JP6954844B2 - 造血幹細胞を培養するため及び/又は造血幹細胞を前駆体へ分化させるための方法及びその使用 - Google Patents
造血幹細胞を培養するため及び/又は造血幹細胞を前駆体へ分化させるための方法及びその使用 Download PDFInfo
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Description
1.造血幹細胞を培養するためのインビトロの方法であって、
(a)前記造血幹細胞を、造血幹細胞拡大のピリミドインドール誘導体アゴニストを含む細胞培養培地において増殖させる工程と、
(b)前記造血幹細胞を、38℃から40℃の間のインキュベーション温度でインキュベートする工程と
を含む、方法。
(a)臍帯血、
(b)骨髄、
(c)末梢血、
(d)人工多能性幹細胞、
(e)胚性幹細胞、
(f)非造血由来の分化細胞から分化転換されたもの、
(g)遺伝子改変された造血幹細胞、
(h)不死化造血幹細胞、
(i)多能性若しくは複能性細胞の他の供給源、又は
(j)それらの任意の組合せ
由来である、態様1又は2に記載の方法。
(a)ピリミド[4,5-b]インドール誘導体、
(b)(1r,4r)-N1-(2-ベンジル-7-(2-メチル-2H-テトラゾール-5-イル)-9H-ピリミド[4,5-b]インドール-4-イル)シクロヘキサン-1,4-ジアミン、
(c)メチル4-(3-(ピペリジン-1-イル)プロピルアミノ)-9H-ピリミド[4,5-b]インドール-7-カルボキシレート、
(d)メチル4-(3-(ピペリジン-1-イル)プロピルアミノ)-9H-ピリミド[4,5-b]インドール-7-カルボキシレート塩酸塩、
(e)(a)から(d)のいずれか1つの薬学的に許容される塩、溶媒和物、プロドラッグ、若しくは立体異性体、又は
(f)(a)から(e)の任意の組合せ
である、態様1から8のいずれか一態様に記載の方法。
(b)巨核球前駆細胞の集団であって、
(i)態様13若しくは14に記載の方法によって作製された、及び/又は
(ii)少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、又は80%のCD34+/CD41+細胞を含む、集団、
(c)態様15に記載の方法によって作製された骨髄系前駆細胞の集団、
(d)態様16に記載の方法によって作製された同調した細胞集団、又は
(e)(a)から(d)の任意の組合せ
である、インビトロにおいて拡大された細胞集団。
(b)巨核球前駆細胞の前記集団が、血小板減少症の処置に使用するため、又はそのための治療用組成物の製造のためであるか、又は
(c)骨髄系前駆細胞の前記集団が、骨髄系前駆細胞移植に使用するため、又はそのための治療用組成物の製造のためである、態様17に記載のインビトロにおいて拡大された細胞集団。
(b)血小板減少症の処置のための態様17に規定の巨核球前駆細胞の集団、又は
(c)骨髄系前駆細胞移植のための態様17に規定の骨髄系前駆細胞の集団
の使用。
(b)態様17に規定の巨核球前駆細胞の集団、又は
(c)態様17に規定の骨髄系前駆細胞の集団
を含む、医薬組成物。
小見出し及びその他の識別名、例えば、(a)、(b)、(i)、(ii)等は、単に明細書及び請求項を読み易くするために提示される。明細書又は請求項における小見出し又はその他の識別名の使用により、必ずしも工程又は要素がアルファベット若しくは数の順序又はそれらが提示される順序で実施される必要はない。
実施例2〜5に関する材料及び方法
1.1 材料
すべての化学薬品は、他に記載がない限りSigma-Aldrich社(オークビル、オンタリオ州、カナダ)から購入した。
CD34+細胞を、標準的な手順に従った正の選択によってヒト臍帯血から単離した。臍帯血の単一単位又はいくつかの単位からプールした精製CD34+細胞のいずれかを、24ウェルプレート中の1mLの適切な培養培地におよそ105細胞/mLの密度で播いた。培養全体をとおして希釈及び/又は培地交換によって105〜106細胞/mLの密度で細胞を維持した。
細胞表現型は、以下の標識化一次抗体:CD34-FITC、CD45RA-APC、CD41a-APC、CD42b-PE、及びCD235-PEのパネルを使用し、示した日のフローサイトメトリーによって決定した。
StemSpan(商標)ACF+BS1培養培地において成長させた細胞のアリコートを示した日に採取し、製造業者の説明書に従ってSTEMCELL(商標)Technologies社のMegacult(商標)Cキットを使用してCFU-MKを決定した。
軽度温熱及びピリミドインドール化合物PIC下における培養の組合せは、巨核球前駆細胞の拡大を増加させる
一般に実施例1.2に記載されるとおりに巨核球系統への分化のためにCD34+細胞を単離し、培養した。巨核球前駆(MKP)細胞拡大に対する軽度温熱及びピリミドインドール化合物の組合せの効果を決定するために、CD34+細胞を37℃又は39℃で、本明細書において「PIC」と呼ぶ35nM(最終濃度)のピリミドインドール化合物:
(1r,4r)-N1-(2-ベンジル-7-(2-メチル-2H-テトラゾール-5-イル)-9H-ピリミド[4,5-b]インドール-4-イル)シクロヘキサン-1,4-ジアミン塩酸塩(「UM171」)
を加えた又は加えていない細胞培養培地の存在下において培養した。CD34+/CD41+MKP細胞の拡大を経時的に監視するために、実施例1.3に記載されるとおりフローサイトメトリーを使用した。
軽度温熱及びピリミドインドール化合物PIC下における培養の組合せは、更に均一な巨核球前駆細胞の集団をもたらす
実施例2で単離し、培養したCD34+細胞の更に完全な細胞表現型プロファイルを、実施例1.3に記載されるとおりのフローサイトメトリーによって6、10及び14日目に決定した。示した細胞表面マーカー又はマーカーの組合せを持つ細胞のパーセンテージを示すTable 1(表1)に結果の概要を示す。
軽度温熱及びピリミドインドール化合物下における培養の組合せは、CFU-MKの数を増加させる
実施例2に記載されているとおりに、単離及び培養した精製CD34+細胞から開始し、得られたCFU-MKの数に対する39℃のインキュベーション温度及びPICピリミドインドール化合物の単独の効果又は組合せの効果を、実施例1.4に記載されている標準的な前駆細胞アッセイによって分析した。
軽度温熱及びピリミドインドール化合物PIC下における培養の組合せは、未分化表現型を保持しながらのCD34+細胞の拡大を増加させる
CD34+細胞を単離し、前駆体への分化を制限しながら自己複製を維持するのに適した培地において培養した(実施例1.2に記載されているとおりのStemSpan(商標)CC110サイトカインカクテルを加えたStemSpan(商標)ACF)。CD34+細胞を37℃又は39℃で、35nM(最終濃度)のピリミドインドール化合物PICを加えたか、又はそれを含まない細胞培養培地の存在下において培養した。
実施例7〜16に関する材料及び方法
6.1 CD34+細胞の供給源
本発明者らの病院の研究倫理委員会ガイドラインに従ってドナーから書面のインフォームドコンセントを得た後にヒト臍帯血(CB)を採取した。単核細胞(MNC)をFicoll-Hypaque(商標)密度勾配(GE Healthcare社)により最初に分離した後、-180℃でCryostor CS10(商標)培地(STEMCELL Technologies社)中で凍結保存した。6から8つのCBからの解凍したMNCをCD34単離前にプールした。CB CD34+細胞を、製造業者の説明書(STEMCELL Technologies社)に従ってEasySep(商標)CD34濃縮キットを使用した正の選択によって濃縮した。
ヒトCD34+濃縮細胞(純度≧90%)を、24ウェルプレートに100000細胞/mLで(1)OMPCサイトカインカクテル(Robertら、2011年)を加えたStemSpan(商標)ACF(ACF;STEMCELL Technologies社)、又は(2)BS1巨核球拡大及び分化カクテル(Cortinら、2005年)を加えたStemSpan(商標)SFEM(STEMCELL Technologies社)のいずれかから成る拡大培地中に播いた。OMPCは、35ng/mLトロンボポエチン(TPO、Feldan Therapeutics社)、10ng/mL幹細胞因子(SCF、Peprotech社)、及び11ng/mLヒトFMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3、Peprotech社)から成る。BS1は、1ng/mL SCF、30ng/mL TPO、7.5ng/mL IL-6及び13.5ng/mL IL-9(Feldan Therapeutics社)から成る。
ヒトCB CD34+濃縮細胞(純度≧90%)を、24ウェルプレートに100000細胞/mLで、20ng/mL SCF(Peprotech社)及び2U/mLエリスロポエチン(EPO、Feldan Therapeutics社)を加えたEaveの基本培地(イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、20% BIT (10ng/mLウシ血清アルブミン、10μg/mLウシ膵臓インスリン、200μg/mLヒトトランスフェリン;STEMCELL Technologies社)、0.1mg/mL低密度リポタンパク質(STEMCELL Technologies社)、50μM 2-メルカプトエタノール)から成る拡大培地中に播いた。実施例に示されるとおり、5%CO2、37℃又は39℃の加湿雰囲気に培養物を維持した。3から4日毎に新しい培地により300000細胞/mLに細胞を希釈した。DMSOに溶解させることによってPICの原液を調製し、その後、35nMの最終有効濃度で培養細胞に直接添加した。
ヒトCD34+濃縮細胞(純度≧90%)を、24又は96ウェルプレートに500000細胞/mLで、CC110(STEMCELL Technologies社)若しくは100ng/mLヒトFLT3(Peprotech社)、100ng/mL SCF(Peprotech社)、50ng/mL TPO(Feldan Therapeutics社)及び10μg/mL低密度リポタンパク質(LDL、STEMCELL Technologies社)から成る自作の(HM)サイトカインカクテルのいずれかを加えたStemSpan(商標)ACF(ACF)、SFEM、又はSFEM II(STEMCELL Technologies社)から成る3つの拡大培地のうちの1つの拡大培地中に播いた。実施例に示されるとおり、5%CO2、37℃又は39℃の加湿雰囲気に培養物を維持した。3から4日毎に新しい培地で500000細胞/mLに細胞を希釈した。DMSOに溶解させることによってPIC及びPIC2の原液を調製し、その後、以下の最終有効濃度で培養細胞に直接添加した:PIC:35nM;PIC2:500nM。
細胞数及び生存率を溶液18(Acridine Orange及びDAPI溶液、ChemomMetec社)を添加し、検出のためにNucleoCounter(商標)NC-250(ChemomMetec社)を使用することによって決定した。
7から9週齢の雌のNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスをJackson Laboratory社(バー・ハーバー、メイン州)から購入した。致死量以下で放射線照射したマウス(250cGy、137Cs)に、BS1カクテルを加えたStemSpan(商標)SFEM培地において10日間拡大したCB CD34+濃縮細胞を尾静脈注射により静脈内に移植した。各実験には、骨髄生着に関する陰性対照としてPBSを注射したマウスを含めた。骨髄(BM)生着及びヒト血小板産生の評価のための実験群及び対照群は少なくとも6匹のマウスで構成した。大腿骨及び脛骨を洗い流し、以下の抗体:ヒトCD45-PE-Cy7、マウスCD45-PE、ヒトCD41-APC、ヒトCD33-APC、ヒトCD34-PE、ヒトCD235-PE、ヒトCD3-FITCを使用したフローサイトメトリーによって新たに単離したBM細胞を分析することによって、移植後12から16週間、マウスの骨髄におけるヒト細胞の生着について評価した。生存率用色素として7AADを使用した。製造業者の説明書に従ってBD Lysing溶液を使用して赤血球を溶解させた。
EDTAコーティングキャピラリー(Drummond社)を使用して麻酔をかけたマウスから後眼窩静脈叢血液を採取した。移植マウスにおけるヒト血小板産生の評価は、二つの別個の段階から構成した。第1に、ラット抗マウスCD41-FITC抗体で全血中のネズミの血小板を染色することによってネズミの血小板数を決定した。次に、サンプルをPBS/1%BSA中1/18000に最終希釈し、BD Accuri(商標)C6機器を使用したフローサイトメトリーによってネズミの血小板の濃度をアッセイした。第2に、多血小板血漿(PRP)中のヒト血小板の割合を測定した。PRPは、全血をPBS(1/2)で希釈し、800RPMで30秒間遠心分離することによって調製した。10マイクロリットルのPRPをマウス抗ヒトCD41-APC及びラット抗マウスCD41-FITC抗体で染色した。次に、サンプルをBD Accuri(商標)C6機器で分析した。ドット・プロットの血小板領域に少なくとも400000の事象を得た。
7から9週齢の雌のNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスをThe Jackson Laboratory社(バー・ハーバー、メイン州)から購入した。致死量以下で放射線照射したマウス(250 cGy、137Cs)に新しいCD34+濃縮CB細胞、又は12日間インビトロにおいて拡大されたそれらの全細胞の後代のいずれかを尾静脈注射によって静脈内に移植した。各実験には、骨髄生着に関する陰性対照としてPBSを注射したマウスが含まれた。実験群及び対照群は、少なくとも5匹のマウスで構成した。大腿骨及び脛骨を洗い流し、以下の抗体:ヒトCD45-PE-Cy7、マウスCD45-PE、ヒトCD33-BV421、ヒトCD19-FITC、ヒトCD34-PE、及びヒトCD3-FITCを使用したフローサイトメトリーによって新たに単離したBM細胞を分析することによって、移植後27週目にマウスの骨髄におけるヒト細胞の生着について評価した。生存率用色素として7AADを使用した。
軽度温熱及びピリミドインドール化合物下におけるCD34+/CD41+巨核球前駆体の拡大に対するCD34+細胞の異なる供給源の影響
7.1 軽度温熱及びPICを組み合わせた使用は、臍帯血CD34+細胞由来の巨核球前駆体の相乗的な拡大をもたらす
実施例6.1に記載されているとおりに、ヒト臍帯血(CB)からヒトCD34+濃縮細胞を得、実施例6.2に記載されているとおりに軽度温熱(39℃)の存在下若しくは非存在下及び/又はピリミドインドール化合物PICの存在下若しくは非存在下においてOMPCサイトカインカクテルを加えたStemSpan(商標)ACF培地中で培養した(実施例2を参照)。細胞数及び生存率を、実施例6.5に記載されているとおりに決定した。
実施例6.1に記載されているとおりに、ヒトG-CSF動員末梢血CD34+細胞を得、実施例6.2に記載されているとおりに軽度温熱(39℃)の存在下若しくは非存在下及び/又はピリミドインドール化合物PICの存在下若しくは非存在下においてBS1巨核球拡大及び分化カクテルを加えたStemSpan(商標)SFEM培地中で培養した(実施例2を参照)。細胞数及び生存率を、実施例6.5に記載されているとおりに決定した。
実施例6.1に記載されているとおりに、ヒト骨髄CD34+細胞を得、実施例6.2に記載されているとおりに軽度温熱(39℃)の存在下若しくは非存在下及び/又はピリミドインドール化合物PICの存在下若しくは非存在下においてBS1巨核球拡大及び分化カクテルを加えたStemSpan(商標)SFEM培地中で培養した(実施例2を参照)。細胞数及び生存率を、実施例6.5に記載されているとおりに決定した。
実施例6.1に記載されているとおりに、ヒト臍帯血(CB)からヒトCD34+濃縮細胞を得、実施例6.2に記載されているとおりに軽度温熱(39℃)の存在下若しくは非存在下及び/又はピリミドインドール化合物「PIC2」:
メチル4-((3-(ピペリジン-1-イル)プロピル)アミノ)-9H-ピリミド[4,5-b] インドール-7-カルボキシレート(「UM729」)
の存在下若しくは非存在下においてBS1サイトカインカクテルを加えたStemSpan(商標)SFEM培地中で培養した。
インビトロにおいて拡大されたMK前駆体の注入後のマウスにおけるヒト血小板の産生
実施例6.2に記載されているとおりに、軽度温熱下、MK前駆体の優先的な拡大に好都合な条件でインビトロにおいてCB CD34+細胞を拡大することによってヒトCD41+細胞を調製した。StemSpan(商標)SFEM培地には、インビトロにおける拡大のためにBS1サイトカインカクテルを加えた。実施例6.6に記載されているとおりに、培養の10日後に得た測定した用量のCD41+細胞をNSGマウスに移植した。
軽度温熱及びPIC下におけるCD34+細胞の拡大に対する赤血球分化培地の効果
実施例6.1に記載されているとおりに、ヒト臍帯血(CB)からヒトCD34+濃縮細胞を得、実施例6.3に記載されているとおりに、軽度温熱(39℃)の存在下若しくは非存在下及び/又はピリミドインドール化合物PICの存在下若しくは非存在下において赤血球分化培地中で培養した(実施例2を参照)。細胞数及び生存率を、実施例6.5に記載されているとおりに決定した。
図10は、14日間にわたって試験した異なる培養条件下におけるCB CD71+細胞(赤血球前駆体)の拡大倍数を示す。軽度温熱(39℃)の使用は、CD71+赤血球前駆体の拡大の増加をもたらした(図10を参照、「37」対「39」、及び「37+PIC」対「39+PIC」)。しかしながら、PICの添加は、CD71+赤血球前駆体の拡大の低下をもたらした(図10を参照、「37」対「37+PIC」、及び「39」対「39+PIC」)。
図12及び図13は、それぞれ14日間にわたって試験した異なる培養条件下におけるCD34+細胞及びCD34+/CD71+細胞(赤血球前駆体)の拡大倍数を示す。興味深いことに、これらの結果は、軽度温熱(39℃)及びPICの使用が赤血球分化培地におけるCB CD34+細胞(図12)及びCB CD34+/CD71+細胞(赤血球前駆体)(図13)の両方の拡大に対して相加効果があったことを示す。
軽度温熱及びPIC下におけるCD34+細胞(HSC)及びCD34+/CD45RA-細胞(LT-HSC)の拡大に対する様々なサイトカインカクテルの効果
実施例5で提示した結果は、軽度温熱(39℃)及びPICを組み合わせた使用が、商業的に入手可能なCC110サイトカインカクテルを加えたStemSpan(商標)ACF培地を使用した場合、分化を制限しながらCD34+細胞の拡大の増加をもたらしたことを示した。この実施例において提示した結果は、軽度温熱(39℃)及びPIC下におけるCB CD34+ HSCの相乗的な拡大が自作の(HM)サイトカインカクテルを使用して得られることを示す。
軽度温熱及びPIC下におけるCD34+細胞(HSC)及びCD34+/CD45RA-細胞(LT-HSC)の拡大に対する様々な基本培地及びサイトカインカクテルの効果
この実施例において提示した結果は、軽度温熱(39℃)及びPIC下におけるCB CD34+ HSC及びCD34+/CD45RA- LT-HSCの相乗的な拡大が様々な商業的に入手可能な培地及び様々なサイトカインカクテルを使用して得られたことを示す。
CD34+細胞(HSC)、CD34+/CD45RA-細胞(LT-HSC)、及びCD34+/CD38-/CD45RA-細胞の拡大に対する軽度温熱及びPIC2又はPICを組み合わせた使用の効果
実施例6.1に記載されているとおりに、ヒト臍帯血(CB)からヒトCB CD34+濃縮細胞を得、実施例6.4に一般に記載されているとおりに、軽度温熱(39℃)の存在下若しくは非存在下及び/又はピリミドインドール化合物PIC2の存在下若しくは非存在下において自作の(HM)サイトカインカクテルを加えたStemSpan(商標)ACF培地中で自己複製に好都合な条件において培養した(実施例7.4を参照)。細胞数及び生存率を、実施例6.5に記載されているとおりに決定した。
動員末梢血(mPB)CD34+細胞(HSC)、CD34+/CD45RA-細胞(LT-HSC)、及びCD34+/CD38-/CD45RA-細胞の拡大に対する軽度温熱及びPICを組み合わせた使用の効果
実施例6.1に記載されているとおりに、ヒトG-CSF-動員末梢血CD34+濃縮細胞を得、実施例6.4に一般に記載されているとおりに、軽度温熱(39℃)の存在下若しくは非存在下及び/又はピリミドインドール化合物PICの存在下若しくは非存在下において自作の(HM)サイトカインカクテルを加えたStemSpan(商標)ACF培地中で自己複製に好都合な条件において培養した(実施例2を参照)。細胞数及び生存率を、実施例6.5に記載されているとおりに決定した。
骨髄CD34+細胞(HSC)、CD34+/CD45RA-細胞(LT-HSC)、及びCD34+/CD38-/CD45RA-細胞の拡大に対する軽度温熱及びPICを組み合わせた使用の効果
実施例6.1に記載されているとおりに、ヒト骨髄(BM)CD34+濃縮細胞を得、実施例6.4に一般に記載されているとおりに軽度温熱(39℃)の存在下若しくは非存在下及び/又はピリミドインドール化合物PICの存在下若しくは非存在下において自作の(HM)サイトカインカクテルを加えたStemSpan(商標)ACF培地中で自己複製に好都合な条件において培養した(実施例2を参照)。細胞数及び生存率を、実施例6.5に記載されているとおりに決定した。
CB CD34+/ALDHBright細胞の拡大に対する軽度温熱及びPICを組み合わせた使用の効果
実施例6.1に記載されているとおりに、ヒト臍帯血(CB)からヒトCB CD34+濃縮細胞を得、実施例6.4に一般に記載されているとおりに軽度温熱(39℃)の存在下若しくは非存在下及び/又はピリミドインドール化合物PICの存在下若しくは非存在下において自作の(HM)サイトカインカクテルを加えたStemSpan(商標)ACF培地中で自己複製に好都合な条件において培養した(実施例2を参照)。細胞数及び生存率を、実施例6.5に記載されているとおりに決定した。
軽度温熱及びPIC下、インビトロにおいて拡大したヒトCB CD34+細胞(HSC)の免疫不全マウスにおける移植及び生着
実施例6.1に記載されているとおりに、ヒト臍帯血(CB)からヒトCB CD34+濃縮細胞を得、実施例6.4に一般に記載されているとおりに軽度温熱(39℃)及びピリミドインドール化合物PICの存在下において自作の(HM)サイトカインカクテルを加えたStemSpan(商標)ACF培地中で自己複製に好都合な条件において培養した(実施例2を参照)。実施例6.8に記載されているとおりに、新しいCB CD34+細胞、又は12日間拡大したCB CD34+細胞を免疫不全マウスに移植した。
Claims (13)
- 造血幹細胞を培養するためのインビトロの方法であって、
(a)前記造血幹細胞を、造血幹細胞拡大を促進するピリミド [4,5-b]インドール誘導体を含む細胞培養培地において増殖させる工程と、
(b)前記造血幹細胞を、前記細胞培養培地中で38℃から40℃の間のインキュベーション温度でインキュベートする工程と
を含み、
前記細胞培養培地が、造血幹細胞培養培地又は造血幹細胞の巨核球系統への分化を促進する培地である、方法。 - 前記造血幹細胞が、CD34+造血幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記造血幹細胞が、
(a)臍帯血、
(b)骨髄、
(c)末梢血、
(d)人工多能性幹細胞、
(e)胚性幹細胞、
(f)非造血由来の分化細胞から分化転換されたもの、
(g)遺伝子改変された造血幹細胞、
(h)不死化造血幹細胞、
(i)多能性若しくは複能性細胞の他の供給源、又は
(j)それらの任意の組合せ
由来である、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記造血幹細胞が、動員末梢血細胞由来である、請求項3に記載の方法。
- 前記造血幹細胞が、未動員末梢血細胞由来である、請求項3に記載の方法。
- 前記造血幹細胞が、白血球低減化、白血球除去、及び/又はその他の血液精製若しくは末梢血の処理後に残存している細胞由来である、請求項4又は5に記載の方法。
- 前記造血幹細胞が、前記ピリミド[4,5-b]インドール誘導体を含む細胞培養培地において、38℃から40℃の間のインキュベーション温度で、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21日間インキュベートされる、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インキュベーション温度が、39℃である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 造血幹細胞拡大の前記ピリミド [4,5-b]インドール誘導体が、
(a)(1r,4r)-N1-(2-ベンジル-7-(2-メチル-2H-テトラゾール-5-イル)-9H-ピリミド[4,5-b]インドール-4-イル)シクロヘキサン-1,4-ジアミン、
(b)メチル4-(3-(ピペリジン-1-イル)プロピルアミノ)-9H-ピリミド[4,5-b]インドール-7-カルボキシレート、
(c)メチル4-(3-(ピペリジン-1-イル)プロピルアミノ)-9H-ピリミド[4,5-b]インドール-7-カルボキシレート塩酸塩、
(d)(a)から(c)のいずれか1つの薬学的に許容される塩、溶媒和物、プロドラッグ、若しくは立体異性体、又は
(e)(a)から(d)の任意の組合せ
である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記細胞培養培地が、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、又はSCF及びTPOの両方を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記造血幹細胞培養培地が、ヒトFMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3)、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、低密度リポタンパク質(LDL)、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 造血幹細胞の巨核球系統への分化を促進する前記培地が、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、ヒトFMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3)、IL-6、IL-9、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- (c)前記ピリミド[4,5-b]インドール誘導体を除去し、38℃から40℃の間のインキュベーション温度、又は約37℃のインキュベーション温度で前記細胞を増殖させ続けることにより、前記細胞を同調させる工程を更に含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
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