KR20180023947A - 조혈 줄기세포를 전구 세포로 배양 및/또는 분화시키는 방법 및 그의 용도 - Google Patents

조혈 줄기세포를 전구 세포로 배양 및/또는 분화시키는 방법 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 경증 고체온(hyperthemia) 상태(예를 들어, 38℃ 내지 40℃)에서 조혈모세포(hematopoietic stem cell) 증폭의 피리미도인돌(pyrimidoindole) 유도체 작용제(agonist) 존재하에 조혈모세포(HSC)를 시험관내 배양하는 방법에 관한 것이다. 경증 고체온과 피리미도인돌 유도체의 조합 사용은 상승적으로 작용하여 CD34+ HSC의 증폭 및/또는 기원세포(예를 들어, 거핵구 기원세포)로의 분화를 촉진한다. 본 발명은 또한 HSC 및/또는 기원세포의 시험관내 증폭 세포 집단, 및 그의 치료학적 용도(예를 들어, 이식)에 관한 것이다.

Description

조혈모세포를 기원세포로 배양 및/또는 분화하는 방법과 그의 용도
본 발명은 조혈모세포에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 경증 고체온(hyperthemia)(예를 들어, 38℃ 내지 40℃)에서 조혈모세포(hematopoietic stem cell) 증폭의 피리미도인돌(pyrimidoindole) 유도체 작용제(agonist) 존재하에 조혈모세포를 배양하는 것에 관한 것이다.
조혈모세포(HSC)는 중배엽으로부터 유래하며 골수 계통 또는 림프 계통에 상관없이 혈중에서 발견되는 모든 세포 성분의 생산을 담당한다. HSC는 일반적인 골수 기원세포(CMP)와 일반적 림프 기원세포(CLP)로 분화한다. CMP는 적혈구, 과립구, 단핵구, 거핵구, 및 수지상 계통의 세포를 발생하는 반면, CLP는 T와 B 림프구, 형질 세포, 자연살상세포 및 림프 수지상 세포의 유도를 일으킨다. 골수 계통 세포의 최종 분화는 궁극적으로 적혈구, 과립구, 단핵구, 골수 유래 수지상 세포, 및 혈소판의 생성과 재생을 유도한다. 또한, HSC (초기 또는 장기)는 자기재생 능력이 있기 때문에, 개체의 전체 생애 동안 최종 분화된 혈액 세포와 기원세포의 적절한 공급을 보장한다. 이러한 세포들의 자기재생 능력은 의료분야, 즉 혈액암 또는 골수부전을 앓고 있는 환자의 치료방법으로서 HSC 이식(transplantation)에서 커다란 발전을 이끌어냈다. 역사적으로, 골수는 HSC의 주요 공급원이었으며, 오늘날까지 골수 치환술에서 세포의 중요한 공급원이다. 이후, G-CSF-이동성 공여체(donor)로부터의 말초 혈액과 제대혈(umbilical cord blood) 또한 HSC 공급원으로 사용되고 있다.
임상에서 이들을 사용하는 것과 함께, HSC는 다양한 계통의 세포로의 시험관 내 배양, 증폭, 분화를 목표로 하는 집중적인 연구 노력과, 실험실 내에서 혈액 성분 생산의 대상이 되어 왔다. 이러한 연구로 현재 특이적 계통에 대한 조혈모세포의 우선적 성장 및/또는 분화를 허용하는 다양한 배양방법에서 일반적으로 사용되는 여러 가지 계통 특이적 사이토카인을 발견하였다. 또한, 열성(fever-like) 경증 고체온(37℃의 표준 온도 대신 37℃) 하의 HSC 배양이 거핵구 유도 사이토카인 칵테일의 존재하에 거핵구 계통으로의 증폭 및 분화를 가속화하는 것이 발견되었다(Proulx 등., 2004). 최근, 한 종류의 피리미도인돌 화합물에 대해 장기 조혈모세포를 증폭하는 능력이 확인되었다(Fares 등, 2014).
이러한 진전에도 불구하고, HSC의 시험관내 증폭과 특정 골수 계통으로의 이들의 우선적 분화에 대해 수많은 단점들이 존재한다. 예를 들어, 초기 표현형과 제어된 분화를 유지하면서 시험관내에서 HSC를 증폭하는 것은 특히 어렵다. 세포의 특정 계통으로의 효율적 증폭과 유지 또한 여전히 문제가 있다. 예를 들어, 혈액 성분들의 시험관내 생산을 계획하는데 필요한 증폭 수준은 오늘날의 기술로는 여전히 불충분하다. 게다가 현재의 배양 방법은 일반적으로 특정 임상 증상에 대한 의학적 적용에 적합하지 않은 이종 세포 집단을 야기한다. 줄기세포와 기원세포(progenitor) 특정 집단의 시험관내 생산은 임상에서 그의 사용을 가능하게 하기 위해 실질적 개선이 필요하다. 따라서, 임상적 용도와 대량 생산을 위한 조혈 줄기 및 기원세포의 균질 세포 집단으로의 분화 방향과 범위를 동시에 조절할 수 있는, 시험관내 대량 증폭이 가능한 방법과 기술이 요구되고 있다.
본 발명은 다양한 문헌을 참조로 하였으며, 그 내용은 참조로서 전체적으로 본원에 포함되었다.
요약
본 발명은 조혈모세포(HSC)가 경증 고체온(예를 들어, 38℃ 내지 40℃)으로 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제 존재하에서 유리하게 배양될 수 있다는 놀라운 발견으로부터 시작한다. 경증 고체온과 피리미도인돌 유도체의 병용은 상승적으로 작용하여 CD34+ HSC(장기 HSC 포함)의 증폭 및/또는 "계통 감작(primed)" 또는 기원세포로의 분화, 및/또는 이들의 유지(예를 들어, 골수 기원세포, 거핵구 기원세포)를 촉진하는 것으로 본원에서 나타났다.
실제로, 일부 구체예에서, 경증 고체온과 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제의 조합은 조혈모세포 자기재생(self-renewal)에 유리한 배양 배지를 사용했을 때 HSC(CD34+ 세포)를 기하급수적으로 증폭하는 것으로 나타났다. 이론과 결부되는 것은 아니지만, 본원에 기술된 결과는 피리미도인돌 화합물의 사용과 조합된 경증 고체온은 피리미도인돌 화합물의 항분화 효과를 보존하면서, 동시에 경증 고체온 인큐베이션 온도의 자극 효과를 증강하는 것을 시사하고 있다.
다른 구체예에서, 경증 고체온과 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제의 조합은 또한 거핵구 계통으로의 분화에 유리한 배양 조건이 사용되었을 때 HSC의 기원세포(예를 들어, 골수 기원세포, 거핵구 기원세포)로의 분화를 기하급수적으로 증가시키는 것으로 나타났다. 이론과 결부되는 것은 아니지만, 본원에 기술된 결과는 피리미도인돌 화합물이 성숙 거핵구 단계 이전에 HSC의 고체온 유도성 분화를 차단하거나/하고, 거핵구 기원세포를 우선적으로 증폭 및 유지하는 것을 시사한다. 그러므로, 일부 구체예에서, 피리미도인돌 화합물을 제거하고 세포를 경증 고체온 조건 하에 추가로 증식시켜서 보다 동조된(synchronized) 세포 집단을 생산할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다음 측면에 관한 것이다.
1. (a) 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제를 포함하는 세포 배양 배지에서 조혈모세포를 증식하고;
(b) 38℃ 내지 40℃의 인큐베이션 온도에서 조혈모세포를 인큐베이션하는 것을 포함하는 조혈모세포의 시험관내 배양방법.
2. 조혈모세포가 CD34+ 조혈모세포인 것인 제1 측면의 방법.
3. 조혈모세포가:
(a) 제대혈;
(b) 골수;
(c) 말초혈액;
(d) 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell);
(e) 배아줄기세포;
(f) 비조혈성 기원의 분화 세포 유래의 트랜스분화된 것 (trans-differentiated);
(g) 유전자 변형 조혈모세포;
(h) 불멸화(immortalized) 조혈모세포;
(i) 만능(pluripotent) 또는 다능(multipotent) 세포의 다른 공급원; 또는
(j) 이들의 임의의 조합으로부터 유래하는 것인 제1 또는 제2 측면의 방법.
4. 조혈모세포가 이동(mobilized) 말초혈액 세포에서 유래하는 것인 제3 측면의 방법.
5. 조혈모세포가 고정 말초혈액 세포에서 유래하는 것인 제3 측면의 방법.
6. 조혈모세포가 백혈구감소, 백혈구제거(deleukocytation), 및/또는 말초혈액의 다른 혈액 정제 또는 가공 후의 잔류 세포로부터 유래하는 것인 제4 또는 제5 측면의 방법.
7. 조혈모세포가 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제를 포함하는 세포 배양 배지, 및/또는 38℃ 내지 40℃의 인큐베이션 온도에서, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21일 동안 인큐베이션되는 것인 제1 내지 제6 측면 중 어느 하나의 방법.
8. 인큐베이션 온도가 39℃인 제1 내지 제7 측면 중 어느 하나의 방법.
9. 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제가:
(a) 피리미도[4,5-b]인돌 유도체;
(b) (1r,4r)-N1-(2-벤질-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-일)사이클로헥산-1,4-디아민;
(c) 메틸 4-(3-(피페리딘-1-일)프로필아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카복실레이트;
(d) 메틸 4-(3-(피페리딘-1-일)프로필아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카복실레이트 염산염;
(e) (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 프로드럭, 또는 입체이성제; 또는
(f) (a) 내지 (e)의 임의의 조합인 것인 제1 내지 제8 측면 중 어느 하나의 방법.
10. 세포 배양 배지가 줄기세포인자(SCF); 트롬보포이에틴(thrombopoietin) (TPO); 또는 SCF와 TPO 둘 다를 포함하는 것인 제1 내지 제9 측면 중 어느 하나의 방법.
11. 조혈모세포를 증폭하기 위한 것이고, 세포 배양 배지가 조혈모세포 배양 배지인 것인 제1 내지 제9 측면 중 어느 하나의 방법.
12. 조혈모세포 배양 배지가 인간 FMS 유사 티로신 키나제 3 리간드 (FLT3); 줄기세포인자 (SCF); 트롬보포이에틴 (TPO); 저밀도 리포단백질 (LDL); 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 제11 측면의 방법.
13. 거핵구 기원세포를 생산하기 위해 조혈모세포를 배양하는 것이고, 세포 배양 배지가 거핵구 계통으로의 조혈모세포 분화를 촉진하는 배지인 것인 제1 내지 제9 측면 중 어느 하나의 방법.
14. 거핵구 계통으로의 조혈모세포 분화를 촉진하는 배지가 줄기세포인자 (SCF); 트롬보포이에틴(TPO); 인간 FMS 유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3); IL-6; IL-9; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 제13 측면의 방법.
15. 골수 기원세포를 생산하기 위해 조혈모세포를 배양하는 것이고, 세포 배양 배지가 골수 기원세포 계통으로의 조혈모세포 분화를 촉진하는 배지인 것인 제1 내지 제9 측면 중 어느 하나의 방법.
16. (c) 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제를 제거하고 38℃ 내지 40℃의 인큐베이션 온도 또는 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 세포의 증식을 지속하여 세포를 동조화하는 것을 추가로 포함하는 것인 제1 내지 제15 측면 중 어느 하나의 방법.
17. (a) 제11 또는 제12 측면의 방법으로 생산된 증폭 조혈모세포의 집단;
(b) (i) 제13 또는 제14 측면의 방법으로 생산되거나/되고;
(ii) 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%의 CD34+/CD41+ 세포를 포함하는 거핵구 기원세포의 집단;
(c) 제15 측면의 방법으로 생산된 골수 기원세포의 집단;
(d) 제16 측면의 방법으로 생산된 동조화 세포 집단; 또는
(e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합인 것인 시험관내 증폭 세포 집단.
18. 대상 내 이식에서 사용하기 위한 것인 제17 측면의 시험관내 증폭 세포 집단.
19. (a) 증폭된 조혈모세포의 집단이 조혈모세포 이식용, 또는 그의 치료 조성물 제조용이거나;
(b) 거핵구 기원세포의 집단이 혈소판 감소증의 치료용, 또는 그의 치료 조성물 제조용이거나;
(c) 골수 기원세포의 집단이 골수 기원세포 이식용, 또는 그의 치료 조성물 제조용인 것인 제17 측면의 시험관내 증폭 세포 집단.
20. (a) 조혈모세포 이식을 위한 제17 측면의 증폭 조혈모세포 집단의 용도;
(b) 혈소판 감소증의 치료를 위한 제17 측면의 거핵구 기원세포 집단의 용도; 또는
(c) 골수 기원세포 이식을 위한 제17 측면의 골수 기원세포 집단의 용도.
21. (a) 제17 측면의 증폭 조혈모세포 집단;
(b) 제17 측면의 거핵구 기원세포 집단; 또는
(c) 제17 측면의 골수 기원세포 집단을 포함하는 약학 조성물.
일반적 정의
제목 및 다른 식별 기호들, 예를 들어, (a), (b), (i), (ii), 등은 단지 명세서 및 청구범위를 용이하게 해석하기 위하여 제시된 것이다. 명세서 및 청구범위에서 제목 및 다른 식별 기호들의 사용이 반드시 단계들 또는 요소들이 알파벳 순서 또는 숫자 순서 또는 제시된 순서대로 수행되어야 할 필요는 없다.
청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우 "하나"라는 용어의 사용은 "하나"를 의미할 수도 있지만 "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 그 이상"의 의미와도 일치한다.
"약"이라는 용어는 값을 결정하기 위해 채용되는 장치 또는 방법에 대한 오류의 표준 편차를 포함하는 값을 나타내기 위해 사용된다. 일반적으로, "약"이라는 용어는 최대 10%의 변화 가능성을 지정하는 것을 의미한다. 따라서, 값의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10%의 변화는 용어 "약"에 포함된다. 달리 명시하지 않는 한, 범위를 그 범위의 양 끝에 적용하기 전에 "약"이라는 용어를 사용한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된, "포함하는"(및 "포함하다"와 같은 "포함하는"의 임의의 형태), "가지는"(및 "가지다"와 같은 "가지는"의 임의의 형태), "이루어지는"(및 "이루어지다"와 같은 "이루어지는"의 임의의 형태) 또는 "함유하는"(및 "함유하다"와 같은 "함유하는"의 임의의 형태)이란 단어는 포괄적, 개방형이며 추가적인, 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다.
본 발명의 다른 목적, 이점 및 특징은 첨부된 도면과 관련하여 단지 예시적으로 주어진 이하의 구체적인 실시예들의 비제한적인 설명의 해석에 따라 더욱 명백해질 것이다.
첨부된 도면에 있어서:
도 1은 CD34+/CD41+ 거핵구 기원세포의 증폭 배율(fold)을 거핵구 계통으로의 분화를 촉진하는 조건 하에서 배양된 CD34+ 세포에 대한 시간의 함수로서 나타낸 것이다. 다음 4가지 조건이 시험되었다: (1) "37℃": 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제 (PIC) 부재하의 표준온도; (2) "37℃ + PIC": 35 nM PIC 존재하의 표준온도; (3) "39℃": PIC 부재하의 경증 고체온; 또는 (4) "39℃ + PIC": 35 nM PIC 존재하의 경증 고체온.
도 2는 표준 CFU-MK 어세이에 의해 측정된, 도 1에서 시험된 4가지 배양 조건 하에서 생산된 거핵구 콜로니 형성 단위 (CFU-MK)의 수를 나타낸 것이다.
도 3(A)는 CD34+ 조혈모세포의 증폭 배율을, 분화를 제한하면서 조혈모세포 증폭을 촉진하는 조건 하에서 배양된 CD34+ 세포에 대한 시간의 함수로서 나타낸 것이다. 다음 4가지 조건이 시험되었다: (1) "37℃": 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제 (PIC) 부재하의 표준온도; (2) "37℃ + PIC": 35 nM PIC 존재하의 표준온도; (3) "39℃": PIC 부재하의 경증 고체온; 또는 (4) "39℃ + PIC": 35 nM PIC 존재하의 경증 고체온. 도 3(B)는 CD34+/CD45RA- 장기 조혈모세포(LT-HSC)의 증폭 배율을 분화를 제한하면서 조혈모세포 증폭을 촉진하는 조건 하에서 배양된 정제된CD34+ 세포의 초기 집단으로 시작하여 시간의 함수로서 나타낸 것이다. 다음 4가지 조건이 시험되었다: (1) "37℃": 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제 (PIC) 부재하의 표준온도; (2) "37℃ + PIC": 35 nM PIC 존재하의 표준온도; (3) "39℃": PIC 부재하의 경증 고체온; 또는 (4) "39℃ + PIC": 35 nM PIC 존재하의 경증 고체온.
도 4-6은 경증 고체온의 존재("39") 또는 부재("37") 및/또는 PIC의 존재 또는 부재하에서 14일 동안 CD34+/CD41+ 세포(거핵구 기원세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 증폭은 제대혈 CD34+ 세포(도 4), 이동 말초혈액 CD34+ 세포(도 5), 또는 골수 CD34+ 세포(도 6)에서 수행하였다.
도 7은 경증 고체온의 존재("39") 또는 부재("37") 및/또는 조혈모세포 증폭의 다른 피리미도인돌 유도체 작용제(PIC2)의 존재 또는 부재하에서 14일 동안 CD34+/CD41+ 세포(거핵구 기원세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
도 8과 9는 경증 고체온의 조건과 거핵구(MK) 기원세포(CD41+ 세포)의 우선적 증폭에 유리한 배양 배지에서 시험관내 증폭된 인간 제대혈 CD34+ 세포로 이식된 면역결핍 마우스에서 각각 5일과 2.5주에서의 인간 혈소판 생산 결과를 나타낸 것이다. "MK-6M": PIC 부재하에서 생산된 6백만 CD41+ 세포의 주입; "(MK+PIC)-1M": PIC 존재하에서 생산된 1백만 CD41+ 세포의 주입; "(MK+PIC)-6M": PIC 존재하에서 생산된 6백만 CD41+ 세포의 주입; 및 "PBS": 대조용으로서 인산염 완충 염류용액의 주입. 대시(dash) 기호의 오른쪽에 있는 숫자는 각 조건에 대한 혈액 μL/ 사람 혈소판의 평균수를 나타낸다.
도 10은 경증 고체온의 존재("39") 또는 부재("37") 및/또는 PIC의 존재 또는 부재하에서 14일 동안 제대혈 유래 CD71+ 세포(적혈구 전구세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
도 11은 경증 고체온의 존재("39") 또는 부재("37") 및/또는 PIC의 존재 또는 부재하에서 14일 동안 전체 세포의 증폭 배율(전체 세포 증폭)을 나타낸 것이다.
도 12와 13은 경증 고체온의 존재("39") 또는 부재("37") 및/또는 PIC의 존재 또는 부재하에서 14일 동안 CD34+ 세포(HSC)와 CD34+/CD71+ 세포(적혈구 기원세포)의 증폭 배율을 각각 나타낸 것이다.
도 14는 상업적으로 입수가능한 CC110 사이토카인 칵테일(도 14A) 또는 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일(도 14B)이 보충된 배지에서 배양된 제대혈 유도 CD34+ 세포(조혈모세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 세포는 경증 고체온의 존재("39") 또는 부재("37") 및/또는 PIC의 존재 또는 부재하에 배양되었다.
도 15는 상기 CC110 사이토카인 칵테일(도 15A) 또는 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일(도 15B)이 보충된 배지에서 배양된 제대혈 유도 CD34+/CD45RA- (장기 조혈모세포; LT-HSC)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 세포는 경증 고체온의 존재("39") 또는 부재("37") 및/또는 PIC의 존재 또는 부재하에 배양되었다.
도 16은 상기 CC110 사이토카인 칵테일(도 16A) 또는 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일(도 16B)이 보충된 StemSpanTM SFEM 배지에서 배양된 제대혈 유도 CD34+ 세포(조혈모세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 세포는 경증 고체온의 존재("39") 또는 부재("37") 및/또는 PIC의 존재 또는 부재하에 배양되었다.
도 17은 상기 CC110 사이토카인 칵테일(도 17A) 또는 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일(도 17B)이 보충된 StemSpanTM SFEM II 배지에서 배양된 제대혈 유도 CD34+ 세포(조혈모세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 세포는 경증 고체온의 존재("39") 또는 부재("37") 및/또는 PIC의 존재 또는 부재하에 배양되었다.
도 18은 상기 CC110 사이토카인 칵테일(도 18A) 또는 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일(도 18B)이 보충된 StemSpanTM ACF 배지에서 배양된 제대혈 유도 CD34+ 세포(조혈모세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 세포는 경증 고체온의 존재("39") 또는 부재("37") 및/또는 PIC의 존재 또는 부재하에 배양되었다. 도 18C는 경증 고체온 하 및 PIC의 존재("39") 또는 부재("CTL") 하에서 BS1 사이토카인 칵테일이 보충된 StemSpanTM SFEM 배지에서 배양된 CB CD34+/CD45RA-세포(장기 조혈모세포; LT-HSC)의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
도 19, 20 및 21은 경증 고체온의 존재("39") 또는 부재("37") 및/또는 PIC2의 존재 또는 부재하의 배양에서 7, 10, 및 14 일 후 CD34+ 세포(조혈모세포), CD34+/CD45RA-세포(LT-HSC), 및 CD34+/CD38-/CD45RA-세포 각각의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
도 22는 경증 고체온(39℃) 및 PIC 하의 배양에서 14일 후 CD34+/CD38-/CD45RA-세포의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
도 23, 24 및 25는 경증 고체온의 존재("39") 또는 부재("37") 및/또는 PIC의 존재 또는 부재하의 배양에서 10, 14, 및 17 일 후 이동 말초혈액 유도 CD34+ 세포(조혈모세포), CD34+/CD45RA-세포(LT-HSC), 및 CD34+/CD38-/CD45RA-세포의 증폭 배율을 각각 나타낸 것이다.
도 26, 27 및 28은 경증 고체온의 존재("39") 또는 부재("37") 및/또는 PIC의 존재 또는 부재하의 배양에서 10, 14, 및 17 일 후 인간 골수 유도 CD34+ 세포(조혈모세포), CD34+/CD45RA-세포(LT-HSC), 및 CD34+/CD38-/CD45RA-세포의 증폭 배율을 각각 나타낸 것이다.
도 29는 경증 고체온의 존재("39") 또는 부재("37") 및/또는 PIC의 존재 또는 부재하의 배양에서 21일 동안 CD34+/ALDHBright 세포의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
본 발명은 경증 고체온(예를 들어, 38℃ 내지 40℃) 및 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제의 존재를 포함하는 세포 배양 조건이 상승적으로 작용하여 조혈모세포(HSC)의 증폭 및/또는 기원세포(예를 들어, 골수 기원세포, 거핵구 기원세포)로의 분화를 촉진한다는 놀라운 발견으로부터 시작한다. 실제로, 일부 구체예에서, 경증 고체온과 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제의 조합은 조혈모세포를 기하급수적으로 증폭시키는 것으로 나타났다. 이외에도, 이러한 조합은 또한, 일부 구체예에서 HSC의 기원세포(예를 들어, 골수 기원세포, 거핵구 기원세포)로의 분화를 기하급수적으로 증가시키는 것으로 나타났다.
일부 측면에서, 본 발명은 (a) 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제를 포함하는 세포 배양 배지에서 조혈모세포를 증식하고; (b) 경증 고체온(예를 들어, 38℃ 내지 40℃의 인큐베이션 온도)의 조건 하에 조혈모세포를 인큐베이션하는 것을 포함하는 조혈모세포의 시험관내 배양방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 본 방법은 (c) 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제를 제거하고 38℃ 내지 40℃의 인큐베이션 온도에서 세포의 증식을 지속하여 더욱 동조화된 세포 집단을 생산하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용된, "조혈모세포" 또는 "HSC"란 (혈액에서 발견되는 모든 세포 성분, 예컨대 백혈구, 적혈구, 혈소판 등을 생산할 수 있는)다분화능(multi-potency)과 자기재생능을 모두 갖는 세포를 지칭한다. 양성 선택 마커로서 CD34를 사용하여 조혈모세포를 농축(enrich)할 수 있고, 따라서 일부 구체예에서 CD34+ 세포는 조혈모세포로서 사용될 수 있다. CD34 이외에도 다수의 다른 조혈모세포 마커를 단독 또는 조합으로 사용하여 당 분야에서 알려진 방법에 의해 HSC의 제공된 집단을 동정, 농축 및/또는 단리할 수 있다(예를 들어, FACS, 면역자기 입자). 이러한 목적에 유용할 수 있는 다른 마커의 예로는 CD133/AC133+, Lin-, ALDHhi 또는 ALDHBright, CD38-, CD71-, HLA-DR-, CD33-, CD117/c-kit+, CD59+, CD90/Thy-1+, 및 CD49f+가 있다. 특히, 일부 구체예에서 장기 조혈모세포(LT-HSC)는 마커, 예컨대 CD34+/CD45RA-, CD34+/CD38-/CD45RA-, 및 CD49f+를 사용하여 동정, 농축 및/또는 단리할 수 있다. 여기에 열거되지 않은 다른 마커들 또한 HSC의 제공된 집단을 동정, 농축 및/또는 단리하는데 유용할 수 있고, 이러한 마커들도 본 발명의 범위 내인 것으로 간주된다. 일부 구체예에서, HSC는 제대혈의 세포; 골수; 말초혈액; 유도 다능성 줄기세포; 배아줄기세포; 비조혈, 분화 세포의 트랜스분화로 얻어진 세포; 유전적으로 변형된 HSC; 불멸화(immortalized) 또는 조작된 HSC; 만능 또는 다능 세포의 다른 공급원; 또는 이들의 임의의 조합으로부터 단리되거나 유도될 수 있다. 일부 구체예에서, HSC는 (예를 들어 G-CSF로 이동화된)이동성 말초혈액 세포로부터 단리되거나 유도될 수 있다. 일부 구체예에서, HSC는 부동화 말초혈액 세포(즉, 예를 들어 G-CSF로 이동화되지 않은 말초혈액 세포)로부터 단리되거나 유도될 수 있다. 일부 구체예에서, HSC는 이동성 또는 부동성 말초혈액 세포의 백혈구감소 및/또는 백혈구제거 후에 남아있는 세포(예를 들어, 혈소판 수혈 장치의 백혈구제거 챔버 내에 남아있는 세포, 또는 전체 혈액 수집 세트의 백혈구제거 필터로부터 회수된 세포; 이러한 백혈구제거 장치는 그렇지 않으면 폐기됨)로부터 단리되거나 유도될 수 있다. 본 발명은 다양한 공급원과 정제, 처리 및/또는 농축 방법들로부터의 HSC에 적용될 수 있다. 이러한 공급원과 방법의 비제한적인 예를 본원에 기술하였으나, 본원에서 명확하게 언급되지 않은 HSC의 다른 공급원들도 본 발명에 따라 사용할 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "증식(propagating)"이란 특정 목적, 예컨대 특정 세포 집단(예를 들어, HSC 및/또는 CD34+ 세포)의 증폭, 및/또는 목적하는 세포 계통 (예를 들어, 거핵구 계통, 또는 골수 기원세포를 유발하는 다른 계통)으로의 세포분화 촉진을 달성하기 위한 세포(예를 들어, 조혈모세포)의 시험관내 배양을 지칭한다. 일부 구체예에서, "증식"은 소형 "실험실 규모(lab-scale)" 세포 배양 또는 (예를 들어, 생체반응기를 사용하는)대규모 세포 배양을 지칭할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포를 증식하는데 사용되는 세포 배양 배지의 조성물은 특정한 세포 타입 (예를 들어, HSC 및/또는 CD34+ 세포)의 증폭을 촉진하거나, 목적하는 세포 계통 (예를 들어, 거핵구 계통, 또는 골수 기원세포로부터 발생하는 다른 계통)으로의 분화를 촉진하기 위해 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세포 배양 배지는 하나 이상의 사이토카인을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 사이토카인은 다음을 포함할 수 있다: 줄기세포인자(SCF); 트롬보포이에틴(TPO); 또는 둘 다. 본원에서 사용된, "-로의 분화를 촉진한다"라는 표현은 반드시 종말점(즉, 성숙하고 충분히 분화된 세포로의 최종 세포 분화)에 이르는 것이 아니라 특정한 종말점을 향한 세포분화의 일반적 방향을 지칭한다. 이러한 매질과 첨가제(예를 들어, 상이한 사이토카인 칵테일 및/또는 특정 계통으로의 증폭 및/또는 분화에 영향을 미치는 다른 세포 배양 배지 성분)는 이 분야의 숙련된 사람들에게 일반적으로 알려져 있다. 대부분의 적합한 매질과 첨가제는 이 분야의 사람들이 상업적으로 입수할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 내용 중 제한된 분화를 사용한 CD34+ 세포 배양 및 증폭에 있어서, 세포는 다양한 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 StemSpan™ ACF, SFEM, 또는 SFEM II에서 증식되고 상업적으로 입수가능한 사이토카인 칵테일, 예컨대 CC110 (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada)으로 보충될 수 있다. 일부 구체예에서, 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일을 제조할 수 있고 이것은 다음을 포함할 수 있다: 인간 FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3) (예를 들어, 100 ng/mL), 줄기세포인자(SCF) (예를 들어, 100 ng/mL), 트롬보포이에틴(TPO) (예를 들어, 50 ng/mL), 저밀도 리포단백질(LDL) (예를 들어, 10 μg/mL), 또는 이들의 임의의 조합. 본 발명의 내용에서 자기재생 조건하에서 HSC(예를 들어, CD34+ 세포)의 증식을 구현할 수 있는 이러한 세포 배양 배지/사이토카인 칵테일 등은 본원에서 "조혈모세포 배양 배지"라고 지칭하였다. 그러나, 다른 종류의 세포 배양 배지 및/또는 첨가제(예를 들어, 사이토카인 칵테일)를 사용할 수 있으며 본 발명은 실시예에서 사용된 세포 배양 배지에 제한되지 않아야 한다.
본 발명의 내용 중 거핵구 계통으로의 배양 및 분화에 있어서, 정제된 CD34+ 세포는 배지, 예컨대 StemSpan™ ACF 또는 SFEM 배지(STEMCELL™ Technologies)에서, 사이토카인 칵테일, 예컨대 OMPC 사이토카인 칵테일(Robert 등, 2011), 또는 BS1 거핵구 증폭 및 분화 사이토카인 칵테일(Cortin 등, 2005)을 보충하여 배양할 수 있다. OMPC 사이토카인 칵테일은 TPO(예를 들어, 35 ng/mL), SCF(예를 들어, 10 ng/mL), 및 인간 FLT3(11 ng/mL)를 포함한다. BS1 사이토카인 칵테일은 TPO(예를 들어, 30 ng/mL TPO), SCF(1 ng/mL), IL-6(예를 들어, 7.5 ng/mL), 및 IL-9(예를 들어, 13.5 ng/mL)을 포함한다. 본 발명의 내용에서 거핵구 계통으로의 HSC 분화를 촉진하는 이러한 세포 배양 배지/사이토카인 칵테일 등은 본원에서 "거핵구 계통으로의 조혈모세포 분화를 촉진하는 배지"라 지칭한다. 그러나, 다른 종류의 세포 배양 배지 및/또는 첨가제 (예를 들어, 사이토카인 칵테일)를 사용할 수 있으며 본 발명은 실시예에서 사용된 세포 배양 배지에 제한되지 않아야 한다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 상이한 세포 증폭 방법 또는 세포 집단은 더 큰 효능(예를 들어, 가속 혈소판 회복을 촉진시키기 위해 대상에 주입되거나 이식될 세포 집단을 생산하는 것)을 위해 함께 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21 일 동안 증식될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21 일 동안 인지할 수 있는 세포 생존능 및/또는 "줄기능(stemness)"의 상실 없이 조혈모세포 증식이 가능하다. 본원에서 사용된, "인지할 수 있는 세포 생존능 상실"이란 표현은 세포 사멸비율이 세포 증폭비율보다 더 커서 주목하는 총 생존 세포의 순 증폭이 더 이상 관찰되지 않는 경우를 지칭한다. 이 분야의 사람이라면 세포 배양 배지가 증폭 및/또는 분화의 특정한 요구에 적합하도록 적응될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 구체예에서, 세포 배양 배지는 비분화성 배지일 수 있다.
일부 구체예에서, 경증 고체온 및 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제의 첨가는 목적하는 배양 결과에 따라 다양한 기간 동안 및/또는 상이한 시점에 조합될 수 있다(예를 들어, 제공된 시험관내 배양 기간 동안 동시 및/또는 교대 방식). 이러한 변형은 본 발명의 일부 구현예의 범위 내에 있으며, 여기서 이러한 변형은 제공된 시험관내 배양 기간 동안 경증 고체온 또는 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제만을 사용하여 HSC 배양에 비하여 세포 증폭의 양을 향상시킨다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 조혈모세포를 증폭하는 방법에 관한 것이고, 여기서 세포 배양 배지는 조혈모세포 배양 배지이다. 일부 구체예에서, 조혈모세포를 시험관내에서 증폭하는 본 방법은 성인에서 성공적인 생착(engraftment)을 위한 충분한 수의 세포를 얻기 위해 제대혈로부터 HSC를 증폭하는데 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명은 조혈모세포의 시험관내 증폭방법에 관한 것으로, 본 방법은: (a) 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제를 포함하는 조혈모세포 세포 배양 배지에서 조혈모세포를 증식하고; (b) 38℃ 내지 40℃의 인큐베이션 온도에서 조혈모세포를 인큐베이션하는 것을 포함하고, 여기서 얻어진 조혈모세포 증폭의 수준은 (a) 또는 (b) 중 어느 하나만으로 조혈모세포를 배양하여 얻어질 수 있는 것보다 더 높다. 일부 구체예에서, HSC는 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 배 (예를 들어, 5 내지 21 일 배양) 증폭된다. 일부 구체예에서, HSC는 장기-재집단(repopulating) HSC (LT-HSC), 예컨대 CD34+/CD45RA-세포, CD34+/CD38-/CD45RA- 또는 CD49f+이다. 일부 구체예에서, LT-HSC는 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 200 배(예를 들어, 5 내지 21일 배양) 증폭된다. 당업자라면 얻어진 증폭 배율의 실제값이 수많은 인자들, 예컨대 출발물질 세포의 품질 및/또는 양에 따라 변화할 수 있는 것을 이해할 것이다. 이러한 변화는 본 발명의 범위 내에 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 조혈모세포를 배양하여 골수 기원세포를 생산하는 방법에 관한 것으로, 여기서 세포 배양 배지는 골수 기원세포로의 조혈모세포 분화를 촉진하는 배지이다. 본원에서 사용된, "골수 기원세포"란 하나 이상의 거핵구, 하나 이상의 적혈구, 하나 이상의 비만 세포 또는 하나 이상의 골수모세포로 분화하도록 유도될 수 있는 조혈세포를 지칭한다. 일부 구체예에서, 골수 기원세포는 CD34+/CD41+ 세포(거핵구 기원세포)로서 확인될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명은 골수 기원세포를 생산하기 위해 조혈모세포를 시험관내 배양하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은: (a) 조혈모세포의 골수 기원세포로의 분화를 촉진하는 세포 배양 배지에서 조혈모세포를 증식하고(여기서 세포 배양 배지는 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제를 포함한다); (b) 38℃ 내지 40℃의 인큐베이션 온도에서 조혈모세포를 인큐베이션하는 것을 포함하고, 여기서 얻어진 골수 기원세포의 수준은 (a) 또는 (b) 중 어느 하나만으로 조혈모세포를 배양하여 얻어질 수 있는 것보다 더 높다. 일부 구체예에서, 골수 기원세포는 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 배 (예를 들어, 5 내지 21 일 배양) 증폭된다. 당업자라면 얻어진 증폭 배율의 실제값이 수많은 인자들, 예컨대 출발물질 세포의 품질 및/또는 양에 따라 변화할 수 있는 것을 이해할 것이다. 이러한 변화는 본 발명의 범위 내에 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 거핵구 기원세포를 생산하기 위해 조혈모세포를 배양하는 방법에 관한 것으로, 여기서 세포 배양 배지는 거핵구 계통으로의 조혈모세포의 분화를 촉진하는 배지이다. 본원에서 사용된, "거핵구 기원세포"란 하나 이상의 거핵구로 분화하도록 유도될 수 있는 조혈세포를 지칭한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 거핵구 기원세포를 생산하기 위해 조혈모세포를 시험관내 배양하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은: (a) 조혈모세포의 거핵구 계통으로의 분화를 촉진하는 세포 배양 배지에서 조혈모세포를 증식하고(여기서 세포 배양 배지는 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제를 포함한다); (b) 38℃ 내지 40℃의 인큐베이션 온도에서 조혈모세포를 인큐베이션하는 것을 포함하고, 여기서 얻어진 거핵구 기원세포의 수준은 (a) 또는 (b) 중 어느 하나만으로 조혈모세포를 배양하여 얻어질 수 있는 것보다 더 높다. 일부 구체예에서, 거핵구 기원세포는 혈소판 또는 혈소판 유사 단편으로 분화하도록 촉진될 수 있다. 일부 구체예에서, 거핵구 기원세포는 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 배 (예를 들어, 5 내지 14 일 배양) 증폭된다. 당업자라면 얻어진 증폭 배율의 실제값이 수많은 인자들, 예컨대 출발물질 세포의 품질 및/또는 양에 따라 변화할 수 있는 것을 이해할 것이다. 이러한 변화는 본 발명의 범위 내에 있다.
일부 측면에서, 본 발명은 "조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제" 존재하의 세포 증식에 관한 것이다. 본원에서 사용된 이 표현은 HSC 증폭을 자극하는 능력을 갖는 피리미도인돌과 어느 정도의 구조적 유사성을 공유하는 저분자 화합물을 지칭한다. "조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제"에 의해, 화합물의 충분한 농도 또는 투여량이 세포 배양 배지에 존재하여 원하는 효과(예를 들어, 본 발명의 내용에 있어서 HSC 증폭의 자극 및/또는 경증 고체온 사용과의 상승작용)를 유발한다. 일부 구체예에서, 피리미도인돌 유도체는 "피리미도[4,5-b]인돌 유도체"일 수 있다. 이러한 유도체는 이전에, 예를 들어 WO 1993/020078; WO 1995/019970; WO 1997/002266; WO 1998/042708; WO 2000/066585; WO 2003/037898; WO 2004/058764; WO 2005/037825; WO 2006/116733; WO 2008/055233; WO 2009/004329, 및 WO 2010/006032에 기술되었다. 일부 구체예에서, 피리미도[4,5-b]인돌 유도체는, 예를 들어 Fares 등, 2014, 또는 WO 2013/110198에 기술된 화합물, 예컨대 (1r,4r)-N1-(2-벤질-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-일)사이클로헥산-1,4-디아민 [UM171], 또는 메틸 4-(3-(피페리딘-1-일)프로필아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카복실레이트 [UM729]일 수 있다. 이러한 화합물들은 아릴 탄화수소 리셉터(AhR) 경로(Fares 등, 2014)의 억제제로서 작용하지 않으면서 장기-재집단 HSC(LT-HSC)가 농축된 CD34+/CD45RA-이동 말초혈액 세포의 증폭을 자극하는 것으로 나타났다. 따라서, 일부 구체예에서, 피리미도인돌 유도체는 CD34+/CD45RA-세포 증폭의 AhR 경로 비의존성 피리미도[4,5-b]인돌 유도체 작용제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제 농도는 DMSO 같은 담체 중의 원액으로 제조할 수 있다. 일부 구체예에서, 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제 농도는 10, 15, 20, 25, 또는 30 nM, 내지 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 nM일 수 있다. 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제 농도는 분자의 역가에 따라 변경될 수 있고, 여기에 명시적으로 언급되지 않은 다른 농도 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 일부 구체예에서, 상기한 피리미도인돌 유도체의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 프로드럭 또는 입체이성체도 본 발명의 범위 내일 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "프로드럭"은 (예를 들어, 생체 내에서)대사되었을 때 목적하는 활성 화합물을 수득하는 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 프로드럭은 불활성이거나 목적하는 활성 화합물보다 활성이 적지만 유리한 취급, 투여 또는 대사특성을 제공할 수 있다. 달리 특정되지 않는 한, 특정 화합물에 대한 레퍼런스 또한 그의 프로드럭을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 피리미도인돌 유도체는 다른 화합물, 예컨대 아릴 탄화수소 리셉터 (AhR)의 길항제 (예를 들어, SR1: 4-[2-[[2-벤조[b]티엔-3-일-9-(1-메틸에틸)-9H-퓨린-6-일]아미노]에틸-페놀)와 조합하여 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 아릴 탄화수소 리셉터 화합물의 길항제 (예를 들어, SR1)는 DMSO 같은 담체 중의 원액으로 제조할 수 있다. 일부 구체예에서, 아릴 탄화수소 리셉터 화합물의 길항제 (예를 들어, SR1)는, 예를 들어 100 내지 1000 nM, 200 내지 900 nM, 300 내지 800 nM, 400 내지 800 nM, 450 내지 750 nM, 700 내지 800 nM, 또는 450 내지 550 nM로 사용할 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명은 경증 고체온 하의 세포 증식에 관한 것이다. 일부 구체예에서, "경증 고체온"이란 38℃ 내지 40℃, 바람직하게 39℃의 인큐베이션 온도에서 세포를 증식하는 것을 지칭한다. 물론, 당업자라면 일반적으로 세포가 제공된 세포 집단에 대해 권장 온도(예를 들어, 일반적으로 37℃)보다 1 내지 3℃ 더 높은 온도에서 배양/증식되는 한, 상기한 온도 범위를 벗어나는 일시적인 변이가 허용될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구체예에서, 세포는 경증 고체온 하에 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21 일 동안 유지된다. 일부 구체예에서, 세포는 경증 고체온 하에 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21일 동안 연속 유지된다.
일부 측면에서, 본 발명은 본원에서 정의된 방법으로 생산된 증폭 조혈모세포, 골수 기원세포, 거핵구 기원세포, 또는 이들의 임의의 조합의 집단인 시험관내 증폭 세포 집단에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 상이한 시험관내 증폭 세포 집단은 더 큰 치료적 이점(예를 들어, 가속된 혈소판회수 촉진)을 위해 조합될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 시험관내 증폭 세포 집단은 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%의 CD34+/CD41+ 세포를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명은 대상으로의 이식, 또는 대상으로의 이식용 치료 조성물의 제조를 위한 본원에 기술된 시험관내 증폭 세포 집단의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 시험관내 증폭 세포 집단은 조혈모세포 이식에서 사용하거나 이를 위한 치료 조성물 제조를 위한 증폭 조혈모세포 집단일 수 있다. 일부 구체예에서, 시험관내 증폭 세포 집단은 혈소판 감소증의 치료에서 사용하거나, 이를 위한 치료 조성물의 제조를 위한 거핵구 기원세포 집단일 수 있다. 따라서, 일부 측면에서 본 발명은 본원에서 정의된, 증폭 조혈모세포, 골수 기원세포, 또는 거핵구 기원세포의 집단을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 일반적 완충 염류 용액(예를 들어, 약 135-150 mM NaCl)을 포함할 수 있다). 다른 적합한 담체들로는 비제한적으로 물, 완충수, 0.4% 염류 용액, 0.3% 글리신 등이 있다. 본 발명의 배양 줄기세포를 전달하는데 사용하기 적합한 다른 담체들은, 예를 들어 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co., Philadelphia, Pa., 18th ed. (1995)에 기술되어 있다.
본 발명의 다른 목적, 이점 및 특징은 첨부된 도면과 관련하여 단지 예시적으로 주어진 이하의 구체적인 실시예들의 비제한적 설명의 해석에 따라 더욱 명백해질 것이다.
실시예
실시예 1:
실시예 2 내지 5의 재료 및 방법
1.1 재료
달리 표시하지 않는 한, 모든 약품은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (Oakville, ON, Canada)로부터 구매하였다.
1.2 인간 제대혈로부터 CD34+ 세포의 단리 및 배양
CD34+ 세포를 인간 제대혈로부터 표준 방법에 따른 포지티브 선택에 의해 단리하였다. 제대혈의 단일 단위 또는 수 단위로부터 모아진 정제 CD34+ 세포를 24 웰 플레이트에서 1mL의 적절한 배양 배지에 약 105 세포/mL의 밀도로 접종하였다. 세포는 배양하는 동안 희석 및/또는 배지 교환에 의해 105-106 세포/mL의 밀도로 유지되었다.
거핵구 계통으로의 배양 및 분화를 위해, 정제 CD34+ 세포를 항생제 및 이전에 기술된 "BS1" 사이토카인 칵테일(Cortin 등, 2005)이 보충된 StemSpan™ ACF 배지 (STEMCELL™ Technologies, Vancouver, BC, Canada)에서 배양하고, 세포를 6, 10 및 14일차에 계수하였다.
CD34+ 세포 배양 및 증폭에서는 분화를 제한하면서 세포를 StemSpan™ CC110 사이토카인 칵테일(STEMCELL™ Technologies)이 보충된 StemSpan™-ACF 배지 (STEMCELL™ Technologies)에서 배양하고, 세포를 4, 7, 10, 14, 17 및 21일차에 계수하였다.
세포 계수 및 생존능은 NucleoCounter® NC-250™ 생존능 및 세포 계수 어세이 시스템(ChemoMetec Inc., Davis, CA)를 사용하여 제조자의 설명서에 따라 측정하였다.
1.3 세포 표현형 분석
세포 표현형을 다음 패널의 표지된 프라이머리 항체를 사용하여 표시된 날짜에 유세포 분석기로 측정하였다.: CD34-FITC, CD45RA-APC, CD41a-APC, CD42b-PE, 및 CD235-PE.
1.4 CFU-MK 어세이
StemSpan™ ACF + BS1 배양 배지에서 배양된 세포 분액을 표시된 날짜에 수집하여 CFU-MK를 STEMCELL™ Technologies의 Megacult™ C 키트를 사용하여 제조자의 설명서에 따라 측정하였다.
실시예 2:
거핵구 기원세포의 증폭을 증가하는 경증 고체온 하의 배양과 피리미도인돌 화합물 PIC의 조합
CD34+ 세포를 실시예 1.2에서 일반적으로 기술한 바와 같이 단리하여 거핵구 계통으로의 분화를 위해 배양하였다. 거핵구 기원체(MKP) 세포 증폭에 대한 경증 고체온과 피리미도인돌 화합물 조합의 효과를 측정하기 위해, CD34+ 세포를 37℃ 또는 39℃에서, 35 nM(최종 농도)의 피리미도인돌 화합물이 보충되거나 보충되지 않은 세포 배양 배지 존재하에 배양하였다:
본원에서 "PIC"라 지칭되는 피리미도인돌 화합물:
( 1r,4r )-N1-(2- 벤질 -7-(2- 메틸 -2H- 테트라졸 -5-일)-9H- 피리미도[4,5-b인돌4- 일)사이클로헥산-1,4-디아민 염산염 ("UM171")
유세포 분석기를 사용하여 실시예 1.3에 기술된 바와 같이 시간에 따라 CD34+/CD41+ MKP 세포의 증폭을 관찰하였다
도 1에서 보이는 바와 같이, 37℃에서 PIC의 존재("37℃ + PIC") 또는 부재 ("37℃") 하에 배양된 세포는 PIC의 부재하에 경증 고체온("39℃")에서 배양된 세포와 마찬가지로, CD34+/CD41+ MKP 세포의 증폭이 5배 미만이었다. 흥미롭고 놀라웁게도, 경증 고체온 및 PIC의 조합("39℃ + PIC")으로 보통 40%를 초과하는 CD34+/CD41+ 세포의 순도(데이터 미기재)로 14일까지 거의 100배에 이르는 CD34+/CD41+ MKP 세포의 증폭을 얻었다.
실시예 3:
보다 균질한 거핵구 기원세포 집단을 수득하는 경증 고체온 하의 배양과 피리미도인돌 화합물 PIC의 조합
실시예 2에서 단리 및 배양된 CD34+ 세포의 보다 철저한 세포 표현형 프로파일을 6, 10 및 14일차에 유세포 분석기에 의해 실시예 1.3에 기술된 바와 같이 측정하였다. 그 결과를 표 1에 요약하였으며, 이것은 표시된 세포 표면 마커 또는 마커들의 조합을 함유하는 세포의 비율을 나타낸다.
Figure pct00001
표 1에서 보이는 바와 같이, 경증 고체온에서 PIC 존재("39℃ + PIC") 하에 CD34+ 세포를 배양하여 6, 10 및 14일차에 표준 온도에서 PIC의 부재("37℃") 또는 존재("37℃ + PIC") 하에서 CD34+ 세포를 배양하는 것, 또는 PIC 없이 경증 고체온("39℃") 하에서 세포를 배양하는 것보다 더 높은 비율의 CD34+/CD41+ MKP 세포를 얻었다. 보다 구체적으로, 경증 고체온에서 PIC 존재("39℃ + PIC") 하에 14일 동안 배양된 CD34+ 세포는 76.5%의 CD34+/CD41+ MKP 세포를 수득한 반면, PIC 만("37℃ + PIC") 또는 경증 고체온 만("39℃")을 사용하는 경우는 각각 11%와 10%의 CD34+/CD41+ MKP 세포를 수득하였다. 이러한 결과는 거핵구 기원세포의 보다 균질한 세포 집단은 거핵구 기원세포로의 분화에 유리한 표준 조건에서 CD34+ 조혈모세포를 배양하여 얻어질 수 있는 것을 나타내며, 여기서 표준 배양 조건은 피리미도인돌 화합물과 39℃의 인큐베이션 온도의 조합에 의해 조절될 수 있다.
또한, 표 1에서 보이는 바와 같이, 39℃에서 PIC 존재("39℃ + PIC") 하에 배양된 배양물만 14일차에 성숙 거핵구의 전형인 표현형 CD41+/CD42+의 세포 27%를 가진 반면, 39℃에서 PIC 부재("39℃") 하에 배양된 배양물은 68%의 CD41+/CD42+ 성숙 거핵구를 가졌다. 37℃에서 PIC 존재("37℃ + PIC") 하에 배양된 배양물은 14일차에 CD41+/CD42+ 성숙 거핵구가 거의 없는 반면, 37℃에서 PIC 부재("37℃") 하에 배양된 배양물은 44%의 CD41+/CD42+ 성숙 거핵구를 가졌다. 이러한 결과는 피리미도인돌 화합물이 성숙 CD41+/CD42+ 거핵구 단계 이전에 CD34+ 세포의 고체온 유도성 분화를 차단하거나/하고 CD34+/CD41+ 거핵구 기원세포를 우선적으로 증폭 및 유지하는 것을 시사한다. 따라서, 일부 구체예에서 피리미도인돌 화합물을 제거하고 세포를 경증 고체온의 조건하에 추가로 증식하여 더 많은 동조화 세포 집단을 생산할 수 있다.
이론과 결부되는 것은 아니지만, 경증 고체온과 PIC를 조합하였을 때 얻어진 세포 표현형의 분포는 두 이팩터가 시너지로 작용하여 거핵구 계통으로의 CD34+ 세포 분화를 기원체 수준까지 진전시키고 유지하여, 배양 14일 후에 CD34+/CD41+ MKP가 전체 집단에서 대다수의 세포를 나타내는 것임을 강하게 시사하고 있다.
실시예 4:
CFU -MK의 수를 증강하는 경증 고체온 하의 배양과 피리미도인돌 화합물의 조합
실시예 2에 기술된 바와 같이 단리 및 배양된 정제 CD34+ 세포로 출발하여 39℃ 인큐베이션 온도와 PIC 피리미도인돌 화합물, 단독 또는 조합의 얻어진 CFU-MK의 수에 대한 효과를 실시예 1.4에 기술된 표준 기원세포 어세이에 의해 분석하였다.
도 2에서 보이는 바와 같이, 39℃ 인큐베이션 온도와 PIC의 조합("39℃ + PIC") 효과는 개별적으로 시험된 어느 하나의 조건("39℃" 또는 "37℃ + PIC")과 비교하여 상당히 많은 CFU-MK를 생산하였다. 더욱 구체적으로, "39℃ + PIC"에서 얻어진 CFU-MK의 수는 배양물을 37℃에서 PIC("37℃ + PIC")와 배양하여 얻어진 것과 비교하여 2배를 초과하였고, 배양물을 39℃에서 PIC 부재하("39℃")에 배양하여 얻어진 CFU-MK의 수에 4배를 넘었다. 또한, 39℃에서 PIC 존재하("39℃ + PIC")에 배양된 세포로부터 얻어진 CFU-MK의 수는 개별적으로 시험된 어느 하나의 조건("39℃" 또는 "37℃ + PIC")의 CFU-MK의 수를 추가하여 얻어질 수 있는 것보다 훨씬 더 컸다. 이러한 결과는 경증 고체온과 PIC의 조합이 얻어진 CFU-MK의 수를 증가하도록 상승작용하였다는 것을 나타낸다. 현재의 기술은 시험관 내에서 CFU-MK 포텐셜을 갖는 세포를 증폭하는데 비효율적이기 때문에 예측하지 못한 효과가 특히 흥미롭다.
실시예 5:
초기 표현형을 유지하면서 CD34+ 세포의 증폭을 증가하는 경증 고체온 하의 배양과 피리미도인돌 화합물 PIC의 조합
CD34+ 세포를 단리하여 그의 전구체로의 분화를 제한하면서 자기재생을 유지하는데 적합한 배지에서 배양하였다 (StemSpan™ CC110 사이토카인 칵테일이 보충된 StemSpan™ ACF, 실시예 1.2). CD34+ 세포를 37℃ 또는 39℃에서, 35 nM (최종 농도)의 피리미도인돌 화합물 PIC가 보충되거나 보충되지 않은 세포 배양 배지 존재하에 배양하였다..
도 3(A)에서 보이는 바와 같이, 37℃에서 PIC 부재하에 배양된 세포("37℃")는 배양하는 동안 언제나 CD34+ 세포의 적당한 증폭을 수득하였다. 세포 배양 배지에 PIC를 보충하여 21일차에 증폭을 100 내지 200배까지 증가하였다. 확연하게, 39℃에서 PIC 없이 배양된 세포("39℃")는 CD34+ 세포의 최소 세포 증폭을 얻은 반면, 39℃에서 PIC 존재하에 세포("39℃ + PIC")를 배양하여 21일차에 1000배 초과의 증폭으로 CD34+ 세포 증폭의 급격한 증가를 나타냈다. 이러한 결과는 CD34+ 세포의 증폭에 있어서 경증 고체온과 피리미도인돌 화합물의 강력한 상승효과를 나타내는 것이다.
증폭된 CD34+ 세포의 세포 표현형 프로파일을 4, 7, 10, 14, 17, 및 21일차에 유세포 분석기에 의해 실시예 1.3에 기술된 바와 같이 측정하였다. 그 결과를 표 2에 요약하였으며, 이것은 표시된 세포 표면 마커 또는 마커들의 조합을 함유하는 세포의 비율을 나타낸다.
Figure pct00002
표 2에 제공된 표현형 분석 결과는 경증 고체온과 PIC의 조합 치료가 거핵구 및 적혈구(CD235+) 계통으로의 증강된 세포 분화를 유도하지 않는 것을 나타내고 있으며, 이것은 "줄기능"이 어느 정도까지 유지되었다는 것을 보여준다. 이론과 결부되는 것은 아니지만, 이러한 결과는 종합적으로 피리미도인돌 화합물의 사용과 조합된 경증 고체온이 피리미도인돌 화합물의 항분화 효과를 보존하면서, 세포의 시험관내 증폭에 대한 39℃ 인큐베이션 온도의 자극 효과를 동시에 강화하는 것을 나타낸다.
도 3(A)에 제시된 결과는 CD34+ 세포의 전체 집단으로부터 유래한 것이다. CD34+/CD45RA-세포의 소집단이 진성 장기 조혈모세포(LT-HSC)를 나타내는 것으로 판단된다. 전체 세포 증폭의 결과와 표 2의 결과를 결합하여 CD34+/CD45RA-LT-HSC의 절대 수치와 증폭 배율을 결정할 수 있었다. 도 3(B)에서 보이는 바와 같이, CD34+/CD45RA-LT-HSC의 증폭은 39℃에서 PIC 화합물 존재하에 세포("39℃ + PIC")를 배양하여 강력하게 증강되었다. 이러한 결과는 경증 고체온과 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 작용제의 상승효과가 다양한 목적과 여러 조혈 계통의 유도에 활용될 수 있음을 보여주는 것이다.
실시예 6:
실시예 7 내지 16의 재료 및 방법
6.1 CD34+ 세포의 공급원
인간 제대혈(CB)을 당 연구소의 Research Ethics Committee 지침에 따라 공여자로부터 서면 동의서를 얻은 후에 수집하였다. 단핵 세포(MNC)를 먼저 Ficoll-HypaqueTM 밀도 그래디언트(GE Healthcare)로 분리한 다음, Cryostor CS10TM 배지 (STEMCELL Technologies)에서 -180℃로 냉동보존하였다. 6 내지 8 CB로부터의 해동 MNC를 CD34 단리 전에 모았다. CB CD34+ 세포를 제조사의 설명서에 따라 EasySepTM CD34 강화 키트(STEMCELL Technologies)를 사용하여 포지티브 선택에 의해 강화하였다.
인간 골수 및 G-CSF 이동 말초혈액 CD34+ 세포는 AllCells로부터 구입하였다.
6.2 거핵구 계통으로의 CD34+ 농축(enriched) 세포의 배양 및 분화
인간 CD34+ 농축 세포(순도 ≥ 90%)를 24-웰 플레이트에 100 000 세포/mL로 다음 중 어느 하나로 구성되는 증폭 배지에 접종하였다: (1) OMPC 사이토카인 칵테일(Robert 등, 2011)이 보충된 StemSpanTM ACF(ACF; STEMCELL Technologies), 또는 (2) BS1 거핵구 증폭 및 분화 칵테일(Cortin 등, 2005)이 보충된 StemSpanTM SFEM (STEMCELL Technologies). OMPC는 35ng/mL 트롬보포이에틴(TPO; Feldan Therapeutics), 10 ng/mL 줄기세포인자(SCF; Peprotech), 및 11 ng/mL 인간 FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3, Peprotech)로 구성되었다. BS1은 1 ng/mL SCF, 30 ng/mL TPO, 7.5 ng/mL IL-6 및 13.5 ng/mL IL-9 (Feldan Therapeutics)로 구성되었다.
배양물을 37℃ 또는 39℃에서 5 % CO2로 가습된 대기에서 실시예에 표시된 대로 유지하였다. 세포를 3 내지 4일마다 새로운 배지를 사용하여 300 000 세포/mL로 희석하였다. PIC와 PIC2의 원액을 DMSO에 용해하여 제조한 다음, 배양된 세포에 하기한 최종 유효 농도로 직접 첨가하였다: PIC: 35 nM(실시예 2 참조); PIC2: 500 nM(실시예 7.4 참조)
6.3 적혈구 계통으로의 CD34+ 농축 세포의 배양 및 분화
인간 CB CD34+ 농축 세포(순도 ≥ 90%)를 20 ng/mL SCF (Peprotech) 및 2 U/mL 에리트로포이에틴 (EPO; Feldan Therapeutics)이 보충된 이브(Eave) 기저 배지 (이스코브(Iscove)의 변성 듈베코 배지(IMDM), 20% BIT (10 ng/mL 소혈청알부민, 10 μg/mL 소 췌장 인슐린, 200 μg/mL 인간 트랜스페린(transferrin); STEMCELL Technologies), 0.1 mg/mL 저밀도 리포단백질 (STEMCELL Technologies), 50 μM 2-머캡토에탄올)로 구성되는 증폭 배지에서 100 000 세포/mL로 24-웰 플레이트에 접종하였다. 배양물을 37℃ 또는 39℃에서 5 % CO2로 가습된 대기에서 실시예에 표시된 대로 유지하였다. 세포를 3 내지 4일마다 새로운 배지를 사용하여 300 000 세포/mL로 희석하였다. PIC의 원액을 DMSO에 용해하여 제조한 다음, 배양된 세포에 35nM의 최종 유효 농도로 직접 첨가하였다.
6.4 자기재생에 유리한 조건에서 CD34+ 농축 조혈모세포의 배양
인간 CD34+ 농축 세포(순도 ≥ 90%)를 CC110 (STEMCELL Technologies), 또는 100 ng/mL 인간 FLT3(Peprotech), 100 ng/mL SCF(Peprotech), 50 ng/mL TPO (Feldan Therapeutics) 및 10 μg/mL 저밀도 리포단백질(LDL, STEMCELL Technologies)로 구성되는 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일로 보충된, StemSpanTM ACF (ACF), SFEM, 또는 SFEM II (STEMCELL Technologies)로 이루어진 3종의 증폭 배지 중 하나에 500 000 세포/mL로 24- 또는 96-웰 플레이트에 접종하였다. 배양물을 37℃ 또는 39℃에서 5 % CO2로 가습된 대기에서 실시예에 표시된 대로 유지하였다. 세포를 3 내지 4일마다 새로운 배지를 사용하여 500 000 세포/mL로 희석하였다. PIC와 PIC2의 원액을 DMSO에 용해하여 제조한 다음, 직접 배양된 세포에 하기한 최종 유효 농도로 첨가하였다: PIC: 35 nM; PIC2: 500 nM.
6.5 배양 세포 분석
세포 계수 및 생존능을 Solution 18(Acridine Orange 및 DAPI solution, ChemomMetec)을 첨가하고 검출용 NucleoCounterTM NC-250(ChemomMetec)을 사용하여 측정하였다.
MK 계통으로의 분화에 유리한 조건에서 증폭된 세포에 대해, 표면 마커를 다음 항체를 사용하여 검출하였다: CD34-FITC, CD41a-APC 및 CD42b-PE. 이뮤노테크(Immunotech)에서 구입한 CD34-FITC를 제외하고, 모든 항체는 BD 바이오사이언시즈(Biosciences)에서 구입하였다. 7AAD를 생존능 염료로 사용하였다. 모든 샘플은 AccuriTM C6 유동 세포측정기(BD Biosciences)에서 분석하였고, 미가공 데이터는 FCS Express 5 Flow Research Edition 소프트웨어를 사용하여 각 샘플에서 얻어진 적어도 15000의 생존 세포 이벤트로부터 분석되었다. 콜로니 형성 단위 거핵구 (CFU-MK)는 MegaCult-CTM를 사용하여 제조자의 설명서(STEMCELL Technologies)에 따라 어세이하였다.
적혈구 계통으로의 분화에 유리한 조건에서 증폭된 세포에 대해, 표면 마커를 다음 항체를 사용하여 검출하였다: CD34-FITC, CD71-APC 및 CD235-PE. 이뮤노테크에서 구입한 CD34-FITC를 제외하고, 모든 항체는 BD 바이오사이언시즈에서 구입하였다. 7AAD를 생존능 염료로 사용하였다. 모든 샘플은 AccuriTM C6 유동 세포측정기(BD Biosciences)에서 분석하였고, 미가공 데이터는 FCS Express 5 Flow Research Edition 소프트웨어를 사용하여 각 샘플에서 얻어진 적어도 15000의 생존 세포 이벤트로부터 분석하였다.
자기재생에 유리한 조건에서 증폭된 세포에 대해, 표면 마커를 다음 항체를 사용하여 검출하였다: CD34-PE, CD45RA-FITC, 및 CD38-BV421. 이뮤노테크에서 구입한 CD34-PE를 제외하고, 모든 항체는 BD 바이오사이언시즈에서 구입하였다. 알데히드 데히드로게나제(ALDH) 양성 세포를 ALDEFLUOR™ 키트(STEMCELL Technologies)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 표지화하였다. 7AAD를 생존능 염료로 사용하였다. 모든 샘플은 FACS-Cy Flow ML 시스템 (Sysmex)에서 분석하였고, 미가공 데이터는 FCS Express 5 Flow Research Edition 소프트웨어를 사용하여 각 샘플에서 얻어진 적어도 15000의 생존 세포 이벤트로부터 분석하였다.
6.6 CD41+ 세포의 마우스 이식, 및 골수 생착의 평가
7 내지 9주령 암컷 NOD.Cg-Prkdc scid / 12rg tm1Wjl / SzJ(NSG) 마우스를 더 잭슨 래버러토리(The Jackson Laboratory) (Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. 치명적으로 조사된 마우스(250 cGy, 137Cs)를 꼬리정맥 주사에 의해 BS1 칵테일이 보충된 StemSpanTM SFEM 배지에서 10일 동안 증폭된 CB CD34+ 농축 세포로 정맥 내 이식하였다. 각 실험은 골수 생착의 음성 대조군으로서 PBS가 주사된 마우스를 포함하였다. 골수 (BM) 생착 및 인간 혈소판 생산의 평가를 위한 실험군과 대조군은 적어도 6마리의 마우스를 포함하였다. 마우스 골수 내 인간 세포의 생착을 이식한 12 내지 16주 후에 대퇴골과 경골을 플러싱(flushing) 하고 다음 항체를 사용한 유동 세포측정법에 의해 새로 단리된 BM 세포를 분석하여 평가하였다: 인간 CD45-PE-Cy7, 마우스 CD45-PE, 인간 CD41-APC, 인간 CD33-APC, 인간 CD34-PE, 인간 CD235-PE, 인간 CD3-FITC. 7AAD를 생존능 염료로 사용하였다. 레드(Red)세포를 BD 용균 용액을 제조사의 설명서에 따라 사용하여 용해하였다.
6.7 이식 마우스에서 인간 혈소판 생산 분석
안구 뒤 정맥 신경총 혈액(Retro-orbital venous plexus blood)을 마취시킨 마우스에서 EDTA 코팅 모세관(Drummond)을 사용하여 수집하였다. 이식 마우스에서 인간 혈소판 생산에 대한 평가는 2개의 별도 단계로 이루어졌다. 첫 번째로, 마우스 혈소판 계수는 전체 혈액에서 래트-항-마우스 CD41-FITC 항체로 마우스 혈소판을 염색하여 측정되었다. 이후, 샘플을 PBS/1% BSA로 1/18 000로 최종 희석하고 마우스 혈소판의 농도를 유동 세포측정법에 의해 BD AccuriTM C6 장치를 사용하여 어세이하였다. 두 번째로, 인간 혈소판 비율을 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)에서 측정하였다. PRP는 전체 혈액을 PBS로 희석(1/2)하고 30초 동안 800 RPM으로 원심분리하여 제조하였다. 10 마이크로리터의 PRP를 마우스 항-인간 CD41-APC 및 래트 항-마우스 CD41-FITC 항체로 염색하였다. 이후 샘플을 BD AccuriTM C6 장치에서 분석하였고; 적어도 400 000 이벤트가 점도표(dot-plot)의 혈소판 영역에서 얻어졌다.
6.8 자기재생에 유리한 조건에서 CB CD34+ 세포의 시험관내 배양으로 얻어진 새로운 CB CD34+ 세포 또는 그의 계통(progenies)의 마우스 내 이식 및 골수 생착 평가
7 내지 9주령 암컷 NOD.Cg-Prkdc scid / 12rg tm1Wjl / SzJ(NSG) 마우스를 더 잭슨 래버러토리(Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. 치명적으로 조사된 마우스(250 cGy, 137Cs)를 꼬리정맥 주사에 의해 12일 동안 시험관 내에서 증폭된, 새로운 CD34+ 농축 CB 세포, 또는 그의 전체 세포 계통을 정맥 내 이식하였다. 각 실험은 골수 생착의 음성 대조군으로서 PBS가 주사된 마우스를 포함하였다. 실험군과 대조군은 적어도 5마리의 마우스를 포함하였다. 마우스 골수 내 인간 세포의 생착을 이식한 27주 후에 대퇴골과 경골을 플러싱(flushing)하고 다음 항체를 사용한 유동 세포측정법에 의해 새로 단리된 BM 세포를 분석하여 평가하였다: 인간 CD45-PE-Cy7, 마우스 CD45-PE, 인간 CD33-BV421, 인간 CD19-FITC, 인간 CD34-PE, 및 인간 CD3-FITC. 7AAD를 생존능 염료로 사용하였다.
실시예 7:
경증 고체온 및 피리미도인돌 화합물 하의 CD34+/CD41+ 거핵구 기원세포의 증폭에 대한 상이한 CD34+ 세포 공급원의 효과
7.1 제대혈 CD34+ 세포로부터 거핵구 기원세포의 상승적 증폭을 유발하는 경증 고체온과 PIC의 조합 사용
인간 CD34+농축 세포를 인간 제대혈(CB)로부터 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 얻고, OMPC 사이토카인 칵테일이 보충된 StemSpanTM ACF 배지에서 실시예 6.2에 기술된 바와 같이 경증 고체온(39℃)의 존재 또는 부재 및/또는 피리미도인돌 화합물 PIC의 존재 또는 부재하에서 배양하였다(실시예 2 참조). 세포 계수 및 생존능을 실시예 6.5에 기술된 바와 같이 측정하였다
도 4는 상이한 배양 조건 하에서 14일 동안 시험된 CD34+/CD41+ 세포(거핵구 기원세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 제대혈 CD34+ 세포로 부터 CD34+/CD41+ 세포의 증폭에 대한 경증 고체온(39℃)과 PIC의 조합 사용의 상승 효과를 나타내는 것이다.
7.2 이동 말초혈액 CD34+ 세포로부터 거핵구 기원세포의 상승적 증폭을 유발하는 경증 고체온과 PIC의 조합 사용
인간 G-CSF 이동 말초혈액 CD34+ 세포를 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 얻고, BS1 거핵구 증폭 및 분화 칵테일이 보충된 StemSpanTM SFEM 배지에서 실시예 6.2에 기술된 바와 같이 경증 고체온(39℃)의 존재 또는 부재 및/또는 피리미도인돌 화합물 PIC의 존재 또는 부재하에서 배양하였다(실시예 2 참조). 세포 계수 및 생존능을 실시예 6.5에 기술된 바와 같이 측정하였다
도 5는 상이한 배양 조건 하에서 14일 동안 시험된 CD34+/CD41+ 세포(거핵구 기원세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 이동 말초혈액 CD34+ 세포로 부터 CD34+/CD41+ 세포의 증폭에 대한 경증 고체온(39℃)과 PIC의 조합 사용의 상승 효과를 나타내는 것이다.
7.3 골수 CD34+ 세포로부터 거핵구 기원세포의 상승적 증폭을 유발하는 경증 고체온과 PIC의 조합 사용
인간 골수 CD34+ 세포를 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 얻고, BS1 거핵구 증폭 및 분화 칵테일이 보충된 StemSpanTM SFEM 배지에서 실시예 6.2에 기술된 바와 같이 경증 고체온(39℃)의 존재 또는 부재 및/또는 피리미도인돌 화합물 PIC의 존재 또는 부재하에서 배양하였다(실시예 2 참조). 세포 계수 및 생존능을 실시예 6.5에 기술된 바와 같이 측정하였다
도 6은 상이한 배양 조건 하에서 14일 동안 시험된 CD34+/CD41+ 세포(거핵구 기원세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 골수 CD34+ 세포로 부터 CD34+/CD41+ 세포의 증폭에 대한 경증 고체온(39℃)과 PIC의 조합 사용의 상승 효과를 나타내는 것이다.
7.4 제대혈 CD34+ 세포로부터 거핵구 기원세포의 상승적 증폭을 유발하는 경증 고체온과 PIC2의 조합 사용
인간 CD34+농축 세포를 인간 제대혈(CB)로부터 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 얻고, BS1 사이토카인 칵테일이 보충된 StemSpanTM SFEM 배지에서 실시예 6.2에 기술된 바와 같이 경증 고체온(39℃)의 존재 또는 부재 및/또는 피리미도인돌 화합물 "PIC2"의 존재 또는 부재하에서 배양하였다.
"PIC2":
메틸 4-((3-(피페리딘-1-일)프로필)아미노)-9H- 피리미도 [4,5-b] 인돌-7- 카복실레이트 ("UM729").
세포 계수 및 생존능을 실시예 6.5에 기술된 바와 같이 측정하였다
도 7은 상이한 배양 조건 하에서 14일 동안 시험된 CD34+/CD41+ 세포(거핵구 기원세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 CB CD34+/CD41+ 세포의 증폭에 대한 경증 고체온(39℃)과 PIC2의 조합 사용의 상승 효과를 나타내는 것이다.
실시예 8:
시험관내 증폭 MK 기원세포 주입 후 마우스에서 인간 혈소판의 생산
인간 CD41+ 세포를 CB CD34+ 세포를 시험관내에서 경증 고체온 하에 MK 기원세포의 우선적 증폭에 유리한 조건에서 실시예 6.2에 기술된 바와 같이 증폭하여 제조하였다; StemSpan™ SFEM 배지에 시험관내 증폭을 위해 BS1 사이토카인 칵테일을 보충하였다. 10일의 배양 후 얻어진 측정된 CD41+ 세포의 투여량을 실시예 6.6에서 기술된 바와 같이 NSG 마우스에 이식하였다.
마우스에서의 인간 혈소판 생산을 실시예 6.2에 기술된 바와 같이 MK 기원세포의 우선적 증폭에 유리한 조건에서 시험관내 증폭된 CB CD34+ 세포의 주입 5일 또는 2.5주 후에 마우스 혈액 중의 인간 혈소판을 계수하여 측정하였다. 도 8과 9는 각각 5일과 2.5주에 마우스 내 단기 인간 혈소판 생산의 결과를 나타낸 것이다: "MK-6M": StemSpan™ SFEM + BS1 칵테일을 사용하여 생산된 6백만 CD41+ 세포의 주입; "(MK+PIC)-1M": StemSpan™ SFEM + PIC가 보충된 BS1 칵테일을 사용하여 생산된 백만 CD41+ 세포의 주입; "(MK+PIC)-6M": StemSpan™ SFEM + PIC가 보충된 BS1 칵테일을 사용하여 생산된 6백만 CD41+ 세포의 주입; 및 "PBS": 대조군으로서 인산염 완충 염류 용액의 주입. 대쉬(dash) 기호 오른쪽의 숫자는 각 조건에서 혈액 μL 당 인간 혈소판의 평균수를 나타낸다.
실시예 9:
경증 고체온 및 PIC 하에서 CD34+ 세포의 증폭에 대한 적혈구 분화 배지의 효과
인간 CD34+농축 세포를 인간 제대혈(CB)로부터 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 얻고, 적혈구 분화 배지에서 실시예 6.3에 기술된 바와 같이 경증 고체온(39℃)의 존재 또는 부재 및/또는 피리미도인돌 화합물 PIC의 존재 또는 부재하에서 배양하였다(실시예 2 참조). 세포 계수와 생존능은 실시예 6.5에 기술된 바와 같이 측정하였다.
9.1 적혈구 분화 배지에서 CD71+ 세포(적혈구 기원세포) 증폭에 대한 PIC 효과
도 10은 상이한 배양 조건 하에 14일 동안 시험된 CB CD71+ 세포(적혈구 기원세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 경증 고체온(39℃)의 사용 결과, CD71+ 적혈구 전구체의 증폭이 증가하였다 (도 10 참조, "37" 대 "39", 및 "37+"PIC" 대 "39+PIC"). 그러나, PIC 첨가는 CD71+ 적혈구 전구체의 증폭을 감소하였다(도 10 참조, "37" 대 "37+PIC", 및 "39" 대 "39+PIC").
도 11은 상이한 배양 조건 하에 14일 동안 시험된 전체 세포(전체 세포 증폭)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 경증 고체온(39℃)의 사용 결과, 전체 세포 증폭이 증가하였다 (도 11 참조, "37" 대 "39", 및 "37+PIC" 대 "39+PIC"). 그러나, PIC 첨가는 전체 세포 증폭을 감소하였다(도 11 참조, "37" 대 "37+PIC", 및 "39" 대 "39+PIC").
9.2 적혈구 분화 배지에서 CD34+ 세포(HSC) 및 CD34+/CD71+ 세포(적혈구 기원체)의 증폭에 대한 경증 고체온 및 PIC의 가산 효과
도 12 및 13은 각각 상이한 배양 조건 하에 14일 동안 시험된 CD34+ 세포 및 CD34+/CD71+ 세포(적혈구 기원체)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 흥미롭게도, 이러한 결과는 경증 고체온(39℃) 및 PIC의 사용이 적혈구 분화 배지에서 CB CD34+ 세포(도 12)와 CB CD34+/CD71+ 세포(적혈구 기원체) (도 13)의 증폭에 대해 가산 효과가 있는 것을 나타낸다.
실시예 10:
경증 고체온 및 PIC 하에서 CD34+ 세포( HSC ) 및 CD34+/ CD45RA-세포 ( LT -HSC)의 증폭에 대한 상이한 사이토카인 칵테일의 효과
실시예 5에서 제공된 결과는 경증 고체온(39℃)과 PIC의 조합 사용으로 상업적으로 입수가능한 CC110 사이토카인 칵테일이 보충된 StemSpan™ ACF 배지를 사용하였을 때 분화를 제한하면서 CD34+ 세포의 증폭이 증가하였다는 것을 나타낸다. 이 실시예에서 제공된 결과는 경증 고체온(39℃) 및 PIC 하에서 CB CD34+ HSC의 상승적 증폭이 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일을 사용하여 얻어질 수 있는 것을 나타내고 있다.
인간 CB CD34+농축 세포를 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 인간 제대혈(CB)로부터 얻고, 실시예 6.4에 일반적으로 기술된 그의 자기재생에 유리한 조건에서 경증 고체온(39℃)의 존재 또는 부재 및/또는 피리미도인돌 화합물 PIC의 존재 또는 부재하에 배양하였다(실시예 2 참조). 세포 계수와 생존능은 실시예 6.5에 기술된 바와 같이 측정하였다.
도 14는 CC110 사이토카인 칵테일(도 14A) 또는 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일(도 14B) 중 어느 하나를 보충한 StemSpanTM ACF 배지에서 배양된 CB CD34+ 세포(조혈모세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
도 15는 CC110 사이토카인 칵테일(도 15A) 또는 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일(도 15B) 중 어느 하나를 보충한 StemSpanTM ACF 배지에서 배양된 CB CD34+/CD45RA-세포(장기 조혈모세포; LT-HSC)의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
표 3은 14일 동안 자체제작(HM) 또는 CC110 사이토카인 칵테일 중 어느 하나를 보충한 StemSpanTM ACF 배지에서 CB CD34+ 세포를 배양한 후 각각의 표시된 HSC 서브집단의 비율을 나타낸 것이다.
Figure pct00003
실시예 11:
경증 고체온 및 PIC 하의 CD34+ 세포( HSC ) 및 CD34+/ CD45RA-세포 ( LT - HSC )의 증폭에 대한 상이한 기저배지 및 사이토카인 칵테일의 효과
본 실시예에 제공된 결과는 경증 고체온(39℃) 및 PIC 하에서 CB CD34+ HSC 및 CD34+/CD45RA-LT-HSC의 상승적 증폭이 상업적으로 입수가능한 상이한 배지 및 상이한 사이토카인 칵테일을 사용하여 얻어질 수 있음을 보여준다.
인간 CB CD34+농축 세포를 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 인간 제대혈(CB)로부터 얻고, 실시예 6.4에 일반적으로 기술된 그의 자기재생에 유리한 조건에서 경증 고체온(39℃)의 존재 또는 부재 및/또는 피리미도인돌 화합물 PIC의 존재 또는 부재하에 배양하였다(실시예 2 참조). 세포 계수와 생존능은 실시예 6.5에 기술된 바와 같이 측정하였다.
도 16은 CC110 사이토카인 칵테일(도 16A) 또는 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일(도 16B) 중 어느 하나를 보충한 StemSpanTM SFEM 배지에서 배양된 CB CD34+ 세포(조혈모세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
도 17은 CC110 사이토카인 칵테일(도 17A) 또는 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일(도 17B) 중 어느 하나를 보충한 StemSpanTM SFEM II 배지에서 배양된 CB CD34+ 세포(조혈모세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
도 18은 CC110 사이토카인 칵테일(도 18A) 또는 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일(도 18B) 중 어느 하나를 보충한 StemSpanTM ACF 배지에서 배양된 CB CD34+ 세포(조혈모세포)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 도 18C는 경증 고체온에서 PIC의 존재("39") 또는 부재("CTL") 하에 BS1 사이토카인 칵테일을 보충한 StemSpanTM SFEM 배지에서 배양된 CB CD34+/CD45RA-세포(장기 조혈모세포; LT-HSC)의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
표 4는 CC110 또는 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일을 사용하는 다양한 기저배지에서 배양된 CB CD34+ 세포로부터 장기 조혈모세포(LT-HSC) (CD34+/CD45RA-)의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
Figure pct00004
표 5는 CC110 또는 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일을 보충한 다양한 기저 배지(SFEM, SFEM II, 또는 StemSpan ACF (ACF))에서 14일 동안 배양된 CB CD34+ 세포로부터 유래한 표시된 HSC 서브집단 각각의 비율을 나타낸 것이다.
Figure pct00005
도 18C는 BS1 사이토카인 칵테일을 보충한 StemSpanTM SFEM 배지에서 배양된 CB CD34+/CD45RA-세포(장기 조혈모세포; LT-HSC)의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 이 결과는 거핵구 기원세포(CD34+/CD41+) 의 증폭을 촉진하는 것으로 알려진 세포 배양 배지 또한 자기재생 LT-HSC를 증폭할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 12:
CD34+ 세포( HSC ), CD34+/ CD45RA-세포 ( LT - HSC ), 및 CD34+/CD38-/ CD45RA-세포 의 증폭에 대한 경증 고체온 및 PIC2 또는 PIC의 조합 사용 효과
인간 CB CD34+농축 세포를 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 인간 제대혈(CB)로부터 얻고, 실시예 6.4에 일반적으로 기술된 그의 자기재생에 유리한 조건에서 경증 고체온(39℃)의 존재 또는 부재 및/또는 피리미도인돌 화합물 PIC2의 존재 또는 부재하에 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일을 보충한 StemSpanTM ACF 배지에서 배양하였다(실시예 7.4 참조). 세포 계수와 생존능은 실시예 6.5에 기술된 바와 같이 측정하였다.
도 19, 20 및 21은 배양 7, 10, 및 14일 후 CD34+ 세포(조혈모세포), CD34+/CD45RA-세포(LT-HSC), 및 CD34+/CD38-/CD45RA-세포(Majeti 등, 2007) 각각의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
도 22는 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일을 보충한 StemSpanTM ACF 배지에서 14일 동안 배양된 CB CD34+/CD38-/CD45RA-세포의 증폭에 대해 경증 고체온(39℃) 및 PIC 하의 14일 배양 후 CD34+/CD38-/CD45RA-세포의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
실시예 13
이동 말초혈액 ( mPB ) CD34+ ( HSC ), CD34+/ CD45RA - ( LT - HSC ), 및 CD34+/CD38-/CD45RA-세포의 증폭에 대한 경증 고체온 및 PIC의 조합 사용 효과
인간 G-CSF-이동 말초혈액 CD34+농축 세포를 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 얻고, 실시예 6.4에 일반적으로 기술된 그의 자기재생에 유리한 조건으로 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일을 보충한 StemSpanTM ACF 배지에서 경증 고체온(39℃)의 존재 또는 부재 및/또는 피리미도인돌 화합물 PIC의 존재 또는 부재하에 배양하였다(실시예 2 참조). 세포 계수와 생존능은 실시예 6.5에 기술된 바와 같이 측정하였다.
도 23, 24 및 25는 각각 배양 10, 14, 및 17일 후 CD34+ 세포(조혈모세포), CD34+/CD45RA-세포(LT-HSC), 및 CD34+/CD38-/CD45RA-세포의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
실시예 14
골수 CD34+ ( HSC ), CD34+/ CD45RA - ( LT - HSC ), 및 CD34+/CD38-/ CD45RA-세포 의 증폭에 대한 경증 고체온 및 PIC의 조합 사용 효과
인간 골수(BM) CD34+농축 세포를 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 얻고, 실시예 6.4에 일반적으로 기술된 그의 자기재생에 유리한 조건으로 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일을 보충한 StemSpanTM ACF 배지에서 경증 고체온(39℃)의 존재 또는 부재 및/또는 피리미도인돌 화합물 PIC의 존재 또는 부재하에 배양하였다(실시예 2 참조). 세포 계수와 생존능은 실시예 6.5에 기술된 바와 같이 측정하였다.
도 26, 27 및 28은 각각 배양 10, 14, 및 17일 후 CD34+ 세포(조혈모세포), CD34+/CD45RA-세포(LT-HSC), 및 CD34+/CD38-/CD45RA-세포의 증폭 배율을 나타낸 것이다.
실시예 15:
CB CD34+/ ALDH Bright 세포의 증폭에 대한 경증 고체온 및 PIC의 조합 사용 효과
인간 CB CD34+농축 세포를 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 인간 제대혈(CB)로부터 얻고, 실시예 6.4에 일반적으로 기술된 그의 자기재생에 유리한 조건으로 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일을 보충한 StemSpanTM ACF 배지에서 경증 고체온(39℃)의 존재 또는 부재 및/또는 피리미도인돌 화합물 PIC의 존재 또는 부재하에 배양하였다(실시예 2 참조). 세포 계수와 생존능은 실시예 6.5에 기술된 바와 같이 측정하였다.
도 29는 배양 21일 후 CD34+/ALDHBright 세포의 증폭 배율을 나타낸 것이다. 이 결과는 경증 고체온과 PIC를 조합 사용하여 이 HSC 서브집단이 상승적으로 증폭되는 것을 나타낸다.
실시예 16:
경증 고체온 및 PIC 하에서 시험관내 증폭된 인간 CB CD34+ 세포( HSC )의 면역결핍 마우스 내 이식 및 생착
인간 CB CD34+농축 세포를 실시예 6.1에 기술된 바와 같이 인간 제대혈(CB)로부터 얻고, 실시예 6.4에 일반적으로 기술된 그의 자기재생에 유리한 조건으로 자체제작(HM) 사이토카인 칵테일을 보충한 StemSpanTM ACF 배지에서 경증 고체온(39℃) 및 피리미도인돌 화합물 PIC의 존재하에 배양하였다(실시예 2 참조). 새로운 CB CD34+ 세포, 또는 12일 동안 증폭된 CB CD34+ 세포를 실시예 6.8에서 기술된 바와 같이 면역결핍 마우스에 이식하였다.
PBS만 이식된 마우스와 비교하여, 시험관내 증폭 CB CD34+ 세포를 이식한 마우스의 골수에서 인간 CD45+ 세포 비율의 증가가 관찰되었으며, 이것은 성공적 생착을 나타낸다 (데이터 미표시).
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Claims (21)

  1. (a) 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제를 포함하는 세포 배양 배지에서 조혈모세포를 증식하고;
    (b) 38℃ 내지 40℃의 인큐베이션 온도에서 조혈모세포를 인큐베이션하는 것을 포함하는 조혈모세포의 시험관내 배양방법.
  2. 제1항에 있어서, 조혈모세포가 CD34+ 조혈모세포인 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조혈모세포가:
    (a) 제대혈;
    (b) 골수;
    (c) 말초혈액;
    (d) 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell);
    (e) 배아줄기세포;
    (f) 비조혈성 기원의 분화 세포 유래의 트랜스분화된 것 (trans-differentiated);
    (g) 유전자 변형 조혈모세포;
    (h) 불멸화(immortalized) 조혈모세포;
    (i) 만능(pluripotent) 또는 다능(multipotent) 세포의 다른 공급원; 또는
    (j) 이들의 임의의 조합으로부터 유래하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 조혈모세포가 이동(mobilized) 말초혈액 세포에서 유래하는 것인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 조혈모세포가 고정 말초혈액 세포에서 유래하는 것인 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 조혈모세포가 백혈구감소, 백혈구제거(deleukocytation), 및/또는 말초혈액의 다른 혈액 정제 또는 가공 후의 잔류 세포로부터 유래하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조혈모세포가 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제를 포함하는 세포 배양 배지, 및/또는 38℃ 내지 40℃의 인큐베이션 온도에서, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21일 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인큐베이션 온도가 39℃인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제가:
    (a) 피리미도[4,5-b]인돌 유도체;
    (b) (1r,4r)-N1-(2-벤질-7-(2-메틸-2H-테트라졸-5-일)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-4-일)사이클로헥산-1,4-디아민;
    (c) 메틸 4-(3-(피페리딘-1-일)프로필아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카복실레이트;
    (d) 메틸 4-(3-(피페리딘-1-일)프로필아미노)-9H-피리미도[4,5-b]인돌-7-카복실레이트 염산염;
    (e) (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 프로드럭, 또는 입체이성제; 또는
    (f) (a) 내지 (e)의 임의의 조합인 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 배양 배지가 줄기세포인자(SCF); 트롬보포이에틴(thrombopoietin) (TPO); 또는 SCF와 TPO 둘 다를 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조혈모세포를 증폭하기 위한 것이고, 세포 배양 배지가 조혈모세포 배양 배지인 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 조혈모세포 배양 배지가 인간 FMS 유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3); 줄기세포인자(SCF); 트롬보포이에틴(TPO); 저밀도 리포단백질(LDL); 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 거핵구 기원세포를 생산하기 위해 조혈모세포를 배양하는 것이고, 세포 배양 배지가 거핵구 계통으로의 조혈모세포 분화를 촉진하는 배지인 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 거핵구 계통으로의 조혈모세포 분화를 촉진하는 배지가 줄기세포인자(SCF); 트롬보포이에틴(TPO); 인간 FMS 유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3); IL-6; IL-9; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 골수 기원세포를 생산하기 위해 조혈모세포를 배양하는 것이고, 세포 배양 배지가 골수 기원세포 계통으로의 조혈모세포 분화를 촉진하는 배지인 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추가로 (c) 조혈모세포 증폭의 피리미도인돌 유도체 작용제를 제거하고 38℃ 내지 40℃의 인큐베이션 온도 또는 약 37℃의 인큐베이션 온도에서 세포의 증식을 지속하여 세포를 동조화하는 것을 포함하는 것인 방법.
  17. (a) 제11항 또는 제12항의 방법으로 생산된 증폭 조혈모세포의 집단;
    (b) (i) 제13항 또는 제14항의 방법으로 생산되거나/되고;
    (ii) 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%의 CD34+/CD41+ 세포를 포함하는 거핵구 기원세포의 집단;
    (c) 제15항의 방법으로 생산된 골수 기원세포의 집단;
    (d) 제16항의 방법으로 생산된 동조화 세포 집단; 또는
    (e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합인 것인 시험관내 증폭 세포 집단.
  18. 제17항에 있어서, 대상 내 이식에서 사용하기 위한 것인 시험관내 증폭 세포 집단.
  19. 제17항에 있어서,
    (a) 증폭된 조혈모세포의 집단이 조혈모세포 이식용, 또는 이를 위한 치료 조성물 제조용이거나;
    (b) 거핵구 기원세포의 집단이 혈소판 감소증의 치료용, 또는 이를 위한 치료 조성물 제조용이거나;
    (c) 골수 기원세포의 집단이 골수 기원세포 이식용, 또는 이를 위한 치료 조성물 제조용인 것인 시험관내 증폭 세포 집단.
  20. (a) 조혈모세포 이식을 위한 제17항의 증폭 조혈모세포 집단의 용도;
    (b) 혈소판 감소증의 치료를 위한 제17항의 거핵구 기원세포 집단의 용도; 또는
    (c) 골수 기원세포 이식을 위한 제17항의 골수 기원세포 집단의 용도.
  21. (a) 제17항의 증폭 조혈모세포 집단;
    (b) 제17항의 거핵구 기원세포 집단; 또는
    (c) 제17항의 골수 기원세포 집단을 포함하는 약학 조성물.
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