CN115003794A - 治疗血管疾病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及新型中胚层衍生的血管祖细胞(meso‑VPC)和产生meso‑VPC的方法。本发明还涉及通过给予对象meso‑VPC来治疗血管疾病(如严重肢体缺血)的方法。

Description

治疗血管疾病的组合物和方法
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)的规定要求2019年8月28日提交的美国临时申请第62/892,724号的优先权，将其全部内容通过引用纳入本文。
技术领域
本发明涉及新型中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)和产生meso-VPC的方法。本发明还涉及使用meso-VPC来治疗血管疾病(如缺血)的方法。
背景技术
血管疾病是影响身体血管网络的病症。超过7800万美国人患有最常见形式的血管疾病——高血压。此外，外周动脉疾病(PAD)在美国影响着1200-1500万人，还有更多未确诊的病例。
外周动脉疾病(PAD)是指从心脏向其他器官和组织输送血液的血管变窄或堵塞。它主要是由动脉中的脂肪斑块堆积造成的，这被称为动脉粥样硬化。PAD可发生在任何血管中，但它相比于手臂更常见于腿部。
缺血是由外周动脉疾病引起的病症，涉及向组织、器官或肢体的动脉血液供应中断，如果不治疗就可能导致组织死亡。其可由栓塞、动脉粥样硬化动脉的血栓形成或外伤引起。静脉问题如静脉流出阻塞和低流量状态可引起急性动脉缺血。腿部缺血可导致腿部疼痛或活动时抽筋(跛行)，皮肤颜色改变，出现疮或溃疡，并感到腿部疲劳。血液循环的完全丧失可能导坏疽和肢体的丧失。
血管疾病如缺血的治疗是有限的。虽然大多数治疗方法涉及侵入性外科手术步骤，但其他治疗方法侧重于预防现有病症的进展。因此，本领域仍然需要对血管疾病(如缺血)的改进治疗。
发明内容
本发明涉及通过多能干细胞的体外分化产生中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)的新方法。本发明还提供用本发明的meso-VPC治疗血管疾病(如严重肢体缺血)的方法。
因此，在一个方面，本发明提供一种由多能干细胞产生中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)群体的方法，其中该方法包括在包含选自血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、和转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂的一种或多种因子的培养基中，在非粘附或低粘附条件下培养从多能干细胞衍生的中胚层细胞，从而产生中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)群体。
在一个实施方式中，通过在包含选自激活素-A、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、和骨形态发生蛋白4(BMP4)的一种或多种中胚层诱导性生长因子的培养基中培养多能干细胞，从多能干细胞衍生中胚层细胞。
在一个实施方式中，meso-VPC产生为类血管(vasculonoid)。在另一个实施方式中，meso-VPC被解离为单细胞。
在一个实施方式中，中胚层诱导性生长因子包括激活素-A、VEGF165、FGF-2和BMP4。在一个实施方式中，激活素-A以约5-15ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，VEGF165以约5-25ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，FGF-2以约5-25ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，BMP4以约5-50ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，该方法还包括在培养约24小时后从培养基中去除激活素-A。
在一个实施方式中，多能干细胞在细胞外基质表面上培养。在一个实施方式中，细胞外基质表面是Matrigel包被的表面。在一个实施方式中，多能干细胞培养约3天～约5天。
在一个实施方式中，转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂是SB431542。在另一个实施方式中，一种或多种因子包括VEGF165、FGF-2、BMP4和SB431542。在一个实施方式中，一种或多种因子还包括毛喉素。在一个实施方式中，毛喉素以约2-10μM的浓度使用。在一个实施方式中，VEGF165以约10-50ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，FGF-2以约10-50ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，BMP4以约10-50ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，SB431542以约5-20μM的浓度使用。
在一个实施方式中，中胚层细胞的培养进行约3天～约7天。
在一个实施方式中，中胚层细胞的培养在5％CO2和20％O2的常氧条件下进行。
在一个实施方式中，多能干细胞的培养在5％CO2和20％O2的常氧条件下进行。
在一个实施方式中，非粘附或低粘附条件是在超低附着表面上。
在一个方面，本发明提供一种由多能干细胞产生中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)群体的方法，其中该方法包括：(a)在包含选自血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、和骨形态发生蛋白4(BMP4)的一种或多种因子的培养基中，在细胞外基质表面上培养从多能干细胞衍生的中胚层细胞；以及(b)在包含选自血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、和转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂的一种或多种因子的培养基中，在细胞外基质表面上培养(a)中产生的细胞，从而产生中胚层衍生的血管祖细胞群体。
在一个实施方式中，通过在包含选自激活素-A、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、和骨形态发生蛋白4(BMP4)的一种或多种中胚层诱导性生长因子的培养基中培养多能干细胞，从多能干细胞衍生中胚层细胞。
在一个实施方式中，该方法还包括将meso-VPC群体解离为单细胞。
在一个实施方式中，中胚层诱导性生长因子包括激活素-A、VEGF165、FGF-2和BMP4。在一个实施方式中，激活素-A以约5-15ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，VEGF165以约5-25ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，FGF-2以约5-25ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，BMP4以约5-50ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，该方法还包括在培养约24小时后从培养基中去除激活素-A。
在一个实施方式中，步骤(a)中的细胞外基质表面是IV型胶原蛋白包被的表面。
在一个实施方式中，多能干细胞培养约3天～约5天。
在一个实施方式中，步骤(a)中的一种或多种因子包括VEGF165、FGF-2和BMP4。
在一个实施方式中，转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂是SB431542。在另一个实施方式中，步骤(b)中的一种或多种因子包括VEGF165、FGF-2、BMP4和SB431542。
在一个实施方式中，步骤(a)中的一种或多种因子还包括毛喉素。
在一个实施方式中，步骤(b)中的一种或多种因子还包括毛喉素。
在一个实施方式中，毛喉素以约2-10μM的浓度使用。
在一个实施方式中，VEGF165以约10-50ng/mL的浓度使用。
在一个实施方式中，FGF-2以约10-50ng/mL的浓度使用。
在一个实施方式中，BMP4以约10-50ng/mL的浓度使用。
在一个实施方式中，SB431542以约5-20μM的浓度使用。
在一个实施方式中，步骤(a)和(b)中的细胞外基质表面是IV型胶原蛋白包被的表面。
在一个实施方式中，步骤(a)中的培养进行约1天。
在一个实施方式中，步骤(a)中的培养进行约4天～约7天。
在一个实施方式中，步骤(a)中的培养在5％CO2和20％O2的常氧条件下进行。
在一个实施方式中，步骤(b)中的培养在5％CO2和5％O2的缺氧条件下进行。
在一个实施方式中，多能干细胞的培养在5％CO2和20％O2的常氧条件下进行。
在一个实施方式中，多能干细胞是人胚胎干细胞。
在一个实施方式中，多能干细胞是人诱导性多能干细胞。
在一个实施方式中，根据本发明的任何方法产生的meso-VPC群体表达选自CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146和PDGFRb的至少一种细胞表面标志物。
在一个实施方式中，根据本发明的任何方法产生的meso-VPC群体表达细胞表面标志物(a)CD146、CD31/PECAM1和CD309/KDR，或(b)CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD146；以及(i)CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD43或PDGFRb的至少一种，(ii)CD34、CD184/CXCR4和PDGFRb；(iii)CD184/CXCR4；(iv)PDGFRb；(v)CD144和CD184/CXCR4；(vi)CD184/CXCR4和CD43；或(vii)CC184/CXCFR4。
在一个实施方式中，根据本发明的任何方法产生的meso-VPC群体表现出有限的或检测不到的(a)选自CXCR7、CD45和NG2的一种或多种细胞表面标志物；(b)CXCR7、CD45和NG2；或(c)选自CD144、CD34、CD184/CXCR4、CXCR7、CD43、CD45、PDGFRb和NG2的一种或多种细胞表面标志物。
在一个实施方式中，根据本发明的任何方法产生的meso-VPC群体表达选自hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p和miR-199a-3p的至少一种miRNA标志物。
在一个实施方式中，根据本发明的任何方法产生的meso-VPC群体表现出有限的或不表达选自hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p的至少一种miRNA标志物。
在一个实施方式中，根据本发明的任何方法产生的meso-VPC群体表达hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p和hsa-miR-542-5p。
在一个实施方式中，根据本发明的任何方法产生的meso-VPC群体包含至少一种meso-VPC，其对选自mir126、mir125a-5p、mir24和mir483-5p的至少一种miRNA标志物呈阳性。在一个实施方式中，miRNA标志物是mir483-5p。
在一个实施方式中，根据本发明的任何方法产生的meso-VPC群体包含至少一种meso-VPC，其表现出有限的或不表达选自mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p和mir133a的至少一种miRNA标志物。
在一个实施方式中，本发明的方法还包括通过meso-VPC的分化产生血管内皮细胞。
在一个实施方式中，分化在纤连蛋白包被的表面上进行。
在一个方面，本发明提供包含通过本发明的任一种方法产生的meso-VPC群体的组合物。
在一个方面，本发明提供包含通过从多能干细胞衍生的中胚层细胞的体外分化产生的中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)群体的组合物，其中，meso-VPC群体表达选自CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146和PDGFRb的至少一种细胞表面标志物。
在一个实施方式中，包含meso-VPC群体的组合物表达选自CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146和PDGFRb的至少两种细胞表面标志物。
在一个实施方式中，包含meso-VPC群体的组合物表达细胞表面标志物CD146、CD31/PECAM1和CD309/KDR。
在一个实施方式中，包含meso-VPC群体的组合物表达细胞表面标志物CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD146，以及(i)CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD43或PDGFRb的至少一种，(ii)CD34、CD184/CXCR4和PDGFRb；(iii)CD184/CXCR4；(iv)PDGFRb；(v)CD144和CD184/CXCR4；(vi)CD184/CXCR4和CD43；或(vii)CC184/CXCFR4。
在一个实施方式中，包含meso-VPC群体的组合物表现出有限的或检测不到的(a)选自CXCR7、CD45和NG2的一种或多种细胞表面标志物；(b)CXCR7、CD45和NG2；或(c)选自CD144、CD34、CD184/CXCR4、CXCR7、CD43、CD45、PDGFRb和NG2的一种或多种细胞表面标志物。
在一个实施方式中，包含meso-VPC群体的组合物表达选自hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p和miR-199a-3p的至少一种miRNA标志物。
在一个实施方式中，包含meso-VPC群体的组合物表现出有限的或不表达选自hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p的至少一种miRNA标志物。
在一个实施方式中，包含meso-VPC群体的组合物表达hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p和hsa-miR-542-5p。
在一个实施方式中，meso-VPC群体包含meso-VPC的类血管。
在一个实施方式中，meso-VPC群体包含meso-VPC的单细胞。
在一个实施方式中，本发明提供通过从多能干细胞衍生的中胚层细胞的体外分化产生的meso-VPC，其中，meso-VPC对选自mir126、mir125a-5p、mir24和mir483-5p的至少一种miRNA标志物呈阳性。
在一个实施方式中，meso-VPC对miRNA标志物mir483-5p呈阳性。
在一个实施方式中，meso-VPC对选自mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p和mir133a的至少一种miRNA标志物呈阴性。
在一个实施方式中，多能干细胞是人多能干细胞。
在一个实施方式中，多能干细胞是人胚胎干细胞(hESC)。
在一个实施方式中，多能干细胞是人诱导性多能干细胞(hiPSC)。
在一个实施方式中，多能干细胞首先分化为中胚层细胞，而中胚层细胞又分化为meso-VPC。
在一个方面，本发明提供包含组合物的药物组合物，所述组合物包含本发明的meso-VPC群体或本发明的任一种meso-VPC。
在一个方面，本发明提供治疗对象中的血管疾病或病症的方法，该方法包括给予对象有效量的本发明的包含meso-VPC群体的任一种组合物、或本发明的中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)、或本发明的任一种药物组合物，以治疗对象中的血管疾病或病症。
在一个实施方式中，血管疾病或病症选自动脉粥样硬化、外周动脉疾病(PAD)、颈动脉疾病、静脉疾病、血栓、主动脉瘤、纤维肌性发育不良、淋巴水肿和血管损伤。
在一个实施方式中，外周动脉疾病选自严重肢体缺血、肠缺血综合征、肾动脉疾病、腘动脉陷迫综合征、雷诺现象、柏格氏病。
在一个实施方式中，外周动脉疾病是严重肢体缺血。
在一个实施方式中，包含meso-VPC群体的组合物、meso-VPC、或药物组合物肌肉内或全身给药。
在一个实施方式中，包含meso-VPC群体的组合物、meso-VPC、或药物组合物的给药增加对象中的血流。
在一个实施方式中，包含meso-VPC群体的组合物、meso-VPC、或药物组合物的给药促进对象中的血管生成和/或血管发生。
在一个实施方式中，包含meso-VPC群体的组合物、meso-VPC、或药物组合物的给药减轻对象中的缺血严重程度。
在一个实施方式中，包含meso-VPC群体的组合物、meso-VPC、或药物组合物的给药减小对象中的肢体坏死面积。
在一个实施方式中，给予对象约1x104～约1x1013的meso-VPC。
在一个实施方式中，meso-VPC在药物组合物中给药。
在一个实施方式中，药物组合物包含：(a)缓冲液，将溶液维持在生理pH；(b)至少5％(w/v)的葡萄糖；以及(c)渗透活性剂，将溶液维持在生理渗透压。
在一个实施方式中，葡萄糖是D-葡萄糖(右旋糖)。
在一个实施方式中，渗透活性剂是盐。
在一些实施方式中，盐是氯化钠。
附图说明
图1是人多能干细胞体外分化为中胚层细胞的过程的示意图。
图2A是显示从人诱导性多能干细胞系GMP1分化出的中胚层细胞上的细胞表面标志物KDR、CD56/NCAM1、APLNR/APJ、GARP或CD13的表达的图，证实了向中胚层系的分化。
图2B是显示从人诱导性多能干细胞系GMP1分化出的中胚层细胞上有限的或不表达多能、内胚层、外胚层和血液-血管细胞表面标志物的图，证实了向中胚层系的分化。
图3是人多能干细胞体外分化为中胚层细胞的过程的示意图(左)，以及使用Meso-3D-Vasculonoid VPC1方案(右上)或Meso-3D-Vasculonoid VPC2方案(右下)将中胚层细胞体外分化为中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)的示意图。
图4是人多能干细胞体外分化为中胚层细胞的过程的示意图(左)，以及使用Meso-2D VPC2方案(右上)或Meso-2D VPC3方案(右下)将中胚层细胞体外分化为中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)的示意图。
图5是显示由Meso-3D-Vasculonoid方案产生的meso-VPC进一步分化为内皮系的能力的显微镜图像组。上图显示收获前第5天的meso-VPC的形态。中图显示使用纤连蛋白包被的板和促进内皮分化的培养基进行的meso-VPC的内皮分化。下图显示由meso-VPC形成的毛细管状Matrigel网络。
图6A是显示使用Meso-3D-Vasculonoid-VPC1、Meso-3D-Vasculonoid-VPC2、Meso-2D-VPC2、或Meso-2D-VPC3方案产生的meso-VPC上的细胞表面标志物CD31/PECAM1、CD309/KDR、CXCR4/CD184、CD43、CD146,和PDGFRb的表达的图。
图6B是显示meso-VPC和比较用的血源性内皮细胞(HE)或成血管细胞(HB)对选定的细胞表面标志物呈阳性的比例的热图。还显示了与未分化的多能干细胞(J1和GMP1)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞的比较。
图6C是主成分分析(PCA)图，显示由Meso-3D-Vasculonoid方案或Meso-2D方案产生的meso-VPC、比较用的血源性内皮细胞(HE)、比较用的成血管细胞(HB)、未分化的多能干细胞(J1和GMP1)或人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的血管细胞表面标志物表达概况。
图7是显示由Meso-2D方案产生的meso-VPC进一步分化为内皮系的能力的显微镜图像组。上图显示收获前第7天的meso-VPC的形态。中图显示使用纤连蛋白包被的板和促进内皮分化的培养基进行的meso-VPC的内皮分化。下图显示由meso-VPC形成的毛细管状Matrigel网络。
图8是显示用实施例9所述的meso-VPC治疗的动物中的血流增加的图。具体而言，动物经过假手术(1M)，或者用载剂对照(2M)、J1-HDF Meso-2D VPC2(3M)、J-HDF Meso-3DVasculonoid VPC2(4M)、GMP1HDF Meso-2D VPC2(5M)、GMP1-HDF Meso-3D VasculonoidVPC2(6M)或GMP1-HDF Meso-3D Vasculonoid VPC1(7M)治疗。
图9是显示用实施例9所述的meso-VPC治疗的动物中的血管密度变化的图。具体而言，动物用载剂对照(2M)、J1-HDF Meso-2D VPC2(3M TI1)、J-HDF Meso-3D VasculonoidVPC2(4M TI2)、GMP1HDF Meso-2D VPC2(5M TI3)、GMP1-HDF Meso-3D Vasculonoid VPC2(6M TI4)或GMP1-HDF Meso-3D Vasculonoid VPC1(7M TI5)治疗。
图10是显示用meso-VPC治疗的动物中的CD34+染色(其是小毛细血管形成的指示)、总血管数、以及血流测试的综合定量结果的图。具体而言，动物经过假手术(1M)，或者用载剂对照(2M)、J1-HDF Meso-2D VPC2(3M TI1)、J-HDF Meso-3D Vasculonoid VPC2(4MTI2)、GMP1HDF Meso-2D VPC2(5M TI3)、GMP1-HDF Meso-3D Vasculonoid VPC2(6M TI4)或GMP1-HDF Meso-3D Vasculonoid VPC1(7M TI5)治疗。
图11显示用meso-VPC治疗的每组动物的用激光多普勒仪测量的血流和平均毛细血管密度之间的强烈和统计学上显著的相关性。
图12A提供的图表显示与J1细胞群体和J1衍生的HE细胞群体相比、在三个重复的J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞群体中发现的独特人miRNA，包括hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p和hsa-miR-542-5p。图12A还显示在J1衍生的HE细胞群体中发现的独特人miRNA，包括hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p。“有表达”是指所有3个重复中的标准化表达>0。
图12B是显示先前在单细胞上分析的J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞群体中miRNAs的表达水平的图，并且显示hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p和hsa-miR-24-3p在J1细胞群体和J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞群体中都有表达。
图12C是显示J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞群体表达hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p和hsa-miR-142-3p，而不表达或低表达hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p和hsa-miR-133a-5p的图。
图12D是显示J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞群体表达hsa-miR-483-5p和hsa-miR-483-3p的图。
图13是显示在单细胞RNA-seq分析中，与单个J1或HUVEC细胞相比，J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞样品中最上调或最下调的基因表达的图。
图14A是低倍率(10倍物镜)下的图像，其通过14天后的DAPI和UAE1染色，显示从J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2类血管的嵌入聚合体延伸出广泛的血管网络。
图14B是显示如下结果的图：当J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2类血管(“复数”)或解离为单细胞的J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞(“单细胞”)在解冻后在体外的常氧(20％O2)(左图)或缺氧(5％O2)(右图)的CLI模拟条件下进行培养时，与作为单细胞冷冻保存的J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞相比，类血管显示出更好的细胞存活率。
图14C是显示如下结果的图：在整个研究过程中，与载剂治疗组(仅GS2培养基)相比，给予J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2单细胞(“sc”)或类血管后，血流有统计学上显著的改善；双向方差分析，然后进行Tukey检验。
图15A是显示在第21天，与HE和HB细胞相比，用meso-3D vasculonoid VPC2细胞治疗的动物有更好的平均坏死(左图)和功能评分(右图)。单向方差分析，然后进行Dunnett检验。平均值+/-sem。
图15B是显示在第63天，与载剂相比，用meso-3D vasculonoid VPC2细胞、HE和HB细胞治疗的动物中的血流改善的图。*相对于载剂p<0.05。平均值+/-s.d.。双向方差分析，然后进行Tukey检验。
图15C是显示用Meso-3D vasculonoid VPC2细胞、HE和HB细胞治疗的动物的股四头肌中CD34+血管生长的图。*相对于载剂p<0.05。平均值+/-s.d.。双向方差分析，然后进行未校正Fisher’s LSD检验。
图15D是显示在给予Meso-3D vasculonoid VPC2细胞、HE或HB细胞后腓肠肌的改善的图表。*相对于载剂p<0.05。平均值+/-s.d.。双向方差分析，然后进行未校正Fisher’sLSD检验。
图16A是通过Ku80+染色来显示治疗后第63天和第180天的植入的供体GMP1-Meso3D vasculonoid VPC2细胞的图，表明细胞的长期植入。
图16B是通过Ku80+染色来显示到第35天和第63天时，meso-3D vasculonoid VPC2细胞显示出植入的图。
图16C是在Balb/c裸鼠中的HLI手术后63天，注射的Meso3D vasculonoid VPC2表现出长期植入(Ku80+)，形成人脉管系统(UEA1+血管)，并促进旁分泌宿主血管生长(IB4+和SMA+血管)的荧光图像。
具体实施方式
I.定义
为了可以更好地理解本发明，首先定义某些术语。还应注意，每当提到一个参数的数值或数值范围时，其都将介于所提到的数值之间的数值和范围也作为本发明的一部分。
在以下描述中，出于解释的目的，为了提供对本发明的透彻理解，陈述了许多具体的数字、材料和配置。但是，对本领域技术人员显而易见的是，本发明可以在没有这些具体细节的情况下实施。在一些情况下，众所周知的特征可以被省略或简化，以避免模糊本发明。此外，说明书中提及的短语如“一个实施方式”或“一种实施方式”是指关于该实施方式中描述的具体特征、结构或性质包括在本发明的至少一个实施方式中。在说明书中不同地方出现的短语如“在一个实施方式中”不一定需要涉及所有相同的实施方式。
如本文所用，冠词“一个”和“一种”是指一种或一种以上的(即至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”是指一个元素或多于一个元素。
术语“包括”或“包含”在本文中用于指代在本公开中必不可少的组合物、方法及其各自的成分，但也可以包括未指明的元素，无论是否是必需的。
如本文所用，“多能细胞”、“多能干细胞”和“PSC”泛指能够在体外延长增殖或几乎无限增殖，同时维持其未分化状态，表现出稳定(最好是正常)的核型，并且有能力在适当条件下分化为所有三个生殖层(即外胚层、中胚层和内胚层)的细胞。典型的多能细胞(a)在移植到免疫缺陷(SCID)小鼠中时能够诱发畸胎瘤；(b)能够分化为所有三个生殖层(如外胚层、中胚层和内胚层细胞类型)的细胞类型；以及(c)表达至少一种hES细胞标志物(如Oct-4、碱性磷酸酶、SSEA 3表面抗原、SSEA 4表面抗原、NANOG、TRA 1 60、TRA 1 81、SOX2和REX1)。示例性的多能细胞可以表达Oct-4、碱性磷酸酶、SSEA 3表面抗原、SSEA 4表面抗原、TRA 1 60和/或TRA 1 81。其他示例性的多能细胞包括但不限于：胚胎干细胞、诱导性多能细胞(iPS)、胚胎衍生的细胞、由胚胎生殖(EG)细胞产生的多能细胞(例如通过在FGF-2、LIF和SCF的存在下培养)、孤雌生殖ES细胞、由培养的内细胞团细胞(ICM)产生的ES细胞、由卵裂球产生的ES细胞，以及通过核移植(例如将体细胞核转移到受体卵细胞中)产生的ES细胞。可以在不破坏胚胎的情况下产生示例性的多能细胞。例如，诱导性多能细胞可由不破坏胚胎获得的细胞产生。作为又一个例子，多能细胞可以由活检的卵裂球产生(这可以在不伤害剩余胚胎的情况下完成)；可选地，剩余胚胎可以被低温保存、培养和/或植入合适的宿主。多能细胞(无论来自何种来源)都可以进行遗传修饰或其他方式的修饰。
如本文所用，“胚胎”或“胚”泛指尚未植入母体宿主子宫膜的发育中的细胞团。“胚胎细胞”是从胚胎中分离出来的或包含在胚胎中的细胞。这也包括早在两细胞阶段就获得的卵裂球，以及聚集的卵裂球。
"胚胎干细胞"(ES细胞或ESC)包括由胚胎细胞(如由培养的内细胞团细胞或培养的卵裂球)产生的多能细胞。通常这样的细胞是或已经作为细胞系进行了连续传代。胚胎干细胞可作为多能干细胞用于本文所述的产生中胚层细胞和meso-VPC的方法。例如，ES细胞可以通过本领域已知的方法产生，包括从通过任何方法(包括通过有性或无性方式)产生的胚胎衍生，如卵细胞与精子或精子DNA受精、核移植(包括体细胞核移植)或孤雌生殖。作为又一个例子，胚胎干细胞还包括通过体细胞核移植产生的细胞，即使在这个过程中使用了非胚胎细胞。例如，ES细胞可以衍生自囊胚阶段胚胎的ICM，以及衍生自一个或多个卵裂球的胚胎干细胞。这种胚胎干细胞可以从受精产生的胚胎材料中产生，或者也可以通过无性的方式产生，包括体细胞核移植(SCNT)、孤雌生殖和孤雄生殖。如上文中进一步讨论的，ES细胞可以进行遗传修饰或其他方式的修饰。
可以通过例如遗传操作、筛选自发的杂合性丧失等方式，生成具有一个或多个HLA基因的纯合性或杂合性的ES细胞。胚胎干细胞，无论其来源或用于产生它们的特定方法，通常都具有以下一个或多个特性：(i)分化为所有三个生殖层的细胞的能力，(ii)至少表达Oct-4和碱性磷酸酶，以及(iii)移植到免疫力低下的动物中时产生畸胎瘤的能力。可用于本发明实施方式的胚胎干细胞包括但不限于人ES细胞(“hESC”或“hES细胞”)，如CT2、MA01、MA09、ACT-4、No.3、J1、H1、H7、H9、H14和ACT30胚胎干细胞。其他示例性的细胞系包括NED1、NED2、NED3、NED4、NED5和NED7。另见NIH人胚胎干细胞登记处。可以使用的一个示例性的人胚胎干细胞系是J1细胞。
示例性的人胚胎干细胞(hESC)标志物包括但不限于：碱性磷酸酶、Oct-4、Nanog、阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、Sox2、生长分化因子3(GDF3)、减弱表达1(REX1)、成纤维细胞生长因子4(FGF4)、胚胎细胞特异性基因1(ESG1)、发育多能性相关因子2(DPPA2)、DPPA4、端粒酶逆转录酶(hTERT)、SALL4、E-CADHERIN、簇编号30(CD30)、Cripto(TDGF-1)、GCTM-2、Genesis、生殖细胞核因子和干细胞因子(SCF或c-Kit配基)。此外，胚胎干细胞可以表达Oct-4、碱性磷酸酶、SSEA 3表面抗原、SSEA 4表面抗原、TRA 1 60和/或TRA 1 81。
ESC最初可以在有或没有饲养细胞的情况下在本领域已知的能维持ESC多能性的任何培养基中培养，所述饲养细胞例如有小鼠胚胎饲养细胞(MEF)细胞或人饲养细胞，如人真皮成纤维细胞(HDF)。MEF细胞或人饲养细胞可以被有丝分裂失活，例如在接种ESC进行共培养之前通过暴露于丝裂霉素C、伽马射线或任何其他已知的方法，由此MEF不会在培养中繁殖。此外，可以通过显微镜检查ESC细胞培养物，并且例如使用干细胞切割工具、通过激光烧蚀或其他方式挑选和丢弃含有非ESC细胞形态的集落。通常，在收获ESC进行用于拟胚体形成的接种后的时间点，不再使用额外的MEF细胞或人饲养细胞。
或者，hES细胞可以通过本领域已知的任何方法(例如Klimanskaya等人，柳叶刀(Lancet)365:1636-1641(2005))，在无饲养细胞的条件下，在固体表面如细胞外基质(例如
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层粘连蛋白或iMatrix-511或本文公开的或本领域已知的任何其他细胞外基质)上进行培养。因此，本文所述方法中使用的hES细胞可以在无饲养细胞的培养物上进行培养。
如本文所用，“胚胎衍生的细胞”(EDC)泛指多能的桑椹胚衍生的细胞、囊胚衍生的细胞(包括内细胞团、胚盾或上胚层的细胞)、或早期胚胎(包括原始内胚层、外胚层和中胚层及其衍生物)的其他多能干细胞。“EDC”还包括卵裂球和来自聚集的单个卵裂球或不同发育阶段的胚胎的细胞团，但不包括已作为细胞系传代的人胚胎干细胞。
如本文所用，“诱导性多能干细胞”或“iPSC”或“iPS细胞”是指通过重编程体细胞而生成的多能干细胞。iPSC可以通过表达或诱导表达多种因子的组合(“重编程因子”)而生成。iPS细胞可以使用胎儿、产后、新生儿、少年或成年体细胞来生成。iPS细胞可以从细胞库获得。或者，在开始分化为血管祖细胞(VPC)或其他细胞类型之前，iPS细胞可以是(通过本领域已知的方法)新生成的。制作iPS细胞可能是产生分化细胞的最初步骤。iPS细胞可以使用来自特定患者或匹配供体的材料专门生成，目的是生成组织匹配的VPC。iPS细胞可以由在预期接受者中没有实质免疫原性的细胞产生，例如由自体细胞或与预期接受者组织相容的细胞产生。如上文中进一步讨论的(见“多能细胞”)，包括iPS细胞在内的多能细胞可以进行遗传修饰或其他方式的修饰。可以使用的一种示例性人iPSC细胞系是GMP1细胞。
作为又一个例子，诱导性多能干细胞可以通过使体细胞或其他细胞与一种或多种重编程因子接触而将该细胞重编程来产生。例如，重编程因子可以由细胞表达，例如由添加到细胞的外源核酸表达，或响应于小分子、microRNA等促进或诱导内源基因表达的因素由该基因表达(见Suh和Blelloch，Development 138，1653-1661(2011)；Miyoshi等人，CellStem Cell(2011)，doi:10.1016/j.stem.2011.05.001；Sancho-Martinez等人，Journal ofMolecular Cell Biology(2011)1–3；Anokye-Danso等人，Cell Stem Cell 8，376–388，2011年4月8日；Orkin和Hochedlinger，Cell 145，835-850，2011年6月10日；或Warren等人，Scientific Reports，10.1038/srep00657，2012年9月14日；各文献均通过引用其全文纳入本文)。重编程因子可以由外源提供，例如通过添加到培养基中，并且可以通过本领域已知的方法引入细胞，例如通过与细胞进入肽、蛋白质或核酸转染剂偶联，脂质转染、电穿孔、生物射弹颗粒递送系统(基因枪)、显微注射等。在某些实施方式中，可用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括例如Oct4(有时称为Oct3/4)、Sox2、c-Myc和KLF4的组合。在另一些实施方式中，可用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括例如Oct-4、Sox2、Nanog和Lin28的组合。在另一些实施方式中，体细胞通过表达至少2个重编程因子、至少3个重编程因子或4个重编程因子而被重编程。在另一个实施方式中，体细胞通过表达Oct4、Sox2、MYC、KLF4、Nanog和Lin28而被重编程。在另一些实施方式中，鉴定其他重编程因子，并将其单独或与一种或多种已知的重编程因子组合使用，以将体细胞重编程为多能干细胞。iPS细胞通常可以通过表达与胚胎干细胞相同的标志物来鉴定，尽管一个特定的iPS细胞系可能在其表达谱上有所不同。
诱导性多能干细胞可以通过在体细胞中表达或诱导表达一种或多种重编程因子而产生。在一个实施方式中，体细胞是成纤维细胞，例如真皮成纤维细胞、滑膜成纤维细胞或肺成纤维细胞，或非成纤维的体细胞。在一个实施方式中，体细胞通过表达上述的至少1、2、3、4、5个重编程因子而被重编程。在另一个实施方式中，可以通过使体细胞与至少一种诱导重编程因子表达的药剂、如小有机分子药剂接触，来诱导重编程因子的表达。
体细胞也可以使用组合方法进行重编程，其中表达重编程因子(例如使用病毒载体、质粒等)，并诱导重编程因子的表达(例如使用小有机分子)。例如，可以通过用病毒载体、如逆转录病毒载体或慢病毒载体进行感染，在体细胞中表达重编程因子。也可以使用非整合型载体、如附加型质粒或mRNA，在体细胞中表达重编程因子。见例如Yu等人，Science.2009年5月8日；324(5928):797-801，该文献通过引用其全文纳入本文。当使用非整合型载体表达重编程因子时，可使用电穿孔、转染或用载体转化体细胞的方式在细胞中表达这些因子。
一旦重编程因子在细胞中表达，即可通过本领域已知的任何方法对该细胞进行培养。随着时间的推移，培养皿中出现了具有ES特征的细胞。该细胞可以根据例如ES的形态，或根据可选择或可检测的标志物的表达来选择和传代培养。可以培养该细胞以产生类似于ES细胞的细胞培养物——这些是推定的iPS细胞。iPS细胞通常可以通过表达与其他胚胎干细胞相同的标志物来鉴定，尽管一个特定的iPS细胞系可能在其表达谱上有所不同。示例性的iPS细胞可以表达Oct-4、碱性磷酸酶、SSEA 3表面抗原、SSEA 4表面抗原、TRA 1 60和/或TRA 1 81。
为了确认iPS细胞的多能性，可以用一种或多种多能性试验对细胞进行测试。例如，可以测试细胞的ES细胞标志物的表达；可以评价细胞移植到SCID小鼠中时产生畸胎瘤的能力；可以评价细胞分化产生所有三个生殖层的细胞类型的能力。一旦获得多能iPS细胞，就可以用它来产生中胚层细胞和血管祖细胞，例如中胚层衍生的血管祖细胞。
如本文所用，“中胚层”是指所有两侧对称动物的非常早期胚胎中的三个主要胚层之一。中胚层形成间充质、间皮、非上皮血细胞和体腔细胞。早期中胚层通过上皮间充质转化而定型，随后随着原肠胚形成的进行，特定的中胚层系细胞向内迁移。中胚层系的细胞注定要形成血管和淋巴系统，包括成血管细胞和能够分化为多种特定细胞类型的多能中胚层干细胞。中胚层通过形成胚外中胚层、然后是胚胎脏壁中胚层而引起血管发生。血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PIGF或PGF)等生长因子刺激新血管的生长和发育。在一个实施方式中，中胚层系的细胞注定要成为血管前体细胞或血管祖细胞。在一个实施方式中，多能干细胞如hESC或iPSC，例如hiPSC可以分化为中胚层系细胞，如中胚层前体细胞。因此，术语“中胚层”也包括多能干细胞衍生的中胚层系细胞，而不考虑细胞的成熟度，因此该术语涵盖各种成熟度水平的中胚层细胞，包括中胚层前体细胞。
示例性的中胚层标志物包括但不限于：CD309/KDR、CD56/NCAM1、APLNR/APJ、GARP、CD13、N-钙粘蛋白、活化素A、活化素AB、活化素AC、活化素B、活化素C、BMP及其他活化素受体激活剂、BMP及其他活化素受体抑制剂、BMP-2、BMP-2/BMP-4、BMP-2/BMP-6异源二聚体、BMP-2/BMP-7异源二聚体、BMP-2a、BMP-4、BMP-6、BMP-7、Cryptic、FABP4/A-FABP、FGF-5、GDF-1、GDF-3、INHBA、INHBB、节点(Nodal)、TGF-β、TGF-β1、TGF-β1、2、3、TGF-β1.2、TGF-β1/1.2、TGF-β2、TGF-β2/1.2、TGF-β3、TGF-β受体抑制剂、Wnt-3a、Wnt-8a、MESDC2、Nicalin、Brachyury、EOMES、FoxC1、FoxF1、Goosecoid、HAND1、MIXL1、Slug、Snail、TBX6、Twist-1、和Twist-2。在一个实施方式中，中胚层细胞是中胚层前体细胞，其对选自CD309/KDR、CD56/NCAM1、APLNR/APJ、GARP和CD13的一个或多个标志物呈阳性。
如本文所用，“血管发生”是指新血管的形成。血管发生包括衍生自中胚层的内皮的形成。如本文所用，“血管生成”是指从先前已存在的血管形成血管。见例如Gilbert,Scott F.的《发育生物学》(Developmental Biology)，马萨诸塞州桑德兰：西瑙尔协会(Sinauer Associates,Inc.)；c2000，以及《细胞的分子生物学》(Molecular Biology ofthe Cell)，第4版，Alberts，Bruce；Johnson，Alexander；Lewis，Julian；Raff，Martin；Roberts，Keith；Walter，Peter纽约和伦敦：加兰科学；c2002。
如本文所用，“血管祖细胞”(VPC)是指有能力分化为内皮细胞、平滑肌细胞和周细胞及其他血液-血管细胞系的细胞。在一个实施方式中，血管祖细胞是中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)。
如本文所用，“中胚层衍生的血管祖细胞”(meso-VPC)是指通过多能干细胞(如ESC或iPSC)的体外分化由中胚层细胞生成的VPC。Meso-VPC可以通过一种或多种细胞表面标志物的表达来鉴定，如本文进一步描述。在一个实施方式中，中胚层衍生的血管祖细胞是通过多能干细胞(如ESC或iPSC)体外分化为中胚层细胞而生成的，而中胚层细胞又分化为meso-VPC。
Meso-VPC可以在体外从小鼠PSC和人PSC衍生。Meso-VPC能够分化为造血细胞系和内皮细胞系，并且可能也能够成为平滑肌细胞。本发明的meso-VPC群体可以对至少一种标志物如CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146和PDGFRb呈阳性。在一个实施方式中，meso-VPC群体对上文中指出的标志物中的1、2、3、4、5、6、7或8种呈阳性。在一个实施方式中，meso-VPC群体对CD146、CD31/PECAM1和CD309/KDR呈阳性。在另一个实施方式中，meso-VPC群体表达CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD146，以及(i)CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD43或PDGFRb的至少一种、(ii)CD34、CD184/CXCR4和PDGFRb；(iii)CD184/CXCR4；(iv)PDGFRb；(v)CD144和CD184/CXCR4；(vi)CD184/CXCR4和CD43；或(vii)CC184/CXCFR4。在一个实施方式中，meso-VPC群体表达选自下组的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种或至少15种miRNA标志物：hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p、和miR-199a-3p。在一个实施方式中，meso-VPC群体表达hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p和hsa-miR-542-5p。在一个实施方式中，如果组合物中有至少约20％的meso-VPC表达某种标志物，则认为meso-VPC群体表达该标志物。在一个实施方式中，本发明的meso-VPC对选自mir126、mir125a-5p、mir24和mir483-5p的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种miRNA标志物呈阳性。在一个实施方式中，miRNA标志物是mir483-5p。在一个实施方式中，meso-VPC群体包含对选自mir126、mir125a-5p、mir24和mir483-5p的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种miRNA标志物呈阳性的至少一种meso-VPC。在一个实施方式中，miRNA标志物是mir483-5p。在一个实施方式中，meso-VPC群体表达CD31和KDR的水平高于HE细胞群体。在另一个实施方式中，meso-VPC群体表达CD146的水平低于HE细胞群体。在又一个实施方式中，meso-VPC群体表达CD184/CXCR4的水平低于HE细胞群体。
在任一实施方式中，meso-VPC群体表现出有限的或检测不到的CXCR7、CD45和NG2中的一种、两种或三种。在任一实施方式中，meso-VPC群体表现出有限的或检测不到的所有CXCR7、CD45和NG2。在任一实施方式中，meso-VPC群体表现出有限的或检测不到的CD144、CD34、CD184/CXCR4、CXCR7、CD43、CD45、PDGFRb或NG2中的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8种。在一个实施方式中，meso-VPC群体表现出有限的或不表达选自hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或至少7种miRNA标志物。在一个实施方式中，如果组合物中有少于约20％的meso-VPC表达某种标志物，则认为meso-VPC群体表现出有限的或不表达该标志物。在一个实施方式中，本发明的meso-VPC群体表现出有限的或不表达选自mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p和mir133a的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种或至少9种miRNA标志物。在本发明的一个实施方式中，meso-VPC群体包含至少一种meso-VPC，其表现出有限的或不表达选自mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p和mir133a的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种或至少9种miRNA标志物。
如本文所用，“类血管”是指在例如细胞培养过程中形成的细胞(如中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC))的集落状聚集体。在一个实施方式中，类血管由用3D-Vasculonoid分化平台产生的meso-VPC形成。
如本文所用，“疗法”、“治疗性”、“治疗”或“处理”泛指治疗疾病、阻止或减少疾病或其临床症状的发展、和/或缓解疾病，导致疾病或其临床症状的消退。“疗法”、“治疗性”、“治疗”或“处理”涵盖预防、防止、治疗、治愈、补救、减少、减轻和/或缓解疾病、疾病的指征和/或症状。“疗法”、“治疗性”、“治疗”或“处理”涵盖减轻持续存在的疾病指征和/或症状的患者的指征和/或症状。“疗法”、“治疗性”、“治疗”或“处理”也涵盖“预防”和“防止”。预防包括防止患者在治疗疾病后发生疾病，或降低患者疾病的发生率或严重程度。用于“疗法”、“治疗性”、“治疗”或“处理”目的的术语“减少”泛指在临床上明显减少指征和/或症状。“疗法”、“治疗性”、“治疗”或“处理”包括治疗复发或反复出现的指征和/或症状。“疗法”、“治疗性”、“治疗”或“处理”涵盖但不限于随时排除指征和/或症状的出现，以及减少现有指征和/或症状和消除现有指征和/或症状。“疗法”、“治疗性”、“治疗”或“处理”包括治疗慢性疾病(“维持”)和急性疾病。例如，治疗包括治疗或预防复发或反复出现的指征和/或症状。在一个实施方式中，治疗包括在临床上明显减少血管疾病如严重肢体缺血的指征和/或症状。
如本文所用“使病理正常化”是指将由疾病导致的异常结构和/或功能恢复到更加正常的状态。正常化意味着通过纠正由疾病导致的组织、器官或细胞类型的结构和/或功能的异常，可以控制和改善病理的发展。例如，在用本发明的meso-VPC治疗后，由血管疾病(如严重肢体缺血)造成的肢体的异常情况可以得到改善、纠正和/或逆转。
如本文所用，“血管疾病”是指血管(动脉和静脉)的任何异常状况。心脏以外的血管疾病可以在任何地方出现。最常见的血管疾病是中风、外周动脉疾病(PAD)、腹主动脉瘤(AAA)、颈动脉疾病(CAD)、动静脉畸形(AVM)、严重肢体缺血(CLI)、肺栓塞(血凝块)、深静脉血栓(DVT)、慢性静脉功能不全(CVI)和静脉曲张。在一个实施方式中，血管疾病是外周动脉疾病(PAD)。在一个实施方式中，血管疾病是缺血疾病，例如严重肢体缺血(CLI)。在一个实施方式中，血管疾病是动脉粥样硬化、外周动脉疾病(PAD)、颈动脉疾病、静脉疾病、血栓、主动脉瘤、纤维肌性发育不良、淋巴水肿或血管损伤。在一个实施方式中，血管疾病是外周动脉疾病，例如严重肢体缺血(CLI)、肠缺血综合征、肾动脉疾病、腘动脉陷迫综合征、雷诺现象或柏格氏病。
II.中胚层衍生的血管祖细胞(Meso-VPC)的体外生成
本发明提供由从多能干细胞衍生的中胚层细胞生产中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)的方法。该方法包括以下步骤：在含有一种或多种中胚层诱导性生长因子的培养基中培养多能干细胞，以产生中胚层细胞；以及在含有一种或多种引导中胚层细胞分化为中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)的培养基中，在合适的表面上培养中胚层细胞。在一个实施方式中，该方法还包括将多个meso-VPC解离为单细胞。
本发明中使用的多能干细胞可以通过上文中介绍的任何方法获得和培养。在一个实施方式中，多能干细胞(如人胚胎干细胞(hESC)或人诱导性多能干细胞(hiPSC))在无饲养细胞(FF)的条件下培养，并铺在细胞外基质上。在一个实施方式中，多能干细胞在有饲养细胞的培养条件下培养，并铺在细胞外基质上。
在一些实施方式中，细胞外基质选自下组：层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、胶原蛋白、I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸肝素、来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的可溶性制剂、
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(康宁)、明胶和人基底膜提取物。在一个实施方式中，细胞外基质可以来源于任何哺乳动物来源，包括人。在一个实施方式中，用于培养多能干细胞的细胞外基质表面是Matrigel包被的表面。
在一些实施方式中，多能干细胞在适合支持多能性的培养基中培养，任何这样的培养基都是本领域已知的。在一个实施方式中，支持多能性的培养基是NutristemTM。在一个实施方式中，支持多能性的培养基是TeSRTM。在一个实施方式中，支持多能性的培养基是StemFitTM。在一个实施方式中，支持多能性的培养基是KnockoutTMDMEM(Gibco)，其中可以补充KnockoutTM血清替代物(Gibco)、LIF、bFGF或任何其他因子。这些示例性培养基中的每一种都是本领域已知的，并且可商购。在其他实施方式中，支持多能性的培养基中可以补充bFGF或任何其他因子。在一个实施方式中，可以以低浓度(例如4ng/mL)补充bFGF。在另一个实施方式中，可以以高浓度(例如100ng/mL)补充bFGF。在一个实施方式中，培养基是无血清的。在另一个实施方式中，培养基包含血清。
多能干细胞可以在本领域已知的任何合适的容器中进行培养、传代或收获。示例性的组织培养容器包括15cm组织培养板、10cm组织培养板、3cm组织培养板、6孔组织培养板、12孔组织培养板、24孔组织培养板、48孔组织培养板、96孔组织培养板、T-25组织培养瓶、T-75组织培养瓶。在一个实施方式中，多能干细胞在6孔组织培养板中培养。
在一些实施方式中，培养约1、2、3、4、5或6天后进行培养基更换，以维持多能干细胞的最佳状态。对于培养基更换，可以使用与起始条件相同的培养基，也可以根据培养需要调整培养基。在一些实施方式中，多能干细胞在约1、2、3、4、5、6、7、8或9天后，或在细胞培养物达到约60-90％融合度时被分割并传代。对于细胞传代，可以使用与起始条件相同的培养基，也可以根据培养需要调整培养基。细胞可以以1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20的稀释比例分割和传代。在一个实施方式中，多能干细胞以1:3的稀释比例传代。
在一些实施方式中，多能干细胞可以在约5％CO2和约20％O2的常氧条件下，或其他适合多能干细胞生长的已知条件下培养。
在一些实施方式中，多能干细胞在无饲养细胞条件下的培养基中培养、传代或收获，其中培养物中不含饲养细胞层。在一些实施方式中，多能干细胞在饲养细胞培养条件下的培养基中培养、传代或收获，其中培养物中含有一层饲养细胞，例如人真皮成纤维细胞(HDF)或本领域技术人员已知的其他细胞类型。
为了通过多能干细胞的体外分化产生中胚层细胞，将多能干细胞(如hESC或hiPSC)在合适的表面上，例如细胞外基质表面上培养。在一些实施方式中，细胞外基质选自下组：层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、胶原蛋白、I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸肝素、来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的可溶性制剂、Matrigel、明胶和人基底膜提取物。在一个实施方式中，细胞外基质可以来源于任何哺乳动物来源，包括人。在一个实施方式中，用于多能干细胞体外分化为中胚层细胞的细胞外基质表面是Matrigel包被的表面。
在一个实施方式中，多能干细胞铺在培养基中并培养约1小时至约24小时，以便在诱导分化前让细胞沉降。为了诱导多能干细胞分化为中胚层细胞，将多能干细胞在培养基中在合适的表面上，例如上述细胞外基质表面上培养。
用于诱导多能干细胞分化为中胚层细胞的培养基可以是任何支持分化的培养基，可以是本领域已知的培养基。在一些实施方式中，培养基可以是任何支持血液-血管培养和/或扩展的培养基，包括但不限于
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II(西格玛(Sigma)公司)、StemSpanTMSFEMII(干细胞技术(StemCell Technologies)公司)、StemSpanTMAFC(干细胞技术公司)、最小基本培养基(MEM)(Gibco)和αMEM。在一个实施方式中，培养基是无血清的。在另一个实施方式中，培养基包含血清。培养基还可以包含一种或多种中胚层诱导性生长因子，例如活化素-A、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和骨形态发生蛋白4(BMP4)。在一个实施方式中，该方法中使用的VEGF是VEGF165。在一个实施方式中，该方法中使用的FGF是碱性FGF(bFGF)。在一个实施方式中，多能干细胞在包含活化素-A、VEGF165、bFGF和BMP4的培养基中培养。在一个实施方式中，培养持续时间为约1、2、3、4、5、6或7天。在一个实施方式中，培养持续时间为约4天。在一个实施方式中，在培养约24小时后更换培养基，用不含活化素-A的培养基代替。
VEGF(如VEGF165)可以以约1ng/mL～约100ng/mL、或者更优选约5ng/mL～约20ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，VEGF以约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL或约20ng/mL的浓度使用。活化素-A可以以约1ng/mL～约100ng/mL、或者更优选约5ng/mL～约20ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，活化素-A以约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL或约20ng/mL的浓度使用。FGF(如bFGF)可以以约1ng/mL～约100ng/mL、或者更优选约5ng/mL～约20ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，FGF以约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL或约20ng/mL的浓度使用。BMP4可以以约1ng/mL～约100ng/mL、或者更优选约5ng/mL～约35ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，BMP4以约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL或约35ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，VEGF以10ng/mL的浓度使用，活化素-A以10ng/mL的浓度使用，FGF以10ng/mL的浓度使用，BMP4以25ng/mL的浓度使用。
多能干细胞向中胚层细胞的分化可以在约5％CO2和约20％O2的常氧条件下，或其他适合多能干细胞分化的已知条件下进行。
多能干细胞向中胚层细胞的分化可以在本领域已知的任何合适的容器中进行。示例性的组织培养容器包括但不限于：15cm组织培养板、10cm组织培养板、3cm组织培养板、6孔组织培养板、12孔组织培养板、24孔组织培养板、48孔组织培养板、96孔组织培养板、T-25组织培养瓶、T-75组织培养瓶。在一个实施方式中，多能干细胞向中胚层细胞的分化在10cm组织培养板中进行。
中胚层细胞可以进一步解离为单细胞，以便进一步使用。在一个实施方式中，通过多能干细胞体外分化产生的中胚层细胞通过酶处理被解离为单细胞。
在一个实施方式中，中胚层细胞表达选自CD309/KDR、CD56/NCAM1、APLNR/APJ、GARP和CD1的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种或至少5种标志物。
中胚层细胞还可以表达选自下组的一种或多种其他中胚层标志物：N-钙粘蛋白、活化素A、活化素AB、活化素AC、活化素B、活化素C、BMP及其他活化素受体激活剂、BMP及其他活化素受体抑制剂、BMP-2、BMP-2/BMP-4、BMP-2/BMP-6异源二聚体、BMP-2/BMP-7异源二聚体、BMP-2a、BMP-4、BMP-6、BMP-7、Cryptic、FABP4/A-FABP、FGF-5、GDF-1、GDF-3、INHBA、INHBB、节点(Nodal)、TGF-β、TGF-β1、TGF-β1、2、3、TGF-β1.2、TGF-β1/1.2、TGF-β2、TGF-β2/1.2、TGF-β3、TGF-β受体抑制剂、Wnt-3a、Wnt-8a、MESDC2、Nicalin、Brachyury、EOMES、FoxC1、FoxF1、Goosecoid、HAND1、MIXL1、Slug、Snail、TBX6、Twist-1、和Twist-2。
通过本发明的方法产生的中胚层细胞利用本文所公开的以下两个平台之一进一步分化为中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)：3D-Vasculonoid分化平台或2D分化平台。
3D-Vasculonoid分化平台提供了将由多能干细胞(如hESC或hiPSC)产生的中胚层细胞体外分化为meso-VPC的方法。
3D-Vasculonoid分化平台的方法是通过在非粘附或低粘附条件下(例如在超低附着表面上或悬浮培养中)在培养基中培养中胚层细胞来进行的，其中培养基可以是任何支持分化的培养基，可以是本领域已知的。在一些实施方式中，培养基可以是任何支持血液-血管培养和/或扩展的培养基，包括但不限于
Figure BDA0003618915260000261
II(西格玛(Sigma)公司)、StemSpanTMSFEMII(干细胞技术(StemCell Technologies)公司)、StemSpanTMAFC(干细胞技术公司)、最小基本培养基(MEM)(Gibco)和αMEM。在一个实施方式中，培养基是无血清的。在另一个实施方式中，培养基包含血清。培养基还可以包含一种或多种诱导中胚层细胞分化为meso-VPC的因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂、以及毛喉素。在一个实施方式中，该方法中使用的VEGF是VEGF165。在一个实施方式中，该方法中使用的FGF是碱性FGF(bFGF)。在一个实施方式中，转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂是SB431542。在一个实施方式中，多能干细胞在包含VEGF165、bFGF、BMP4和SB431542的培养基中培养。在一个实施方式中，多能干细胞在包含VEGF165、bFGF、BMP4、SB431542和毛喉素的培养基中培养。在一个实施方式中，培养持续时间为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在一个实施方式中，培养持续时间为约5天。在一个实施方式中，在分化开始约2天后和约4天后更换培养基。
VEGF(如VEGF165)可以以约1ng/mL～约100ng/mL、或者更优选约10ng/mL～约100ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，VEGF以约1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL的浓度使用。FGF(如bFGF)可以以约1ng/mL～约100ng/mL、或者更优选约10ng/mL～约100ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，FGF以约1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL的浓度使用。BMP4可以以约1ng/mL～约100ng/mL、或者更优选约10ng/mL～约100ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，BMP4以约1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL的浓度使用。转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂如SB431542可以以约0.1μM～约100μM、或者更优选约1μM～约100μM的浓度使用。在一个实施方式中，转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂以约0.1μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM或100μM的浓度使用。毛喉素可以以约0.1μM～约10μM的浓度使用。在一个实施方式中，毛喉素以约0.1μM、0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.5μM、9μM、9.5μM或10μM的浓度使用。
在一个实施方式中，VEGF以约50ng/mL的浓度使用，FGF以约50ng/mL的浓度使用，BMP4以约25ng/mL的浓度使用，小分子抑制剂以约10μM的浓度使用，毛喉素以约2μM的浓度使用。
使用3D-Vasculonoid分化平台的中胚层细胞向meso-VPC的分化可以在约5％CO2和约20％O2的常氧条件下，或其他适合多能干细胞分化的已知条件下进行。
使用3D-Vasculonoid分化平台的中胚层细胞向meso-VPC的分化可以在本领域已知的任何合适的容器中进行。示例性的组织培养容器包括但不限于：15cm组织培养板、10cm组织培养板、3cm组织培养板、6孔组织培养板、12孔组织培养板、24孔组织培养板、48孔组织培养板、96孔组织培养板、T-25组织培养瓶、T-75组织培养瓶。在一个实施方式中，使用3D-Vasculonoid分化平台的中胚层细胞向meso-VPC的分化在10cm组织培养板中进行。
使用3D-Vasculonoid分化平台的中胚层细胞向meso-VPC的分化可以在细胞最小限度地粘度在培养容器上的非粘附或低粘附条件下进行。在一个实施方式中，使用3D-Vasculonoid分化平台的中胚层细胞向meso-VPC的分化在超低附着表面上或悬浮培养中进行。
在一些实施方式中，由3D-Vasculonoid分化平台产生的meso-VPC形成类血管。如本文所用，类血管是指细胞聚集体，例如由血管细胞系如meso-VPC形成的集落状聚集体。类血管的形态可以改变，这取决于用于产生血管细胞的方法。本发明还提供将类血管中的多个细胞解离以获得单细胞的方法。在一个实施方式中，由3D-Vasculonoid分化平台产生的meso-VPC可以进一步解离为单细胞。在一个实施方式中，类血管中的多个meso-VPC通过酶处理被解离为单细胞。
2D分化平台提供了将由多能干细胞(如hESC或hiPSC)产生的中胚层细胞体外分化为meso-VPC的方法。
2D分化平台的方法通过在培养基中在合适的表面上，例如细胞外基质表面上培养中胚层细胞来进行。在一些实施方式中，细胞外基质选自下组：层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、胶原蛋白、I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸肝素、来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的可溶性制剂、Matrigel、明胶和人基底膜提取物。在一个实施方式中，细胞外基质可以来源于任何哺乳动物来源，包括人。在一个实施方式中，用于中胚层细胞体外分化的细胞外基质表面是IV型胶原蛋白包被的表面。
在一些实施方式中，培养基可以是任何支持中胚层细胞分化的培养基，可以是本领域已知的培养基。在一些实施方式中，培养基可以是任何支持血液-血管培养和/或扩展的培养基，包括但不限于
Figure BDA0003618915260000281
II(西格玛(Sigma)公司)、StemSpanTMSFEMII(干细胞技术(StemCell Technologies)公司)、StemSpanTMAFC(干细胞技术公司)、最小基本培养基(MEM)(Gibco)和αMEM。在一个实施方式中，培养基是无血清的。在另一个实施方式中，培养基包含血清。培养基还可以包含一种或多种诱导中胚层细胞分化为meso-VPC的因子。该因子选自血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂、以及毛喉素。在一个实施方式中，该方法中使用的VEGF是VEGF165。在一个实施方式中，该方法中使用的FGF是碱性FGF(bFGF)。在一个实施方式中，转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂是SB431542。
在一个实施方式中，用于分化中胚层细胞的以获得meso-VPC的2D分化平台的方法包括两个步骤：第一步，将中胚层细胞在支持分化的培养基中分化，所述培养基可以是本领域已知的培养基。在一些实施方式中，培养基可以是任何支持血液-血管培养和/或扩展的培养基，包括但不限于
Figure BDA0003618915260000291
II(西格玛(Sigma)公司)、StemSpanTMSFEMII(干细胞技术(StemCell Technologies)公司)、StemSpanTMAFC(干细胞技术公司)、最小基本培养基(MEM)(Gibco)和αMEM。在一个实施方式中，培养基是无血清的。在另一个实施方式中，培养基包含血清。培养基还可以包含选自血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、以及毛喉素的一种或多种因子。在一个实施方式中，培养基包含VEGF165、bFGF和BMP4。在一个实施方式中，培养基包含VEGF165、bFGF、BMP4和毛喉素。该步骤中的培养进行约12小时至约2天。在一个实施方式中，将中胚层细胞分化为meso-VPC的2D分化平台的第一步进行约1天。
VEGF(如VEGF165)可以以约1ng/mL～约100ng/mL、或者更优选10ng/mL～约100ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，VEGF以约1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL的浓度使用。FGF(如bFGF)可以以约1ng/mL～约100ng/mL、或者更优选约10ng/mL～约100ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，FGF以约1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL的浓度使用。BMP4可以以约1ng/mL～约100ng/mL、或者更优选约10ng/mL～约100ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，BMP4以约1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL的浓度使用。毛喉素可以以约0.1μM～约10μM的浓度使用。在一个实施方式中，毛喉素以约0.1μM、0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.5μM、9μM、9.5μM或10μM的浓度使用。
在一个实施方式中，VEGF以约50ng/mL的浓度使用，FGF以约50ng/mL的浓度使用，BMP4以约25ng/mL的浓度使用，毛喉素以约2μM的浓度使用。
使用2D分化平台的中胚层细胞向meso-VPC的分化的第一步可以在约5％CO2和约20％O2的常氧条件下，或其他适合中胚层细胞分化的已知条件下进行。
2D分化平台的第二步是使第一步中得到的细胞在支持分化的培养基中进一步分化为meso-VPC。在一些实施方式中，培养基可以是任何支持血液-血管培养和/或扩展的培养基，包括但不限于
Figure BDA0003618915260000301
II(西格玛(Sigma)公司)、StemSpanTMSFEMII(干细胞技术(StemCell Technologies)公司)、StemSpanTMAFC(干细胞技术公司)、最小基本培养基(MEM)(Gibco)和αMEM。在一个实施方式中，培养基是无血清的。在另一个实施方式中，培养基包含血清。培养基还可以包含一种或多种因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂、和/或毛喉素。在一个实施方式中，培养基包含VEGF165、bFGF、BMP4和SB431542。在一个实施方式中，培养基包含VEGF165、bFGF、BMP4、SB431542和毛喉素。在一个实施方式中，该步骤中的培养进行约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在一个实施方式中，将中胚层细胞分化为meso-VPC的2D分化平台的第二步进行约6天。在一个实施方式中，在2D分化平台的第二步开始约2天后和约4天后更换培养基。
VEGF(如VEGF165)可以以约1ng/mL～约100ng/mL、或者更优选10ng/mL～约100ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，VEGF以约1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL的浓度使用。FGF(如bFGF)可以以约1ng/mL～约100ng/mL、或者更优选约10ng/mL～约100ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，FGF以约1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL的浓度使用。BMP4可以以约1ng/mL～约100ng/mL、或者更优选约10ng/mL～约100ng/mL的浓度使用。在一个实施方式中，BMP4以约1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL的浓度使用。转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂如SB431542可以以约0.1μM～约100μM、或者更优选约1μM～约100μM的浓度使用。在一个实施方式中，转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂以约0.1μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM或100μM的浓度使用。毛喉素可以以约0.1μM～约10μM的浓度使用。在一个实施方式中，毛喉素以约0.1μM、0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.5μM、9μM、9.5μM或10μM的浓度使用。
在一个实施方式中，VEGF以约50ng/mL的浓度使用，FGF以约50ng/mL的浓度使用，BMP4以约25ng/mL的浓度使用，小分子抑制剂以约10μM的浓度使用，毛喉素以约2μM的浓度使用。
使用2D分化平台的中胚层细胞向meso-VPC的分化的第二步可以在约5％CO2和约5％O2的缺氧条件下，或其他适合向血管祖细胞分化的已知条件下进行。
使用2D分化平台的中胚层细胞向meso-VPC的两步分化可以在本领域已知的任何合适的容器中进行。示例性的组织培养容器包括但不限于：15cm组织培养板、10cm组织培养板、3cm组织培养板、6孔组织培养板、12孔组织培养板、24孔组织培养板、48孔组织培养板、96孔组织培养板、T-25组织培养瓶、T-75组织培养瓶。在一个实施方式中，使用2D分化平台的中胚层细胞向meso-VPC的分化在T-75组织培养瓶中进行。
使用2D分化平台的中胚层细胞向meso-VPC的分化可以在任何合适的表面上进行。在一个实施方式中，使用2D分化平台的中胚层细胞向meso-VPC的分化在细胞外基质表面上进行。在一个实施方式中，细胞外基质表面是IV型胶原蛋白包被的表面。
在一个实施方式中，由2D分化平台产生的meso-VPC可以通过酶处理进一步解离为单细胞。
在本发明的一些实施方式中，各步骤中产生的中胚层细胞或meso-VPC可以通过本领域已知的方法如流式细胞术进一步分选，以选出具有某些分子标志物、例如细胞表面标志物或miRNA标志物表达谱的细胞。下文中进一步提供由本发明方法产生的细胞的表征方法。
III.Meso-VPC的特征和组成
本发明提供中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)，该细胞是通过用本文所公开的方法进行多能干细胞衍生的中胚层细胞的体外分化而获得的。在一个实施方式中，多能干细胞首先分化为中胚层细胞，而中胚层细胞又分化为meso-VPC。某些表型标志物的表达水平可以通过本领域已知的任何方法确定，例如流式细胞仪/荧光激活细胞分选(FACS)、单细胞mRNA分析或免疫组织化学。某些基因的表达可以通过本领域已知的任何方法确定，例如RT-PCR和RNA-Seq。
在一个实施方式中，本发明的meso-VPC群体表达选自CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146和PDGFRb的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8种标志物。在一个实施方式中，meso-VPC群体表达CD31/PECAM1、CD309/KDR和CD146。在另一个实施方式中，meso-VPC群体表达CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD146，以及(i)CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD43或PDGFRb的至少一种、(ii)CD34、CD184/CXCR4和PDGFRb；(iii)CD184/CXCR4；(iv)PDGFRb；(v)CD144和CD184/CXCR4；(vi)CD184/CXCR4和CD43；或(vii)CC184/CXCFR4。在一个实施方式中，如果组合物中有至少约20％的meso-VPC表达某种标志物，则认为meso-VPC群体表达该标志物。
在任一实施方式中，meso-VPC群体表现出有限的或检测不到的CXCR7、CD45和NG2中的一种或多种。在任一实施方式中，meso-VPC群体表现出有限的或检测不到的所有CXCR7、CD45和NG2。在任一实施方式中，meso-VPC群体表现出有限的或检测不到的CD144、CD34、CD184/CXCR4、CXCR7、CD43、CD45、PDGFRb或NG2中的一种或多种。在一个实施方式中，如果组合物中有少于约20％的meso-VPC表达某种标志物，则认为meso-VPC群体表现出有限的或不表达该标志物。
在一个实施方式中，组合物中有至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的meso-VPC表达选自CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146和PDGFRb的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8种标志物。在本发明的一个实施方式中，组合物中有至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的meso-VPC表达CD31/PECAM1、CD309/KDR和CD146。在本发明的一个实施方式中，本发明的组合物中有至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的meso-VPC表达CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD146，以及(i)CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD43或PDGFRb的至少一种、(ii)CD34、CD184/CXCR4和PDGFRb；(iii)CD184/CXCR4；(iv)PDGFRb；(v)CD144和CD184/CXCR4；(vi)CD184/CXCR4和CD43；或(vii)CC184/CXCFR4。.
在任一实施方式中，本发明的组合物中有少于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的meso-VPC表达CXCR7、CD45和NG2中的一种或多种。在任一实施方式中，本发明的组合物中有少于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的meso-VPC表达所有CXCR7、CD45和NG2。在任一实施方式中，本发明的组合物中有少于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的meso-VPC表达CD144、CD34、CD184/CXCR4、CXCR7、CD43、CD45、PDGFRb或NG2中的一种或多种。
本发明的meso-VPC还可以通过单细胞miRNA谱来表征。在一个实施方式中，本发明的meso-VPC对选自mir126、mir125a-5p、mir24和mir483-5p的至少1种、至少2种、至少3种或至少4种miRNA标志物呈阳性。在任一实施方式中，meso-VPC对选自mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p和mir133a的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种或至少9种标志物呈阴性。在一个实施方式中，meso-VPC对mir126、mir125a-5p、mir24和mir483-5p呈阳性。在另一个实施方式中，meso-VPC对mir483-5p呈阳性。
在一个实施方式中，组合物中有约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的meso-VPC对选自mir126、mir125a-5p、mir24和mir483-5p的至少1种、至少2种、至少3种或至少4种miRNA标志物呈阳性。在本发明的一个实施方式中，组合物中有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的meso-VPC对选自mir126、mir125a-5p、mir24和mir483-5p的至少1种、至少2种、至少3种或至少4种标志物呈阳性。在任一实施方式中，组合物中有少于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的meso-VPC表达选自mir367,mir302a,mir302b,mir302c,mirLet7-e,mir223,mir99a,mir142-3p和mir133a的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种或至少9种标志物。在本发明的一个实施方式中，组合物中有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的meso-VPC对mir126、mir125a-5p、mir24和mir483-5p呈阳性。在另一个实施方式中，组合物中有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的meso-VPC对mir483-5p呈阳性。
在一个实施方式中，meso-VPC群体表达选自下组的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种或至少15种miRNA标志物：hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p、和miR-199a-3p。在一个实施方式中，meso-VPC群体表达hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p和hsa-miR-542-5p。在一个实施方式中，如果组合物中有至少约20％的meso-VPC表达某种标志物，则认为meso-VPC群体表达该标志物。
在一个实施方式中，组合物中有约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的meso-VPC表达选自下组的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种或至少15种miRNA标志物：hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p、和miR-199a-3p。在本发明的一个实施方式中，组合物中有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的meso-VPC表达选自下组的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种或至少15种miRNA标志物：hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p、和miR-199a-3p。在一个实施方式中，组合物中有约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的meso-VPC表达hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p和hsa-miR-542-5p。在一个实施方式中，组合物中有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的meso-VPC表达hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p和hsa-miR-542-5p。
在一个实施方式中，meso-VPC群体表现出有限的或不表达选自hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或至少7种miRNA标志物。在一个实施方式中，meso-VPC群体表现出有限的或不表达hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p和hsa-miR-133a-5p。在一个实施方式中，meso-VPC群体表现出有限的或不表达hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p。在一个实施方式中，如果组合物中有少于约20％的meso-VPC表达某种标志物，则认为meso-VPC群体表现出有限的或不表达该标志物。
在一个实施方式中，组合物中有约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的meso-VPC表现出有限的或不表达选自hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p和hsa-miR-133a-5p的至少1种、至少2种或至少3种miRNA标志物。在一个实施方式中，组合物中有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的meso-VPC表现出有限的或不表达选自hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p和hsa-miR-133a-5p的至少1种、至少2种或至少3种miRNA标志物。
除了上述特征外，本发明的meso-VPC还具有血管祖细胞的其他特性，例如分化为血管细胞如内皮细胞、平滑肌细胞和造血细胞的潜力。在一个实施方式中，本发明的meso-VPC具有分化为血管内皮细胞的潜力。meso-VPC的其他血管细胞特性可以通过例如Matrigel和AcLDL摄取试验来确定。
在一个实施方式中，本发明的meso-VPC具有血管细胞的形态，例如鹅卵石内皮样形态。表征本发明的meso-VPC的其他方法包括核型分析以确定染色体的完整性。
在一个实施方式中，本发明的meso-VPC相对于多能干细胞和中胚层细胞基本上得到了纯化。在又一个实施方式中，本发明的meso-VPC相对于多能干细胞和中胚层细胞基本上得到了纯化，使得所述细胞包含至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的meso-VPC。多能干细胞可以是本文所述的任何多能干细胞。
meso-VPC可以包含少于约30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％的多能干细胞和中胚层细胞。组合物可以不含多能干细胞和中胚层细胞。
IV.包含Meso-VPC的药物组合物
本发明提供包含本文所述的任何meso-VPC的药物组合物。包含本发明的meso-VPC的药物组合物可以用药学上可接受的运载体配制。例如，本发明的meso-VPC可以单独或作为药物制剂的组分给药，其中meso-VPC可以配制成以任何方便的方式给药，以用于药物。适用于本发明的运载体包括那些常用的运载体，例如水、盐水、右旋糖水、乳糖、林格氏溶液、缓冲溶液、透明质酸和乙二醇是示例性的液体运载体，特别是(当等渗时)用于溶液。
其他示例性的运载体或赋形剂描述于例如Hardman等人(2001)Goodman和Gilman的《治疗的药理学基础》(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，纽约州纽约的MGH公司(McGraw-Hill,New York,N.Y.)；Gennaro(2000)《雷鸣顿：药物科学和实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)；Lippincott，Williams和Wilkins，纽约州纽约；Avis等人(编)(1993)《药物剂型：胃肠道外药物》(PharmaceuticalDosage Forms:Parenteral Medications)；纽约州MD公司(Marcel Dekker,NY)；Lieberman等人(编)(1990)《药物剂型：片剂》(Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets)，纽约州MD(Marcel Dekker)公司；Lieberman等人(编)(1990)《药物剂型：分散体系》(PharmaceuticalDosage Forms:Disperse Systems)，纽约州MD公司；Weiner和Kotkoskie(2000)《赋形剂毒性和安全性》(Excipient Toxicity and Safety)，纽约州纽约MD公司。
包含meso-VPC的药物组合物可以与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液一起配制，这些溶液选自分散剂、悬浮剂、乳剂、无菌粉末(任选地在临使用前重建为无菌注射溶液或分散液)、抗氧化剂、缓冲剂、杀菌剂、溶质或悬浮剂和增稠剂。
本发明的示例性的药物组合物可以是任何适合用于治疗人类患者、例如患有血管疾病或病症的患者的制剂。在一个实施方式中，包含meso-VPC的药物组合物配制成可注射材料，例如适合于肌肉内注射的材料。包含meso-VPC的药物组合物可以在生理pH的缓冲溶液中给药，还含有渗透活性剂，将溶液维持在生理渗透压。在一个实施方式中，包含meso-VPC的药物组合物可以在包含至少5％(w/v)的葡萄糖的缓冲液中给药。在一个实施方式中，包含meso-VPC的药物组合物可以在包含氯化钠的缓冲液中给药。其他本领域已知的试剂也可以用于配制药物组合物。在一个实施方式中，用于配制药物组合物的缓冲液或溶液在使用前是无菌的。
包含本文所述方法中使用的meso-VPC的药物组合物可以以悬浮液、凝胶、胶体、浆液或混合物的形式递送。此外，在递送时，冷冻保存的meso-VPC可以用可商购的平衡盐溶液重悬，以达到所需的渗透压和浓度，以便通过注射(例如推注或静脉内)给药。包含meso-VPC的药物组合物可以通过例如一次或多次注射，以与耐用惰性基质的混合物形式递送给对象。耐用惰性基质如水凝胶——天然或合成的水不溶性聚合物——可以为给药部位的细胞的生长和扩展提供支架。在一个实施方式中，包含meso-VPC的药物组合物在透明质酸水凝胶中给药。在一个实施方式中，包含meso-VPC的药物组合物在甲基纤维素水凝胶中给药。本领域已知的为细胞生长和扩展提供耐用惰性基质支架的其他合适的材料也可以用于本文所述的方法。
包含meso-VPC的药物组合物可以通过一次或多次注射(例如通过注射器)来递送。或者，包含meso-VPC的药物组合物可以通过本领域已知的其他合适的方法递送。合适的递送方法可进一步促进meso-VPC的生长和存活，并防止给药部位的细胞流失。在某些实施方式中，适当的递送方法有助于将meso-VPC保留在给药部位，并为细胞生长提供最佳环境。因此，包含meso-VPC的药物组合物也可以配制成例如水凝胶管、水凝胶片、由天然或人工材料制成的生物工程贴片、或为药物组合物中的meso-VPC提供足够支持的细胞片。在一个实施方式中，包含meso-VPC的药物组合物以水凝胶管的形式递送。在一个实施方式中，包含meso-VPC的药物组合物以水凝胶片的形式递送。在一个实施方式中，包含meso-VPC的药物组合物以生物工程贴片的形式递送。在一个实施方式中，包含meso-VPC的药物组合物以细胞片的形式递送。本领域已知的任何其他合适的方法也可以用于本文所述药物组合物的递送。
在制备和储存条件下，药物组合物通常必须无菌和稳定。可以将组合物配制成溶液、微乳剂、脂质体或其它有序结构。运载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂覆材料、分散液情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。在许多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。组合物中包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸盐和明胶可延长可注射组合物的吸收。此外，可溶性因子可以在定时释放制剂中给药，例如在包括缓释聚合物的组合物中给药。活性化合物可以用能保护化合物不快速释放的运载体来制备，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLG)。许多制备这类制剂的方法已获得专利，或为本领域技术人员所公知。
本发明的一个方面涉及一种适合用于哺乳动物患者、例如人类患者的药物组合物，其包含至少104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012或1013的meso-VPC和药学上可接受的运载体。meso-VPC的药物制剂的给药浓度可以是任何有效的量，并且例如基本上不含PSC。例如，药物组合物可以包含各种数量、各种类型的本文所述的meso-VPC。在一个特定的实施方式中，meso-VPC的药物组合物包含约1×104～约1×105、约1×105～约1×106、约1×106～约1×107、约1×107～约1×108、约1×108～约1×109、约1×109～约1×1010、约1×1010～约1×1011、约1×1011～约1×1012或约1×1012～约1×1013的所述meso-VPC以用于有此需要的宿主的全身给药，或者包含约1×104～约1×105、约1×105～约1×106、1×106～约1×107、约1×107～约1×108、约1×108～约1×109、约1×109～约1×1010、约1×1010～约1×1011、约1×1011～约1×1012或约1×1012～约1×1013的所述meso-VPC以用于有此需要的宿主的局部给药。
V.治疗血管疾病的方法
本文所述的meso-VPC和包含meso-VPC的药物组合物可以用于基于细胞的治疗。具体而言，本发明提供用于治疗血管疾病如严重肢体缺血的方法。该方法包括给予有此需要的对象治疗有效量的meso-VPC，其中meso-VPC是通过多能干细胞衍生的中胚层细胞的体外分化而获得的。在一个实施方式中，多能干细胞分化为中胚层细胞，而中胚层细胞又分化为meso-VPC。
血管疾病是指血管(动脉和静脉)的任何异常状况。心脏以外的血管疾病可以在任何地方出现。最常见的血管疾病是中风、外周动脉疾病(PAD)、腹主动脉瘤(AAA)、颈动脉疾病(CAD)、动静脉畸形(AVM)、严重肢体缺血(CLI)、肺栓塞(血凝块)、深静脉血栓(DVT)、慢性静脉功能不全(CVI)和静脉曲张。在一个实施方式中，血管疾病是外周动脉疾病(PAD)。在一个实施方式中，血管疾病是缺血疾病，例如严重肢体缺血(CLI)。在一个实施方式中，血管疾病是动脉粥样硬化、外周动脉疾病(PAD)、颈动脉疾病、静脉疾病、血栓、主动脉瘤、纤维肌性发育不良、淋巴水肿或血管损伤。在一个实施方式中，血管疾病是外周动脉疾病，例如严重肢体缺血(CLI)、肠缺血综合征、肾动脉疾病、腘动脉陷迫综合征、雷诺现象或柏格氏病。
meso-VPC或药物组合物可以用于治疗对象中的任何血管疾病。在一个实施方式中，meso-VPC或药物组合物用于治疗外周动脉疾病。在一个实施方式中，meso-VPC或药物组合物用于治疗外周动脉疾病，包括严重肢体缺血(CLI)、肠缺血综合征、肾动脉疾病、腘动脉陷迫综合征、雷诺现象或柏格氏病。在一个实施方式中，meso-VPC或药物组合物用于治疗严重肢体缺血(CLI)。
本发明的meso-VPC或药物组合物可以全身或局部给药。meso-VPC或药物组合物可以用本领域已知的方式给药，包括但不限于通过静脉内、颅内、肌肉内、腹膜内或其他给药途径注射、或局部植入，取决于所治疗的特定病理。在一个实施方式中，meso-VPC或药物组合物肌肉内给药。
本发明的meso-VPC或药物组合物可以通过局部植入给药，其中采用递送装置。本发明的递送装置是生物相容且可生物降解的。本发明的递送装置可以用选自下组的材料制造：生物相容性纤维、生物相容性纱线、生物相容性泡沫、脂肪族聚酯、聚(氨基酸)、共聚(醚-酯)、聚亚烷基草酸酯、聚酰胺、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚(亚氨基碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧杂酯(polyoxaesters)、聚酰胺酯、含有胺基的聚氧杂酯、聚(酸酐)、聚磷酰苯、生物聚合物；丙交酯、乙交酯、ε-己内酯、对二氧杂环己酮、碳酸三亚甲基酯的均聚物和共聚物；丙交酯、乙交酯、ε-己内酯、对二氧杂环己酮、碳酸三亚甲基酯的均聚物和共聚物；纤维状胶原蛋白、非纤维状胶原蛋白、未经胃蛋白酶处理的胶原蛋白、与其他聚合物结合的胶原蛋白、生长因子、细胞外基质蛋白、生物相关肽片段、肝细胞生长因子、血小板衍生生长因子、富含血小板的血浆、胰岛素生长因子、生长分化因子、血管内皮细胞衍生生长因子、烟酰胺、胰高血糖素样肽、生腱蛋白-C、层粘连蛋白、抗排异剂、镇痛剂、抗氧化剂、抗凋亡剂、抗炎剂和细胞抑制剂。
具体的治疗方案、给药途径和辅助疗法可以根据特定的病理、病理的严重程度和患者的总体健康状况来确定。meso-VPC或药物组合物的给药可有效降低病理表现的严重性，和/或防止病理表现的进一步变性。
本发明的治疗方式可以包括给予单剂的meso-VPC或药物组合物。或者，本文所述的治疗方式可以包括一个疗程，其中meso-VPC或药物组合物在一定时间段内多次给药。示例性的疗程可以包括每周、每两周、每月、每季度、每半年或每年的治疗。或者，治疗可以分阶段进行，其中最初需要多次用药(例如在第一周每天用药)，随后需要减少给药的量和频率。
在一个实施方式中，在患者的整个生命过程中，meso-VPC或药物组合物定期给予患者一次或多次。在本发明的又一个实施方式中，meso-VPC或药物组合物每年给药一次、每6-12个月一次、每3-6个月一次、每1-3个月一次、或每1-4周一次。另外，对于某些病情或病症来说，更频繁的给药可能是理想的。在一个实施方式中，在患者的整个生命过程中，meso-VPC或药物组合物通过设备定期给药一次、一次以上，或根据特定的患者和患者所治疗的病理的需要给药。同样考虑到的是随时间变化的治疗方案。例如，在发作时可能需要更频繁的治疗(例如每天或每周治疗)。随着时间的推移，随着患者病情的改善，可能需要减少治疗频率，甚至可能不需要进一步治疗。
在一些实施方式中，给予对象约1×104、约1×105、约1.5×105、约2×105、约5×105、约1×106、约5×106、约1千万、约2千万、约4千万、约6千万、约8千万、约1亿、约1.2亿、约1.4亿、约1.6亿、约1.8亿、约2亿、约2.2亿、约2.4亿、约2.6亿、约2.8亿、约3亿、约3.2亿、约3.4亿、约3.6亿、约3.8亿、约4亿、约4.2亿、约4.4亿、约4.6亿、约4.8亿、约5亿、约5.2亿、约5.4亿、约5.6亿、约5.8亿、约6亿、约6.2亿、约6.4亿、约6.6亿、约6.8亿、约7亿、约7.2亿、约7.4亿、约7.6亿、约7.8亿、约8亿、约8.2亿、约8.4亿、约8.6亿、约8.8亿、约9亿、约9.2亿、约9.4亿、约9.6亿或约9.8亿个meso-VPC。在一些实施方式中，给予约10亿、约20亿、约30亿、约40亿或约50亿个或更多的meso-VPC。在一些实施方式中，meso-VPC的数量范围为约2千万～约40亿个meso-VPC、约4千万～约10亿个meso-VPC、约6千万～约7.5亿个meso-VPC、约8千万～约4亿个meso-VPC、约1亿～约3.5亿个meso-VPC、约1.75亿～约2.5亿个meso-VPC。
本文所述的方法还可以包括使用本领域已知的方法监测治疗或预防的功效的步骤。在一个实施方式中，meso-VPC或药物组合物的给药增加对象中的血流。在一个实施方式中，meso-VPC或药物组合物的给药促进对象中的血管化，例如血管生成和血管发生。在一个实施方式中，meso-VPC或药物组合物的给药减轻对象中的缺血严重程度。在一个实施方式中，meso-VPC或药物组合物的给药减小对象中的坏死面积。对象中的其他物理和功能变化也可以被测量和定量，以确定治疗血管疾病的方法的功效。
VI.试剂盒
在一些实施方式中，本发明提供一种试剂盒，其中，在一个或多个单独的隔室中包括本发明的meso-VPC或药物组合物。该试剂盒还可以在一个或多个隔室中包括其他成分，例如胶凝剂、软化剂、表面活性剂、湿润剂、增粘剂、乳化剂。该试剂盒可以任选地包括为诊断或治疗应用而配制meso-VPC或药物组合的说明书。该试剂盒还可以包括在治疗血管病症和/或疾病时单独或共同使用这些成分的说明书。在一个实施方式中，本发明的试剂盒包括注射器，用于注射包含meso-VPC的药物组合物。
在一些实施方式中，本发明提供一种试剂盒，其包括本发明的meso-VPC，以及用于选择、培养、扩展、维持和/或移植meso-VPC的试剂。细胞选择试剂盒、培养试剂盒、扩展试剂盒、移植试剂盒的代表性示例是本领域已知的。也可以通过使用表达其基因产物的阳性选择、阴性选择或其组合来富集样品中的细胞。
通过以下的实施例对本发明进行进一步的说明，这并不意味对本发明进行任何方式的限制。本申请全文中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请以及附图的全部内容均在此通过引用纳入本文。
实施例
实施例1：人多能干细胞的培养和向中胚层细胞的分化
这些研究中使用了专有的人胚胎干细胞(hES)系J1和人诱导性多能干细胞(hiPS)系GMP1。细胞在mTeSR1完全培养基(干细胞技术公司)中维持在6孔组织培养板中，该培养板预包被Matrigel(康宁公司)，其用于无饲养细胞的培养条件(以下称为“FF”)，或预包被Matrigel加人真皮成纤维细胞或HDF，其用于有饲养细胞的培养条件(以下称为“HDF”)，培养条件为37℃、5％CO2加20％O2的常氧条件(图1)。在细胞铺板(第0天)后1、2和3天进行培养基更换。细胞在第4天或在细胞融合度达到60-70％时传代。使用1mL/孔的Dispase(1U/ml，干细胞技术公司)进行FF培养的人多能干细胞的传代，或者使用1mL/孔的细胞解离缓冲液(CDB)(Gibco)进行HDF培养的人多能干细胞的传代。细胞在37℃下孵育5-7分钟或直到集落的边缘从板上翘起。将含有Dispase或CDB的培养基小心地从板上吸走，用DMEM-F12(Gibco)轻轻地清洗细胞，以去除任何残留量的酶或缓冲液。然后用新鲜的mTeSR1完全培养基从板上收集集落，使用一次性细胞刮刀用力清洗和刮除，注意避免形成气泡，然后在室温(RT)下以300×g离心5分钟，得到细胞团。去除上清后，将细胞团重悬在mTeSR1完全培养基中，并在含有2mL的mTeSR1完全培养基的6孔组织培养板(如上所述预包被Matrigel用于FF培养或预包被Matrigel加HDF)中每孔加入1mL这种均匀混合的细胞悬浮液。对于FF培养，大约有50万个细胞的小细胞块均匀地分布在每个孔中，或者对于HDF培养，大约有25万个细胞的小细胞块均匀地分布在每个孔中。然后，在避免任何涡旋的情况下，利用多次侧向摇动的动作将细胞散布在孔内。每天检查培养物的生长质量和形态。
通过加入5mL的Matrigel/皿来制备Matrigel预包被的10cm组织培养皿(康宁)，用于多能干细胞向中胚层细胞的分化。从每个皿中去除未附着的Matrigel后，立即加入10mL的mTeSR1完全培养基/10cm皿，以避免Matrigel包被的表面干燥。在每个Matrigel预包被的10cm皿中接种来自FF或HDF培养的GMP1细胞培养物的大约有150万个细胞的小细胞块(或来自HDF培养的J1细胞培养物的大约有30万个细胞的小细胞块/10cm皿)，均匀分布在10mL的TeSR1完全培养基中。然后在避免任何涡旋的情况下，利用多次侧向摇动的动作将细胞散布在皿中，并将板再孵育24小时(D-1)，条件为37℃、5％CO2加20％O2的常氧条件(图1)。在分化的D0，将mTeSR1完全培养基替换成12mL/10cm皿的Stemline II培养基(西格玛公司)，所述Stemline II培养基含有中胚层诱导性生长因子激活素-A(10ng/mL；Humanzyme)/FGF-2(10ng/mL；Humanzyme)/VEGF165(10ng/mL，Humanzyme)和BMP4(25ng/mL，Humanzyme)的鸡尾酒。在分化的D1，从中胚层鸡尾酒中去除激活素-A，并将培养基替换成12mL/皿的新鲜Stemline II培养基，所述Stemline II培养基含有FGF-2(10ng/mL)、VEGF165(10ng/mL)和BMP4(25ng/mL)，以促进中胚层细胞的出现和扩展。在分化的D3，通过加入15mL/皿的新鲜Stemline II培养基，所述Stemline II培养基含有FGF-2(10ng/mL)、VEGF165(10ng/mL)和BMP4(25ng/mL)，来进行最后的培养基更换。培养基持续至第4天，条件始终为37℃、5％CO2加20％O2的常氧条件(图1)。然后通过用Stempro Acutase酶(Gibco)将细胞解离为单细胞来收获细胞。(通过FACS和q-PCR分析)进行细胞表征，以确认在D4收获的细胞存在中胚层特征(图2A-B)。
实施例2：通过3D-vasclonoid分化平台将人中胚层细胞分化为血管祖细胞(MESO- VPC)
通过使用超低附着组织培养皿(康宁)将实施例1中获得的中胚层细胞悬浮在VPC分化培养基中，在有促进血管祖细胞出现和扩展的因子存在的情况下，开发了一种新型的3D-vasclonoid分化平台(图3)。在D0，将100万个未分选的D4中胚层细胞悬浮在超低附着6孔板的每个孔中，在常氧(37℃，5％CO2和20％O2)条件下，在VPC 3D分化培养基(StemlineII培养基，含有50ng/mL的VEGF165、50ng/mL的FGF-2、25ng/mL的BMP4、10μM的SB431542)中，在含有2μM的毛喉素(“Meso-3D Vasculonoid VPC1”方案)或不含毛喉素(“Meso-3DVasculonoid VPC2”方案)的情况下使其分化。在D2和D4更换各培养基，在第5天完成分化培养。分化5天后，通过用Stempro Acutase酶将两种方案的MESO-VPC解离为单细胞来收获这些MESO-VPC。然后对细胞进行计数并测量活力，随后冷冻保存。
实施例3：通过2D分化平台将人中胚层细胞分化为血管祖细胞(MESO-VPC)
通过将根据实施例1产生的中胚层细胞接种到粘附性人细胞外基质(IV型胶原蛋白包被的组织培养皿)上，还开发了一种新型的基于2D的VPC分化平台。在D0，将120万个未分选的D4中胚层细胞(来自上文)接种到人IV型胶原(5mg/cm2)包被的T-175瓶(康宁)上，在VPC 2D分化培养基中，使用两种不同的(Meso-2D VPC2和Meso-2D VPC3)分化方案使其分化(图4)。对于Meso-2D VPC2方案，在D0使用含有50ng/mL的VEGF165、50ng/mL的FGF-2和25ng/mL的BMP4的Stemline II培养基(40mL/瓶)，并且从D1到D7使用含有50ng/mL的VEGF165、50ng/mL的FGF-2、25ng/mL的BMP4加10μM的SB431542的Stemline II培养基(45mL/瓶)。对于Meso-2D VPC3方案，在D0使用含有50ng/mL的VEGF165、50ng/mL的FGF-2、25ng/mL的BMP4和2μM的毛喉素的Stemline II培养基，并且从D1到D7使用含有50ng/mL的VEGF165、50ng/mL的FGF-2、25ng/mL的BMP4和2μM的毛喉素加10μM的SB431542的Stemline II培养基。在D0，细胞在常氧(37℃，5％CO2和20％O2)条件下培养。在D1-D7，细胞在缺氧(37℃，5％CO2和5％O2)条件下培养，并在分化的D3(50mL/瓶)和D5(60mL/瓶)进行培养基更换。分化7天后，通过用Stempro Acutase酶进行酶促解离，将来自Meso-2D VPC2和Meso-2D VPC3方案的MESO-VPC收获为单细胞。然后对细胞进行计数并测量活力，随后冷冻保存，如实施例2中所述。
实施例4：Matrigel/AcLDL试验
将来自实施例2-3的冷冻保存的Meso-VPC在37℃水浴中快速解冻(2-3分钟)。然后将细胞转移到15mL锥形管中，加入10mL的内皮细胞或EC培养基(生命线细胞技术(LifeLineCell Technology)公司的
Figure BDA0003618915260000461
VEGF培养基)，以300×g离心5分钟。离心后，去除上清，将细胞重悬在1mL的新鲜EC培养基中以进行细胞计数。使用台盼蓝和耐细隆生物科学(Nexcelom Bioscience)公司的K2细胞计数仪对细胞进行计数。使用EC培养基制备总共18mL的细胞悬浮液，浓度为10,000-20,000个活MESO-VPC/mL。将3mL/孔的该细胞悬浮液铺在纤连蛋白(FN)包被的6孔板上，在常氧(37℃，5％CO2和20％O2)条件下进行3-4天，为Matrigel和AcLDL摄取试验准备细胞。
为进行Matrigel/AcLDL试验，在NuncTM 4孔板(赛默飞世尔科技(ThermoScientific)公司)的每个孔中加入250μL基底膜Matrigel(康宁)，并将板在RT下孵育30分钟。涂板后，立即以每孔250μL EC培养基中5.0×104个细胞的密度接种细胞。在铺板2-3小时后，将培养基替换成含有AcLDL(分子探针(Molecular Probes)公司)的250μL的新鲜EC培养基(5μL的AcLDL加245μL的EC培养基)。板在常氧条件下孵育过夜。孵育24小时后，去除含有AcLDL的培养基，用D-PBS洗板3次，并加入250μL的新鲜EC培养基/孔。最后，用Keyence显微镜在4倍放大倍率下对每个孔拍摄显微照片。
实施例5：流式细胞术试验
将第5天收获的Meso-3D Vasculonoid VPC和第7天收获的Meso-2D VPC(来自上述实施例2-3)的冷冻保存小瓶解冻，并在EC培养基中制备成单细胞悬浮液，以进行细胞计数。在进行细胞计数后，将细胞重悬在FACS缓冲液(含2％FBS的D-PBS)中。在100μL的FACS缓冲液中制备细胞的等份试样(100,000-200,000个细胞/FACS试验样品)，用于表面标志物抗体染色。抗人CD31/PECAM1(白乐津(BioLegend)公司)、CD34(BD生物科学(BD Biosciences)公司)、CD144/VE-Cadh(白乐津公司)、CD309/KDR(白乐津公司)、CD43(BD生物科学公司)、CD45(BD生物科学公司)、CD184/XCR4(BD生物科学公司)、CXCR7(白乐津公司)、CD146(白乐津公司)、NG2(BD生物科学公司)和PDGFRb(白乐津公司)单克隆抗体以5μL/样品，总体积100μL的量使用。细胞与抗体一起在冰上孵化20-30分钟。孵育后，用1mL的FACS缓冲液清洗细胞，以去除未结合的抗体。然后将细胞以300×g离心5分钟，去除上清，随后重悬在含碘化丙啶(PI，西格玛公司)的100μL的新鲜FACS缓冲液中，以1:1000稀释。在细胞悬浮液中加入PI，用于在FACS分析中排除死细胞。用SONY SA3800频谱分析仪进行分析。通过使用阳性(HUVEC)和阴性(未分化的J1或GMP1细胞)对照来设定补偿。
实施例6：比较用细胞
为了与本发明的Meso-VPC进行比较，使用如前所述的HE和HB方案，从人胚胎干细胞(例如J1 hESC)或人诱导性多能干细胞(例如GMP-1iPSC)生成血源性内皮细胞(HE)或成血管细胞(HB)，例如在美国专利第9,938,500号；美国专利第9,410,123号；WO 2013/082543；WO 2014/100779；美国专利第9,993,503号；以及美国临时申请第62/892,712号(2019年8月28日提交)及要求其优先权的PCT申请中有描述，所有这些文献都通过引用其全文纳入本文。简而言之，为了生成HE，用
Figure BDA0003618915260000481
细胞解离缓冲液(CDB)解离hESC或iPSC，以获得单细胞聚集体。将细胞以400,000个细胞/10mL的最终密度重悬在含有终浓度为10μM的Y-27632(Stemgent)的mTeSRTM1培养基(干细胞技术公司)中。将10mL的细胞悬浮液转移到IV型胶原蛋白包被的10cm板中(第-1天)。将板在常氧的培养箱中放置过夜。次日(第0天)，将mTeSRTM1/Y-27632培养基从每个10cm板中轻轻去除，替换成10mL的BVF-M培养基[
Figure BDA0003618915260000482
II造血干细胞扩展培养基(西格玛公司)；25ng/mL BMP4(Humanzyme)；50ng/mLVEGF165(Humanzyme)；50ng/mL FGF2(Humanzyme)]。将板在缺氧室(5％CO2/5％O2)内孵育2天。第2天，吸出培养基，在每个10cm板中加入10-12mL的新鲜BVF-M。第4天，再次吸出培养基，在每个10cm板中加入10-15mL的新鲜BVF-M。第6天，收获细胞用于移植和/或用于进一步测试。吸出每块板上的培养基，通过加入10mL的D-PBS(Gibco)并吸出D-PBS来清洗板。将5mL的StemPro Accutase(Gibco)加入每个10cm板中，并在常氧CO2培养箱(5％CO2/20％O2)中孵育3-5分钟。细胞用5mL移液器移取5次，然后用P1000移液器移取约5次。然后通过30μM细胞过滤器过滤细胞，并转移到收集管中。每个10cm板再次用10mL的EGM-2培养基(龙沙(Lonza)公司)或
Figure BDA0003618915260000483
II造血干细胞扩展培养基(西格玛公司)冲洗，并将细胞通过30μM细胞过滤器，收集到收集管中。将管以120-250×g离心5分钟。然后用EGM-2培养基或
Figure BDA0003618915260000484
II造血干细胞扩展培养基(西格玛公司)重悬细胞并计数。计数后，将细胞离心沉降下来(250×g，5分钟)，用冷冻培养基(10％DMSO+热失活FBS)以3×106个细胞/mL的浓度重悬。为了创建冷冻储备料，将细胞悬浮液等分为每个冷冻小瓶2mL FBS(海克隆(Hyclone)公司)和DMSO(西格玛公司)(6×106个细胞/2mL/小瓶)。
为了生成成血管细胞(HB)，用4mg/mL的IV型胶原酶(Gibco)解离hESC或iPSC以获得细胞块，然后重悬在BV-M培养基[
Figure BDA0003618915260000485
II造血干细胞扩展培养基(西格玛公司)；25ng/mL BMP4(Humanzyme)；50ng/mL VEGF165(Humanzyme)]中，并以每孔约750,000-1,200,000个细胞的密度铺在超低附着表面6孔板(康宁)上。将板在常氧CO2培养箱中放置48小时，以使拟胚体形成(第0-2天)。然后收集每个孔中的培养基和细胞，并以120-300g离心3分钟。去除一半的上清，替换成含有50ng/mL bFGF的2mL BV-M。因此，细胞悬浮液中bFGF的终浓度为约25mg/mL。将4mL的细胞悬浮液铺在超低附着表面6孔板的每个孔上，并在常氧CO2培养箱中再放置48小时(第2-4天)，以使拟胚体继续形成。第4天，将拟胚体收集到15mL管中，以120-300×g离心2分钟，用D-PBS清洗，并使用StemPro Accutase(Gibco)解聚成单细胞悬浮液。用FBS(海克隆公司)使Accutase失活，并将单细胞通过细胞过滤器，离心，并以约1×106个细胞/mL重悬在Stemline II培养基(西格玛公司)中。将约3×106个细胞在30mL的Methocult BGM培养基[MethoCultTMSF H4536(无EPO)(干细胞技术公司)；青霉素/链霉素(Gibco)；ExCyte细胞生长补充剂(1:100)(密理博(Millipore)公司)；50ng/mL Flt3配体(PeproTech)；50ngm/ml VEGF(Humanzyme)；50ng/mL TPO(PeproTech)；30ng/mL bFGF(Humanzyme)]中混合，重新铺在超低附着表面10cm皿(康宁)上，并在常氧CO2培养箱中孵育7天(第4-11天)，以使其形成成血管细胞。第11天，收获成血管细胞用于移植和/或用于进一步测试。通过用D-PBS(Gibco)稀释甲基纤维素来收集成血管细胞。将细胞混合物以300×g离心两次，每次15分钟，并重悬在30mL的EGM2 BulletKit培养基(龙沙公司)或StemlineII中，并对细胞进行计数和冷冻，如上所述。
实施例7A：3D vasculonoid分化平台生成具有血管祖细胞特性的细胞
如实施例2所述，使用两种不同的3D分化方案(Meso-3D Vasculonoid VPC1和Meso-3D Vasculonoid VPC2)，在常氧(37℃，5％CO2和20％O2)条件下生成Meso-VPC，为期5天(图3)。接种的中胚层细胞保持活力，早在第1天就形成了细胞聚集体(数据未显示)。到第5天(图5；上图)，这些细胞聚集体(以下称为“类血管”)逐渐长大，此时将它们收获。与Meso-3D Vasculonoid VPC2方案相比，Meso-3D Vasculonoid VPC1方案产生了更大的类血管聚集体。收获细胞后，将细胞重新铺在FN包被的板上，以确定其进一步分化为内皮细胞系的能力。如图5中图所示，当细胞在促进内皮细胞分化的培养基中在FN包被的板上培养时，它们获得了内皮细胞的典型的鹅卵石形态。Meso-3D VPC还表现出在Matrigel上形成毛细血管状网络的强大能力，并显示出对AcLDL的摄取(图5；下图)。与VPC1细胞相比，VPC2细胞显示出更高的管形成能力(图5；下图)。
此外，对血管标志物的FACS分析表明，J1和GMP1衍生的Meso-3D VasculonoidVPC1和VPC2细胞都显示出内皮标志物KDR、CD31以及内皮/周细胞(CD146)的强烈表达(>20％)(图6A)和造血标志物CD43的低表达。它们广泛的血管标志物表达谱与在未分化的多能干细胞(GMP1和J1)或HUVEC细胞以及在其他PSC衍生细胞(如HB和HE)中观察到的表达谱不同(图6B-C)。通过G-banding核型分析对这些分化的细胞进行染色体稳定性分析，细胞显示出正常的核型，表明通过Meso-3D Vasculonoid VPC1和Meso-3D Vasculonoid VPC2方案进行的hES和hiPS细胞的分化并不改变分化过程中的染色体稳定性(数据未显示)。
实施例7B：2D分化平台生成具有血管祖细胞特性的细胞
如实施例3所示，使用两种不同的2D分化方案(Meso-2D VPC2和Meso-2D VPC3)，在常氧和缺氧的培养条件下，由iPS细胞(GMP1)和hES细胞(J1)生成Meso-VPC，共为期7天(图4)。接种的中胚层细胞附着在IV型胶原蛋白包被的表面上，到第7天(收获日)成长并扩展为更大的紧凑的细胞集落，成为2D分化的贴壁细胞培养物(图7上图)。对于J1和GMP1衍生细胞而言，与Meso-2D VPC3方案相比，Meso-2D VPC2方案产生了更紧凑的细胞集落(集落更“尖锐”或“漩涡状”)。在第7天收获细胞后，在FN包被的板上进一步培养并暴露在内皮培养基中，细胞表现出典型的血管祖细胞特性，包括鹅卵石内皮样形态(图7；中图)和在Matrigel上形成毛细血管状网络和AcLDL摄取的能力(图7；下图)，但规模低于Meso-3D细胞(比较图5和图7的下图)。
此外，对血管标志物的FACS分析表明，J1和GMP1衍生的Meso-2D VPC1和VPC2细胞都显示出CD146的高表达，内皮标志物KDR、CD31的强烈表达(>20％)和PDGFRb的可检测表达(10-40％)。这样的表达谱与在未分化的多能干细胞或HUVEC细胞以及在其他PSC衍生的血管祖细胞(如HB和HE)中观察到的表达谱不同(图6B和6C)。与Meso-3D细胞相比，Meso-2DVPC表达更高水平的CD146，并且有PDGFR的独特表达，表明有更高的周细胞分化倾向(图6A-B)。此外，与Meso-3D不同，Meso-2D VPC不表达任何血液标志物CD45或CD43。
实施例8：单细胞miRNA谱
如下所述，进行了使用单细胞qRT-PCR分析的额外分析，以评价与多能性或血管细胞属性相关的96种microRNA的表达水平。订购了96种人miRNA的TaqMan基因表达试验(应用生物系统(Applied Biosystems)公司)。通过将25μL的20X Taqman检测试剂与25μL的2X检测上样试剂(Fluidigm)混合来制备10X检测试剂，最终储备料体积为50μL。准备了66,000～250,000个细胞/mL范围内的细胞等分试样(冷冻或新鲜收获的)。将细胞与LIVE/DEAD染色液(LIVE/DEAD活力/细胞毒性试剂盒)在室温下孵育10分钟。然后清洗细胞，悬浮在培养基中并通过40μm过滤器过滤。使用细胞计数仪对细胞进行计数，以确定活力和细胞浓度。将细胞(60μL)与悬浮试剂(40μL)(Fluidigm)以3:2的比例混合，制备细胞混合液。将6μL的细胞悬浮混合液装入已打底的C1 Single-Cell Autoprep IFC微流控芯片，其用于中等细胞(10-17μm)或大细胞(17-25μm)，然后在Fluidigm C1仪器上使用“STA：细胞上样(1782x/1783x/1784x)”脚本处理该芯片。该步骤在96个捕获室中各自捕获一个细胞。然后将芯片转移到Keyence显微镜上，扫描每个腔室，以对捕获的单细胞数量、细胞的活/死状态和捕获的双细胞/细胞聚集体进行评分。为了在C1上进行细胞裂解、逆转录和预扩增，根据制造商的方案，将收获试剂(Harvest reagent)、裂解最终混合物(Lysis final mix)、RT最终混合物(RT final mix)和预扩增混合物(Preamp mix)加入C1芯片的指定孔中。然后将IFC置于C1中，并使用“STA:miRNA Preamp(1782x/1783x/1784x)”脚本。cDNA的收获安排在次日上午完成。将cDNA从C1芯片的每个腔室转移到新的96孔板上，该板预载有12.5μL的C1DNA稀释试剂。根据制造商的说明书，为每个实验准备管对照，例如无模板对照和阳性对照。使用96.96Dynamic ArrayTMIFC和BioMarkTMHD系统对预扩增的cDNA样品进行qPCR分析。在JUNO仪器中处理IFC引物，然后加载cDNA样品混合物和10X检测试剂，按照制造商的方案进行。然后将IFC放入BiomarkTMHD系统，使用“GE96×96miRNA Standard v1.pcl”方案进行PCR。使用Fluidigm公司提供的Real-Time PCR分析软件进行数据分析。将死细胞、重复试样等从分析中去除，并使用基于线性导数基线(Linear Derivative Baseline)和用户检测器Ct阈值(User Detector Ct Threshold)的方法进行分析。数据在热图(Heatmap)视图中查看，并以CSV文件形式导出。然后用“R”软件进行“离群点识别(Outlier Identification)”分析，得出“FSO”文件，然后按照说明书进行“自动分析”。
结果
表1：miRNA谱
Figure BDA0003618915260000521
如表1所示，MESO-VPC(3D或2D)对多能干细胞miRNA标志物(mir376、mir302a、mir302b和mir 302c)呈阴性，对HUVEC中表达的内皮miRNA标志物如mir126、mir125a-5p和mir24呈阳性。然而，MESO-VPC对HUVEC特异性miRNA(mirLet7-e、mir223和mir99a)呈阴性。最后，MESO-VPC显示miRNA 483-5P的独特表达，并且对HB和HE独特的miRNA mir142-3p和133a分别呈阴性。
实施例9：后肢缺血模型中的体内研究
外周动脉疾病(PAD)是外周血管疾病(PVD)的一种形式，其中肢体(通常是腿部)的血液供应部分或全部受阻，导致血流受损和组织缺氧。当PAD发展到一定程度时，就会达到严重肢体缺血(CLI)的阶段，出现皮肤溃烂、坏疽和不可避免的截肢。后肢缺血动物模型已被用来评价各种治疗方法。在这项研究中，我们使用了一个稳定的严重缺血模型(Ishikane等人(2008)Stem Cells，16:2625-2633)来评估meso-VPC的功效，并证明了血流恢复的改善和供体细胞进入到缺血肢体中的迹象。诱导小鼠中的后肢缺血包括两次结扎髂动脉和股动脉的近端，以及在两次结扎之间将其解剖。手术导致血流受阻，随后造成严重的缺血性损害。
物种
小鼠/Balb/cOlaHsd-Foxn1nu(查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))，研究开始时年龄为6-8周龄，最小和最大体重在组平均体重的+/-20％范围内。
测试物
测试项目1＝根据实施例3制备的J1-HDF Meso-2D VPC2
测试项目2＝根据实施例2制备的J1-HDF Meso-3D Vasculonoid VPC2
测试项目3＝根据实施例3制备的GMP-1-HDF Meso-2D VPC2
测试项目4＝根据实施例2制备的GMP1-HDF Meso-3D Vasculonoid VPC2
测试项目5＝根据实施例2制备的GMP1-HDF Meso-3D Vasculonoid VPC1
载剂(阴性对照)
GS2(无细胞培养基，如WO 2017/031312所述，其通过引用其全文纳入本文)[552.2mL的GS2：0.9％氯化钠冲洗USP(百特医疗(Baxter Healthcare)公司或赫士睿(Hospira)公司)(408.6mL)；5％右旋糖/0.9％氯化钠，注射USP(百特(Baxter)公司或博朗(Braun)公司)(33.2mL)，以及BSS冲洗液(爱康(Alcon)公司)(110.4mL)]
研究设计和时间线
按照以下研究设计(表2)和时间线(表3)进行该研究。
表2：研究设计
Figure BDA0003618915260000541
IM＝对缺血肢体进行局部肌肉内注射
表3：时间线
Figure BDA0003618915260000542
实验步骤
发病率和死亡率观察
在手术日期间连续监测动物，此后每天两次(周末每天一次)。
体重
治疗前记录体重，此后每周一次。
HLI手术步骤
在麻醉和镇痛下，将小鼠腹侧向上放置。
在手术当天(第0天)，在右后肢腹股沟区的皮肤上做一个切口。用6-0丝线将股动脉结扎两次，并在两次结扎之间横切。用5-0Vicryl可吸收线闭合伤口，让小鼠恢复。
测试项目给药步骤
在手术后0天，立即在每个动物的以下两个部位进行肌肉内注射：手术伤口的近端和远端。在动物的每个部位注射50μl，每只动物共100μl。每只小鼠的总量为1M个细胞/小鼠。
血流测量步骤
在手术前、刚手术后和临治疗前，用非接触式Peri-Med激光多普勒仪测量每只小鼠双腿中的血流，以确定纳入标准(只有与未受伤的腿相比血流减少至少30％的动物被纳入)，并且在研究日：手术后7、14、21、28和35天进行测量。血流测量表示为手术后缺血肢体中的血流与正常肢体中的血流的比值，以及右肢中的血流与左肢中的血流的比值。
血管成像步骤
用RSOM Explorer P50”(i-Thera Medical)成像系统测量每组3只小鼠在3个时间点(手术后7、21和35天)的双腿(股骨和胫骨区域)中的血管成像。RSOM(光栅扫描光声内窥镜)Explorer P50的工作原理是用532纳米的纳秒级激光脉冲和球形聚焦的50MHz探测器进行照射。80秒的采集时间允许对5×5mm的视野成像，穿透力为3mm，轴向/横向分辨率为40μm/10μm。
缺血严重程度的宏观评价步骤
从第7天开始，通过采用表4所述的坏死区域的形态学等级，在手术后每周对缺血肢体进行宏观评价(见Goto等人，Tokai J.Exp.Clin.Med.2006.31:128-132)。
表4：坏死区域的形态学等级
等级 描述
0 无坏死
1 坏死局限于脚趾(脚趾丧失)，
2 坏死延伸至足背(足部丧失)，
3 坏死延伸至小腿(膝关节丧失)
4 坏死延伸至大腿(全部后肢丧失)
肢体功能的体内评估步骤
从第7天开始，使用表5中的如下量表，在手术后每周对缺血肢体的使用障碍进行半定量评估(见Stabile等人，Circulation.2003.108:205-210)。
表5：肢体功能的评估
等级 描述
0 弯曲脚趾以抵抗尾部的轻度牵引
1 足底弯曲
2 不拖着脚走，但无足底弯曲
3 拖着脚走
在部分或全部截肢的情况下，肢体功能评级为“不适用”或“N/A”。在这种情况下，血流测量不包括在统计分析中。
动物处死和组织固定
在第36天处死小鼠。收集双后肢的腓肠肌，用福尔马林固定并包埋入石蜡中(每组5只动物)。将来自每组3只动物的肌肉OCT包埋，冷冻并储存起来以备进一步运输。将包埋的肌肉样品切片，用H&E+IHC异凝集素B4-HRP偶联物染色，并由病理学家进行评价。对人特异性抗体(Stem 121)进行IHC，以检测组织中存在的人细胞。进行针对CD34的ICH染色和血管密度评价。
结果
死亡率
研究期间有14只动物死亡。其中：一只小鼠在手术过程中死亡。13只小鼠在HLI手术后11天内被发现死在它们的笼子里。其中，小鼠编号：19、40、99、100和101来自1M组；小鼠编号97来自2M组；小鼠编号：69、72、88和89来自4M组；小鼠编号：38和50来自6M组；小鼠编号28来自7M组。由于腿部截肢，20只小鼠出于人道原因而被安乐死(小鼠编号：58和98来自2M组；小鼠编号：61、63、64、90、91、92、93和95来自3M组；小鼠编号81来自4M组；小鼠编号21来自5M组；小鼠编号：36、37、47和53来自6M组；小鼠编号：29、30、32和34来自7M组)。在各个时间点存活的所有动物都在该时间点进行了评价。
体重
监测体重直至研究第35天。手术后第一周体重下降，但在第二周开始恢复，在最后一周几乎达到完全恢复。所有动物组都平行地恢复。使用GraphPad Prism 5软件进行双向方差分析和随后的Bonferroni事后比较，在所有组之间均未发现体重有统计学上的显著差异。
血流测量
在测试项目治疗之前对血流进行评估，此后在所有接受了手术的动物中都观察到明显的变化。在整个研究中，与载剂治疗组(2M)相比，所有治疗组(3-7M)的血流都可见明显的改善。3M组从第21天开始，其他治疗组从第28天开始到第35天，对于接受了手术的右肢，这种改善在统计学上是显著的(双向方差分析，随后是Bonferroni多重比较)(图8)。
血管成像
用RSOM Explorer P50(i-Thera Medical)成像系统测量每组3只小鼠在3个时间点(手术后7、21和35天)的双腿(股骨和胫骨区域)中的血管成像。
使用数种分析方法来评价缺血后肢中的小血管密度可能的增加。最后，最高的100个部分的汇总被用来更可靠地观察血管的生成。结果以第35天的总结相对于第7天的百分比表示。为了使数据更加清晰，示出了所有小组的平均值相较于载剂组的增减情况。在整个研究中，与载剂治疗组(2M)相比，治疗组(3、4、6和7M)的小血管密度可见改善(图9)。
缺血严重程度的宏观评价
从第7天到第35天，通过使用坏死面积的分级形态学量表对缺血肢体进行宏观评价。所有组的动物都可见截肢现象，在4M和5M组中最低。(见表6和7)。
表6：第7天肢体坏死评分为0、1和2的小鼠的发生率
Figure BDA0003618915260000581
表7：第35天肢体坏死评分为0、1和2的小鼠的发生率
Figure BDA0003618915260000582
肢体功能的评估
从第7天到第35天，通过使用分级功能量表对缺血肢体的使用障碍进行半定量评估。在所有的动物组中都发现肢体功能的自发改善。然而，用4M和5M组的测试项目治疗的动物与用载剂治疗(2M)的对照组相比，表现出更好的功能改善(见表8和9)。
表8：第7天肢体功能评分为0、1、2和3的小鼠的发生率
Figure BDA0003618915260000583
表9：第35天肢体功能评分为0、1、2和3的小鼠的发生率
Figure BDA0003618915260000591
组织学结果
所有切片都用H&E和Masson Trichrome染色，并由一名病理学家检查。该评价以半定量分析的方式进行(见下述等级)。CD34+高分辨率组织学图片转用于定量图像分析。
肌肉萎缩等级：
0＝完全没有萎缩
1＝极轻度萎缩(最多10％的肌纤维)
2＝轻度萎缩(>10％且<25％的肌纤维)
3＝中度萎缩(>25％且<75％的肌纤维)
4＝重度萎缩(>75％且<100％的肌纤维)
炎症(巨噬细胞和卫星细胞)等级：
0＝完全没有炎性浸润。
1＝轻度细胞浸润，每X20 HPF最多增加10个细胞。
2＝中度细胞浸润，每X20 HPF增加10-20个细胞。
3＝重度细胞浸润，每X20 HPF增加20-50个细胞。
4＝极重度细胞浸润，每X20 HPF增加>50个细胞。
在所有动物组中，都观察到肌纤维的中度到重度萎缩。观察到肌细胞的退行性脂肪变化以及卫星细胞和巨噬细胞的增加。在一些病例中，纤维组织和淋巴细胞浸润明显增加。少数动物也显示出一些营养不良性矿化。与4M、5M和6M组相比，2M和3M组总体上显示出更严重的变化。7M组显示出中度变化。
免疫组织化学和毛细血管密度分析
染色后的切片通过荧光显微镜(E600；尼康(Nikon)，日本东京)进行评价和拍照，该显微镜配备了Plan Fluor物镜，与CCD相机(DMX1200F；尼康)相连。Cy3显示出亮红色荧光：Ex(最大值)：543nm；Em(最大值)：570nm；而荧光素葡聚糖显示出强烈的绿色荧光(Ex(最大值)：488nm；Em(最大值)：530nM)。使用Image Pro+软件收集和分析数字图像。从1M组和7M组的五只动物的相同区域获取两块肌肉样本。测量血管的面积。密度表示为每个视野中毛细血管的平均数量。血管总数表示测量区域内的所有血管。在研究的第36天，与对照组2M相比，所有治疗组的CD-34阳性毛细血管的数量都更大。CD-34阳性染色被认为是小毛细血管形成的标志，因此所获得的结果支持在用细胞治疗的动物组中观察到的血流改善。用激光多普勒仪测量的血流和毛细血管密度之间有很强的统计学显著相关性(见图10和11)。
讨论
通过在缺血肢体上IM给予测试项目，发现肢体功能(主要是在治疗组4M和5M中)、血流(通过激光多普勒仪监测)、RSOM成像和血管定量组织学有一些改善。在研究结束时(第36天)，与载剂治疗对照组相比，所有治疗组中的治疗都使得血液灌注恢复(在最好的一组——4M中最高达其正常值的78％)。这种血液灌注的恢复与RSOM成像分析的结果以及接受了手术的后肢中的毛细血管密度的免疫组织化学结果有很好的相关性。各组的评级表明4M是最好的，6M和7M紧随其后。腓肠肌石蜡包埋切片的STEM121染色未能显示出人干细胞，但在更接近注射部位的股四头肌中却能看到这些细胞。
实施例10：Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞的整体小RNA-seq分析
根据实施例2生成Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞。将约1-2百万个细胞的细胞团裂解，分离RNA，进行测序、生物信息学比对，并在整个已知人转录组中分析小RNA表达(约2000个miRNAs)。图12A显示与J1细胞群体和J1衍生的HE细胞群体相比、在三个重复的J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞群体中发现的独特人miRNA，包括hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p和hsa-miR-542-5p。图12A还显示在J1衍生的HE细胞群体中发现的独特人miRNA，包括hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p。
此外，整体小RNA-seq分析显示，miR 214在J1衍生的HE和meso 3D VasculonoidVPC2细胞中都高水平表达，miR 335-5p在J1和J1衍生的HE细胞中高水平表达，而miR 335-3p在J1衍生的HE和meso 3D Vasculonoid VPC2细胞中高水平表达。同样，miR 199a-3p在J1衍生的HE和meso 3D Vasculonoid VPC2细胞中都有更高水平的表达(数据未显示)。
图12B显示先前在单细胞上分析的J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞群体中miRNAs的表达水平。图12B显示hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p和hsa-miR-24-3p在J1细胞群体和J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞群体中都有表达。图12C显示J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞群体表达hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p和hsa-miR-142-3p，而不表达或低表达hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p和hsa-miR-133a-5p。图12D也显示J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞群体表达hsa-miR-483-5p和hsa-miR-483-3p。
实施例11：Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞的单细胞RNA-seq分析
还对根据实施例2生成的J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞进行单细胞RNA-seq分析。每种细胞类型(J1细胞、J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞和HUVEC)约有3,700-8,000个单细胞被捕获、处理，并使用10X Genomics(Pleasonton,CA)平台及其Cell Ranger分析管道进行单细胞测序来进行分析。使用R包Seurat(Butler等人，NatureBiotechnology 36:411-420(2018)；Stuart等人，Cell 177:1888-1902(2019))来进行进一步的数据QC和分析。其中一项分析是对J1细胞、J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞和HUVEC进行综合分析，以鉴定三个样品中差异表达最大的基因。该分析遵循Stuart等人，Cell 177:1888-1902(2019)以及https://satijalab.org/seurat/v3.0/pancreas_integration_label_transfer.html中描述的准则。只有在≥10个细胞中表达的基因和具有至少200个被检测基因的细胞被保留在分析中。图13显示在单细胞RNA-seq分析中，与单个J1或HUVEC细胞相比，J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞样品中最上调或最下调的基因表达。
实施例12：类血管在体外表现出更高的细胞存活率，在体内显示出疗效
根据实施例2生成了J1衍生的Meso-3D Vasculonooid VPC2细胞的类血管，但细胞被冷冻保存，没有解离为单细胞，因此细胞仍为聚集体形式。
将约150个未解离的Meso-3D Vasculonoid VPC2(相当于约1,500,000个解离的单细胞)以1:1的比例混合在I型胶原蛋白和生长因子减少的Matrigel中，并铺在96孔板的4个孔中。凝胶在37℃凝固30分钟，然后覆盖50ul的完全
Figure BDA0003618915260000621
基本培养基(生命线细胞技术(
Figure BDA0003618915260000622
Cell Technology)公司，马里兰州弗雷德里克)，其中补充有20ng/mL FGF、25ng/mL BMP4、45ng/mL VEGF和10uM SB431542-。类血管培养14天。用4％的PFA固定凝胶，用0.05％的Triton-X透化最长达4小时，并用罗丹明偶联的Ulex europaeus I(UEA1，一种人特异性内皮细胞标志物)染色过夜。彻底清洗凝胶，并用核标志物DAPI复染。凝胶在LeicaSP8共聚焦显微镜上成像。图14A在低倍率(10倍物镜)下显示14天后从J1衍生的Meso-3DVasculonoid VPC2类血管的嵌入聚合体延伸出广泛的血管网络。
接着，将解离的(或“单细胞”)和未解离的(或类血管或“复数”)Meso-3DVasculonoid VPC2细胞接种到100μl培养基中的组织培养物处理的96孔板(每孔约14,000个单细胞)或超低附着96孔板(每孔约70个复数细胞或类血管，相当于每孔约14,000个单细胞)中。为了测试CLI模拟条件(即高血糖和/或缺氧)，在常氧(20％O2)或缺氧(5％O2)的氧气条件下，用作为对照的含有5.5mM D-葡萄糖的完全
Figure BDA0003618915260000626
基本培养基(生命线细胞技术(
Figure BDA0003618915260000623
Cell Technology)公司，马里兰州弗雷德里克)、或用含有高浓度葡萄糖(30mM)的完全
Figure BDA0003618915260000624
基本培养基培养细胞72小时。72小时后，按照制造商的指示，通过用100μl的CellTiter-
Figure BDA0003618915260000625
试剂(普洛麦格(Promega)公司，威斯康星州麦迪逊)将每个孔孵育45分钟，来测量相对细胞存活率。在每种氧气条件下，测量单细胞和复数细胞的发光，并将其标准化为5.5mM对照，作为细胞存活率的读数。图14B显示，当这些类血管在解冻后如上所述在常氧(20％O2)或缺氧(5％O2)的体外CLI模拟条件下培养时，与作为单细胞冷冻保存的J1衍生的Meso-3D Vasculonoid VPC2细胞相比，类血管显示出更好的细胞存活率。
为了测试体内疗效，在如实施例9中详述地诱导后肢缺血后，将GMP1-Meso3D VPCs作为单细胞(Meso3D s.c.；每只动物共计100万个单细胞)或作为未解离的复数细胞或类血管(Meso3D vasculonoid；每只动物25000个，大致相当于每只动物共计100万个单细胞)注射到Balb/c裸鼠(每组n＝15)的股四头肌中。手术后立即通过激光多普勒仪灌注成像(LDPI)评估血流，此后每周一次，直到第64天。图14C显示在整个研究过程中，与载剂治疗组(仅GS2培养基)相比，给予单细胞或类血管后，血流有统计学上显著的改善；双向方差分析，然后进行Tukey检验。
实施例13：Meso-3D vasculonoid VPC2细胞在HLI模型中的长期效果
根据实施例2生成meso-3D vasculonoid VPC2细胞(作为解离的单细胞)，并给予实施例9所述的HLI动物模型，观察长期效果。在这些研究中，每只动物在HLI手术后，将GS2培养基中的100万个GMP1衍生的细胞(GMP1Meso3D vasculonoid VPC2、GMP1-HE和GMP1-HB)或单独的GS2培养基(载剂)注射至右股四头肌中(n＝12-19只小鼠/组)。肢体坏死和功能评分如实施例9所述进行。对于一些细胞类型，使用的是由独立分化实验产生的不止一批细胞，因此，当来自同一细胞类型的不止一批的数据被合并时，可以看到更大的动物计数。数据是平均值±sem，是两个独立和重复研究的平均值。*相对于载剂对照(GS2培养基)p<0.05，采用单向方差分析，然后进行Dunnett检验。
图15A显示在第21天，与HE和HB细胞相比，用meso-3D vasculonoid VPC2细胞治疗的动物有更好的平均坏死和功能评分。图15B显示在第63天，与载剂相比，用meso-3Dvasculonoid VPC2细胞、HE和HB细胞治疗的动物中的血流改善。股四头肌(图15C)和腓肠肌(图15D)中的CD34血管生长在所有三种细胞类型中都显示出改善，HB在第35天左右显示出更好的生长。然而，到第63天，所有三种细胞类型似乎都能类似地促进生长，其中meso-3Dvasculonoid VPC2细胞在腓肠肌中促进生长的效果比HE和HB略好。
Meso-3D vasculonoid VPC2细胞在治疗后63天之后也显示出更长期的植入(图16A)。在这项研究中，每只动物在HLI手术后，将GS2培养基中的100万个细胞或单独的GS2培养基(载剂)注射至右股四头肌中(载剂＝18只小鼠，GMP1-Meso3D批次#1＝19只小鼠，GMP1-Meso3D批次#2＝18只小鼠，GMP1-Meso3D批次#3＝19只小鼠，GMP1-HE＝19只小鼠，J1-HE＝19只小鼠)。然后在注射部位做一个纹身的标记。在第14天、第35天、第63天和第180天，收集接受了手术的右后肢的股四头肌，用PFA固定，包埋入石蜡中，并对Ku80(一种人特异性标志物)染色。每只动物分析两张图像(20倍放大)，每组至少n＝3，除了第14天的J1-HE只有n＝1。数据表示为平均数±s.e.m，由不知情的独立的组织病理学家使用以下半定量尺度得出；0＝无阳性Ku-80细胞存在；1＝存在<5个阳性Ku-80细胞；2＝存在>5个且<15个阳性Ku-80细胞；3＝存在>15个且<50个阳性Ku-80细胞；4＝存在>50个阳性Ku-80细胞。图16A显示治疗后63天和180天的植入的供体GMP1-Meso3D vasculonoid VPC2细胞，表明细胞的长期植入，尽管GMP-1衍生的HE在第180天似乎显示出更好的植入。
在第二项研究中(图16B)，每只动物在HLI手术后，将GS2培养基中的100万个细胞注射至右股四头肌中(GMP1-Meso3D vasculonoid VPC2细胞＝16只小鼠，GMP1-HE批次#1＝16只小鼠，GMP1-HE批次#2＝17只小鼠，GMP1-HB批次#1＝16只小鼠，GMP1-HB批次#2＝16只小鼠)。然后在注射部位做一个纹身的标记。在第14天、第35天和第63天，收集接受了手术的右后肢的股四头肌，用PFA固定，包埋入石蜡中，并对Ku80(一种人特异性标志物)染色。每只动物分析两张图像(20倍放大)，用Olympus BX60光学显微镜拍摄，每组至少n＝2。由不知情的独立的组织病理学家对Ku80+细胞进行定量。数据表示为平均数±s.e.m。图16B显示，到第35天和第63天，meso-3D vasculonoid VPC2细胞显示出植入，尽管有一批GMP-1衍生的HE在第63天似乎显示出更好的植入。
在另一项研究中(图16C)，每只动物在HLI手术后，将GS2培养基中的100万个细胞注射至右股四头肌中(GMP1-Meso3D vasculonoid VPC2细胞＝两个批次的24-25只小鼠)。在第63天，收集接受了手术的右后肢的股四头肌，用PFA固定，包埋入石蜡中。然后用异凝集素-B4(小鼠内皮细胞的标志物)和Ulex europaeus I(UEA1，人内皮细胞的标志物)或Ku80(泛人特定性标志物)、UEA1以及平滑肌α-肌动蛋白(SMA，小鼠和人的平滑肌标志物)对切片进行染色。用DAPI来反标记细胞核。图16C所示为在Balb/c裸鼠中的HLI手术后第63天，注射的Meso3D vasculonoid VPC2表现出长期植入(Ku80+)，形成人脉管系统(UEA1+血管)，并促进旁分泌宿主血管生长(IB4+和SMA+血管)的荧光图像。
等同方案
本领域的技术人员将认识到，或能够仅采用常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施方式的许多等同方案。这些等同方案旨在被以下权利要求所涵盖。本申请全文中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容均通过引用纳入本文。

Claims (99)

1.一种由多能干细胞产生中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)群体的方法，其中该方法包括在包含选自血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、和转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂的一种或多种因子的培养基中，在非粘附或低粘附条件下培养从多能干细胞衍生的中胚层细胞，从而产生中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)群体。
2.如权利要求1所述的方法，其中，通过在包含选自激活素-A、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、和骨形态发生蛋白4(BMP4)的一种或多种中胚层诱导性生长因子的培养基中培养多能干细胞，从多能干细胞衍生中胚层细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，meso-VPC产生为类血管(vasculonoid)。
4.如权利要求3所述的方法，其中，还包括将类血管中的meso-VPC解离为单细胞。
5.如权利要求2～4中任一项所述的方法，其中，中胚层诱导性生长因子包括激活素-A、VEGF165、FGF-2和BMP4。
6.如权利要求5所述的方法，其中，激活素-A以约5-15ng/mL的浓度使用。
7.如权利要求5所述的方法，其中，VEGF165以约5-25ng/mL的浓度使用。
8.如权利要求5所述的方法，其中，FGF-2以约5-25ng/mL的浓度使用。
9.如权利要求5所述的方法，其中，BMP4以约5-50ng/mL的浓度使用。
10.如权利要求2～9中任一项所述的方法，其中，还包括在培养约24小时后从培养基中去除激活素-A。
11.如权利要求2～10中任一项所述的方法，其中，多能干细胞在细胞外基质表面上培养。
12.如权利要求11所述的方法，其中，细胞外基质表面是Matrigel包被的表面。
13.如权利要求2～12中任一项所述的方法，其中，多能干细胞培养约3天～约5天。
14.如权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂是SB431542。
15.如权利要求1～14中任一项所述的方法，其中，一种或多种因子包括VEGF165、FGF-2、BMP4和SB431542。
16.如权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，一种或多种因子还包括毛喉素。
17.如权利要求16所述的方法，其中，毛喉素以约2-10μM的浓度使用。
18.如权利要求15～17中任一项所述的方法，其中，VEGF165以约10-50ng/mL的浓度使用。
19.如权利要求15～17中任一项所述的方法，其中，FGF-2以约10-50ng/mL的浓度使用。
20.如权利要求15～17中任一项所述的方法，其中，BMP4以约10-50ng/mL的浓度使用。
21.如权利要求14～20中任一项所述的方法，其中，SB431542以约5-20μM的浓度使用。
22.如权利要求1～21中任一项所述的方法，其中，中胚层细胞的培养进行约3天～约7天。
23.如权利要求1～22中任一项所述的方法，其中，中胚层细胞的培养在5％CO2和20％O2的常氧条件下进行。
24.如权利要求2～23中任一项所述的方法，其中，多能干细胞的培养在5％CO2和20％O2的常氧条件下进行。
25.如权利要求1～24中任一项所述的方法，其中，非粘附或低粘附条件是在超低附着表面上。
26.一种从多能干细胞产生中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)群体的方法，其中该方法包括：
(a)在包含选自血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、和骨形态发生蛋白4(BMP4)的一种或多种因子的培养基中，在细胞外基质表面上培养从多能干细胞衍生的中胚层细胞；以及
(b)在包含选自血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、和转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂的一种或多种因子的培养基中，在细胞外基质表面上培养(a)中产生的细胞，
从而产生中胚层衍生的血管祖细胞群体。
27.如权利要求26所述的方法，其中，通过在包含选自激活素-A、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、和骨形态发生蛋白4(BMP4)的一种或多种中胚层诱导性生长因子的培养基中培养多能干细胞，从多能干细胞衍生中胚层细胞。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中，该方法还包括将meso-VPC群体解离为单细胞。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中，中胚层诱导性生长因子包括激活素-A、VEGF165、FGF-2和BMP4。
30.如权利要求29所述的方法，其中，激活素-A以约5-15ng/mL的浓度使用。
31.如权利要求29所述的方法，其中，VEGF165以约5-25ng/mL的浓度使用。
32.如权利要求29所述的方法，其中，FGF-2以约5-25ng/mL的浓度使用。
33.如权利要求29所述的方法，其中，BMP4以约5-50ng/mL的浓度使用。
34.如权利要求29～33中任一项所述的方法，其中，还包括在培养约24小时后从培养基中去除激活素-A。
35.如权利要求26～34中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的细胞外基质表面是IV型胶原蛋白包被的表面。
36.如权利要求27～35中任一项所述的方法，其中，多能干细胞培养约3天～约5天。
37.如权利要求26～36中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的一种或多种因子包括VEGF165、FGF-2和BMP4。
38.如权利要求26～37中任一项所述的方法，其中，转化生长因子-β(TGF-β)I型受体小分子抑制剂是SB431542。
39.如权利要求26～38中任一项所述的方法，其中，步骤(b)中的一种或多种因子包括VEGF165、FGF-2、BMP4和SB431542。
40.如权利要求26～39中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的一种或多种因子还包括毛喉素。
41.如权利要求26～40中任一项所述的方法，其中，步骤(b)中的一种或多种因子还包括毛喉素。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中，毛喉素以约2-10μM的浓度使用。
43.如权利要求37～42中任一项所述的方法，其中，VEGF165以约10-50ng/mL的浓度使用。
44.如权利要求37～42中任一项所述的方法，其中，FGF-2以约10-50ng/mL的浓度使用。
45.如权利要求37～42中任一项所述的方法，其中，BMP4以约10-50ng/mL的浓度使用。
46.如权利要求38或39所述的方法，其中，SB431542以约5-20μM的浓度使用。
47.如权利要求26～46中任一项所述的方法，其中，步骤(a)和(b)中的细胞外基质表面是IV型胶原蛋白包被的表面。
48.如权利要求26～47中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的培养进行约1天。
49.如权利要求26～48中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的培养进行约4天～约7天。
50.如权利要求26～49中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的培养在5％CO2和20％O2的常氧条件下进行。
51.如权利要求26～50中任一项所述的方法，其中，步骤(b)中的培养在5％CO2和5％O2的缺氧条件下进行。
52.如权利要求27～51中任一项所述的方法，其中，多能干细胞的培养在5％CO2和20％O2的常氧条件下进行。
53.如权利要求1～52中任一项所述的方法，其中，多能干细胞是人胚胎干细胞。
54.如权利要求1～52中任一项所述的方法，其中，多能干细胞是人诱导性多能干细胞。
55.如权利要求1～54中任一项所述的方法，其中，meso-VPC群体表达选自CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146和PDGFRb的至少一种细胞表面标志物。
56.如权利要求55所述的方法，其中，meso-VPC群体表达细胞表面标志物(a)CD146、CD31/PECAM1和CD309/KDR；或(b)CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD146，以及(i)CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD43或PDGFRb的至少一种，(ii)CD34、CD184/CXCR4和PDGFRb；(iii)CD184/CXCR4；(iv)PDGFRb；(v)CD144和CD184/CXCR4；(vi)CD184/CXCR4和CD43；或(vii)CC184/CXCFR4。
57.如权利要求1～56中任一项所述的方法，其中，meso-VPC群体表现出有限的或检测不到的(a)选自CXCR7、CD45和NG2的一种或多种细胞表面标志物；(b)CXCR7、CD45和NG2；或(c)选自CD144、CD34、CD184/CXCR4、CXCR7、CD43、CD45、PDGFRb和NG2的一种或多种细胞表面标志物。
58.如权利要求1～57中任一项所述的方法，其中，meso-VPC群体表达选自hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p和miR-199a-3p的至少一种miRNA标志物。
59.如权利要求1～58中任一项所述的方法，其中，meso-VPC群体表现出有限的或不表达选自hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p的至少一种miRNA标志物。
60.如权利要求1～59中任一项所述的方法，其中，meso-VPC群体表达hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p和hsa-miR-542-5p。
61.如权利要求1～60中任一项所述的方法，其中，meso-VPC群体包含至少一种meso-VPC，其对选自mir126、mir125a-5p、mir24和mir483-5p的至少一种miRNA标志物呈阳性。
62.如权利要求61所述的方法，其中，miRNA标志物是mir483-5p。
63.如权利要求1～62所述的方法，其中，meso-VPC群体包含至少一种meso-VPC，其表现出有限的或不表达选自mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p和mir133a的至少一种miRNA标志物。
64.如权利要求1～63中任一项所述的方法，其中，还包括通过meso-VPC的分化产生血管内皮细胞。
65.如权利要求64所述的方法，其中，分化在纤连蛋白包被的表面上进行。
66.一种组合物，包含通过权利要求1～63中任一项所述的方法产生的meso-VPC群体。
67.包含通过从多能干细胞衍生的中胚层细胞的体外分化产生的中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)群体的组合物，其中，meso-VPC群体表达选自CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146和PDGFRb的至少一种细胞表面标志物。
68.如权利要求67所述的组合物，其中，meso-VPC群体表达选自CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD43、CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD146和PDGFRb的至少两种细胞表面标志物。
69.如权利要求67～68中任一项所述的组合物，其中，meso-VPC群体表达细胞表面标志物CD146、CD31/PECAM1和CD309/KDR。
70.如权利要求67～69中任一项所述的组合物，其中，meso-VPC群体表达细胞表面标志物CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD146，以及(i)CD144、CD34、CD184/CXCR4、CD43或PDGFRb的至少一种，(ii)CD34、CD184/CXCR4和PDGFRb；(iii)CD184/CXCR4；(iv)PDGFRb；(v)CD144和CD184/CXCR4；(vi)CD184/CXCR4和CD43；或(vii)CC184/CXCFR4。
71.如权利要求67～70中任一项所述的组合物，其中，meso-VPC群体表现出有限的或检测不到的(a)选自CXCR7、CD45和NG2的一种或多种细胞表面标志物；(b)CXCR7、CD45和NG2；或(c)选自CD144、CD34、CD184/CXCR4、CXCR7、CD43、CD45、PDGFRb和NG2的一种或多种细胞表面标志物。
72.如权利要求67～71中任一项所述的组合物，其中，meso-VPC群体表达选自hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-483-3p、miR 214、miR 335-3p和miR-199a-3p的至少一种miRNA标志物。
73.如权利要求67～72中任一项所述的组合物，其中，meso-VPC群体表现出有限的或不表达选自hsa-let-7e-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p的至少一种miRNA标志物。
74.如权利要求67～73中任一项所述的组合物，其中，meso-VPC群体表达hsa-miR-3917、hsa-miR-450a-2-3p和hsa-miR-542-5p。
75.如权利要求67～74中任一项所述的组合物，其中，meso-VPC群体包含meso-VPC的类血管。
76.如权利要求67～74中任一项所述的组合物，其中，meso-VPC群体包含meso-VPC的单细胞。
77.通过从多能干细胞衍生的中胚层细胞的体外分化产生的meso-VPC，其中，meso-VPC对选自mir126、mir125a-5p、mir24和mir483-5p的至少一种miRNA标志物呈阳性。
78.如权利要求77所述的meso-VPC，其中，meso-VPC对miRNA标志物mir483-5p呈阳性。
79.如权利要求77或78所述的meso-VPC，其中，meso-VPC对选自mir367、mir302a、mir302b、mir302c、mirLet7-e、mir223、mir99a、mir142-3p和mir133a的至少一种miRNA标志物呈阴性。
80.如权利要求66～79中任一项所述的组合物或meso-VPC，其中，多能干细胞是人多能干细胞。
81.如权利要求80所述的组合物或meso-VPC，其中，多能干细胞是人胚胎干细胞(hESC)。
82.如权利要求80所述的组合物或meso-VPC，其中，多能干细胞是人诱导性多能干细胞(hiPSC)。
83.如权利要求66～82中任一项所述的组合物或meso-VPC，其中，多能干细胞首先分化为中胚层细胞，而中胚层细胞又分化为meso-VPC。
84.一种药物组合物，其包含权利要求66～83中任一项所述的组合物或meso-VPC。
85.治疗对象中的血管疾病或病症的方法，该方法包括给予对象有效量的权利要求66～83中任一项所述的组合物或中胚层衍生的血管祖细胞(meso-VPC)、或权利要求83所述的药物组合物，以治疗对象中的血管疾病或病症。
86.如权利要求85所述的方法，其中，血管疾病或病症选自动脉粥样硬化、外周动脉疾病(PAD)、颈动脉疾病、静脉疾病、血栓、主动脉瘤、纤维肌性发育不良、淋巴水肿和血管损伤。
87.如权利要求86所述的方法，其中，外周动脉疾病选自严重肢体缺血、肠缺血综合征、肾动脉疾病、腘动脉陷迫综合征、雷诺现象、柏格氏病。
88.如权利要求87所述的方法，其中，外周动脉疾病是严重肢体缺血。
89.如权利要求85～88中任一项所述的方法，其中，所述组合物、所述meso-VPC、或所述药物组合物肌肉内或全身给药。
90.如权利要求85～89中任一项所述的方法，其中，所述组合物、所述meso-VPC、或所述药物组合物的给药增加对象中的血流。
91.如权利要求85～90中任一项所述的方法，其中，所述组合物、所述meso-VPC、或所述药物组合物的给药促进对象中的血管生成和/或血管发生。
92.如权利要求85～91中任一项所述的方法，其中，所述组合物、所述meso-VPC、或所述药物组合物的给药减轻对象中的缺血严重程度。
93.如权利要求85～92中任一项所述的方法，其中，所述组合物、所述meso-VPC、或所述药物组合物的给药减小对象中的肢体坏死面积。
94.如权利要求85～93中任一项所述的方法，其中，给予对象约1x104～约1x1013的meso-VPC。
95.如权利要求85～94中任一项所述的方法，其中，meso-VPC在药物组合物中给药。
96.如权利要求95所述的方法，其中，药物组合物包含：
(a)缓冲液，将溶液维持在生理pH；
(b)至少5％(w/v)的葡萄糖；以及
(c)渗透活性剂，将溶液维持在生理渗透压。
97.如权利要求96所述的方法，其中，葡萄糖是D-葡萄糖(右旋糖)。
98.如权利要求96所述的方法，其中，渗透活性剂是盐。
99.如权利要求96所述的方法，其中，盐是氯化钠。
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