素(TPO)、EPO和/或tPTD-HOXB4。
步骤(b)中添加的所述至少一种生长因子可以包含以下各项中的一种或多种：约20-25ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、约20-100ng/ml的血管内皮生长因子(VEGF)、约15-100ng/ml的骨形态发生蛋白4(BMP-4)、约20-50ng/ml的干细胞因子(SCF)、约10-50ng/ml的Flt 3L(FL)、约20-50ng/ml的促血小板生成素(TPO)、EPO和/或1.5-5U/ml的tPTD-HOXB4。
步骤(b)中任选地添加的所述至少一种生长因子中的一种或多种可以从步骤(a)开始的36-60小时或40-48小时内添加到所述培养物中。
步骤(b)中添加的所述至少一种生长因子中的一种或多种可以从步骤(a)开始的48-72小时内添加到所述培养物中。
步骤(b)中添加的所述至少一种因子可以包含bFGF、VEGF、BMP-4、SCF和/或FL中的一种或多种。
该方法可以另外包括(c)使所述细胞簇任选地解离成多个单细胞。
该方法可以另外包括(d)在包含至少一种另外的生长因子的培养基中培养所述成血管细胞，其中所述至少一种另外的生长因子的量可以足以扩增这些成血管细胞。
在步骤(d)中，所述至少一种另外的生长因子可以包含以下各项中的一种或多种：胰岛素、转铁蛋白、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素(EPO)、干细胞因子(SCF)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白4(BMP-4)和/或tPTD-HOXB4。
在步骤(d)中，所述至少一种另外的生长因子可以包含以下各项中的一种或多种：约10-100μg/ml的胰岛素、约200-2,000μg/ml的转铁蛋白、约10-50ng/ml的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、约10-20ng/ml的白细胞介素-3(IL-3)、约10-1000ng/ml的白细胞介素-6(IL-6)、约10-50ng/ml的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、约3-50U/ml的促红细胞生成素(EPO)、约20-200ng/ml的干细胞因子(SCF)、约20-200ng/ml的血管内皮生长因子(VEGF)、约15-150ng/ml的骨形态发生蛋白4(BMP-4)和/或约1.5-15U/ml的tPTD-HOXB4。
步骤(a)、(b)、(c)和/或(d)中的所述培养基可以是一种无血清培养基。
如以上所描述的方法可以另外包括(e)使这些间充质基质细胞有丝分裂地失活。
可以产生至少8000、8500、9000、9500、10000、12500或15000万个间充质基质细胞。
所述成血管细胞可以在开始诱导所述多能细胞分化的至少10、11、12、13、14、15、16、17或18天之后收集。
所述间充质基质细胞可以在开始诱导所述多能细胞分化的至少25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50天内产生。
该方法可以使得在培养约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35天内由约200,000个成血管细胞产生至少8000、8500、9000、9500、10000、12500或15000万个间充质基质细胞。
这些间充质基质细胞可以在作为成血管细胞培养的约26、27、28、29、30、31、32、33、34或35天内由成血管细胞以至少1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:415、1:425、1:440、1:450、1:365、1:475、1:490及1:500的成血管细胞与间充质基质细胞比率产生。
所述细胞可以是人类的。
在另一个方面，本披露提供了通过以上描述的任何方法所获得的衍生自成血管细胞的间充质基质细胞。
在另一个方面，本披露提供了通过成血管细胞的体外分化所衍生的间充质基质细胞。
所述间充质基质细胞中至少50％(i)可能对于CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD 44、CD166、CD274及HLA-ABC全部呈阳性，并且(ii)可能对CD31、34、45、133、FGFR2、CD271、Stro-1、CXCR4和/或TLR3呈阴性，或者不到5％或不到10％的细胞表达CD31、34、45、133、FGFR2、CD271、Stro-1、CXCR4和/或TLR3。
所述间充质基质细胞中至少50％可能对以下各项呈阳性：(i)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73及CD90的全部；或(ii)CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD44、CD166、CD274及HLA-ABC的全部。
所述间充质基质细胞中至少60％、70％、80％或90％可能对以下各项呈阳性：(i)CD10、CD24、IL-11、AIRE-1、ANG-1、CXCL1、CD105、CD73及CD90中的至少一种；或(ii)CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD44、CD166、CD274及HLA-ABC中的至少一种。
这些间充质基质可以不表达或者不到5％或不到10％的细胞可以表达CD31、34、45、133、FGFR2、CD271、Stro-1、CXCR4或TLR3中的至少一种。
在另一个方面，本披露提供了一种如以上所描述的间充质基质细胞制剂。
所述制剂可以包含不到10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％的多能细胞。
该制剂可以不含多能细胞。
所述制剂可以是基本上纯化的并且任选地可以包含至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的人间充质基质细胞。
该制剂可以包含基本上类似水平的p53和p21蛋白，或其中p53蛋白的水平可以比p21蛋白高出1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
该制剂中的间充质基质细胞或MSC能够在培养物中经历至少5次群体倍增，或能够在培养物中经历至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多次群体倍增。
所述间充质基质细胞(a)不会丛生或比直接地衍生自多能细胞的间充质基质细胞基本上更少地丛生；(b)与直接地衍生自多能细胞的间充质基质细胞相比较，当分裂时可能更易于分散；(c)数量可以比当以相等数量的多能细胞开始时直接地衍生自多能细胞的间充质基质细胞更多；和/或(d)比直接地衍生自多能细胞的间充质基质细胞更早地获得特征性间充质细胞表面标记物。
在另一个方面，本披露提供了包含如以上描述的任何间充质基质细胞或间充质基质细胞制剂的药物制剂。
该药物制剂可以包含有效治疗不想要的免疫反应的量的间充质基质细胞。
该药物制剂可以包含有效治疗不想要的免疫反应的量的间充质基质细胞并且可以另外包含供移植到有需要的接受者体内的其他细胞或组织。
所述其他细胞或组织可以是异基因或同基因的胰腺、神经、肝、RPE、角膜细胞或含有前述任一种的组织。
该药物制剂可以用于治疗一种自体免疫病症或针对异基因细胞的一种免疫反应，或用于治疗多发性硬化、系统性硬皮病、血液科恶性疾病、心肌梗塞、器官移植排斥、慢性同种移植肾病、硬化、肝衰竭、心脏衰竭、GvHD、胫骨骨折、左心室功能障碍、白血病、骨髓增生异常综合征、克罗恩氏病、糖尿病、慢性阻塞性肺病、成骨不全症、纯合性家族性高胆固醇血症、半月板切除术后治疗、成人牙周炎、严重心肌缺血患者的血管形成、脊髓损伤、骨发育不良、重症肢体缺血、糖尿病性足病、原发性修格连氏综合征、骨关节炎、软骨缺损、蹄叶炎、多系统萎缩症、肌萎缩性侧索硬化、心脏手术、全身性红斑狼疮、活体肾同种移植、非恶性红细胞病症、热烧伤、辐射烧伤、帕金森氏病、微骨折、大疱性表皮松解症、严重冠状动脉缺血、特发性扩张性心肌病、股骨头坏死、狼疮性肾炎、骨缺损、缺血性脑中风、中风后、急性辐射综合征、肺病、关节炎、骨再生、葡萄膜炎或其组合。
在另一个方面，本披露提供了一种试剂盒，该试剂盒包含如以上描述的任何间充质基质细胞或任何间充质基质细胞制剂。
在另一个方面，本披露提供了包含如以上描述的间充质基质细胞或间充质基质细胞制剂的一种试剂盒，其中所述细胞或细胞制剂可以是冷冻的或低温保存的。
在另一个方面，本披露提供了包含如以上描述的间充质基质细胞或间充质基质细胞制剂的一种试剂盒，其中所述细胞或细胞制剂可以包含在一种细胞递送媒介中。
在另一个方面，本披露提供了一种用于治疗疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的如以上所描述的间充质基质细胞或间充质基质细胞制剂。
该方法可以另外包括移植其他细胞或组织。这些细胞或组织可以包含视网膜、RPE、角膜、神经、免疫、骨髓、肝或胰腺细胞。该疾病或病症可以选自多发性硬化、系统性硬皮病、血液科恶性疾病、心肌梗塞、器官移植排斥、慢性同种移植肾病、硬化、肝衰竭、心脏衰竭、GvHD、胫骨骨折、左心室功能障碍、白血病、骨髓增生异常综合征、克罗恩氏病、糖尿病、慢性阻塞性肺病、成骨不全症、纯合性家族性高胆固醇血症、半月板切除术后治疗、成人牙周炎、严重心肌缺血患者的血管形成、脊髓损伤、骨发育不良、重症肢体缺血、糖尿病性足病、原发性修格连氏综合征、骨关节炎、软骨缺损、多系统萎缩症、肌萎缩性侧索硬化、心脏手术、难治性全身性红斑狼疮、活体肾同种移植、非恶性红细胞病症、热烧伤、帕金森氏病、微骨折、大疱性表皮松解症、严重冠状动脉缺血、特发性扩张性心肌病、股骨头坏死、狼疮性肾炎、骨缺损、缺血性脑中风、中风后、急性辐射综合征、肺病、关节炎、骨再生或其组合。
该疾病或病症可以是葡萄膜炎。所述疾病或病症可以是一种自体免疫病症或针对异基因细胞的一种免疫反应。该自体免疫病症可以是多发性硬化。
在另一个方面，本披露提供了一种治疗骨损失或软骨损害的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的间充质基质细胞或间充质基质细胞制剂。
这些间充质基质细胞可以与异基因或同基因移植的细胞或组织组合给予。该异基因移植的细胞可以包含视网膜色素上皮细胞、视网膜细胞、角膜细胞或肌肉细胞。
在另一个方面，本披露提供了一种药物制剂，该药物制剂包含了有丝分裂地失活的间充质基质细胞。这些间充质基质细胞可以由成血管细胞分化。
该药物可以包含至少106个间充质基质细胞和一种药学上可接受的载体。
在另一个方面，本披露提供了一种药物制剂，该药物制剂包含了通过以上方法产生的有丝分裂地失活的间充质细胞。
该制剂可以适合给予人类患者。该制剂可以适合给予非人类兽类哺乳动物。
该药物制剂可以不含多能细胞。
该药物制剂可以包含有效治疗有需要的受试者体内的不想要的免疫反应的量的间充质基质细胞。
该药物制剂可以包含有效治疗一种疾病或病状的量的间充质基质细胞，该疾病或病状选自下组，该组由以下各项组成：发炎性呼吸系统病状、因急性损伤引起的呼吸系统病状，成人呼吸窘迫综合征、创伤后成人呼吸窘迫综合征、移植性肺病、慢性阻塞性肺病、气肿病、慢性阻塞性支气管炎、支气管炎、过敏反应、由细菌性肺炎引起的损害、由病毒性肺炎引起的损害、哮喘、暴露于刺激物、抽烟、异位性皮炎、过敏性鼻炎、听力丧失、自体免疫性听力丧失、噪音诱发的听力丧失、牛皮癣及其任何组合。
间充质基质细胞的制剂
在本发明的一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种制剂，其中如与通过ESC培养得到的间充质基质细胞相比较，所述间充质基质细胞的所希望的表型出现更早(参看图5)。在本发明的另一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种制剂，其中如与通过ESC培养得到的间充质基质细胞相比较，所述间充质基质细胞的所希望的表型出现更早，并且其中所述所希望的表型是通过至少两种标记物的表达来确定，这些标记物选自下组，该组包括CD9、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166及HLA-abc。
本发明的又一实施例包含了一种间充质基质细胞制剂，其中所述间充质基质细胞的表型是通过至少两种标记物的表达来确定，这些标记物选自下组，该组包括CD9、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166及HLA-ABC。本发明的又另一个实施例包含了一种间充质基质细胞制剂，其中所述间充质基质细胞的表型是通过至少两种标记物的表达来确定，这些标记物选自下组，该组包括CD9、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90及CD105，并且其中所述间充质基质细胞不表达CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E及CD133。
在本发明的一个实施例中，这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)中约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％在培养物中约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天之后呈现通过标记物CD9、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166及HLA-abc的表达所确定的表型。在本发明的一个实施例中，这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)中至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％在培养物中约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天之后呈现通过至少两种标记物的表达以及CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E、CD133及Stro-1的表达缺乏所确定的表型，这些标记物选自下组，该组包括CD9、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166及HLA-abc。前一实施例，其中所述表型是另外通过选自下组的多种标记物所确定，该组包括AIRE-1、IL-11、CD10、CD24、ANG-1及CXCL1。
提供了本发明的一种优选的方法，其中在培养间充质基质细胞约30天内，衍生自成血管细胞的间充质基质细胞的数量是约8×107、8.5×107、9×107、9.5×107、1×108、1.25×108或1.5×108个衍生自约2×105个成血管细胞的间充质基质细胞。在本发明的一个替代性实施例中，间充质基质细胞可以在培养间充质基质细胞约30天内，由成血管细胞以约1:200、1:400、1:415、1:425、1:440、1:450、1:465、1:475、1:490及1:500的成血管细胞与间充质基质细胞比率产生。
在本发明的一个优选实施例中，通过成血管细胞培养所获得的间充质基质细胞的数量高于直接地从ESC获得的间充质基质细胞的数量。在本发明的另一个优选实施例中，通过成血管细胞培养所获得的间充质基质细胞的数量比直接地从ESC获得的间充质基质细胞的数量高至少5倍、10倍、20倍、22倍(参看图4)。
在本发明另一个实施例中，这些主题间充质基质细胞的制剂当引入哺乳动物宿主体内时不会形成畸胎瘤。
本发明的一个实施例提供了通过使用本发明的方法实施例中的任一种培养成血管细胞所产生的间充质基质细胞的制剂。本发明的一个实施例包含了通过使用本发明的方法实施例中的任一种培养成血管细胞所产生的间充质基质细胞的制剂，其中所述制剂的表型是通过选自下组的任一种或全部标记物的存在来确定，该组包括AIRE-1、IL-11、CD10、CD24、ANG-1及CXCL1。本发明的另一个实施例包含了通过使用本发明的方法实施例中的任一种培养成血管细胞所产生的间充质基质细胞的制剂，其中所述制剂的表型是通过选自下组的任一种或全部标记物的存在来确定，该组包括AIRE-1、IL-11、CD10、CD24、ANG-1及CXCL1，并且其中所述制剂呈现减少的IL-6、Stro-1及VEGF表达。
在本发明一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种制剂，其中所述制剂包含基本上类似水平的p53和p21蛋白，或其中p53的水平比p21高出1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在本发明一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种制剂，其中所述制剂包含基本上类似水平的p53和p21蛋白，或其中p53的水平比p21高出1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在本发明一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种药物制剂，其中所述药物制剂包含基本上类似水平的p53和p21蛋白，或其中p53的水平比p21高出1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
在本发明一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种制剂，其中所述制剂包含基本上类似百分比的对p53和p21蛋白呈阳性的细胞，或其中对p53呈阳性的细胞的百分比要比p21高出1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在本发明一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种制剂，其中所述制剂包含基本上类似百分比的对p53和p21蛋白呈阳性的细胞，或其中对p53呈阳性的细胞的百分比要比p21高出1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在本发明一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种药物制剂，其中所述药物制剂包含基本上类似百分比的对p53和p21蛋白呈阳性的细胞，或其中对p53呈阳性的细胞的百分比要比p21高出1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
在本发明的一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种制剂，其中所述制剂包含基本上类似百分比的具有背景水平的老化标记物的细胞，这些标记物选自下组，该组包括S100A1、VIM、MYADM、PIM1、ANXA2、RAMP、MEG3、IL13R2、S100A4、TREM1、DGKA、TPBG、MGLL、EML1、MYO1B、LASS6、ROBO1、DKFZP586H2123、LOC854342、DOK5、UBE2E2、USP53、VEPH1、SLC35E1、ANXA2、HLA-E、CD59、BHLHB2、UCHL1、SUSP3、CREDBL2、OCRL、OSGIN2、SLEC3B、IDS、TGFBR2、TSPAN6、TM4SF1、MAP4、CAST、LHFPL2、PLEKHM1、SAMD4A、VAMP1、ADD1、FAM129A、HPDC1、KLF11、DRAM、TREM140、BHLHB3、MGC17330、TBC1D2、KIAA1191、C5ORF32、C15ORF17、FAM791、CCDC104、PQLC3、EIF4E3、C7ORF41、DUSP18、SH3PX3、MYO5A、PRMT2、C8ORF61、SAMD9L、PGM2L1、HOM-TES-103、EPOR及TMEM112，或选自下组，该组包括S100A1、VIM、MYADM、PIM1、ANXA2、RAMP、MEG3、IL13R2、S100A4,TREM1、DGKA、TPBG、MGLL、EMLI、MYO1B、LASS6、ROBO1、DKFZP586H2123、LOC854342、DOK5、UBE2E2、USP53、VEPH1及SLC35E1，或其中对老化标记物呈阳性的细胞的百分比要比背景高1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，这些老化标记物选自下组，该组包括S100A1、VIM、MYADM、PIM1、ANXA2、RAMP、MEG3、IL13R2、S100A4、TREM1,DGKA、TPBG、MGLL、EML1、MYO1B、LASS6、ROBO1、DKFZP586H2123、LOC854342、DOK5、UBE2E2、USP53、VEPH1、SLC35E1、ANXA2、HLA-E、CD59、BHLHB2、UCHL1、SUSP3、CREDBL2、OCRL、OSGIN2、SLEC3B、IDS、TGFBR2、TSPAN6、TM4SF1、MAP4、CAST、LHFPL2、PLEKHM1、SAMD4A、VAMP1ADD1、FAM129A、HPDC1、KLF11、DRAM、TREM140、BHLHB3、MGC17330、TBC1D2、KIAA1191、C5ORF32、C15ORF17、FAM791、CCDC104、PQLC3、EIF4E3、C7ORF41、DUSP18、SH3PX3、MYO5A、PRMT2、C8ORF61、SAMD9L、PGM2L1、HOM-TES-103、EPOR、TMEM112，或选自下组，该组包括S100A1、VIM、MYADM、PIM1、ANXA2、RAMP、MEG3、IL13R2、S100A4、TREM1,DGKA、TPBG、MGLL、EML1、MYO1B、LASS6、ROBO1、DKFZP586H2123、LOC854342、DOK5、UBE2E2、USP53、VEPH1及SLC35E1。在本发明的一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种制剂，其中所述制剂包含基本上类似百分比的具有背景水平的标记物的细胞，这些标记物选自下组，该组包括HoxB3、HoxB7、MID1、SNAPC5、PPARG、ANXA2、TIPIN、MYLIP、LAX1、EGR1CRIP1、SULT1A3、STMN1、CCT8、SFRS10、CBX3、CBX1、FLJ11021、DDX46、ACADM、KIAA0101、TYMS、BCAS2、CEP57、TDG、MAP2K6、CSRP2、GLMN、HMGN2、HNRPR、EIF3S1、PAPOLA、SFRS10、TCF3、H3F3A、LOC730740、LYPLA1、UBE3A、SUM02、SHMT2、ACP1、FKBP3、ARL5A、GMNN、ENY2、FAM82B、RNF138、RPL26L1、CCDC59、PXMP2、POLR3B、TRMT5、ZNF639、MRPL47、GTPBP8、SUB1、SNHG1、ATPAF1、MRPS24、C16ORF63、FAM33A、EPSTL1、CTR9、GAS5、ZNF711、MTO1及CDP2，或其中对标记物呈阳性的细胞的百分比要比背景低1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，这些标记物选自下组，该组包括HoxB3、HoxB7、MID1、SNAPC5、PPARG、ANXA2、TIPIN、MYLIP、LAX1、EGR1、CRIP1、SULT1A3、STMN1、CCT8、SFRS10、CBX3、CBX1、FLJ11021、DDX46、ACADM、KIAA0101、TYMS、BCAS2、CEP57、TDG、MAP2K6、CSRP2、GLMN、HMGN2、HNRPR、EIF3S1、PAPOLA、SFRS10、TCF3、H3F3A、LOC730740、LYPLA1、UBE3A、SUM02、SHMT2、ACP1、FKBP3、ARL5A、GMNN、ENY2、FAM82B、RNF138、RPL26L1、CCDC59、PXMP2、POLR3B、TRMT5、ZNF639、MRPL47、GTPBP8、SUB1、SNHG1、ATPAF1、MRPS24、C16ORF63、FAM33A、EPSTL1、CTR9、GAS5、ZNF711、MTO1及CDP2。
在本发明的一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种制剂，其中所述制剂包含基本上类似百分比的具有背景水平的老化标记物的细胞，这些标记物选自下组，该组包括HoxB3、HoxB7、MID1、SNAPC5、PPARG、ANXA2、TIPIN、MYLIP、LAX1、EGR1、CRIP1、SULT1A3、STMN1、CCT8、SFRS10、CBX3、CBX1、FLJ11021、DDX46、ACADM、KIAA0101、TYMS、BCAS2、CEP57、TDG、MAP2K6、CSRP2、GLMN、HMGN2、HNRPR、EIF3S1、PAPOLA、SFRS10、TCF3、H3F3A、LOC730740、LYPLA1、UBE3A、SUM02、SHMT2、ACP1、FKBP3、ARL5A、GMNN、ENY2、FAM82B、RNF138、RPL26L1、CCDC59、PXMP2、POLR3B、TRMT5、ZNF639、MRPL47、GTPBP8、SUB1、SNHG1、ATPAF1、MRPS24、C16ORF63、FAM33A、EPSTL1、CTR9、GAS5、ZNF711、MTO1及CDP2，或选自下组，该组包括HoxB3、HoxB7、MID1、SNAPC5、PPARG、ANXA2、TIPIN、MYLIP、LAX1、EGR1、CRIP1及SULT1A3，或其中对老化标记物呈阳性的细胞的百分比要比背景低1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，这些标记物选自下组，该组包括HoxB3、HoxB7、MID1、SNAPC5、PPARG、ANXA2、TIPIN、MYLIP、LAX1、EGR1、CRIP1、SULT1A3、STMN1、CCT8、SFRS10、CBX3、CBX1、FLJ11021、DDX46、ACADM、KIAA0101、TYMS、BCAS2、CEP57、TDG、MAP2K6、CSRP2、GLMN、HMGN2、HNRPR、EIF3S1、PAPOLA、SFRS10、TCF3、H3F3A、LOC730740、LYPLA1、UBE3A、SUM02、SHMT2、ACP1、FKBP3、ARL5A、GMNN、ENY2、FAM82B、RNF138、RPL26L1、CCDC59、PXMP2、POLR3B、TRMT5、ZNF639、MRPL47、GTPBP8、SUB1、SNHG1、ATPAF1、MRPS24、C16ORF63、FAM33A、EPSTL1、CTR9、GAS5、ZNF711、MTO1及CDP2，或该组包括HoxB3、HoxB7、MID1、SNAPC5、PPARG、ANXA2、TIPIN、MYLIP、LAX1、EGR1、CRIP1、SULT1A3。
在另一个实施例中，如与成人衍生的MSC相比较，成血管细胞衍生的MSC具有更年轻细胞的表型。在一个实施例中，这些主题MSC能够在培养物中经历至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多次群体倍增。相比之下，成人衍生的间充质基质细胞典型地在培养物中经历2-3次倍增。在另一个实施例中，与成人衍生的MSC相比较，这些成血管细胞衍生的MSC具有更长的端粒长度、更强的免疫抑制作用、更少的液泡，分裂更快，在培养物中更易于分裂、更高的CD90表达，谱系定型更少，或其组合。在另一个实施例中，与成人衍生的MSC相比较，这些成血管细胞衍生的MSC具有增加的促进细胞增殖的转录物表达(即，具有更高的增殖能力)及减少的涉及终末细胞分化的转录物表达。
在本发明的一个实施例中，间充质基质细胞的制剂是通过本发明方法中的任一种或多种产生的，其中所述间充质基质细胞能够在培养物中经历至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多次群体倍增。
在本发明的另一个实施例中，间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的制剂能够在培养物中经历至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多次群体倍增。在本发明的另一个实施例中，这些主题间充质基质细胞的制剂能够在培养物中经历至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多次群体倍增，其中在所述群体倍增之后，不到50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％或1％的间充质基质细胞经历了复制衰老。在另一个实施例中，所述制剂是一种药物制剂。
在本发明的另一个实施例中，提供了间充质基质细胞的一种制剂，其中所述间充质基质细胞已经在培养物中经历了至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60次倍增，
在本发明的另一个实施例中，提供了一种间充质基质细胞的制剂，其中所述间充质基质细胞已经在培养物中经历了至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60次倍增，其中所述间充质基质细胞中不到50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％或1％经历了复制衰老，其中所述间充质基质细胞保持了年轻的表型和效力，并且其中所述制剂是一种药物制剂。所述制剂可以包含有效数量的间充质基质细胞用于治疗疾病，如免疫病症、退化性疾病或适于使用MSC治疗的其他疾病。
在本发明的另一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种制剂，其中所述间充质基质细胞已经在培养物中经历了至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60次倍增，其中所述间充质基质细胞中不到50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％或1％在这些倍增之后经历了复制衰老，其中所述间充质基质细胞保持了年轻的表型和效力，并且其中所述制剂是一种药物制剂。所述制剂可以包含有效数量的间充质基质细胞用于治疗疾病，如免疫病症、退化性疾病或适于使用MSC治疗的其他疾病。
在本发明的另一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种制剂，其中所述间充质基质细胞已经在培养物中经历了约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60次倍增。前一实施例，其中所述间充质基质细胞中不到50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、1％经历了复制衰老，其中所述间充质基质细胞保持了年轻的表型和效力，其中所述制剂是一种药物制剂，其中所述药物制剂包含有效数量的间充质基质细胞，并且其中所述药物制剂被保存。
在另一个实施例中，本发明提供了一种包含间充质基质细胞的药物制剂的试剂盒。在另一个实施例中，本发明提供了一种包含间充质基质细胞的药物制剂的试剂盒，其中所述制剂被保存。在另一个实施例中，本发明提供了一种包含主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的药物制剂的试剂盒。在另一个实施例中，本发明提供了一种包含主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的药物制剂的试剂盒，其中所述制剂被保存。
在另一个实施例中，本发明提供了一种通过向有需要的受试者给予有效量的衍生自成血管细胞的间充质基质细胞来治疗病变的方法。所述病变可以包括但不限于，自体免疫病症、葡萄膜炎、骨损失或软骨损害。
如与直接地衍生自ESC的MSC相比较，通过培养成血管细胞获得的间充质基质细胞具有改善的特征。举例来说，与成血管细胞衍生的MSC相比较，ESC衍生的MSC丛生更多，当分裂时更难分散，产生的MSC不如当以相等数量的ESC开始时那么多，并且花费更长时间来获得特征性MSC细胞表面标记物。参看实例2和图3-6。
在一个实施例中，本发明提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种制剂，其中所述制剂有效使病变正常化。在本发明的另一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种制剂，其中所述制剂有效减少过度或不想要的免疫反应。在本发明的另一个实施例中，提供了这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的一种制剂，其中所述制剂有效缓解自体免疫病症。在本发明的另一个实施例中，提供了通过向宿主给予有效量的主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)来使病变正常化。本发明的另一个实施例提供了病变的正常化，其中此类病变的正常化是以选自下组的效应为特征，该组包括所述MSC对细胞因子的释放、刺激调控性T细胞数量的增加、抑制一定量IFNγ从Th1细胞释放，及刺激一定量IL4从Th2细胞分泌。在另一个实施例中，这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的制剂的给予使得从所述间充质基质细胞释放多种细胞因子，这些细胞因子选自下组，该组包括转化生长因子β、吲哚胺2,3双加氧酶、前列腺素E2、肝细胞生长因子、一氧化氮、白细胞介素10、白细胞介素6、巨噬细胞集落刺激因子及可溶性人白细胞抗原(HLA)G5。
在本发明的另一个实施例中，这些主题间充质基质细胞(例如，通过培养成血管细胞产生)的制剂的给予使得从所述间充质基质细胞释放多种细胞因子，这些细胞因子选自下组，该组包括转化生长因子β、吲哚胺2,3双加氧酶、前列腺素E2、肝细胞生长因子、一氧化氮、白细胞介素10、白细胞介素6、巨噬细胞集落刺激因子、可溶性人白细胞抗原(HLA)G5、白细胞介素4、8、11、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、血管内皮生长因子、类胰岛素生长因子1、磷脂酰肌醇-聚糖生物合成F类蛋白、单核细胞趋化蛋白1、基质衍生的因子1、肿瘤坏死因子1、转化生长因子β、碱性成纤维细胞生长因子、促血管生成素1和2、由干扰素γ诱导的单核因子、干扰素诱导性蛋白10、脑衍生的神经营养因子、白细胞介素1受体α、趋化因子配体1和2。
MSC的药物制剂
本发明的MSC可以在药学上可接受的载体存在下配制。举例来说，本发明的MSC可以单独给予，或作为药物配制物的一种组分给予，其中所述MSC可以配制用于以任何便利的方式给予以用于医学中。一个实施例提供了间充质基质细胞的一种药物制剂，该药物制剂包含所述间充质基质细胞与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、在即将使用前任选地复水成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、溶质或悬浮剂及增稠剂的组合，这些水性或非水性溶液选自下组，该组由以下各项组成：分散液、悬浮液、乳液。
在本发明的一个实施例中，提供了间充质基质细胞的一种药物制剂，其中所述间充质基质细胞已经历了介于约5与约100次之间的群体倍增。在本发明的另一个实施例中，提供了间充质基质细胞的一种药物制剂，其中所述间充质基质细胞已经历了介于约10与约80次之间的群体倍增。在本发明的另一个实施例中，提供了间充质基质细胞的一种药物制剂，其中所述间充质基质细胞已经历了介于约25与约60次之间的群体倍增。在本发明的另一个实施例中，提供了间充质基质细胞的一种药物制剂，其中所述间充质基质细胞已经历了不到约10次的群体倍增。在本发明的又另一个实施例中，提供了间充质基质细胞的一种药物制剂，其中所述间充质基质细胞已经历了不到约20次的群体倍增。在本发明的另一个实施例中，提供了间充质基质细胞的一种药物制剂，其中所述间充质基质细胞已经历了不到约30次的群体倍增，其中所述间充质基质细胞未经历复制衰老。在本发明的另一个实施例中，提供了间充质基质细胞的一种药物制剂，其中所述间充质基质细胞已经历了不到约30次的群体倍增，其中所述间充质基质细胞中不到约25％经历了复制衰老。在本发明的另一个实施例中，提供了间充质基质细胞的一种药物制剂，其中所述间充质基质细胞已经历了不到约30次的群体倍增，其中所述间充质基质细胞中不到约10％经历了复制衰老。在本发明的另一个实施例中，提供了间充质基质细胞的一种药物制剂，其中所述间充质基质细胞已经历了不到约30次的群体倍增，其中所述间充质基质细胞中不到约10％已经历复制衰老，并且其中所述间充质基质细胞表达多种标记物，这些标记物选自下组，该组包括AIRE-1、IL-11、CD10、CD24、ANG-1及CXCL1。
MSC的药物制剂的注射液的浓度可以是有效并且例如基本上不含ESC的任何量。举例来说，这些药物制剂可以包含在此所描述的数量和类型的MSC。在一个特定实施例中，MSC的药物制剂包含约1×106个主题MSC(例如，通过培养成血管细胞产生)以对有需要的宿主进行全身给药，或约1×104个通过培养成血管细胞得到的所述MSC以对有需要的宿主进行局部给药。
本披露的示例性组合物可以是适合用于治疗人类患者的配制物，如无热原或基本上无热原并且无病原体的。当给药时，用于本披露中的这些药物制剂可以呈无热原、无病原体的生理学上可接受的形式。
在此所描述的方法中使用的包含MSC的制剂可以呈悬浮液、凝胶、胶体、浆液或混合物形式移植。另外，在注射时，可以用可商购的平衡盐溶液对低温保存的MSC进行再悬浮以达到供注射(即，推注或静脉内)给药所希望的摩尔渗透浓度和浓度。
本发明一个方面涉及一种适合用于哺乳动物患者中的药物制剂，该药物制剂包含至少106、107、108或甚至109个间充质基质细胞和一种药学上可接受的载体。本发明另一个方面涉及一种药物制剂，该药物制剂包含至少106、107、108或甚至109个间充质基质细胞和一种药学上可接受的载体，其中这些间充质基质细胞是由成血管细胞分化的。本发明的又另一个方面提供一种低温细胞库，该细胞库包含至少108、109、1010、1011、1012或甚至1013个间充质基质细胞。本发明的再另一个方面提供了不含或基本上不含非人类细胞和/或非人类动物产品的一种纯化的细胞制剂，该制剂包含至少106、107、108或甚至109个间充质基质细胞和不到1％的任何其他细胞类型，更优选地不到0.1％、0.01％或甚至0.001％的任何其他细胞类型。以上制剂、组合物及库的某些优选的实施例包括但不限于，以下段落中所列的那些：
在某些实施例中，这些间充质基质细胞具有的复制能力使得在细胞培养物中经历至少10次群体倍增并且到第10次倍增时不到25％、20％、15％、10％或甚至5％的细胞经历细胞死亡、衰老或分化成为非MSC细胞(如成纤维细胞、脂肪细胞和/或骨细胞)。
在某些实施例中，这些间充质基质细胞具有的复制能力使得在细胞培养物中经历至少15次群体倍增并且到第15次倍增时不到25％、20％、15％、10％或甚至5％的细胞经历细胞死亡、衰老或分化成为非MSC细胞(如成纤维细胞、脂肪细胞和/或骨细胞)。
在某些实施例中，这些间充质基质细胞具有的复制能力使得在细胞培养物中经历至少20次群体倍增并且到第20次倍增时不到25％、20％、15％、10％或甚至5％的细胞经历细胞死亡、衰老或分化成为非MSC细胞(如成纤维细胞、脂肪细胞和/或骨细胞)。
在某些实施例中，这些间充质基质细胞具有的复制能力使得在细胞培养物中经历至少5次传代并且到第5次传代时不到25％、20％、15％、10％或甚至5％的细胞经历细胞死亡、衰老或分化成为非MSC细胞(如成纤维细胞、脂肪细胞和/或骨细胞)。
在某些实施例中，这些间充质基质细胞具有的复制能力使得在细胞培养物中经历至少10次传代并且到第10次传代时不到25％、20％、15％、10％或甚至5％的细胞经历细胞死亡、衰老或分化成为非MSC细胞(如成纤维细胞、脂肪细胞和/或骨细胞)。
在某些实施例中，这些间充质基质细胞是由多能干细胞来源分化的，如表达OCT-4、碱性磷酸酶、Sox2、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及TRA-1-80的多能干细胞(如，以及胚胎干细胞系或诱导性多能性干细胞系)，并且甚至更优选地由常见的多能干细胞来源分化。
在某些实施例中，这些间充质基质细胞在HLA基因型方面是相同的。
在某些实施例中，这些间充质基质细胞在基因组方面是相同的。
在某些实施例中，至少30％、35％、40％、45％或甚至50％的间充质基质细胞对CD10呈阳性。
在某些实施例中，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％的间充质基质细胞对标记物CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD44、CD166以及CD274和HLA-ABC呈阳性。
在某些实施例中，不到30％、25％、20％、15％或甚至10％的间充质基质细胞对标记物CD31、CD34、CD45、CD133、FGFR2、CD271、Stro-1、CXCR4及TLR3呈阳性。
在某些实施例中，这些间充质基质细胞具有的复制率使得在细胞培养物中在不到25、24、23、22、21或甚至20天内经历至少10次群体倍增。
在某些实施例中，这些间充质基质细胞具有的平均末端限制性片段长度(TRF)长于7kb、7.5kb、8kb、8.5kb、9kb、9.5kb、10kb、10.5kb、11kb、11.5kb或甚至12kb。
在某些实施例中，这些间充质基质细胞在培养物中经10、15或甚至20次群体倍增不经历超过75％、70％、65％、60％、55％、50％或甚至45％的具有通过流式细胞术测量的超过5,000,000的前向散射光值的细胞增加。
在某些实施例中，处于休眠状态的这些间充质基质细胞对编码白细胞介素-6的mRNA进行表达，其表达水平低于处于休眠状态的衍生自脐血、骨髓或脂肪组织的间充质基质细胞制剂所表达的IL-6mRNA水平的10％、8％、6％、4％或甚至2％。
在某些实施例中，这些间充质基质细胞的效力比衍生自脐血、骨髓或脂肪组织的MSC高出至少2、4、6、8、10、20、50或甚至100倍。
在某些实施例中，当将一百万个间充质基质细胞注射到MOG35-55EAE小鼠模型(如用MOG35-55肽免疫的C57BL/6小鼠)中时，这些细胞平均起来将使临床评分3.5降低到低于2.5，并且甚至更优选地将使该临床评分降低到低于2、1.5或甚至低于1。
在某些实施例中，该制剂适合给予人类患者，并且更优选地为无热原和/或不含非人类动物产品。
在其他实施例中，该制剂适合给予非人类兽类哺乳动物，如狗、猫或马。
使用衍生自培养成血管细胞的MSC可治疗的疾病和病状
经显示，MSC可作为多种疾病和病状的治疗剂。确切地说，MSC迁移到损伤部位，发挥免疫抑制作用并促进受损组织的修复。提供了本发明的一个实施例，其中间充质基质细胞的药物制剂减少了病变的表现。提供了本发明的一个实施例，其中将间充质基质细胞的药物制剂给予罹患病变的宿主。在本发明的另一个实施例中，这些主题MSC(例如，通过培养成血管细胞产生)的药物制剂减少病变的表现，该病变选自下组，该组包括创伤愈合、移植物抗宿主疾病(GvHD)、疾病、慢性眼病、视网膜变性、青光眼、葡萄膜炎、急性心肌梗塞、慢性疼痛、肝炎及肾炎。在本发明的另一个实施例中，通过培养成血管细胞得到的间充质基质细胞的药物制剂使马蹄叶炎的表现减少。作为另一个实例，MSC可以与异基因移植的细胞或组织(例如，包含了已经从ES细胞分化的细胞的制剂，如视网膜色素上皮(RPE)细胞、少突胶质细胞前体、视网膜、角膜、肌肉(如骨骼肌、平滑肌或心肌)，或其任何组合，或其他)组合给予，藉此降低针对移植的细胞或组织的免疫反应的可能性，并且潜在地避免对其他免疫抑制的需求。在此描述的主题MSC(例如，通过培养成血管细胞产生)可以用于类似应用中。本发明方法的一个实施例，其中对宿主给予主题MSC(例如，通过培养成血管细胞产生)的药物制剂来降低对未来疗法的需求。提供了本发明方法的一个实施例，其中对宿主给予主题MSC(例如，通过培养成血管细胞产生)的药物制剂来降低对未来疗法的需求，其中所述疗法抑制免疫功能。
在本发明的一个实施例中，对宿主给予主题MSC(例如，通过培养成血管细胞产生)的药物制剂以治疗病变。在本发明的一个实施例中，对宿主给予主题MSC(例如，通过培养成血管细胞产生)的药物制剂以治疗多种病变，这些病变选自以下清单，该清单包括创伤愈合、多发性硬化、系统性硬皮病、血液科恶性疾病、心肌梗塞、组织和器官移植、组织和器官排斥、慢性同种移植肾病、硬化、肝衰竭、心脏衰竭、GvHD、胫骨骨折、左心室功能障碍、白血病、骨髓增生异常综合征、克罗恩氏病、I型或II型糖尿病、慢性阻塞性肺病、肺高压、慢性疼痛、成骨不全症、纯合性家族性高胆固醇血症、半月板切除术后治疗、成人牙周炎、严重心肌缺血患者的血管形成、脊髓损伤、骨发育不良、与糖尿病相关的重症肢体缺血、糖尿病性足病、原发性修格连氏综合征、骨关节炎、软骨缺损(例如关节软骨缺损)、蹄叶炎、多系统萎缩症、肌萎缩性侧索硬化、心脏手术、难治性全身性红斑狼疮、活体肾同种移植、非恶性红细胞病症、热烧伤、辐射烧伤、帕金森氏病、微骨折(例如，在具有膝关节软骨缺损性损伤的患者中)、大疱性表皮松解症、严重冠状动脉缺血、特发性扩张性心肌病、股骨头坏死、狼疮性肾炎、骨缺损、缺血性脑中风、中风后、急性辐射综合征、肺病、关节炎及骨再生。
在本发明的另一个实施例中，对宿主给予主题MSC(例如，通过培养成血管细胞产生)的药物制剂以治疗多种自体免疫病变，这些病变选自以下清单，该清单包括急性坏死性出血性白质脑炎、艾迪逊氏病(Addison's disease)、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自体免疫性血管性水肿、自体免疫性再生障碍性贫血、自体免疫性自主神经异常、自体免疫性肝炎、自体免疫性高脂血症、自体免疫性免疫缺陷、自体免疫性内耳疾病(AIED)、自体免疫性心肌炎、自体免疫性胰腺炎、自体免疫性视网膜病变、自体免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自体免疫性甲状腺疾病、自体免疫性荨麻疹、轴突与神经元神经病、巴洛病(Balo disease)、贝赛特氏病(Behcet’sdisease)、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯尔曼病(Castleman disease)、乳糜泻、查加斯病(Chagas disease)、慢性疲劳综合征、慢性发炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多病灶性骨髓炎(CRMO)、查格-斯特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、克罗恩氏病、科根综合征(Cogans syndrome)、冷凝集素病、先天性心脏阻滞、柯萨奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST病、原发性混合型冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(Devic's disease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒氏病(Dressler’s syndrome)、子宫内膜炎、嗜酸性食管炎、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、实验性过敏性脑脊髓炎、伊文氏综合征(Evans syndrome)、纤维肌痛、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、肾小球肾脏炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture’s syndrome)、肉芽肿性血管炎(GPA)(参看韦格纳氏(Wegener's))、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏脑炎(Hashimoto's encephalitis)、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、亨诺-许兰二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫调控性脂蛋白、包涵体肌炎、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、间质性膀胱炎、青少年关节炎、青少年糖尿病、川崎氏综合征(Kawasakisyndrome)、兰伯特-伊顿二氏综合征(Lambert-Eaton syndrome)、白细胞分裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木质性结膜炎、线性IgA疾病(LAD)、狼疮(SLE)、莱姆病(Lymedisease)、慢性美尼尔氏病(Meniere’s disease)、显微镜下多血管炎、混合性结缔组织疾病(MCTD)、莫伦氏溃疡(Mooren’s ulcer)、穆哈-哈伯曼二氏病(Mucha-Habermanndisease)、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(德维克氏)、嗜中性粒细胞减少症、眼部瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、PANDAS(儿童链球菌相关性自体免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、帕瑞-罗姆伯格二氏综合征(Parry Romberg syndrome)、帕森纳格-特纳二氏综合征(Parsonnage-Turner syndrome)、扁平部睫状体炎(周边葡萄膜炎)、天疱疮、周围神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型及III型自体免疫性多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、黄体酮皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、雷诺现象(Raynauds phenomenon)、反射性交感神经萎缩症、瑞特氏综合征(Reiter’s syndrome)、复发性多软骨炎、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特氏综合征(Schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、修格连氏综合征、精子与睾丸自体免疫性、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏症候群(Susac's syndrome)、交感性眼炎、高安氏动脉炎(Takayasu’s arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、托洛萨-亨特二氏综合征(Tolosa-Huntsyndrome)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、水疱大疱性皮肤病、白癜风及韦格纳氏肉芽肿(现称为肉芽肿性血管炎(GPA))。
使用衍生自培养成血管细胞的MSC的治疗方案
在此描述的MSC和包含MSC的药物制剂可以用于基于细胞的治疗。确切地说，本发明提供了用于治疗或预防在此所描述的疾病和病状的方法，这些方法包括给予有效量的包含MSC的药物制剂，其中这些MSC是衍生自培养成血管细胞。
取决于所治疗的特定病变，本发明的MSC可以使用本领域已知的方式给予，包括但不限于，经由静脉内、心肌内、经心内膜、玻璃体内或肌肉内途径注射，或局部植入。
本发明的间充质基质细胞可以经由局部植入来给予，其中利用了一种递送装置。本发明的递送装置是生物可相容并且生物可降解的。本发明的递送装置可以使用多种材料制造，这些材料选自下组，该组包括生物可相容的纤维、生物可相容的纱线、生物可相容的泡沫材料、脂肪族聚酯、聚(氨基酸)、共聚(醚-酯)、聚草酸亚烷基酯、聚酰胺、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚(亚氨基碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧杂酯、聚酰胺基酯、含胺基的聚氧杂酯、聚(酐)、聚磷腈、生物聚合物；丙交酯、乙交酯、ε-己内酯、对二氧杂环己酮、碳酸三亚甲基酯的均聚物和共聚物；丙交酯、乙交酯、ε-己内酯、对二氧杂环己酮、碳酸三亚甲基酯的均聚物和共聚物、原纤维胶原蛋白、非原纤维胶原蛋白、未用胃蛋白酶处理的胶原蛋白、与其他聚合物组合的胶原蛋白、生长因子、细胞外基质蛋白、生物相关性肽片段、肝细胞生长因子、血小板衍生的生长因子、富含血小板的血浆、胰岛素生长因子、生长分化因子、血管内皮细胞衍生的生长因子、烟碱酰胺、胰高血糖素样肽、生腱蛋白-C、层粘连蛋白、抗排斥剂、止痛剂、抗氧化剂、抗细胞凋亡剂消炎剂及细胞生长抑制剂。
特定治疗方案、给药途径及辅助疗法可以基于特定病变、该病变的严重程度及患者的总体健康状况进行定制。包含MSC的药物制剂的给予可以有效降低病变的表现的严重程度或和/或防止病变的表现的进一步恶化。
本发明的治疗方式可以包括给予单剂MSC。作为替代方案，在此描述的治疗方式可以包括一个疗程，其中经某一时间段多次给予MSC。示例性疗程可以包含每周一次、每两周一次、每月一次、每季度一次、每年两次或每年一次治疗。作为替代方案，治疗可以分数阶段进行，藉此起初需要多次剂量(例如，在第一周里每天多剂)，并且随后需要更少并且不太频繁的剂量。
在一个实施例中，在患者的一生中，定期一次或多次向患者给予通过培养成血管细胞获得的间充质基质细胞的药物制剂。在本发明的另一个实施例中，每年一次、每6–12个月一次、每3-6个月一次、每1-3个月一次或每1-4周一次给予主题MSC(例如，通过培养成血管细胞产生)的药物制剂。作为替代方案，更频繁的给药可能是某些病状或病症所希望的。在本发明的一个实施例中，在患者的一生中，或根据所治疗的特定患者和患者的病变的需要，经由一种装置一次、超过一次、定期给予主题MSC(例如，通过培养成血管细胞产生)的药物制剂。类似地涵盖一种随时间变化的治疗方案。举例来说，在开始时可能需要更频繁的治疗(例如，每天或每周一次治疗)。随时间推移，当患者的病状改善时，可能需要不太频繁的治疗或甚至不需要进一步治疗。
根据本发明，这些疾病或病状可以通过静脉内给予在此所描述的间充质基质细胞来进行治疗或预防。在一些实施例中，静脉内注射约2000万个、约4000万个、约6000万个、约8000万个、约10000万个、约12000万个、约14000万个、约16000万个、约18000万个、约20000万个、约22000万个、约24000万个、约26000万个、约28000万个、约30000万个、约32000万个、约34000万个、约36000万个、约38000万个、约40000万个、约42000万个、约44000万个、约46000万个、约48000万个、约50000万个、约52000万个、约54000万个、约56000万个、约58000万个、约60000万个、约62000万个、约64000万个、约66000万个、约68000万个、约70000万个、约72000万个、约74000万个、约76000万个、约78000万个、约80000万个、约82000万个、约84000万个、约86000万个、约88000万个、约90000万个、约92000万个、约94000万个、约96000万个或约98000万个细胞。在一些实施例中，静脉内注射约10亿个、约20亿个、约30亿个、约40亿个或约50亿个细胞或更多。在一些实施例中，细胞的数量在介于约2000万到约40亿个细胞之间、介于约4000万到约10亿个细胞之间、介于约6000万到约75000万个细胞之间、介于约8000万到约40000万个细胞之间、介于约10000万到约35000万个细胞之间及介于约17500万到约25000万个细胞之间的范围内。
在此描述的方法可以另外包括以下步骤：使用本领域中已知的方法监测治疗或预防功效。
试剂盒
本发明提供了包含在此描述的任何组合物的试剂盒。间充质基质细胞的制剂可以包含在根据本领域普通技术人员已知的方法制造的递送装置中，并且包括美国专利申请公开2002/0103542、欧洲专利申请EP 1 454 641中的方法，或根据本领域普通技术人员已知的方法保存，并且包括美国专利8,198,085、PCT申请WO 2004/098285及美国专利申请公开2012/0077181中的方法。在本发明的一个实施例中，试剂盒包含了具有约至少8×107、8.5×107、9×107、9.5×107、1×108、1.25×108或1.25×108个衍生自培养成血管细胞的MSC的制剂。在另一个实施例中，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含了具有约8×107、8.5×107、9×107、9.5×107、1×108、1.25×108或1.25×108个主题MSC(例如，通过培养成血管细胞产生)的制剂，其中所述制剂是药物制剂。在又另一个实施例中，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含了具有约8×107、8.5×107、9×107、9.5×107、1×108、1.25×108或1.25×108个主题MSC(例如，通过培养成血管细胞产生)的药物制剂，其中所述制剂被保存。在又另一个实施例中，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含了具有约8×107、8.5×107、9×107、9.5×107、1×108、1.25×108或1.25×108个主题MSC(例如，通过培养成血管细胞产生)的药物制剂，其中所述制剂是包含在一种细胞递送媒介中。
另外，这些试剂盒可以包含低温保存的MSC或低温保存的MSC的制剂、冷冻的MSC或冷冻的MSC的制剂、解冻的冷冻MSC或解冻的冷冻MSC的制剂。
不同实施例与观念的组合
应了解，在此描述的实施例和观念可以组合使用。举例来说，本发明提供了一种产生MSC的方法，该方法包括由ESC产生成血管细胞，培养这些成血管细胞至少四天，收集这些成血管细胞，将这些成血管细胞再铺板于涂有基质胶的板上，并且如在此所描述将这些成血管细胞培养至少十四天，其中该方法产生至少8500万个基本上不含ESC的MSC。
实例
以下实例不打算以任何方式限制本发明。
实例1—由成血管细胞产生MSC
成血管细胞是由临床级单个卵裂球衍生的ESC系MA09[16]，如下产生的：
首先，由在补充有成形素和早期造血细胞因子，特别是骨形态发生蛋白-4(BMP-4)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维蛋白生长因子(bFGF)、干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(Tpo)及fms相关性酪氨酸激酶3配体(FL)的组合的无血清培养基中培养的MA09ESC产生早期阶段的细胞簇。更具体地说，将ESC从6孔组织培养物处理的板的一个孔铺板到在一个六孔超低粘附板(康宁公司(Corning))的一个孔中的补充有50ng/ml VEGF和50ng/ml BMP-4(R&D)的3ml Stemline II培养基(西格玛公司(Sigma))中，并在37℃及5％CO2下进行孵育。在前24小时内形成细胞簇。40-48小时之后，将该培养基的一半(1.5ml)用补充有50ng/ml VEGF、50ng/ml BMP-4及20-22.5ng/ml bFGF的新鲜Stemline II培养基更换，并且再继续孵育40-48小时(即，总计3.5-4天)。
将细胞簇解离并将单个细胞铺板于无血清半固体母细胞集落生长培养基(BGM)中。具体地说，通过0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA(英杰公司(Invitrogen))解离细胞簇2-5分钟。上下吸取细胞悬浮液，并且然后添加DMEM+10％FCS以使胰蛋白酶失活。然后，使细胞通过一个40μm的粗滤器以获得单细胞悬浮液。然后，对细胞进行计数并将其以1-1.5×106个细胞/毫升再悬浮于Stemline II培养基中。
在短暂涡旋下，将该单细胞悬浮液(0.3ml，3到4.5×105个细胞)与2.7ml的成血管细胞生长培养基(如以上所描述，基于H4536的培养基配方)混合，并使其静置5分钟。然后，通过使用一个连接有18G针的注射器(3ml)将该细胞混合物转移到六孔超低粘附板的一个孔中，并在37℃及5％CO2下进行孵育。
一些细胞发育成葡萄状母细胞集落(BC)。具体地说，在3天时可见BC(在第3天开始时，典型地含有不到10个细胞)，并且在4-6天之后，在显微镜下容易地鉴别出葡萄状hES-BC(每个BC含有超过100个细胞)。培养物中存在的BC的数量在数天过程内逐渐增加。在6-7天之后，可以使用敞口玻璃毛细管拣取BC。
可以在培养的第7-12天之间收集成血管细胞，并且将其再铺板到涂有基质胶的组织培养板上的αMEM+20％FCS中。流式细胞术分析显示，在开始的成血管细胞群中，典型地在MSC上所见到的5种细胞表面标记物的表达水平相对较低。(图2，左图，4次实验的平均值+/-标准偏差)。然而，在MSC生长条件中培养三周之后，产生均匀的粘附细胞群，该细胞群>90％对这5种特征性MSC标记物染色呈阳性(图2，右图—22-23天，4次实验的平均值+/-标准偏差)。在MSC培养条件下，细胞分化以获得MSC表面标记物所花费的时间量可以取决于所用特定ESC系、成血管细胞收集的天数及铺板到基质胶上的成血管细胞的数量而变化。在一些实验中，到7-14天时90％的细胞产生标记物，而在其他实验中，这么多细胞获得这些MSC标记物可能花费22-24天。
与以上实验有关，图1示出了由多能细胞产生FM-MA09-MSC，以及由ESC经由成血管细胞产生间充质基质细胞的显微镜图。此外，图2含有由如以上描述而产生的多能细胞衍生的成血管细胞获得的FM-MA09-MSC的表型。该图示出了在初始成血管细胞群(图表左侧，第7-11天的成血管细胞)和在涂有基质胶的板上培养成血管细胞之后(图表右侧)对MSC表面标记物呈阳性的细胞的百分比以及衍生自成血管细胞的间充质基质细胞的显微镜图(右图照片)。另外，与以上实验有关，图17描绘了产生FM-MA09-MSC的过程；以及基质胶的作用，即，如与维持在基质胶上直到p6的那些相比较，在较早子代(即，p2)从基质胶移出细胞可能暂时地减慢MSC生长。
图18另外显示，所获得的BM-MSC和FM-MA09-MSC经历软骨形成。
实例2—ESC与MSC衍生的成血管细胞的分化的比较。
这一实例描述了ESC通过以下两种方法分化成MSC的比较：直接分化(其中将ESC直接地铺板于明胶或基质胶上)或成血管细胞法(其中，ESC首先分化成为成血管细胞，并且然后铺板于基质胶上，如实例1中所描述)。在明胶上进行直接分化产生了类MSC细胞，但这些细胞缺乏CD105的表达，表明不完全采用MSC的命运(图3，左图)。当将ESC直接地铺板于基质胶上时，所得细胞如关于MSC所预期的那样表达CD105(图3，中图)。然而，与通过成血管细胞法产生的MSC相比较，直接分化的MSC细胞以丛生方式生长，当分裂时更难分散，并且产生的MSC不如当从相等数量的ESC开始时那么多(图4)。
直接地从ESC分化的MSC还花费更长时间来获得特征性MSC细胞表面标记物(图5)。一旦获得了MSC，扩展的免疫表型分型就显示，由两种方法得到的MSC对典型地见于MSC上的其他标记物(如HLA-ABC)呈阳性，而对血细胞形成相关性标记物(如CD34和CD45)呈阴性(图6)。这些结果表明，使用成血管细胞-中间物阶段允许由ESC稳固地产生均匀的MSC。鉴于这些发现，将以成血管细胞衍生的MSC进行有关MSC的另外的研究。
此外，结果包含在图3-6、13、15、16、19及21-27中的实验(上文所描述)比较了ESC-MSC或BM-MSC相对于成血管细胞衍生的MSC的不同特性，并且揭露出这些细胞展现了可能影响这些细胞和衍生自其的组合物的治疗功效的显著差异。确切地说，图3示出了将人胚胎干细胞(ESC)在涂有明胶的板上(左图)、ESC在涂有基质胶的板上(中间图)及成血管细胞在涂有基质胶的板上(右图)进行培养之后对MSC表面标记物呈阳性的细胞的百分比。另外地，图4示出了由多能细胞得到的MSC的产率，图5图解了间充质基质细胞标记物的获得，并且图6示出了衍生自不同培养方法的间充质基质细胞的表型，包括MSC标记物的表达及血细胞形成和内皮标记物的表达的缺乏。另外，对FM-MA09-MSC进行分析以检测在效力和抑制作用(图13)、Treg扩增的刺激(图15)、增殖能力(图16)、PGE2分泌(图19)、Stro-1和CD10表达(图21-22)、在传代期间大小的维持(图23)、CD10和CD24表达(图24)、Aire-1和IL-11表达(图25)、Ang-1和CXCL1表达(图26)以及IL6和VEGF表达(图27)方面的值得注意的差异(相对于BM-MSC)。
实例3—衍生自成血管细胞的MSC分化成为其他细胞类型。
从定义上看，MSC应当能够产生脂肪细胞、骨细胞及软骨细胞。使用标准方法，图7示出了成血管细胞衍生的MSC分化成脂肪细胞和骨细胞的能力，而图8示出了它们经由表达软骨细胞特异性基因而朝向软骨细胞分化的潜能，并且图18经由团粒块培养物的番红O染色示出了它们朝向软骨细胞分化的潜能。
预期衍生自成血管细胞的MSC可分化成脂肪细胞、骨细胞及软骨细胞。这些分化路径可以使用本领域中先前报导的方法进行检查。参看卡尔森(Karlsson)等，《干细胞研究》(Stem Cell Research)3:39-50(2009)(有关成血管细胞衍生的和直接ESC衍生的MSC分化成脂肪细胞和骨细胞)。确切地说，FM-MA09-MSC展示了多种分化能力，包括分化成脂肪细胞和骨细胞的能力(图7)。对于软骨细胞分化，已经采用了来自龚(Gong)等，《细胞生理学杂志》(J.Cell.Physiol.)224:664-671(2010)的方法来研究此过程，并且继续通过番红O、阿尔辛蓝和/或甲苯蓝染色来检查软骨细胞特异性基因(例如软骨蛋白聚糖和胶原蛋白IIa)的获得以及糖胺聚糖沉积。确切地说，通过软骨蛋白聚糖(硫酸软骨素蛋白聚糖1)和胶原蛋白IIa的mRNA表达来检测MA09ESC成血管细胞衍生的间充质基质细胞的软骨形成分化(图8)。文献中已报导，衍生自MSC的脂肪细胞、骨细胞或软骨细胞这三种细胞类型都不会表达免疫刺激性HLA DR分子(勒布兰克(Le Blanc)2003，乔瑟斯托姆(Gotherstrom)2004，刘(Liu)2006)。将对这些完全分化的MSC细胞类型进行免疫染色和/或流式细胞术以确定这些报导的观察结果。这对于确定很重要，以致MSC在体内环境中的分化将不会诱导来自宿主接受者的免疫反应。在这三种细胞类型中，软骨形成分化可以是特别值得关注的，因为它有可能被用于针对运动损伤、老年关节疼痛、骨关节炎等的软骨更换疗法中。对于此类疗法，可能无需MSC完全地分化成软骨细胞以便进行治疗性使用。
实例4—确定衍生自成血管细胞的MSC基本上不含ESC
MSC还应当不具有ESC的形成畸胎瘤的倾向。经确定，MSC到第12代(培养约50天)时仍含有正常核型(数据未示出)。为了确定母细胞衍生的MSC不含痕量的ESC，在NOD/SCID小鼠中进行畸胎瘤形成分析。将5×106个MSC皮下注射到3只小鼠的左大腿肌肉中。CT2EC被用作阳性对照物，并且将在6周时间内监测该小鼠以对注射MSC与ESCC的小鼠中畸胎瘤的形成进行比较。在注射有MSC的小鼠中未形成畸胎瘤。
实例5—通过衍生自成血管细胞的MSC来降低EAE评分。
进行一项探索性研究以用成血管细胞衍生的ESC-MSC治疗6-8周龄的C57BL/6小鼠的实验性自体免疫性脑脊髓炎(EAE)。通过在第0天时对小鼠的侧腹皮下注射50pg MOG(35-55)肽和250pg结核分枝杆菌于佐剂油(CFA)中的100pL乳液来诱发EAE，同时对该小鼠腹膜内注射500ng百日咳毒素。六天之后，对小鼠腹膜内注射在PBS中的一百万个ESC-MSC(n＝3)或作为对照物的媒剂(n＝4)。免疫接种之后29天，记录下这些动物的临床评分。观察到疾病评分的明显降低(数据未示出)。
实例6—成血管细胞衍生的ESC-MSC在EAE治疗方面的功效的确定和另外的动物疾 病模型的使用
A.针对小鼠EAE模型测试ESC-MSC以确定其抗EAE作用。
为了确定实例5中所获得的结果，用增加的动物数量、变化的细胞剂量、不同的给药方案及更多的对照物来进行另外的测试。记录下临床评分和死亡率。还将对小鼠脑部和脊髓中淋巴细胞浸润的程度进行评估。一般认为MSC的抗EAE作用涉及免疫抑制活性，如Th17细胞的抑制，并且预期这些作用将降低CNS中淋巴细胞浸润的程度。
B.ESC-MSC与小鼠骨髓(BM)-MSC、人BM-MSC及人UCB-MSC的比较。
首先将使用小鼠BM-MSC来进行EAE治疗并且已得到充分研究[1]。可以针对抗EAE功效直接地比较ESC-MSC(已知其异种性质)与鼠类BM-MSC。经显示，人UCB-MSC还具有免疫抑制活性[19]。还可以在EAE小鼠模型中比较人UCB-MSC和人BM-MSC的抗EAE活性与ESC-MSC的抗EAE活性。这些不同细胞类型的年龄或传代次数可能影响其抗EAE行为，因此，还将在EAE小鼠模型系统中评价年龄对MSC功效的影响。
C.优化ESC-MSC的给药剂量、途径及时间选择。
注射ESC-MSC可以降低如在免疫接种之后29天内所记录的EAE的评分。为研究疾病的长期预防和治愈，可以按不同剂量、途径及时间给予ESC-MSC。
已经由H1gfp ESC产生MSC并且确定它们仍以MSC状态表达GFP。可以对EAE小鼠注射这些GFP+ESC-MSC并且通过使用精诺真(Xenogen)体内成像系统可以在体内追踪其分布。通过这些方法，ESC-MSC的不同给药剂量、途径及时间选择将得到分析，并且提供了关于MSC的抗EAE活性的作用机制(即，旁分泌或内分泌作用)、MSC在小鼠内的寿命以及MSC生物分布和排除/清除途径的信息。
抗EAE作用可以通过临床评分的降低、存活期增加和/或CNS中淋巴细胞浸润和脱髓鞘的衰减中的一种或多种来反映。不同的ESC系可以具有不同的产生MSC的固有能力。因此，在这一研究中可以使用多种ESC系并且可以随时间推移来监测MSC标记物的获得并针对每一ESC系进行比较。为进一步减少用ESC-MSC进行的多项实验之间的变化，可以将大量的冷冻ESC-MSC的储备液分数等分并且每一等分的储备液可以用于多项实验中。
D.确定成血管细胞衍生的MSC在其他疾病模型中的功效。
如以上所提到的，MSC还可以针对其他类型自体免疫病症(如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎及眼部病症葡萄膜炎)具有治疗活性。存在有关这些疾病的动物模型并且是本领域中众所周知的(参看例如，皮扎罗(Pizarro)等，2003，杜杰维斯坦(Duijvestein)等，2011，梁(Liang)等，2011，康普兰德(Copland.)等，2008)。体内研究可以扩展到包括在这些动物模型系统中的一种或多种中评估MSC的治疗效用。这些模型可以允许通过分离并筛选被注射动物的血清中的人细胞因子来检查人MSC的细胞因子分泌特征。确切地说，葡萄膜炎模型可以是有用的，因为局部玻璃体内注射可以允许在非全身性环境中研究MSC的作用。
MSC还可以在治疗骨关节炎病状(包括涉及关节软骨损失和受影响关节的炎症的那些)方面具有较大治疗效用(诺斯(Noth)等，2008)。用于检查骨关节炎、软骨损失及关节炎症的模型是本领域中众所周知的(参看例如，莫巴夏利(Mobasheri)等，2009)。在这些研究的一些中，将人BM-MSC囊封在半固体支架或微球中并移植到人类受试者的受影响关节中，以确定MSC在减少炎症和/或软骨修复方面是否具有局部、非全身性治疗作用(胁谷(Wakitani)等，2002)。这些方法将有助于确定这些ESC成血管细胞衍生的MSC治疗退化性关节病状的治疗效用。
注射的MSC的寿命极短[8]，这表明不需要移植的细胞长期存活。因此，也可以在以上提到的动物模型中测试有丝分裂失活的ESC-MSC(例如，经过照射或用丝裂霉素C处理的)的抗EAE作用或其他抗疾病作用。如果是这样，那么可能无需活的ESC-MSC，由此进一步降低了在移植的ESC-MSC中由潜在的残留ESC污染引起的生物安全性问题。
E.结果
预期来自不同供体衍生来源的MSC(小鼠BM-MSC、人BM-MSC及人UCB-MSC)可具有抗EAE作用。然而，其作用可能在多项实验之间变化，因为这些MSC是来自供体受限的来源。相比之下，本披露的ESC-MSC可以具有更一致的作用。因为使用了许多细胞表面标记物来表征MSC，并且不是每个MSC都表达所有标记物，所以可以使用一小组标记物(例如，CD73+和CD45-)以便比较来自不同来源的MSC的功效。
预期ESC-MSC在克罗恩氏病、溃疡性结肠炎及葡萄膜炎的动物模型中具有治疗效用，因为这些含有自体免疫组分和发炎性反应。
有丝分裂地失活的MSC(例如，照射或丝裂霉素C失活的MSC或ESC-MSC)可以至少部分地保持免疫抑制功能，因为它们仍分泌与该功能相关的细胞因子并且表达与该功能相关的细胞表面标记物[29]。然而，其作用可能因其在体内的寿命缩短而降低。如果是这样，那么可以增加经过照射或其他有丝分裂地失活的细胞的剂量和给药频率以增强免疫抑制功能。有丝分裂地失活的MSC和ESC-MSC可以至少部分地保持免疫抑制功能，因为它们仍分泌与该功能相关的细胞因子并且表达与该功能相关的细胞表面标记物[29]。然而，其作用可能因其在体内的寿命缩短而降低。如果是这样，那么可以增加有丝分裂地失活的细胞的剂量和给药频率以增强免疫抑制功能。
进行第二项探索性研究以治疗EAE。用在完全弗氏佐剂中的MOG35-55肽，经由subQ注射对八到十周龄的C57BL/6小鼠进行免疫接种。这是结合腹膜内注射百日咳毒素进行的。六天之后，每只小鼠腹膜内注射100万个活(或200万个经过照射的)成血管细胞衍生的多能细胞-间充质基质细胞。如先前所公开的，通过监测小鼠肢体/身体活动在0-5分量表上对疾病严重程度进行评分。结果证实，如与用第4代的成血管细胞衍生的多能细胞-间充质基质细胞和经过照射的成血管细胞衍生的多能细胞-间充质基质细胞的媒剂对照组相比较，临床评分显著降低(数据未示出)。有关两项探索性研究的评分是根据以下方案进行的：1分指示尾无力，2分指示部分后腿麻痹，3分是全部后腿麻痹，4分是全部后腿和部分前腿麻痹，5分是垂死的。
此外，取决于所涵盖的治疗适应症，根据本发明的MSC和可衍生自其的产物用于不同疗法中的功效可以在其他动物模型中得到确定，例如其他移植或自体免疫模型。
实例7—ESC-MSC的功能组分的研究
MSC可以定义为塑料粘附细胞，这些细胞表达以下细胞表面标记物：CD105、CD73、CD29、CD90、CD166、CD44、CD13及HLA-I类(ABC)，同时当在未诱导状态下培养(例如在不含细胞因子的常规αMEM+20％FCS中培养)时，对CD34、CD45、CD14、CD19、CD11b、CD79a及CD31呈阴性。在这些条件下，它们必须表达细胞内HLA-G并且对CD40和II类HLA(DR)呈阴性。在功能上，这些细胞还必须能够分化成脂肪细胞、骨细胞及软骨细胞，如通过标准体外培养分析所评估的。在用干扰素γ(IFNγ)刺激7天之后，MSC应当在其细胞表面上表达HLA-G以及在其细胞表面上表达CD40和HLA-II类(DR)。尽管有这些要求，但衍生自任何来源的MSC可以含有某种异质性，并且归因于ESC的多能性，有可能的是，衍生自ESC的MSC培养物可以含有来自三种胚层的任何谱系的细胞。尽管在此描述的培养系统指示，>90％的细胞常规地展示以上提到的免疫表型和功能特征，但在MSC培养物内可能存在较小的细胞子群，该子群缺乏一种或多种MSC细胞表面标记物的表达或表达应当不存在的一种或多种标记物。将对MSC培养物内这些子群的含量进行检查以测定污染性异质性的程度。可以在BD LSR II流式细胞仪上进行多色流式细胞术(同时地进行8+色彩)以便确定以上提到的标记物之间的重叠。这还可以帮助查明最大免疫抑制活性所需的确切细胞表面标记物特征。
A.表征与免疫抑制作用有关的ESC-MSC的分化阶段、子群及活化状态。
存在一个较大的时间窗(例如，在MSC分化培养基中至少从第14天到第28天)来收集ESC-MSC(参看例如，图1)。数项研究已指出，MSC倾向于丧失其免疫抑制功能并且可能衰老，因为它们在较长培养期的期间继续传代并老化。因此，可以在不同的时间点活性收集这些细胞以便确定在MSC培养基中指定天数是否提供更高的免疫抑制活性。事实上，在较早时间点(例如，在MSC培养条件下14天)收集的MSC可能含有前体细胞，这些细胞尚未完全获得所有特征性MSC细胞表面标记物，但具有高度有效的免疫抑制作用。为了确定潜在地有用的MSC前体群，在整个MSC分化过程中，从第7天到第28天，对众多细胞表面标记物的表达进行追踪。已观察到，至少50％的培养物将在MSC培养条件的14天内获得细胞表面标记物CD309(其他名称包括VEGFR2、KDR)。CD309在很大程度上不存在于开始的成血管细胞群中(图9，第一时间点，在第7天和第8天收集的MA09成血管细胞)，但在MSC培养条件的前两周内产生，并且然后到第28天时再次下降回到不到5％的细胞(图9，第二、第三及第四时间点)。已经发现，这一模式不仅出现在MA09成血管细胞衍生的MSC，而且还出现在来自MA01、H1gfp及H7ESC的那些。在这些实验中，成血管细胞常规地对CD309呈阴性(不到5％的细胞对其染色呈阳性)，不管其收集时间如何(第6-14天)。然而，当从更老的成血管细胞(例如，第10天或第12天母细胞)发育时，获得CD309表达的发育的MSC的百分比可能降低。以一种类似的方式，已经观察到成血管细胞衍生的MSC的扩增特性可能取决于成血管细胞的收集日期而不同。从更年轻的成血管细胞(第6天或第7天)发育的MSC不像从更老的(第8-12天)成血管细胞发育的MSC那么稳固地持续扩增。成血管细胞的最佳收集日期可以是中间日期(第8-10天)，因为它们可以允许适当地获得CD309作为MSC发育的替代性标记物，同时到第28天及之后时间仍维持稳固的扩增能力。继续进行研究以优化MSC前体发育的这些方面。
除CD105、CD90及CD73已经证实是MSC的最典型标记物(如由国际细胞疗法协会注为MSC的最小分类(多米尼西(Dominici)等，《细胞疗法》(Cytotherapy)8(4):315-317(2006)))外，以上未提到的许多其他细胞表面分子，如CD49a、CD54、CD80、CD86、CD271、VCAM及ICAM，也被提出或用作MSC标记物[22]。因此，有可能的是，ESC-MSC可以含有多个子群，这些子群在由成血管细胞分化期间表达其他标记物的不同组合，这些组合可以具有变化的免疫抑制活性。可以基于一种或多种供分析的标记物(个别地或组合)来分选(例如，使用FACS)子群以使用体外或体内方法进行免疫抑制活性的比较。
B.优化分化和扩增条件以获得大量的功能性ESC-MSC。
尽管初步实验已经指出MSC可以维持在IMDM+10％热灭活人血清中，但尚未测试它们在这一培养基中的衍生化。可以测试不同培养条件以确定取代培养物组分(例如，基础培养基、血清来源、血清代用产品、人血清血小板溶解产物)是否可以富集在此所描述的有效子群。将对包括不同基础培养基的无动物并且成分确定的培养物(不含FBS)系统培养ESC并制备MSC进行评价。具体地说，将使用来自英杰公司的MSC SFM和来自龙沙公司(Lonza)的MSCM子弹式试剂盒来检查无血清的成分确定的培养物系统是否会产生具有所希望的质量和数量的ESC-MSC。还可以使用不同生长因子(如FGF、PDGF及TGFI3)以及调控信号传导路径或细胞结构的小化学试剂来增强ESC-MSC的质量和数量。
C.结果
这些ESC-MSC表达典型标记物CD73(内切-5’-核苷酸酶[26])、CD90及CD105。另外，图20显示，根据本发明产生的FM-MA09-MSC随时间推移而维持其表型(基于在随时间及连续传代进行的不同MSC群的流式细胞术分析期间所检测的标记物表达)。
实例8—ESC-MSC的免疫抑制机制
A.有关ESC-MSC如何抑制由T细胞介导的适应性免疫反应的研究。
T细胞在PBMC内的一般反应是当它们用如植物凝集素(PHA)或佛波醇十四烷酸乙酸酯(PMA)/离子霉素等有丝分裂刺激剂诱导时或当它们遇到如树突状细胞等抗原呈递细胞(APC)时会增殖。这一情形的最佳例证是在混合白细胞反应(MLR)分析中CD4+和CD8+T细胞的一般增殖情况。先前的研究指出，MSC在MLR分析中可以抑制T细胞增殖。
对ESC-成血管细胞衍生的MSC抑制通过化学刺激(PMA/离子霉素，图10a和13a)(PHA，图13b)或暴露于APC(树突状细胞，图10b和13c)所引起的T细胞增殖的能力进行检查。观察到MSC阻碍了由化学刺激或与APC共培养所引起的T细胞的增殖反应，并且这一抑制作用是以剂量依赖性方式发生(图10b，右边的曲线)。此外，发现有丝分裂地失活的MSC(图10b)能够抑制T细胞增殖达到与活的MSC相当的程度，表明有丝分裂地失活的MSC确实可以在体内用于免疫抑制。
存在不同的功能性T细胞子集，并且它们进行的特定作用涉及到促炎性反应、消炎反应或T细胞反应低落的诱导。调控性T细胞(Treg)可以被认为是天然存在的免疫抑制性T细胞并且处于标准环境中，负责阻碍过敏性自体反应性T细胞反应。它们通常仅代表一小部分的身体T细胞，但其流行性可以受不同环境因素的影响。经显示，MSC可通过诱导Treg细胞来诱导周边耐受性[33-35]。
简短点说，5天的共培养分析发现，与先前的研究类似，成血管细胞衍生的MSC能够增加CD4/CD25双重阳性Treg的百分比，这些Treg是响应于IL2刺激物而诱导的(图11a、14、15a)。来自非粘附外周血单核细胞(PBMC)的混合T细胞群与MSC的共培养(比率为10个PBMC:1个MSC)显示，当在IL2诱导的培养物中包括MSC时，Treg诱导作用几乎加倍。这一Treg诱导作用程度类似于在常被引用的阿格拉旺(Aggarwal)等在《血液学》(Blood)，2005中公开的研究中所观察的程度。经检查，在CD4/CD25双重阳性群内诱导的FoxP3的量可确定这些确实是真正的Treg(图15b)。分子内流式细胞术被用于研究在IL2诱导的T细胞培养物中在不存在和存在MSC情况下FoxP3的诱导。非粘附PBMC和纯化的CD4+T细胞群都可以用于在这些分析中研究Treg诱导作用。不希望受理论的束缚，相信ES-MSC在诱导Treg方面更有效，因为它们比BM—MSC更有效地增加了CD25的表达(图15b)。
Th1和Th17细胞被认为在MS中和在其他自体免疫疾病中起到重要作用。Th1和Th17CD4+T细胞的分化和功能将首先并且最主要地使用体外分析进行分析；它们还可以在EAE模型中或在可能采用的其他动物模型中进行检查。已经开始检查MSC在体外对Th1诱导的影响。促进从原生CD4+T细胞特化Th1的培养条件是本领域中已知的(阿格拉旺等)。已采用了这些培养条件(这些条件包括抗CD3、抗CD28及抗CD4抗体以及人IL3和IL12)在不存在或存在MSC(10个PBMC:1个MSC)情况下诱导由原生的非粘附PBMC产生Th1细胞。共培养48小时之后，对非粘附细胞进行分离，冲洗并且在一个新孔中用PMA/离子霉素刺激16小时。诱导16小时之后，收集上清液并针对Th1细胞因子IFNγ的分泌进行分析。如所预期的，发现在48小时Th1诱导条件下与MSC一起培养的PBMC不会产生如在无MSC情况下培养的那些那么多的IFNγ。这指示，MSC可以抑制主要的Th1细胞功能，即IFNγ分泌。(图11b)类似研究将通过以下方式进行：在体外分化Th17细胞并使用对培养物上清液进行的ELISA分析来确定MSC对促炎性IL17分泌的影响。
已知Th2细胞可分泌多种具有促炎性作用的细胞因子，如IL4。MSC能够增进Th2分化和IL4的分泌。与以上关于Th1细胞所描述的实验类似，将在48小时培养物系统中使用Th2诱导条件来刺激从含T细胞的原生PBMC分化Th2。MSC共培养对IL4分泌的影响将使用ELISA分析进行检查。
近来，多项研究已表明，CD8T细胞也在EAE模型和MS的潜在机制中起到关键作用[30]。发明人将检查在体外与ESC-MSC共培养是否会影响CD8T细胞的功能。为此，通过使用APC将非粘附PBMC或纯化的CD8+T细胞暴露于EAE相关性MBP110-118肽。这将使抗原特异性CD8+T细胞群出现并且此类群体可以使用CD3/CD28扩珠(expander bead)(英杰公司)进行扩增。抗原特异性CD8+T细胞的存在可以在流式细胞术中使用MBP-肽特异性五聚体试剂(普迈公司(Proimmune))进行验证。用载有MBP110-118的APC进行再刺激以便诱导抗原特异性免疫反应，该反应包括抗原特异性CD8+T细胞的扩增和IFNγ的分泌。将对在不存在或存在MSC情况下培养的T细胞的反应进行比较以确定MSC是否能抑制这些细胞毒性EAE相关性抗原特异性T细胞的诱导。为这一目的，将采用五聚体特异性流式细胞术、BrdU结合及ELISA分析。
B.确定发炎性因子和细胞间粘附分子(ICAM)是否有助于ESC-MSC的免疫抑制作用。
经显示，TGFβ、PGE2、IDO、一氧化氮(NO)及ICAM对于MSC的免疫抑制功能很重要[7]。ESC-MSC对这些分子的分泌及对ICAM的表达将使用ELISA分析和流式细胞术进行检查。
经显示，促炎性细胞因子IFNγ是MSC活化所需的[23]，并且针对Toll样受体(TLR)的不同激动剂(如LPS和聚(I:C))可以诱导不同的MSC子集[24]。举例来说，近期已显示，IFNγ活化的MSC在小鼠结肠炎模型中具有比未处理的MSC更强的治疗功效(杜杰维斯坦等，2011)。IFNγ对MSC特性的影响已经开始进行检查。已经在体外用IFNγ处理ESC-MSC长达七天并且已经引起了细胞表面标记物表达的明显变化。这些发现与在先前的研究(乔瑟斯托姆等，2004；拉斯姆森(Rasmusson)等，2006；纽曼(Newman)等，2009)中所得出的观察结果一致，并且确定成血管细胞衍生的ESC-MSC功能类似于从身体分离的MSC。举例来说，在休眠状态下，MSC典型地在其细胞表面上不表达较多(<10％)的HLA G，而它们在细胞内具有这一特殊类别的免疫耐受性HLA标记物的储存。在7天的IFNγ处理之后，可以容易地在细胞表面上检测到HLA G(图12)，并且还可以诱导其分泌(尚未测试)。另外地，IFNγ处理引起了CD40表达的上调及在细胞表面处HLA DR的表达(图12)。这些变化被提出增强了其免疫抑制作用。举例来说，将通过使用以上描述的体外共培养分析来确定用IFNγ预处理MSC是否增强它们诱导Treg群、抑制Th1的IFNγ分泌或增强从Th2细胞分泌IL4的能力。IFNγ还可以影响MSC在MLR分析中抑制总体T细胞增殖的能力。TNFα、LPS和/或聚I:C对这些类型的MSC免疫抑制特性的影响也可以得到测试。
C.结果
经显示，由MSC诱导的CD4/CD25双重阳性Treg群还表达转录因子FoxP3，因为据报导，功能性Treg响应于诱导性刺激物而上调其表达(图15b)。
预期MSC将在某种程度上抑制Th17细胞对促炎性IL17的分泌并且MSC还可以显著地增强消炎性Th2细胞对IL4的分泌。这些观察结果已经在先前的研究中得出，并且将有助于确定成血管细胞衍生的MSC的真实功能。
ESC-MSC应当至少部分地抑制抗原诱导的CD8+T细胞活化。在ESC-MSC共培养之后，NK细胞、巨噬细胞及树突状细胞的功能也可以进行检查。ESC-MSC对这些其他类型免疫细胞的成熟、细胞毒性和/或特定细胞因子产生的影响将得到检查。
举例来说，图11A中的实验显示，成血管细胞衍生的间充质基质细胞使响应于IL2刺激而诱导的CD4/CD25双重阳性Treg的百分比增加。图12中的实验也显示，促炎性细胞因子IFNg刺激FM-MA09-MSC表面标记物表达的变化并且干扰素γ刺激MSC表面标记物表达的变化并且可以增强MSC的免疫抑制作用。
此外，图14中的实验显示，FM-MA09-MSC增强Treg诱导，并且特别是较早子代的MSC具有比较晚子代的MSC更强的作用。在不存在或存在FM-MA09-MSC情况下，将非粘附PBMC(不同供体)在有或没有IL2情况下培养4天。通过流式细胞术评估CD4/CD25双重阳性Treg的百分比。使用年轻的(p6)或老的(p16-18)FM-MA09-MSC。黑色柱形指示6次实验的平均值。MSC作为整体对Treg的诱导具有统计学上显著的影响。(p＝0.02)。
实例9—ESC-MSC相比BM-MSC具有增加的效力和更强的抑制作用
进行混合淋巴细胞反应(MLR)分析以确定不同的MSC群是否具有不同的抑制T细胞增殖的能力。结果表明，ESC-MSC在响应于促有丝分裂刺激物(“单向MLR”)(参看图13a和13b)或抗原呈递细胞(树突状细胞，DC；“双向”MLR)(参看图13c)抑制T细胞增殖的能力方面比BM-MSC更有效。
该“单向”MLR分析是如下进行的：从奥赛尔斯公司(AllCells)购买人PBMC。在将冷冻小瓶解冻后，将PBMC铺板于IMDM+10％热灭活人血清中保持至少1小时或过夜，以选择性粘附单核细胞。非粘附细胞(含有T细胞)用作T细胞反应物的粗来源。ESC衍生的MSC或BM衍生的MSC用作抑制剂。这些MSC是活的或用丝裂霉素C进行有丝分裂停滞的。将非粘附PBMC和MSC以不同比率混合在一起并且使其共培养5天。第3天时，向该培养物中添加促分裂素佛波醇-12-十四烷基酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素或植物凝集素(PHA)以诱导T细胞增殖。第4天，添加溴脱氧尿苷(BrdU)。第5天，通过用针对CD4、CD8及BrdU的抗体，使用BrdU结合试剂盒(BD生物系统公司(B&D Biosystems))进行流式细胞术染色来评估T细胞增殖。T细胞增殖是以已将BrdU结合到其DNA(即BrdU+)中的CD4+和/或CD8+细胞的百分比进行评估(示于图13a和13b中)。
在“双向”MLR中，ESC衍生的MSC或BM衍生的MSC被用作抑制剂，非粘附外周血单核细胞(PBMC)被用作T细胞反应物的粗来源，并且单核细胞衍生的树突状细胞(DC)被用作刺激剂。为衍生DC，从PBMC分离出塑料粘附单核细胞。将PBMC铺板于IMDM+10％热灭活人血清(10％HuSer)中保持至少1小时或过夜，以选择性粘附单核细胞。去除非粘附细胞，并在SCF、FL、GM-CSF、IL3及IL4存在下，在IMDM+10％HuSer中培养粘附细胞4天。在该分析的这一变化形式中，第3天未添加促分裂素。在收集细胞之前16-24小时，简单地添加BrdU以如以上进行流式细胞术。在这一分析中，MSC和DC都用丝裂霉素C进行有丝分裂失活(示于图13c中)。
实例10—由年轻的ESC-MSC诱导的Treg扩增相较于BM-MSC和较老的ESC-MSC有所 改善。
用PBMC和MSC进行共培养实验以确定MSC的存在是否能在PBMC群内诱导调控性T细胞(Treg)扩增。结果表明，年轻的ESC-MSC诱导Treg扩增比BM-MSC和较老的ESC-MSC更好(参看图14和图15)。
用非粘附PBMC以及不同类型的MSC(“年轻”ESC衍生的MSC(约p5-6)、“较老”ESC衍生的MSC(约p12或更高)、BM衍生的MSC)以10:1的比率(PBMC:MSC)建立共培养。在IMDM+10％热灭活人血清+300个单位/毫升重组人IL2中孵育共培养物4天。使用FoxP3细胞内流式细胞术染色试剂盒(博雷德公司(Biolegend))，通过对CD4、CD25及FoxP3染色呈阳性的PBMC的百分比来确定Treg的存在。
实例11—ESC-MSC具有更强增殖能力
随时间监测不同MSC群的生长速率以确定MSC的来源是否影响其增殖能力。结果显示，ESC衍生的MSC具有比BM衍生的MSC更强的增殖能力。结果还表明，在一种基质(如基质胶)上培养ESC-MSC一段更长时间(多达6代)可以有助于维持比在更早子代(如p2)从该基质移出细胞时更高的生长速率(参看图16和图17)。
将ESC衍生的成血管细胞以50,000个细胞/平方厘米接种于在涂有基质胶的组织培养塑料上的αMEM+20％海可隆(Hyclone)FBS+l-谷氨酰胺+非必需氨基酸(＝MSC生长培养基，作为p0)中。将骨髓单核细胞以50,000个细胞/平方厘米接种于在常规组织培养塑料上的MSC生长培养基中作为p0。当细胞在p0达到约50％-60％汇合或从p1向前达到70％-80％汇合(通常每3-5天)时，用0.05％胰蛋白酶-edta(吉博克公司(Gibco))收集细胞。收集后，对细胞进行短暂离心，计数并且以7000个细胞/平方厘米再铺板。从基质胶中取出ESC-MSC，并且除非另作指示，否则随后使其自p3开始在常规组织培养塑料上生长。对累积群体倍增随时间的变化进行作图，以示出当在培养物中维持MSC时细胞生长的速率。
实例12—ESC-MSC经历软骨形成分化
为了确定不同MSC群的软骨形成潜能，将ESC-MSC或BM-MSC以团粒块培养物形式接种并用分化培养基诱导其分化成软骨细胞(或保持在常规MSC生长培养基中作为阴性对照物)。结果表明，ESC-MSC以一种与BM-MSC类似的方式经历软骨形成。ESC-MSC和BM-MSC团粒经由番红O染色而揭露软骨基质(蛋白聚糖)沉积(参看图18)。
为了形成软骨形成团粒培养物，在一个15mL的锥形管中以500X g将2.5×105个细胞ESC-MSC离心5分钟。抽吸出培养基并向该团粒添加0.5mL的软骨形成培养基，该培养基由补充有1mM丙酮酸钠(生命技术公司(Life Technologies))、0.1mM抗坏血酸2-磷酸(密苏里州圣路易斯的西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))、0.1μM地塞米松(西格玛-阿尔德里奇公司)、1％ITS(马萨诸塞州贝德福德的康博生物医疗产品公司(Collaborative Biomedical Products,Bedford,MA))、10ng/mL TGF-β3(新泽西州罗泽希尔的派普泰克公司(Peprotech,Rocky Hill,NJ))的DMEM-HG(马里兰州盖瑟斯堡的生命技术公司(Life Technologies,Gaithersburg,MD))组成；或培养基(对照物)。维持球粒培养物21天，并且每2-3天更换培养基。在21天结束时，用4％三聚甲醛固定球粒并将其送到马萨组织学研究所(MassHistology)以使用标准程序进行石蜡包埋、切片以及番红O染色。
实例13-在IFN-γ或TNF-α刺激下前列腺素2(PGE2)的分泌增强
ESC-MSC部分通过PGE2的分泌来发挥免疫调节作用。从FM ESC-MSC和BM-MSC收集的条件培养基显示，BM-MSC在基础状态下分泌PGE2的水平比FM ESC-MSC更高。在刺激条件(不同浓度的IFN-γ和/或TNF-α)下确定PGE2分泌的实验显示，FM ESC-MSC响应于刺激而大幅增加PGE2的分泌(参看图19)。事实上，PGE2分泌从基础到刺激状态的诱导倍数对于FMESC-MSC比对于BM-MSC高得多。然而，在刺激条件下PGE2分泌的实际原始量(以pg/ml为单位)对于FM ESC-MSC与BM-MSC是类似的。
将ESC-MSC以7.5×106个细胞/平方厘米铺板于6孔板(新泽西州富兰克林湖的BD富康公司(BD Falcon,Franklin Lakes,NJ))中。培养物维持在培养基中24小时，随后用10、50、100或200ng/ml IFN-γ和/或10、25、50ng/mL TNF-α(派普泰克公司)进行刺激。在诱导3天之后，收集上清液并在-20℃下储存。收集ESC-MSC并计数以关于细胞数量对PGE2水平进行归一化。PGE2浓度是用ELISA试剂盒(R&D PGE2参数或前列腺素E2表达EIA试剂盒，凯曼化学品公司(Cayman Chemicals))测量并根据制造商的方案使用。
实例14—ESC-MSC表型评价
针对不同MSC群评估不同细胞表面标记物的表达以确定其个别免疫表型。ESC衍生的MSC可以在不同基质上分化。对一组细胞表面标记物进行检查以确定它们于在三种不同基质(基质胶、纤连蛋白或胶原蛋白I)上衍生的MSC上的表达谱与它们在BM-MSC上的表达的比较。结果显示，不管用于其初始分化的基质如何，这些标记物的表达模式类似。它们有超过95％对CD13、29、44、73、90、105、166及HLA-ABC呈阳性，而对CD31、34、45、HLA-DR、FGFR2、CD271呈阴性(参看图20A)。Stro-1的表达在对于ESC-MSC的约5％到对于BM-MSC的约30％之间变化。
随着传代次数增加，MSC的生长和群体倍增减慢。这一实验旨在查看在FM-ESC-MSC中来自第3到17代的多种不同MSC标记物的表面标记物表达。FM-ESC-MSC所有子代中的细胞都对CD90、CD73、CD105、HLA-ABC、CD166、CD13及CD44染色呈阳性。细胞对CD34、CD45、TLR3、HLA-DR、CD106、CD133及CD271呈阴性(参看图20B)。
对于每一系/传代次数，遵循相同的方案。使细胞在T75或T175烧瓶中在MSC培养基中生长。细胞每3-4天传代。细胞传代由以下各项组成：用PBS洗涤烧瓶；使用细胞解离培养基TryPLE Express收集细胞；并且用MSC培养基洗涤。用台盼蓝针对有活力细胞进行计数，并以每种条件50-100,000个存活细胞进行等分。使用以下抗体：CD34-Fitc、CD34-PE、CD44-Fitc、CD73-PE、CD106-PE、CD45-APC(BD公司)；HLA-DR-APC、CD90-Fitc、HLA-ABC-Fitc、CD133-APC、CD29(艾伯生物科技公司(ebioscience))；CD166-PE、CD105-APC、CD13-PE、CD13-APC、CD271-Fitc、CD10-Fitc、Stro-1-AF647、CD10(博雷德公司)；TLR3-Fitc(圣塔科鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotech))。还添加碘化丙啶作为活力标记物。在室温下孵育细胞30分钟，短暂离心，使其通过40μm的细胞粗滤器，并用一个Accuri C6流式细胞仪进行分析。对于每种细胞类型，在MSC群(FSC对比SSC)上对细胞进行门控，PI阴性。阳性百分比是通过门控直方图并使用未染色的细胞群作为阴性对照物来测定。参看，瓦格纳W(WagnerW)等，间充质干细胞的复制衰老：一个持续并且有组织的过程(Replicative Senescenceof Mesenchymal Stem Cells:A Continuous and Organized Process.《公共科学图书 馆·综合》(PLoS ONE)(2008).3(5):e2213.doi:10.1371/journal.pone.0002213；和穆希纳，R(Musina,R)等，从不同人类组织获得的间充质干细胞的比较(Comparison ofMesenchymal Stem Cells Obtained from Different Human Tissues.)《生物学与医学中的细胞技术》(Cell Technologies in Biology and Medicine)(2005)4月1(2),504-509。
另外地，FM ESC-MSC具有比FM ESC-MSC和BM-MSC更高的CD10表达水平和更低的Stro-1表达(参看图21)。这一低Stro-1(5％-10％的细胞)和中等水平CD10(约40％的细胞)的表达模式在10个不同批次的FM-MA09-MSC中得到确认(参看图22)。还对不同群体使用流式细胞术以评价细胞大小(参看图23)。结果显示，细胞在培养物中维持更长时间段，BM-MSC的细胞大小增加，而FM ES衍生的MSC维持细胞大小。细胞大小是通过在流式细胞术点状图上前向散射与侧向散射的比较来确定。使用象限门将该图划分成4个区域。右上象限含有较大细胞，即，该区域中的细胞具有较大的前向散射(细胞体积)以及高侧向散射(粒度)。
如先前所提到的，收集ESC-MSC，并在1X DPBS(生命技术公司)中洗涤。用上样缓冲液(3％FBS；科罗拉多州科林斯堡的阿特拉斯生物公司(Atlas Biologicals,FortCollins,CO))洗涤75-100×105个细胞，随后用含有一次抗体或同型对照抗体的100μL上样缓冲液在冰上孵育45分钟。用2mL上样缓冲液洗涤细胞，并在含有二次抗体的100μL上样缓冲液中在冰上孵育45分钟。最后一次洗涤细胞，并将其再悬浮于含有碘化丙啶的上样缓冲液中，并在Accuri C6流式细胞仪(密歇根州安娜堡的阿克里细胞仪器有限公司(AccuriCytometers Inc.,Ann Arbor,MI))上进行分析。
实例15—在ESC-MSC中进行的基因表达分析
这些研究的目的在于确定FM-ESC-MSC与BM-MSC之间mRNA表达的相似性和差异。在第一组实验(基础实验)中，通过定量聚合酶链反应(QPCR)比较来自FM-ESC-MSC与BM-MSC的细胞的mRNA表达的相对差异。使用了针对不同基因的泰格曼探针(生命技术公司)，使用ΔΔCt法来确定相对于内源对照物GAPDH的相对表达。从28个基因的清单中，以下基因在基础实验中在FM-ESC-MSC中相对于BM-MSC上调：AIRE、ANGPT1(ANG-1)、CXCL1、CD10、CD24及IL11(参看图24-26)。IL6和VEGF在FM-ESC-MSC中相对于BM-MSC下调(参看图27)。以下基因在多种MSC来源之间无显著差异：ALCAM、FGF7、HGF、LGALS1、NT5E及TNFSF1B(数据未示出)。以下基因在任何MSC来源中未检测到：ANGPT2、CD31、CD34、CD45、HLA-G、IL2RA、IL3、IL12B(数据未示出)。作为阴性对照物，测试所有MSC中成血管祖细胞标记物CD34、CD41及CD45的表达。从这些实验已经确定，FM-ESC-MSC表达一些基因的水平比相等的BM-MSC更高或更低。
还通过用T细胞处理MSC并且然后添加刺激物植物凝集素(PHA)来使MSC面临模拟免疫反应的环境的挑战。使ESC-MSC在T细胞(未刺激)或T细胞加PHA(经刺激)存在下生长两天，随后添加2.5μg/ml PHA再保持2天，之后收集RNA。目前将未刺激和经刺激的ESC-MSC的基因表达与未刺激和经刺激的BM-MSC的mRNA水平相比较。
对于基础实验：在先前所描述的条件下，在10cm培养皿中，将FM-ESC-MSC和BM-MSC以约500,000个细胞的初始密度培养4天。另外地，基础实验的阴性对照物是MA09ESC衍生的成血管祖细胞。
对于刺激实验：在先前所描述的条件下，在10cm培养皿中，将FM-ESC-MSC和BM-MSC以约500,000个细胞的初始密度培养3-4天。然后，使MSC暴露于T细胞2天，并且然后+/-暴露于2.5μg/ml PHA。作为对照物，使MSC在存在T细胞并且无PHA情况下生长，并且单独地，也在T细胞加PHA(无MSC)中生长。抽吸出培养基，在PBS中冲洗2次，并抽吸干燥。遵照制造商的指导，使用RNAeasy试剂盒(凯杰公司(Qiagen))分离RNA。通过使用Nanodrop 2000(赛默科技公司(Thermo Scientific))分析RNA的浓度和纯度。使用针对qRT-PCR的SuperScript III第一链合成超级混合物(SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix)(生命技术公司)，使用1微克RNA作为起始物质来进行cDNA合成。对于5微升/孔，将cDNA稀释约30倍。每孔混合稀cDNA、1微升QPCR泰格曼探针(生命技术公司)及15微升SSO Fast Mastermix(贝拉德公司(Biorad))。在贝拉德公司的CFX 96上进行QPCR。使用CFX管理器2.1(贝拉德公司)分析数据。使用内源对照物GAPDH和ΔΔCt法确定mRNA表达的相对量。
实例16—在ESC-MSC中吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的酶活性
吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是一种涉及将色氨酸转化成犬尿氨酸的酶。IFNγ活化的MSC产生IDO，并且这可能部分地负责其抑制T细胞增殖的能力，因为IDO干扰T细胞代谢。在这一研究中，测试了BM-MSC与ESC-MSC的IDO活性的比较。在用IFNγ或通过与T细胞共培养来刺激细胞之前和之后测量IDO表达。实验显示，在用IFNγ刺激之后，所有MSC群都使IDO活性大幅增加(参看图28)。
通过向培养基中添加IFNγ(50ng/ml)，或通过与T细胞共培养3天来刺激细胞；使用分光光度分析来进行IDO表达的测量。刺激之后，收集细胞，并将1-2×106个细胞溶解。收集溶解产物，并且以1:1与2X IDO缓冲液(含有40mM抗坏血酸酯、20μM亚甲基蓝、200μg/ml过氧化氢酶及800μM L-色氨酸的PBS)混合，并在37℃下孵育30分钟。通过添加30％三氯乙酸来停止该反应，并在52℃下孵育30分钟。对溶解产物进行短暂离心，并将上清液以1:1与艾利奇氏试剂(Ehrlich’s reagent)(乙酸中的0.8％对二甲基氨基苯甲醛，新鲜制备)混合。颜色显现之后，在分光光度计上在492nm下读取吸光度。将OD值与从0到1000μM的犬尿氨酸标准品相比较，以评估色氨酸向犬尿氨酸的转化。
参看梅塞尔R(Meisel R)等，人骨髓基质细胞通过吲哚胺2,3-双加氧酶介导的色氨酸降解来抑制异基因T细胞反应(Human bone marrow stromal cells inhibitallogeneic T-cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase-mediatedtryptophan degradation.)《血液学》(2004)6月15日；103(12):4619-21。
参看布劳恩，D(Braun,D)等，在树突状细胞成熟期间吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)活性的两步诱导(A two-step induction of indoleamine 2,3dioxygenase(IDO)activityduring dendritic-cell maturation.)《血液学》(2005)10月1日；106(7):2375-81。
实例17—ESC-MSC中Aire-1和朊蛋白的表达水平
使用蛋白质印迹分析对Aire-1和朊蛋白(Prp)的表达水平进行监测以确定在不同MSC群间是否存在差异(基于MSC的细胞来源、衍生化法或传代次数)。Aire-1有助于诱导稀有的周围组织限制性抗原(PTA)的转录，这些抗原随后被呈递于MHC上并压制相邻T细胞的反应。Aire-1还可以抑制早期T细胞活化因子-1(ETA-1)的表达以抑制T细胞发炎性反应。经显示，朊蛋白(PrP)可增强不同干细胞群(成血管、神经干细胞等)的增殖和自我更新，并且其表达可能与不同MSC群在培养物中的生长特征有关。结果显示，两种蛋白质存在年龄相关性下降(在对于每一样品考虑了内对照物肌动蛋白之后)。FM MA09-MSC看来随时间而维持Aire-1和PrP的表达(参看图29)。
根据标准方案，使MSC全细胞溶解产物在12％丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶上进行跑胶。将蛋白质转移到硝基纤维素膜上并用在PBS+0.05％吐温20(tween 20)中的5％牛乳进行阻断。用针对Aire-1(圣塔科鲁兹生物技术公司)或朊蛋白(艾博康公司(Abcam))的抗体，随后HRP结合的二次抗体探查膜。使用增强型化学发光试剂来产生信号，随后在贝拉德公司的GelDoc成像系统上进行分析。
参看帕雷柯达(Parekkadan)等，《分子疗法》(Molecular Therapy)20(1):178-186(2011)。
参看莫汉提(Mohanty)等，《干细胞》(Stem Cells)30:1134-1143(2012)。
实例18—ESC-MSC的细胞因子分泌
已知MSC在基础状态下以及响应于不同刺激物而分泌多种细胞因子和生长因子。使用细胞因子阵列对超过20种不同的分泌型因子进行分析。结果显示，就分泌型因子来说，在基础状态和经刺激状态下ESC-MSC与BM-MSC之间存在极少关键差异。BM-MSC在基础状态和IFNγ刺激状态下对于VEGF和IL6的表达水平高于ESC-MSC(参看图30-32)。
最初铺板相同数量的MSC，并在铺板之后3-4天，从MSC收集条件培养基。对CM进行简短地短暂离心以去除细胞碎片，并且然后在-20℃下冷冻。将CM解冻以根据制造商的方案，在雷柏泰克公司(RayBiotech)(佐治亚州诺克罗斯(Norcross,GA))定制膜阵列上或在不同R&D系统公司(R&D Systems)(明尼苏达州明尼阿波利斯(Minneapolis,MN))的现成细胞因子阵列上进行分析。
实例19—用于MSC分化的人ES细胞培养物
这一实验的目的在于评价在分化成MSC之前用于hESC培养的不同生长培养基。
人ES细胞一般是在人ES细胞生长培养基(knockout DMEM或DMEM/F12(1:1)基础培养基、20％血清代用品、l-谷氨酰胺、非必需氨基酸及10ng/ml bFGF)中在经过照射或丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层细胞上培养的。使用0.05％胰蛋白酶/EDTA进行传代。作为替代方案，在灵长类动物培养基中的MEF饲养层上培养hESC，并使用解离溶液进行传代(二者都是购自雷普赛尔公司(ReproCELL))。结果显示，与在含有knockoutDMEM的人ES细胞生长培养基上生长的细胞相比较，灵长类动物培养基始终产生“更佳”外观的hESC集落(更圆、更紧密的集落，更少的自发分化)。
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在此引用的每一文献(例如，美国专利、美国公开的申请、非专利文献等)都以全文引用的方式结合于此。

Claims (10)

1.一种适合用于哺乳动物患者的药物制剂，该药物制剂包含至少106个间充质基质细胞和药学上可接受的载体，其中这些间充质基质细胞具有的复制能力使得在细胞培养物中经历至少10次群体倍增，并且这些细胞中不到25％到第十次倍增时经历细胞死亡、衰老或分化成为非MSC细胞。
2.一种适合用于哺乳动物患者的药物制剂，该药物制剂包含至少106个间充质基质细胞和药学上可接受的载体，其中这些间充质基质细胞具有的复制能力使得在细胞培养物中经历至少5次传代，并且这些细胞中不到25％到第5次传代时经历细胞死亡、衰老或分化成为成纤维细胞。
3.一种药物制剂，包含至少106个间充质基质细胞和药学上可接受的载体，其中这些间充质基质细胞是由成血管细胞分化的。
4.一种低温细胞库，该细胞库包含至少108个间充质基质细胞，其中这些间充质基质细胞具有的复制能力使得在细胞培养物中经历至少10次群体倍增，并且这些细胞中不到25％到第十次群体倍增时经历细胞死亡、衰老或分化成为成纤维细胞。
5.一种纯化的细胞制剂，该制剂包含至少106个间充质基质细胞和不到百分之一的任何其他细胞类型，其中这些间充质基质细胞具有的复制能力使得在细胞培养物中经历至少10次群体倍增，并且这些细胞中不到25％到第十次群体倍增时经历细胞死亡、衰老或分化成为非MSC细胞。
6.权利要求1到5中任一项所述的制剂或细胞库，其中这些间充质基质细胞是由多能干细胞来源，如胚胎干细胞系或诱导性多能性干细胞系分化的。
7.权利要求6所述的制剂或细胞库，其中该制剂或库的所有间充质基质细胞都是由常见的多能干细胞来源分化的。
8.权利要求6所述的制剂或细胞库，其中这些间充质基质细胞是由多能干细胞来源分化，在培养物中传代以扩增间充质基质细胞的数量，并且在不到二十次群体倍增之后从培养物分离。
9.权利要求1到5中任一项所述的制剂或细胞库，其中这些间充质基质细胞在HLA基因型方面是相同的。
10.权利要求1到5中任一项所述的制剂或细胞库，其中这些间充质基质细胞在基因组方面是相同的。
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