KR20220113422A - 내피에서 조혈로의 이행 동안 최종 계통 선별화를 유도하는 대사작용 - Google Patents

내피에서 조혈로의 이행 동안 최종 계통 선별화를 유도하는 대사작용 Download PDF

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Abstract

분화하는 iPS 세포, 조혈세포의 전구체로 직접 재프로그래밍된 세포, 최종 조혈세포로 직접 재프로그래밍된 세포, 및 골수, 제대혈, 태반 또는 동원된 말초혈액 유래의 성체 또는 신생아 조혈세포 중 적어도 하나를 포함하는 공급원 세포로부터 최종 조혈세포를 생성하는 방법으로서, 대사 조절인자를 사용하여 공급원 세포의 트리카르복실산 회로를 활성화시키는 단계를 포함하는, 최종 조혈세포를 생성하는 방법. 다른 방법은, 분화하는 iPS 세포, 조혈세포의 전구체로 직접 재프로그래밍된 세포, 최종 조혈세포로 직접 재프로그래밍된 세포, 및 골수, 제대혈, 태반 또는 동원된 말초혈액 유래의 성체 또는 신생아 조혈세포 중 적어도 하나를 포함하는 공급원 세포로부터 원시 조혈세포를 생성하는 방법으로서, 대사 조절인자를 사용하여 공급원 세포의 트리카르복실산 회로를 저해하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태는, 최종 조혈세포 또는 원시 조혈세포의 생산을 위한 공급원 세포의 트리카르복실산 회로 활성화용 대사 조절인자에 관한 것이다.

Description

내피에서 조혈로의 이행 동안 최종 계통 선별화를 유도하는 대사작용
임의의 선행 출원에 대한 참조로서의 인용
해외 또는 국내 우선권 주장이 본 출원과 함께 제출된 출원 데이터 시트에서 확인되는 임의의 및 모든 출원은, 37 CFR 1.57에 따라 본원에 참조로서 인용된다.
기술분야
공급원 세포로부터 최종 조혈세포(definitive hematopoietic cell)를 생성하는 방법으로서, 여기서 최종 조혈세포는 분화하는 iPS 세포, 조혈세포의 전구체로 직접 재프로그래밍된 세포, 최종 조혈세포로 직접 재프로그래밍된 세포, 및 골수, 제대혈, 태반 또는 동원된 말초혈액 유래의 성체 또는 신생아 조혈세포 중 적어도 하나를 포함하며, 대사 조절인자를 사용하여 공급원 세포의 트리카르복실산 회로를 활성화시키는 단계를 포함하는, 최종 조혈세포를 생성하는 방법.
발달중인 배아에서, 원시(primitive) 조혈작용은 난황낭(YS: yolk sac)의 혈도에서 적혈구, 거핵구 및 대식세포를 만들어낸다(문헌[Palis, J. et al. Development 126, 5073-5084 (1999)]). 다음으로, 조혈작용의 최종 웨이브(wave)는 더 성숙한 적혈구-골수계(문헌[Palis, J. et al. Development 126, 5073-5084 (1999)]) 및 림프계(문헌[Yoder, M. C. et al. Immunity 7, 335-344 (1997)]; 및 문헌[Boiers, C. et al. Cell Stem Cell 13, 535-548 (2013)]) 선구체를 생산한다. 카네기 발생기(CS: Carnegie stage) 12기 내지 13기쯤, 조혈줄기세포(HSC: hematopoietic stem cell)는 두 번째 최종 조혈 웨이브를 통해 대동맥-생식샘-중신(AGM: aorta-gonad-mesonephros) 영역에서 나타난다(문헌[Medvinsky, A. & Dzierzak, E. Cell 86, 897-906 (1996)]; 및 문헌[Ivanovs, A. et al. J Exp Med 208, 2417-2427 (2011)]). 원시 적혈구, 적혈구-골수계 선구체(EMP) 및 HSC는 내피에서 조혈로의 이행(EHT: endothelial to hematopoietic transition)(문헌[Boisset, J.-C. et al. Nature 464, 116-120 (2010)]; 및 문헌[Kissa, K. & Herbomel, P. Nature 464, 112-115 (2010)])으로 공지된 과정을 통해 조혈성 내피(HE) 세포(문헌[Lancrin, C. et al. Nature 457, 892-895 (2009)]; 문헌[Frame, J. M. et al. STEM CELLS 34, 431-444 (2016)] 및 문헌[Stefanska, M. et al. Sci Rep 7, 1-10 (2017)])에서 파생된다. 배아 발달 동안 조혈 출현에 대한 연구는 몇몇 동물 모델에서 공간적 및 시간적 맥락에서 EHT를 설명했을 뿐 아니라(문헌[Boisset, J.-C. et al. Nature 464, 116-120 (2010)]; 및 문헌[Kissa, K. & Herbomel, P. Nature 464, 112-115 (2010)]), 이러한 과정을 조절하는 성장인자와 전사인자에 대한 심도 있는 이해로 이어졌다(문헌[Chen, M. J. et al. Nature 457, 887-891 (2009)]; 문헌[Zhou, F. et al. Nature 533, 487-492 (2016)]; 및 문헌[Swiers, G. et al. Nat Commun 4, 2924 (2013)]). 하지만, 조혈세포의 출현에서 대사산물과 대사경로의 역할은 발달 동안 평가되지 않았다.
대사경로가 세포 운명을 제어할 수 있다는 사실을 향하고 있는 증거가 증가하고 있다(문헌[Oburoglu, L. et al. Cell Stem Cell 15, 169-184 (2014)]; 문헌[Moussaieff, A. et al. Cell Metabolism 21, 392-402 (2015)]; 및 문헌[Folmes, C. D. L. et al. Cell Metabolism 14, 264-271 (2011)]). 구체적으로, 골수 HSC의 운명은 몇몇 대사경로에 의해 조절된다. 골수의 저산소 적소(niche)는 HSC가 최소 에너지 제공 경로인 혐기성 당분해를 활성화시키도록 만들고, HSC의 휴지 상태(quiescent state)를 보장한다(문헌[Takubo, K. et al. Cell Stem Cell 12, 49-61 (2013)]). HSC 자가 재생 및 유지는 지방산 산화에 의존하며(문헌[Ito, K. et al. Nat Med 18, 1350-1358 (2012)]), 분화하는 HSC는 에너지 요건을 충족시키기 위해 산화적 인산화(OXPHOS)로 전환된다(문헌[Yu, W.-M. et al. Cell Stem Cell 12, 62-74 (2013)]; 및 문헌[Simsek, T. et al. Cell Stem Cell 7, 380-390 (2010)]).
EHT 과정은 다능성 줄기세포(PSC: pluripotent stem cell)를 사용하여 시험관내에서 광범위하게 모델링되었으며, 이러한 맥락에서 발생하는 HE 중간체는 원시 조혈세포와 최종 조혈세포를 모두 만들어낼 수 있다(문헌[Garcia-Alegria, E. et al. Stem Cell Reports 11, 1061-1074 (2018)]). 다수의 연구는, 치료용으로 사용하기 위한 기능적이고 이식 가능한 HSC를 생산하고자 하는 노력의 일환으로, 시험관내에서 전적으로 최종 형태의 잠재력이 있는 HE를 얻는 데 초점이 맞추어져 왔다(문헌[Kennedy, M. et al. Cell Reports 2, 1722-1735 (2012)]; 문헌[Sugimura, R. et al. Nature 545, 432-438 (2017)]; 문헌[Ng, E. S. et al. Nature Biotechnology 34, 1168-1179 (2016)]; 및 문헌[Sturgeon, C. M. et al. Nat Biotech 32, 554-561 (2014)]).
EHT가 융합막(tight-junction) 용해, 즉 줄기세포 유사 특성의 획득을 의미하고, 이행 세포(transitioning cell)에서 광범위한 전사 및 표현형 변화를 야기하기 때문에(문헌[Zhou, F. et al. Nature 533, 487-492 (2016)]; 문헌[Swiers, G. et al. Nat Commun 4, 2924 (2013)]; 및 문헌[Guibentif, C. et al. Cell Reports 19, 10-19 (2017)]), 대사는 이러한 과정을 조절하는 데 기여할 수 있다. 이전에, 동물 모델에서, HSC의 출현은 ATP 수준 및 이용 가능성에 의해 엄격하게 제어되는 아데노신 신호전달과 PKA-CREB 경로에 의해 조절되는 것으로 나타났으며(문헌[Jing, L. et al. J Exp Med 212, 649-663 (2015)]; 및 문헌[Kim, P. G. et al. J Exp Med 212, 633-648 (2015)]), 이는 EHT 동안 에너지 수요의 변화를 시사한다. 나아가, 글루코오스 대사는 제브라피시(zebrafish)에서 HSC 출현을 유도하는 것으로 나타났다(문헌[Harris, J. M. et al. Blood 121, 2483-2493 (2013)]).
당업자가 이해하는 바와 같이, 현재, 100가지가 넘는 혈액학적 질환, 악성종양 및 기타 생명을 위협하는 적응증의 상용 치료에 필요한 이식 또는 수혈 절차를 위해 적합하게 일치된 조혈세포의 이용 가능성에 제한이 있다. 조혈세포와 조혈줄기세포의 현재 공급원은, 전형적으로 골수, 제대혈 및 동원된 말초혈액에 대한 줄기세포 공여자 명부 및 헌혈 캠페인(예를 들어, 적십자)의 일부로 건강한 개인의 공여에 의존하기 때문에, 제한적이다. 이러한 적합한 공여자 혈액 제제의 부족은 필요한 치료를 수행할 수 있는 능력을 제한하기 때문에, 악성종양의 치료를 위해 조혈줄기세포 이식을 필요로 하는 환자의 최대 30%는 적합하게 일치하는 공여자가 없으며, 시간 및 지리적 영역에 따라 수요가 다르기 때문에 수혈 가능한 혈구의 복잡한 수송 인프라와 선의의 헌혈 캠페인이 공급 부족 문제를 해결한다. 따라서, 조혈줄기세포 제제와 수혈 가능한 혈구 제제를 모두 획득하기 위한 더 강력하고 신뢰할 수 있는 시스템에 대한 상당한 요구가 존재한다.
수혜 환자에게의 감염 전파와 같은 공여자 유래 제제 사용과 관련된 위험, 및 이식편대숙주병과 같은 조직 거부 합병증이 또한 존재하며, 이들 둘 모두 잠재적으로 생명을 위협한다. 따라서, 감염의 전파 위험 없이 수혜자에게 완벽하게 일치할 수 있는, 실질적으로 무제한적인 자가 재생 능력을 갖는 이러한 조혈세포의 대안적인 공급원을 개발하는 것이 필요하다.
본 발명자들은, 대사 조절이 HE 세포가 최종 조혈 운명을 우선적으로 채택하도록 유도한다고 결정하였다. 본 발명자들은, 글루코오스, 글루타민 및 피루베이트에 의해 연료가 공급되는 인간 EHT 동안 대사의 점진적이고 전반적인 증가를 보여준다. 이러한 영양소의 사용을 분석하는 방식으로, 본 발명자들은 조혈 계통 선별화에서 이들의 역할을 설명하였다.
일부 양태는, 공급원 세포로부터 최종 조혈세포를 생성하는 방법으로서, 여기서 공급원 세포는
분화하는 iPS 세포,
조혈세포의 전구체로 직접 재프로그래밍된 세포,
최종 조혈세포로 직접 재프로그래밍된 세포, 및
골수, 제대혈, 태반 또는 동원된 말초혈액 유래의 성체 또는 신생아 조혈세포 중 적어도 하나를 포함하며;
대사 조절인자를 사용하여 공급원 세포의 트리카르복실산 회로를 활성화시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 피루베이트 데히드로게나아제 키나아제(PDK)를 저해한다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 피루베이트 데히드로게나아제 복합체(PDH)를 활성화시킨다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 미토콘드리아로의 피루베이트의 흡수를 증가시킨다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 아세틸 조효소 A(Ac-CoA)로의 피루베이트의 전환을 촉진시킨다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 디클로로아세테이트(DCA)이다.
일부 예에서, 공급원 세포의 배양 배지 내 디클로로아세테이트의 농도는 적어도 30 μM이다.
일부 예에서, DCA는 림프계/골수계 편향 최종 조혈작용을 유도한다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 LSD1 저해제이다.
일부 예에서, LSD1 저해제는 GSK2879552 또는 RO7051790 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 예에서, LSD1 저해제는 적혈구 계통의 최종 조혈세포를 생성한다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 α-케토글루타레이트의 생산을 증가시킨다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 글루타민이다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 조혈성 내피(HE) 공급원 세포로부터 CD43+ 세포의 생성을 유도한다.
일부 예에서, 상기 방법은 뉴클레오시드 트리포스페이트를 사용하는 것을 추가로 포함한다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 α-케토글루타레이트의 더 강력하거나 더 안정한 등가물이다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 디메틸 α-케토글루타레이트(DMK)이다.
일부 예에서, 분화하는 iPS 세포의 배양 배지 내 디메틸 α-케토글루타레이트의 농도는 적어도 17.5 μM이다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 뉴클레오시드와 조합으로 사용된다.
일부 예에서, 뉴클레오시드의 농도는 적어도 0.7 mg/L이다.
일부 예에서, 뉴클레오시드는 시티딘, 구아노신, 우리딘, 아데노신, 티미딘 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 예에서, 최종 조혈세포는 최종 조혈줄기세포를 포함한다.
일부 예에서, 최종 조혈줄기세포는 림프 및/또는 골수 재증식 잠재력이 있다.
일부 예에서, 최종 조혈세포는 최종 림프계 및/또는 골수계 세포를 포함한다.
일부 예에서, 최종 림프계세포는 T세포, 종양세포를 표적으로 하는 변형된 T세포, B세포, NK세포 및 NKT세포 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 예에서, 최종 조혈세포는 비만세포를 포함한다.
일부 예에서, 최종 조혈세포는 성체 헤모글로빈의 생산에 적합한 적혈구를 포함한다.
일부 예에서, 조혈세포의 전구체로 직접 재프로그래밍된 세포는 중배엽 전구세포, 조혈성 내피세포, 및 내피에서 조혈로의 이행을 거치는 세포 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 예에서, 성체 또는 신생아 조혈세포는 조혈줄기세포 또는 조혈전구세포를 포함한다.
일부 양태는, 공급원 세포로부터 원시 조혈세포를 생성하는 방법으로서, 여기서 공급원 세포는
분화하는 iPS 세포,
조혈세포의 전구체로 직접 재프로그래밍된 세포,
최종 조혈세포로 직접 재프로그래밍된 세포, 및
골수, 제대혈, 태반 또는 동원된 말초혈액 유래의 성체 또는 신생아 조혈세포 중 적어도 하나를 포함하며;
대사 조절인자를 사용하여 공급원 세포의 트리카르복실산 회로를 저해하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 미토콘드리아로의 피루베이트의 흡수를 저해한다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 Ac-CoA로의 피루베이트의 전환을 저해한다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 MPC를 저해한다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 UK5099이다.
일부 예에서, 공급원 세포의 배양 배지 내 UK5099의 농도는 적어도 100 nM이다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 PDH를 저해한다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 1-아미노에틸포스핀산(1-AA)이다.
일부 예에서, 공급원 세포의 배양 배지 내 1-아미노에틸포스핀산의 농도는 적어도 4 μM이다.
일부 양태는, 최종 조혈세포의 생산을 위한 공급원 세포의 트리카르복실산 회로 활성화용 대사 조절인자에 관한 것이다.
일부 양태는, 원시 조혈세포의 생산을 위한 공급원 세포의 트리카르복실산 회로 활성화용 대사 조절인자에 관한 것이다.
당업자는, 하기 도면이 하기 기재되는 바와 같은 정보를 보여주는 데이터와 다이어그램의 예를 나타낸다는 것을 이해할 것이다.
도 1a는, iPSC 유래 세포가 1차 인간 EHT 집단과 일치하는 데이터의 예이다. iPSC 유래 HE 세포, EHT 세포 및 HSC 유사 세포를 분류하고, 1일 동안 배양하고, scRNAseq로 분석하였으며; HE 세포, EHT 세포 및 HSC 유사 세포의 scRNAseq 데이터의 UMAP 가시화를 표현형 분류에 따라 착색하여 나타내었다.
도 1b는, iPSC 유래 세포가 1차 인간 EHT 집단과 일치하는 데이터의 예이다. 이러한 도면에는, HE 집단, EHT 집단 및 HSC 유사 집단에서 내피 유전자와 조혈 유전자의 발현 수준을 보여주는 히트맵(heatmap)이 포함되어 있다.
도 1c는, iPSC 유래 세포가 1차 인간 EHT 집단과 일치하는 데이터의 예이다. 카네기 발생기(CS) 1333기의 AEC/Hem 클러스터 세포를 보여주는 UMAP는 도 1a의 HE 집단, EHT 집단 및 HSC 유사 집단과 일치한다.
도 1d는, iPSC 유래 세포가 1차 인간 EHT 집단과 일치하는 데이터의 예이다. 히트맵은 도 1c에 도시된 바와 같은 HE 집단, EHT 집단 및 HSC 유사 집단에 대해 매핑된 AEC/Hem 클러스터 세포에서의 내피 유전자와 조혈 유전자의 발현 수준을 보여준다.
도 2는, EHT 동안 당분해, 산소 소비 및 미토콘드리아 활성이 증가하는 데이터의 예이다. (도 2a) 세포외 산성화율(ECAR: extracellular acidification rate)을 HE 세포(n=24), EHT 세포(n=13) 및 HSC 유사 세포(n=8)에서 측정하였으며, 세포외 플럭스(flux) 분석으로 당분해 플럭스를 평가하였다. 막대 그래프는 표시된 과정의 상대 수준 ± s.e.m.을 보여준다(7회(HE, EHT) 또는 3회(HSC 유사)의 독립 실험, 독립표본 t검정). (도 2b) scRNAseq를 통해 검출된 당분해 효소의 유전자 발현 수준을, 발현의 백분율 표현(점의 크기)과 평균 발현 수준(색상 강도)에 기반하여 보여주는 점 도표. (도 2c) FACS로 분류된 HE 세포를 2-DG(1 mM)의 존재 유무 하에서 계대배양하였다. 계대배양 3일차 대표적인 FSC-A/CD43 플롯이 제시되어 있다(n=7, 막대 그래프는 확장된 데이터 도 3d 참조). (도 2d) 계대배양 3일차 대표적인 GPA/CD43 플롯과 계대배양 6일차 CD45/CD43 플롯이 제시되어 있다(n=6 및 n=5, 막대 그래프는 확장된 데이터 도 3e 참조). (도 2e) 계대배양 3일차 CellTrace Violet(CTV) 형광을 유세포분석으로 평가하였다(n=4 중 대표적인 것). (도 2f) 10일차에 유세포분석으로 HE 세포, EHT 세포 및 HSC 유사 세포에 대한 2-NBDG 흡수를 측정하고, 평균 MFI 수준 ± s.e.m.를 나타내었다(n=4, 대응표본 t검정). (도 2g) 산소 소비율(OCR)을 HE 세포와 EHT 세포(n=7)에서 측정하고, 세포외 플럭스 분석으로 산화적 인산화를 평가하였다. 막대 그래프는 표시된 과정의 상대 수준 ± s.e.m.을 보여준다(3회 독립 실험, 독립표본 t검정). (도 2h) 10일차에 유세포분석으로 HE 세포, EHT 세포 및 HSC 유사 세포에 대한 TMRE 형광을, 100 μM FCCP 처리 유무 하에서, 측정하고, HE와 비교한 MFI - MFI FMO 수준 ± s.e.m.를 나타내었다(n=5, 대응표본 t검정). (도 2i) 10일차에 HE 세포(n=6), EHT 세포(n=5) 및 HSC 유사 세포(n=4)에서 기초 OCR을 측정하였으며, 막대 그래프는 HE와 비교한 평균 수준 ± s.e.m.을 보여준다(대응표본 t검정). (도 2j) 계대배양 3일차에 TMRE(적색)로 염색한 HE 세포와 HSC 유사 세포의 생세포 이미지화. 대표적인 병합된 명시야/TMRE 및 TMRE 이미지가 제시되어 있다. 축척 막대, 100 μm. 막대 그래프는 모든 실험에 걸친 모든 복제 웰의 TMRE 염색 강도의 평균을 보여준다(HE 방추세포, n=9; HE 원형세포, n=9; HSC 유사 세포, n=6, 다중비교를 통한 Kruskal- Wallis 검정). (도 2k) scRNAseq를 통해 검출된 TCA 회로 효소의 유전자 발현 수준을, 발현의 백분율 표현(점의 크기)과 평균 발현 수준(색상 강도)에 기반하여 보여주는 점 도표. ns, 유의하지 않음, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 3은, HE의 조혈 선별화가 글루타민 이화작용에 의존하는 데이터의 예이다. FACS로 분류된 HE 세포를 표시된 화합물과 함께 글루타민 미함유 배지에서 계대배양하였다. (도 3a) FSC-A/CD43 및 CD34/CD43에 대한 계대배양 3일차 대표적인 플롯이 제시되어 있다(n=3, 막대 그래프는 도 11g 참조). (도 3b) 계대배양 3일차 CellTrace Violet(CTV) 형광을 유세포분석으로 평가하였다(n=4, 막대 그래프는 도 11h 참조). (도 3c) HE 세포에서 유래한 GPA+ 집단(주황색) 및 CD45+ 집단(청색)에 대한 대표적인 3일차 CTV 플롯이 제시되어 있다(n=6, 그래프는 도 11i 참조). (도 3d) 계대배양 6일차 CD43+ 집단에서 GPA 또는 CD45를 발현하는 세포의 백분율 ± s.e.m.가 도시되어 있다(대조군, n=7; DMK, n=6; DMK+nucl, n=5; DMK+nucl+NEAA, n=3; 대조군을 이용한 대응표본 t검정, 플롯은 확장된 데이터 도 5j 참조). (도 3e) 3일 계대배양한 HE 세포와 OP9-DL1 기질의 35일 공동배양 후 얻은 CD45+CD56+ 세포의 백분율 ± s.e.m. 3일 계대배양 동안, HE 세포를 표시된 화합물로 처리하였다. (대조군 및 DMK, n=5; -GLN, n=4; -GLN+nucl 및 DMK+nucl, n=3, 플롯은 확장된 데이터 도 5k 참조). ns, 유의하지 않음, *p<0.05, **p<0.01.
도 4는, HE 세포에서 미토콘드리아로의 피루베이트 플럭스의 증가가 최종 조혈 운명을 유리하게 하는 데이터의 예이다. (도 4a) 피루베이트는 미토콘드리아 피루베이트 담체(MPC, 저해제: UK5099)를 통해 미토콘드리아로 수송되고, 피루베이트 데히드로게나아제 복합체(PDH, 저해제: 1-AA)에 의해 아세틸-coA로 전환된다. 피루베이트 데히드로게나아제 키나아제(PDK, 저해제: DCA)는 PDH 활성을 음의 상관관계로 조절한다. (도 4b 내지 도 4e) FACS로 분류된 HE 세포를 UK5099(10 μM) 또는 DCA(3 mM)의 존재 유무 하에서 계대배양하였다. 계대배양 3일차 대표적인 GPA/CD43 플롯(도 4b, 도 4d)과 계대배양 6일차 대표적인 CD45/CD43 플롯(도 4c, 도 4e)이 제시되어 있다(상응하는 막대 그래프는 도 12a, 도 12f, 도 12k 및 도 12m 참조). (도 4f) 표시된 화합물과 함께 6일 동안 계대배양한 HE 세포에서 얻은 대조군 조건과 비교한, CFU-E 대 CFU-G, M, GM 집락의 비, 백분율은 확장된 데이터 도 6r 참조(n=5, 대응표본 t검정). (도 4g) 미처리된 세포와 비교한, UK5099(10 μM) 또는 DCA(3 mM)로 처리된 HE 세포에서 얻은 CFU에서 KLF1로 정규화된 HBE1 또는 HBG1-2 전사체 발현의 배수 변화. (도 4h) 3일 계대배양한 HE 세포와 OP9-DL1 기질의 35일 공동배양 후 얻은 CD45+CD56+ 세포의 백분율 ± s.e.m. 3일 계대배양 동안, HE 세포를 표시된 화합물로 처리하였다. (n=3, 일원분산분석(one-way ANOVA) 검정, 플롯은 도 12u 참조). (도 4i 내지 도 4k) 임신한 마우스에 E9.5에서 UK5099 또는 DCA를 주사하고, E14.5에서 태아 간을 유세포분석으로 분석하였다. FL, 태아 간. 대조군(n=10), UK5099 처리된 조건(n=14) 및 DCA 처리된 조건(n=16)에 대한, 태아 간 내 LT-HSC(도 4i), T세포 및 B세포(도 4j)의 수준(백분율로 표시)이 제시되어 있다(일원분산분석 검정). (도 4k) 분류된 LT-HSC에서 얻은 BFU-E 집락 대 CFU-GM 집락의 비가 제시되어 있다(도 13e의 데이터도 참조)(일원분산분석 검정). CFU, 집락형성단위; BFU, 대집락형성단위; E, 적혈구; M, 대식세포; G, 과립구. (도 4l 내지 도 4p) OP9-DL1 기질과 공동배양한 HE 세포를 3일 동안 DCA로 처리하고, 조사처리된 NSG 마우스에 이식하였다. 12주차에 골수(BM)와 흉선을 수거하였다. (도 4l) 흉선 유래 huCD45+ 세포 내 인간 CD4+CD8+ 이중 양성 흉선세포의 백분율 ± s.e.m.가 제시되어 있다(대조군, n=6; DCA, n=7; 독립표본 t검정). BM 유래 huCD45+ 세포 내 인간 B세포(도 4m), CLP(도 4n) 및 CD11b+ 골수세포(도 4p)의 백분율 ± s.e.m.가 제시되어 있다(대조군, n=6; DCA, n=7; 독립표본 t검정). (도 4o) 8주차 PB 유래 huCD45+ 세포 내 CD11b+ 골수세포의 백분율 ± s.e.m.가 제시되어 있다(대조군, n=6; DCA, n=6; 독립표본 t검정). ns, 유의하지 않음, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 5는, 피루베이트 이화작용의 조절이 단세포 수준에서 HE 실행에 영향을 미치는 데이터의 예이다. (도 5a) 대조군, UK5099 처리된 HE 세포 및 DCA 처리된 HE 세포를 UMAP를 통해 함께 가시화하고, 7개의 클러스터로 나누었다. (도 5b) 7개의 클러스터에서 발현된 내피 유전자 또는 조혈 유전자의 scRNAseq 데이터를 보여주는 히트맵. (도 5c) 클러스터 6(559개의 세포)과 클러스터 7(280개의 세포)을 독립적으로 평가하였으며, 점 도표는 scRNAseq를 통해 검출된 표시된 유전자의 발현 수준을, 발현의 백분율 표현(점의 크기)과 평균 발현 수준(색상 강도)에 기반하여 보여준다. (도 5d) 점 도표는 scRNAseq를 통해 검출된, HE 대조군, HE + UK5099 및 HE + DCA 조건에 대한 클러스터 6 및 클러스터 7에서의 표시된 조혈전사인자의 발현 수준을, 발현의 백분율 표현(점의 크기)과 평균 발현 수준(색상 강도)에 기반하여 보여준다.
도 6은, 피루베이트 이화작용이 별개의 메커니즘을 통해 EHT에 영향을 미치는 데이터의 예이다. (도 6a) FACS로 분류된 HE 세포를 표시된 화합물과 함께 계대배양하고, 대조군과 비교한 3일차 CD43+GPA+ 세포 빈도 ± s.e.m.를 나타내었다(n=4, 일원분산분석 검정). (도 6b) UK5099(10 μM)의 존재 유무 하에서 sh스크램블(shScr: shScrambled) 또는 shLSD1로 HE 세포에 형질을 도입하고, shScr과 비교한 분류 다음날 및 3일차 CD43/GPA+ 세포 빈도 ± s.e.m.를 나타내었다(n=3, 일원분산분석 검정). (도 6c) 아세틸-coA는 ACC(저해제: CP-640186 또는 CP)를 통한 지질 생합성, 또는 HMGCR(저해제: 아토르바스타틴(Atorvastatin) 또는 Ato)을 통한 메발로네이트 경로/콜레스테롤 생합성의 전구체일 수 있다. (도 6d) FACS로 분류된 HE 세포를 CP(5 μM), DCA(3 mM) 또는 둘 모두와 함께 계대배양하고, 대조군과 비교한 6일차 CD43+CD45+ 세포 빈도 ± s.e.m.를 나타내었다(n=4, 일원분산분석 검정). (도 6e) 처리 2일차에 HE 세포 내 콜레스테롤 함량을 필리핀(filipin) III 염색으로 측정하였다(n=3, 대응표본 t검정). (도 6f) FACS로 분류된 HE 세포를 Ato(0.5 μM), DCA(3 mM) 또는 둘 모두와 함께 계대배양하고, 대조군과 비교한 3일차 CD43+CD45+ 세포 빈도 ± s.e.m.를 나타내었다(대조군의 경우 n=3/DCA, Ato/Ato+DCA의 경우 2개의 기술 복제를 포함하여 n=2, 일원분산분석 검정). (도 6g) 당분해는 HE 세포의 조혈 분화에 필수적이며, (UK5099 또는 shMPC1/2를 통해) 미토콘드리아로의 피루베이트 진입을 저해하면 원시 적혈구 운명이 유리해진다. DCA를 통해 미토콘드리아로의 피루베이트 플럭스를 증가시키면 아세틸-coA 생산이 증폭되는데, 이는 콜레스테롤 생합성에 연료를 공급하고, HE 세포의 최종 조혈 분화를 촉진시킨다.
도 7은, 관심 EHT 집단의 생성 및 특징분석에 대한 데이터의 예이다. (도 7a) 조혈 분화 시스템의 개략도. 배아체 설정 후, BMP4, 액티빈 A(Activin A), CHIR99021, VEGF 및 조혈 사이토카인을 순차적으로 첨가하여 HE 세포 형성과 EHT를 유도하였다. 프로토콜 8일차에 관심 세포를 분류하였다. (도 7b) 순수한 HE 세포, EHT 세포 및 HSC 유사 세포 집단을 얻기 위한 분류 전략. 분화 8일차에, 대표적인 플롯은 자성 비드 농축 후 CD34+ 세포의 수준, CD43 발현을 기반으로 한 분리, 및 HE 세포와 EHT 세포의 경우 CXCR4-CD73-와 CD90+VEcad+에 대한 추가의 게이팅; 및 HSC 유사 세포의 경우 CD90+CD38-에 대한 추가의 게이팅을 보여준다. (도 7c 및 도 7d) G0 경로(도 7c) 또는 S/G2M 경로(도 7d)를 택한 EHT 집단의 유사시간 분석, 및 집단의 풍부도를 보여주는 상응하는 막대 그래프. (도 7e) 제대혈 CD34+ 세포(CB HSC) 데이터 세트를 EHT 데이터 세트에 맵핑한 scCoGAPS, 및 패턴 가중치를 보여주는 바이올린 플롯. (도 7f 및 도 7g) EHT 데이터 세트를 인간 CS 13 등쪽대동맥 데이터 세트에 맵핑한 scCoGAPS(도 7f) 및 그 반대 경우의 scCoGAPS(도 7g), 여기서 플롯은 집단의 공편재화를 보여줌.
도 8은, HE 세포와 EHT 세포의 조혈 잠재력 검증에 대한 데이터의 예이다. (도 8a 내지 도 8c) 분류된 HE 세포와 EHT 세포를 6일 동안 계대배양하였다(n=5 중 대표적인 것). 계대배양 3일차 및 6일차에 CD43 및 CD34 마커의 수준(도 8a)과, CD43, GPA 및 CD45 마커의 수준(도 8c)을 평가하였다. (도 8b) HE 세포와 EHT 세포의 계대배양 동안 매일 웰의 대표적인 사진을 촬영하였다. 축척 막대, 100 μm. (도 8d) scRNAseq를 통해 평가된 HSC 유사 세포 내 글로빈 유전자의 발현.
도 9는, 당분해가 조혈 선별화에서 역할을 하는 데이터의 예이다. (도 9a) 대표적인 검정 데이터는 표시된 화합물의 첨가 후 뿐만 아니라 기본 조건 하에서, HE 세포와 EHT 세포에서 측정된 세포외 산성화율(ECAR)을 보여준다. 막대 그래프는 도 2a에 제시되어 있다. (도 9b) 인간 CS 13 AGM 영역에서 검출된 당분해 효소의 유전자 발현 수준(Zeng 등의 데이터)을 보여주는 점 도표로서, scRNAseq 데이터를 본 발명의 데이터 세트(도 1c에 제시되어 있음)에 맵핑하여, 발현의 백분율 표현(점의 크기)과 평균 발현 수준(색상 강도)에 기반하여 나타낸 점 도표. (도 9c) 글루코오스는 당분해를 통해 분해되고, 생성된 피루베이트는 락테이트를 만들어내거나 TCA 회로에 통합되는 아세틸-coA로 전환된다. 2-데옥시-D-글루코오스(2-DG)는 당분해 플럭스를 차단한다. (도 9d) 대조군과 비교한 계대배양 3일차 CD43+ 세포 빈도 ± s.e.m.가 제시되어 있다(n=7, 대응표본 t검정). (도 9e) 대조군과 비교한 계대배양 3일차 CD43+GPA+ 및 계대배양 6일차 CD43+CD45+ 세포 빈도 ± s.e.m.가 제시되어 있다(각각, n=6 및 n=5, 대응표본 t검정). (도 9f) 계대배양 3일차 CellTrace Violet(CTV) 형광을 유세포분석으로 평가하고, MFI 중앙값을 나타내었다(n=4, 대응표본 t검정).
도 10a는, 글루코오스 부재 하에서도 EHT 동안 OXPHOS가 증가하는 데이터의 예이다. 대표적인 검정 데이터는 표시된 화합물의 첨가 후 뿐만 아니라 기본 조건 하에서, HE 세포와 EHT 세포에서 측정된 산소 소비율(OCR)을 보여준다. 막대 그래프는 도 2g에 제시되어 있다.
도 10b는, 글루코오스 부재 하에서도 EHT 동안 OXPHOS가 증가하는 데이터의 예이다. HE 집단, EHT 집단 및 HSC 유사 집단에서 발현된 OXPHOS 관련 유전자의 scRNAseq 데이터를 보여주는 히트맵.
도 10c는, 글루코오스 부재 하에서도 EHT 동안 OXPHOS가 증가하는 데이터의 예이다. 인간 CS 13 AGM 영역에서 발현된 OXPHOS 관련 유전자의 scRNAseq 데이터(Zeng 등의 데이터)를 보여주는 히트맵으로서, scRNAseq 데이터를 본 발명의 데이터 세트(도 1c에 제시되어 있음)에 맵핑하여 나타낸 히트맵. 이러한 1차 세포 데이터 세트에서 더 많은 OXPHOS 관련 유전자가 검출 가능하다는 점에 유의해야 한다.
도 10d는, 글루코오스 부재 하에서도 EHT 동안 OXPHOS가 증가하는 데이터의 예이다. 인간 CS 13 AGM 영역에서 발현된 TCA 회로 효소의 scRNAseq 데이터(Zeng 등의 데이터)를 보여주는 점 도표로서, scRNAseq 데이터를 본 발명의 데이터 세트(도 1c에 제시되어 있음)에 맵핑하여 나타낸 점 도표.
도 10e는, 글루코오스 부재 하에서도 EHT 동안 OXPHOS가 증가하는 데이터의 예이다. 표시된 화합물의 첨가 후 뿐만 아니라 글루코오스의 부재 하에서, HE 세포와 EHT 세포(n=11)에서 OCR을 측정하였다. 상응하는 막대 그래프는 글루코오스 부재 하 및 글루코오스 주입 후 OCR의 평균 수준 ± s.e.m.를 보여준다(n=11, 3회 독립 실험, 독립표본 t검정).
도 11은, 글루타민이 초기 적혈구와 성숙한 조혈 계통을 유도하는 별개의 과정에 기여하는 데이터의 예이다. (도 11a) TCA 회로에 대한 글루타민의 기여를 보여주는 개략도. 글루타민은 글루타메이트(Glu)로 탈아미드화되고, 이어서 TCA 회로의 중간체인 α-케토글루타레이트(α-KG)로 전환된다. 글루타민의 글루타메이트로의 전환은 BPTES에 의해 특이적으로 저해되는 글루타미나아제(GLS) 효소에 의해 매개된다. (도 11b) scRNAseq를 통해 검출된 글루타민 수송체의 유전자 발현 수준을, 발현의 백분율 표현(점의 크기)과 평균 발현 수준(색상 강도)에 기반하여 보여주는 점 도표. (도 11c 및 도 11d) FACS로 분류된 HE 세포를 BPTES(25 μM)의 존재 유무 하에서 계대배양하였다. 계대배양 3일차 대표적인 플롯과 막대 그래프(도 11c)는 CD43+GPA+ 세포 빈도 ± s.e.m.를 보여준다(n=6, 대응표본 t검정). 계대배양 6일차 대표적인 플롯과 막대 그래프 (도 11d)는 CD43+CD45+ 세포 빈도 ± s.e.m.를 보여준다(n=4, 대응표본 t검정). (도 11e 및 도 11f) FACS로 분류된 HE 세포를 표시된 화합물과 함께 글루타민 미함유 배지에서 계대배양하였다. FSC-A/CD43에 대한 계대배양 3일차 대표적인 플롯(도 11e)이 제시되어 있다. 계대배양 6일차에 CD43을 발현하는 세포의 백분율 ± s.e.m.의 막대 그래프가 도시되어 있다(도 11f)(n=3, 대응표본 t검정). (도 11g) 도 3a에서의 CD34-CD43+ 세포의 백분율 ± s.e.m.에 대한 막대 그래프가 제시되어 있다(n=3, 대응표본 t검정). (도 11h) 대조군과 비교한 CTV MFI 중앙값 ± s.e.m.가 제시되어 있다(n=5, 대응표본 t검정, 도 3b의 상응하는 플롯 참조). (도 11i) 도 3c에 상응하는 CTV MFI 중앙값 ± s.e.m.가 제시되어 있다(n=6, 대응표본 t검정). (도 11j) FACS로 분류된 HE 세포를 표시된 화합물과 함께 글루타민 미함유 배지에서 계대배양하였다. FSC-A/GPA 및 FSC-A/CD45에 대한 계대배양 3일차 또는 6일차 대표적인 플롯이 제시되어 있다(그래프는 도 3d 참조). (도 11e) 3일 계대배양한 HE 세포와 OP9-DL1 기질의 35일 공동배양 후 얻은 CD45+CD56+ 세포의 백분율을 보여주는 플롯. 3일 계대배양 동안, HE 세포를 표시된 화합물로 처리하였다. ns, 유의하지 않음, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 12는, 피루베이트 이화작용이 조혈 계통 선별화를 유도하는 데이터의 예이다. (도 12a) FACS로 분류된 HE 세포, EHT 세포 또는 HSC 유사 세포를 UK5099(10 μM)의 존재 유무 하에서 계대배양하였다. 모든 집단에 대한, 대조군과 비교한 계대배양 3일차 CD43+/GPA+ 세포 빈도 ± s.e.m.가 제시되어 있다(HE, n=5; EHT, n=6; HSC 유사, n=4; 대응표본 t검정). (도 12b) FACS로 분류된 HE 세포를 1-AA(4 mM)의 존재 유무 하에서 계대배양하였다. 대조군과 비교한 계대배양 3일차 CD43+GPA+ 세포 빈도 ± s.e.m.가 제시되어 있다(n=4, 대응표본 t검정). (도 12c) sh스크램블(shScr)과 비교한, shRNA로 형질도입된 세포 내 HPRT를 기준으로 한 MPC1 및 MPC2 발현의 배수 변화가 제시되어 있다(n=3, 독립표본 t검정). Untr, 형질도입되지 않은 군. (도 12d) HE 세포에 sh스크램블(shScr), shMPC1, shMPC2 또는 둘 모두로 형질을 도입하고, shScr과 비교한 분류 다음날 및 3일차 CD43+/GPA+ 세포 빈도 ± s.e.m.를 나타내었다(n=4; 일원분산분석 검정). Untr, 형질도입되지 않은 군. (도 12e) FACS로 분류된 HE 세포를 CTV로 염색하고, UK5099(10 μM) 존재 유무 하의 계대배양 3일차 GPA+ 세포에 대한 형광을 유세포분석으로 평가하였다. n=3 중 대표적인 것. (도 12f 및 도 12g) FACS로 분류된 HE 세포, EHT 세포 또는 HSC 유사 세포를 UK5099(10 μM)의 존재 유무 하에서 계대배양하였다. 모든 집단에 대한, 대조군과 비교한 계대배양 6일차 CD43+ 세포 빈도 ± s.e.m.(도 12f) 및 CD43+CD45+ 세포 빈도 ± s.e.m.(도 12g)가 제시되어 있다(HE, n=7; EHT, n=7; HSC 유사, n=4; 대응표본 t검정). (도 12h) FACS로 분류된 HE 세포를 1-AA(4 mM)의 존재 유무 하에서 계대배양하였다. 대조군과 비교한 계대배양 6일차 CD43+ 세포 빈도 ± s.e.m. 및 CD43+CD45+ 세포 빈도 ± s.e.m.가 제시되어 있다(n=3, 대응표본 t검정). (도 12i 및 도 12j) FACS로 분류된 HE 세포를 UK5099(10 μM)의 존재 유무 하에서 3일 동안 계대배양하였다. HE 유래 CD45+ 세포에 대한 CTV(도 12i) 및 대조군과 비교한 HE 유래 HSC 유사 세포 빈도 ± s.e.m.(n=7, 대응표본 t검정)(도 12j)가 제시되어 있다. (도 12k 내지 도 12p) FACS로 분류된 HE 세포와 EHT 세포를 DCA(3 mM)의 존재 유무 하에서 계대배양하였다. 대조군과 비교한 계대배양 3일차 CD43+GPA+ 세포 빈도 ± s.e.m.(도 12k, n=3) 및 6일차 CD43+GPA+ 세포 빈도 ± s.e.m.(도 12l, HE, n=5; EHT, n=4)가 제시되어 있다(대응표본 t검정). (도 12m) 계대배양 3일차 HE 유래 GPA+ 세포에 대한 CTV가 제시되어 있다. n=3 중 대표적인 것. (도 12n) 두 가지 집단에 대한, 대조군과 비교한 계대배양 6일차 CD43+CD45+ 세포 빈도 ± s.e.m.가 제시되어 있다(HE, n=5; EHT, n=4; 대응표본 t검정). (도 12o) HE 유래 CD45+ 세포에 대한 CTV가 제시되어 있다. n=3 중 대표적인 것. (도 12p) 대조군과 비교한 HE 유래 HSC 유사 세포 빈도 ± s.e.m.(n=4, 대응표본 t검정)가 제시되어 있다. (도 12q) UK5099(10 μM) 또는 DCA(3 mM) 존재 유무 하의 계대배양 1일차 및 2일차 HE 세포에 혼입된 EdU를, 24시간 펄스 후 유세포분석으로 평가하였다(n=3). (도 12r 및 도 12s) 표시된 화합물과 함께 3일 동안(도 12r)(n=3, 이원분산분석 검정) 또는 6일 동안(도 12s)(n=5, 이원분산분석 검정) 계대배양한 HE 세포에서 얻은 CFU 검정 집락 유형의 백분율. CFU, 집락형성단위; E, 적혈구; M, 대식세포; G, 과립구; GEMM, 혼합된 것. (도 12t) 표시된 화합물과 함께 3일 동안 계대배양한 HE 세포에서 얻은 EryD 및 EryP CFU-E. 축척 막대, 100 μm. (도 12u) 미처리된 세포와 비교한, UK5099(10 μM) 또는 DCA(3 mM)로 처리된 HE 세포에서 얻은 CFU에서 KLF1로 정규화된 HBA1-2 전사체 발현의 배수 변화. (도 12v) 3일 계대배양한 HE 세포와 OP9-DL1 기질의 35일 공동배양 후 얻은 CD45+CD56+ 세포의 백분율을 보여주는 플롯. 3일 계대배양 동안, HE 세포를 표시된 화합물로 처리하였다. ns, 유의하지 않음, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 13은, 피루베이트 대사의 조절이 생체내 계통 선별화에 영향을 미치는 데이터의 예이다. (도 13a 내지 도 13c) 임신한 마우스에 E9.5에서 UK5099 또는 DCA를 주사하고, E14.5에서 태아 간을 유세포분석으로 분석하였다. FL, 태아 간. 대조군(n=10), UK5099 처리된 조건(n=14) 및 DCA 처리된 조건(n=16)에 대한, 태아 간 내 HPC-1과 HPC-2(도 13a) 및 적혈구 선구체(도 13b)의 수준(백분율로 표시)이 제시되어 있다(일원분산분석 검정). (도 13c) CD71/Ter119 염색에 따른 적혈구 분화 단계는 대조군 플롯에 제시되어 있다. 대조군, UK5099 처리된 조건 또는 DCA 처리된 조건에 대한, 각 단계의 세포의 백분율을 나타내는 대표적인 플롯이 제시되어 있다. (도 13d) E14.5 배아에서 LT-HSC를 분류하기 위한 게이팅 전략이 도시되어 있다. (도 13e) 대조군(n=4), UK5099 처리된 조건(n=8) 및 DCA 처리된 조건(n=10)에 대한, 분류된 LT-HSC에서 얻은 집락의 백분율이 제시되어 있다(일원분산분석 검정). (도 13f 내지 도 13i) 조사처리된 NSG 마우스에 3일 동안 OP9-DL1 기질과 공동배양한 상태로 보관한 DCA 처리된 HE 세포를 이식하고, 4주차, 8주차 및 12주차에 말초혈액(PB) 내 인간 세포를 평가하였다. (도 13f) huCD45+ 세포의 말초혈액(PB) 내 생착 수준(백분율로 표시됨)이 제시되어 있다(대조군, n=6; DCA, n=7). (도 13g) 이식 후 12주차에 흉선을 수거하고, 대조군 및 DCA 처리된 조건에 대한 CD4/CD8 발현 세포를 보여주는 대표적인 플롯을 나타내었다. (도 13h) 8주차 PB 유래 huCD45+ 세포 내 CD19+ 세포(B세포)의 대표적인 플롯과 백분율 ± s.e.m.가 제시되어 있다(대조군, n=6; DCA, n=6; 독립표본 t검정). (도 13i) BM 유래 huCD45+ 세포 내 인간 HSC의 백분율 ± s.e.m.가 제시되어 있다(대조군, n=6; DCA, n=7; 독립표본 t검정). ns, 유의하지 않음, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
도 14는, 분화하는 HE 세포에서 내피 유전자와 조혈 유전자의 발현을 보여주는 데이터의 예이다. 계대배양 2일차에 대조군, UK5099 처리된 HE 세포 및 DCA 처리된 HE 세포에 대한 단세포 RNAseq를 수행하였다. 도 5a의 UMAP에 대한 내피 유전자의 발현(도 14a) 또는 조혈 유전자의 발현(도 14b)을 보여주는 특징 플롯. (도 14c) 각 조건에서 클러스터 6과 클러스터 7에 속하는 세포의 백분율을 나타내는 10 x 10 점 도표. (도 14d) 14일 동안 표시된 화합물로 처리된 OP9-DL1 기질(stroma)에서 공동배양한 단일 HE 세포에서 얻은 GPA+ 클론의 수(n=6 독립 실험, 각 조건에 대해 총 552개의 웰을 스크리닝함).
도 15는, EHT 동안 피루베이트 이화작용의 기계적 분석을 보여주는 데이터의 예이다. (도 15a) FACS로 분류된 HE 세포를 TSA(60 nM)의 존재 유무 하에서 계대배양하였다. 계대배양 3일차 CD43 MFI 수준과 대표적인 CD43 히스토그램이 제시되어 있다(n=4, 대응표본 t검정). (도 15b) scRNAseq를 통해 검출된 LSD1, GFI1 및 GFI1B의 유전자 발현 수준을, 발현의 백분율 표현(점의 크기)과 평균 발현 수준(색상 강도)에 기반하여 보여주는 점 도표. (도 15c) sh스크램블(shScr)과 비교한, shRNA로 형질도입된 세포 내 HPRT를 기준으로 한 LSD1 발현의 배수 변화가 제시되어 있다(n=3, 독립표본 t검정). Untr, 형질도입되지 않은 군. (도 15d 및 도 15e) FACS로 분류된 HE 세포를 TCP(300 nM), DCA(3 mM) 또는 둘 모두와 함께 계대배양하였다. 대조군과 비교한 6일차 CD43+CD45+ 세포 빈도 ± s.e.m.(도 15d) 및 6일차 CD43+CD45+CD33+CD11b+ 세포 빈도 ± s.e.m.(도 15e)가 제시되어 있다(n=5, 일원분산분석 검정). (도 15f) 아세테이트는 ACSS2(저해제: ACSS2i)에 의해 아세틸-coA로 직접 전환될 수 있다. 아세틸-coA는 아세틸화 표시의 전구체이며, 히스톤 아세틸트랜스퍼라아제(HAT, 저해제: C646)를 통해 히스톤으로 전달된다. (도 15g 및 도 15h) FCS로 분류된 HE 세포를 ACSS2i(5 μM), DCA(3 mM) 또는 둘 모두와 함께 계대배양하거나(n=5, 일원분산분석 검정)(도 15g), 또는 C646(10 μM), DCA(3 mM) 또는 둘 모두와 함께 계대배양(n=3, 일원분산분석 검정)(도 15h)하고, 6일차 CD43+CD45+ 세포 빈도 ± s.e.m.를 나타내었다. (도 15i) FACS로 분류된 HE 세포를 커버슬립 상에서 DCA(3 mM)의 존재 유무 하에서 2일 동안 계대배양하였다. H3K9 아세틸화와, H4K5, H4K8, H4K12, H4K16 아세틸화의 염색 강도를 공초점 현미경 이미지화를 통해 평가하고, 대조군과 비교한 배수 변화를 나타내었다(n=3). (도 15j) scRNAseq를 통해 검출된 콜레스테롤 유출 경로 유전자의 유전자 발현 수준을, 발현의 백분율 표현(점의 크기)과 평균 발현 수준(색상 강도)에 기반하여 보여주는 점 도표.
배아 발달 동안, 초기에 주로 난황낭(YS)과 대동맥-생식샘-중신(AGM) 영역에서 원시 웨이브와 최종 웨이브를 통해 조혈작용이 일어나 별개의 혈액 계통이 만들어진다(문헌[Palis, J. et al. Development 126, 5073-5084 (1999)]; 및 문헌[Medvinsky, A. & Dzierzak, E. Cell 86, 897-906 (1996)]). 최초의 조혈줄기세포(HSC)는 AGM의 조혈성 내피(HE) 세포에서, 내피에서 조혈로의 이행(EHT)을 통해 나타난다(문헌[Boisset, J.-C. et al. Nature 464, 116-120 (2010)]; 및 문헌[Kissa, K. & Herbomel, P. Nature 464, 112-115 (2010)]). 성체에서, HSC 휴지, 유지 및 분화는 대사의 변화와 밀접한 관련이 있다(문헌[Takubo, K. et al. Cell Stem Cell 12, 49-61 (2013)]; 및 문헌[Yu, W.-M. et al. Cell Stem Cell 12, 62-74 (2013)]). 본원에 개시된 특정 예에서, 혈액의 새로운(de novo) 출현은 인간 EHT 동안 조혈 선별화와 계통 실행(lineage commitment)을 직접 유도하거나 조절하는 다수의 대사경로를 통해 조절될 수 있다. EHT는 당분해와 산화적 인산화(OXPHOS)의 증가와 함께, 대사 전환을 동반할 수 있다. 나아가, OXPHOS 연료인 글루타민은 조혈 발생에 필수적이며, 상이한 경로 중간체를 통해, 별개의 계통 결과를 유도할 수 있다. 시험관내 설정과 생체내 설정 둘 모두에서, 당분해 또는 OXPHOS에 대한 피루베이트 사용을 조정하면, HE 세포의 실행을, 각각, 원시 적혈구 운명 또는 림프계/골수계 잠재력이 있는 최종 운명으로 차등적으로 편중시킬 수 있다. 특정 예에서, 이러한 맥락에서 원시 또는 최종 운명으로의 실행은 별개의 메커니즘에 의해 제어될 수 있다. EHT 동안, 대사는 조혈 선별화, 계통 실행 및 원시 대 최종 운명 결정의 주요 결정인자일 수 있다. 본원에 제공된 개시내용은 시험관내에서 최종 HSC를 생성하기 위해 대사경로의 조절을 사용하는 것에 대한 기초를 제공할 수 있으며, 이에 따라, 예에서 조혈 장애 및 악성종양에 대한 치료의 매우 유용한 공급원을 제공할 수 있다.
유도된 다능성 줄기(iPS) 세포는 배아 줄기세포와 기능적으로 동등하기 때문에 무제한적인 자가 재생 잠재력이 있을 수 있고, 환자 자신의 체세포(예를 들어, 피부세포, 또는 양수 MSC 등)에서 생성될 수 있어, 이에 따라 자기로 인식될 수 있기 때문에, 이러한 이상적인 공급원 중 하나이며, 아마도 가장 실현 가능성이 있다. 일부 예에서, 환자 유래 iPS 세포로부터 조혈줄기세포를 생성하는 능력은, 조혈 장애가 있는 환자, 또는 조혈 및 일부 비(非)조혈 고형종양 암에 대한 화학요법을 받고 있는 환자의 조혈계를 재구성할 수 있는 인간 백혈구 항원(HLA) 일치 세포의 무제한적인 공급의 생성을 가능하게 한다. 일부 예에서, iPS 세포를 유도하기 위한 체세포 공급에 따라, iPS 유래 조혈줄기세포는 다음과 같은 측면에서 전통적으로 수거된 조혈줄기세포보다 우수할 수 있다: 1) 후천적 돌연변이 감소(예를 들어, iPS 세포가 신생아 세포 공급원에서 유래된 경우), 2) 무제한적 증식 능력, 3) 거부 문제 감소, 4) 존재하는 본래 종양으로부터 오염된 세포가 없음, 및 5) Crispr/Cas와 같은 기존 유전자 편집 기술을 사용하여 환자 유래의 iPS 세포주에서 선천적 돌연변이를 교정하는 능력.
나아가, 최근 iPS 세포로부터의 분화 후 악성세포를 표적화하고 파괴하도록 특별히 설계된 T세포를 생성하는 능력의 발전은, 줄기세포와 항종양 T세포의 동시 투여로 이식이 수행될 수 있음을 의미한다(문헌[Trounson et al. Nature Reviews 2016], 문헌[Vizcardo et al. Cell Stem Cell 2013]). 이와 같이, 일부 예에서, iPS 유래 조혈줄기세포를 생성하는 능력은 다수의 환자에게 공여 세포에 대한 즉각적인 요구량을 제공하며, 잠재적으로 주변 기술이 발전함에 따라 기하급수적으로 사용이 증가할 수 있다. 따라서, iPS 유래 조혈세포는 상기 언급된 생명을 위협하는 질환을 앓고 있는 환자를 위한 신뢰할 수 있고 강력한 신규한 치료 양식을 제공한다.
나아가, 환자에게의 수혈을 위해 iPS로부터 치료적으로 유용한 성숙한 또는 분화된 조혈세포를 생성하는 능력은, 아마도 대중의 필요를 충족시키는 측면에서 훨씬 더 큰 또 다른 측면이다. 일부 예에서, 부상으로 인해 혈액을 상실한 환자, 수술 동안 수혈을 필요로 하는 환자, 또는 다양한 형태의 빈혈로 고통받고 있는 환자를 위한 수혈 제제의 부족을 해결할 수 있도록 모든 혈액형에 대한 기능성 적혈구가 대량으로 생성될 수 있다. 또한, iPS에서 분화된 다른 혈구, 예컨대 항종양 활성이 있는 프로그래밍된 NK세포 또는 T세포가 또한 암의 치료에 유용할 수 있다.
크렙스(Krebs) 회로 또는 시트르산 회로로도 공지된 트리카르복실산(TCA) 회로는, 세포의 주요 에너지원이며, 호기성 호흡의 중요한 부분이다. 이러한 회로는 아세틸 조효소 A(Acetyl CoA)의 이용 가능한 화학 에너지를 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NADH)의 환원력으로 이용한다. TCA 회로는, 글루코오스가 산화되어 피루베이트를 형성한 후, 산화되고, 아세틸-coA로서 TCA 회로로 들어가는 더 큰 글루코오스 대사의 일부이다.
분화하는 iPS 세포는 배아 줄기(ES) 세포와 유사한 기능을 한다. ES 세포와 달리, iPS 세포는 치료법 및 연구를 위해 보다 용이하게 수득 가능하며, 이의 단리는 ES 세포와 같은 윤리적 문제를 수반하지 않는다. 인간 iPS 세포는 환자 자신에서 유래할 수 있기 때문에, 환자 특이적 요법을 위한 이상적인 공급원일 수 있다. 또한, iPS 세포는 신규한 약물을 스크리닝하거나 병인 및 독성의 메커니즘을 연구하는 데 사용하기 위한 인간 질환의 모델과, 정상 발달의 모델을 제공하는 방식으로 유용한 연구 도구로 사용될 수 있다.
조혈줄기세포(HSC)는 조혈작용으로 불리는 과정을 통해 이의 자손이 단핵구/대식세포, 또는 T림프구 및 B 림프구와 같은 혈구 계통을 재구성하는 미분화 세포이다. HSC는 혈구의 지속적인 재구성을 위한 이식에 있어서 이러한 세포에 대한 관심을 설명하는 무한한 자가 재생 잠재력을 가지고 있다. B세포는 체액성 면역(항체의 의해 매개되는 면역)을 담당하는 림프구의 한 유형이다.
최종 조혈줄기세포(HSC)는 개체의 전체 성체수명 동안 모든 성숙한 혈구의 지속적인 생산을 담당한다. 이는 혈액 관련 질환의 요법에 사용되는 이식 프로토콜에서 임상적으로 중요한 세포이다. 실험적으로, HSC는 조사처리된 성체 수용체의 전체 조혈계의 장기적인 재구성을 제공할 수 있다.
특정 예에서, 당분해와 TCA 회로(세포에서 에너지 생산의 주요 수단)의 특정 대사경로 조절인자는 조혈 계통 편향 유도 및 최종 조혈세포의 생성을 가능하게 하는 조혈세포의 전구체(내피에서 조혈로의 이행을 거치는 세포)에서 전사 변화를 직접 활성화시킬 수 있다. 최종 세포만이 림프계 혈액 계통(NK세포, B세포 및 T세포), 조혈줄기세포, 및 성체 헤모글로빈을 발현하는 적혈구를 만들어내기 때문에, 재프로그래밍된 세포로부터 최종 조혈세포를 생성하는 능력이 치료법에서 중요하다. 이는, 매년 전세계적으로 환자들이 받는 수백만 회의 적혈구 수혈을 포함하여, 조혈세포 기반 요법을 사용하기 위해 이미 널리 사용되거나 개발 중인 현재 공여자에 의해 제공되는 세포 유형이다.
iPS 유래 최종 조혈세포의 생산에서 상기 기재된 대사경로의 조절에 더하여, 대사 조절은 iPS 세포 이외의 세포 공급원으로부터 최종 혈액을 생성하기 위한 중요한 수단일 수 있다. 예를 들어, 최종 조혈세포의 새로운 생성은, 또한 직접 재프로그래밍된 혈구에 더하여, 중배엽 세포와 내피에서 조혈로의 이행을 거치는 세포를 포함하는 혈액의 전구체 세포로 체세포를 직접 재프로그래밍하는 방식으로 달성될 수 있다. 대사 조절은 모든 이러한 경우에 최종 혈액 생산을 유도하는 기초를 제공할 수 있다. 나아가, 이미 실행된 최종 혈구(즉, 현재 전세계적으로 조혈줄기세포 이식 요법에 사용되는 골수, 제대혈, 동원된 말초혈액 유래의 것)의 자가 재생 능력은, 치료용 조혈줄기세포 또는 다른 최종 조혈세포의 자가 재생 및 증식을 위한 대사경로의 조작을 통해 이득을 얻는다.
피루베이트 데히드로게나아제 키나아제 패밀리 멤버(PDK1, PDK2, PDK3, PDK4)는 피루베이트 데히드로게나아제 복합체(PDC)의 E1α 서브유닛의 인산화를 촉진시키는 세린 키나아제이다. 피루베이트 데히드로게나아제 키나아제는 ATP, NADH 및 아세틸-coA에 의해 활성화된다. 이는 ADP, NAD+, CoA-SH 및 피루베이트에 의해 저해된다. PDK를 저해하는 생화학물질은 조혈 계통 편향을 유도하고, 최종 조혈세포를 생산하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 피루베이트 데히드로게나아제 키나아제(PDK)의 저해제에는, 약한 CB1 수용체 아고니스트 및 PDK 저해제인 릴라민(Leelamine) HCl; 천연 플라보노이드 항증식성 키나아제 저해제인 쿼세틴 2수화물; 미토콘드리아 피루베이트 데히드로게나아제 키나아제의 저해제인 소듐 디클로로아세테이트; MAPK 저해제인 SB 203580(히드로클로라이드); 미토콘드리아 PDK(피루베이트 데히드로게나아제 키나아제) 저해제인 디클로로아세트산; 세포자멸사를 선택적으로 유도하는 세포 투과성 화합물인 PDK1/Akt/Flt 이중 경로 저해제; PDK1, TBK1 및 IKK&엡실론의 저해제인 BX 795; SB 203580; MK2의 p38 매개 활성화를 억제하는 피리딜 이미다졸 및 특정 저해제; PKA의 강력하고 특이적이며 세포 투과성 저해제인 KT 5720; 세포자멸사를 유도하는 강력하고 선택적인 PDK-1 저해제인 BX-912; 후속적으로 세포자멸사적 세포 사멸을 유도하는 강력하고 선택적인 PDK1 저해제인 GSK 2334470; 및 PDK1 저해제, 및 카스파아제 및 p53 의존적 세포자멸사의 유도제인 OSU 03012가 포함된다.
피루베이트 데히드로게나아제(PDH)는 피루베이트 데히드로게나아제 복합체(PDC)의 제1 성분 효소이다. 피루베이트 데히드로게나아제 복합체는 피루베이트 탈카르복실화(스완슨 전환(Swanson Conversion))로 불리는 과정을 통해 피루베이트를 아세틸-coA로 전환시키는 데 기여한다. 이어서, 아세틸-coA는 세포 호흡을 수행하는 시트르산 회로에 사용될 수 있다. 따라서, 피루베이트 데히드로게나아제는 당분해 대사경로를 시트르산 회로에 연결하여, NADH를 통해 에너지를 방출한다. 피루베이트 데히드로게나아제는 프룩토오스-1,6-바이포스페이트에 의해 알로스테릭적으로(allosterically) 활성화될 수 있고, NADH와 아세틸-coA에 의해 저해된다. PDH의 인산화는 피루베이트 데히드로게나아제 키나아제에 의해 매개된다. 피루베이트 데히드로게나아제 복합체(PDH)를 활성화시키는 대사 조절인자가 사용될 수 있다.
PDH 저해제인 1-아미노에틸포스핀산(1-AA)이 공급원 세포를 위한 배양 배지에 사용될 수 있으며, 여기서 1-AA의 농도는 바람직하게는 적어도 4 μM이지만, 약 0.5 μM 내지 50 μM 범위, 예를 들어 약 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, 1.0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM 및 50 μM일 수 있다.
일부 예에서, 대사 조절인자는 미토콘드리아로의 피루베이트의 흡수를 증가시키는 데 사용될 수 있다. 외부 미토콘드리아 막(OMM)을 가로지르는 피루베이트의 수송은, 수동 확산을 가능하게 하는 전압 의존적 음이온 채널/포린(porin)과 같은 대형 비(非)선택적 채널을 통해 달성된다(문헌[Benz R. Biochim Biophys Acta. 1994; 1197: 167-196]). 전압 의존적 음이온 채널(VDAC)은 OMM에서 가장 풍부한 단백질이며, 시토졸과 미토콘드리아의 막사이 공간(IMS) 사이의 대사산물/이온 수송을 위한 주요 경로로 작용한다. 이러한 채널의 결핍은 피루베이트 대사를 차단하는 것으로 제안되었다(문헌[Huizing M. et al. Pediatr Res. 1996; 39: 760-765]). 전압 의존적 음이온 채널/포린의 저해제는 피루베이트의 흡수를 저해하는 데 사용될 수 있다. 단백질 키나아제, GSK3β, PKA 및 단백질 키나아제 C 엡실론(PKCε)에 의한 VDAC 인산화는, Bax 및 tBid와 같은 다른 단백질과 VDAC의 회합을 차단하거나 저해하며, VDAC 개방도 조절한다. PKA 의존적 VDAC 인산화와 GSK3β 매개 VDAC2 인산화는 VDAC 전도도를 증가시킨다.
하지만, 내부 미토콘드리아 막(IMM)을 통한 피루베이트와 같은 대사산물의 이동은 OMM을 가로지르는 것보다 더 제한적일 수 있다. 다수의 대사산물에는 식별되고 연구된 특정 미토콘드리아 내부 막 수송체가 있다(문헌[Palmieri F. et al. Biochim Biophys Acta. 1996; 1275: 127-132]).
아세틸 조효소 A(Ac-CoA)로의 피루베이트의 전환을 촉진시키는 대사 조절인자가 사용될 수 있다. 디클로로아세테이트(DCA)는, 피루베이트 데히드로게나아제(PDH) 키나아제를 저해하여 PDH를 활성 탈인산화된 상태로 유지하는 방식으로, 크렙스 회로로의 피루베이트 진입을 촉진시킨다. 대사 조절인자가 디클로로아세테이트(DCA)인 경우, 공급원 세포의 배양 배지 내 디클로로아세테이트의 농도는 적어도 약 30 μM일 수 있고, 10 μM 내지 100 μM로 달라질 수 있으며, 약 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM 및 100 μM의 농도를 포함한다.
본원의 개시된 방법에 사용되는 대사 조절인자는 Ac-CoA로의 피루베이트의 전환을 저해할 수 있다. 예를 들어, UK-5099는 미토콘드리아 피루베이트 담체(MPC)의 강력한 저해제이다. UK-5099는 IC50 50 nM으로 피루베이트 의존적 O2 소비를 저해한다. 공급원 세포의 배양 배지 내 UK5099의 농도는 적어도 100 nM일 수 있지만, 10 nM 내지 1 μM 범위일 수 있으며, 약 10 nM, 20, nM, 30 nM, 40, nM, 50 nM, 60, nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM 및 1 μM의 농도를 포함한다.
리신 특이적 데메틸라아제 1(LSD1: Lysine-Specific Demethylase 1)은 EHT 및 특히 적혈구 계통에 사용될 수 있다. TCP, ORY-1001, GSK-2879552, IMG-7289, INCB059872, CC-90011, ORY-2001 및 RO7051790과 같은 다수의 LSD1 저해제가 보고되어 있다. 이러한 저해제 중 1종 이상이 조합으로 사용될 수 있으며, 예컨대 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상 또는 6종 이상의 조합이 사용될 수 있다.
α-케토글루타레이트의 생산을 증가시키는 대사 조절인자가 사용될 수 있다. 예를 들어, L-글루타민은 대부분의 세포와 조직에서 적절한 성장을 위한 영양적으로 반필수적인 아미노산이며, 세포의 정상적인 대사 과정을 결정하고 보호하는 데 중요한 역할을 한다. 수송 시스템의 도움으로, 세포외 L-글루타민은 원형질막을 가로지를 수 있으며, 2가지 경로, 즉, 글루타미나아제(GLS) I 및 II 경로를 통해 알파-케토글루타레이트(AKG)로 전환될 수 있다. 글루타민 대사의 다양한 단계(글루타민-AKG 축)는 몇몇 인자를 통해 조절될 수 있기 때문에(문헌[Xiao, D. et al. 2016 Amino Acids 48: 2067-2080]), 글루타민-AKG 축은 공급원 세포의 트리카르복실산 회로의 활성화를 통해 공급원 세포로부터 최종 조혈세포의 생성을 조절하는 잠재적인 표적이 된다. α-케토글루타레이트는 막 불투과성이며, 이는 통상적으로 디메틸 α-케토글루타레이트(DMKG), 트리플루오로메틸벤질 α-케토글루타레이트(TFMKG) 및 옥틸 α-케토글루타레이트(O-KG)와 같은 에스테르 형태로 세포에 첨가된다는 것을 의미한다. 이러한 화합물이 원형질막을 가로지르면, 에스테라아제에 의해 가수분해되어 α-케토글루타레이트를 생성할 수 있으며, α-케토글루타레이트는 세포 내에 포획된 채로 남아있다. 이러한 모든 화합물은 α-케토글루타레이트의 세포내 수준을 증가시킨다. 따라서, 이러한 화합물은 α-케토글루타레이트의 대사 조절인자이다. 일부 예에서, 분화하는 iPS 세포의 배양 배지 내 디메틸 α-케토글루타레이트의 농도는 적어도 약 17.5 μM일 수 있으나, 약 10 μM 내지 100 μM 범위일 수 있으며, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM 및 100 μM의 농도를 포함한다.
본원에 개시된 다양한 대사 조절인자는 뉴클레오시드와 조합으로 사용될 수 있으며, 여기서 뉴클레오시드의 농도는 적어도 0.7 mg/L일 수 있으나, 약 0.1 mg/L 내지 약 10 mg/L일 수 있으며, 약 0.1 mg/L, 0.2 mg/L, 0.3 mg/L, 0.4 mg/L, 0.5 mg/L, 0.6 mg/L, 0.7 mg/L, 0.8 mg/L, 0.9 mg/L, 1 mg/L, 1.5 mg/L, 2 mg/L, 2.5 mg/L, 1 mg/L, 1.5 mg/L, 2 mg/L, 2.5 mg/L, 1 mg/L, 1.5 mg/L, 2 mg/L, 2.5 mg/L, 3 mg/L, 3.5 mg/L, 4 mg/L, 4.5 mg/L, 5 mg/L, 5.5 mg/L, 6 mg/L, 6.5 mg/L, 7 mg/L, 7.5 mg/L, 8 mg/L, 8.5 mg/L, 9 mg/L, 9.5 mg/L, 10 mg/L 및 10.5 mg/L의 농도를 포함한다. 뉴클레오시드는 시티딘, 구아노신, 우리딘, 아데노신 및 티미딘 중 적어도 하나를 포함하지만, 임의의 가능한 조합, 예컨대 2개, 3개, 4개 또는 5개의 모든 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
실시예 1
시험관내 인간 EHT 및 조혈 분화의 개요
배양물에서 원시 조혈 웨이브와 최종 조혈 웨이브를 모두 얻기 위한 예에서, 인간 iPSC 분화 동안 다음과 같은 이전에 기재된 2개의 소분자를 조합하였다(도 7a): 최종 조혈작용을 지원하는 WNT 경로 아고니스트인 CHIR99021(문헌[Ng, E. S. et al. Nature Biotechnology 34, 1168-1179 (2016)])과, 원시 조혈작용을 촉진시키는 액티빈 A(문헌[Kennedy, M. et al. Cell Reports 2, 1722-1735 (2012)]). 이러한 변형을 이전에 기재된 조혈 분화 프로토콜(문헌[Ditadi, A. & Sturgeon, C. M. Methods 101, 65-72 (2016)])에 통합시킨 후, 조혈성 내피세포(HE), 중간 수준에서 CD43을 발현하는 이행 세포(EHT)(문헌[Guibentif, C. et al. Cell Reports 19, 10-19 (2017)]) 및 조혈 줄기 유사 세포(HSC 유사, 면역표현형 HSC)(게이팅 전략에 대해서는 도 7b 참조)를 수득하였다. 단세포 RNA 시퀀싱(scRNAseq)을 사용하여 이러한 3가지 집단을 전사적으로 특징분석하였다. UMAP 가시화는 HE 세포를 HSC 유사 세포의 원위에 배치하였으며, 여기서 EHT 세포는 이러한 2가지 집단을 연결하여, 순차적 EHT 과정을 확인시켜 주었다(도 1a). 또한, 2가지 세포 주기 경로인 G0(도 7c)과 S/G2M(도 7d)을 사용하여 데이터 세트의 유사시간 분석을 수행하였다. 두 가지 경우 모두에서, 궤적의 시작 시에는 HE 세포의 풍부함이 관찰되었고, 중간에는 EHT 세포의 풍부함이 관찰되었으며, 마지막에는 HSC 유사 세포의 풍부함이 관찰되었다(도 7c 및 도 7d; 막대 그래프). 다른 EHT 시스템에서 이전에 제시된 바와 같이(문헌[Zhou, F. et al. Nature 533, 487-492 (2016)]; 문헌[Swiers, G. et al. Nat Commun 4, 2924 (2013)]; 및 문헌[Guibentif, C. et al. Cell Reports 19, 10-19 (2017)]), HE 세포는 KDR, FLT1, CDH5와 같은 내피 마커를 발현시켰지만, 조혈 마커는 발현시키지 않았으며; 대조적으로, EHT 세포는 내피 마커와 조혈 마커를 모두 발현시켰고, HSC 유사 세포는 RUNX1, TAL1, WAS 및 SPN과 같은 조혈 마커만 발현시켰다(도 1b). 단리된 제대혈 CD34+ 세포 데이터 세트를 생성하고, scCoGAPS 패키지를 사용하여 EHT 과정 데이터 세트에 투영시켰을 때, 본 발명의 HSC 유사 클러스터를 포함하는 패턴 1과 패턴 3의 일부에 대해 가장 높은 패턴 가중치가 관찰되었으며(도 7e), 이는 제대혈 CD34+ 세포가 본원의 다른 곳에 기재된 iPSC 유래 HSC 유사 세포와 대부분의 전사체를 공유한다는 것을 증명한다. EHT 과정 데이터를 카네기 발생기(CS) 13기의 1차 인간 배아세포의 최근 공개된 scRNAseq 분석(문헌[Zeng, Y. et al. Cell Res 1-14 (2019)])과 비교하였다. 동맥 내피 및 조혈(AEC/Hem) 클러스터 내 99개의 세포 중, 50개, 36개 및 13개의 세포를, 각각, HE 집단, EHT 집단 및 HSC 유사 집단에 맵핑하였으며(도 1c); 이들은 도 1a의 EHT 데이터 세트와 유사하게 클러스터링되었다. 나아가, EHT 데이터 세트와 유사하게, HE에 맵핑된 AEC/Hem 클러스터 세포는 KDR, FLT1, CDH5와 같은 내피 마커를 발현시켰고, HSC 유사 세포에 맵핑된 세포는 RUNX1, TAL1, WAS 및 SPN과 같은 조혈 마커를 발현시켰다(도 1d). 이러한 데이터 세트를 scCoGAPS 패키지를 사용하여 Zeng 등의 인간 CS 13 등쪽대동맥 집단 데이터 세트에 맵핑하였다. HE 집단(패턴 9)의 대부분은 CS 13 AEC 및 EC 집단과 공편재화되었지만(회색 화살표), HSC 유사 집단(패턴 7 및 8)의 상당 부분은 CS 13 Hem 클러스터에 맵핑되었다(분홍색 화살표)(도 7f). 상기 데이터 세트에 CS 13 데이터의 역 맵핑을 수행한 경우, CS 13 EC 집단은 HE 세포에 근접하게 맵핑되었고(패턴 9, 회색 화살표), CS 13 Hem 클러스터는 EHT 세포와 HSC 유사 세포 모두에 근접하게 맵핑되었다(패턴 10, 녹색 화살표)(도 7g). 따라서, 예에서, 상기 시스템은 인간 EHT 과정을 성공적으로 포착하였으며, 수득된 HE 집단, EHT 집단 및 HSC 유사 집단은 CS 13의 인간 배아에서 발생하는 세포 유형과 동등한 조혈-내피 전사 시그니처(transcriptional signature)를 보유한다.
다음으로, HE 집단과 EHT 집단 둘 모두에 대한 조혈 잠재력을 확인하였다. 두 가지 세포 유형은 모두 조혈세포(CD43+)를 만들어냈다(도 8a). 계대배양 6일차에, HE 세포 또는 EHT 세포에서 유래한 거의 모든 세포(>96%)는 CD43+이었고, 대부분은 CD34 발현을 상실하였으며(>86%), 이는 성숙을 나타낸다. 두 가지 세포 배양물 모두에서, 방추형 내피세포는 둥근 조혈세포로 이의 형태가 변경되었다(도 8b). HE 유래 계대배양과 EHT 유래 계대배양 둘 모두에서, 적혈구(CD43+GPA+) 세포 집단과 비(非)적혈구 범조혈 CD43+CD45+ 세포 집단은, 각각, 3일차와 6일차에 명백하게 식별 가능하였다(도 8c). Kennedy 등에 의해 설명된 모델에 따르면(문헌[Kennedy, M. et al. Cell Reports 2, 1722-1735 (2012)]), CD43+GPA+ 세포 집단과 CD43+CD45+ 세포 집단이 생성되는 시간대는, 각각, 원시 특성과 최종 특성에 대한 힌트를 준다. 나아가, 계대배양된 HSC 유사 세포에서 배아(HBZ, HBE1), 태아(HBA1, HBA2, HBG1, HBG2) 및 성체(HBD, HBB) 글로빈 상향조절의 존재는, 이러한 설정에서, 본 발명자들이 원시 조혈세포와 최종 조혈세포를 모두 수득할 수 있음을 시사한다(도 8d). 종합하면, 이러한 결과는, 이러한 분화 시스템이 인간 EHT 과정을 정확하게 모델링할 수 있게 하며, 생성된 HE 세포를 효율적으로 계대배양하여 원시 조혈 집단과 최종 조혈 집단을 만들어낼 수 있음을 나타낸다.
EHT 동안 별개의 과정에 연료를 공급할 수 있는 당분해
예에서, EHT 집단에서 일어나는 대사 과정을 설명하기 위해, HE 세포, EHT 세포 및 HSC 유사 세포에서 당분해를 평가하였다. 분화에 따른 당분해 능력과 당분해의 점진적인 증가가 나타났다(도 2a, 도 9a). 나아가, scRNAseq에 따른 평가 시, EHT 동안 당분해 효소 HK1, PFKFB2, TPI1, GAPDH, PKLR, ENO3, LDHA 및 LDHB의 발현이 또한 증가하였다(도 2b). 일부 예에서, 또한 CS 13의 인간 1차 세포에서 EHT 동안 이러한 당분해 효소의 대부분이 증가하는 것으로 나타났으며(문헌[Zeng, Y. et al. Cell Res 1-14 (2019)]), 이는 시험관내 결과(도 9b)와 일치한다.
EHT 동안 당분해 활성이 필요한지 여부를 조사하는 예에서, HE 세포를 당분해를 차단하는 글루코오스 유사체인 2-데옥시-D-글루코오스(2-DG)로 처리하였다(도 9c). 이러한 처리는 계대배양 3일차 HE 세포로부터의 CD43+ 세포 산출을 유의하게 감소시켰다(도 2c, 도 9d). 나아가, 2-DG의 존재 하에서, 3일차 CD43+GPA+ 세포 집단의 생성과 6일차 CD43+CD45+ 세포 집단의 생성이 유의하게 방해되어, 대조군의 50% 미만으로 떨어졌다(도 2d, 도 9e). 흥미롭게도, HE 세포가 아닌 EHT 세포 또는 HSC 유사 세포의 증식율이 2-DG의 존재 하에서 유의하게 감소하였다(도 2e, 도 9f). 이러한 결과는, 당분해가 HE 세포의 조혈 분화를 유도하는데 중요하지만, EHT 과정 동안 이후의 단계에서 EHT 세포와 HSC 유사 세포의 증식에 연료를 공급할 수도 있음을 시사한다.
EHT 과정 동안 점진적으로 증가할 수 있는 미토콘드리아 호흡
증가된 당분해 및 증식과 함께, HSC 유사 세포는 또한 HE 세포 및 EHT 세포와 비교하여 글루코오스 흡수가 증가하였다(도 2f). 흥미롭게도, 당분해 플럭스는 HE 세포에 비해 EHT 세포에서 더 높았지만, 글루코오스 흡수는 이들 2가지 세포 유형에서 비슷하였다. 이러한 결과에 따라, 본 발명자들은 미토콘드리아 호흡이 EHT 세포에 비해 HE 세포에서 더 활성인지 여부를 조사하였다. 예상치 못하게, EHT 세포는 HE 세포와 비교하여 더 높은 수준의 기초 호흡, ATP 생산 및 최대 호흡을 나타냈다(도 2g, 도 10a). 나아가, TMRE 염색을 통해 측정된 미토콘드리아 활성은 HE 세포와 비교하여 개별적으로 분석된 EHT 세포에서 유의하게 증가하였으며, 본 발명자들은 HSC 유사 세포의 경우에 더 높은 비율을 관찰하였다(도 2h). 미토콘드리아를 탈분극시키는 FCCP로의 처리는 모든 세포 유형에서 TMRE 신호를 폐지하였으며, 이는 OXPHOS가 이러한 집단에서 활성이었음을 시사한다(도 2h). TMRE 염색과 일치하게, 본 발명자들은 HSC 유사 세포에서 가장 높은 기초 호흡률을 관찰하였다(도 2i). 공초점 현미경을 통한 생세포 이미지화를 사용하여, 본 발명자들은 방추형 HE 세포에서의 미토콘드리아 활성을 동일한 웰에서 새로 형성된 둥근 조혈 자손에서의 미토콘드리아 활성과 비교하였다. TMRE 염색 강도 측정은 HE 웰 내 방추형 세포에 비해 원형 세포에서 2배 더 높은 미토콘드리아 활성을 보여주었으며, 이러한 값은 HSC 유사 세포에서 검출된 수준과 유사하였다(도 2j). 나아가, 본 발명자들은, scRNAseq를 통해 검출 시, HE 집단, EHT 집단 및 HSC 유사 집단에서, 복합체 I(NDUF로 명명된 유전자), II(SDHA), IV(COX로 명명된 유전자) 및 V(ATP5로 명명된 유전자)의 서브유닛을 포함하여, OXPHOS와 관련된 몇몇 유전자 발현의 점진적 증가를 관찰하였다(도 10b). 이러한 결과는, EHT 동안 TCA 회로 효소의 점진적 증가를 동반했다(도 2k). 본 발명자들은, CS 13의 인간 1차 세포에서 EHT 동안 OXPHOS 관련 유전자와 TCA 회로 효소 둘 모두의 점진적인 증가(문헌[Zeng, Y. et al. Cell Res 1-14 (2019)])를 관찰하였으며, 이는 본 발명의 시험관내 결과를 확인시켜 준다(도 10c 및 도 10d). 종합하면, 이러한 결과는, TCA 회로 활성, 미토콘드리아 호흡 및 OXPHOS가 EHT 과정 동안 점진적으로 증가함을 보여준다.
HE의 조혈 분화를 개시하는 결정적 단계일 수 있는 글루타민
글루코오스 미함유 배지에서도, HE 세포와 EHT 세포는 높은 기초 호흡 수준을 나타냈다(도 10e). 따라서, 이러한 세포는 미토콘드리아 호흡을 위해 다른 에너지 공급원에도 의존할 수 있다. 글루타민은 TCA 회로의 중간체인 α-케토글루타레이트(α-KG)를 만들어낼 수 있으며, 결과적으로 OXPHOS에 연료를 공급한다(도 11a). 도면에 제시된 바와 같이, HE 세포, EHT 세포 및 HSC 유사 세포는 몇 가지 상이한 글루타민 수송체를 발현시켰고(도 11b), HSC 유사 세포는 1차 제대혈 HSC에서 이전에 기재된 바와 같이(문헌[Oburoglu, L. et al. Cell Stem Cell 15, 169-184 (2014)]) SLC1A5 수송체를 가장 높은 수준으로 발현시켰다.
글루타민이 EHT에 중요한지 여부를 결정하기 위해, HE 세포를 BPTES로 처리하는 방식으로 글루타민의 글루타메이트로의 탈아미드화를 촉진시키는 글루타미나아제(GLS) 효소를 차단하였다(도 11a). BPTES의 존재 하에서, 3일차 HE 유래 CD43+GPA+ 적혈구 집단의 생성과 6일차 CD43+CD45+ 집단의 생성에서의 급격한 감소가 도면에 제시되어 있다(도 11c 및 도 11d). 이러한 결과는, 일부 예에서, EHT 동안 조혈 분화를 위해 TCA 회로로의 글루타민의 진입이 필요할 수 있음을 시사한다.
글루타민은 또한 뉴클레오타이드 합성과 비필수 아미노산(NEAA) 합성을 포함하는 몇몇 대사경로에 참여한다(문헌[DeBerardinis, R. J. & Cheng, T. Oncogene 29, 313-324 (2009)]). 따라서, EHT 동안 이의 역할을 보다 잘 이해하기 위해, 이의 부재 하에서 HE 세포를 시험하였다. 글루타민 박탈은 계대배양 3일차에 HE 세포로부터의 CD43+ 세포 산출을 없앴다(>80% 감소)(도 3a). 이러한 표현형을 구제하기 위해, 글루타민 미함유 배양 배지에 뉴클레오시드, NEAA 또는 세포 투과성 형태의 α-KG(디메틸-케토글루타레이트, DMK)를 보충하였으며, 이들은 모두 글루타민에서 유도될 수 있는 기질이었다(문헌[DeBerardinis, R. J. & Cheng, T. Oncogene 29, 313-324 (2009)]). 뉴클레오시드, NEAA 또는 이 둘의 조합은 글루타민 박탈 시 볼 수 있었던 영향을 구제할 수 없었다(도 11e). 하지만, DMK 첨가는 HE 세포로부터의 CD43+ 세포 산출을 최대 60%까지 구제하였다(도 3a, 도 11e). 나아가, DMK/뉴클레오시드 또는 DMK/뉴클레오시드/NEAA의 조합은 HE 세포에서 유래한 CD43+ 세포의 백분율을 대조군 조건의 수준에 도달할 정도로 추가로 증가시켰다.
TCA 회로를 위한 또 다른 연료인 피루베이트가 글루타민을 대체할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 HE 세포를 피루베이트 데히드로게나아제 키나아제(PDK) 저해제인 디클로로아세테이트(DCA)로 처리하여, 글루타민 박탈 동안 피루베이트 데히드로게나아제(PDH) 활성을 증가시켰다. 예에서, 글루타민이 존재하지 않으면, DCA 처리만으로 대조군에서 볼 수 있는 CD43+ 세포 수준을 회복할 수 없었다(도 11f).
특정 예에서, CD34+ 발현을 상실한 더 성숙한 CD43+ 세포의 백분율은 글루타민 미함유 DMK 처리 조건에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(도 3a, 도 11g). 하지만, 뉴클레오시드 첨가 단독 또는 NEAA와 함께 첨가는 CD43+CD34- 세포의 백분율을 대조군에서 관찰된 수준으로 회복시켰다. 뉴클레오타이드가 세포 증식에 필수적이기 때문에, 특정 예에서, 분화하는 HE 세포의 증식은 이러한 인자에 의존하였다. 일부 예에서, DMK 또는 뉴클레오시드 단독으로는 대조군 조건에서 볼 수 있는 증식 프로파일을 회복시킬 수 없었으며; 사실, 이러한 인자 두 가지 모두의 첨가만이 글루타민 박탈 동안 HE 세포의 증식을 회복시켰다(도 3b, 도 11h). 이러한 결과는, 글루타민이 HE로부터 CD43+ 세포를 생성하는 데 중요할 수 있으며, TCA 회로 연료 공급뿐 아니라, 증식 지원을 위한 뉴클레오타이드 생산에서 역할을 담당한다는 것을 나타낸다.
조혈 집단을 차등적으로 유지시키는 글루타민
이전에, 적혈구 분화는 글루타민에 의해 연료가 공급되는 뉴클레오타이드 합성을 필요로 하는 것으로 나타났다(문헌[Oburoglu, L. et al. Cell Stem Cell 15, 169-184 (2014)]). 따라서, HE 세포를 증식 염료(Cell Trace Violet, CTV)로 염색하고, 3일 후에 새로 형성된 GPA+ 세포 또는 CD45+ 세포의 증식 상태를 평가하였다. GPA+ 세포는 분열된 세포에 클러스터링되었지만(낮은 CTV MFI 값), 흥미롭게도, HE 세포에서 유래한 CD45+ 세포는 거의 분열되지 않았다(높은 CTV MFI 값; 도 3c, 도 11i). 글루타민 부재 하의 HE 계대배양 3일차 및 6일차에, DMK 단독은 CD43+GPA+ 집단을 대조군에서 볼 수 있는 수준으로 구제할 수 없었다(도 11j). 하지만, DMK/뉴클레오시드 또는 DMK/뉴클레오시드/NEAA의 조합은 글루타민 존재 하에서 볼 수 있었던 바와 유사한 CD43+GPA+ 집단을 만들어냈다(도 3d, 도 11j). 결과적으로, 글루타민은 이의 증식 프로파일과 일치하게, 탄소 공여자와 질소 공여자 둘 모두로 작용하여, HE 세포로부터 CD43+GPA+를 생산하는 데 필요한 α-KG와 뉴클레오타이드를 모두 생산한다(도 3c).
흥미롭게도, 조건 하에서의 CD43+CD45+ 세포 백분율의 유의한 증가는, 대조군과 비교하여, DMK 또는 DMK/뉴클레오시드에 의해 회복되었다(도 3d, 도 11j). HE 유래 CD45+ 세포가 증식을 개시하는 데 더 느리다는 발견(도 3c)과 유사하게, DMK는 뉴클레오시드 부재 하에서도 HE로부터 CD45+ 세포를 유도하는 데 충분하였다. 따라서, TCA 회로의 부스트는 CD45+ 성숙 조혈세포의 형성을 유리하게 한다. DMK+/뉴클레오시드+ 조건에서 대조군과 유사한 수준의 CD43+GPA+가 관찰된 바와 같이(도 4d), 이는 CD43+CD45+ 세포가 배양물을 취하여 다른 집단을 대체할 가능성을 배제한다. DMK가 최종 조혈세포의 형성을 유도하는지를 이해하기 위해, 3일차 HE 세포를 OP9-DL1 기질과 함께 공동배양하고, 림프계 분화를 유도하였다. 3일 계대배양 동안 글루타민 박탈 또는 뉴클레오시드 보충 단독은 공배양물에서 HE 세포가 NK세포를 만들어내는 것을 막았으며, DMK 또는 DMK/뉴클레오시드 보충은 효율적인 NK세포 분화를 가능하게 하였다(도 3e 및 도 11k). 따라서, 글루타민은 EHT 동안 필수적이며, HE로부터 원시 GPA+ 집단과 최종 CD45+ 집단의 증식을 차등적으로 조절한다.
HE로부터의 조혈 산출을 변경할 수 있는 피루베이트의 조절
일부 예에서, HE 세포는 EHT 세포보다 당분해율이 더 낮음에도 불구하고 EHT 세포와 유사한 수준으로 글루코오스를 흡수하기 때문에(도 2f), 피루베이트 산화가 HE 세포의 조혈 실행에 중요한지 여부를 조사하였다. 피루베이트는 미토콘드리아 피루베이트 담체 복합체(MPC)를 통해 미토콘드리아에 의해 흡수되며, PDH 효소에 의해 아세틸-coA로 전환되어 TCA 회로를 보충할 수 있다(도 4a). 미토콘드리아로의 피루베이트 진입은 UK5099로 불리는 특정한 MPC 저해제를 사용하여 차단하였다(도 4a). EHT 세포 또는 HSC 유사 세포에서와 달리, HE 세포에서, MPC 저해는 계대배양 3일차에 CD43+GPA+ 세포 산출을 현저하게 증가시켰다(도 4b 및 도 12a). 이러한 결과를 확인하기 위해, HE 세포를 또한 PDH 저해제(5)인 1-아미노에틸포스핀산(1-AA)으로 처리하였고(도 4a), 대조군과 비교하여 GPA+ 세포 산출의 유의한 증가를 관찰하였다(도 12b). 나아가, 일부 예에서, 2가지 MPC 서브유닛인 MPC1과 MPC2는 모두 shRNA를 사용한 경우 하향조절되었고(도 12c), 계대배양 3일차 CD43+GPA+ 세포 산출의 2.7배 증가가 관찰되었으며(도 12d), 이는 UK5099를 이용한 결과를 확인시켜 준다. UK5099의 존재 하에서 HE에서 유래한 GPA+ 집단의 증식은 대조군과 비교하여 차이가 관찰되지 않았다(도 12e). 이러한 결과는, 당분해를 위한 글루코오스의 사용이 적혈구 형성을 유도하는 데 충분할 수 있으며, 미토콘드리아로의 피루베이트 진입을 저해하면 적혈구 계통으로의 HE 세포의 분화가 증가한다는 것을 입증한다.
6일차에 전체 CD43+ 세포의 수준은 UK5099 처리된 조건과 미처리 조건 사이에서 변하지 않았지만(도 12f), HE 세포와 EHT 세포 둘 모두에서 유래한 CD43+CD45+ 집단의 2배 감소가 관찰되었으며, HSC 유사 세포의 경우에는 관찰되지 않았다(도 4c, 도 12g). 유사하게, 1-AA 처리는, 전체 CD43+ 세포 수준이 변하지 않았음에도 불구하고, HE 유래 CD45+ 세포 집단의 유의한 감소를 초래하였다(도 12h). 일부 예에서, UK5099는 HE에서 유래한 CD45+ 세포의 증식 또는 HE에서 유래한 HSC 유사 세포의 빈도에 영향을 미치지 않았다(도 12i 및 도 12j). 이러한 결과는, 미토콘드리아로의 피루베이트 진입을 차단하면 EHT 동안 CD45+ 조혈 운명으로의 분화가 방해를 받는다는 것을 나타낼 수 있다.
특정 예에서, 미토콘드리아로의 피루베이트 플럭스를 증가시키는 방식으로 반대 효과를 유도할 수 있다. DCA를 사용하여 PDK를 차단하면 PDH 복합체가 억제되는데, 이는 피루베이트를 아세틸-coA로 전환시켜 잠재적으로 TCA 회로에 연료를 공급할 수 있다(도 4a). CD43+GPA+ 세포의 형성이 HE 계대배양 3일차에 DCA에 의해 유의하게 변경되지 않았지만(도 12k), 처리된 조건에서 6일차에 이러한 집단의 50% 감소가 관찰되었다(도 4d, 도 12l). 따라서, DCA는 당분해를 직접 차단하지 않기 때문에, HE 세포로부터의 원시 적혈구 분화에 영향을 미치지 않을 수 있다. 사실, HE 계대배양에서 유래한 GPA+ 집단의 증식은 계대배양 3일차에 DCA에 의해 영향을 받지 않았다(도 12m). DCA를 이용한 계대배양 6일차에, HE에서 유래한 CD43+CD45+ 세포 백분율의 80% 증가가 관찰되었으며, EHT 세포의 경우에는 관찰되지 않았다(도 4e, 도 12n). HE에서 유래한 CD45+ 세포의 증식 또는 HSC 유사 세포의 빈도는 DCA에 영향을 받지 않았다(도 12o 및 도 12p). 증식에 대한 UK5099와 DCA의 임의의 효과를 완전하게 배제하기 위해, 계대배양 초기 시점(1일차 및 2일차)에 EdU를 혼입시켰으며, UK5099 또는 DCA 처리로 인한 증식의 차이는 확인되지 않았다(도 12q). 종합하면, 이러한 결과는, TCA 회로로의 피루베이트 진입이 저해되는 경우, HE 세포는 우선적으로 적혈구를 만들어낼 수 있으며; 다른 한편으로, 피루베이트가 미토콘드리아에서 산화로 밀려나는 경우, 증가된 TCA 회로 연료 공급은 HE 세포의 최종 CD45+ 분화를 유리하게 한다는 것을 보여준다.
예에서, HE 세포에서 UK5099를 이용한 MPC 저해 3일 또는 6일 후, 적혈구 집락(CFU-E) 형성은 미처리 조건과 비교하여 유의하게 증가되었지만, 과립구 집락과 대식세포 집락은 감소하였다(CFU-G, GM 및 M)(도 12r 및 도 12s). 대조적으로, DCA를 이용한 3일 PDK 저해는 CFU에 영향을 미치지 않았으며(도 12r), 6일 DCA 처리는 CFU-E의 감소와 CFU-M 집락의 유의한 증가로 이어졌다(도 12s). CFU-G, CFU-GM 및 CFU-M 집락의 합에 대한 CFU-E 집락의 비는, 대조군에 비해, UK5099 처리된 세포에서 20배 더 높았고, DCA 처리된 세포에서 3배 넘게 더 낮았다(도 4f). 모든 조건에서, 밝은 적색의 원시 적혈구 집락(EryP)과 갈색빛의 최종 적혈구 집락(EryD)이 모두 관찰되었다(도 12t). 하지만, UK5099 또는 DCA는 HBA1-2(성체 글로빈) 발현에 영향을 미치지 않았지만(도 12u), UK5099 처리된 HE 세포에서 얻은 집락에서는 HBE1(배아) 및 HBG1-2(태아) 글로빈 전사체의 유의한 증가(도 4g)가 관찰되었으며, 이는 MPC 저해가 원시 적혈구의 생성을 증가시킨다는 것을 확인시켜 준다.
특정 예에서, DCA가 최종 조혈세포의 형성을 유도하는지를 이해하기 위해, OP9-DL1 기질 공배양물 내 3일차 HE 세포에서 림프계 분화를 유도하였다. UK5099 처리는 NK 세포 형성을 방해했지만, DCA 처리는 미처리된 HE 세포와 비교하여 NK세포 분화를 유의하게 증가시켰다(도 4h, 도 12v). 종합하면, 예에서, 이러한 결과는 유세포분석 데이터를 확인시켜 주며, UK5099는 원시 적혈구생성을 증가시킬 수 있지만, DCA는 이후의 단계에서 HE로부터의 골수계/림프계 분화를 유리하게 한다는 것을 보여준다.
생체내 설정에서 이러한 결과를 확인하기 위해, 임신한 마우스에 배아(E) 9.5일차에 UK5099 또는 DCA를 주사하였으며, 이는 조혈성 내피에 영향을 미쳐 E9 내지 E9.5 및 E10.5에서 일어나는 최종 조혈작용(2차 웨이브와 3차 웨이브 모두)을 일으켰지만, E7 내지 E7.25에 일어나는 원시 조혈작용은 일으키지 않았다(문헌[Palis, J. et al. Development 126, 5073-5084 (1999)]; 및 문헌[Medvinsky, A. & Dzierzak, E. Cell 86, 897-906 (1996)]). 일부 예에서, 태아 간(FL)이 조혈작용의 주요 부위인 경우, E14.5에서 FL의 세포 조성을 특징분석하는 방식으로 배아의 혈액 계통 결과를 평가하였다. 일부 예에서, 표현형 장기 HSC(LT-HSC)의 빈도는 UK5099 또는 DCA에 영향을 받지 않았으며(도 4i), 이는 시험관내 결과를 확인시켜 준다(도 12j 및 도 12p). 림프계/골수계 잠재력이 있는 제한된 선구체인 조혈전구세포(HPC)-1과, 주로 거핵구 자손을 만들어내는 HPC-2는, 대조군 및 UK5099 주사된 조건과 비교하여, DCA 주사된 마우스의 배아에서 유의하게 증가하였다(도 13a). 이와 일치하게, T세포 수준과 B세포 수준은 모두 대조군 및 UK5099 주사된 배아에 비해 DCA에서 증가했으며(도 4j), 이는 DCA를 통해 증가된 CD45+ 최종 산출을 보여주는 시험관내 결과를 뒷받침한다. 나아가, 예에서, FL에서 DCA 처리는, 대조군 및 UK5099 조건과 비교하여, 0기, 4기 및 5기 적혈구 집단에서 유의한 증가로 이어질 수 있으며, 1기, 2기 및 3기의 경우에는 유의한 차이가 없다(도 13b 및 도 13c). 일부 예에서, 이러한 프로파일은, 최종 적혈구 생산의 방해(S0에서의 감소)를 시사하지만, 주사 전에 형성된 원시 적혈구는, 이전에 기재된 바와 같이(문헌[Fraser, S. T. et al. Blood 109, 343-352 (2007)]; 및 문헌[Isern, J. PNAS 105, 6662-6667 (2008)]), FL에서 후기 성숙 단계(S1, 2 및 3)에 존재하거나, FL에서 순환계로 빠져나간다(S4 및 5에서의 감소).
나아가, 예에서, 도 13d에 제시된 게이팅 전략에 따라 분류된 DCA 처리된 배아 유래의 LT-HSC는, 유의하게 더 많은 CFU-GM 집락과 더 적은 BFU-E 집락을 만들어냈으며(도 13e), 대조군 및 UK5099 처리된 조건과 비교하여, BFU-E 대 CFU-GM의 비는 80% 증가하였다(도 4k). 생체내 EHT 및 조혈작용에 대한 UK5099의 유의한 영향은 관찰되지 않았으며(도 4i 내지 도 4k), 이는 MPC 저해가 바람직하게는 원시 조혈 웨이브에 영향을 미친다는 것을 확인시켜 준다. 따라서, 시험관내 결과와 유사하게, DCA에 의한 PDK 저해는 생체내 성숙한 적혈구의 희생을 통해 림프계/골수계 세포의 빈도를 증가시킨다.
특정 예에서, iPS 유래 세포의 최종 조혈 잠재력을 평가하기 위해, OP9-DL1 기질과 공동배양한 3일 DCA 처리된 HE 세포를 조사처리된 NSG 마우스에 정맥내 주사하였다. 이전 연구와 비슷한 생착 수준을 얻었으며(문헌[Rahman, N. et al. Nat Commun 8, 1-12 (2017)]), 8주차에 말초혈액(PB)에 약 1% 인간 CD45+ 세포가 있었다(도 13f). 8주차에 DCA 처리된 세포를 주사한 NSG 마우스의 PB에서 유의하게 더 많은 인간 B세포가 검출되었으며(도 13g), 골수세포 수준은 미처리 조건과 유사하였다(도 12h). 12주차에, 두 가지 조건 모두에서 유사한 수준의 인간 HSC(CD34+CD38-CD90+CD49f+CD45RA-로 정의됨)가 확인되었으며(도 4l), DCA 처리된 조건에서 공통 림프계 선구체(CLP: common lymphoid progenitor) 집단의 유의한 증가가 검출되었다(도 4m). 이러한 결과와 일치하게, DCA 처리된 HE 세포를 주사한 NSG 마우스의 BM에서 유의하게 더 많은 인간 B세포가 관찰되었으며(도 4n), 골수세포의 수준은 차이가 없었다(도 4o). 나아가, DCA 처리된 HE 세포를 주사한 NSG 마우스의 흉선에서 유의하게 더 많은 CD4+CD8+ DP 흉선세포가 검출되었다(도 4p, 도 13i). 종합하면, 이러한 결과는, DCA를 이용하여 미토콘드리아로의 피루베이트 플럭스를 증가시키면, HE 세포가 생체내에서 최종 조혈 운명 및 우선적으로 림프계 운명으로 향하게 된다는 것을 보여줄 수 있다.
단세포 수준에서 HE 세포의 조혈 계통 실행을 지시할 수 있는 피루베이트 운명
특정 예에서, 피루베이트 조작의 분자적 효과를 분석하기 위해, 처리 초기 시점(2일차)에, 대조군, 및 UK5099 처리된 세포 또는 DCA 처리된 세포에서, HE 세포의 전사 프로파일을 단세포 수준에서 평가하였다. 먼저, 모든 조건을 그룹화하고, 세포를 7개의 클러스터로 분리하였다(도 5a). HE 세포의 대부분은 ENG, CDH5, PROCR 및 ANGPT2를 포함하는 내피 마커를 발현시켰으며(도 14a), 이의 발현은 대부분 클러스터 1 내지 클러스터 5에 국한되었다(도 5b). 대조적으로, 클러스터 6과 클러스터 7의 세포는 RUNX1, GATA2, MYB 및 SPN을 포함하는 조혈 유전자를 발현시켰다(도 5b 및 도 14b). 따라서, 이러한 시점에서 클러스터 6과 클러스터 7 내에서 일어나는 HE 세포에서 조혈세포로의 실행을 포착할 수 있다.
단리된 클러스터 6과 클러스터 7에 초점을 맞춘 예에서(도 5c), 초기 적혈구생성 조절인자인 RYK(문헌[Tusi, B. K. et al. Nature 555, 54-60 (2018)])와 적혈구 특이적 KLF3은 이미 클러스터 6에서 높은 수준으로 발현되었으며, TAL1, GATA2, ZFPM1, KLF1, NFE2, ANK1 및 HBQ1과 같은 다른 적혈구 마커는 클러스터 7에서 더 고도로 발현되었다는 것을 확인하였다(적혈구 마커; 도 5c). 초기 림프계세포 운명 조절인자인 POU2F2(B세포)와 GATA3(T세포)뿐 아니라, 골수계 마커인 SWAP70과 IRF8은 클러스터 6에서 더 높은 수준으로 발현되었으며, T림프구 인자인 BCL11B, 골수계 단핵구 인자인 CSF1R, CEBPE 및 거핵구 인자인 PF4는 클러스터 7에서 가장 높았다(림프계/골수계 마커; 도 5c). 따라서, 클러스터 6 세포는 특정 계통의 초기 조절인자를 발현시켰지만, 클러스터 7 세포는 더 성숙한 조혈세포의 특징적인 전사인자를 발현하기 시작하였다. 나아가, 클러스터 7에서, 각각, HE 유래의 GPA+ 세포와 CD45+ 세포의 초기 출현과 후기 출현에 따라, 적혈구 전사인자를 발현하는 세포의 백분율은 75% 초과였으며, 림프계 또는 골수계 마커를 발현하는 세포는 전체 중에서 20% 미만으로 나타났다(도 5c).
일부 예에서, 클러스터 6에서 세포의 백분율은 조건들 사이에서 일정하였지만, 클러스터 7에서는, 대조군과 비교하여 UK5099 처리된 HE 세포가 38% 더 많았고, DCA 처리된 HE 세포가 35% 더 적었다(도 14c). 이러한 결과는, 피루베이트 조절이 초기 조혈 실행에 영향을 미치지 않을 수 있음을 보여준다(클러스터 6). 하지만, 이는 계통 실행에 영향을 미치는 것으로 보인다(클러스터 7).
특정 예에서, 클러스터 6과 클러스터 7에서, 적혈구 계통 유전자인 RYK, KLF3, TAL1, GATA2, ZFPM1, KLF1, NFE2, ANK1 및 HBQ1의 평균 발현 수준은 미처리된 HE 세포와 비교하여 UK5099 처리된 HE 세포에서 더 높았으며, 이러한 인자는 DCA 처리된 HE 세포에 거의 존재하지 않았다(좌측 점 도표, 도 5d). 대조적으로, DCA 처리된 HE 세포는, 대조군 및 UK5099 처리된 HE 세포와 비교하여, 림프계/골수계 전사인자인 SWAP70, POU2F2, GATA3, CSF1R, PF4, BCL11B, CEBPE 및 IRF8을 더 높은 수준으로 발현시켰다(우측 점 도표, 도 5d).
단세포 수준에서 피루베이트 조작의 영향을 추가로 평가하기 위한 일부 예에서, 단일 HE 세포를 OP9-DL1 기질로 분류하고, 14일차에 GPA+ 클론의 점수를 매겼다. 조건 당 총 552개의 단세포 중에서, 대조군의 9개 GPA+ 클론과 비교하여, UK5099 처리된 조건에서는 12개의 GPA+ 클론이 검출되었고, DCA 처리된 조건에서는 7개의 GPA+ 클론이 검출되었다(도 14d). 이러한 결과는, UK5099의 존재 하에서 HE 세포에서 적혈구 계통으로의 우선적인 실행을 확인시켜 줄 수 있다. 종합하면, 이러한 결과는, HE 분화의 초기 단계에서, 피루베이트 사용의 조절이 계통 특이적 전사인자의 발현에 직접적인 영향을 미치고, HE 세포의 계통 실행을 지시한다는 것을 보여줄 수 있다.
LSD1에 의존할 수 있는 MPC 저해 동안의 원시 적혈구 실행
이전 연구는 리신 특이적 데메틸라아제 1(LSD1)이 EHT 및 특히 적혈구 계통에 중요할 수 있다는 것을 보여주었다(문헌[Takeuchi, M. et al. PNAS 112, 13922-13927 (2015)]; 및 문헌[Thambyrajah, R. et al. Nat Cell Biol 18, 21-32 (2016)]). EHT 동안, LSD1은 HDAC1/2(문헌[Thambyrajah, R. et al. Stem Cell Reports 10, 1369-1383 (2018)]) 및 GFI1/GFI1B(문헌[Thambyrajah, R. et al. Nat Cell Biol 18, 21-32 (2016)])와 함께 작용하여 후성적 변화를 유도한다. 일부 예에서, CD43+ 조혈세포의 출현을 방해하는 HDAC1/2 저해제(트리코스타틴 A(trichostatin A), TSA)를 사용하는 EHT에 HDAC가 중요할 수 있다고 나타났다(도 15a). 나아가, LSD1, GFI1 및 GFI1B는 DCA 처리된 세포와 비교하여 UK5099 처리된 세포에서 더 높은 수준으로 발현되었음이 관찰되었으며(도 15b), 이는 피루베이트 이화작용에 의한 계통 선별화가 LSD1 의존적일 수 있음을 시사한다. LSD1이 트라닐시프로민(TCP: tranylcypromine)에 의해 차단되거나, shRNA에 의해 하향조절되는 조건 하에서(도 15c), HE 세포의 UK5099 처리 후 3일차에 CD43+GPA+ 세포 빈도의 증가는 검출되지 않았다(도 6a 및 도 6b). 한편, TCP 처리된 HE 세포는 6일차에 DCA 처리와 유사하게 더 많은 CD43+CD45+ 세포를 만들어냈지만(도 15d); DCA와 달리, TCP는, 이전에 문헌에 기재된 바와 같이(문헌[Schenk, T. et al. Nat Med 18, 605-611 (2012)]), 골수계 분화를 특이적으로 증가시켰다(도 15e). 따라서, 기계적으로, MPC 저해를 통한 원시 적혈구생성의 유도는 HE 세포에서 LSD1에 의한 후성적 조절에 의존할 수 있다.
콜레스테롤 대사에 의해 촉진될 수 있는 DCA 의존적 최종 조혈작용
일부 예에서, 디클로로아세테이트는, 아세테이트가 ACSS2에 의해 아세틸-coA로 전환되고, 히스톤 아세틸트랜스퍼라아제(HAT)를 통해 히스톤으로 전달되는 아세틸화 표시의 전구체로서 직접 사용될 수 있다(도 15f). ACSS2를 저해하는 것은 HE 계대배양 6일차에 CD43+CD45+ 세포에 대한 DCA 영향을 교란시키지 않았으며(도 15g), 이는 DCA가 아세틸-coA로 직접 전환되지 않음을 보여준다. 나아가, C646 단독을 이용하여 HAT를 차단하는 것은 HE 세포에 영향을 미치지 않았지만; C646 + DCA 처리는 DCA 단독에 비해 CD43+CD45+ 세포의 증가를 2배 증가시켰다(도 15h). HAT를 차단하는 것이 DCA 효과를 저해하지 않았기 때문에, DCA를 이용한 경우 H3K9 또는 H4의 전반적인 아세틸화는 변화가 없었다(도 15i). 따라서, PDH 활성을 증강시키면서 동시에 HAT를 저해하면 다른 대사 과정을 위한 아세틸-coA 이용 가능성이 촉진되어, CD45+ 세포의 증가로 이어질 수 있다. 아세틸-coA는 콜레스테롤을 생산하는 (HMGCR를 통한) 메발로네이트 경로와 (ACC를 통한) 지질 생합성 둘 모두를 위한 전구체이다(도 6c). CP-640186(CP)을 이용하여 ACC를 차단하는 것은 DCA와 동일한 효과를 나타냈으며, CP와 DCA 둘 모두로의 조합 처리는 DCA 단독과 비교하여 6일차에 CD43+CD45+ 세포의 빈도를 추가로 증가시켰다(도 6d). 따라서, 지질 생합성을 차단하면 콜레스테롤 생산을 위한 아세틸-coA 이용 가능성이 증가할 수 있다. 사실, DCA 처리된 HE 세포에서, 콜레스테롤 함량의 8% 증가가 검출되었으며(도 6e), 2일차에 더 높은 수준의 콜레스테롤 유출 유전자가 검출되었다(도 15j). 놀랍게도, 아토르바스타틴(Ato)(메발로네이트 경로의 저해제)과 조합된 DCA로 HE 세포를 처리하면 DCA의 효과가 무효화되었다(도 6f). 종합하면, 이러한 결과는, DCA가 HE 세포의 최종 조혈 실행을 유리하게 하는 콜레스테롤 생합성을 촉진시킨다는 것을 보여줄 수 있다(도 6g).
상기 설명된 바와 같이, EHT 동안, 이행 세포는 당분해 및 TCA 회로/OXPHOS의 동시 증가와 함께, 에너지 사용과 대사의 급격한 변화를 거칠 수 있다. 본원에 제시된 개시내용 및 결과는, 글루타민이 원시 적혈구와 최종 조혈세포의 선별화에서 별개의 역할을 하기 때문에 EHT 과정에서 중요하다는 것을 처음으로 입증하였다. 한편, 예에서, 당분해와 TCA 회로 둘 모두에서 글루코오스의 역할이 있을 수 있다. 2-DG를 이용하여 이를 차단하면 HE 세포의 조혈 분화가 방해를 받을 수 있다. 휴지 상태의 HSC에서, 당분해는 저산소증 유발 인자-1α(HIF-1α)의 안정화를 통해 저산소증에 의해 조절되는 것으로 나타났다(문헌[Takubo, K. et al. Cell Stem Cell 7, 391-402 (2010)]). HE에서 HSC로의 이행은 또한 HIF-1α에 의해 조절되는 것으로 나타났다(문헌[Harris, J. M. et al. Blood 121, 2483-2493 (2013)]; 및 문헌[Imanirad, P. et al. Stem Cell Research 12, 24-35 (2014)]). 따라서, 예에서, 당분해의 HIF-1α 의존적 유도는 EHT에 중요할 수 있다.
본원에 제시되고 상기 설명된 바와 같이, 당분해는 원시 조혈작용을 위한 에너지를 공급하는 데 충분하다. 사실, 초기 배아 단계에서, 산소는 전신적으로 이용 가능하지 않으며, 당분해는 에너지를 생산하기 위한 선택적 경로이다(문헌[Gardner, D. K. et al. Semin Reprod Med 18, 205-218 (2000)]). 발달중인 배아에서, 원시 적혈구는 신속한 증식을 촉진시키기 위해 높은 비율로 당분해를 수행하는 것으로 나타났다(문헌[Baron, M. H. et al. Blood 119, 4828-4837 (2012)]). 유사하게, 본원에 기재된 설정에서, HE에서 유래한 GPA+ 세포는 CD45+ 세포보다 더 빠르게 증식하며, 이러한 과정을 위한 뉴클레오타이드를 제공하기 위해 글루타민에 의존한다. 마찬가지로, 적혈구 분화를 위한 뉴클레오타이드 공급에 있어서 글루타민의 중요한 역할은 제대혈에서 얻은 HSC의 맥락에서 이전에 설명되었다(문헌[Oburoglu, L. et al. Cell Stem Cell 15, 169-184 (2014)]). MPC를 차단하면, 단세포 수준에서 실행된 세포의 증가된 빈도뿐 아니라, 이러한 조건에서 더 높은 수준의 적혈구 인자, 및 배아/태아 특이적 글로빈으로 나타난 바와 같이, EHT의 매우 초기 단계에서 원시 적혈구생성으로 HE 실행을 재지시할 수 있다.
일부 예에서, 본원 및 상기 제시된 결과는, 최종 조혈 정체성을 명시하는데 있어 TCA 회로와 OXPHOS의 역할을 해명할 수 있다. 글루타민 박탈 또는 DCA 처리 동안 DMK를 이용하여 TCA 회로에 연료를 공급하면, 최종 CD45+ 계통으로의 HE 세포의 분화를 증가시킬 수 있다. DCA에 의한 PDK 저해는 원시 적혈구 형성에 영향을 미치지 않지만, 시험관내와 생체내 둘 모두에서 본원에 제시된 바와 같이, 림프계/골수계 편향된 최종 조혈작용을 유도할 수 있다. HE 세포의 DCA 처리는 NSG 마우스에서 림프구 재구성을 증가시킬 수 있다. 본원에 제시된 결과는, 빈혈인 것으로 나타났지만, T세포, B세포 및 골수 집단을 정상 빈도로 유지했던 Pdk2/Pdk4 이중 녹다운 마우스에서의 이전 결과와 일치한다(문헌[Takubo, K. et al. Cell Stem Cell 12, 49-61 (2013)]). 예에서, 본원의 결과는, DCA가 콜레스테롤 생합성에 연료를 공급하는 방식으로 CD45+ 세포 형성을 촉진시킬 수 있음을 보여준다. 이러한 결과는, 콜레스테롤 생합성의 Srebp2 의존적 조절이 HSC 출현에 필수적이라는 것을 입증하는 제브라피시에서의 정밀한 연구에 의해 확증된다(문헌[Gu, Q. et al. Science 363, 1085-1088 (2019)]). 본원에 제시된 바와 같이, HE 세포에서의 직접적인 대사 변화, 즉, 아세틸-coA 함량의 증가는, 콜레스테롤 대사를 촉진시키고, 최종 조혈 산출을 제어할 수 있다.
다른 연구자들은, 별개의 EHT 세포 서브세트 또는 전구 HSC가 상이한 계통 성향을 나타낸다고 보고하였다(문헌[Zhou, F. et al. Nature 533, 487-492 (2016)]; 및 문헌[Guibentif, C. et al. Cell Reports 19, 10-19 (2017)]). 본원에 제시된 바와 같은 특정 예에서, 대사는 HE 세포의 운명을 재설계할 수 있으며, 이는 계통 성향이 HE 수준에서 결정될 수 있음을 시사한다. 본원의 결과와 일치하게, scRNAseq와 렌티바이러스 계통 추적을 조합한 최근 연구는, 통상의 방법을 이용하여, 조혈 발달 동안 세포 운명 편향이 상기 기재된 것보다 훨씬 더 이른 단계에 나타난다는 것을 보여주었다(문헌[Weinreb, C. et al. Science. 2020 Feb 14; 367(6479)]). 나아가, 쥣과 HSC는 이의 형성 전에 확립되는 후성적 프라이밍으로 인해 림프계 또는 골수계 조혈 계통 편향이 나타나는 것으로 나타났다(문헌[Yu, V. W. C. et al. Cell 167, 1310-1322.e17 (2016)]). 실제로, 대사에 후성적 변화를 연결하는 것은, 대사 변경을 세포 과정의 전사 조절과 조화시키는 새롭게 부상하는 분야이다. 따라서, 본원의 예에 제시된 바와 같이, MPC 저해에 의한 적혈구 운명 유도는 후성적 인자인 LSD1에 의존할 수 있다.
본원의 예 및 결과는, 원시 조혈 웨이브와 최종 조혈 웨이브의 계통 성향이 YS 적소와 AGM 적소에서의 영양소 이용 가능성에 의해 형성됨을 나타낼 수 있다. 초기 배아 단계에서의 산소 부족으로 인해, 원시 조혈 웨이브는 당분해에 의존하여, 산소 친화도가 높은 배아 글로빈을 발현하는 적혈구를 형성할 수 있다(도 6g). 이는, 새로 형성된 조직에 산소를 효율적으로 분배하고, OXPHOS의 사용을 촉진시켜, 최종 조혈 웨이브의 출현을 개시할 수 있다(도 6g).
본원에 설명된 바와 같이, 예에서, PSC로부터 시험관내에서 최종 HSC 발달을 유도하는 대사 결정인자를 사용하여, 조혈 악성종양 및 장애를 앓고 있는 환자의 조혈계를 재구성할 수 있는 전사 가능한 세포를 생산하는 방법을 제공할 수 있다.
hiPSC 배양, 조혈 분화 및 세포 단리 방법
당업자는, 하기 및 본 명세서의 다른 곳에 기재된 방법 및 재료가 단지 예시이며, 이러한 예는 방법들과 재료들의 상이한 조합을 사용하여 수행될 수 있음을 이해할 것이다. 나아가, 본원에 기재된 방법 및 재료의 요소는 선택적일 수 있다. RB9-CB1 인간 iPSC 계통을 마우스 배아 섬유아세포(MEF, Millipore)와 공동배양하고, 6일마다 계대배양하고, 이전에 기재된 바(문헌[Guibentif, C. et al. Cell Reports 19, 10-19 (2017)])와 같이 처리하여 배아체(EB)를 형성하였다. 본 연구에 사용된 분화 프로토콜은 이전에 기재된 바와 같지만(문헌[Ditadi, A. & Sturgeon, C. M. Methods 101, 65-72 (2016)]), 하기 및 도 7a에 제시된 바와 같이, 원시 조혈작용과 최종 조혈작용 둘 모두를 유도하도록 약간의 변형이 이루어졌다. 새로 형성된 EB를 먼저 1 ng/ml 액티빈 A(0일차 내지 2일차)와 3 μM CHIR99021(2일차에만)이 보충된 SFD 배지에 보관하였다. 3일차에, 배지를 6일차까지 1 ng/ml 액티빈 A(3일차에만)와 3 μM CHIR99021(3일차에만)이 보충된 "3일차-SP34" 배지로 바꾸었다. 6일차에, 배지를 8일차까지 "6일차-SP34" 배지로 대체하였다. 제시된 일부 실험에서, 높은 수율의 HSC 유사 세포를 얻기 위해, EB를 10일까지 보관하였으며, 이러한 경우, 8일차에 EB를 Matrigel(8 μg/cm2, Corning) 코팅된 디쉬에 플레이팅하고, 10일차까지 보관하였다. 5일차 및 7일차를 제외하고, 배지를 매일 교체하였다. 8일차 또는 10일차(표시된 바와 같이), TryPLE Express(Thermo Fisher Scientific)와의 5분 인큐베이션을 5회 내지 6회 수행하여 EB를 단수화하였다. 인간 CD34 MicroBead 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 CD34+ 세포를 선별하고, CD34-FITC, CD73-PE, VECad-PerCPCy5.5, CD38-PC7, CD184-APC, CD45-AF700, CD43-APCH7, GPA-eF450, CD90-BV605 및 생존능 마커 7AAD로 염색하여, 이전에 기재된 마커에 따라(문헌[Guibentif, C. et al. Cell Reports 19, 10-19 (2017)]; 문헌[Harris, J. M. et al. Blood 121, 2483-2493 (2013)] 및 문헌[Schenk, T. et al. Nat Med 18, 605-611 (2012)]), HE 세포(CD34+CD43-CXCR4-CD73-CD90+VECad+), EHT 세포(CD34+CD43intCXCR4-CD73-CD90+VECad+) 및 HSC 유사 세포(CD34+CD43+CD90+CD38-)를 분류하였다.
HE 세포, EHT 세포 및 HSC 유사 세포 계대배양
분류된 HE 세포(40,000개), EHT 세포(30,000개) 및 HSC 유사 세포(5,000개 내지 20,000개)를 1% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 HE 배지(30) 내 Matrigel(16 μg/cm2, Corning) 코팅된 96웰 편평한 바닥 플레이트에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2, 4% O2의 가습 인큐베이터에서 밤새 보관하였다. 다음날(0일차), 웰을 PBS로 2회 세척하고, 새로운 HE 배지를 2-DG(1 mM), UK5099(10 μM), DCA(3 mM), BPTES(25 μM), TSA(60 nM), TCP(300 nM), ACSS2i(5 μM), C646(10 μM), CP-640186(5 μM), 아토르바스타틴(0.5 μM)과 함께, 또는 지시된 경우 DMK(1.75 mM), 뉴클레오시드(1X) 또는 NEAA(1X)가 함유된 글루타민 미함유 배지에 첨가하였다. 배지를 교체하고, 약물을 2일마다 첨가하고, 세포를 37℃, 5% CO2, 20% O2의 가습 인큐베이터에서 6일 내지 7일 동안 보관하였다. CellSens DP72 카메라와 CellSens Standard 1.6 소프트웨어가 장착된 Olympus IX70 현미경(Olympus)을 사용하여 사진을 촬영하였다.
세포외 플럭스 분석
HE 세포와 EHT 세포와 HSC 유사 세포를 비교하기 위해, 10일차 FACS로 분류된 세포(40,000개 이하)를 CellTak(0.56 μg/웰)로 코팅된 Seahorse XF96 세포 배양 마이크로플레이트 웰 상에 2회 내지 4회 반복으로 직접 플레이팅하고, Seahorse XF96 분석기에서 즉시 세포외 플럭스를 평가하였다. HE 세포와 EHT 세포를 비교하기 위해, 8일차 FACS로 분류된 세포(40,000개 이하)를 Matrigel(16 μg/cm2, Corning) 코팅된 Seahorse XF96 세포 배양 마이크로플레이트 웰 상에 3회 내지 4회 반복으로 플레이팅하고, 플레이팅 2일 후 Seahorse XF96 분석기에서 세포외 플럭스를 평가하였다. 당분해 플럭스를 평가하기 위해, 25 mM 글루코오스, 4 μM 올리고마이신 및 50 mM 2-DG를 첨가한 후 뿐만 아니라 기본 조건(제조업체의 지침에 따라 1시간 글루코오스 고갈 후) 하에서, 2 mM 글루타민이 함유된 XF 배지에서 ECAR를 측정하고, 데이터를 세포 수로 정규화하였다. 당분해 능력(ECAR올리고마이신 - ECAR2-DG)과 당분해(ECAR글루코오스 - ECAR2-DG)의 수준을 계산하였다. 산화적 인산화를 평가하기 위해, 4 μM 올리고마이신, 2 μM 카르보닐 시아니드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP) 및 1 μM 로테논/40 μM 안티마이신 A의 첨가 후 뿐만 아니라 기본 조건 하에서, 10 mM 글루코오스, 2 mM 글루타민 및 1 mM 소듐 피루베이트가 함유된 XF 배지에서 OCR을 측정하고, 데이터를 세포 수로 정규화하였다. 기초 호흡(OCR기초 - OCR로테논/안티마이신 A), ATP 생산(OCR기초 - OCR올리고마이신) 및 최대 호흡(OCRFCCP - OCR로테논/안티마이신 A)의 수준을 계산하였다.
유세포분석
계대배양 3일차 및 6일차에, StemPro Accutase 세포 해리 시약과 함께 37℃에서 2분 인큐베이션 후 세포를 수집하고, CD34-FITC, CD14-PE, CD33-PC7, CD11b-APC, CD45-AF700, CD43-APCH7, GPA-eF450, CD90-BV605 및 생존능 마커 7AAD로 염색하고, BD LSRII에서 형광을 측정하였다. 미토콘드리아 활성을 측정하기 위해, 세포를 테트라메틸로다민 에틸 에스테르(TMRE, 20 nM)와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 음성 대조군은 TMRE 염색 전 100 μM FCCP와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. BD FACSARIA III에서 형광을 측정하고 MFI 수준인 MFI FMO를 계산하였다. 글루코오스 흡수를 측정하기 위해, 세포를 2-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)-2-데옥시글루코오스(2-NBDG)와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, BD FACSARIA III에서 형광을 측정하였다. 증식을 측정하기 위해, 세포를 제조업체의 지침에 따라 CellTrace Violet(CTV) 키트를 이용하여 처리하고(10분 인큐베이션), BD LSRFortessa에서 형광을 측정하였다. EdU 혼입을 측정하기 위해, 계대배양 1일차 또는 2일차에 24시간 EdU 펄스 후, 제조업체의 지침에 따라 Click-iT EdU 유세포분석 세포 증식 검정(Thermo Fisher Scientific, C10424)을 사용하여 HE 세포를 평가하였다. 유세포분석 결과를 FlowJo 소프트웨어로 분석하였으며, 여기서 모든 실험에서 이중항과 사멸된 세포를 배제시키기 위해 SSC-A/FSC-A, FSC-H/FSC-A, SSC-H/SSC-A 및 7-AAD에 대한 초기 게이팅을 수행하였다.
집락형성단위 검정
계대배양된 HE 세포를 StemPro Accutase 세포 해리 시약으로 37℃에서 2분 동안 처리하고, 해리된 세포를 3 ml Methocult H4230(STEMCELL Technologies, France)(제조업체의 지침에 따라 제조됨, 2.5 μg hSCF, 5 μg GM-CSF, 2.5 μg IL-3 및 500 U EPO가 함유된 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 함유) 20 mL에 재현탁시켰다. 각각의 혼합물을 비(非)조직 배양 처리된 6웰 플레이트의 2개의 웰로 나누었다. 37℃, 5% CO2, 20% O2의 가습 인큐베이터에서 12일 인큐베이션 후, 집락을 형태학적으로 구별하고, 점수를 매겼다. 글로빈 분석의 경우, PBS를 이용하여 Methocult 웰 내 집락을 수거하고, 철저하게 세정하고, β-메르캅토에탄올이 함유된 RLT 완충액 중에 동결시켰다. RNA 추출 및 RT(Qiagen) 후, taqman 프로브를 이용하여 q-PCR로 유전자 발현을 평가하였다. 본 연구에 사용된 taqman 프로브는 HBA1/2(Hs00361191_g1), HBE1(Hs00362216_m1), HBG2/1(Hs00361131_g1) 및 KLF1(Hs00610592_m1)이었다.
OP9-DL1 기질에서의 림프계 분화 검정
UK5099(10 μM), DCA(3 mM)의 존재 하에서, 또는 표시된 바와 같이 DMK(1.75 mM), 뉴클레오시드(1X) 또는 NEAA(1X)가 함유된 글루타민 미함유 배지에서 배양된 계대배양 3일차 HE 세포를, StemPro Accutase 세포 해리 시약과 함께 37℃에서 2분 인큐베이션한 후 수집하고, 80% 컨플루언스 OP9-DL1 기질 상에 씨딩하였다. 이전에 기재된 바와 같이(문헌[Renoux, V. M. et al. Immunity 43, 394-407 (2015)]), 세포를 SCF(10 ng/ml), FLT3-L(10 ng/ml), IL-2(5 ng/ml), IL-7(5 ng/ml, 처음 15일만) 및 IL-15(10 ng/ml)가 함유된 OP9 배지에서 배양하고, 매주 새로운 OP9-DL1 기질로 계대배양하였다. 공동배양 35일차에, BD LSRFortessa에서 세포를 분석하였다.
단세포 RNAseq 라이브러리 제조 및 시퀀싱
분류된 HE 세포, EHT 세포 및 HSC 유사 세포뿐 아니라, 자성에 의해 선별된(Miltenyi Biotec) 제대혈 CD34+ 세포를 1% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 HE 배지(문헌[Ditadi, A. & Sturgeon, C. M. Methods 101, 65-72 (2016)]) 내 Matrigel(16 μg/cm2, Corning) 코팅된 96웰 편평한 바닥 플레이트에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2, 4% O2의 가습 인큐베이터에서 밤새 보관하였다. 다음날(0일차), 웰을 PBS로 2회 세척하고, 새로운 HE 배지를 지시된 경우 UK5099(10 μM) 또는 DCA(3 mM)와 함께 첨가하였다. 1일차 및 2일차에(지시된 바와 같이), 세포를 PBS 0.04% UltraPure BSA로 2회 세척하고, StemPro Accutase 세포 해리 시약과 함께 37℃에서 2분 인큐베이션 후 수집하였다. 세포를 회전시키고, PBS 0.04% UltraPure BSA에 재현탁시키고, 계수하고(수율: 8,000개의 세포 내지 18,000개의 세포), Chromium Single Cell 3' Reagent kit v3 지침(10x Genomics)에 따라 라이브러리 제조를 수행하였다. 10x Genomics 사의 권장 실행 파라미터(28-8-0-91)를 이용하여 풀링된 라이브러리의 최종 로딩 농도 300 pM로 NOVASeq 6000(Illumina)에서 시퀀싱을 수행하였다. 인간 제대혈 샘플은 스코네 대학병원(Skane University Hospital)(Lund and Malmo)과 헬싱보리 병원(Helsingborg Hospital)에서 지역 윤리 위원회가 승인한 지침에 따라 정보에 입각한 동의 하에 수집하였다.
단세포 RNAseq 분석
데이터를 처리하고, Seurat v3.1.0을 사용하여 분석하였으며, 여기서 세포는 로그 정규화 전 최대 20% 미토콘드리아 판독을 가능하게 하였고, "vst" 방법을 사용하여 상위 500개의 가변 유전자를 찾았다. 세포 주기 점수를 계산하고, 데이터를 미토콘드리아 함량 및 S 점수와 G2M 점수의 차이에 따라 회귀분석하였다. UMAP를 계산하기 전 주성분을 계산하였다. 세포를 정렬하는 Slingshot(문헌[Street, K. et al. BMC Genomics 19, 477 (2018)])를 사용하여, 본 발명의 EHT 데이터 세트에서 2가지 발달 경로를 설명하는 유사시간 궤적을 확인하였다. 이어서, 세포를 각 궤적을 따라 비닝하였으며, 여기서 각 빈의 세포 유형 조성을 백분율로 계산하였다. 제대혈 CD34+ 세포를 본 발명의 데이터에 맵핑하고, scCoGAPS를 사용하여 표지하였다(문헌[Stein-O'Brien, G. L. et al. Cell Syst 8, 395-411.e8 (2019)]). Zeng 등의 CS13 데이터(문헌[Zeng, Y. et al. Cell Res 1-14 (2019)])를 판독하고, 처리하여 "AEC"및 "Hem"으로 명명한 세포가 식별되는 UMAP를 만들었다. 이러한 99개 세포를 본 발명의 데이터에 맵핑하고, SCMAP(문헌[Kiselev, V. Y. et al. Nat Methods 15, 359-362 (2018)])를 사용하여 표지하였다. scCoGAPS를 사용하여 본 발명의 EHT 데이터를 Zeng 등의 데이터(문헌[Zeng, Y. et al. Cell Res 1-14 (2019)])에, 그리고 그 반대로 맵핑한 후(여기서 각 데이터 세트에서 10개의 패턴이 식별됨), projectR을 사용하여 서로에 대해 투영하였다. 각각의 세포를 가장 높은 가중치를 달성한 군으로 할당하였다. 세포 유형과 패턴 사이의 관계를 보여주는 개요는, R에 대한 ca 패키지를 사용하여 대응 분석을 수행한 분할표를 형성하는 방식으로 이루어졌다. FindAllMarkers 함수를 사용하여 차등적으로 발현된 유전자를 확인하였다. 1일차 샘플의 세포 수는 다음과 같았다: HE = 1451개, EHT = 1523개, HSC 유사 = 732개. 2일차 샘플의 세포 수는 다음과 같았다: HE 대조군 = 1195개, HE + UK5099 = 718개, HE + DCA = 2309개. 모든 평가된 내피 유전자와 조혈 유전자는 EHT 과정을 검증하기 위해 몇몇 간행물에서 이전에 사용되었었다(문헌[Zhou, F. et al. Nature 533, 487-492 (2016)]; 문헌[Swiers, G. et al. Nat Commun 4, 2924 (2013)]; 문헌[Ng, E. S. et al. Nature Biotechnology 34, 1168-1179 (2016)] 및 문헌[Guibentif, C. et al. Cell Reports 19, 10-19 (2017)]). 유전자 발현 분석의 경우, 당분해, 산화적 인산화, 글루타민 수송 및 콜레스테롤 유출에 대한 유전자 세트를 The Molecular Signatures Database(MSigDB)에서 다운로드하였다.
shRNA를 통한 하향조절
관심 유전자를 인식하는 짧은 헤어핀 서열을, 이전에 설명된 바와 같이(문헌[Fellmann, C. et al. Cell Reports 5, 1704-1713 (2013)]), 최소 독성을 위해 microRNA 맥락에 내장된 GFP 발현 pRRL-SFFV 벡터에 클로닝하였다. 2.5 M CaCl2을 사용하여 22 μg의 pMD2.G, 15 μg의 pRSV-Rev, 30 μg의 pMDLg/pRRE 및 75 μg의 shRNA 벡터와 공동트랜스펙션시키는 방식으로, HEK 293T 세포의 2개의 T175 플라스크에 각각의 렌티바이러스 배치를 생산하였다. 트랜스펙션 16시간 후 배지를 교체하고, 트랜스펙션 48시간 후 바이러스를 수거하고, 4℃에서 2시간 동안 20,000 x g으로 펠릿화하고, 100 μl DMEM에 재현탁시키고, 분취하고, -80℃에서 보관하였다. 제대혈 CD34+ HSPC의 렌티바이러스 형질도입 3일 후, 분류된 GFP+ 세포에서 qPCR로 상응하는 유전자 발현을 평가하는 방식으로 각각의 shRNA의 하향조절 효율을 측정하였다. 분류 다음날 배양 배지에 렌티바이러스 입자를 직접 첨가하는 방식으로 HE 세포에 형질을 도입하였다.
생체내 화합물 주사 및 쥣과 조혈작용 평가
임신한 암컷 C57Bl/6xB6.SJL 마우스에 E9.5에서 UK5099(4 mg/kg) 또는 DCA(200 mg/kg) 또는 PBS(대조군)를 복강내 주사하였다. E14.5에서 배아를 수거하고, 개별적으로 무게를 측정하고, 처리하였다. 태아 간을 해부하고, 2% 소태아혈청(FBS)이 보충된 얼음 냉각된 PBS 800 μL 중에 균질화시키고, FL 세포를 2% FBS가 함유된 PBS 중에서 세척하였다. 분화된 계통 패널의 경우, 세포를 B220 및 CD19(B세포 마커)-PE, CD3e-APC, Ter119-PeCy7 및 CD71-FITC로 염색하고, BD FACSARIA III에서 분석하였다. HSC 패널의 경우, 샘플을 먼저 염화암모늄 용액(STEMCELL Technologies, France)으로 처리하여 적혈구를 용해시키고, 2% FBS가 함유된 얼음 냉각된 PBS로 2회 세척하고, CD3e, B220, Ter119, Gr1(Lineage)-PeCy5, c-Kit-Efluor780, Sca1-BV421, CD48-FITC, CD150-BV605 및 7-AAD(사멸된 세포 배제용)로 염색하고, BD FACSARIA III에서 분석하였다. 유세포분석 결과를 FlowJo 소프트웨어로 분석하였으며, 여기서 이중항을 배제시키기 위해 SSC-A/FSC-A와 FSC-H/FSC-A에 대한 초기 게이팅을 수행하였다. CFU 검정의 플레이팅의 경우, 100 LT-HSC를 분류하고(도 13d에 제시된 게이팅 전략), Methocult M3434(STEMCELL Technologies, France) 3.0 mL에 재현탁시켰다. 각각의 혼합물을 비조직 배양 처리된 6웰 플레이트의 2개의 웰로 나누었다. 37℃, 5% CO2, 20% O2의 가습 인큐베이터에서 14일 인큐베이션 후, 집락을 형태학적으로 구별하고, 점수를 매겼다.
NSG 마우스 이식
분류된 인간 HE 세포(350,000개)를 OP9-DL1 기질(60,000개)과 혼합하고, HE 배지30 내 Matrigel(16 μg/cm2, Corning) 코팅된 12웰 플레이트 상에서 DCA(3 mM)의 존재 유무 하에 3일 동안 계대배양하였다. 대조군 또는 DCA 샘플 유래의 100,000개 내지 150,000개 세포를, C57Bl/6.SJL 마우스의 20,000개의 전골수 지지세포(CD45.1+/CD45.2+, 자체 사육)와 함께, 치사량 이하로 조사처리된(300 cGy) 8주령 암컷 NOD/Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ 마우스(NSG, The Jackson Laboratory)에 이식하였다. 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해, 2% FBS가 함유된 PBS 250 μL 중 단세포 용액으로 세포를 이식하였다. 감염을 예방하기 위해 이식 후 3주 동안 이식받은 NSG 마우스의 식수에 시프로플록사신(ciprofloxacin)(125mg/L, HEXAL)을 보충하였다. 마우스를 12시간 명암 주기의 제어된 환경에 수용하고, 먹이와 물은 임의로 제공하였다. 실험 및 동물 관리는 룬드대학교 동물 윤리 위원회(Lund University Animal Ethical Committee)에 따라 수행하였다.
NSG 마우스 이식 후 말초혈액 분석
말초혈액(PB)을 꼬리 정맥에서 EDTA 코팅된 microvette 튜브(Sarstedt, Cat# 20.1341.100)에 수집하였다. 말초혈액을 염화암모늄 용액(STEMCELL technologies) 중에서 실온에서 10분 동안 성숙한 적혈구에 대해 용해시키고, 세척하고, 4℃에서 45분 동안 세포 표면 항체에 대해 염색하고, 세척하고, 여과한 후, FACS AriaIII(BD)에서 유세포분석으로 분석하였다. 유세포분석 결과를 FlowJo 소프트웨어로 분석하였으며, 여기서 이중항 배제를 위해 SSC-A/FSC-A와 FSC-H/FSC-A에 대한 초기 게이팅, 사멸된 세포 배제를 위해 DAPI에 대한 초기 게이팅, 및 쥣과 세포 배제를 위해 huCD45/muCD45.1에 대한 초기 게이팅을 수행하였다.
NSG 마우스 이식 후 골수 분석
12주차 이식 종점에서 골수를 분석하였다. 마우스를 척추 탈구로 안락사시킨 후, 우측 및 좌측 대퇴골, 경골 및 장골을 절개하였다. 막자사발로 분쇄하여 골수를 수거하고, 2% FBS가 함유된 얼음 냉각된 PBS 20 mL에 세포를 수집하고, 여과하고, 세척하였다(350xg, 5분). 골수 세포를 실온에서 10분 동안 적혈구에 대해 용해시키고(염화암모늄 용액, STEMCELL technologies), 세척하고, 4℃에서 45분 동안 세포 표면 항체에 대해 염색하고, 세척하고, 여과한 후, FACS AriaIII(BD)에서 FACS 분석으로 분석하였다. 유세포분석 결과를 FlowJo 소프트웨어로 분석하였으며, 여기서 이중항 배제를 위해 SSC-A/FSC-A와 FSC-H/FSC-A에 대한 초기 게이팅, 사멸된 세포 배제를 위해 DAPI 또는 7AAD에 대한 초기 게이팅, 및 쥣과 세포 배제를 위해 huCD45/muCD45.1에 대한 초기 게이팅을 수행하였다.
NSG 마우스 이식 후 흉선 분석
12주차 이식 종점에서 전체 흉선을 수거하였다. 2% FBS가 함유된 PBS 중에서 위아래로 피펫팅하는 방식으로 흉선의 연결조직에서 흉선세포를 기계적으로 분리한 후, 50 μm 멸균 필터를 통해 여과하였다. 실온에서 10분 동안 염화암모늄 용액(STEMCELL technologies) 중에서 샘플을 용해시키는 방식으로 적혈구 오염을 제거하였다. 샘플을 세척하고, 회전시킨 후, 흉선세포의 펠릿을 FACS 완충액에 재현탁시키고, 4℃에서 45분 동안 세포 표면 항체에 대해 염색하고, 세척하고, 여과한 후, FACS AriaIII(BD)에서 FACS 분석으로 분석하였다. 유세포분석 결과를 FlowJo 소프트웨어로 분석하였으며, 여기서 이중항 배제를 위해 SSC-A/FSC-A와 FSC-H/FSC-A에 대한 초기 게이팅, 사멸된 세포 배제를 위해 DAPI에 대한 초기 게이팅, 및 쥣과 세포 배제를 위해 huCD45/muCD45.1에 대한 초기 게이팅을 수행하였다.
공초점 현미경 이미지화 및 정량화
TMRE 염색의 경우, 계대배양 3일차에, 배양 배지의 절반을 제거하고, 2배 농축된 용액의 배양 배지에 집적 첨가하는 방식으로 20 nM TMRE(Thermo Fisher Scientific, T669)로 세포를 염색하였다. 37℃에서 20분 인큐베이션 후, 웰을 PBS로 조심스럽게 세척하고, 새로운 HE 배지를 첨가하였다. 수집하는 동안, 세포를 37℃, 5% CO2, 20% O2의 가습 인큐베이터에서 보관하였다. 면역세포화학의 경우, 계대배양 2일차 HE 세포(커버슬립 상에 플레이팅됨)를 PBS 중에서 2회 세척하고, 실온에서 15분 동안 4% PFA를 이용하여 고정시키고, PBS로 3회 세척하였다. 필리핀 염색의 경우, 고정된 세포를 100 μg/ml 필리핀 III(Sigma-Aldrich, F4767)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 3회 세척하고, 증류수로 헹군 후, PVA/DABCO를 이용하여 고정시켰다. H3K9 및 H4 아세틸화 염색의 경우, 고정된 세포를 투과성으로 만들고, PBS + 0.25% Triton X-100 + 5% 정상 당나귀 혈청(차단 용액)을 이용하여 실온에서 1시간 동안 차단한 후, 차단 용액 중에 희석된 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBS + 0.25% Triton X-100(TPBS)로 5분 동안 2회, 차단 용액으로 5분 동안 세척한 후, 차단 용액 중에 희석된 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 이후 1 μg/ml Hoechst가 함유된 TPBS로 5분 동안 세척하고, PBS로 2회 세척한 후, 증류수로 헹구고, PVA:DABCO를 이용하여 고정시켰다. Zen 소프트웨어와 1.5배 줌(TMRE) 또는 0.6배 줌(필리핀 및 아세틸화)을 사용하여 Zeiss LSM 780 공초점 현미경의 10배(TMRE) 또는 20배(필리핀 및 아세틸화) 대물렌즈를 이용하여 이미지를 얻었다. 수집 설정은 각 실험의 모든 이미지 대해 동일하였으며, 동일한 수의 스택을 이용하였다. 하기와 같이 Fiji 소프트웨어를 사용하여 강도 정량화를 수행하였다. TMRE의 경우, 명시야 채널을 사용하여, 5개의 방추형 세포와 5개의 둥근 세포(무작위로 선택됨)에 대해 ROI를 선택하고, TMRE 채널의 전체 Z-스택에서 각 ROI에 대한 평균 강도를 계산하였다. 필리핀과 아세틸화의 경우, 필리핀 채널의 전체 Z-스택을 얻고, 평균 강도를 계산하였다. 2개 내지 3개의 복제 웰을 이용한 총 2회 내지 3회의 독립 실험을 정량화하였다. 각 복제 웰에 대해, 4개 내지 6개의 이미지를 수집하였다.
통계 분석
표시된 바와 같이, GraphPad Prism 6 소프트웨어에서 대응표본/독립표본 t-검정, 일원/이원 분산분석(ANOVA) 검정 또는 다중비교를 통한 Kruskal-Wallis 검정을 사용하여 조건들 간 차이의 유의성을 계산하였다. p값은 하기 약어로 도면에 표시되어 있다: ns, 유의하지 않음, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
본 발명의 설명이 다양한 구현예의 특정 세부사항을 설명하지만, 이러한 설명은 단지 예시적이며, 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해할 것이다. 나아가, 당업자에게 일어날 수 있는 이러한 구현예 및 이에 대한 변형의 다양한 응용은 또한 본원에 기재된 일반적인 개념에 포함된다. 본원에 기재된 각각의 및 모든 특징, 및 이러한 특징 중 둘 이상의 각각의 및 모든 조합은, 이러한 조합에 포함된 특징이 상호 모순되지 않는 한, 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 언급된 모든 도면, 표 및 부록뿐 아니라, 특허, 특허출원 및 간행물은, 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예는 첨부된 도면과 관련하여 설명되었다. 하지만, 도면이 축적에 맞게 도시된 것이 아니라는 것을 이해해야 한다. 거리, 각도 등은 단지 예시적이며, 예시된 장치의 실제 치수 및 레이아웃과 반드시 정확한 관계를 나타내는 것은 아니다. 구성요소가 부가, 제거 및/또는 재배열될 수 있다. 나아가, 다양한 구현예와 관련된 임의의 특정한 특징, 양태, 방법, 특성, 특질, 품질, 속성, 요소 등에 대한 본원의 개시내용은, 본원에 제시된 모든 다른 구현예에 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 임의의 방법이 인용된 단계를 수행하는 데 적합한 임의의 장치를 사용하여 실행될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 개시내용의 목적을 위해, 특정 양태, 이점 및 신규한 특징이 본원에 기재되어 있다. 모든 이러한 이점이 반드시 임의의 특정 구현예에 따라 달성될 수 있는 것은 아니라는 것을 이해해야 한다. 따라서, 예를 들어, 당업자는, 본 개시내용이 본원에 교시되거나 제안될 수 있는 바와 같은 다른 이점을 반드시 달성하지 않고도, 본원에 교시된 바와 같은 하나의 이점 또는 일련의 이점들을 달성하는 방식으로 구현되거나 수행될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
이러한 발명이 특정 바람직한 구현예 및 실시예의 맥락에서 개시되었지만, 당업자는, 본 발명이 구체적으로 개시된 구현예를 넘어 본 발명의 다른 대안적인 구현예 및/또는 용도, 및 이의 명백한 변형 및 등가물로 확장된다는 것을 이해할 것이다. 또한, 본 발명의 몇 가지 변형이 상세하게 제시되고 설명되었지만, 이러한 발명의 범위에 속하는 다른 변형이 본 개시내용에 기반하여 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 구현예의 특정한 특징 및 양태의 다양한 조합 또는 하위조합이 이루어질 수 있으며, 이는 여전히 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 고려된다. 본원에 개시된 구현예의 다양한 특징 및 양태는 본원에 개시된 발명의 다양한 형식을 형성하기 위해 서로 조합되거나 치환될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 나아가, 본원에 개시된 과정 및 방법의 동작은, 동작을 재정렬하고/하거나 추가의 동작을 삽입하고/하거나 동작을 제거하는 것을 포함하는 임의의 방식으로 변형될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 본 발명의 적어도 일부의 범위는 상기 기재된 특정하게 개시된 구현예에 의해 제한되어서는 안 되는 것으로 의도된다. 청구범위의 제한은 청구범위에 사용된 언어에 기반하여 광범위하게 해석되고, 본 명세서에 기재된 예에 제한되거나 출원의 심사 동안 제한되지 않아야 하며, 여기서 예는 배타적이지 않은 것으로 해석되어야 한다.

Claims (40)

  1. 최종 조혈세포(definitive hematopoietic cell)를 생성하는 방법으로서,
    분화하는 iPS 세포, 조혈세포의 전구체로 직접 재프로그래밍된 세포, 최종 조혈세포로 직접 재프로그래밍된 세포, 및 골수, 제대혈, 태반 또는 동원된 말초혈액에서 유래된 성체 또는 신생아 조혈세포로 이루어지는 군에서 선택되는 복수의 공급원 세포를 제공하는 단계와,
    공급원 세포의 트리카르복실산 회로를 활성화시키도록 구성된 대사 조절인자로 공급원 세포를 처리하는 단계를 포함하는, 최종 조혈세포를 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 대사 조절인자가 피루베이트 데히드로게나아제 키나아제(PDK: pyruvate dehydrogenase kinase)를 저해하도록 구성된 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대사 조절인자가 피루베이트 데히드로게나아제 복합체(PDH: pyruvate dehydrogenase complex)를 활성화시키도록 구성된 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 조절인자가 미토콘드리아로의 피루베이트의 흡수를 증가시키도록 구성된 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 대사 조절인자가 아세틸 조효소 A(Ac-CoA)로의 피루베이트의 전환을 촉진시키도록 구성된 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 조절인자가 디클로로아세테이트(DCA)인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 디클로로아세테이트의 농도가 적어도 약 30 μM인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, DCA가 림프계/골수계 편향 최종 조혈작용을 유도하도록 구성된 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 조절인자가 LSD1 저해제인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, LSD1 저해제가 GSK2879552 또는 RO7051790 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  11. 제9항에 있어서, LSD1 저해제가 적혈구 계통의 최종 조혈세포를 생성하도록 구성된 것인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 대사 조절인자가 α-케토글루타레이트의 생산을 증가시키도록 구성된 것인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 대사 조절인자가 글루타민인, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 대사 조절인자로의 처리에 반응하여 조혈성 내피(HE) 공급원 세포로부터 CD43+ 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 공급원 세포를 뉴클레오시드 트리포스페이트로 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 대사 조절인자가 α-케토글루타레이트의 더 강력하거나 더 안정한 등가물인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 대사 조절인자가 디메틸 α-케토글루타레이트(DMK)인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 디메틸 α-케토글루타레이트의 농도가 적어도 약 17.5 μM인, 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 조절인자가 뉴클레오시드와 조합으로 사용되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 뉴클레오시드의 농도가 적어도 약 0.7 mg/L인, 방법.
  21. 제19 항 또는 제20항에 있어서, 뉴클레오시드가 시티딘, 구아노신, 우리딘, 아데노신 및 티미딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오시드를 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 최종 조혈세포가 최종 조혈줄기세포를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 최종 조혈줄기세포가 림프 및/또는 골수 재증식 잠재력이 있는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 최종 조혈세포가 최종 림프계 및/또는 골수계 세포를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 최종 림프계세포가 T세포, 종양세포를 표적으로 하는 변형된 T세포, B세포, NK세포 및 NKT세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포를 포함하는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 최종 조혈세포가 비만세포를 포함하는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 최종 조혈세포가 성체 헤모글로빈의 생산에 적합한 적혈구를 포함하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈세포의 전구체로 직접 재프로그래밍된 세포가 중배엽 전구세포, 조혈성 내피세포, 및 내피에서 조혈로의 이행을 거치는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포를 포함하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 성체 또는 신생아 조혈세포가 조혈줄기세포 또는 조혈전구세포를 포함하는, 방법.
  30. 최종 조혈세포를 생성하는 방법으로서,
    분화하는 iPS 세포, 조혈세포의 전구체로 직접 재프로그래밍된 세포, 최종 조혈세포로 직접 재프로그래밍된 세포, 및 골수, 제대혈, 태반 또는 동원된 말초혈액에서 유래된 성체 또는 신생아 조혈세포로 이루어지는 군에서 선택되는 복수의 공급원 세포를 제공하는 단계와,
    공급원 세포의 트리카르복실산 회로를 저해하도록 구성된 대사 조절인자로 공급원 세포를 처리하는 단계를 포함하는, 최종 조혈세포를 생성하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 대사 조절인자가 미토콘드리아로의 피루베이트의 흡수를 저해하도록 구성된 것인, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 대사 조절인자가 Ac-CoA로의 피루베이트의 전환을 저해하도록 구성된 것인, 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 조절인자가 MPC를 저해하도록 구성된 것인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 대사 조절인자가 UK5099인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, UK5099의 농도가 적어도 약 100 nM인, 방법.
  36. 제30항에 있어서, 대사 조절인자가 PDH를 저해하도록 구성된 것인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 대사 조절인자가 1-아미노에틸포스핀산(1-AA)인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 1-아미노에틸포스핀산의 농도가 적어도 약 4 μM인, 방법.
  39. 최종 조혈세포의 생산을 위한 공급원 세포의 트리카르복실산 회로 활성화용 대사 조절인자.
  40. 원시 조혈세포(primitive hematopoietic cell)의 생산을 위한 공급원 세포의 트리카르복실산 회로 저해용 대사 조절인자.
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