CN114514322A - 制造寡能和单能前体的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开文本尤其涉及用于从扩增的CD34+细胞源在培养物中制备限定谱系的寡能和单能祖细胞的方法和系统、用于制造其的培养基、和用于治疗多种疾病的治疗性化合物和包含其的组合物，所述疾病包括但限于血液系统障碍、免疫疾病、癌症和传染病。

Description

制造寡能和单能前体的方法
本申请根据35U.S.C§119(e)要求2019年5月1提交的美国临时申请号62/841,713的优先权权益，将所述临时申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明尤其涉及用于在培养物中制备限定谱系的寡能和单能祖细胞的方法和系统、用于制造其的培养基、和用于治疗多种疾病的治疗性化合物和包含其的组合物，所述疾病包括但限于血液系统障碍、免疫疾病、癌症和传染病。
背景技术
患有各种疾病(诸如再生障碍性贫血、自身免疫性疾病和影响骨髓的病毒感染)的患者以及接受细胞毒性化疗或电离放射疗法的患者会经历降低水平的造血干细胞、寡能和单能祖细胞、和终末分化细胞。造血系统的耗尽使这些患者高度易受感染，并且因此是造血重建的主要候选因素。
造血重建可以包括施用造血干细胞(一种原始多能细胞类型，其具有自我更新和重新填充所有血细胞谱系的能力)；然而，即使进行造血重建，由于造血系统无法充分补充与每种障碍相关的终末分化的髓系细胞，患者也会出现诸如嗜中性粒细胞减少症和血小板减少症的病症。
为了解决诸如嗜中性粒细胞减少症的疾病，已经尝试了向有需要的患者提供治疗剂量的终末分化的嗜中性粒细胞的技术，但这种技术未能提供持久效果。最值得注意地，临床有效性受到这些细胞寿命期限短和这些细胞在经受冷冻/解冻储存循环时的低存活率的阻碍。类似地，由于细胞的保存期限短、储存存活差、和血小板抗体的发育，直接向患有血小板减少症的个体提供血小板的尝试也不是持久的护理选择。
较少探索的治疗选择是向有需要的患者递送希望谱系的寡能和单能祖细胞。然而，由于缺少提供足够量的这些细胞的方法，因此这种选择受到难以获得治疗相关数量细胞的严重限制。
因此，本领域需要能够可靠地提供临床相关量的限定谱系的寡能和单能祖细胞的方法。本公开文本解决了这种需要并且还提供了相关的优点。
发明内容
本文尤其提供了用于在培养物中制备限定谱系的寡能和单能祖细胞的方法和组合物。
在一些方面，本文提供了用于在培养物中制备寡能和单能粒细胞祖细胞群体的方法，所述方法包括使扩增的CD34+细胞源与一组粒细胞谱系调节剂在培养物中接触，从而制造寡能和单能祖细胞群体，
其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少200倍增加。
在一些方面，本文提供了用于在培养物中制备寡能和单能祖细胞群体的方法，所述方法包括使扩增的CD34+细胞源与一组谱系调节剂在培养物中接触，从而制造寡能和单能祖细胞群体，
其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少20倍增加。
在一些实施方案中，所述原始的CD34+细胞源选自骨髓、脐带血、动员外周血、和非动员外周血。在一些实施方案中，所述原始的CD34+细胞源是动员外周血。在一些实施方案中，所述原始的CD34+细胞源是脐带血。在一些实施方案中，所述原始的CD34+细胞源是骨髓。在一些实施方案中，所述原始的CD34+细胞源是非动员外周血。
在一些实施方案中，所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少约100倍增加、500倍增加、1,000倍增加、5,000倍增加、10,000倍增加、25,000倍增加、50,000倍增加、100,000倍增加、150,000倍增加、200,000倍增加、225,000倍增加、或250,000倍增加。
在一些实施方案中，所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少500倍增加，并且所述原始的CD34+细胞源是脐带血。
在一些实施方案中，所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少20倍增加，并且所述原始的CD34+细胞源是骨髓或动员的血。
在一些实施方案中，所述扩增的CD34+细胞源通过以下方式制备：使在培养物中的所述原始的CD34+细胞源与有效量的式I
Figure BDA0003443861290000021
I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1或表1的化合物(其中每一种都在下面进一步描述)或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物接触，从而使来自在培养物中的所述原始的CD34+细胞源的CD34+细胞的数量增加。
在一些方面，所述一组谱系调节剂是一组红系谱系调节剂，从而制造寡能和单能红细胞祖细胞群体。
在一些实施方案中，所述寡能和单能红细胞祖细胞群体包含CD71+的细胞表面表型。在一些实施方案中，所述寡能和单能红细胞祖细胞群体进一步包含CD45-的细胞表面表型。在一些实施方案中，所述寡能和单能红细胞祖细胞群体包含CD235a+的细胞表面表型。在一些实施方案中，所述寡能和单能红细胞祖细胞群体包含CD45-、CD71-和CD235a+的细胞表面表型。
在一些实施方案中，所述一组红系谱系调节剂包括SCF、IL-3和EPO。在一些实施方案中，所述一组红系谱系调节剂包括SCF、IL-3、肝素、胰岛素、全转铁蛋白和/或EPO。
在一些实施方案中，在培养7天后，所述寡能和单能红细胞祖细胞群体占总细胞的至少25％至40％。
在一些方面，所述一组谱系调节剂是一组巨核细胞谱系调节剂，从而制造寡能和单能巨核细胞祖细胞群体。
在一些实施方案中，所述寡能和单能巨核细胞祖细胞群体包含CD41+的细胞表面表型。在一些实施方案中，所述寡能和单能巨核细胞祖细胞群体包含CD41+/CD42b+的细胞表面表型。
在一些实施方案中，所述一组巨核细胞谱系调节剂包括SCF、IL-6、IL-9、和/或TPO。
在一些实施方案中，在培养7天后，所述寡能和单能巨核细胞祖细胞群体占总细胞的至少20％。
在一些方面，所述一组谱系调节剂是一组粒细胞谱系调节剂，从而制造寡能和单能粒细胞祖细胞群体。
在一些实施方案中，所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体包含CD15+的细胞表面表型。在一些实施方案中，所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体进一步包含CD14-和/或CD34-的细胞表面表型。在一些实施方案中，所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体进一步包含CD14-、CD66b+和/或CD34-的细胞表面表型。在一些实施方案中，所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体进一步包含CD11b+和/或CD16+的细胞表面表型。
在一些实施方案中，所述一组粒细胞谱系调节剂包含SCF、TPO、GM-CSF、和G-CSF。
在一些实施方案中，在培养7天后，所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体占总细胞的至少70％。
在一些方面，所述一组谱系调节剂是一组单核细胞谱系调节剂，从而制造寡能和单能单核细胞祖细胞群体。
在一些实施方案中，所述寡能和单能单核细胞祖细胞群体包含CD14+的细胞表面表型。在一些实施方案中，所述寡能和单能单核细胞祖细胞群体进一步包含CD15低/-的细胞表面表型。
在一些实施方案中，所述一组单核细胞谱系调节剂包括SCF、TPO、FLT3L、M-CSF、和GM-CSF。
在一些实施方案中，在培养5天后，所述寡能和单能单核细胞祖细胞群体占总细胞的至少50％。
在一些方面，所述一组谱系调节剂是一组淋巴细胞谱系调节剂，从而制造寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体。
在一些实施方案中，所述寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体包含CD7+的细胞表面表型。在一些实施方案中，所述寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体包含具有细胞内CD3(iCD3)表型的细胞。在一些实施方案中，所述寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体包含CD7+和CD5+的细胞表面表型。在一些实施方案中，所述寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体包含CD7+/CD5+/CD1a+的细胞表面表型。
在一些实施方案中，所述一组淋巴细胞谱系调节剂包括notch配体、IL-7、FLT3L、SCF和TPO。在一些实施方案中，所述一组淋巴细胞谱系调节剂包括notch配体、细胞粘附分子、IL-7、FLT3L、SCF和TPO。在一些实施方案中，所述notch配体是Notch配体δ样4(DLL4)。在一些实施方案中，所述notch配体固定在用于培养的表面上。在一些实施方案中，所述细胞粘附分子是血管细胞粘附分子1(VCAM-1)。在一些实施方案中，所述VCAM-1固定在用于培养的表面上。在一些实施方案中，所述一组淋巴细胞谱系调节剂进一步包括FBS。
在一些实施方案中，在培养7天后，所述寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体占总细胞的至少40％。
在一些方面，本文提供了通过本文所述方法制备的包含寡能和单能红细胞、巨核细胞、粒细胞、单核细胞或淋巴细胞祖细胞的群体、治疗剂和药物组合物。
在一些方面，本文提供了治疗需要红系、巨核系、粒系、单核系和/或淋巴系重建的个体的方法。所述方法包括向个体施用本文所述的治疗剂或药物组合物。
在一些方面，本文提供了用于制备在培养物中的寡能和单能祖细胞群体的系统和试剂盒。
从以下具体实施方式和附图，本发明的其他方面、特征和优点对于本领域技术人员将变得清楚。
附图说明
图1A-D展示了针对化合物1.001(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.001浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图2A-D展示了针对化合物1.002(柱)和对照测量的扩增效应：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.002浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图3A-D展示了针对化合物1.003(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.003浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图4A-D展示了针对化合物1.004(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.004浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图5A-D展示了针对化合物1.005(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.005浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图6A-D展示了针对化合物1.006(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.006浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图7A-D展示了针对化合物1.007(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.007浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图8A-D展示了针对化合物1.008(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.008浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图9A-D展示了针对化合物1.009(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.009浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图10A-D展示了针对化合物1.010(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.010浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图11A-D展示了针对化合物1.011(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.011浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图12A-D展示了针对化合物1.012(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.012浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图13A-D展示了针对化合物1.013(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.013浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图14A-D展示了针对化合物1.014(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.014浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图15A-D展示了针对化合物1.015(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.015浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图16A-D展示了针对化合物1.016(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.016浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图17A-D展示了针对化合物1.017(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.017浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图18A-D展示了针对化合物1.018(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.018浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图19A-D展示了针对化合物1.019(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.019浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图20A-D展示了针对化合物1.020(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.020浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图21A-D展示了针对化合物1.021(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.021浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图22A-D展示了针对化合物1.022(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.022浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图23A-D展示了针对化合物1.023(柱)和对照测量的扩增效果：基本条件(细虚线)和+SF条件(粗虚线)。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第2天到第7天的倍数变化。每个柱报告在指定的化合物1.023浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例33中所述计算。
图24A-E报告了在“基本条件”(白色柱，左)；“+SF条件”(对角散列柱，左起第二个)；“+1.008条件”(黑色柱，右起第二个)；“+1.008/+ER条件”(水平条纹柱，右)中培养的脐带血样品中的流式细胞术细胞计数。图24A报告了在培养物中的活细胞总数，并且图24B、24C、24D和24E示出了+1.008条件和+1.008/+ER条件使CD34+细胞(24B)、CD34+/CD133+细胞(24C)、CD34+/CD133+/CD90+(24D)和CD34+/CD133+/CD90+/CD38低/-细胞(24E)的总数增加。
图25A-E基于图24中报告的脐带血数据报告了从第2天至指示天数细胞计数的倍数变化。“基本条件”(白色柱，左)；“+SF条件”(对角散列柱，左起第二个)；“+1.008条件”(黑色柱，右起第二个)；“+1.008/+ER条件”(水平条纹柱，右)，图25A报告了培养物中活细胞的倍数变化，并且图25B、25C、25D和25E示出了CD34+细胞(25B)、CD34+/CD133+细胞(25C)、CD34+/CD133+/CD90+(25D)和CD34+/CD133+/CD90+/CD38低/-细胞(25E)总数的倍数变化。
图26A-D展示了针对化合物1.005和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.005浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图27A-D展示了针对化合物1.006和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.006浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图28A-D展示了针对化合物1.007和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.007浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图29A-D展示了针对化合物1.008和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.008浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图30A-D展示了针对化合物1.009和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.009浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图31A-D展示了针对化合物1.010和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.010浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图32A-D展示了针对化合物1.013和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.013浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图33A-D展示了针对化合物1.014和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.014浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图34A-D展示了针对化合物1.015和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.015浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图35A-D展示了针对化合物1.021和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.021浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图36A-D展示了针对化合物1.022和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.022浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图37A-D展示了针对化合物1.023和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.023浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图38A-D展示了针对化合物1.024和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.024浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图39A-D展示了针对化合物1.025和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.025浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图40A-D展示了针对化合物1.026和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.026浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图41A-D展示了针对化合物1.027和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.027浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图42A-D展示了针对化合物1.028和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.028浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图43A-D展示了针对化合物1.029和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.029浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图44A-D展示了针对化合物1.030和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.030浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图45A-D展示了针对化合物1.031和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.031浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图46A-D展示了针对化合物1.032和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.032浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图47A-D展示了针对化合物1.033和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.033浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图48A-D展示了针对化合物1.034和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.034浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图49A-D展示了针对化合物1.035和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.035浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图50A-D展示了针对化合物1.036和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.036浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图51A-D展示了针对化合物1.037和“仅细胞因子”对照(虚线)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第7天的倍数变化。每个数据点报告在指定的化合物1.037浓度下细胞的倍数变化。倍数变化如实施例35中所述计算。
图52A-F展示了在使用源自脐带血的造血干细胞培养7、10、14和21天后，针对化合物1.010(黑色条)和“仅细胞因子”对照(白色条)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)、CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)、CD34+/CD13+/CD90+/CD38低/-细胞(E)和CD34+/CD13+/CD90+/CD45RA-细胞(F)从第1天到指示天数的倍数变化。
图53A-F展示了在使用源自动员外周血的造血干细胞培养7、10、14和21天后，针对化合物1.010(黑色条)和“仅细胞因子”对照(白色条)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)、CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)、CD34+/CD13+/CD90+/CD38低/-细胞(E)和CD34+/CD13+/CD90+/CD45RA-细胞(F)从第1天到指示天数的倍数变化。
图54A-F展示了在使用源非动员外周血的造血干细胞培养7、10、14和21天后，针对化合物1.010(黑色条)和“仅细胞因子”对照(白色条)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)、CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)、CD34+/CD13+/CD90+/CD38低/-细胞(E)和CD34+/CD13+/CD90+/CD45RA-细胞(F)从第1天到指示天数的倍数变化。
图55A-D展示了在大气氧气下培养9天后，针对化合物1.010(黑色条)和“仅细胞因子”对照(白色条)测量的扩增效果。数据报告为所有活细胞(A)、CD34+细胞(B)、CD34+/CD133+细胞(C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(D)从第1天到第9天的倍数变化。
图56提供了实施例38-40中遵循的扩增和分化方案的概述。此图解提供了示例性分化谱系调节剂和示例性鉴定标记物，所述鉴定标记物可以用于鉴定沿每个谱系的分化。应理解，替代的标记物和细胞因子组合可以用于制备本文所述的祖细胞。
图57A-B展示了在CD34+重新选择和分化培养开始之前由在对照或+式I条件中培养21天(A)或63天(B)得到的CD34+细胞扩增。倍数变化如实施例38中所述计算。
图58A-D示出了由置于相应分化培养物中的输入CD34+细胞得到的红系(A)、单核细胞(B)、粒细胞(C)和巨核细胞(D)谱系的“按每个测定CD34+细胞的输出”。此量如实施例38中所述计算。
图59A-D示出了在红系(A)、单核细胞(B)、粒细胞(C)和巨核细胞(D)谱系分化之前在+式I或对照条件中的扩增培养物对总的按每个扩增第1天CD34+细胞的输出的影响，表述为相对于未培养细胞输出的倍数增加。倍数增加如实施例38中所述计算。
图60示出了可从平均库存脐带在扩增培养和分化培养后制备的粒细胞祖细胞(A)和巨核细胞祖细胞(B)的估计治疗剂量。剂量/脐带如实施例38中所述计算。
图61示出了在培养7天后上调红细胞谱系标记物CD71的红细胞分化培养物中细胞的百分比(A)以及在培养10天后上调巨核细胞谱系标记物CD41的巨核细胞分化培养物中细胞的百分比(B)。
图62示出了在也上调成熟红细胞谱系标记物CD235a的红细胞分化培养物中CD71+细胞的细胞百分比(A)以及在另外上调成熟巨核细胞谱系标记物CD42b+的巨核细胞分化培养物中CD41+细胞的百分比(B)。
图63展示了在用于粒细胞前体亚群表型分析的分化测定和功能测定开始之前CD34+细胞的倍数扩增。倍数变化如实施例39中所述计算。
图64描绘了置于粒细胞分化培养物中七天的具有CD34+细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞和晚幼粒细胞以及已失去CD34但未进入粒细胞分化的细胞的表型的式I扩增CD34+细胞的百分比(占培养物中总细胞的比例)。
图65A-B描绘了在未扩增的(A)或式I扩增的(B)CD34+细胞的粒细胞分化培养第13天时，早幼粒细胞(白色填充)、中幼粒细胞(阴影填充)或晚幼粒细胞及其后(“晚幼粒细胞+”，黑色填充)的粒细胞前体群体的细胞分数。
图66A-B展示了源自未扩增对照扩增的或式I扩增的CD34+细胞的CD15+细胞在用于吞噬作用(A)或呼吸爆发(B)的抗微生物功能测定中阳性细胞的比例，其中视情况而定提供阳性对照(新鲜外周血嗜中性粒细胞)或阴性对照用于每种测定，实施例39中所述。
图67展示了实施例41中所述为描述祖细胞培养物而计算的量的推导和关系：按每个测定CD34+细胞的输出、度量输出、和倍数增强(与未扩增相比)。
图68展示了在CD34+重新选择和淋巴系培养开始之前，由在对照条件中培养14天(“C”)、在+式I条件中培养14天(“d14”)或在+式I条件中培养21天(“d21”)得到的CD34+细胞的倍数扩增。倍数变化相对于未扩增细胞来计算并且如实施例41中所述。
图69A-D示出了用未扩增CD34+细胞(“U”)或者在对照中或在+式I条件中扩增14天的细胞(分别为“C”或“d14”)或在+式I条件中扩增21天的细胞(“d21”)开始，随后置于淋巴系分化培养条件中14天，在淋巴系分化培养物中CD10+淋巴系祖细胞(A)、CD7+/CD5-淋巴系祖细胞(B)、CD7-/CD5+淋巴系祖细胞(C)或CD7+/CD5+淋巴系祖细胞(D)的按每个测定CD34+细胞的输出。按每个测定CD34+细胞的输出如实施例41中所述计算。
图70A-D示出了用未扩增CD34+细胞(“U”)、在对照中或在+式I条件中扩增14天的细胞(分别为“C”或“d14”)或在+式I条件中扩增21天的细胞(“d21”)开始，然后进行淋巴系分化培养，在淋巴系分化培养物中CD10+淋巴系祖细胞(A)、CD7+/CD5-淋巴系祖细胞(B)、CD7-/CD5+淋巴系祖细胞(C)或CD7+/CD5+淋巴系祖细胞(D)的度量输出。度量输出如实施例41中所述计算。
图71A-D示出了由于在淋巴系分化培养之前在对照中或在+式I条件中14天的先前扩增(分别为“C”或“d14”)或在+式I条件中21天的先前扩增(“d21”)，CD10+淋巴系祖细胞(A)、CD7+/CD5-淋巴系祖细胞(B)、CD7-/CD5+淋巴系祖细胞(C)或CD7+/CD5+淋巴系祖细胞(D)的度量输出的相对于未扩增细胞的倍数增强。相对于未扩增的倍数增强如实施例41中所述计算。
图72A-C示出了在NK细胞成熟培养物中CD56+NK谱系细胞(A)或在T细胞成熟培养物中CD3+(B)或CD3+/CD8+T细胞(C)的按每个测定CD34+细胞的输出。用未扩增CD34+细胞(“U”)或在对照或+式I条件中扩增14天的细胞(分别为“C”或“d14”)或在+式I条件中扩增21天的细胞(“d21”)开始培养，然后置于淋巴系分化培养物中14天，然后在相应的成熟培养中培养另外14天。按每个测定CD34+细胞的输出如实施例41中所述计算。
图73A-C示出了在NK细胞成熟培养物中CD56+NK谱系细胞(A)或在T细胞成熟培养物中CD3+(B)或CD3+/CD8+T细胞(C)的度量输出。用未扩增CD34+细胞(“U”)或在对照或+式I条件中扩增14天的细胞(分别为“C”或“d14”)或在+式I条件中扩增21天的细胞(“d21”)开始培养，然后置于淋巴系分化培养物中14天，然后在相应的成熟培养中培养另外14天。度量输出如实施例41中所述计算。
图74A-C示出了在NK细胞成熟培养物中CD56+NK谱系细胞(A)或在T细胞成熟培养物中CD3+(B)或CD3+/CD8+T细胞(C)的成人外周血单位当量/CBU。用未扩增CD34+细胞(“U”)或在对照或+式I条件中扩增14天的细胞(分别为“C”或“d14”)或在+式I条件中扩增21天的细胞(“d21”)开始培养，然后置于淋巴系分化培养物中14天，然后在相应的成熟培养中培养另外14天。成人外周血单位当量/CBU如实施例41中所述计算。
图75A-C示出了在NK细胞成熟培养物中CD56+NK谱系细胞(A)或在T细胞成熟培养物中CD3+(B)或CD3+/CD8+T细胞(C)的相对于未扩增细胞的倍数增强。用未扩增CD34+细胞(“U”)或在对照或+式I条件中扩增14天的细胞(分别为“C”或“d14”)或在+式I条件中扩增21天的细胞(“d21”)开始培养，然后置于淋巴系分化培养物中14天，然后进行相应的成熟培养。倍数增强如实施例41中所述计算。
图76示出了在对照条件(空心符号)或+式I条件(实心符号)中培养后，两种不同的脐带血CD34+(三角形或圆形)细胞样品的扩增。倍数扩增如实施例41中所述计算。
图77A-D示出了在式I条件中扩增14天(A)、28天(B)、42天(C)或64天(D)后，由以指定的分化序列分化培养得到的CD15+细胞的度量输出的倍数增强。分化培养基和序列描述在表12至表14中，并且相应的分析天数和倍数增强数可以在表16中找到。倍数增强如实施例41中所述计算。
图78A-C示出了在+式I条件中扩增在括号中指示的天数后，在指示的分化培养基(A、T、B或H)中分化培养六至七天(A)、九或十天(B)、或13或14天(C)后，占总活细胞的百分比的CD15+细胞。误差条指示在重复培养中测量的CD15+百分比的平均值加一个标准偏差。黑色虚线和白色虚线示出了用在STEMCELL髓系分化培养基中分化的未扩增的未引发的脐带血CD34+细胞开始培养通过STEMCELL测量的平均CD15+细胞百分比。
图79A-C示出了在+式I条件中扩增14天或28天(如括号中指示)后，在指示的分化培养基(A、T、B或H)中分化培养六至七天(A)、九或十天(B)、或13或14天(C)后，缺少CD11b的早期CD15+细胞(条的白色部分)或CD11b上调的成熟CD15+细胞占总活细胞的比例。黑色虚线和白色虚线示出了用在STEMCELL髓系分化培养基中分化的未扩增的未引发的脐带血CD34+细胞开始培养通过STEMCELL测量的总CD15+细胞的平均百分比。
图80示出了在分化培养基B(白色条)或分化培养基H(黑色条)中，在所指示的分化培养天数时共表达CD66b的CD15+细胞的比例。
具体实施方式
本文提供了用于在培养物中从扩增的CD34+细胞源制造限定谱系的寡能和单能祖细胞群体的方法和系统。本文提供了用于在培养物中从扩增的CD34+细胞源制造寡能和单能粒细胞祖细胞群体的方法和系统。有利地，本公开文本提供了用于从单一CD34+细胞源制备多治疗剂量的限定谱系的寡能和单能祖细胞的方法。例如，来自公共储库的平均脐带血单位可以提供多于500个治疗剂量的粒细胞祖细胞。
对比之下，用于制备寡能和单能祖细胞的特定谱系的已知方法需要汇集多个CD34+样品或充其量从脐带血样品提供单一治疗剂量的所希望的寡能和单能祖细胞谱系。
另外，相对于未扩增的CD34+细胞源，首先使用本文所述方法扩增的CD34+细胞群体有利地更好地响应于分化培养基，在一些实施方案中提供在群体中更高比例的细胞，遵循希望的分化谱系(增加的纯度)和/或更快的分化速度(需要更少的培养时间)。
因此，本文提供的公开方法大大地增加了从CD34+细胞源的寡能和单能祖细胞产率，从而改善了对有需要的受试者的所需治疗产品的获取和可用性。
I.通用技术
除非另有指示，否则本发明的实践将采用本领域技术人员众所周知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中进行了充分的解释，所述文献诸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第四版(Sambrook等人,2012)和Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Sambrook和Russel,2001)(在本文中统称为“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,1987,including supplements through 2014)；PCR:ThePolymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑,1994)；Antibodies:A LaboratoryManual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,冷泉港,纽约(Greenfield编辑,2014)，Beaucage等人编辑,Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,JohnWiley&Sons,Inc.,纽约,2000,(包括增刊至2014)，和Gene Transfer and Expression inMammalian Cells(Makrides编辑,Elsevier Sciences B.V.,Amsterdam,2003)。
II.定义
造血细胞不仅包括HSC，而且还包括红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、血小板、巨核细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞、B和T淋巴细胞和NK细胞以及相应的谱系祖细胞。
如本文所用，“维持HSC的扩增”是指培养这些细胞使得它们继续分裂而不是采取静止状态和/或失去它们的多能特征。可以使用本领域已知的方法使用已知的多能标记物来评估细胞的多能性。示例性多能标记物包括CD133+、CD90+、CD38低/-、CD14-、CD15-、CD71-、CD45RA阴性但总体CD45阳性、和CD34。在一些例子中，CD34低/-细胞可以是造血干细胞。在CD34低/-细胞是造血干细胞的例子中，这些细胞表达CD133。
如本文所用，术语“细胞因子”是指对细胞产生多种作用(例如，诱导生长或增殖)的众多因子中的任一种。细胞因子可以是人类来源的，或者当对目的细胞有活性时可以源自其他物种。在所述定义的范围内包括具有与野生型或纯化细胞因子相似生物活性的分子，例如通过重组手段产生的；以及与细胞因子受体结合并且诱发与天然细胞因子相似的细胞反应的分子。
术语“培养”是指细胞在各种培养基(诸如本文公开的任何培养基)上或中的增殖。
如本文所用，术语“动员外周血”是指已经暴露于促进细胞从骨髓移动到外周血和/或身体的其他贮库(例如，滑液)或组织中的药剂的细胞。
如本文所用，短语“非动员外周血”是指从个体获得的血液样品，所述个体尚未暴露于促进细胞从骨髓移动到外周血和/或其他贮库中的药剂。在一些情况下，“非动员外周血”是指来自个体的血液，所述个体在至少1、3、5、7或10天或更多天内尚未暴露于促进细胞从骨髓移动到外周血和/或身体其他贮库中的药剂。在一些情况下，“非动员外周血”是指个体的血液，所述个体在至少5、7、10、14、21天或更多天内尚未暴露于促进细胞从骨髓移动到外周血和/或身体其他贮库中的药剂。在一些情况下，“非动员外周血”是指个体的血液，所述个体在至少14、21、28、35、42、49天或更多天内尚未暴露于促进细胞从骨髓移动到外周血和/或身体其他贮库中的药剂。
如本文所用，“四跨膜蛋白(tetraspanin)”(也称为“四跨膜物(tetraspan)”或“跨膜4超家族”(TM4SF))是指在所有多细胞真核生物中发现的膜蛋白家族，所述膜蛋白具有四个跨膜结构域、细胞内N末端和C末端和两个胞外结构域：一个称为小胞外结构域或环(SED/SEL或EC1)，并且另一个较长(典型地100个氨基酸残基)结构域称为大胞外结构域/环(LED/LEL或EC2)。哺乳动物中存在34种四跨膜蛋白，其中33种也在人类中被鉴定。四跨膜蛋白显示出许多特性，其表明它们在细胞粘附、运动、激活和增殖方面的生理重要性以及它们对病理状况(诸如转移或病毒感染)的贡献。
“个体”可以是脊椎动物、哺乳动物或人。哺乳动物包括但不限于农场动物、体育动物、宠物、灵长类动物、小鼠和大鼠。在一方面，个体是人。
如本文所用，“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”或“治疗(treating)”涵盖对哺乳动物(例如，人)的疾病或病症的任何治疗，并且包括但不限于：(a)在可能易患所述疾病或病症但尚未被诊断为患有所述疾病或病症的受试者中预防所述疾病或病症发生；(b)抑制所述疾病或病症，即阻止其发展；(c)缓解和或改善疾病或病症，即引起所述疾病或病症消退；或(d)治愈所述疾病或病症，即停止其发展或进展。通过本发明方法治疗的个体群体包括患有不希望的病症或疾病的个体以及处于发展所述病症或疾病的风险中的个体。
“烷基”是指具有指示数目的碳原子的直链或支链的饱和脂族基团。烷基可以包含任何数目的碳，诸如C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C1-9、C1-10、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6和C5-6。例如，C1-6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。烷基可以是经取代或未经取代的。
“亚烷基”是指具有所指示数目的碳原子并且连接至少两个其他基团的直链或支链饱和脂族基团，即二价烃基。与亚烷基连接的两个部分可以与亚烷基的相同原子或不同原子连接。例如，直链亚烷基可以是-(CH2)n-的二价基团，其中n是1、2、3、4、5或6。代表性亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、异亚丙基、亚丁基、异亚丁基、仲亚丁基、亚戊基和亚己基。亚烷基可以是经取代或未经取代的。
“烯基”是指具有至少2个碳原子和至少一个双键的直链或支链烃。烯基可以包含任何数目的碳，诸如C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6、和C6。烯基可以具有任何合适数目的双键，包括但不限于1、2、3、4、5或更多个。烯基的例子包括但不限于乙烯基(vinyl)(乙烯基(ethenyl))、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基或1,3,5-己三烯基。烯基可以是经取代或未经取代的。
“炔基”是指具有至少2个碳原子和至少一个三键的直链或支链烃。炔基可以包含任何数目的碳，诸如C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6、和C6。炔基的例子包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1,3-戊二炔基、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基或1,3,5-己三炔基。炔基可以是经取代或未经取代的。
卤素或“卤代”是指氟、氯、溴和碘。
“卤代烷基”是指其中一些或全部氢原子被卤素原子替代的如上所定义的烷基。至于烷基，卤代烷基可以具有任何合适数目的碳原子，诸如C1-6。例如，卤代烷基包括三氟甲基、氟甲基等。在一些情况下，术语“全氟”可以用于定义其中所有氢都被氟取代的化合物或基团。例如，全氟甲基是指1,1,1-三氟甲基。
“烷氧基”是指具有氧原子的烷基，所述氧原子将烷基连接至附接点：烷基-O-。至于烷基，卤代烷氧基可以具有任何合适数目的碳原子，诸如C1-6。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基可以进一步被各种取代基取代。烷氧基可以是经取代或未经取代的。
“氧代”是指用双键连接到化合物的剩余部分的氧原子(例如
Figure BDA0003443861290000131
其中“波浪线”
Figure BDA0003443861290000132
表示与分子剩余部分的附接点)。
“肟”是指用双键连接到化合物的剩余部分并且包含与羟基部分连接的另一个共价键的氮原子(例如
Figure BDA0003443861290000133
其中“波浪线”
Figure BDA0003443861290000134
表示与分子剩余部分的附接点)。
“羟基烷基”是指如上所定义的烷基，其中至少一个氢原子被羟基替代。至于烷基，羟基烷基可以具有任何合适数目的碳原子，诸如C1-6。示例性羟基烷基包括但不限于羟基-甲基、羟基乙基(其中羟基位于1位或2位)、羟基丙基(其中羟基位于1位、2位或3位)、羟基丁基(其中羟基位于1位、2位、3位或4位)、羟基戊基(其中羟基位于1位、2位、3位、4位或5位)、羟基己基(其中羟基在1位、2位、3位、4位、5位或6位)、1,2-二羟基乙基等。
“杂芳基”是指含有5至6个环原子的单环组件，其中从1至3个环原子是杂原子，诸如N、O或S。其他杂原子也可能有用，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子也可以被氧化，诸如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。杂芳基可以包括诸如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、四唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑和异噁唑。杂芳基可以是经取代或未经取代的。
“杂环烷基”是指具有从3至6个环成员和从1至3个N、O和S中的杂原子的饱和环体系。其他杂原子也可能有用，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子也可以被氧化，诸如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。杂环烷基中可以包含任何合适数目的杂原子，诸如1、2、3，或1至2、1至3、2至3个。杂环烷基可以包括诸如以下的基团：氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷、氮杂环辛烷、奎宁环、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪(1,2-、1,3-和1,4-异构体)、环氧乙烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、噁烷(四氢吡喃)、氧杂环庚烷、硫杂环丙烷、硫杂环丁烷、硫杂环戊烷(四氢噻吩)、硫杂环己烷(四氢噻喃)、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、二氧戊环、二硫杂环戊烷、吗啉、硫代吗啉、二噁烷或二噻烷。杂环烷基可以是未经取代的或经取代的。例如，杂环烷基尤其可以被C1-6烷基或氧代(＝O)取代。
与“包含”、“含有”或“特征在于”同义的过渡术语“包括”是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。相比之下，过渡短语“由……组成”排除了权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤“以及不会实质性影响所要求保护的发明的一个或多个基本和新颖特征的那些材料或步骤”
除非本文另有定义，否则本文所用的所有技术和科技术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
除非上下文有其他明确指示，否则如本文所用的单数术语“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋体、非对映异构体、几何异构体、区域异构体和单独的异构体(例如，单独的对映异构体)均旨在包括在本发明的范围内。在一些实施方案中，本发明的化合物是基本上不含其他形式的特定对映异构体或非对映异构体。
术语“基本上不含”是指10％或更少量的另一种形式，优选8％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或更少量的另一种形式。在一些实施方案中，异构体是立体异构体。
III.发明组成
本文提供了提供希望谱系的寡能和单能祖细胞群体的细胞培养物、用于在培养物中制造希望谱系的寡能和单能祖细胞群体的细胞培养基、和通过本文所述方法制备的含有希望谱系的寡能和单能祖细胞的细胞群体。寡能和单能祖细胞包括红细胞祖细胞、巨核细胞祖细胞、粒细胞祖细胞、单核细胞祖细胞、淋巴细胞祖细胞及其组合。寡能和单能祖细胞群体具有体内治疗应用的潜力。
寡能祖细胞是未成熟的造血细胞，其保留了对于一些但不是所有血液谱系通过分化和增殖产生完全分化的功能性后代的能力。单能祖细胞是未成熟的造血细胞，其保留了对于单一类型血细胞通过分化和增殖产生完全分化的功能性后代的能力。寡能祖细胞和单能祖细胞两者均无法无限复制。许多寡能祖细胞在成熟为其分化的功能性子代之前通常会进一步分化为单能祖细胞。通过本文所述方法制备的细胞群体可以具有不同水平的寡能和单能祖细胞。特定群体中给定寡能和单能祖细胞的相对量将取决于许多因素，包括所使用的分化培养基以及细胞暴露于分化培养物的时间量。应理解，增加用分化培养物的孵育时间将通常提供进一步分化的祖细胞群体。本领域技术人员应认识到寡能性和单能性的标记物基于具体的细胞谱系而变化。下面进一步讨论给定祖细胞群体的具体特征标记物。
本文提供的寡能和单能红细胞、巨核细胞、粒细胞、单核细胞和/或淋巴细胞祖细胞赋予在脐带血、骨髓或另一种未成熟造血祖细胞源中发现的祖细胞相同或相似的优点。本领域技术人员将容易地认识到寡能和单能祖细胞的特征以及其中的有利特性。
在一些实施方案中，本文提供的寡能和单能祖细胞群体的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％源自扩增的造血干细胞(HSC)。扩增的HSC是已在培养物中经受扩增的HSC源，所述培养物使HSC的总数增加，同时维持造血干细胞表型。在一些实施方案中，在细胞群体中扩增的HSC在延长的时间段内保留其干细胞表型。例如，在一些实施方案中，含有HSC的细胞群体包含具有包括CD45+、CD34+、CD133+、CD90+、CD45RA-和/或CD38低/-的细胞表面表型的扩增的HSC并且已在体外培养至少3、7、10、13、14、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120或130天或更多天。在一些实施方案中，含有HSC的细胞群体包含具有包括CD34+的细胞表面表型的扩增的HSC并且已在体外培养至少3、7、10、13、14、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120或130天或更多天。在一些实施方案中，含有HSC的细胞群体包含具有包括CD133+和/或CD90+的细胞表面表型的扩增的HSC细胞并且已在体外培养至少3、7、10、13、19、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84、91、98、105、112、119、126、133、140、147天或更多天。
在培养物中扩增HSC后，在分化条件下培养扩增的HSC(在一些实施方案中，扩增的CD34+细胞源)以获得希望谱系的寡能和单能祖细胞群体。希望的谱系包括寡能和单能红细胞祖细胞、巨核细胞、粒细胞、单核细胞和/或淋巴细胞祖细胞。
A.扩增细胞培养
用于维持和/或增强在培养物中造血干细胞(HSC)的扩增的培养基包含基础培养基或补料培养基以及式I的化合物。在本发明的上下文中可以使用用于培养哺乳动物细胞的任何合适的基础培养基或补料培养基，并且可以包括但不限于可商购培养基，诸如DMEM培养基、IMDM培养基、StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)、199/109培养基、Ham的F10/F12培养基、McCoy的5A培养基、αMEM培养基(不含和含酚红)和RPMI1640培养基。在一些实施方案中，基础培养基或补料培养基是αMEM培养基(不含酚红)。
在一些实施方案中，本文提供的方法、培养基、系统和试剂盒不包括四跨膜蛋白。在一些实施方案中，本文提供的方法、培养基、系统和试剂盒还包括视黄酸受体(RAR)抑制剂或调节剂。在一些实施方案中，RAR抑制剂是ER50891。
在一些实施方案中，在扩增细胞培养物中扩增细胞之前使用引发培养物。包括引发培养物可以改善最终HSC扩增和/或分化的结果。引发培养物可以包括本文所述的任何培养基，但最常见的是包括与HSC扩增培养物相同的培养基。在一些实施方案中，引发培养物包括StemSpan SFEM I。引发培养物还典型地包含细胞因子和生长因子。在一些实施方案中，细胞因子和生长因子选自针对扩增细胞培养物所述的组分。在一些实施方案中，引发培养物包含FLT3L、TPO、SCF和IL-6。在一些实施方案中，FLT3L、TPO、SCF和IL-6的浓度各自是100ng/mL。
1.式I的化合物
用于本文公开的方法的扩增细胞培养基(例如，基础培养基或补料培养基)可以含有本文所述的式I的化合物或子实施方案。式I的化合物促进HSC的存活、维持、扩增或增强。
扩增细胞培养基可以包含式I的化合物。
在一些实施方案中，式I的化合物具有以下结构
Figure BDA0003443861290000151
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
A是稠合环状部分或不存在，所述稠合环状部分选自苯基、C3-6环烷基、杂环烷基、和杂
芳基；
其中每个杂环烷基包含从3至6个环成员，具有1至3个氮原子环成员，并且
每个杂芳基包含5至6个环成员，具有1至3个氮原子环成员；
R1选自-C(O)-NRb-R1a、-NRb-C(O)-R1a、-NRb-C(O)-R1b、-NRb-X1-C(O)-R1a、-C(O)-X1-NRb-R1a、-X1-C(O)-NRb-R1a、-X1-NRb-C(O)-R1a、-NRb-C(O)-X1-C(O)-R1b、-C(O)-NRb-X1-C(O)-R1b、-NRb-C(O)-O-R1a,-O-C(O)-NRb-R1a、-X1-NRb-C(O)-O-R1a、-X1-O-C(O)-NRb-R1a、-NRb-R1a、-C(O)-R1a、-O-C(O)-R1a、卤基和-NO2；
R1a选自H、C1-10烷基；C1-10卤代烷基；
R1b选自-ORa、-NRaRb、杂环烷基、和苯基
其中每个杂环烷基包含从5至6个环成员，具有1至3个选自氮、氧和硫的杂原子环成员，并且
每个杂环烷基和苯基未经取代或被一至四个C1-4烷基、-OH和卤基取代；
每个R2独立地选自卤素、-CN、-C1-8烷基、-C2-8烯基、C2-8炔基、C1-8卤代烷基、-C1-8烷氧基、-X1-C1-8烷氧基、-C(O)-R2a、-NRb-C(O)-R2a、-SRa、-X1-SRa、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb、-X1-NRaRb、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-X1-S(O)2Ra、-X1-S(O)2NRaRb、和-O-C(O)-R
每个R3独立地选自卤素、-CN、-C1-8烷基、-C2-8烯基、C2-8炔基、C1-8卤代烷基、-C1-8烷氧基、-X1-C1-8烷氧基、-C(O)-R3a、-SRa、-X1-SRa、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb、-X1-NRaRb、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-X1-S(O)2Ra、和-X1-S(O)2NRaRb；
每个R2a和R3a独立地选自H、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb和-X1-NRaRb；
R4a选自-ORa、-NRaRb、-O-C(O)-Ra和氰基；
R4b是H；或R4a和R4b组合形成氧代基或肟部分；
每个Ra和Rb独立地选自H和C1-4烷基；
每个X1是C1-4亚烷基；
下标n是从0至3的整数；并且
下标m是从0至2的整数。
在一些方面，式I的化合物可以抑制或改变PTEN的活性，从而提供改善的用于在培养物中扩增和维持造血干细胞的条件。
PTEN已知是肿瘤抑制因子，在高频率的癌症中它是突变的。这种蛋白质负向调节磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)的细胞内水平，并且通过负向调节Akt/PKB信号传导通路而发挥肿瘤抑制因子的作用。PTEN的抑制剂降低、阻断、防止或以其他方式减少PTEN的天然活性的化合物。
在一些实施方案中，式I的化合物具有下式的结构
I-1
Figure BDA0003443861290000161
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R4a选自-ORa和-NRaRb；
R4b是H。
在一些实施方案中，式I的化合物具有下式的结构
I-2
Figure BDA0003443861290000162
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R4a选自-ORa和-NRaRb；
R4b是H。
在一些实施方案中，式I、I-1和I-2中的A是
稠合环状部分，所述稠合环状部分选自C3-6环烷基、杂环烷基、和苯基，
其中每个杂环烷基包含从3至6个环成员，具有1至3个氮原子环成员。
在一些实施方案中，式I、I-2和I-2中的A是
稠合环状部分，所述稠合环状部分选自C3-6环烷基和苯基。
在一些实施方案中，式I、I-2和I-2中的A是
稠合C3-6环烷基。
在一些实施方案中，式I中的R4a是-ORa；R4b是H；或R4a和R4b组合形成氧代基部分。
在一些实施方案中，式I中的R4a是-ORa；R4b是H。
在一些实施方案中，式I中的R4a是-NRaRb；R4b是H。
在一些实施方案中，式I的化合物具有式Ia的结构
Figure BDA0003443861290000171
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式Ia的化合物具有式Ia’的结构
Figure BDA0003443861290000172
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式Ia的化合物具有式Ia1的结构
Figure BDA0003443861290000173
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R4a选自-ORa和-NRaRb；
R4b是H。
在一些实施方案中，式Ia1的化合物具有式Ia1’的结构
Figure BDA0003443861290000174
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式Ia的化合物具有式Ia2的结构。
Figure BDA0003443861290000175
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R4a选自-ORa和-NRaRb；
R4b是H。
在一些实施方案中，式Ia2的化合物具有式Ia2’的结构。
Figure BDA0003443861290000181
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
在一些实施方案中，式I的化合物具有式Ib的结构
Figure BDA0003443861290000182
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式Ib的化合物具有式Ib1的结构
Figure BDA0003443861290000183
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R4a选自-ORa和-NRaRb；
R4b是H。
在一些实施方案中，式Ib的化合物具有式Ib2的结构。
Figure BDA0003443861290000184
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R4a选自-ORa和-NRaRb；
R4b是H。
在一些实施方案中，式I的化合物具有式Ic的结构
Figure BDA0003443861290000185
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式Ic的化合物具有式Ic1的结构
Figure BDA0003443861290000191
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R4a选自-ORa和-NRaRb；
R4b是H。
在一些实施方案中，式Ic的化合物具有式Ic2的结构。
Figure BDA0003443861290000192
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R4a选自-ORa和-NRaRb；
R4b是H。
在一些实施方案中，式I的化合物具有式II的结构
Figure BDA0003443861290000193
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式II的化合物具有式IIa的结构
Figure BDA0003443861290000194
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式IIa的化合物具有式IIa’的结构
Figure BDA0003443861290000195
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式IIa的化合物具有式IIa1的结构
Figure BDA0003443861290000201
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，the式II的化合物具有式IIb的结构
Figure BDA0003443861290000202
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式IIb的化合物具有式IIb1的结构
Figure BDA0003443861290000203
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式II的化合物具有式IIc的结构
Figure BDA0003443861290000204
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式IIc的化合物具有式IIc1的结构
Figure BDA0003443861290000205
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式I的化合物具有式II的结构
Figure BDA0003443861290000206
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式II的化合物具有式IIa的结构
Figure BDA0003443861290000211
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式IIa的化合物具有式IIa’的结构
Figure BDA0003443861290000212
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式IIa的化合物具有式IIa1的结构
Figure BDA0003443861290000213
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式I的化合物具有式III的结构
Figure BDA0003443861290000214
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式III的化合物具有式IIIa的结构
Figure BDA0003443861290000215
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式IIIa的化合物具有式IIIa’的结构
Figure BDA0003443861290000216
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式IIIa的化合物具有式IIIa1的结构
Figure BDA0003443861290000221
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的R1选自-C(O)-NRb-R1a、-NRb-C(O)-R1a、-NRb-X1-C(O)-R1a、-C(O)-X1-NRb-R1a、-X1-C(O)-NRb-R1a、-X1-NRb-C(O)-R1a、-NRb-C(O)-X1-C(O)-R1b、-C(O)-NRb-X1-C(O)-R1b、-NRb-C(O)-O-R1a、-O-C(O)-NRb-R1a、-NRb-R1a和-C(O)-R1a。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的R1选自-C(O)-NH-R1a、-NH-C(O)-R1a、-NH-C(O)-O-R1a、-O-C(O)-NH-R1a、-NH-R1a和-C(O)-R1a。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的R1选自-NH-C(O)-R1a、-NH-C(O)-O-R1a和-NRb-R1a。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的R1选自-NH-C(O)-R1a和-NH-C(O)-O-R1a。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的R1是-NH-C(O)-R1a。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的R1是卤基。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的R1是氟。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的每个R2独立地选自卤素、-C1-8烷基、C1-8卤代烷基、-C1-8烷氧基、-X1-C1-8烷氧基、-C(O)-R2a、-NRb-C(O)-R2a、-SRa、-X1-SRa、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb和-X1-NRaRb。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的每个R2独立地选自卤素、-C1-8烷基、C1-8卤代烷基、-C1-8烷氧基、-X1-C1-8烷氧基、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb、-X1-NRaRb、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-X1-S(O)2Ra和-X1-S(O)2NRaRb。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的每个R2独立地选自卤素、-C1-8烷基、C1-8卤代烷基、-C1-8烷氧基、-X1-C1-8烷氧基、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb和-X1-NRaRb。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的每个R2独立地选自卤素、-C1-8烷基、C1-8卤代烷基、-ORa、-X1-ORa、-NRb-C(O)-R2a、-NRaRb和-X1-NRaRb。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的每个R2独立地选自-ORa、-X1-ORa、-NRaRb或-X1-NRaRb。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIb、IIc、III、IIIa或IIIa’中的每个R3独立地选自卤素、-C1-8烷基、-C1-8卤代烷基、-C1-8烷氧基、-X1-C1-8烷氧基、-C(O)-R3a、-SRa、-X1-SRa、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb,-X1-NRaRb、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-X1-S(O)2Ra和-X1-S(O)2NRaRb。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIb、IIc、III、IIIa或IIIa’中的每个R3独立地选自卤素、-C1-8烷基、C1-8卤代烷基、-C1-8烷氧基、-X1-C1-8烷氧基、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb、-X1-NRaRb、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-X1-S(O)2Ra和-X1-S(O)2NRaRb。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIb、IIc、III、IIIa或IIIa’中的每个R3独立地选自卤素、-C1-8烷基、C1-8卤代烷基、-C1-8烷氧基、-X1-C1-8烷氧基、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb和-X1-NRaRb。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIb、IIc或III、IIIa或IIIa’中的每个R3独立地选自卤素、-C1-8烷基、C1-8卤代烷基、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb和-X1-NRaRb。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIb、IIc或III、IIIa或IIIa’中的每个R3独立地选自-ORa、-X1-ORa、-NRaRb或-X1-NRaRb。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的R1a是C1-6烷基或C1-6卤代烷基。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的R1a是C1-6烷基。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的R1a是C2-6烷基或C2-6卤代烷基。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc、IIc1、III、IIIa、IIIa’或IIIa1中的R1a是C2-6烷基。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc或IIc1中的R1b是-ORa。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc或IIc1中的R1b是-OH。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc或IIc1中的R1b是杂环烷基，其中每个杂环烷基包含从5至6个环成员，具有1至3个选自氮、氧和硫的杂原子环成员，并且未经取代或被一至四个C1-4烷基、-OH和卤基取代。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc或IIc1中的R1b是四氢吡喃。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc或IIc1中的R1b是未经取代或被一至四个C1-4烷基、-OH和卤基取代的苯基。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc或IIc1中的R1b是4-羟基苯基。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc或IIc1中的R1b是-NH2或-N(CH3)2。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc或IIc1中的每个Ra和Rb独立地选自H和C1-2烷基。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc或IIc1中的每个X1是C1-2亚烷基。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc或IIc1中的每个X1是C1亚烷基。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc或IIc1中的下标n是从1至3的整数。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc或IIc1中的下标n是1。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIa1、IIb、IIb1、IIc或IIc1中的下标n是0。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIb、IIc中的下标m是从1至2的整数。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIb、IIc中的下标m是0。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1、Ic2、II、IIa、IIa’、IIb、IIc中的下标m是1。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1或Ic2中的R4a是-OH或-NH2。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1或Ic2中的R4a是-OH。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1或Ic2中的R4a是-O-C1-4烷基。
在一些实施方案中，式I、I-1、I-2、Ia、Ia’、Ia1、Ia1’、Ia2、Ia2’、Ib、Ib1、Ib2、Ic、Ic1或Ic2中的R4a是-O-C(O)-C1-4烷基。
在一些实施方案中，式I的化合物具有式II的结构
Figure BDA0003443861290000241
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R1选自-NH-C(O)-R1a、-NH-C(O)-O-R1a；-NH-X1-C(O)-R1a和-NH-R1a；
每个R2和R3独立地选自-NH2、-OH、-X1-NH2、-X1-OH；
R1a选自C2-6烷基；和C1-6卤代烷基；
每个X1是C1-2亚烷基；
下标n是从0至2的整数；并且
下标m是0或1。
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，式IIa的化合物具有式IIa1的结构
Figure BDA0003443861290000251
R1选自-NH-C(O)-R1a；
R2独立地选自-NH2或-OH；
R1a选自C2-6烷基；和C1-6卤代烷基；并且
下标n是0或1。
在一些实施方案中，式I的化合物具有式Ia的结构
Figure BDA0003443861290000252
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R1选自-NH-C(O)-R1a；
R2独立地选自-NH2或-OH；
R1a选自C2-6烷基；和C1-6卤代烷基；
R4a是-OH；
R4b是H；
下标n是0或1；并且
下标m是0。
在一些实施方案中，式IIb的化合物具有式IIb1的结构
Figure BDA0003443861290000253
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R1选自-NH-C(O)-R1a；
R2独立地选自-NH2或-OH；
R1a选自C2-6烷基；和C1-6卤代烷基；并且
下标n是0或1。
在一些实施方案中，式IIc的化合物具有式IIc1的结构
Figure BDA0003443861290000254
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R1选自-NH-C(O)-R1a；
R2独立地选自-NH2或-OH；
R1a选自C2-6烷基；和C1-6卤代烷基；并且
下标n是0或1。
在一些实施方案中，式I的化合物选自表1。
表1：具体化合物
Figure BDA0003443861290000261
Figure BDA0003443861290000271
Figure BDA0003443861290000281
Figure BDA0003443861290000291
Figure BDA0003443861290000301
Figure BDA0003443861290000311
Figure BDA0003443861290000321
Figure BDA0003443861290000331
Figure BDA0003443861290000341
用于本发明方法的扩增细胞培养基组合物可以包含约10-16,000nM的本文公开的式I的化合物或子实施方案，诸如约50-450nM、100-400nM、约150-350nM、约200-300nM、约225-275nM或约240-260nM，诸如约300-3000nM、500-2000nM、约550-1550nM、约800-1200nM、约900-1100nM或约950-1050nM，或诸如以下中的任一个：约10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM 75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、100nM、105nM、110nM、115nM、120nM、125nM、130nM、135nM、140nM、145nM、150nM、155nM、160nM、165nM、170nM、175nM、180nM、185nM、190nM、195nM、200nM、205nM、210nM、215nM、220nM、225nM、230nM、240nM、245nM、250nM、255nM、260nM、265nM、270nM、275nM、280nM、285nM、290nM、295nM、300nM、325nM、350nM、400nM、425nM、450nM、475nM、500nM、525nM、550nM、575nM、600nM、625nM、650nM、675nM、700nM、725nM、750nM、775nM、800nM、825nM、850nM、875nM、900nM、925nM、950nM、975nM、1000nM、1100nM、1200nM、1300nM、1400nM、1500nM、1600nM、1700nM、1800nM、1900nM、2000nM、2100nM、2200nM、2300nM、2400nM、2500nM、2600nM、2700nM、2800nM、2900nM、3000nM、3100nM、3200nM、3300nM、3400nM、3500nM、3600nM、3700nM、3800nM、3900nM、4000nM、5000nM、6000nM、7000nM、8000nM、9000nM、10,000nM、11,000nM、12,000nM、13,000nM、14,000nM、15,000nM、16,000nM或更多本文公开的式I的化合物或子实施方案，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，用于本发明方法的培养基组合物可以包含约500nM的本文公开的式I的化合物或子实施方案。在一些实施方案中，用于本发明方法的培养基组合物可以包含约800nM的本文公开的式I的化合物或子实施方案。在一些实施方案中，用于本发明方法的培养基组合物可以包含约1,600nM的本文公开的式I的化合物或子实施方案。在一些实施方案中，用于本发明方法的培养基组合物可以包含约8,000nM的本文公开的式I的化合物或子实施方案。
2.细胞因子和生长因子
用于本文公开的方法的扩增细胞培养基(例如，基础培养基或补料培养基)可以含有一种或多种细胞因子或生长因子。这些因子促进HSC的存活、维持、扩增或增强，并且可以通过可商购源获得。
扩增细胞培养基可以包含促血小板生成素(TPO)。促血小板生成素是由肝脏和肾脏产生的糖蛋白激素，其调节血小板的产生。它刺激巨核细胞的产生和分化，巨核细胞是生出大量血小板的骨髓细胞。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约50-250ng/mL的TPO，诸如约75-225ng/mL、约100-200ng/mL或约125-175ng/mL，或诸如以下中的任一个：约75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、105ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、141ng/mL、142ng/mL、143ng/mL、144ng/mL、145ng/mL、146ng/mL、147ng/mL、148ng/mL、149ng/mL、150ng/mL、151ng/mL、152ng/mL、153ng/mL、154ng/mL、155ng/mL、156ng/mL、157ng/mL、158ng/mL、159ng/mL、160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL、185ng/mL、190ng/mL、195ng/mL、200ng/mL、205ng/mL、210ng/mL、215ng/mL、220ng/mL、225ng/mL、230ng/mL、235ng/mL、240ng/mL、245ng/mL或250ng/mL或更多TPO，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中TPO的浓度是约100ng/mL。
扩增细胞培养基可以包含罗米司亭。罗米司亭是促血小板生成素的融合蛋白类似物。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约50-250ng/mL的罗米司亭，诸如约10-150ng/mL或约20-100ng/mL，或诸如以下中的任一个：约5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、105ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、141ng/mL、142ng/mL、143ng/mL、144ng/mL、145ng/mL、146ng/mL、147ng/mL、148ng/mL、149ng/mL、150ng/mL、151ng/mL、152ng/mL、153ng/mL、154ng/mL、155ng/mL、156ng/mL、157ng/mL、158ng/mL、159ng/mL、160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL、185ng/mL、190ng/mL、195ng/mL、200ng/mL、205ng/mL、210ng/mL、215ng/mL、220ng/mL、225ng/mL、230ng/mL、235ng/mL、240ng/mL、245ng/mL或250ng/mL或更多罗米司亭，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中罗米司亭的浓度是约20ng/mL。
扩增细胞培养基可以包含艾曲波帕。艾曲波帕是充当TpoR受体激动剂的药物。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约50-2,000ng/mL的艾曲波帕，诸如约200-1,000ng/mL或约400-800ng/mL，或诸如以下中的任一个：约50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL 75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、105ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL、160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL、185ng/mL、190ng/mL、195ng/mL、200ng/mL、205ng/mL、210ng/mL、215ng/mL、220ng/mL、225ng/mL、230ng/mL、240ng/mL、245ng/mL、250ng/mL、255ng/mL、260ng/mL、265ng/mL、270ng/mL、275ng/mL、280ng/mL、285ng/mL、290ng/mL、295ng/mL、300ng/mL、325ng/mL、350ng/mL、400ng/mL、425ng/mL、450ng/mL、475ng/mL、500ng/mL、525ng/mL、550ng/mL、575ng/mL、600ng/mL、625ng/mL、650ng/mL、675ng/mL、700ng/mL、725ng/mL、750ng/mL、775ng/mL、800ng/mL、825ng/mL、850ng/mL、875ng/mL、900ng/mL、925ng/mL、950ng/mL、975ng/mL、1000ng/mL、1100ng/mL、1200ng/mL、1300ng/mL、1400ng/mL、1500ng/mL、1600ng/mL、1700ng/mL、1800ng/mL、1900ng/mL、2000ng/mL或更多的艾曲波帕化合物，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，用于本发明方法的培养基组合物可以包含约1,000ng/mL的艾曲波帕。
本文公开的扩增细胞培养基还可以包含干细胞因子(也称为SCF、KIT-配体、KL或steel因子)。SCF是与c-KIT受体(CD117)结合的细胞因子，并且其在骨髓中HSC的调节中发挥作用。SCF已显示会增加体外HSC的存活，并且有助于体内HSC的自我更新和维持。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约5-100ng/mL的SCF，诸如约10-90ng/mL、约20-80ng/mL、约30-70ng/mL、约40-60ng/mL或约45-55ng/mL，或诸如以下中的任一个：约5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、41ng/mL、42ng/mL、43ng/mL、44ng/mL、45ng/mL、46ng/mL、47ng/mL、48ng/mL、49ng/mL、50ng/mL、51ng/mL、52ng/mL、53ng/mL、54ng/mL、55ng/mL、56ng/mL、57ng/mL、58ng/mL、59ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL或更多SCF，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包括100ng/mL或更高的浓度。因此，SCF的浓度还包括110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL 160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL、185ng/mL、190ng/mL、200ng/mL或更多SCF，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中SCF的浓度是约100ng/mL。
用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约10-16,000nM的本文公开的式I的化合物或子实施方案，诸如约50-450nM、100-400nM、约150-350nM、约200-300nM、约225-275nM或约240-260nM，诸如约300-3000nM、500-2000nM、约550-1550nM、约800-1200nM、约900-1100nM或约950-1050nM，或诸如以下中的任一个：约10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、100nM、105nM、110nM、115nM、120nM、125nM、130nM、135nM、140nM、145nM、150nM、155nM、160nM、165nM、170nM、175nM、180nM、185nM、190nM、195nM、200nM、205nM、210nM、215nM、220nM、225nM、230nM、240nM、245nM、250nM、255nM、260nM、265nM、270nM、275nM、280nM、285nM、290nM、295nM、300nM、325nM、350nM、400nM、425nM、450nM、475nM、500nM、525nM、550nM、575nM、600nM、625nM、650nM、675nM、700nM、725nM、750nM、775nM、800nM、825nM、850nM、875nM、900nM、925nM、950nM、975nM、1000nM、1100nM、1200nM、1300nM、1400nM、1500nM、1600nM、1700nM、1800nM、1900nM、2000nM、2100nM、2200nM、2300nM、2400nM、2500nM、2600nM、2700nM、2800nM、2900nM、3000nM、3100nM、3200nM、3300nM、3400nM、3500nM、3600nM、3700nM、3800nM、3900nM、4000nM、5000nM、6000nM、7000nM、8000nM、9000nM、10,000nM、11,000nM、12,000nM、13,000nM、14,000nM、15,000nM、16,000nM或更多的本文公开的式I的化合物或子实施方案，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，用于本发明方法的培养基组合物可以包含约500nM的本文公开的式I的化合物或子实施方案。在一些实施方案中，用于本发明方法的培养基组合物可以包含约800nM的本文公开的式I的化合物或子实施方案。在一些实施方案中，用于本发明方法的培养基组合物可以包含约1,600nM的本文公开的式I的化合物或子实施方案。在一些实施方案中，用于本发明方法的培养基组合物可以包含约8,000nM的本文公开的式I的化合物或子实施方案。
本文公开的扩增细胞培养基还可以含有胰岛素样生长因子1(IGF-1；也称为生长调节素C)。IGF-1是分子结构与胰岛素相似的激素。它在儿童成长中起重要作用并且在成人中具有合成代谢作用。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约100-400ng/mL的IGF-1，诸如约125-375ng/mL、约150-350ng/mL、约175-325ng/mL、约200-300ng/mL、约225-275ng/mL、约240-260ng/mL或约245-255ng/mL，或诸如以下中的任一个：约100ng/mL、105ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL、160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL、185ng/mL、190ng/mL、195ng/mL、200ng/mL、205ng/mL、210ng/mL、215ng/mL、220ng/mL、225ng/mL、230ng/mL、235ng/mL、240ng/mL、241ng/mL、242ng/mL、243ng/mL、244ng/mL、245ng/mL、246ng/mL、247ng/mL、248ng/mL、249ng/mL、250ng/mL、251ng/mL、252ng/mL、253ng/mL、254ng/mL、255ng/mL、256ng/mL、257ng/mL、258ng/mL、259ng/mL、260ng/mL、265ng/mL、270ng/mL、275ng/mL、280ng/mL、285ng/mL、290ng/mL、295ng/mL、300ng/mL、305ng/mL、310ng/mL、315ng/mL、320ng/mL、325ng/mL、330ng/mL、335ng/mL、340ng/mL、345ng/mL、350ng/mL、355ng/mL、360ng/mL、365ng/mL、370ng/mL、375ng/mL、380ng/mL、385ng/mL、390ng/mL、395ng/mL或400ng/mL或更多IGF-1，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中IGF-1的浓度是约250ng/mL。
本文提供的用于培养HSC的扩增细胞培养基可以进一步包含fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3L)。FLT3L是刺激细胞生长、增殖和分化的细胞因子。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约20-400ng/mL的FLT3L，诸如约40-375ng/mL、约60-350ng/mL、约80-325ng/mL、约100-300ng/mL、约140-275ng/mL、约160-260ng/mL或约180-255ng/mL，或诸如以下中的任一个：约20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL,100ng/mL、105ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL、160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL、185ng/mL、190ng/mL、195ng/mL、200ng/mL、205ng/mL、210ng/mL、215ng/mL、220ng/mL、225ng/mL、230ng/mL、235ng/mL、240ng/mL、241ng/mL、242ng/mL、243ng/mL、244ng/mL、245ng/mL、246ng/mL、247ng/mL、248ng/mL、249ng/mL、250ng/mL、251ng/mL、252ng/mL、253ng/mL、254ng/mL、255ng/mL、256ng/mL、257ng/mL、258ng/mL、259ng/mL、260ng/mL、265ng/mL、270ng/mL、275ng/mL、280ng/mL、285ng/mL、290ng/mL、295ng/mL、300ng/mL、305ng/mL、310ng/mL、315ng/mL、320ng/mL、325ng/mL、330ng/mL、335ng/mL、340ng/mL、345ng/mL、350ng/mL、355ng/mL、360ng/mL、365ng/mL、370ng/mL、375ng/mL、380ng/mL、385ng/mL、390ng/mL、395ng/mL或400ng/mL或更多FLT3L，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中FLT3L的浓度是约100ng/mL。
本文提供的用于培养HSC的扩增细胞培养基可以进一步包含人生长激素(HGH)。HGH是刺激细胞生长、增殖和分化的蛋白激素。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约100-400ng/mL的EGF，诸如约125-375ng/mL、约150-350ng/mL、约175-325ng/mL、约200-300ng/mL、约225-275ng/mL、约240-260ng/mL或约245-255ng/mL，或诸如以下中的任一个：约100ng/mL、105ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL、160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL、185ng/mL、190ng/mL、195ng/mL、200ng/mL、205ng/mL、210ng/mL、215ng/mL、220ng/mL、225ng/mL、230ng/mL、235ng/mL、240ng/mL、241ng/mL、242ng/mL、243ng/mL、244ng/mL、245ng/mL、246ng/mL、247ng/mL、248ng/mL、249ng/mL、250ng/mL、251ng/mL、252ng/mL、253ng/mL、254ng/mL、255ng/mL、256ng/mL、257ng/mL、258ng/mL、259ng/mL、260ng/mL、265ng/mL、270ng/mL、275ng/mL、280ng/mL、285ng/mL、290ng/mL、295ng/mL、300ng/mL、305ng/mL、310ng/mL、315ng/mL、320ng/mL、325ng/mL、330ng/mL、335ng/mL、340ng/mL、345ng/mL、350ng/mL、355ng/mL、360ng/mL、365ng/mL、370ng/mL、375ng/mL、380ng/mL、385ng/mL、390ng/mL、395ng/mL或400ng/mL或更多EGF，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中HGH的浓度是约250ng/mL。
本文提供的用于培养HSC的扩增细胞培养基可以进一步包含表皮生长因子(EGF)。EGF是一种生长因子，其通过与其受体EGFR结合来刺激细胞生长、增殖和分化。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约100-400ng/mL的EGF，诸如约125-375ng/mL、约150-350ng/mL、约175-325ng/mL、约200-300ng/mL、约225-275ng/mL、约240-260ng/mL或约245-255ng/mL，或诸如以下中的任一个：约100ng/mL、105ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL、160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL、185ng/mL、190ng/mL、195ng/mL、200ng/mL、205ng/mL、210ng/mL、215ng/mL、220ng/mL、225ng/mL、230ng/mL、235ng/mL、240ng/mL、241ng/mL、242ng/mL、243ng/mL、244ng/mL、245ng/mL、246ng/mL、247ng/mL、248ng/mL、249ng/mL、250ng/mL、251ng/mL、252ng/mL、253ng/mL、254ng/mL、255ng/mL、256ng/mL、257ng/mL、258ng/mL、259ng/mL、260ng/mL、265ng/mL、270ng/mL、275ng/mL、280ng/mL、285ng/mL、290ng/mL、295ng/mL、300ng/mL、305ng/mL、310ng/mL、315ng/mL、320ng/mL、325ng/mL、330ng/mL、335ng/mL、340ng/mL、345ng/mL、350ng/mL、355ng/mL、360ng/mL、365ng/mL、370ng/mL、375ng/mL、380ng/mL、385ng/mL、390ng/mL、395ng/mL或400ng/mL或更多EGF，包括落入这些浓度之间的值。
本文公开的扩增细胞培养基还可以包含肝细胞生长因子(HGF)。HGF是一种旁分泌细胞生长、运动和形态发生因子。它由间充质细胞分泌，并且主要作用于上皮细胞和内皮细胞，而且也作用于造血祖细胞和T细胞。HGF已显示在胚胎器官发育中，特别是在肌生成、成人器官再生和伤口愈合中具有重要作用。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约100-400ng/mL的HGF，诸如约125-375ng/mL、约150-350ng/mL、约175-325ng/mL、约200-300ng/mL、约225-275ng/mL、约240-260ng/mL或约245-255ng/mL，或诸如以下中的任一个：约100ng/mL、105ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL、160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL、185ng/mL、190ng/mL、195ng/mL、200ng/mL、205ng/mL、210ng/mL、215ng/mL、220ng/mL、225ng/mL、230ng/mL、235ng/mL、240ng/mL、241ng/mL、242ng/mL、243ng/mL、244ng/mL、245ng/mL、246ng/mL、247ng/mL、248ng/mL、249ng/mL、250ng/mL、251ng/mL、252ng/mL、253ng/mL、254ng/mL、255ng/mL、256ng/mL、257ng/mL、258ng/mL、259ng/mL、260ng/mL、265ng/mL、270ng/mL、275ng/mL、280ng/mL、285ng/mL、290ng/mL、295ng/mL、300ng/mL、305ng/mL、310ng/mL、315ng/mL、320ng/mL、325ng/mL、330ng/mL、335ng/mL、340ng/mL、345ng/mL、350ng/mL、355ng/mL、360ng/mL、365ng/mL、370ng/mL、375ng/mL、380ng/mL、385ng/mL、390ng/mL、395ng/mL或400ng/mL或更多HGF，包括落入这些浓度之间的值。
本文公开的扩增细胞培养基还可以含有多效生长因子(PTN)。PTN是一种发育调节的蛋白，其已显示推测通过激活肿瘤血管生成而参与肿瘤生长和转移。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约100-400ng/mL的PTN，诸如约125-375ng/mL、约150-350ng/mL、约175-325ng/mL、约200-300ng/mL、约225-275ng/mL、约240-260ng/mL或约245-255ng/mL，或诸如以下中的任一个：约100ng/mL、105ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL、160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL、185ng/mL、190ng/mL、195ng/mL、200ng/mL、205ng/mL、210ng/mL、215ng/mL、220ng/mL、225ng/mL、230ng/mL、235ng/mL、240ng/mL、241ng/mL、242ng/mL、243ng/mL、244ng/mL、245ng/mL、246ng/mL、247ng/mL、248ng/mL、249ng/mL、250ng/mL、251ng/mL、252ng/mL、253ng/mL、254ng/mL、255ng/mL、256ng/mL、257ng/mL、258ng/mL、259ng/mL、260ng/mL、265ng/mL、270ng/mL、275ng/mL、280ng/mL、285ng/mL、290ng/mL、295ng/mL、300ng/mL、305ng/mL、310ng/mL、315ng/mL、320ng/mL、325ng/mL、330ng/mL、335ng/mL、340ng/mL、345ng/mL、350ng/mL、355ng/mL、360ng/mL、365ng/mL、370ng/mL、375ng/mL、380ng/mL、385ng/mL、390ng/mL、395ng/mL或400ng/mL或更多PTN，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，PTN不会改善造血干细胞的维持或增强。
在又一些实施方案中，本文公开的扩增细胞培养基组合物可以另外含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF、FGF2或FGF-β)。bFGF是人胚胎干细胞培养基的关键组分。然而，虽然生长因子是细胞保持未分化状态所必需的，但其这么做的机制非常不确定。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约25-225ng/mL的bFGF，诸如约50-200ng/mL、约100-200ng/mL、约100-150ng/mL或约115-135ng/mL，或诸如以下中的任一个：约75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、105ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、116ng/mL、117ng/mL、118ng/mL、119ng/mL、120ng/mL、121ng/mL、122ng/mL、123ng/mL、124ng/mL、125ng/mL、126ng/mL、127ng/mL、128ng/mL、129ng/mL、130ng/mL、131ng/mL、132ng/mL、133ng/mL、134ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、141ng/mL、142ng/mL、143ng/mL、144ng/mL、145ng/mL、146ng/mL、147ng/mL、148ng/mL、149ng/mL、150ng/mL、151ng/mL、152ng/mL、153ng/mL、154ng/mL、155ng/mL、156ng/mL、157ng/mL、158ng/mL、159ng/mL、160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL、185ng/mL、190ng/mL、195ng/mL、200ng/mL、205ng/mL、210ng/mL、215ng/mL、220ng/mL、225ng/mL、230ng/mL、235ng/mL、240ng/mL、245ng/mL或250ng/mL或更多bFGF，包括落入这些浓度之间的值。
本文公开的扩增细胞培养基还可以包含血管生成素1(ANG1)。ANG1是血管生长因子的血管生成素家族的成员，其在胚胎和出生后血管生成中发挥作用。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约25-225ng/mL的ANG1，诸如约50-200ng/mL、约100-200ng/mL、约100-150ng/mL或约115-135ng/mL，或诸如以下中的任一个：约75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、105ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、116ng/mL、117ng/mL、118ng/mL、119ng/mL、120ng/mL、121ng/mL、122ng/mL、123ng/mL、124ng/mL、125ng/mL、126ng/mL、127ng/mL、128ng/mL、129ng/mL、130ng/mL、131ng/mL、132ng/mL、133ng/mL、134ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、141ng/mL、142ng/mL、143ng/mL、144ng/mL、145ng/mL、146ng/mL、147ng/mL、148ng/mL、149ng/mL、150ng/mL、151ng/mL、152ng/mL、153ng/mL、154ng/mL、155ng/mL、156ng/mL、157ng/mL、158ng/mL、159ng/mL、160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL、185ng/mL、190ng/mL、195ng/mL、200ng/mL、205ng/mL、210ng/mL、215ng/mL、220ng/mL、225ng/mL、230ng/mL、235ng/mL、240ng/mL、245ng/mL或250ng/mL或更多ANG1，包括落入这些浓度之间的值。
白介素10(IL-10)也可以是本文公开的扩增细胞培养基组合物中的组分。IL-10是一种细胞因子，其在免疫调节和炎症方面具有多重多效性作用。它下调巨噬细胞上Th1细胞因子、MHC II类抗原和共刺激分子的表达。它还增强B细胞存活、增殖和抗体产生。IL-10可以阻断NF-κB活性，并且参与JAK-STAT信号传导通路的调节。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约1-25ng/mL的IL-10，诸如约5-20ng/mL、10-20ng/mL或12-18ng/mL，诸如以下中的任一个：约1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL或25ng/mL的IL-10。
白介素3(IL-3)也可以是本文公开的扩增细胞培养基组合物中的组分。IL-3是一种细胞因子，其在免疫调节和炎症方面具有多重多效性作用。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约1-25ng/mL的IL-3，诸如约5-20ng/mL、10-20ng/mL或12-18ng/mL，诸如以下中的任一个：约1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL或25ng/mL的IL-3。在一些实施方案中，用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包括25ng/mL或更高的浓度。因此，IL-3的浓度还包括10-140ng/mL、约30-130ng/mL、约50-120ng/mL、约70-110ng/mL或约95-105ng/mL，或诸如以下中的任一个：约30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、41ng/mL、42ng/mL、43ng/mL、44ng/mL、45ng/mL、46ng/mL、47ng/mL、48ng/mL、49ng/mL、50ng/mL、51ng/mL、52ng/mL、53ng/mL、54ng/mL、55ng/mL、56ng/mL、57ng/mL、58ng/mL、59ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL 160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL 185ng/mL、190ng/mL、200ng/mL或更多IL-3，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中IL-3的浓度是约25ng/mL。
白介素6(IL-6)也可以是本文公开的扩增细胞培养基组合物的组分。IL-6是一种细胞因子，其在免疫调节和炎症方面具有多重多效性作用。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约1-25ng/mL的IL-6，诸如约5-20ng/mL、10-20ng/mL或12-18ng/mL，诸如以下中的任一个：约1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL或25ng/mL的IL-6。在一些实施方案中，用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包括25ng/mL或更高的浓度。因此，IL-6的浓度还包括10-140ng/mL、约30-130ng/mL、约50-120ng/mL、约70-110ng/mL或约95-105ng/mL，或诸如以下中的任一个：约30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、41ng/mL、42ng/mL、43ng/mL、44ng/mL、45ng/mL、46ng/mL、47ng/mL、48ng/mL、49ng/mL、50ng/mL、51ng/mL、52ng/mL、53ng/mL、54ng/mL、55ng/mL、56ng/mL、57ng/mL、58ng/mL、59ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL 160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL 185ng/mL、190ng/mL、200ng/mL或更多IL-6，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中IL-6的浓度是约100ng/mL。
白介素7(IL-7)也可以是本文公开的扩增细胞培养基组合物的组分。IL-7是一种细胞因子，其在免疫调节和发育方面具有多重多效性作用。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约1-25ng/mL的IL-7，诸如约5-20ng/mL、10-20ng/mL或12-18ng/mL，诸如以下中的任一个：约1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL或25ng/mL的IL-7。在一些实施方案中，用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包括25ng/mL或更高的浓度。因此，IL-7的浓度还包括10-140ng/mL、约30-130ng/mL、约50-120ng/mL、约70-110ng/mL或约95-105ng/mL，或诸如以下中的任一个：约30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、41ng/mL、42ng/mL、43ng/mL、44ng/mL、45ng/mL、46ng/mL、47ng/mL、48ng/mL、49ng/mL、50ng/mL、51ng/mL、52ng/mL、53ng/mL、54ng/mL、55ng/mL、56ng/mL、57ng/mL、58ng/mL、59ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL 160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL 185ng/mL、190ng/mL、200ng/mL或更多IL-7，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中IL-7的浓度是约100ng/mL。
本文公开的扩增细胞培养基还可以包含粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。G-CSF是一种糖蛋白，其刺激骨髓产生粒细胞和干细胞并且将它们释放到血流中。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约5-100ng/mL的G-CSF，诸如约10-90ng/mL、约20-80ng/mL、约30-70ng/mL、约40-60ng/mL或约45-55ng/mL，或诸如以下中的任一个：约5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、41ng/mL、42ng/mL、43ng/mL、44ng/mL、45ng/mL、46ng/mL、47ng/mL、48ng/mL、49ng/mL、50ng/mL、51ng/mL、52ng/mL、53ng/mL、54ng/mL、55ng/mL、56ng/mL、57ng/mL、58ng/mL、59ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL或更多G-CSF，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包括100ng/mL或更高的浓度。因此，G-CSF的浓度还包括110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL 160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL、185ng/mL、190ng/mL、200ng/mL或更多G-CSF，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中G-CSF的浓度是约100ng/mL。
本文公开的扩增细胞培养基还可以包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。GM-CSF是作为白血细胞生长因子的糖蛋白。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约5-100ng/mL的GM-CSF，诸如约10-90ng/mL、约20-80ng/mL、约30-70ng/mL、约40-60ng/mL或约45-55ng/mL，或诸如以下中的任一个：约5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、41ng/mL、42ng/mL、43ng/mL、44ng/mL、45ng/mL、46ng/mL、47ng/mL、48ng/mL、49ng/mL、50ng/mL、51ng/mL、52ng/mL、53ng/mL、54ng/mL、55ng/mL、56ng/mL、57ng/mL、58ng/mL、59ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL或更多GM-CSF，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包括100ng/mL或更高的浓度。因此，GM-CSF的浓度还包括110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL 160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL、185ng/mL、190ng/mL、200ng/mL或更多GM-CSF，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中GM-CSF的浓度是约15ng/mL。
本文公开的扩增细胞培养基还可以含有血管内皮生长因子165(VEGF165)，其属于PDGF/VEGF生长因子家族。许多细胞类型分泌VEGF165，它是一种有效力的血管生成因子和丝裂原，其刺激内皮细胞的增殖、迁移和形成。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约5-100ng/mL的VEGF165，诸如约10-90ng/mL、约20-80ng/mL、约30-70ng/mL、约40-60ng/mL或约45-55ng/mL，或诸如以下中的任一个：约5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、41ng/mL、42ng/mL、43ng/mL、44ng/mL、45ng/mL、46ng/mL、47ng/mL、48ng/mL、49ng/mL、50ng/mL、51ng/mL、52ng/mL、53ng/mL、54ng/mL、55ng/mL、56ng/mL、57ng/mL、58ng/mL、59ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL或更多VEGF165，包括落入这些浓度之间的值。
本文公开的扩增细胞培养基还可以含有血管内皮生长因子C(VEGF-C)，其属于PDGF/VEGF生长因子家族。许多细胞类型分泌VEGF-C，其在血管生成和内皮细胞生长中起作用，刺激增殖和迁移，并且对血管的通透性也有影响。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约50-1000ng/mL的VEGF-C，诸如约100-900ng/mL、约200-800ng/mL、约300-700ng/mL、约400-600ng/mL或约450-550ng/mL，或诸如以下中的任一个：约50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、250ng/mL、300ng/mL、350ng/mL、400ng/mL、410ng/mL、420ng/mL、430ng/mL、440ng/mL、450ng/mL、460ng/mL、470ng/mL、480ng/mL、490ng/mL、500ng/mL、510ng/mL、520ng/mL、530ng/mL、540ng/mL、550ng/mL、560ng/mL、570ng/mL、580ng/mL、590ng/mL、600ng/mL、650ng/mL、700ng/mL、750ng/mL、800ng/mL、850ng/mL、900ng/mL、950ng/mL、1000ng/mL或更多VEGF-C，包括落入这些浓度之间的值。
在再另外的实施方案中，本文公开的扩增细胞培养基组合物可以含有层粘连蛋白，所述层粘连蛋白是细胞外基质的高分子量(约400kDa)蛋白质。它们是基底层(基底膜的一个层)的主要组分，基底层是大多数细胞和器官的蛋白质网络基础。层粘连蛋白是基底层的重要且生物活性的部分，影响细胞分化、迁移和粘附。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约500-1000ng/mL层粘连蛋白，诸如约600-900ng/mL、约700-800ng/mL、约725-775ng/mL或约745-755ng/mL，或诸如以下中的任一个：约500ng/mL、525ng/mL、550ng/mL、575ng/mL、600ng/mL、625ng/mL、650ng/mL、675ng/mL、700ng/mL、705ng/mL、710ng/mL、715ng/mL、720ng/mL、725ng/mL、730ng/mL、735ng/mL、740ng/mL、741ng/mL、742ng/mL、743ng/mL、744ng/mL、745ng/mL、746ng/mL、747ng/mL、748ng/mL、749ng/mL、750ng/mL、751ng/mL、752ng/mL、753ng/mL、754ng/mL、755ng/mL、756ng/mL、757ng/mL、758ng/mL、759ng/mL、760ng/mL、765ng/mL、770ng/mL、775ng/mL、780ng/mL、785ng/mL、790ng/mL、795ng/mL、800ng/mL、825ng/mL、850ng/mL、875ng/mL、900ng/mL、925ng/mL、950ng/mL、975ng/mL、1000ng/mL或更多层粘连蛋白，包括落入这些浓度之间的值。
3.其他小分子
用于本文公开的方法的扩增细胞培养基可以另外含有各种小分子抑制剂，诸如半胱天冬酶抑制剂、DNA甲基化抑制剂、p38 MAPK抑制剂、糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂,和/或JAK/STAT抑制剂。在一个实施方案中，细胞培养基的DMSO浓度不超过0.025％v/v。
在一些实施方案中，用于本文公开的方法的扩增细胞培养基包含一种或多种半胱天冬酶抑制剂。半胱天冬酶是半胱氨酸蛋白酶家族，其在凋亡(程序性细胞死亡)、坏死和炎症中起重要作用。截至2009年11月，已在人类中鉴定出十二种半胱天冬酶。存在两种类型的凋亡半胱天冬酶：起始子(顶端)半胱天冬酶和效应子(执行者)半胱天冬酶。起始子半胱天冬酶(例如，CASP2、CASP8、CASP9和CASP10)切割效应子半胱天冬酶的无活性前形式，从而将其激活。效应子半胱天冬酶(例如，CASP3、CASP6、CASP7)进而切割细胞内的其他蛋白质底物以触发凋亡过程。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约1-10μg/mL的半胱天冬酶抑制剂，诸如以下中的任一个：约2-8μg/mL、约3-7μg/mL或约4-6μg/mL，或诸如以下中的任一个：约1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL或更多半胱天冬酶抑制剂。在一个实施方案中，半胱天冬酶抑制剂是Z-VAD-FMK。
用于本文公开的方法的扩增细胞培养基可以包含一种或多种DNA甲基化抑制剂。DNA甲基化是向DNA添加甲基以修饰其官能团的过程。当位于基因启动子中时，DNA甲基化典型地起抑制基因转录的作用。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约300-700nM的DNA甲基化抑制剂，诸如约350-650nM、约400-600nM、约450-550nM、约475-525nM或约490-510nM，或诸如以下中的任一个：约300nM、325nM、350nM、400nM、425nM、430nM、435nM、440nM、445nM、450nM、455nM、460nM、465nM、470nM、475nM、480nM、485nM、490nM、491nM、492nM、493nM、494nM、495nM、496nM、497nM、498nM、499nM、500nM、501nM、502nM、503nM、504nM、505nM、506nM、507nM、508nM、509nM、510nM、515nM、520nM、525nM、530nM、535nM、540nM、545nM、550nM、555nM、560nM、565nM、570nM、575nM、600nM、625nM、650nM、675nM、700nM或更多DNA甲基化抑制剂，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，DNA甲基化抑制剂是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。在其他实施方案中，用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约0.25-3μM的DNA甲基化抑制剂，诸如约0.5-2.5μM、约1-2μM或约1.25-1.75μM，诸如以下中的任一个：约0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM或3μM或更多DNA甲基化抑制剂，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，DNA甲基化抑制剂是Oct4激活化合物1(OAC1)。
用于本文公开的方法的扩增细胞培养基可以包含地塞米松。地塞米松是一种皮质类固醇。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约5-100nM的地塞米松，诸如约10-90nM、约20-80nM、约30-70nM、约40-60nM或约45-55nM，或诸如以下中的任一个：约5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、41nM、42nM、43nM、44nM、45nM、46nM、47nM、48nM、49nM、50nM、51nM、52nM、53nM、54nM、55nM、56nM、57nM、58nM、59nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、100nM或更多地塞米松，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包括100nM或更高的浓度。因此，地塞米松的浓度还包括110nM、115nM、120nM、125nM、130nM、135nM、140nM、145nM、150nM、155nM160nM、165nM、170nM、175nM、180nM 185nM、190nM、200nM或更多地塞米松，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中地塞米松的浓度是约100nM。
本文公开的任何扩增细胞培养基还可以包含p38 MAPK抑制剂。p38丝裂原活化蛋白激酶是一类对诸如细胞因子、紫外线照射、热休克和渗透压休克的应激刺激有反应的丝裂原活化蛋白激酶，并且参与细胞分化、凋亡和自噬。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约400-800nM的p38 MAPK抑制剂，诸如约500-700nM、约550-650nM、约600-650nM或约615-635nM，或诸如以下中的任一个：约400nM、425nM、450nM、475nM、500nM、525nM、550nM、575nM、600nM、605nM、610nM、615nM、616nM、617nM、618nM、619nM、620nM、621nM、622nM、623nM、624nM、625nM、626nM、627nM、628nM、629nM、630nM、631nM、632nM、633nM、634nM、635nM、640nM、645nM、650nM、655nM、660nM、665nM、670nM、675nM、680nM、685nM、690nM、695nM、700nM、725nM、750nM、775nM、800nM或更多p38 MAPK抑制剂，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，p38 MAPK抑制剂是BIRB796。
在再另外的实施方案中，本文公开的扩增细胞培养基组合物可以含有糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂。GSK3是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其介导磷酸分子添加到丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基上。GSK-3对蛋白质的磷酸化通常会抑制其下游靶标的活性。GSK-3在许多中央细胞内信号传导通路中具有活性，包括细胞增殖、迁移、葡萄糖调节和凋亡。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约0.25-2μM GSK3抑制剂，诸如约0.5-1.5μM或1.75-1.25μM，诸如约0.25μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、or 2μM或更多GSK3抑制剂，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，GSK3抑制剂是CHIR99021。
在又一些实施方案中，本文公开的扩增细胞培养基组合物可以另外含有视黄酸受体(RAR)拮抗剂，或者培养基可以包含受控或减少量的视黄酸以限制视黄酸信号传导。RAR是核受体以及转录因子，其被全反式视黄酸和9-顺式视黄酸激活。在一些实施方案中，通过限制培养基中视黄酸的量来减少视黄酸信号传导。
在又一些实施方案中，本文公开的扩增细胞培养基组合物可以另外含有视黄酸受体(RAR)拮抗剂。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约10-300nM RAR拮抗剂，诸如约25-175nM、约50-150或约75-125，或诸如以下中的任一个：约10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM 75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、100nM、105nM、110nM、115nM、120nM、125nM、130nM、135nM、140nM、145nM、150nM、155nM、160nM、165nM、170nM、175nM、180nM、185nM、190nM、191nM、192nM、193nM、194nM、195nM、196nM、197nM、198nM、199nM、200nM、201nM、202nM、203nM、204nM、205nM、206nM、207nM、208nM、209nM、210nM、215nM、220nM、225nM、230nM、235nM、240nM、241nM、242nM、243nM、244nM、245nM、246nM、247nM、248nM、249nM、250nM、251nM、252nM、253nM、254nM、255nM、256nM、257nM、258nM、259nM、260nM、265nM、270nM、275nM、280nM、285nM、290nM、295nM、300nM或更多RAR拮抗剂，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，RAR拮抗剂是ER50891。在一些实施方案中，ER50891的浓度是约100nM。
本文公开的扩增细胞培养基还可以包含JAK/STAT抑制剂。JAK-STAT信号传导通路将信息从细胞外化学信号传递到细胞核，导致参与免疫、增殖、分化、凋亡和肿瘤发生的基因的DNA转录和表达。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约300-700nM的JAK/STAT抑制剂，诸如约350-650nM、约400-600nM、约450-550nM、约475-525nM或约490-510nM，或诸如以下中的任一个：约300nM、325nM、350nM、400nM、425nM、430nM、435nM、440nM、445nM、450nM、455nM、460nM、465nM、470nM、475nM、480nM、485nM、490nM、491nM、492nM、493nM、494nM、495nM、496nM、497nM、498nM、499nM、500nM、501nM、502nM、503nM、504nM、505nM、506nM、507nM、508nM、509nM、510nM、515nM、520nM、525nM、530nM、535nM、540nM、545nM、550nM、555nM、560nM、565nM、570nM、575nM、600nM、625nM、650nM、675nM、700nM或更多JAK/STAT抑制剂，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，JAK/STAT抑制剂是托法替尼。
除了上述抑制剂分子之外，本文公开的任何扩增细胞培养基组合物还可以含有胎牛血清(FBS)，其浓度范围为从1-20％v/v，诸如约2-18％v/v、约5-15％v/v、约7.5-12.5％v/v，或诸如以下中的任一个：约1％v/v、2％v/v、3％v/v、4％v/v、5％v/v、6％v/v、7％v/v、8％v/v、9％v/v、10％v/v、11％v/v、12％v/v、13％v/v、14％v/v、15％v/v、16％v/v、17％v/v、18％v/v、19％v/v或20％v/v或更多FBS，包括落入这些百分比之间的值。在一些实施方案中，FBS是热灭活FBS。在一些实施方案中，培养基中FBS的浓度是约10％v/v。
除了上述抑制剂分子之外，本文公开的任何扩增细胞培养基组合物还可以含有添加的盐，例如KCl、NaCl、MgCl或CaCl2。在一个例子中，可以添加CaCl2以实现浓度范围为从300-380mOsm，诸如约300mOsm、约310mOsm、约320mOsm、约330mOsm、约340mOsm、约350mOsm、约360mOsm、约370mOsm、约380mOsm或更多CaCl2，包括落入这些数字之间的值。也可以使用高同渗浓摩CaCl2以针对非多能细胞进行选择，例如对HSC表型进行选择。
除了上述抑制剂分子之外，本文公开的任何扩增细胞培养基组合物可以调节为包括总体上更高同渗浓摩。多能干细胞可以更好地适于承受非典型同渗浓摩(例如，高同渗浓摩培养基可以针对非干细胞表型进行选择)。可以调节同渗浓摩，例如通过添加如上的盐或通过葡萄糖。
B.分化培养
与用于维持和/或增强在培养物中造血干细胞(HSC)的扩增的培养基一样，用于分化扩增的CD34+细胞的培养基包括基础培养基或补料培养基。每种分化培养基包含用于使扩增的CD34+细胞定向分化为希望谱系的合适调节剂。合适的调节剂在下面进一步描述并且取决于所希望的谱系。本领域技术人员应认识到，针对扩增细胞培养基所述的一些调节剂也用于分化培养基。本领域技术人员还应认识到，在给定的分化培养基中，单一调节剂不一定限定扩增的CD34+细胞将遵循的分化谱系，而是，添加的调节剂之间的相互作用或一种或多种调节剂的缺失可以限定这样的谱系。
除了下述调节剂的组合之外，用于使HSC分化定向的各种方法是本领域已知的。每种已知的分化培养条件都适用于本文所述的方法。
在一些实施方案中，在分化培养基中培养之前，针对至少一种造血干细胞表面表型标记物选择扩增的CD34+细胞。此类标记物包括CD45+、CD34+、CD133+、CD90+、CD45RA-和/或CD38低/-。在一些实施方案中，选择扩增的CD34+细胞以使细胞富有由以下标记物CD34+、CD133-、CD90-、CD45RA+和/或CD38+中的一种或多种表征的细胞表面表型。
在一些实施方案中，分化培养基不包含式I的化合物。
用于培养哺乳动物细胞的任何合适的基础培养基或补料培养基可以用于分化培养，并且可以包括但不限于可商购培养基，诸如DMEM培养基、IMDM培养基、StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)、STEMdiffTM APELTM 2培养基、199/109培养基、Ham的F10/F12培养基、McCoy的5A培养基、αMEM培养基(不含和含酚红)和RPMI 1640培养基。在一些实施方案中，基础培养基或补料培养基是αMEM培养基(不含酚红)。
1.红细胞分化培养
红系分化培养基提供了扩增的CD34+细胞优先朝向红系谱系分化的条件，从而产生含有寡能和单能红细胞祖细胞的细胞群体。
通过使扩增的CD34+细胞源与一组红系谱系调节剂接触来使分化优先定向至红系谱系。如上所提及，红系谱系调节剂的组合是本领域中已知的并且例如描述在WO2019/040649,(1)Huang,N.-J.,Pishesha,N.,Mukherjee,J.,Zhang,S.,Deshycka,R.,Sudaryo,V.,Dong,M.,Shoemaker,C.B.和Lodish,H.F.(2017)，以及(2)Lee,H.-Y.,Gao,X.,Barrasa,M.I.,Li,H.,Elmes,R.R.,Peters,L.L.和Lodish,H.F.(2015).PPAR-αand glucocorticoidreceptor synergize to promote erythroid progenitor self-renewal.Nature 522,474-477中，出于所有目的将其内容通过引用并入本文。Genetically engineered redcells expressing single domain camelid antibodies confer long-term protectionagainst botulinum neurotoxin.Nat.Commun.8，出于所有目的将其内容通过引用并入本文。另外，诸如STEMCELL的公司销售具有用于培养的红系谱系调节剂的试剂盒(产品编号：02692)。
在一些实施方案中，红系分化培养基包含SCF、IL-3和EPO。在一些实施方案中，红系分化培养基包含SCF、IL-3、肝素、胰岛素、全转铁蛋白和/或EPO。在一些实施方案中，红系分化培养基进一步包含PPAR-α激动剂。在一些实施方案中，红系分化培养基进一步包含非诺贝特。
SCF和IL-3的合适浓度包括在本申请扩增细胞培养基部分(III.A.)中所述的值。在一些实施方案中，红系分化培养基中的SCF处于10ng/mL。在一些实施方案中，红系分化培养基中的IL-3处于1ng/mL。
在一些实施方案中，红系分化培养基包含促红细胞生成素(EPO)。促红细胞生成素是一种刺激红血细胞产生的糖蛋白。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约50-250ng/mL的EPO诸如约0.01-10U/mL、约0.05-5U/mL或约0.1-3U/mL，或诸如以下中的任一个：约0.01U/mL、0.02U/mL、0.03U/mL、0.04U/mL。0.05U/mL、0.06U/mL、0.07U/mL、0.08U/mL、0.09U/mL、0.1U/mL、0.15U/mL、0.2U/mL、0.25U/mL、0.3U/mL、0.35U/mL、0.4U/mL、0.45U/mL、0.5U/mL、0.55U/mL、0.6U/mL、0.65U/mL、0.7U/mL、0.75U/mL、0.8U/mL、0.85U/mL、0.9U/mL、0.95U/mL、1U/mL、1.1U/mL、1.2U/mL、1.3U/mL、1.4U/mL、1.5U/mL、1.6U/mL、1.7U/mL、1.8U/mL、1.9U/mL、2U/mL、2.1U/mL、2.2U/mL、2.3U/mL、2.4U/mL、2.5U/mL、2.6U/mL、2.7U/mL、2.8U/mL、2.9U/mL、3U/mL、3.5U/mL、4U/mL、4.5U/mL、5U/mL、5.5U/mL、6U/mL、6.5U/mL、7U/mL、7.5U/mL、8U/mL、8.5U/mL、9U/mL、9.5U/mL、10U/mL或更多EPO，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中EPO的浓度是约0.1-3U/mL。
在一些实施方案中，红系分化培养基包含肝素。肝素是抗凝血剂。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约0.01-10U/mL、约0.05-5U/mL或约0.1-3U/mL，或诸如以下中的任一个：约0.01U/mL、0.02U/mL、0.03U/mL、0.04U/mL。0.05U/mL、0.06U/mL、0.07U/mL、0.08U/mL、0.09U/mL、0.1U/mL、0.15U/mL、0.2U/mL、0.25U/mL、0.3U/mL、0.35U/mL、0.4U/mL、0.45U/mL、0.5U/mL、0.55U/mL、0.6U/mL、0.65U/mL、0.7U/mL、0.75U/mL、0.8U/mL、0.85U/mL、0.9U/mL、0.95U/mL、1U/mL、1.1U/mL、1.2U/mL、1.3U/mL、1.4U/mL、1.5U/mL、1.6U/mL、1.7U/mL、1.8U/mL、1.9U/mL、2U/mL、2.1U/mL、2.2U/mL、2.3U/mL、2.4U/mL、2.5U/mL、2.6U/mL、2.7U/mL、2.8U/mL、2.9U/mL、3U/mL、3.5U/mL、4U/mL、4.5U/mL、5U/mL、5.5U/mL、6U/mL、6.5U/mL、7U/mL、7.5U/mL、8U/mL、8.5U/mL、9U/mL、9.5U/mL、10U/mL或更多肝素，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中肝素的浓度是约3U/mL。
在一些实施方案中，红系分化培养基包含胰岛素。胰岛素是一种调节碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢的肽。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约2.5-22.5μg/mL的胰岛素，诸如约5-15μg/mL或约12.5-17.5μg/mL，或诸如以下中的任一个：约2.5μg/mL、3μg/mL、3.5μg/mL、4μg/mL、4.5μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL、6.5μg/mL、7μg/mL、7.5μg/mL、8μg/mL、8.5μg/mL、9μg/mL、9.5μg/mL、10μg/mL、10.5μg/mL、11μg/mL、11.5μg/mL、12μg/mL、12.5μg/mL、13μg/mL、13.5μg/mL、14μg/mL、14.5μg/mL、15μg/mL、15.5μg/mL、16μg/mL、16.5μg/mL、17μg/mL、17.5μg/mL、18μg/mL、18.5μg/mL、19μg/mL、19.5μg/mL、20μg/mL、20.5μg/mL、21μg/mL、21.5μg/mL、22μg/mL或22.5μg/mL或更多胰岛素，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中胰岛素的浓度是约10μg/mL。
在一些实施方案中，红系分化培养基包含全转铁蛋白。全转铁蛋白是铁转运蛋白。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约50-1000μg/mL的全转铁蛋白，诸如约150-750μg/mL或约200-500μg/mL，或诸如以下中的任一个：约50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL、175μg/mL、200μg/mL、225μg/mL、250μg/mL、275μg/mL、300μg/mL、325μg/mL、350μg/mL、375μg/mL、400μg/mL、425μg/mL、450μg/mL、475μg/mL、500μg/mL、525μg/mL、550μg/mL、575μg/mL、600μg/mL、625μg/mL、650μg/mL、675μg/mL、700μg/mL、725μg/mL、750μg/mL、800μg/mL、825μg/mL、850μg/mL、875μg/mL、900μg/mL、925μg/mL或1,000μg/mL或更多全转铁蛋白，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中全转铁蛋白的浓度是约200-500μg/mL。
在一些实施方案中，红系分化培养基包含PPAR-α激动剂。PPAR-α激动剂是优先作用于过氧化物酶体增殖物激活受体的α亚型的调节剂。合适的PPAR-α激动剂包括但不限于GW7647。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约1-500nM的PPAR-α，诸如约5-200nM或约10-100nM，或诸如以下中的任一个：约1nM、2.5nM、5nM、7.5nM、10nM、15nM、20nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM 75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、100nM、105nM、110nM、115nM、120nM、125nM、130nM、135nM、140nM、145nM、150nM、155nM、160nM、165nM、170nM、175nM、180nM、185nM、190nM、195nM、200nM、205nM、210nM、215nM、220nM、225nM、230nM、240nM、245nM、250nM、255nM、260nM、265nM、270nM、275nM、280nM、285nM、290nM、295nM、300nM、325nM、350nM、400nM、425nM、450nM、475nM、500nM或更多PPAR-α激动剂，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中PPAR-α激动剂的浓度是约10nM或100nM。
在一些实施方案中，红系分化培养基包含非诺贝特。非诺贝特已知调节血脂水平。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约0.1-10μM的非诺贝特，诸如约0.5-5μM，诸如以下中的任一个：约0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、3.5μM、4.0μM、4.5μM、5.0μM、5.5μM、6.0μM、6.5μM、7.0μM、7.5μM、8.0μM、8.5μM、9.0μM、9.5μM或10μM或更多非诺贝特，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中非诺贝特的浓度是约1μM。
本领域技术人员应认识到，红细胞分化最通常特征在于一序列的CD标记物表型变化。当细胞最初开始分化为红细胞谱系时，被称为前成红细胞的红细胞祖细胞具有CD71+的细胞表面表型/CD235a低/-。随着细胞进一步成熟为红细胞，成为成红细胞，其细胞表面表型包括CD71+/CD235a高。随着红系细胞完全成熟为成熟红细胞，细胞开始失去CD71并且还失去细胞核。
在一些实施方案中，含有红细胞祖细胞的细胞群体包含具有包括CD71+的细胞表面表型的细胞，并且已在体外培养至少1、3、5、7、10、13、14、20或25天或更多天。在一些实施方案中，含有红细胞祖细胞的细胞群体包含具有包括CD45-和/或CD235a+的细胞表面表型的细胞，并且已在体外培养至少1、3、5、7、10、13、14、20、25天或更多天或更多天。
在一些实施方案中，含有红细胞祖细胞的细胞群体包含早期祖细胞，诸如共同髓系祖细胞(CMP)和/或巨核细胞-红系祖细胞(MEP)。据信CMP和MEP是在红细胞分化期间形成的早期细胞类型。在一些实施方案中，CMP由具有细胞表面表型CD34+/CD38-/CD45RA-/CD123低的细胞定义。在一些实施方案中，CMP由具有细胞表面表型CD34+/CD38-/CD45RA-/CD135+/CD10-/CD7-的细胞定义。在一些实施方案中，MEP由具有细胞表面表型CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123-的细胞定义。在一些实施方案中，MEP由具有细胞表面表型CD34+/CD38+/CD45RA-/CD135-/CD10-/CD7-的细胞定义。
在一些实施方案中，在培养1、3、5、7、10、13、14、20、25天或更多天后，在红细胞分化培养基中培养的细胞群体包含至少25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的寡能和单能红细胞祖细胞。在一些实施方案中，在培养7天后，在红细胞分化培养基中培养的细胞群体包含至少50％的寡能和单能红细胞祖细胞。
2.巨核细胞分化培养
巨核细胞分化培养基提供了扩增的CD34+细胞优先朝向巨核细胞谱系分化的条件，从而产生含有寡能和单能巨核细胞祖细胞的细胞群体。
通过使扩增的CD34+细胞源与一组巨核细胞谱系调节剂接触来使分化优先定向至巨核细胞谱系。如上所提及，巨核细胞谱系调节剂的组合是本领域中已知的，其中许多综述于Reems,J.-A.,Pineault,N.和Sun,S.(2010)In Vitro Megakaryocyte Production andPlatelet Biogenesis:State of the Art.Transfus.Med.Rev.24,33-43中；并且详细描述在例如Cortin V,Pineault N,Garnier A(2009)Ex vivo megakaryocyte expansion andplatelet production from human cord blood stem cells中。具体的例子描述在Methods Mol Biol 482:109-126；Matsunaga,T.,Tanaka,I.,Kobune,M.,Kawano,Y.,Tanaka,M.,Kuribayashi,K.,Iyama,S.,Sato,T.,Sato,Y.,Takimoto,R.等人(2006)ExVivo Large-Scale Generation of Human Platelets from Cord Blood CD34+Cells.Stem Cells 24,2877-2887；和Ito,Y.,Nakamura,S.,Sugimoto,N.,Shigemori,T.,Kato,Y.,Ohno,M.,Sakuma,S.,Ito,K.,Kumon,H.,Hirose,H.等人(2018)TurbulenceActivates Platelet Biogenesis to Enable Clinical Scale Ex VivoProduction.Cell 174,636-648.e18；Sullenbarger,B.,Bahng,J.H.,Gruner,R.,Kotov,N.和Lasky,L.C.(2009).Prolonged continuous in vitro human platelet productionusing three-dimensional scaffolds.Exp.Hematol.37,101-110，出于所有目的将其内容通过引用并入本文。另外，诸如STEMCELL的公司销售具有用于培养的巨核细胞谱系调节剂的试剂盒(产品编号：02696)。
在一些实施方案中，巨核细胞分化培养基包含SCF、IL-6、IL-9和TPO。在一些实施方案中，巨核细胞分化培养基包含TPO、SCF、FLT3L、IL-3、IL-6和/或肝素。在一些实施方案中，巨核细胞分化培养基包含TPO、SCF、IL-6和/或IL-9。在一些实施方案中，用于巨核细胞分化培养基的基础培养基或补料培养基是StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)或STEMdiffTMAPELTM 2培养基。本领域技术人员应认识到，本文所述的巨核细胞分化培养基条件可以使用不同的持续时间和/或按顺序使用，取决于巨核细胞祖细胞群体的希望成熟。
FLT3L、TPO、SCF、IL-3和IL-6的合适浓度包括在本申请扩增细胞培养基部分(III.A.)中所述的值。肝素的合适浓度包括本申请红系分化培养基部分(III.B.1.)中所述的值。在一些实施方案中，巨核细胞分化培养基中的SCF处于1ng/mL。在一些实施方案中，巨核细胞分化培养基中的TPO处于50ng/mL。在一些实施方案中，巨核细胞分化培养基中的FLT3处于50ng/mL。在一些实施方案中，巨核细胞分化培养基中的IL-3是3-20ng/mL。在一些实施方案中，巨核细胞分化培养基中的IL-6是7.5ng/mL。
在一些实施方案中，巨核细胞分化培养物包含白介素9(IL-9)。IL-9是一种细胞因子，其在免疫调节和炎症方面具有多重多效性作用。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约1-25ng/mL的IL-9，诸如约5-20ng/mL、10-20ng/mL或12-18ng/mL，诸如以下中的任一个：约1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、13.5ng/mL 14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL或25ng/mL的IL-9。在一些实施方案中，用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包括25ng/mL或更高的浓度。因此，IL-9的浓度还包括10-140ng/mL、约30-130ng/mL、约50-120ng/mL、约70-110ng/mL或约95-105ng/mL，或诸如以下中的任一个：约30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、41ng/mL、42ng/mL、43ng/mL、44ng/mL、45ng/mL、46ng/mL、47ng/mL、48ng/mL、49ng/mL、50ng/mL、51ng/mL、52ng/mL、53ng/mL、54ng/mL、55ng/mL、56ng/mL、57ng/mL、58ng/mL、59ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL 160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL 185ng/mL、190ng/mL、200ng/mL或更多IL-9，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中IL-9的浓度是约13.5ng/mL。
在一些实施方案中，含有巨核细胞祖细胞的细胞群体包含具有包括CD41+的细胞表面表型的细胞，并且已在体外培养至少1、3、5、7、10、13、14、20或25天或更多天。在一些实施方案中，含有巨核细胞祖细胞的细胞群体包含具有包括CD41+/CD42b+的细胞表面表型的细胞，并且已在体外培养至少1、3、5、7、10、13、14、20、25、30、40或50天或更多天或更多天。
在一些实施方案中，含有巨核细胞祖细胞的细胞群体包含早期祖细胞，诸如共同髓系祖细胞(CMP)和/或巨核细胞-红系祖细胞(MEP)。据信CMP和MEP是在巨核细胞分化期间形成的早期细胞类型。在一些实施方案中，CMP由具有细胞表面表型CD34+/CD38-/CD45RA-/CD123低的细胞定义。在一些实施方案中，CMP由具有细胞表面表型CD34+/CD38-/CD45RA-/CD135+/CD10-/CD7-的细胞定义。在一些实施方案中，MEP由具有细胞表面表型CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123-的细胞定义。在一些实施方案中，MEP由具有细胞表面表型CD34+/CD38+/CD45RA-/CD135-/CD10-/CD7-的细胞定义。
在一些实施方案中，在培养1、3、5、7、10、13、14、20、25天或更多天后，在巨核细胞分化培养基中培养的细胞群体包含至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的寡能和单能巨核细胞祖细胞。在一些实施方案中，在培养7天后，在巨核细胞分化培养基中培养的细胞群体包含至少40％的寡能和单能巨核细胞祖细胞。在一些实施方案中，在培养7天后，在巨核细胞分化培养基中培养的细胞群体包含至少50％的寡能和单能巨核细胞祖细胞。
3.粒细胞分化培养
粒细胞分化培养基提供了扩增的CD34+细胞优先朝向粒细胞谱系分化的条件，从而产生含有寡能和单能粒细胞祖细胞的细胞群体。
如上所述，在扩增细胞培养基中CD34+细胞的初始扩增富集、维持和/或增强培养物中造血干细胞(HSC)的总数。通过这种培养，来自通过扩增细胞培养产生的CD34+细胞的粒细胞祖细胞(例如，CD15+、CD15+/CD14-/HLA-DR-和/或CD34-、CD11b+和/或CD16+细胞)的按每个CD34+细胞的输出可以保持与原始的CD34+细胞源中的粒细胞祖细胞的按每个CD34+细胞的输出相比大约相同或降低。然而，尽管来自在扩增细胞培养期间培养的群体的粒细胞祖细胞的按每个CD34+细胞的输出可能降低，但如本文所述的原始的CD34+细胞源的扩增(例如，14、21天或更多天)也可以提供可从此类源产生的粒细胞祖细胞的总数的增加。因此，本文所述的造血干细胞扩增方法有利地提供增加的造血干细胞(HSC)数量以及增加的粒细胞祖细胞量两者，所述粒细胞祖细胞可以用于分化培养步骤。本文所述的粒细胞分化培养基条件优先使扩增的HSC朝向粒细胞谱系定向，从而富集粒细胞祖细胞的总数。作为非限制性例子，在扩增细胞培养物中培养14天，然后在分化培养物中培养6或10天使CD15+细胞输出(与仅在分化培养物中培养的非扩增细胞相比)分别增加至少400倍或200倍。在一些实施方案中，在扩增细胞培养物中培养28天，然后在分化培养物中培养6天使CD15+细胞输出(与仅在分化培养物中培养的非扩增细胞相比)增加至少800倍。在一些实施方案中，在扩增细胞培养物中培养42天，然后在分化培养物中培养6或10天使CD15+细胞输出(与仅在分化培养物中培养的非扩增细胞相比)分别增加至少2,200倍或3,000倍。在一些实施方案中，在扩增细胞培养物中培养64天，然后在分化培养物中培养7或12天使CD15+细胞输出分别增加至少42,000倍或22,000倍。
另外，在一些实施方案中，与在本文所述的粒细胞分化培养基条件中未扩增CD34+细胞(原始的CD34+细胞源)的比例相比，更大比例的首先在扩增细胞培养基中扩增的CD34+细胞在粒细胞分化培养基条件中朝向粒细胞谱系分化。因此，本文所述方法可以提供改善的分化，如通过在细胞群体中朝向希望谱系分化的细胞的相对数量(％)测量的。例如，在一些实施方案中，在培养3、5、7、10、13、14、20或25天后，在通过本文所述方法制造的细胞群体中寡能和单能粒细胞祖细胞的比例可以包括至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的寡能和单能粒细胞祖细胞。在一些实施方案中，在培养6天后，在通过本文所述方法制造的细胞群体中寡能和单能粒细胞祖细胞的比例可以包括至少60％或更多的寡能和单能粒细胞祖细胞。在一些实施方案中，在培养10天后，在通过本文所述方法制造的细胞群体中寡能和单能粒细胞祖细胞的比例可以包括至少80％或更多的寡能和单能粒细胞祖细胞。
通过使扩增的CD34+细胞源与一组粒细胞谱系调节剂接触来使分化优先定向至粒细胞谱系。如上所提及，粒细胞谱系调节剂的组合是本领域已知的并且描述在例如以下中：(1)Haylock,D.N.,To,L.B.,Dowse,T.L.,Juttner,C.A.和Simmons,P.J.(1992).Ex VivoExpansion and Maturation of Peripheral Blood CD34+Cells Into the MyeloidLineage.9；(2)Gupta,D.,Shah,H.P.,Malu,K.,Berliner,N.和Gaines,P.(2014)；(3)Differentiation and Characterization of Myeloid Cells.In Current Protocols inImmunology,J.E.Coligan,B.E.Bierer,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober编辑(Hoboken,NJ,USA:John Wiley&Sons,Inc.),第22F.5.1-22F.5.28页；(4)Jie,Z.,Zhang,Y.,Wang,C.,Shen,B.,Guan,X.,Ren,Z.,Ding,X.,Dai,W.和Jiang,Y.(2017).Large-scaleex vivo generation of human neutrophils from cord blood CD34+cells.PLOS ONE12,e0180832；和(5)Timmins等人Biotechnol Bioeng.2009年11月1日；104(4):832-40.doi:10.1002/bit.22433，出于所有目的将各自内容通过引用并入本文。另外，诸如STEMCELL的公司销售具有用于培养的粒细胞谱系调节剂的试剂盒(产品编号：02693)。
在一些实施方案中，粒细胞分化培养基包含IL-1β、IL-3、IL-6、G-CSF、GM-CSF和SCF。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基包含G-CSF、SCF和TPO。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基包含SCF、TPO、G-CSF和/或GM-CSF。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基包含SCF、IL3和/或G-CSF。
在一些实施方案中，粒细胞分化培养基包含一序列的粒细胞分化调节剂，其中每组调节剂在一定孵育时间后提供。在一些实施方案中，第一粒细胞分化培养基包含SCF、FLT3L、G-CSF、GM-CSF、IL-3、TPO。关于第一粒细胞分化培养物，在一些实施方案中，SCF的浓度为100ng/mL，FLT3L的浓度为100ng/mL，G-CSF的浓度为50ng/mL，IL-3的浓度为25ng/mL，GM-CSF的浓度为15ng/mL并且TPO的浓度为20ng/mL。在一些实施方案中，第二粒细胞分化培养基包含SCF、FLT3L、G-CSF、GM-CSF、IL-3。关于第二粒细胞分化培养物，在一些实施方案中，SCF的浓度为100ng/mL，FLT3L的浓度为100ng/mL，G-CSF的浓度为75ng/mL，IL-3的浓度为15ng/mL并且GM-CSF的浓度为10ng/mL。在一些实施方案中，第三粒细胞分化培养基包含SCF、FLT3L、G-CSF。关于第三粒细胞分化培养物，在一些实施方案中，SCF的浓度为100ng/mL，FLT3L的浓度为100ng/mL并且G-CSF的浓度为100ng/mL，IL-3。关于序列的粒细胞分化培养物的时间的进一步细节描述在上面引用的Jie等人PLOS ONE 12,e0180832中。另外，应理解，为了捕获较早期祖细胞，可以改变每种粒细胞谱系调节剂组合的培养总天数。
FLT3L、IL-3、IL-6、SCF、TPO、G-CSF和GM-CSF的合适浓度包括在本申请扩增细胞培养基部分(III.A.)中所述的值。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基中的FLT3L处于100ng/mL。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基中的SCF处于100ng/mL。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基中的TPO处于20ng/mL。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基中的G-CSF是50、75或100ng/mL。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基中的GM-CSF处于15或10ng/mL。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基中的IL-3处于25或15ng/mL。
在一些实施方案中，粒细胞分化培养基包含白介素1β(IL-1β)。IL-1β是一种细胞因子，其在免疫调节和炎症方面具有多重多效性作用。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约1-25ng/mL的IL-1β，诸如约5-20ng/mL、10-20ng/mL或12-18ng/mL，诸如以下中的任一个：约1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL或25ng/mL的IL-1β。在一些实施方案中，用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包括25ng/mL或更高的浓度。因此，IL-1β的浓度还包括10-140ng/mL、约30-130ng/mL、约50-120ng/mL、约70-110ng/mL或约95-105ng/mL，或诸如以下中的任一个：约30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、41ng/mL、42ng/mL、43ng/mL、44ng/mL、45ng/mL、46ng/mL、47ng/mL、48ng/mL、49ng/mL、50ng/mL、51ng/mL、52ng/mL、53ng/mL、54ng/mL、55ng/mL、56ng/mL、57ng/mL、58ng/mL、59ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL 160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL 185ng/mL、190ng/mL、200ng/mL或更多IL-1β，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中IL-1β的浓度是约10ng/mL。
在一些实施方案中，粒细胞分化培养物的非限制性例子描述在实施例42和表12、表13和表14中。在一些实施方案中，基础培养基或补料培养基是SFEM I。在一些实施方案中，基础培养基或补料培养基是RPMI+10％FBS。在一些实施方案中，粒细胞分化培养物包含SCF、FLT3L、G-CSF、IL-3和GM-CSF。在一些实施方案中，粒细胞分化培养物包含SCF、G-CSF、GM-CSF和TPO。在一些实施方案中，粒细胞分化培养物包含SCF、FLT3L、G-CSF和GM-CSF。在一些实施方案中，粒细胞分化培养物包含SCF、FLT3L和GM-CSF。在一些实施方案中，粒细胞分化培养物包含G-CSF。在一些实施方案中，粒细胞分化培养物包含SCF和IL-3。在一些实施方案中，粒细胞分化培养物包含G-CSF和视黄酸。在一些实施方案中，粒细胞分化培养物包含SCF、IL-3和G-CSF。在一些实施方案中，粒细胞分化培养物包含SCF、FLT3L和G-CSF。在一些实施方案中，粒细胞分化培养物包含SCF、G-CSF、GM-CSF和TPO。
在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中SCF的浓度是约80-120ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中SCF的浓度是约100ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中FLT3L的浓度是约80-120ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中FLT3L的浓度是约100ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中G-CSF的浓度是约40-120ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中G-CSF的浓度是约100ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中G-CSF的浓度是约50ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中IL-3的浓度是约10-120ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中IL-3的浓度是约25ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中IL-3的浓度是约100ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中GM-CSF的浓度是约1-20ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中GM-CSF的浓度是约10ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中GM-CSF的浓度是约5ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中TPO的浓度是约5-120ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中TPO的浓度是约100ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中TPO的浓度是约20ng/mL。在一些实施方案中，前段所述粒细胞分化培养混合料中TPO的浓度是约10ng/mL。
在一些实施方案中，粒细胞分化培养基是如本申请表12中所定义的培养基“A”。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基是如本申请表12中所定义的培养基“B”。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基是如本申请表12中所定义的培养基“C”。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基是如本申请表12中所定义的培养基“E”。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基是如本申请表12中所定义的培养基“F”。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基是如本申请表12中所定义的培养基“Q”。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基是如本申请表12中所定义的培养基“S”。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基是如本申请表12中所定义的培养基“N”。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基是如本申请表12中所定义的培养基“T”。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基是如本申请表12中所定义的培养基“R”。
在一些实施方案中，粒细胞定向分化包括一种或多种粒细胞分化培养基，其中在一定的孵育时间后提供不同的粒细胞分化调节剂。多于一种粒细胞分化培养基的非限制性例子描述在实施例42和表13-16中。每种粒细胞分化培养基(有时含有不同的粒细胞分化调节剂)的孵育时间取决于许多变量，包括培养物中细胞的初始稀释因子和细胞的生长速率。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基(有时含有不同的粒细胞分化调节剂)每1、2、3、4、5或6天更换。在一些实施方案中，粒细胞分化培养基(有时含有不同的粒细胞分化调节剂)约每3天更换。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括表13或表14中所定义的序列。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括在条件AAAAA下培养，其中每种培养基条件在2-3天后更换。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括在培养基条件TTTTT下生长，其中每种培养基条件在2-3天后更换。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括在培养基条件AAAAF下生长，其中每种培养基条件在2-3天后更换。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括在培养基条件TTTTF下生长，其中每种培养基条件在2-3天后更换。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括在培养基条件HHHHH下生长，其中每种培养基条件在2-3天后更换。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括在培养基条件HHHFF下生长，其中每种培养基条件在2-3天后更换。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括在培养基条件HHHFR下生长，其中每种培养基条件在2-3天后更换。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括在培养基条件BBBBB下生长，其中每种培养基条件在2-3天后更换。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括在培养基条件BBBFF下生长，其中每种培养基条件在2-3天后更换。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括在培养基条件BBBFR下生长，其中每种培养基条件在2-3天后更换。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括在培养基条件AAEE下生长，其中每种培养基条件在2-3天后更换。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括在培养基条件AANN下生长，其中每种培养基条件在2-3天后更换。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括在培养基条件TTTT下生长，其中每种培养基条件在2-3天后更换。在一些实施方案中，序列粒细胞分化培养基包括在培养基条件TTTF下生长，其中每种培养基条件在2-3天后更换。
在一些实施方案中，含有粒细胞祖细胞的细胞群体包含具有包括CD15+、CD14-、CD66b+和/或CD34-的细胞表面表型的细胞，并且已在体外培养至少1、3、5、7、10、13、14、20或25天或更多天。在一些实施方案中，含有粒细胞祖细胞的细胞群体包含具有CD13+和/或CD33+细胞表面表型的细胞，其在和已在体外培养至少1、3、5、7、10、13、14、20或25天或更多天。在一些实施方案中，含有粒细胞祖细胞的细胞群体包含具有CD11b+和/或CD16+细胞表面表型的细胞，其包括并且已在体外培养至少1、3、5、7、10、13、14、20、25、30、40或50天或更多天或更多天。在一些实施方案中，含有粒细胞祖细胞的细胞群体包含具有在Elghetany,M.T.(2002).Surface Antigen Changes during Normal Neutrophilic Development:ACritical Review.Blood Cells.Mol.Dis.28,260-274中所述的细胞表面表型的细胞，出于所有目的将所述文献的内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，含有粒细胞祖细胞的细胞群体包含中幼粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞和/或晚幼粒细胞。在一些实施方案中，中幼粒细胞通过表面表型CD15+/CD14-/HLA-DR+/CD11b-/CD13+鉴定。在一些实施方案中，早幼粒细胞通过表面表型CD34-/CD14-/CD15+/CD13高/CD11b-鉴定。在一些实施方案中，早幼粒细胞通过表面表型CD34-/CD14-/CD15+/HLA-DR-/CD13高/CD11b-鉴定。在一些实施方案中，中幼粒细胞通过表面表型CD34-/CD14-/CD15+/CD13dim/CD11b+鉴定。在一些实施方案中，髓细胞通过表面表型CD34-/CD14-/HLA-DR-/CD15+/CD13dim/CD11b+鉴定。在一些实施方案中，晚幼粒细胞通过表面表型CD34-/CD14-/CD15+/CD11b+/CD13+/CD16+鉴定。在一些实施方案中，晚幼粒细胞通过表面表型CD34-/CD14-/CD15+/CD11b+/CD13+鉴定。在一些实施方案中，晚幼粒细胞通过表面表型CD34-/CD14-/HLA-DR-/CD15+/CD11b+/CD13+/CD16dim鉴定。在一些实施方案中，成熟度超过晚幼粒细胞的细胞，包括杆状核粒细胞和嗜中性粒细胞，通过表面表型CD34-/CD14-/HLA-DR-/CD15+/CD11b+/CD13+/CD16++鉴定。
在一些实施方案中，含有粒细胞祖细胞的细胞群体包含早期祖细胞，诸如共同髓系祖细胞(CMP)和/或粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)。据信CMP和GMP是在粒细胞分化期间形成的早期细胞类型。在一些实施方案中，CMP由具有细胞表面表型CD34+/CD38-/CD45RA-/CD123低的细胞定义。在一些实施方案中，CMP由具有细胞表面表型CD34+/CD38-/CD45RA-/CD135+/CD10-/CD7-的细胞定义。在一些实施方案中，GMP由具有细胞表面表型CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123+的细胞定义。在一些实施方案中，GMP由具有细胞表面表型CD34+/CD38+/CD45RA+/CD135+/CD10-/CD7-的细胞定义。本文所述的粒细胞分化条件可以用于制备祖细胞群体，其具有显著数量的双能祖细胞，诸如共同粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)和/或共同髓系祖细胞(CMP)，其能够制造成熟粒细胞和单核细胞两者。
应理解，在含有粒细胞祖细胞的细胞群体内，所有粒细胞祖细胞的细胞表面表型将不是完全相同的。例如，早期粒细胞祖细胞将典型地是HLA-DR+，而更多成熟粒细胞祖细胞将是HLA-DR-。类似地，CD13+是存在于早期和更成熟的粒细胞中的细胞表面表型，但中间发育期典型地显示出CD13-细胞表面表型。CD11b+和CD16+细胞表面表型典型地存在于更成熟的粒细胞祖细胞中。因此，在一些实施方案中，早期粒细胞祖细胞被定义为CD15+/CD11b-/CD16-、CD15+/HLA-DR+或CD15+/HLA-DR+/CD11b-/CD16-。另外，在一些实施方案中，粒细胞祖细胞包括具有CD15+/HLA-DR+/CD13+/CD11b-/CD16-表面表型的细胞。在一些实施方案中，粒细胞祖细胞包括具有CD15+/HLA-DR-/CD13+/CD11b-/CD16-表面表型的细胞。在一些实施方案中，粒细胞祖细胞包括具有CD15+/HLA-DR-/CD13-/CD11b-/CD16-表面表型的细胞。在一些实施方案中，粒细胞祖细胞包括具有CD15+/HLA-DR-/CD13-/CD11b+/CD16-表面表型的细胞。在一些实施方案中，粒细胞祖细胞包括具有CD15+/HLA-DR-/CD13+/CD11b+/CD16-表面表型的细胞。在一些实施方案中，粒细胞祖细胞包括具有CD15+/HLA-DR-/CD13+/CD11b+/CD16+表面表型的细胞。在一些实施方案中，含有粒细胞祖细胞的细胞群体包含具有上述细胞表面表型中的一种、两种、三种、四种、五种或全部的祖细胞。
在一些实施方案中，在培养1、3、5、7、10、13、14、20、25天或更多天后，在粒细胞分化培养基中培养的细胞群体包含至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的寡能和单能粒细胞祖细胞。
4.单核细胞分化培养
单核细胞分化培养基提供了扩增的CD34+细胞优先朝向单核细胞谱系分化的条件，从而产生含有寡能和单能单核细胞祖细胞的细胞群体。
通过使扩增的CD34+细胞源与一组单核细胞谱系调节剂接触来使分化优先定向至单核细胞谱系。如上所提及，单核细胞谱系调节剂的组合是本领域已知的并且描述在例如以下中：Stec,M.,Weglarczyk,K.,Baran,J.,Zuba,E.,Mytar,B.,Pryjma,J.和Zembala,M.(2007).Expansion and differentiation of CD14+CD16-and CD14++CD16+humanmonocyte subsets from cord blood CD34+hematopoieticprogenitors.J.Leukoc.Biol.82,594-602。另外，诸如STEMCELL的公司销售具有用于培养的单核细胞谱系调节剂的试剂盒(产品编号：02694)。
在一些实施方案中，单核细胞分化培养基包含SCF、TPO、FLT3L、M-CSF、和GM-CSF。在一些实施方案中，单核细胞分化培养基包含SCF、M-CSF、IL-3和FLT3L。
FLT3L、SCF、TPO、IL-3和GM-CSF的合适浓度包括在本申请扩增细胞培养基部分(III.A.)中所述的值。在一些实施方案中，单核细胞分化培养基中的SCF处于25ng/mL。在一些实施方案中，单核细胞分化培养基中的FLT3L处于30ng/mL。在一些实施方案中，单核细胞分化培养基中的TPO处于20ng/mL。在一些实施方案中，单核细胞分化培养基中的IL-3处于30ng/mL。在一些实施方案中，单核细胞分化培养基中的GM-CSF是20或100ng/mL。
在一些实施方案中，单核细胞分化培养基包含巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。M-CSF是一种细胞因子，其在造血细胞中刺激巨噬细胞的产生。用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包含约1-25ng/mL的M-CSF，诸如约5-20ng/mL、10-20ng/mL或12-18ng/mL，诸如以下中的任一个：约1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL或25ng/mL的M-CSF。在一些实施方案中，用于本发明方法的细胞培养基组合物可以包括25ng/mL或更高的浓度。因此，M-CSF的浓度还包括10-140ng/mL、约30-130ng/mL、约50-120ng/mL、约70-110ng/mL或约95-105ng/mL，或诸如以下中的任一个：约30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、41ng/mL、42ng/mL、43ng/mL、44ng/mL、45ng/mL、46ng/mL、47ng/mL、48ng/mL、49ng/mL、50ng/mL、51ng/mL、52ng/mL、53ng/mL、54ng/mL、55ng/mL、56ng/mL、57ng/mL、58ng/mL、59ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、115ng/mL、120ng/mL、125ng/mL、130ng/mL、135ng/mL、140ng/mL、145ng/mL、150ng/mL、155ng/mL 160ng/mL、165ng/mL、170ng/mL、175ng/mL、180ng/mL 185ng/mL、190ng/mL、200ng/mL或更多M-CSF，包括落入这些浓度之间的值。在一些实施方案中，培养基中M-CSF的浓度是约30ng/mL。
在一些实施方案中，含有单核细胞祖细胞的细胞群体包含具有包括CD14+和/或CD15低/-的细胞表面表型的细胞，并且已在体外培养至少1、3、5、7、10、13、14、20或25天或更多天。在一些实施方案中，含有单核细胞祖细胞的细胞群体包含具有CD13+和/或CD33+细胞表面表型的细胞，其在和已在体外培养至少1、3、5、7、10、13、14、20或25天或更多天。
在一些实施方案中，含有单核细胞祖细胞的细胞群体包含早期祖细胞，诸如共同髓系祖细胞(CMP)和/或粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)。据信CMP和GMP是在单核细胞分化期间形成的早期细胞类型。在一些实施方案中，CMP由具有细胞表面表型CD34+/CD38-/CD45RA-/CD123低的细胞定义。在一些实施方案中，CMP由具有细胞表面表型CD34+/CD38-/CD45RA-/CD135+/CD10-/CD7-的细胞定义。在一些实施方案中，GMP由具有细胞表面表型CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123+的细胞定义。在一些实施方案中，GMP由具有细胞表面表型CD34+/CD38+/CD45RA+/CD135+/CD10-/CD7-的细胞定义。本文所述的单核细胞分化条件可以用于制备祖细胞群体，其具有显著量的双能祖细胞，诸如共同粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)和/或共同髓系祖细胞(CMP)，其能够制造成熟粒细胞和单核细胞两者。
在一些实施方案中，在培养1、3、5、7、10、13、14、20、25天或更多天后，在单核细胞分化培养基中培养的细胞群体包含至少25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的寡能和单能单核细胞祖细胞。
5.淋巴细胞分化培养
淋巴细胞分化培养基提供了扩增的CD34+细胞优先朝向淋巴系谱系分化的条件，从而产生含有寡能和单能淋巴细胞祖细胞的细胞群体。
如上所述，在扩增细胞培养基中CD34+细胞的初始扩增富集、维持和/或增强培养物中造血干细胞(HSC)的总数。通过这种培养，与在原始的CD34+细胞源中淋巴细胞祖细胞的按每个CD34+细胞的输出相比，在扩增细胞培养基中扩增的细胞群体中淋巴细胞祖细胞(例如，CD10+、CD7+/CD5-、CD7-/CD5+、CD7+/CD5+细胞)的按每个CD34+细胞的输出保持大约相同或降低(参见例如图69A-D)。然而，尽管来自培养群体的淋巴细胞祖细胞的按每个CD34+细胞的输出可能降低，如本文所述的原始的CD34+细胞源的扩增(例如，14、21天或更多天)也提供可从此类源产生的淋巴细胞祖细胞的总数的增加(参见例如图70A-D)。因此，本文所述的造血干细胞扩增方法有利地提供增加的造血干细胞(HSC)数量以及增加的淋巴细胞祖细胞量两者，所述淋巴细胞祖细胞可以用于分化培养步骤。本文所述的淋巴细胞分化培养基条件可以优先使扩增的HSC定向至淋巴细胞谱系，从而富集淋巴细胞祖细胞的总数。另外，在一些实施方案中，在本文所述的淋巴细胞分化培养基条件中未扩增CD34+细胞(原始的CD34+细胞源)的比例相比，更大比例的首先在扩增细胞培养基中扩增的CD34+细胞在本文所述的淋巴细胞分化培养基条件中朝向淋巴细胞谱系分化。因此，本文所述方法可以提供改善的分化，如通过造血干细胞群体中分化的细胞的相对数量测量的。例如，在一些实施方案中，在培养3、5、7、10、13、14、20、21、25、28、35、42或49天后，在通过本文所述方法制造的细胞群体中寡能和单能淋巴细胞祖细胞的比例可以包括至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的寡能和单能淋巴细胞祖细胞。
通过使扩增的CD34+细胞源与一组淋巴细胞谱系调节剂接触来使分化优先定向至淋巴系谱系。如上所提及，淋巴细胞谱系调节剂的组合是本领域已知的并且描述在例如以下中：(1)Reimann,C.,Six,E.,Dal-Cortivo,L.,Schiavo,A.,Appourchaux,K.,Lagresle-Peyrou,C.,de Chappedelaine,C.,Ternaux,B.,Coulombel,L.,Beldjord,K.等人(2012).Human T-Lymphoid Progenitors Generated in a Feeder-Cell-Free Delta-Like-4Culture System Promote T-Cell Reconstitution in NOD/SCID/γc-/-Mice.STEMCELLS 30,1771-1780；或Shukla,S.,Langley,M.A.,Singh,J.,Edgar,J.M.,Mohtashami,M.,Zú
Figure BDA0003443861290000541
ücker,J.C.和Zandstra,P.W.(2017).Progenitor T-cell differentiationfrom hematopoietic stem cells using Delta-like-4and VCAM-1.Nat.Methods 14,531-538，出于所有目的将各自内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，淋巴细胞分化培养基至少包含Notch配体δ样4(DLL4)。在一些实施方案中，Notch配体δ样4可以是融合蛋白的一部分并且可以固定在用于培养的表面上。在一些实施方案中，固定的融合蛋白至少包含人IgG1的Fc部分以及Notch配体δ样4(DLL4)的一些或全部。这种固定的融合蛋白的合适浓度包括10μg/mL。在一些实施方案中，固定的融合蛋白至少包含人IgG1的Fc部分与VCAM-1。这种固定的融合蛋白的合适浓度包括2.3μg/mL。在一些实施方案中，淋巴细胞分化培养基中包含两种融合蛋白，第一种固定的融合蛋白至少包含人IgG1的Fc部分以及Notch配体δ样4(DLL4)的一些或全部，并且第二种融合蛋白至少包含人IgG1的Fc部分与VCAM-1。用于制备这些融合蛋白和固定化的方法是本领域众所周知的。
在一些实施方案中，淋巴细胞分化培养基包含IL-7、FLT3L、SCF和TPO。在一些实施方案中，淋巴细胞分化培养基包含FBS。
FLT3L、SCF、TPO、IL-7和FBS的合适浓度包括在本申请扩增细胞培养基部分(III.A.)中所述的值。在一些实施方案中，FLT3L、SCF、TPO、IL-7以100ng/mL的浓度存在于淋巴细胞分化培养基中。在一些实施方案中，FBS以20％v/v的浓度存在于淋巴细胞分化培养基中。
在一些实施方案中，淋巴细胞分化培养基是StemSpan NK细胞分化补充物，其提供富集量的单能和寡能自然杀伤细胞祖细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞分化培养基是T细胞祖细胞成熟培养基，包括含StemSpan T细胞祖细胞成熟补充物的StemSpan SFEM II培养基，其提供富集量的单能和寡能T细胞祖细胞。在一些实施方案中，StemSpan T细胞祖细胞成熟补充物与StemSpan淋巴系分化包被材料组合使用。
在一些实施方案中，淋巴细胞分化培养基中的基础培养基或补料培养基是IMDM培养基。除了前述段落中所述的培养基添加剂之外，在一些实施方案中，淋巴细胞分化培养物中的基础培养基或补料培养基包含BIT(BSA/胰岛素/转铁蛋白)血清(BIT9500SerumSubstitute是可从STEMCELL technologies获得的产品)，其浓度为诸如20％(v/v)。在一些实施方案中，淋巴细胞分化培养物包含低密度脂蛋白(可从例如EMD Millipore获得)。低密度脂蛋白的合适浓度包括例如0.5％、1％和1.5％(v/v)。在一些实施方案中，淋巴细胞分化培养物包含Glutamax(可从例如ThermoFisher获得)。Glutamax的合适浓度包括例如0.5％、1％和1.5％(v/v)。
在一些实施方案中，含有淋巴细胞祖细胞的细胞群体包含具有包括CD7+的细胞表面表型的细胞，并且已在体外培养至少1、3、5、7、10、13、14、20、25、30、40或50天或更多天。在一些实施方案中，含有淋巴细胞祖细胞的细胞群体包含具有细胞内CD3(iCD3)表型的细胞，其在并且已在体外培养至少1、3、5、7、10、13、14、20或25天或更多天。
在一些实施方案中，含有淋巴细胞祖细胞的细胞群体包含早期胸腺祖细胞(CD34+/CD45RA-/CD7+)、前T1细胞(CD7++/CD5-)、前T2细胞(CD7++/CD5+)和前T细胞(CD7++/CD5+/CD1a+)。
在一些实施方案中，含有淋巴细胞祖细胞的细胞群体包含早期祖细胞，诸如共同淋巴系祖细胞(CLP)和/或多淋巴系祖细胞(MLP)。据信CLP和MLP是在淋巴系分化期间形成的早期细胞类型。在一些实施方案中，CLP由具有细胞表面表型CD34+/CD38-/CD45RA+/CD10+的细胞定义。在一些实施方案中，MLP由具有细胞表面表型CD34+/CD38-/CD45RA+/CD10+/CD7-的细胞定义。
在一些实施方案中，含有淋巴细胞祖细胞的细胞群体包含早期自然杀伤(NK)细胞祖细胞，其被鉴定为具有包括标记物NKP46+、CD56+和CXCR4-的细胞表面表型。在一些实施方案中，早期自然杀伤(NK)细胞祖细胞包含表面表型CD161+、CD11b-和CD16-、CD94-。在一些实施方案中，含有淋巴细胞祖细胞的细胞群体包含NK细胞祖细胞，其被鉴定为具有CD5+和/或CD3阴性的细胞表面表型。自然杀伤细胞的另外标记物描述在例如Freud等人(Evidence for discrete stages of human natural killer cell differentiation invivo.J Exp Med.2006年4月17日；203(4):1033-43.)中，出于所有目将其内容通过引用特此并入。
本文还考虑了用于优先制备B细胞的方法。在一些实施方案中，淋巴细胞分化培养基包含用于优先制备B细胞祖细胞的IL-7、SCF和FLT3L。在一些实施方案中，淋巴细胞分化培养物进一步包含ICAM-1-Fc。在一些实施方案中，ICAM-1-Fc包被在用于培养的表面上，用于优先制备B细胞祖细胞。
用于优先制备B细胞祖细胞的IL-7、SCF和FLT3L的合适浓度包括在本申请扩增细胞培养基部分(III.A.)中所述的值。在一些实施方案中，FLT3L和SCF以25ng/mL的浓度存在于用于优先制备B细胞祖细胞的淋巴细胞分化培养基中。在一些实施方案中，IL-7以20ng/mL的浓度存在于用于优先制备B细胞祖细胞的淋巴细胞分化培养基中。
用于B细胞祖细胞的标记物是本领域已知的，但包括具有包括CD34+、CD10+和/或CD19+的细胞表面表型的细胞。在一些实施方案中，B细胞祖细胞的特征在于以CD34-、CD19+和IgM-为特征的细胞表面表型。B细胞祖细胞、淋巴细胞祖细胞和成熟淋巴细胞的标记物进一步讨论在Kraus,H.,Kaiser,S.,Aumann,K.,Bonelt,P.,Salzer,U.,Vestweber,D.,Erlacher,M.,Kunze,M.,Burger,M.,Pieper,K.等人(2014).A Feeder-FreeDifferentiation System Identifies Autonomously Proliferating B CellPrecursors in Human Bone Marrow.The Journal of Immunology 192,1044–1054；出于所有目的将其内容通过引用并入本文。用于上述淋巴细胞分化的培养天数也可以用于优先制备B细胞。也可以实现上述类似的扩增数量。
在一些实施方案中，在淋巴细胞分化培养基中培养的细胞群体包含至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的寡能和单能淋巴细胞祖细胞，培养1、3、5、7、10、13、14、20、25天或更多天。
IV.本发明的方法
A.在培养物中制备寡能和单能祖细胞群体
本文提供了用于在培养物中制备寡能和单能祖细胞群体的方法。所述方法涉及使在培养物中的扩增的CD34+细胞源与一组谱系调节剂接触。在培养物中使用的谱系调节剂的身份将取决于所希望的谱系，其为红系谱系调节剂、巨核细胞谱系调节剂、粒细胞谱系调节剂、单核细胞谱系调节剂或淋巴细胞谱系调节剂。与原始的CD34+细胞源相比，用于本文所述方法的扩增的CD34+细胞源已经受CD34+细胞数量的一定倍数增加。
1.CD34+细胞源
如上所提及，本发明的方法包括CD34+血细胞源。在一些实施方案中，所述源是CD34低/-、CD133+细胞。此CD34+细胞源可以从组织源获得，所述组织源例如像骨髓、脐带血、胎盘血、动员外周血、非动员外周血等或其组合。应理解，在本文方法中使用的原始的CD34+细胞源可以是本文所述的组织源或从本文所述的组织源分离的CD34+细胞。因此，在一些实施方案中，原始的CD34+细胞源是本文所述的组织源。在一些实施方案中，原始的CD34+细胞源是从本文所述的组织源分离的CD34+细胞。在一些实施方案中，可以使用本文所述的另一种标记物从组织源分离造血干细胞。
在一些实施方案中，造血干细胞和/或祖细胞源自一种或多种CD34+细胞源。在某些实施方案中，CD34+细胞可以表达或缺少细胞标记物CD133。因此，在具体实施方案中，可用于本文公开的方法的造血细胞是CD34+CD133+或CD34+CD133-。在其他实施方案中，CD34+细胞可以表达或缺少细胞标记物CD90。因此，在这些实施方案中，可用于本文公开的方法的造血细胞是CD34+CD90+或CD34+CD90-。因此，基于指示分化状态的标记物的存在或基于指示至少一些谱系分化已发生的谱系标记物的存在，可以选择CD34+细胞(或在一些例子中，CD34低/-、CD133+细胞)群体用于本文公开的方法。
在本文提供的方法中使用的CD34+细胞可以获自单一个体，例如获自非动员外周血源，或获自多个个体，例如可以汇集。在一些实施方案中，来自单一个体的CD34+细胞来源于非动员外周血、动员外周血、胎盘血、或脐带血。在CD34+细胞获自多个个体并且汇集的情况下，造血细胞优选获自相同组织源。因此，在各种实施方案中，汇集的造血细胞均来自例如胎盘、脐带血、外周血(动员或非动员的)等。
CD34+细胞(或在一些实施方案中，CD34低/-、CD133+细胞)可以使用本领域已知的任何常规手段从来源中分离，所述常规手段诸如但不限于干细胞标记物的阳性选择、针对谱系标记物的阴性选择、尺寸排阻、检测细胞中的代谢差异、检测细胞清除或积累物质的差异、粘附差异、在专支持干细胞的条件下直接培养血沉棕黄层。用于本发明方法的CD34+细胞源可以含有许多造血祖细胞亚种，包括但不限于CD34+造血祖细胞；CD34+早期造血祖细胞和/或干细胞；CD133+早期造血祖细胞和/或干细胞；CD90+早期造血祖细胞和/或干细胞；CD45RA-早期造血祖细胞和/或干细胞；和/或CD38低/-早期造血祖细胞和/或干细胞中的一种或多种。
2.在培养物中维持和扩增HSC
在有效维持和/或增强在培养物中造血干细胞的扩增的任何已知细胞培养基中培养源自上述来源的CD34+细胞。本领域中存在实现这些目标的许多已知培养基。在一些实施方案中，在本文所述的任何扩增细胞培养基中培养源自上述来源的CD34+细胞。在一些实施方案中，在有效维持和/或增强在培养物中造血干细胞的扩增的培养基包含本文公开的式I的化合物或子实施方案。具体地，在扩增培养基中使用本文所述的式I的化合物或子实施方案会增加HSC的扩增率，同时维持(并且通常改善)所有测量的干细胞标记物(诸如但不限于CD133和CD90阳性细胞)。在少至3天的培养后，可以看到这些改善。在一些实施方案中，本文提供的培养基不包含四跨膜蛋白。在一些实施方案中，本文提供的培养基还包括视黄酸受体(RAR)抑制剂或调节剂。在一些实施方案中，RAR抑制剂是ER50891。
特别地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100天或更多天中任一个后，与未在本文所述的任何培养基中培养的源细胞相比，在本文所述的任何扩增细胞培养基中培养的源细胞展现出增加的CD34+阳性细胞数量。具体地，与原始数量的CD34+源细胞相比，使用本文公开的方法在本文所述的扩增细胞培养基中培养的源细胞展现出大约1.5；1.6；1.7；1.8；1.9；2；2.1；2.2；2.3；2.4；2.5；2.6；2.7；2.8；2.9；3；3.5；4；4.5；5；7.5；10；20；30；50；60；70；80；90；100；125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000；125,000；150,000；175,000；200,000；225,000；250,000；275,000；300,000；325,000；350,000；400,000倍增加的CD34+阳性细胞数量。
特别地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100天或更多天中任一个后，与未在本文所述的任何培养基中培养的源细胞相比，在本文所述的任何扩增细胞培养基中培养的源细胞展现出增加的CD133+和/或CD90+阳性细胞数量。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100天或更多天中任一个后，与未在本文所述的任何培养基中培养的源细胞相比，使用本文公开的方法在本文所述的扩增细胞培养基中培养的源细胞展现出大约1.5；1.6；1.7；1.8；1.9；2；2.1；2.2；2.3；2.4；2.5；2.6；2.7；2.8；2.9；3；3.5；4；4.5；5；7.5；10；20；30；50；60；70；80；90；100；125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000；125,000；150,000；175,000；200,000；225,000；250,000；275,000；300,000；325,000；350,000；400,000或更多倍的CD133+和/或CD90+阳性细胞数量。
在培养约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100天或更多天中任一个后，与未在本文所述的任何HSC扩增培养基中培养的源细胞相比，在本文所述的扩增细胞培养基中培养的源细胞也展现出增加的CD90+/CD38低/-细胞数量。具体地，在培养约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100天或更多天中任一个后，与未在本文所述的任何培养基中培养的源细胞相比，使用本文公开的方法在本文所述的培养基中培养的源细胞展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000；125,000；150,000；175,000；200,000；225,000；250,000；275,000；300,000；325,000；350,000；400,000或更多倍的CD90+/CD38低/-细胞数量。
本文公开的扩增细胞培养方法包括在低氧气条件下培养细胞。如本文所用，短语“低氧气条件”是指培养细胞所暴露的气氛，其具有少于约10％的氧气，诸如以下中的任一个：约10％、9.5％、9％、8.5％、8％、7.5％、7％、6.5％、6％、5.5％或5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.75％、2.5％、2.25％、2％、1.75％、1.5％％、1.25％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％或0.5％或更少氧气。“低氧气条件”也可以指在0.5％与10％氧气之间的任何范围。对细胞培养物中氧气含量的控制可以通过本领域已知的任何手段进行，诸如通过添加氮气。
本文公开的扩增细胞培养方法包括在大气氧气条件下培养细胞。如本文所用，短语“大气氧气条件”是指包含约20％氧气的气氛。
在将扩增细胞培养基培养所希望的天数后，扩增的CD34+细胞可以使用本领域已知的任何常规手段分离，所述常规手段诸如但不限于干细胞标记物的阳性选择、针对谱系标记物的阴性选择、尺寸排阻、检测细胞中的代谢差异、检测细胞清除或积累物质的差异、粘附差异、在专支持干细胞的条件下直接培养血沉棕黄层。在一些实施方案中，并且使用一种或多种细胞表面标记物(包括CD34+、CD90+或CD133+)进一步分离扩增的细胞。
3.使扩增的HSC定向分化为希望谱系的寡能和单能祖细胞
在使细胞朝向希望谱系定向分化的谱系特异性培养基中进一步培养上述扩增的CD34+细胞源。希望谱系包括但不限于红系谱系、巨核系谱系、粒系谱系、单核系谱系和淋巴系谱系。
如部分III.B.中所讨论，存在许多可使CD34+细胞朝向希望谱系定向分化的分化培养基。可以在培养少至1、2、3或4天内看到在本文所述的分化培养基中的优先分化。在一些实施方案中，本文所述的分化培养基不包含式I的化合物或其子实施方案。
本文公开的分化培养方法包括在低氧气条件下培养细胞。如本文所用，短语“低氧气条件”是指培养细胞所暴露的气氛，其具有少于约10％的氧气，诸如以下中的任一个：约10％、9.5％、9％、8.5％、8％、7.5％、7％、6.5％、6％、5.5％或5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.75％、2.5％、2.25％、2％、1.75％、1.5％％、1.25％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％或0.5％或更少氧气。“低氧气条件”也可以指在0.5％与10％氧气之间的任何范围。对细胞培养物中氧气含量的控制可以通过本领域已知的任何手段进行，诸如通过添加氮气。
本文公开的分化培养方法包括在大气氧气条件下培养细胞。如本文所用，短语“大气氧气条件”是指包含约20％氧气的气氛。
根据本文所述的方法，分化培养物典型地在培养物中生长足以使得细胞群体表达谱系定型标记物的时间量，但不在培养物中的生长足以使群体显著显示出谱系成熟度标记物那么久。技术人员应认识到成熟度标记物根据所制备的谱系而变化(并且在下面的子部分中进一步讨论)。表达谱系定型标记物而不是成熟度标记物的分化培养总天数将取决于许多因素，包括所制备的谱系、所使用的分化培养基以及其他变量诸如氧气水平。
在一些实施方案中，含有寡能和单能祖细胞的细胞群体的少于3％、5％、7％、10％、15％或20％表达成熟度标记物。在一些实施方案中，含有寡能和单能祖细胞的细胞群体的少于5％表达成熟度标记物。细胞群体的所述百分比可以通过限制分化培养的时间来实现，但也可以通过在使用已知技术(诸如免疫磁力消耗具有成熟度标记物的细胞)培养后去除成熟细胞来实现以上参考的百分比。
分化培养物中的细胞可以维持3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或25、30、35、40、45或50天或更多天的培养。
在本文所述的分化培养基中培养所希望的天数后，可以使用本领域已知的任何常规手段分离特定的寡能和单能祖细胞，所述常规手段诸如但不限于针对干细胞标记物的阴性选择、谱系标记物的阳性选择、尺寸排阻、检测细胞中的代谢差异、检测细胞清除或积累物质的差异、粘附差异。应理解，具体的选择特征将取决于被分离的祖细胞的类型。
用于本文所述的给定细胞群体的标记物在本文进一步讨论，但作为非限制性例子，寡能和单能红细胞祖细胞可以使用CD71+的阳性选择来分离；寡能和单能巨核细胞祖细胞可以使用CD41+的阳性选择来分离；寡能和单能粒细胞祖细胞可以使用CD15+的阳性选择来分离或以两步过程来分离：(1)针对CD16+的阴性选择，然后(2)CD15+的阳性选择；寡能和单能淋巴系祖细胞可以使用CD10+的阳性选择来分离。可以使用另外的谱系特异性标记物来分离特别希望的淋巴系细胞。例如，在一些实施方案中，T细胞祖细胞可以使用CD7+的阳性选择来分离，并且B细胞祖细胞可以使用CD19+的阳性选择来分离。
在分化细胞培养基中培养后，含有寡能和单能祖细胞的细胞群体可以使用本领域任何已知的手段来保存，包括冷冻和低温保存。
i.寡能和单能红系祖细胞
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或25天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何红系分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的红系分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞展现出增加的CD71+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的红系分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在红系分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD71+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或25或更多中任一个后，与在本文所述的任何红系分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的红系分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD71+细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或25天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何红系分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的红系分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞也展现出增加的CD71+/CD45-细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的红系分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在红系分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD71+/CD45-细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或25或更多中任一个后，与在本文所述的任何红系分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的红系分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD71+/CD45-细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或25天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何红系分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的红系分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞也展现出增加的CD235a+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的红系分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在红系分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD235a+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或25或更多中任一个后，与在本文所述的任何红系分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的红系分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000；125,000；150,000或更多倍的CD235a+细胞数量。
本文所述的CD71+、CD45-和/或CD235a+细胞的产生增加允许从单一脐带血样品、单一动员外周血样品或另一种CD34+细胞源获得多个治疗剂量的寡能和单能红系祖细胞。
本公开文本还考虑通过本文所述方法制造的细胞群体。本文提供的含有寡能和单能红细胞祖细胞的细胞群体赋予在天然存在的寡能和单能红细胞祖细胞中发现的优点。在一些实施方案中，本文提供的含有寡能和单能红细胞祖细胞的细胞群体的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％是寡能和单能红细胞祖细胞。应理解，上面讨论的细胞标记物以及本领域已知的那些细胞标记物可以用于限定寡能和单能红细胞祖细胞(例如，CD71+、CD45-、CD235a+)。
使用本文所述方法制备的寡能和单能红细胞祖细胞与天然存在的红细胞祖细胞以及在红系分化培养基中培养的没有首先在扩增细胞培养基中经受生长的红细胞祖细胞共享相同的特性和生理特征。特别地，使用本文所述方法制备的寡能和单能红细胞祖细胞证明了与其天然对应物相同的完全成熟和执行其细胞功能的能力。
在一些实施方案中，希望允许红细胞分化培养物继续生长另外的时间以制备完全成熟的红细胞。完全成熟的红细胞可以以许多不同的方式进行鉴定。例如，在一些实施方案中，完全成熟的红细胞被鉴定为具有CD45-的细胞表面表型/CD71-/CD235a+和缺少细胞核。在没有细胞核的情况下，这些细胞缺少DNA。许多用于鉴定细胞中DNA的方法是本领域已知的，并且包括将活细胞用Hoechst 33342(一种与DNA结合的细胞可渗透性染料)染色或将固定细胞用DAPI染色。成熟的红细胞也可以通过以下方式来鉴定：检查用Wright-Giemsa或其他组织学或细胞学染色剂染色的细胞的小尺寸、特征性圆盘形状和细胞核缺少。典型地，将红细胞分化培养物孵育约20-23天以提供成熟红细胞群体。ii.寡能和单能巨核细胞祖细胞
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何巨核细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的巨核细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞展现出增加的CD41+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的巨核细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在巨核细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD41+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何巨核细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的巨核细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000或更多倍的CD41+细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何巨核细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的巨核细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞也展现出增加的CD42b+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的巨核细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在巨核细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD42b+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何巨核细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的巨核细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000或更多倍的CD42b+细胞数量。
本文所述的CD41+和/或CD42b+细胞的产生增加允许从单一脐带血样品、单一动员外周血样品或另一种CD34+细胞源获得多个治疗剂量的寡能和单能巨核细胞祖细胞。
本公开文本还考虑通过本文所述方法制造的细胞群体。本文提供的含有寡能和单能巨核细胞祖细胞的细胞群体赋予在天然存在的寡能和单能巨核细胞祖细胞中发现的优点。在一些实施方案中，本文提供的含有寡能和单能巨核细胞祖细胞的细胞群体的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％是寡能和单能巨核细胞祖细胞。应理解，上面讨论的细胞标记物以及本领域已知的那些细胞标记物可以用于限定寡能和单能巨核细胞祖细胞(例如，CD41+、CD42b+)。
使用本文所述方法制备的寡能和单能巨核细胞祖细胞与天然存在的巨核细胞祖细胞以及在红系分化培养基中培养的没有首先在扩增细胞培养基中经受生长的巨核细胞祖细胞共享相同的特性和生理特征。特别地，使用本文所述方法制备的寡能和单能巨核细胞祖细胞证明了与其天然对应物相同的完全成熟和执行其细胞功能的能力。
在一些实施方案中，希望允许巨核细胞分化培养物继续生长另外的时间以制备完全成熟的巨核细胞。完全成熟的巨核细胞可以以许多不同的方式进行鉴定。例如，在一些实施方案中，成熟巨核细胞被鉴定为具有CD41+/CD42b+、大细胞尺寸与高颗粒度、和/或多倍体(4n+)细胞核。本领域技术人员使用显微术或高流式细胞术前向散射将容易识别成熟巨核细胞的较大细胞尺寸。可以将巨核细胞分化培养物孵育约12-16天以提供成熟巨核细胞群体。在一些实施方案中，希望允许巨核细胞分化培养物继续生长超过成熟巨核细胞阶段以制备血小板。在这样的实施方案中，提供的群体是血小板，其具有CD41+CD42+的表面表型、非常小的尺寸并且没有细胞核。
iii.寡能和单能粒细胞祖细胞
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何粒细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的粒细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞展现出增加的CD15+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的粒细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在粒细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD15+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何粒细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的粒细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD15+细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何粒细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的粒细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞也展现出增加的CD15+、CD14-和/或CD34-细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的粒细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在粒细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD15+、CD14-和/或CD34-细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何粒细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的粒细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD15+、CD14-和/或CD34-细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何粒细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的粒细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞也展现出增加的CD11b+和/或CD16+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的粒细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在粒细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD11b+和/或CD16+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何粒细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的粒细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD11b+和/或CD16+细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何粒细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的粒细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞也展现出增加的CD66b+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的粒细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在粒细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD66b+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何粒细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的粒细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD66b+细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何粒细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的粒细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞也展现出增加的CD15+/HLA-DR+、CD15+/HLA-DR-、CD15+/HLA-DR+/CD13+/CD11b-/CD16-、CD15+/HLA-DR-/CD13+/CD11b-/CD16-、CD15+/HLA-DR-/CD13-/CD11b-/CD16-、CD15+/HLA-DR-/CD13-/CD11b+/CD16-、CD15+/HLA-DR-/CD13+/CD11b+/CD16-和/或CD15+/HLA-DR-/CD13+/CD11b+/CD16+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的粒细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在粒细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD15+/HLA-DR+、CD15+/HLA-DR-、CD15+/HLA-DR+/CD13+/CD11b-/CD16-、CD15+/HLA-DR-/CD13+/CD11b-/CD16-、CD15+/HLA-DR-/CD13-/CD11b-/CD16-、CD15+/HLA-DR-/CD13-/CD11b+/CD16-、CD15+/HLA-DR-/CD13+/CD11b+/CD16-和/或CD15+/HLA-DR-/CD13+/CD11b+/CD16+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何粒细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的粒细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD15+/HLA-DR+、CD15+/HLA-DR-、CD15+/HLA-DR+/CD13+/CD11b-/CD16-、CD15+/HLA-DR-/CD13+/CD11b-/CD16-、CD15+/HLA-DR-/CD13-/CD11b-/CD16-、CD15+/HLA-DR-/CD13-/CD11b+/CD16-、CD15+/HLA-DR-/CD13+/CD11b+/CD16-和/或CD15+/HLA-DR-/CD13+/CD11b+/CD16+细胞数量。
本文所述的CD15+、CD14-、CD34-、CD11b+、CD66b+和/或CD16+细胞的产生增加允许从单一脐带血样品、单一动员外周血样品或另一种CD34+细胞源获得多个治疗剂量的寡能和单能粒细胞祖细胞。
本公开文本还考虑通过本文所述方法制造的细胞群体。本文提供的含有寡能和单能粒细胞祖细胞的细胞群体赋予在天然存在的寡能和单能粒细胞祖细胞中发现的优点。在一些实施方案中，本文提供的含有寡能和单能粒细胞祖细胞的细胞群体的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％是寡能和单能粒细胞祖细胞。应理解，上面讨论的细胞标记物以及本领域已知的那些细胞标记物可以用于限定寡能和单能粒细胞祖细胞(例如，CD15+、CD14-、CD34-、CD11b+、CD66b+、CD16+)。
使用本文所述方法制备的寡能和单能粒细胞祖细胞与天然存在的粒细胞祖细胞以及在红系分化培养基中培养的没有首先在扩增细胞培养基中经受生长的粒细胞祖细胞共享相同的特性和生理特征。特别地，使用本文所述方法制备的寡能和单能粒细胞祖细胞证明了与其天然对应物相同的完全成熟和执行其细胞功能的能力。此外，本文所述的粒细胞祖细胞可以有效储存，与其完全成熟的对应物不同。
粒细胞成熟度的标记物是本领域技术人员已知和认可的。例如，在一些实施方案中，粒细胞成熟的特征在于在显微术下在细胞学或组织学染色的细胞制剂中容易观察到的多小叶核(multilobular nucleus)和/或可以例如使用侧散射流式细胞术测量的在细胞质中的高颗粒度。在一些实施方案中，粒细胞成熟的特征在于在细胞表面上非常高的CD16水平。
iv.寡能和单能单核细胞祖细胞
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何单核细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的单核细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞展现出增加的CD14+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的单核细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在单核细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD14+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何单核细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的单核细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD14+细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何单核细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的单核细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞也展现出增加的CD14+、CD15低/-细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的单核细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在单核细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD15低/-细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何单核细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的单核细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD15低/-细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或天或更多天后，与在本文所述的任何单核细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的单核细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞也展现出增加的CD14+、CD15低/-、CD13+和/或CD33+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的单核细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在单核细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD15低/-、CD13+和/或CD33+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何单核细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的单核细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD15低/-、CD13+和/或CD33+细胞数量。
本文所述的CD14+、CD15低/-、CD13+和/或CD33+细胞的产生增加允许从单一脐带血样品、单一动员外周血样品或另一种CD34+细胞源获得多个治疗剂量的寡能和单能单核细胞祖细胞。
本公开文本还考虑通过本文所述方法制造的细胞群体。本文提供的含有寡能和单能单核细胞祖细胞的细胞群体赋予在天然存在的寡能和单能单核细胞祖细胞中发现的优点。在一些实施方案中，本文提供的含有寡能和单能单核细胞祖细胞的细胞群体的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％是寡能和单能单核细胞祖细胞。应理解，上面讨论的细胞标记物以及本领域已知的那些细胞标记物可以用于限定寡能和单能单核细胞祖细胞(例如，CD14+、CD15低/-、CD13+和/或CD33+)。
使用本文所述方法制备的寡能和单能单核细胞祖细胞与天然存在的红细胞祖细胞以及在单核细胞分化培养基中培养的没有首先在扩增细胞培养基中经受生长的单核细胞祖细胞共享相同的特性和生理特征。特别地，使用本文所述方法制备的寡能和单能单核细胞祖细胞证明了与其天然对应物相同的完全成熟和执行其细胞功能的能力。
v.寡能和单能淋巴细胞祖细胞
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞展现出增加的CD7+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的淋巴细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在淋巴细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD7+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD7+细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞展现出增加的CD10+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的淋巴细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在淋巴细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD10+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD10+细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞展现出增加的CD7+/CD5+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的淋巴细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在淋巴细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD7+/CD5+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD7+/CD5+细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞展现出增加的CD7+/CD5-细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的淋巴细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在淋巴细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD7+/CD5-细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD7+/CD5-细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞展现出增加的CD7+/CD5+/CD1a+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的淋巴细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在淋巴细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD7+/CD5+/CD1a+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD7+/CD5+/CD1a+细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞也展现出增加的细胞内CD3+(iCD3+)或表面CD3+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的淋巴细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在淋巴细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多iCD3+和或CD3+(表面)细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的iCD3+细胞数量和/或更多表面CD3+。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞也展现出增加的NKP46+、CD56+、CD161+、CD16-、CD94+或CD94、CXCR4-、CD5-和/或CD3-细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的淋巴细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在淋巴细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多NKP46+、CD56+、和CXCR4-、CD5-和/或CD3-细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的NKP46+、CD56+、和CXCR4-、CD5-和/或CD3-细胞数量。
在一些实施方案中，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞也展现出增加的CD10+、CD19+和/或IgM+细胞数量。即，使用本文所述的扩增细胞培养方法与本文所述的淋巴细胞分化培养方法的组合扩增CD34+细胞提供了比在淋巴细胞分化培养基中培养的原始的CD34+细胞源显著更多CD10+、CD19+和/或IgM+细胞。具体地，在培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100天或更多天中任一个后，与在本文所述的任何淋巴细胞分化培养基中培养的未扩增的CD34+细胞(原始的源)相比，使用本文公开的方法在本文所述的淋巴细胞分化培养基中培养的扩增的CD34+细胞源展现出大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125；150；175；200；225；250；275；300；325；350；375；400；425；450；475；500；550；600；650；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；15,000；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；85,000；90,000；100,000或更多倍的CD10+、CD19+和/或IgM+细胞数量。
本文所述的CD7+和/或CD3+细胞、CD7+/CD5+细胞、CD7+/CD5+/CD1a+细胞、或NKP46+、CD56+、和CXCR4-、CD5-、和/或CD3-细胞或CD10+、CD19+和/或IgM+细胞的产生增加允许从单一脐带血样品、单一动员外周血样品或另一种CD34+细胞源获得多个治疗剂量的寡能和单能淋巴细胞祖细胞。
本公开文本还考虑通过本文所述方法制造的细胞群体。本文提供的含有寡能和单能淋巴细胞祖细胞的细胞群体赋予在天然存在的寡能和单能淋巴细胞祖细胞中发现的优点。在一些实施方案中，本文提供的含有寡能和单能淋巴细胞祖细胞的细胞群体的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％是寡能和单能淋巴细胞祖细胞。应理解，上面讨论的细胞标记物以及本领域已知的那些细胞标记物可以用于限定寡能和单能淋巴细胞祖细胞(例如，CD7+、CD10+、CD7+/CD5+、CD7+/CD5-、CD7-/CD5+、CD7+/CD5+/CD1a+、NKP46+、CD56+、CXCR4-、CD5-、CD3-或CD10+、CD19+和/或IgM+)。
使用本文所述方法制备的寡能和单能淋巴细胞祖细胞与天然存在的红细胞祖细胞以及在淋巴细胞分化培养基中培养的没有首先在扩增细胞培养基中经受生长的淋巴细胞祖细胞共享相同的特性和生理特征。特别地，使用本文所述方法制备的寡能和单能淋巴细胞祖细胞证明了与其天然对应物相同的完全成熟和执行其细胞功能的能力。
淋巴细胞成熟度的标记物是本领域技术人员已知和认可的。例如，在一些实施方案中，T细胞成熟的特征在于细胞表面上存在CD3(与仅细胞内CD3相对)。在一些实施方案中，T细胞成熟的特征在于细胞表面表型包括CD4+和/或CD8α+。在一些实施方案中，B细胞成熟的特征在于细胞表面表型包括CD34-、CD10-、CD19+和IgM+。在一些实施方案中，自然杀伤细胞(NK)成熟的特征在于细胞表面表型包括CD62L+、CD57+和/或NKG2D+。另外的成熟度标记物在Luetke-Eversloh,M.,Killig,M.和Romagnani,C.(2013).Signatures of Human NKCell Development and Terminal Differentiation.Front.Immunol.4中讨论，出于所有目的将其内容并入本文。
4.分化的寡能和单能祖细胞的储存
在上面部分IV.A.3.所述的希望的定向分化完成后，寡能和单能祖细胞群体可以用于立即使用或任选地储存以供以后在本文所述方法中使用。
本领域已知的多种细胞储存条件可用于本公开文本。在一些实施方案中，寡能和单能祖细胞群体的储存包括低温冷冻细胞。在美国专利申请序列号US 2010/240127中描述了另外的储存条件，出于所有目的将其内容并入本文。
在准备在储存后使用细胞时，可以应用标准融霜或其他适当的技术。在一些实施方案中，在适当的分化培养基中进一步培养寡能和单能祖细胞群体。在适当的分化培养基中进一步培养可以提供增加数量的分化的祖细胞(如通过占总群体的百分比测量的或如在总细胞数量中与解冻细胞数量相比测量的)，并且还可以提供进一步分化且更成熟的祖细胞。
在使用前增加寡能和单能祖细胞群体的成熟度可能是特别有利的。作为非限制性例子，完全分化的嗜中性粒细胞典型地不能在冷冻/解冻循环中存活。因此，当治疗嗜中性粒细胞减少症(或其另一种需要施用嗜中性粒细胞和/或祖细胞的障碍)时，本文所述的寡能和单能粒细胞祖细胞可以在储存后任选地在本文所述的粒细胞培养基中进一步培养。储存后培养可以持续任何希望天数，包括多1、2、3、4、5、6或7、10、14、21或28天。以类似的方式，并且作为另外的非限制性例子，完全分化的自然杀伤(NK)细胞典型地在冷冻/解冻循环后具有有限的存活能力。因此，当治疗自然杀伤细胞替代是有利或需要的疾病或病症时，寡能和单能淋巴细胞祖细胞(包括自然杀伤(NK)细胞祖细胞)可以在储存后任选地在本文所述的淋巴细胞培养基中进一步培养。储存后培养可以持续任何希望天数，包括多1、2、3、4、5、6或7、10、14、21或28天。
B.治疗方法
本文提供了用于治疗需要造血重建的个体；需要红系、巨核系、粒系、单核系和/或淋巴系重建的个体；以及患有癌症、免疫疾病或其他遗传缺陷的个体的方法。特别地，本方法提供谱系特异性寡能和单能祖细胞，其可以帮助治疗各种疾病并且可以辅助有需要的个体的造血系统重建。所述方法涉及向个体施用含有根据本发明方法衍生的任何定向分化寡能和单能祖细胞的治疗剂或药物组合物。
本领域普通技术人员可以容易地对于治疗性施用确定本文公开的定向分化寡能和单能祖细胞的适当浓度或剂量。普通技术人员应认识到，优选的剂量是在有需要的患者中产生治疗效果(诸如预防、治疗和/或减轻疾病、障碍和损伤)的剂量。当然，恰当的细胞剂量将需要在使用时基于若干变量进行经验确定，所述变量包括但不限于所递送的细胞类型；所治疗的疾病、损伤、障碍或病症的严重程度和类型；患者的年龄、体重、性别、健康；向患者施用的其他药物和治疗；等等。
可以以一个剂量但不限于一个剂量来施用有效量的细胞。因此，施用可以是两、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更多次施用药物组合物。在本方法中治疗剂的施用多于一次的情况下，施用可以以一分钟、两分钟、三、四、五、六、七、八、九、十或更多分钟的时间间隔，约一小时、两小时、三、四、五、六、七、八、九、十、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时等的间隔隔开。在小时的上下文中，术语“约”意指加或减在30分钟内的任何时间间隔。施用也可以以一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天及其组合的时间间隔隔开。本发明不限于在时间上等量隔开的给药间隔，而包括非等量间隔的剂量。
例如一次/周、两次/周、三次/周、四次/周、五次/周、六次/周、七次/周、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次等的给药时间表可用于本发明。给药时间表包括例如一周、两周、三周、四周、五周、六周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月和十二个月的总时间段的给药。
提供了以上给药时间表的周期。所述周期可以约例如每七天；每14天；每21天；每28天；每35天；42天；每49天；每56天；每63天；每70天等重复一次。在周期之间可以出现非给药间隔，其中间隔可以是约例如七天；14天；21天；28天；35天；42天；49天；56天；63天；70天等。在此上下文中，术语“约”意指加或减一天、加或减两天、加或减三天、加或减四天、加或减五天、加或减六天或加或减七天。
从本发明方法衍生的定向分化寡能和单能祖细胞可以使用本领域的标准技术低温保存并且储存以备后用。从本发明方法衍生的细胞集合可以一起储存在低温保存的细胞和组织库中。
根据本文公开的任何方法使用一种或多种生理上可接受的载体，任选地包括赋形剂和助剂，以任何常规方式将从本发明方法衍生的定向分化寡能和单能祖细胞配制用于使用。恰当的配制品取决于所选择的施用途径。组合物也可以在一种或多种生理上可接受的载体中施用于个体。用于细胞的载体可以包括但不限于生理盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、含有生理浓度盐混合物的乳酸盐林格氏溶液、或细胞培养基。
本发明的定向分化寡能和单能祖细胞群体以及包含其的治疗剂和药物组合物可以用于加强造血干细胞移植。人自体和同种异体造血干细胞移植目前作为疗法用于疾病，诸如白血病、淋巴瘤和其他危及生命的障碍。然而，这些程序的缺点是在造血干细胞移植中使用的骨髓或其他细胞源通常含有高水平的未成熟细胞，使接受移植的患者具有低水平的其终末分化的造血细胞和祖细胞。
本公开文本的寡能和单能祖细胞群体的定向分化以及包含其的治疗剂和药物组合物可以提供寡能和单能祖细胞，其可以更快速地补充终末分化的造血细胞并且可以辅助移植细胞的植入。
根据本发明的方法，在一些实施方案中，(1)使用本文所述方法在扩增细胞培养基中培养少量骨髓捐赠物、脐带血样品、动员外周血样品、或另一种CD34+细胞源，以及(2)在使用本文所述方法分化培养基中培养，然后输注或移植到受体中。
在另一个实施方案中，本文公开的定向分化寡能和单能祖细胞群体以及包含其的治疗剂和药物组合物可以用于除化疗之外的补充治疗。大多数用于靶向和破坏癌细胞的化疗剂通过杀死所有增殖细胞(即，经历细胞分裂的细胞)来发挥作用。由于骨髓是体内增殖最活跃的组织之一，造血干细胞经常被化疗剂损害或破坏，并且结果，血细胞的产生减少或停止。必须间隔地终止化疗，以允许患者的造血系统在恢复化疗之前补充血细胞供应。可能需要一个月或更久来使以前处于静止的干细胞增殖并且将白血细胞计数增加到可接受的水平，使得可以恢复化疗(这时再次，骨髓干细胞被破坏)。
然而，在化疗治疗之间血细胞再生的时间内，癌症有时间生长并且有可能由于自然选择而对化疗药物产生更强的抵抗。因此，给予的化疗越久并且治疗之间的持续时间越短，成功杀死癌症的几率就越大。为了缩短化疗治疗之间的时间，可以将本文公开的定向分化寡能和单能祖细胞群体以及包含其的治疗剂和药物组合物引入个体中。此类治疗将减少个体将表现出低血细胞计数的时间，并且因此将允许更早地恢复化疗治疗。
当前的护理标准是提供各种细胞因子来刺激耗尽的血细胞的产生。如本文所考虑，通过本文所述方法制备的细胞群体可以作为标准护理治疗的补充或作为所施用的细胞因子的替代物来施用。
1.寡能和单能红细胞祖细胞
如本文所考虑，本公开文本包括用于向有需要的个体递送寡能和单能红细胞祖细胞的方法。有需要的个体包括需要红系重建的那些个体以及患有各种病患的个体，所述病患包括贫血、癌症、免疫疾病、传染病、心血管疾病和代谢障碍。在本文所述的方法中，向有需要的个体施用包含寡能和单能红细胞祖细胞的治疗剂量或药物组合物。
如上所讨论，在各种形式的癌症治疗或其他造血抑制治疗后的个体通常具有耗尽水平的造血干细胞及其祖细胞。在这种情况下，这些个体通常接受造血干细胞移植，但移植的组织通常具有低水平的充分分化的细胞，进一步施用寡能和单能红细胞祖细胞将有助于加强这种移植并且改善其恢复。
在一些实施方案中，将本文所述的寡能和单能红细胞祖细胞群体施用于患有贫血的个体。
在一些实施方案中，寡能和单能红细胞祖细胞群体是基因修饰的。这些基因修饰可以用于例如治疗癌症、治疗传染病、治疗心血管疾病、治疗代谢障碍、或诱导免疫耐受。用于引入这些基因修饰和治疗各种疾病的方法和系统是本领域已知的并且描述于例如WO/2015/153102、WO/2015/073587、WO/2016/183482、WO/2017/123646、WO/2017/123644、WO/2018/151829、WO/2018/009838、WO/2018/102740、WO/2019/017940、WO/2019/017937、WO/2019/040516中，出于所有目的将各自内容通过引用并入本文。
因此，在一些实施方案中，本文提供了治疗癌症的方法，其包括基因修饰通过本文公开的方法制备的寡能和单能红细胞祖细胞群体。基因修饰可以包括两种外源多肽的编码区。一种外源多肽在癌细胞处或附近结合，并且第二外源多肽具有抗癌功能。有用的抗癌功能包括但不限于免疫刺激分子、促凋亡剂、或血管生成抑制剂。
如上所讨论，在一些实施方案中，希望允许红细胞分化培养物继续生长另外的时间以制备完全成熟的红细胞。成熟红细胞包括无细胞核以及包括CD45-的细胞表面表型/CD71-/CD235a+。用于治疗贫血、癌症的方法以及本文所述的其他实施方案(包括红细胞祖细胞的基因修饰)也适用于可以根据本文所述方法制备的完全成熟的红细胞群体。
本文还考虑了组合疗法，其中将通过本文所述方法制备的红细胞群体与另外的治疗剂一起施用。在一些实施方案中，另外的治疗剂是EPO，其进一步激励红细胞的产生。
2.寡能和单能巨核细胞祖细胞
如本文所考虑，本公开文本包括用于向有需要的个体递送寡能和单能巨核细胞祖细胞的方法。有需要的个体包括需要巨核细胞重建的那些个体以及患有血小板减少症或其他疾病诸如癌症的个体。在本文所述的方法中，向有需要的个体施用包含寡能和单能巨核细胞祖细胞的治疗剂量或药物组合物。
如上所讨论，在各种形式的癌症治疗或其他造血抑制治疗后的个体通常具有耗尽水平的造血干细胞及其祖细胞。在这种情况下，这些个体通常接受造血干细胞移植，但移植的组织通常具有低水平的充分分化的细胞，进一步施用寡能和单能巨核细胞祖细胞将有助于加强这种移植并且改善其恢复。
在一些实施方案中，将本文所述的寡能和单能巨核细胞祖细胞群体施用于患有血小板减少症的个体。
血小板减少症是一种以低水平的凝血细胞(也称为血小板)为特征的病症，凝血细胞是血凝块形成的核心组分。血小板减少症可以通过各种遗传综合征而基因遗传，所述遗传综合征诸如但不限于先天性低巨核细胞性血小板减少症。在医学上它也可以通过感染诱导或由感染引起，所述感染诸如但不限于登革热、寨卡病毒、或溶血性尿毒症综合征。
在一些实施方案中，本文所述的寡能和单能巨核细胞祖细胞用于体外生产血小板。用于制造血小板的体外方法是技术人员已知的，并且包括使祖细胞成熟为成熟巨核细胞并且执行已知步骤以诱导血小板产生。
在一些实施方案中，寡能和单能巨核细胞祖细胞群体是基因修饰的。这些基因修饰可以用于例如治疗癌症、传染病和心血管疾病。用于制备基因修饰的血小板的方法是本领域已知的并且描述于例如WO 2014/118117和Thijs等人Blood.2012.119(7):1634-42中；出于所有目的将各自内容通过引用并入本文。
如上所讨论，在一些实施方案中，希望允许巨核细胞分化培养物继续生长另外的时间以制备完全成熟的巨核细胞。成熟巨核细胞包括CD41+/CD42b+、大细胞尺寸与高颗粒度、和/或多倍体(4n+)细胞核。用于治疗血小板减少症、癌症和传染病的方法以及用于体外制造血小板的方法也适用于可以根据本文所述方法制备的完全成熟的巨核细胞群体。
本文还考虑了治疗血小板减少症的组合疗法，其中将通过本文所述方法制备的巨核细胞群体与另外的治疗剂一起施用。在一些实施方案中，另外的治疗剂是罗米司亭或艾曲波帕，其激励血小板的植入。
3.寡能和单能粒细胞祖细胞
如本文所考虑，本公开文本包括用于向有需要的个体递送寡能和单能粒细胞祖细胞的方法。有需要的个体包括需要粒系重建的那些个体以及各种病患的个体，所述病患包括嗜中性粒细胞减少症、癌症、免疫疾病和传染病。在本文所述的方法中，向有需要的个体施用包含寡能和单能粒细胞祖细胞的治疗剂量或药物组合物。
在各种形式的癌症治疗或其他造血抑制治疗后的个体通常具有耗尽水平的造血干细胞及其祖细胞。在这种情况下，这些个体通常接受造血干细胞移植，但移植的组织通常具有低水平的充分分化的细胞，使得进一步施用寡能和单能粒细胞祖细胞将有助于加强这种移植并且加快免疫重建，从而改善其恢复。在一些实施方案中，免疫功能低下的个体没有接受造血干细胞移植，但施用了寡能和单能粒细胞祖细胞。
在一些实施方案中，将本文所述的寡能和单能粒细胞祖细胞群体施用于患有细菌或真菌感染的个体。粒细胞祖细胞的施用将加强个体的先天免疫反应。
在一些实施方案中，将本文所述的寡能和单能粒细胞祖细胞群体与抗癌生物制剂或免疫调节生物制剂(诸如利妥昔单抗或阿达木单抗)组合施用于患有癌症或免疫疾病的个体以增强抗体定向的细胞毒性。许多抗癌生物制剂或免疫调节生物制剂是本领域已知的。
在一些实施方案中，将本文所述的寡能和单能粒细胞祖细胞群体与另外的治疗剂组合施用以增强治疗作用。在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗细菌剂、抗病毒剂或抗真菌剂。与这些另外的治疗剂一起施用特别有用，因为缺少粒细胞、特别是嗜中性粒细胞的个体易受感染。
抗细菌剂包括但不限于青霉素、氨苄青霉素、碳青霉烯、头孢菌素、头孢羟唑、头孢克洛、头孢尼西、头孢替坦、羧苄青霉素、甲氧西林、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢吡肟、新霉素、奈替米星链霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、克拉霉素、红霉素、和阿奇霉素。
抗病毒剂包括但不限于阿昔洛韦、西多福韦、更昔洛韦、碘苷、奈非那韦、喷昔洛韦、缬更昔洛韦、依法韦仑、伐昔洛韦、阿糖腺苷、金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦、福米韦森、咪喹莫特和利巴韦林。
抗真菌剂包括但不限于氟胞嘧啶、两性霉素B、酮康唑、伊曲康唑、氟康唑和益康唑。
本文还考虑了治疗嗜中性粒细胞减少症的组合疗法，其中将通过本文所述方法制备的粒细胞祖细胞群体与另外的治疗剂一起施用。在一些实施方案中，另外的治疗剂是G-CSF(诸如非格司亭)或聚乙二醇化G-CSF(诸如聚乙二醇非格司亭)，其进一步激励粒细胞的产生。
4.寡能和单能单核细胞祖细胞
如本文所考虑，本公开文本包括用于向有需要的个体递送寡能和单能单核细胞祖细胞的方法。有需要的个体包括需要单核系重建的那些个体以及各种病患的个体，所述病患包括单核细胞减少症、癌症、免疫疾病和传染病。在本文所述的方法中，向有需要的个体施用包含寡能和单能单核细胞祖细胞的治疗剂量或药物组合物。
在各种形式的癌症治疗或其他造血抑制治疗后的个体通常具有耗尽水平的造血干细胞及其祖细胞。在这种情况下，这些个体通常接受造血干细胞移植，但移植的组织通常具有低水平的充分分化的细胞，进一步施用寡能和单能单核细胞祖细胞将有助于加强这种移植并且加快免疫重建，从而改善其恢复。在一些实施方案中，免疫功能低下的个体没有接受造血干细胞移植，但施用了寡能和单能单核细胞祖细胞。
单核细胞减少症可能由多种因素引起，包括应激、急性感染、再生障碍性贫血、基因疾病诸如MonoMAC综合征、癌症诸如白血病、以及用骨髓毒性药物的治疗。
在一些实施方案中，向患有单核细胞减少症的个体施用本文所述的治疗剂或药物组合物，其包含寡能和单能单核细胞祖细胞。
在一些实施方案中，将包含寡能和单能单核细胞祖细胞的本文所述的治疗剂或药物组合物施用于患有细菌或真菌感染的个体。单核细胞祖细胞的施用将加强个体的先天免疫反应。
在一些实施方案中，将本文所述的寡能和单能单核细胞祖细胞群体与抗癌生物制剂或免疫调节生物制剂(诸如利妥昔单抗或阿达木单抗)组合施用于患有癌症或免疫疾病的个体以增强抗体定向的细胞毒性。许多抗癌生物制剂或免疫调节生物制剂是本领域已知的。
在一些实施方案中，将本文所述的寡能和单能单核细胞祖细胞群体与另外的治疗剂组合施用以增强治疗作用。在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗细菌剂、抗病毒剂或抗真菌剂。与这些另外的治疗剂一起施用特别有用，因为缺少单核细胞的个体易受感染。
抗细菌剂包括但不限于青霉素、氨苄青霉素、碳青霉烯、头孢菌素、头孢羟唑、头孢克洛、头孢尼西、头孢替坦、羧苄青霉素、甲氧西林、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢吡肟、新霉素、奈替米星链霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、克拉霉素、红霉素、和阿奇霉素。
抗病毒剂包括但不限于阿昔洛韦、西多福韦、更昔洛韦、碘苷、奈非那韦、喷昔洛韦、缬更昔洛韦、依法韦仑、伐昔洛韦、阿糖腺苷、金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦、福米韦森、咪喹莫特和利巴韦林。
抗真菌剂包括但不限于氟胞嘧啶、两性霉素B、酮康唑、伊曲康唑、氟康唑和益康唑。
5.寡能和单能淋巴细胞祖细胞
如本文所考虑，本公开文本包括用于将寡能和单能淋巴细胞祖细胞递送于有需要的个体的方法。有需要的个体包括需要淋巴系重建的那些个体以及各种病患的个体，所述病患包括淋巴细胞减少症、癌症、免疫疾病和传染病。在本文所述的方法中，向有需要的个体施用包含寡能和单能淋巴细胞祖细胞的治疗剂量或药物组合物。
在各种形式的癌症治疗或其他造血抑制治疗后的个体通常具有耗尽水平的造血干细胞及其祖细胞。在这种情况下，这些个体通常接受造血干细胞移植，但移植的组织通常具有低水平的充分分化的细胞，进一步施用寡能和单能淋巴细胞祖细胞将有助于加强这种移植并且加快免疫重建，从而改善其恢复。在一些实施方案中，免疫功能低下的个体没有接受造血干细胞移植，但施用了寡能和单能淋巴细胞祖细胞。
淋巴细胞减少症可能由多种因素引起，包括HIV(以及其他病毒，包括甲型流感病毒)、狼疮、应激、类风湿性关节炎和多发性硬化症。另外，通过意外暴露或医学治疗而暴露于大量辐射也可能引起淋巴细胞减少症。
在一些实施方案中，向患有淋巴细胞减少症的个体施用本文所述的治疗剂或药物组合物，其包含寡能和单能淋巴细胞祖细胞。
在一些实施方案中，将本文所述的寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体施用于患有细菌、病毒或真菌感染的个体。淋巴细胞祖细胞的施用将加强个体的先天性和适应性免疫反应。
在一些实施方案中，将本文所述的寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体与抗癌生物制剂或免疫调节生物制剂(诸如利妥昔单抗或阿达木单抗)组合施用于患有癌症或免疫疾病的个体以增强抗体定向的细胞毒性。许多抗癌生物制剂或免疫调节生物制剂是本领域已知的。
在一些实施方案中，将本文所述的寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体与另外的治疗剂组合施用以增强治疗作用。在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗细菌剂、抗病毒剂或抗真菌剂。与这些另外的治疗剂一起施用特别有用，因为缺少淋巴细胞的个体易受感染。
抗细菌剂包括但不限于青霉素、氨苄青霉素、碳青霉烯、头孢菌素、头孢羟唑、头孢克洛、头孢尼西、头孢替坦、羧苄青霉素、甲氧西林、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢吡肟、新霉素、奈替米星链霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、克拉霉素、红霉素、和阿奇霉素。
抗病毒剂包括但不限于阿昔洛韦、西多福韦、更昔洛韦、碘苷、奈非那韦、喷昔洛韦、缬更昔洛韦、依法韦仑、伐昔洛韦、阿糖腺苷、金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦、福米韦森、咪喹莫特和利巴韦林。
抗真菌剂包括但不限于氟胞嘧啶、两性霉素B、酮康唑、伊曲康唑、氟康唑和益康唑。
C.用于生产谱系特异性细胞培养基的方法
本文进一步提供了用于生产用于培养造血干细胞(HSC)以及用于使其定向分化为希望谱系的扩增细胞培养基和/或分化培养基(诸如本文公开的任何细胞培养基)的方法。用于制备扩增细胞培养基的方法涉及将基础培养基或补料培养基；和本文公开的式I的化合物或子实施方案组合。在一些实施方案中，本文提供的方法还包括视黄酸受体(RAR)抑制剂或调节剂。在一些实施方案中，RAR抑制剂是ER50891。在另外的实施方案中，所述方法还包括将干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt3l)和/或白介素6(IL-6)中的一种、两种、三种或全部四种组合。所述方法还可以包括将半胱天冬酶抑制剂、DNA甲基化抑制剂、p38 MAPK抑制剂、GSK3抑制剂、RAR受体拮抗剂、JAK/STAT通路抑制剂和/或FBS(诸如热灭活FBS)中的一种或多种组合。在一些实施方案中，本文提供的方法不包括四跨膜蛋白。用于制备分化培养基的方法涉及将基础培养基或补料培养基；和本文公开的合适分化调节剂组合。合适的分化调节剂包括本文所述的红系谱系调节剂、巨核细胞谱系调节剂、粒细胞谱系调节剂、单核细胞谱系调节剂或淋巴细胞谱系调节剂。
如本文所用，“基础培养基”是用于培养细胞的培养基，其本身直接用于培养细胞并且不用作其他培养基的添加剂，尽管可以将各种组分添加到基础培养基中。基础培养基的例子包括但不限于DMEM培养基、IMDM培养基、StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)、199/109培养基、Ham的F10/F12培养基、McCoy的5A培养基、αMEM培养基(不含和含酚红)和RPMI1640培养基。可以例如通过添加盐、葡萄糖或其他添加剂来修改基础培养基。
“补料培养基”是在培养物中用作补料的培养基。与基础培养基一样，补料培养基是根据所培养的特定细胞的需要而设计的。因此，基础培养基可以用作设计补料培养基的基础。补料培养基可以具有更高浓度的基础培养基的大部分(但不是全部)组分。例如，一些组分诸如盐可以保持在基础培养基浓度的约1X，因为人们想要保持补料与基础培养基等渗。因此，在一些实施方案中，添加各种组分以保持补料培养基是生理性的，并且添加其他组分，因为它们为细胞培养物补充营养物。其他组分，例如营养素，可以是在基础培养基中其正常浓度的约2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、12X、14X、16X、20X、30X、50X、100X或更多。
V.系统和试剂盒
本文还提供了用于在培养物中制备寡能和单能祖细胞群体的系统。在一些实施方案中，此系统包含(1)在培养物中的CD34+细胞源(诸如来自骨髓、脐带血、动员外周血和非动员外周血中的一种或多种的CD34+细胞)，(2)本文所述的任何扩增细胞培养基组合物，和(3)本文所述的任何分化培养基组合物。在一些实施方案中，此系统包含(1)使用本文所述的扩增细胞培养基组合物制备的扩增的CD34+细胞源，和(2)本文所述的任何分化培养基组合物。
在一些实施方案中，本发明的系统为扩增细胞培养基和/或分化培养基维持低氧气培养条件。因此，所述系统提供了培养细胞所暴露的气氛，其具有少于约10％氧气，诸如以下中的任一个：约10％、9.5％、9％、8.5％、8％、7.5％、7％、6.5％、6％、5.5％或5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.75％、2.5％、2.25％、2％、1.75％、1.5％％、1.25％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％或0.5％或更少氧气。在一些实施方案中，所述系统提供了培养细胞所暴露的气氛，其具有在0.5％与10％氧气之间的任何范围。对系统中氧气含量的控制可以通过本领域已知的任何手段来完成，诸如通过添加氮气。
在一些实施方案中，本发明的系统为扩增细胞培养基和/或分化培养基维持大气氧气培养条件。
在另外的方面，本文公开的发明提供了一种或多种试剂盒。这些试剂盒可以包含(1)用于扩增细胞培养基的基础培养基或补料培养基(诸如但不限于DMEM培养基、IMDM培养基、StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)、199/109培养基、Ham的F10/F12培养基、McCoy的5A培养基、αMEM培养基(不含和含酚红)和RPMI 1640培养基)和本文公开的式I的化合物或子实施方案，以及(2)用于分化培养基的基础培养基或补料培养基(诸如但不限于DMEM培养基、IMDM培养基、StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)、199/109培养基、Ham的F10/F12培养基、McCoy的5A培养基、αMEM培养基(不含和含酚红)和RPMI 1640培养基)以及包括本文公开的合适分化调节剂。合适的分化调节剂包括本文所述的红系谱系调节剂、巨核细胞谱系调节剂、粒细胞谱系调节剂、单核细胞谱系调节剂或淋巴细胞谱系调节剂。
在一些实施方案中，用于定向制备淋巴细胞谱系祖细胞的试剂盒进一步包含用固定的DLL4预处理的培养容器。在一些实施方案中，用于定向制备淋巴细胞谱系祖细胞的试剂盒进一步包含用固定的VCAM-I和DLL4预处理的培养容器。
所述试剂盒还可以包含通过使用试剂盒的扩增细胞培养基和分化培养基组分培养细胞而在培养物中制备寡能和单能祖细胞群体的书面说明书。
本公开文本的试剂盒还可以包含(1)通过本文所述方法制备的寡能和单能祖细胞群体；(2)包含基础培养基或补料培养基的分化培养基(诸如但不限于DMEM培养基、IMDM培养基、StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)、199/109培养基、Ham的F10/F12培养基、McCoy的5A培养基、αMEM培养基(不含和含酚红)和RPMI 1640培养基)以及本文公开的合适分化调节剂。合适的分化调节剂包括本文所述的红系谱系调节剂、巨核细胞谱系调节剂、粒细胞谱系调节剂、单核细胞谱系调节剂或淋巴细胞谱系调节剂。在一些实施方案中，寡能和单能祖细胞群体作为冷冻样品来提供。在一些实施方案中，寡能和单能祖细胞群体是粒细胞祖细胞群体。在一些实施方案中，寡能和单能祖细胞群体在单核细胞祖细胞群体中。在一些实施方案中，寡能和单能祖细胞群体在淋巴细胞祖细胞群体中。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于在分化培养基中培养寡能和单能祖细胞群体的书面说明书。
在一些实施方案中，所述试剂盒不包含四跨膜蛋白。
在本说明书通篇中给出的每一个最大数值限旨在包括每一个较低数值限，如同此类较低数值限被明确地书写在本文中一样。在本说明书通篇中给出的每一个最小数值限将包括每一个较高数值限，如同此类较高数值限被明确地书写在本文中一样。在本说明书通篇中给出的每一个数值范围将包括落在这种较宽的数值范围内的每一个较窄数值范围，如同此类较窄数值范围都被明确地书写在本文中一样。
VI.实施例
通过参考以下实施例可以进一步理解本发明，所述实施例是通过说明的方式提供的，而不意味着是限制性的。
下面使用的试剂和溶剂可以从商业来源获得，诸如MilliporeSigma(美国密苏里州圣路易斯)。
在Varian Mercury 400MHz NMR波谱仪上记录1H-NMR波谱。化学位移在内部参考CDCl3(7.26ppm)中的残余质子共振，并且按以下顺序列出：多重性(s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰)和质子数。13C NMR在100MHz质子下记录。碳化学位移在内部参考CDCl3(77.20ppm)中的氘化溶剂信号。
质谱结果报告为质荷比，然后是每种离子的相对丰度(在括号中)。在实施例中，报告了含有最常见原子同位素的M+H(或如上指出的M-H)离子的单一m/z值。在所有情况下，同位素模式都对应于预期的式。在Shimadzu LC-MS2020上使用Agilent C18柱(Eclipse XDB-C18，5um，2.1x50mm)以1mL/min的流速进行电喷雾电离(ESI)质谱分析。流动相A：在水中的0.1％甲酸；流动相B：在乙腈中的0.1％甲酸。通常，分析物以0.1mg/mL溶解在甲醇中，并且用递送溶剂将1微升输注到质谱仪中，所述质谱仪从100至1500道尔顿扫描。所有化合物都可以在正ESI模式下分析或在负ESI模式下分析。
在Agilent 1200HPLC上用Zorbax Eclipse XDB C18柱(2.1x150mm)以1mL/min的流速进行分析型HPLC。流动相A：在水中的0.1％TFA；流动相B：在乙腈中的0.1％TFA。
在Varian ProStar上使用Hamilton C18 PRP-1柱(15x250mm)以20mL/min的流速进行制备型HPLC。流动相A：在水中的0.1％TFA；流动相B：在乙腈中的0.1％TFA。
在实施例和本发明的整个说明书中使用以下缩写：
THF： 四氢呋喃
TLC： 薄层色谱法
TFA： 三氟乙酸
TEA： 三乙胺
Tol： 甲苯
DCM： 二氯甲烷
DCE： 1,2-二氯乙烷
DMF： 二甲基甲酰胺
DMSO： 二甲基亚砜
DPPA： 二苯基磷酰基叠氮化物
MeOH： 甲醇
BINAP： (2,2’-双(二苯基膦基)-1,1’-联萘)
Pd2(dba)3： 三(二亚苄基丙酮)二钯(0)
PPA 多磷酸
PDC 重铬酸吡啶嗡(Cornforth试剂)
PE： 石油醚
EA： 乙酸乙酯
XPhos： 2-二环己基膦基-2’,4’,6’-三异丙基联苯
LCMS: 液相色谱质谱法
HPLC： 高压液相色谱法
t-Bu： 叔丁基
Et 乙基
OAc： 乙酸盐(酯)
Piv 新戊酰基(t-BuC(O)-)
本发明范围内的化合物可以如下所述使用本领域技术人员已知的多种反应来合成。本领域技术人员还应认识到，可以采用替代方法来合成本发明的目标化合物，并且本文件正文中所述的方法并非详尽穷举的，但确实为目的化合物提供了广泛可适用且实用的途径。
本专利中要求保护的某些分子可以以不同的对映异构体和非对映异构体形式存在，并且这些化合物的所有此类变体都在本公开文本的范围内。
本文本中用于合成关键化合物的实验程序的详细描述导致通过鉴定它们的物理数据以及通过与它们相关的结构描述来描述的分子。
本领域技术人员还应认识到，在有机化学的标准后处理程序中，经常使用酸和碱。如果母体化合物具有必要的固有酸性或碱性，则在本专利中所述的实验过程中，有时产生母体化合物的盐。
实施例1：N-(8-氧代-1,2,3,3a,8,8a-六氢环戊烯并[a]茚-6-基)新戊酰胺(化合物1.001)的合成
Figure BDA0003443861290000781
将在苯(50mL)中的化合物1.1(4.9g，437mmol，1.0当量)和AlCl3(17.5g，1311mmol，3.0当量)的混合物添加3次，然后在回流下加热3h。通过3M HCl淬灭反应，并且将水溶液用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层干燥并且浓缩至残余物，将其通过柱色谱法纯化(PE/EA＝100:1)以得到化合物1.2(3.4g，45％)。
将化合物1.2(3.4g，19.7mmol，1.0当量)在浓HNO3(32mL)和浓H2SO4(4mL)中的混合物在80℃下加热1h。添加水并且将粗混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层干燥并且浓缩至残余物，将其通过柱色谱法纯化(PE/EA＝30:1)以得到呈黄色固体的化合物1.3(2.7g，63％)。
将1.3(2.7g，12.44mmol，1.0当量)、铁粉(3.5g，62.2mmol，5.0当量)、NH4Cl(6.65g，10.0mmol，10.0当量)在乙醇/水(v/v＝2:1，20mL/10mL)中的混合物在氮气气氛下在80℃下搅拌1h。反应完全后，滤出固体并且将滤液在真空中浓缩以提供1.4(1.8g，77％)。
向1.4(50mg，0.267mmol，1.0当量)在THF(5mL)中的混合物中添加Na2CO3(114mg，1.07mmol，4.0当量)和1.5(65mg，0.535mmol，2.0当量)。将混合物在氮气气氛下在室温下搅拌30min。然后将混合物过滤，添加H2O(3mL)，用EA(2x9mL)萃取。将残余物经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩以得到残余物，将其通过制备型纯化以得到呈白色固体的化合物1.001(40mg，56％)。LCMS:[M+1]＝272。1H NMR(400MHz,DMSO):δ9.32(s,1H),8.09(s,1H),8.08-7.82(m,1H),7.31-7.29(m,1H),3.39-3.37(m,1H),3.01-2.98(m,1H),2.51-2.50(m,2H),2.19-2.10(m,1H),1.84-1.79(m,1H),1.78-1.40(m,2H),1.12(s,9H)。
实施例2：N-(9-氧代-2,3,4,4a,9,9a-六氢-1H-芴-7-基)新戊酰胺(化合物1.002)的合成
Figure BDA0003443861290000791
将化合物2.1(400mg，3.2mmol，1.0当量)和AlCl3(1.27g，9.5mmol，3.0当量)在苯(10mL)中的混合物在回流下加热2h。将反应用3M HCl淬灭，并且将水溶液用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层干燥并且浓缩至残余物，将其通过柱色谱法纯化(PE/EA＝100:1)以得到化合物2.2(150mg，25％)。
将化合物2.2(140mg，0.75mmol，1.0当量)在浓HNO3(1.3mL)和浓H2SO4(0.16mL)中的混合物在80℃下加热2h。添加水并且将粗混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层干燥并且浓缩至残余物，将其通过柱色谱法纯化(PE/EA＝30:1)以得到呈白色固体的化合物2.3(51mg，29％)。
将2.3(51mg，0.22mmol，1.0当量)、铁粉(62mg，1.1mmol，5.0当量)、NH4Cl(118mg，2.2mmol，10.0当量)在乙醇/水(v/v＝2:1，5mL/2.5mL)中的混合物在氮气气氛下在80℃下搅拌1h。反应完全后，滤出固体并且将滤液在真空中浓缩以提供2.4(30mg，68％)。
向2.4(30mg，0.15mmol，1.0当量)在THF(3mL)中的混合物中添加Na2CO3(63.6mg，0.60mmol，4.0当量)和2.5(36mg，0.30mmol，2.0当量)。将混合物在氮气气氛下在室温下搅拌30min。然后将混合物过滤，添加H2O(5mL)，用EA(5x3mL)萃取。将残余物经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩以得到残余物，将其通过制备型TLC纯化以得到呈白色固体的化合物1.002(12mg，28％)。LCMS:[M+1]＝286。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.36(s,1H),8.14(m,1H),7.91-7.85(m,1H),7.30-7.27(m,1H),3.15(s,1H),2.61(s,1H),2.18-2.21(m,1H),1.74-1.72(m,4H),1.58-1.53(m,3H),1.23(s,9H)。
实施例3：(9-氧代-9H-芴-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化合物1.003)的合成
Figure BDA0003443861290000792
在室温下向化合物3.1(224mg，1mmol，1.0当量)、Et3N(158mg，1.55mmol，1.55当量)和t-BuOH(120mg，1.62mmol，1.62当量)在甲苯(100mL)中的混合物中添加DPPA(413mg，1.5mmol，1.5当量)。将混合物在105℃下回流1h。通过LCMS监测反应。将反应混合物用水(20mL)稀释，过滤。将滤液用EA(2x20mL)萃取。将有机层合并，用水(30mL)、盐水(30mL)洗涤，干燥，过滤并且浓缩以得到残余物，将其通过制备型TLC纯化(PE/EA＝5:1)以得到呈黄色固体的化合物1.003(54mg，18％)。LCMS:[M+Na]＝318。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.67(s,1H),7.76(s,1H),7.75-7.63(m,2H),7.59-7.52(m,3H),7.29-7.25(m,1H),1.47(s,9H)。
实施例4：2-(叔丁基氨基)-9H-芴-9-酮(化合物1.004)的合成
Figure BDA0003443861290000801
向化合物4.1(200mg，0.772mmol，1.0当量)在PhMe(5mL)中的混合物中添加化合物12(67mg，0.927mmol，1.2当量)、Pd2(dba)3(1.3mg，0.00579mmol，0.0075当量)、BINAP(1.2mg，0.00193mmol，0.0025当量)和NaOtBu(104mg，1.08mmol，1.4当量)。将混合物在100℃下微波处理30min。通过LCMS监测反应。然后将混合物用水(5mL)淬灭。将沉淀的固体过滤，用THF(5mL)洗涤。将残余物通过制备型HPLC纯化以得到呈橙色固体的化合物1.004(5mg，3％)。LCMS:[M+1]＝252。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.50-7.35(m,4H),7.15-7.10(m,1H),6.92(s,1H),6.83(d,J＝8.0Hz,1H),5.83(s,1H),1.32(s,9H)。
实施例5：N-(9-氧代-9H-芴-2-基)新戊酰胺(化合物1.005)的合成
Figure BDA0003443861290000802
在0℃下在氮气气氛下向化合物5.1(1.5g，7.7mmol，1.0当量)和TEA(2.33g，23mmol，3.0当量)在DCM(50mL)中的混合物中添加化合物5(1.1g，9mmol，1.2当量)。将混合物在室温下搅拌1h。通过TLC监测反应。然后将混合物过滤，添加H2O(20mL)，用DCM(3x50mL)萃取。将残余物用EA处理并且过滤以得到呈橙色固体的化合物1.005(1.7g，79％)。TLC：DCM:MeOH＝20:1，UV 254nm。Rf(化合物5.1)＝0.3。Rf(化合物1.005)＝0.8。LCMS:[M+1]＝280。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.43(s,1H),7.98(s,1H),7.85-7.83(m,1H),7.73-7.69(m,2H),7.60-7.55(m,2H),7.35-7.26(m,1H),1.24(s,9H)。
实施例6：N-(6-甲氧基-9-氧代-9H-芴-2-基)新戊酰胺(化合物1.006)的合成
Figure BDA0003443861290000811
在氮气气氛下向化合物6.1(2.0g，7.7mmol，1.0当量)在甲苯(20mL)/EtOH(5mL)/H2O(5mL)中的溶液中添加化合物6.2(1.29g，8.5mmol，1.1当量)、Pd(PPh3)4(92mg，0.8mmol，0.1当量)和Na2CO3(2.4g，23.1mmol，3.0当量)。将混合物在90℃下搅拌2h。然后将混合物过滤并且用EA和H2O萃取，分离并且将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，在真空中浓缩。将残余物通过在硅胶上的柱色谱法纯化(PE/EA，20:1-15:1)以得到呈黄色油状物的化合物6.3(2.2g，100％)。TLC：PE:EA＝8:1，Rf(6.1)＝0.7，Rf(6.3)＝0.5。
Figure BDA0003443861290000812
向化合物6.3(2.2g，7.7mmol，1.0当量)在MeOH(20mL)/THF(20mL)中的溶液中添加2.5M NaOH(6.2mL，15.4mmol，2.0当量)。将混合物在室温下搅拌2h。然后向混合物中添加1MHCl以调节pH＝3，过滤并且在真空中干燥以得到呈白色固体的化合物6.4(1.78g，85％)。TLC：PE:EA＝1:3，Rf(6.3)＝1，Rf(6.4)＝0.1。
Figure BDA0003443861290000821
将化合物6.4(1.7g，6.2mmol，1.0当量)添加到PPA(30mL)中，将混合物在120℃下搅拌4h。然后将混合物倒入冰水中，过滤并且用H2O和MeOH洗涤，然后过滤并且在真空中干燥以得到的混合物呈黄色固体的化合物6.5a和6.5b(1.4g，89％)。TLC：PE:EA＝1:3，Rf(6.4)＝0.1，Rf(6.5)＝0.8,0.9。
Figure BDA0003443861290000822
向化合物6.5a和6.5b(0.7g，2.7mmol，1.0当量)在MeOH(30mL)/THF(30mL)中的溶液中添加Pd/C(70mg，10％wt)。将所得溶液在H2下在室温下搅拌3h。将混合物过滤并且在真空中浓缩以得到的混合物呈棕色固体的化合物6.6a和6.6b(0.57g，92％)。TLC：PE:EA＝1:1，Rf(6.5)＝0.6，Rf(6.6)＝0.4。
Figure BDA0003443861290000823
在氮气气氛下向化合物6.6a和6.6b(0.57g，2.5mmol，1.0当量)在干THF(20mL)中的溶液中添加Na2CO3(1.06g，10.0mmol，4.0当量)，然后添加新戊酰氯(1.5g，12.7mmol，5.0当量)。将混合物在室温下搅拌0.5h。然后将混合物用EA和H2O稀释，分离并且将有机层用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，在真空中浓缩。将残余物通过在硅胶上的柱色谱法纯化(PE/EA，6:1-2:1)以得到的混合物呈黄色固体的化合物6.7a和6.7b(0.46g，56％)。TLC：PE:EA＝1:1，Rf(6.6)＝0.4，Rf(6.7)＝0.5。
Figure BDA0003443861290000824
向化合物6.7a和6.7b(0.45g，1.45mmol，1.0当量)在DCM(30mL)中的溶液中添加PDC(1.6g，4.34mmol，3.0当量)和SiO2(1g)。将混合物在室温下搅拌2h。然后将混合物过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过在硅胶上的柱色谱法纯化(PE/EA，6:1-2:1)以得到呈黄色固体的化合物6.8a(0.17g，38％)和6.8b(0.28g，62％)。TLC：PE:EA＝2:1，Rf(6.7)＝0.2，Rf(6.8)＝0.3
Figure BDA0003443861290000825
向化合物6.8a(100mg，0.32mmol，1.0当量)在DCM(30mL)中的溶液中添加2M BBr3(1.6mL，3.2mmol，10.0当量)。将混合物在室温下搅拌0.5h。然后将混合物用MeOH淬灭并且用DCM和H2O萃取，分离并且将有机层用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化以得到呈黄色固体的化合物1.006(51mg，41％)。TLC:PE:EA＝1:1,Rf(6.8a)＝0.5,Rf(1.006)＝0.8。LCMS:[M+1]+＝296。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.31(s,1H),7.78-7.75(m,1H),7.59-7.58(m,1H),7.40-7.38(m,1H),7.33(s,1H),7.30-7.27(m,1H),6.92-6.90(m,1H),6.67-6.64(m,1H),1.27(s,9H)。
实施例7：N-(7-羟基-9-氧代-9H-芴-2-基)新戊酰胺(化合物1.007)的合成
Figure BDA0003443861290000831
将7.1(1.3g，5mmol，1.0当量)和水(6mL)的混合物在110℃下加热。然后逐滴添加HNO3(65％，6mL)和H2SO4(96％，9mL)。将混合物在110℃下加热6h。添加水并且将粗产物过滤，用水洗涤，并且干燥。将化合物与丙酮一起磨碎以得到呈黄色固体的化合物7.2(1g，67％)。
将2(100mg，0.32mmol，1.0当量)、铁粉(92mg，1.64mmol，5.0当量)、NH4Cl(175mg，3.28mmol，10.0当量)在乙醇/水(v/v＝2:1，6mL/3mL)中的混合物在氮气气氛下在80℃下搅拌1h。反应完全后，滤出固体并且将滤液在真空中浓缩。然后将残余物通过制备型TLC纯化(PE/EA，1:1)以提供7.3(70mg，78％)。
向7.3(70mg，0.255mmol，1.0当量)在THF(5mL)中的混合物中添加Na2CO3(108mg，1.02mmol，4.0当量)和7.4(62mg，0.51mmol，2.0当量)。将混合物在氮气气氛下在室温下搅拌30min。然后将混合物过滤，添加H2O(6mL)，用EA(2x8mL)萃取。将残余物经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC纯化以得到呈黄色固体的7.5(80mg，88％)。
将化合物7.5(40mg，0.112mmol，1.0当量)、B2(OH)4(50mg，0.556mmol，5.0当量)、XPhosPdG2(10mg，0.011mmol，0.1当量)、XPhos(12mg，0.022mmol，0.2当量)、KOAc(54mg，0.556mmol，5.0当量)在EtOH(6mL)中的混合物用N2脱气三次并且加热至80℃持续3h。通过TLC监测反应。去除溶剂以提供呈黄色固体的粗化合物7.6(40mg)。
将化合物7.6溶解在THF(5mL)和乙酸(0.4mL)中，并且用过氧化氢(1.6mL)处理。将反应搅拌15min并且然后用饱和NaHSO3水溶液淬灭。将反应用EtOAc(2.x.10mL)萃取。将有机层合并，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩成残余物，将其通过制备型TLC纯化(PE/EA＝1:1)以得到呈黄色固体的化合物1.007(10.5mg，32％)。LCMS:[M+1]＝296。1H NMR(400MHz,DMSO):δ9.97(s,1H),9.35(s,1H),7.88(s,1H),7.77-7.15(m,1H),7.53-7.47(m,2H),6.94-6.90(m,2H),1.25-1.23(m,9H)。
实施例8：N-(7-氨基-9-氧代-9H-芴-2-基)新戊酰胺(化合物1.008)的合成
Figure BDA0003443861290000841
向化合物8.5(5g，18.5mmol，1.0当量)在EtOH(200mL)中的混合物中添加在H2O(345mL)中的Na2S·9H2O(20g，83.2mmol，4.5当量)和NaOH(8g，200mmol，10.8当量)。将混合物在室温下回流5h，然后在0℃下搅拌过夜。通过TLC监测反应。然后将混合物过滤，用H2O(2x50mL)、5％NaOH(2x50mL)、H2O(3x50mL)、冷EtOH(2x25mL)、醚(25mL)和己烷(20mL)洗涤以得到化合物8.6(3.2g，82％)。
Figure BDA0003443861290000842
向化合物8.6(200mg，0.952mmol，1.0当量)在THF(10mL)中的混合物中添加Na2CO3(202mg，1.9mmol，2.0当量)和化合物8.4(114mg，0.952mmol，1.0当量)。将混合物在-78℃下搅拌1h。通过TLC监测反应。然后将混合物用水(10mL)淬灭。将沉淀的固体过滤，用THF(10mL)洗涤。将残余物通过制备型HPLC纯化以得到呈黑色固体的化合物1.008(5mg，4％)。LCMS:[M+42]＝336。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.30(s,1H),7.81(s,1H),7.70(d,J＝8.0Hz,1H),7.45-7.30(m,2H),6.85(s,1H),6.73(d,J＝8.0Hz,1H),1.22(s,9H)。
实施例9：N-(9-氧代-9H-芴-2-基)乙酰胺(化合物1.009)的合成
Figure BDA0003443861290000843
向9.1(50mg，0.26mmol，1.0当量)在THF(3mL)中的混合物中添加Na2CO3(83mg，0.78mmol，3.0当量)和9.2(41mg，0.52mmol，2.0当量)。将混合物在氮气气氛下在室温下搅拌30min。然后将混合物过滤，添加H2O(5mL)，用EA(3x5mL)萃取。将残余物与MeOH一起磨碎以得到呈红色固体的化合物1.009(35mg，58％)。LCMS:[M+1]＝238。1H NMR(400MHz,DMSO):δ10.19(s,1H),7.92(s,1H),7.70-7.65(m,3H),7.57-7.54(m,2H),7.31-7.27(m,1H),2.06(s,3H)。
实施例10：3,3-二甲基-3,6-二氢-2H-1,4-噁嗪4-氧化物(化合物1.010)的合成
Figure BDA0003443861290000851
如实施例5中所述制备化合物1.005。向化合物1.005(62mg，0.22mmol)在甲醇(3mL)中的混合物中添加NaBH4(10mg，0.26mmol)。在LC-MS和TLC分析中观察不到起始材料后，将反应混合物浓缩以去除甲醇。将所得残余物通过在硅胶上的pTLC纯化以得到39mg产物(化合物1.010)，产率为63％。TLC：己烷/乙酸乙酯＝3/1；Rf(起始材料)＝0.6；Rf(化合物1.010)＝0.2；LC-MS(ESI):282.4[M+H]+；1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.82(s,1H),7.64-7.53(m,4H),7.34-7.26(m,2H),5.49(s,1H),1.32(s,9H)。
实施例11：1,1’-(9-氧代-9H-芴-2,7-二基)二脲(化合物1.011)的合成
Figure BDA0003443861290000852
如实施例8中所述制备化合物8.6。向化合物8.6(50mg，0.238mmol，1.0当量)在HOAc/H2O(5mL/10mL)中的混合物中添加在H2O(6mL)中的氰酸钠(61.97mg，0.952mmol，4.0当量)。将混合物在50℃下搅拌2h。通过TLC监测反应。然后将混合物用水(5mL)淬灭。将沉淀的固体过滤，用EA(20mL)萃取。将残余物通过制备型HPLC纯化以得到呈棕色固体的化合物1.013(7mg，10％)。LCMS:[M+42]＝338。1H NMR(400MHz,DMSO):δ8.74(s,2H),7.71(s,2H),7.45-7.30(m,4H),5.92(s,4H)。
实施例12：N,N’-(9-氧代-9H-芴-2,7-二基)二乙酰胺(化合物1.012)的合成
Figure BDA0003443861290000853
如实施例8中所述制备化合物8.6。向化合物8.6(50mg，0.238mmol，1.0当量)在THF(10mL)中的混合物中添加Na2CO3(100.95mg，0.952mmol，4.0当量)和AcCl(74.82mg，0.952mmol，4.0当量)。将混合物在室温下搅拌10min。通过TLC监测反应。然后将混合物用水(10mL)淬灭。将沉淀的固体过滤，用THF(10mL)洗涤。将残余物通过制备型HPLC纯化以得到呈红色固体的化合物1.012(5mg，7％)。LCMS:[M+42]＝336。1H NMR(400MHz,DMSO):δ10.17(s,2H),7.90(s,2H),7.65-7.55(m,4H),2.07(s,6H)。
实施例13：N-(9-(羟基亚氨基)-9H-芴-2-基)新戊酰胺(化合物1.013)的合成
Figure BDA0003443861290000861
如实施例5中所述制备化合物1.005。向化合物1.005(200mg，0.72mmol，1.0当量)在EtOH(5mL)中的混合物中添加HONH2·HCl(100mg，1.44mmol，2.0当量)。将混合物在室温下回流16h。通过TLC监测反应。然后将混合物用水(5mL)淬灭。将沉淀的固体过滤。将残余物经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC纯化(PE:EA，5:1)4次以得到呈黄色固体的化合物1.013(4mg，2％)。TLC：PE:EA＝2:1，UV 254nm。Rf(化合物1.013)＝0.5。LCMS:[M+42]＝336。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.34(d,J＝8.0Hz,1H),7.91(s,1H),7.70-7.60(m,2H),7.55-7.50(m,1H),7.42-7.36(m,1H),7.28-7.24(m,1H),1.31(s,9H)。
实施例14：N-(3-羟基-9-氧代-9H-芴-2-基)新戊酰胺(化合物1.014)的合成
Figure BDA0003443861290000862
将化合物14.1(100mg，0.51mmol，1.0当量)溶解在HOAc(2.0mL)中。在室温下逐滴添加Br2(100mg，0.61mmol，1.2当量)。将混合物在室温下搅拌1h。添加水并且将固体过滤，将其用水洗涤以得到呈黄色固体的化合物14.2(140mg，81％)。
向14.2(140mg，0.42mmol，1.0当量)在THF(3mL)中的混合物中添加Na2CO3(134mg，1.26mmol，3.0当量)和14.3(100mg，0.84mmol，2.0当量)。将混合物在氮气气氛下在室温下搅拌30min。然后将混合物过滤，添加H2O(5mL)，用EA(3x5mL)萃取。将残余物经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩以得到呈黄色固体的14.4(100mg，66％)。
将化合物14.4(100mg，0.28mmol，1.0当量)、B2(OH)4(125mg，1.40mmol，5.0当量)、XPhosPdG2(23mg，0.03mmol，0.1当量)、XPhos(29mg，0.06mmol，0.2当量)、KOAc(137mg，1.40mmol，5.0当量)在EtOH(10mL)中的混合物用N2脱气三次并且加热至80℃持续6h。通过TLC监测反应。去除溶剂以得到粗黄色残余物。将此粗油状物溶解在THF(4mL)和乙酸(0.5mL)中并且用过氧化氢(2mL)处理。将反应搅拌15min并且然后用饱和NaHSO3水溶液淬灭。将反应用EtOAc(3x40mL)萃取。将有机层合并，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩成残余物，将其通过制备型HPLC纯化以得到呈黄色固体的化合物1.014(15mg，18％)。LCMS:[M+1]＝296。1H NMR(400MHz,DMSO):δ8.56(s,1H),8.12(s,1H),7.66-7.65(m,1H),7.58-7.52(m,2H),7.36-7.32(m,1H),7.23(s,1H),1.27(m,9H)。
实施例15：N-(9-氨基-9H-芴-2-基)新戊酰胺(化合物1.015)的合成
Figure BDA0003443861290000871
如实施例5中所述制备化合物1.005。向化合物1.005(50mg，0.18mmol，1.0当量)在EtOH(3mL)中的混合物中添加HONH2·HCl(100mg，1.44mmol，8.0当量)。将混合物在室温下回流过夜。然后将混合物浓缩并且溶解在AcOH(6mL)中。向混合物中添加Zn(120mg，1.85mmol，10.0当量)。将混合物在80℃下回流2h。通过TLC监测反应。然后将混合物过滤，经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将残余物用EA处理并且过滤以得到呈白色固体的化合物1.015(14mg，28％)，呈AcOH形式。LCMS:[M+42]＝322。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.28(s,1H),7.98(s,1H),7.70-7.60(m,4H),7.35-7.25(m,2H),4.72(s,1H),1.90(s,3H),1.25(s,9H)。
实施例16：N-(6-羟基-9-氧代-9H-芴-2-基)新戊酰胺(化合物1.016)的合成
Figure BDA0003443861290000872
如实施例6中所述制备化合物6.8b。向化合物6.8b(230mg，0.74mmol，1.0当量)在DCM(30mL)中的溶液中添加2M BBr3(3.7mL，7.4mmol，10.0当量)。将混合物在室温下搅拌0.5h。然后将混合物用MeOH淬灭并且用DCM和H2O萃取，分离并且将有机层用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化以得到呈黄色固体的化合物1.016(4.7mg，5％)。LCMS:[M+1]+＝296。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.76-7.75(m,1H),7.68-7.65(m,1H),7.49-7.42(m,2H),6.95-6.94(m,1H),6.61-6.58(m,1H),1.29(s,9H)。
实施例17：N-(9-羟基-9H-芴-2-基)甲酰胺(化合物1.017)的合成
Figure BDA0003443861290000873
向化合物17.1(100mg，0.513mmol，1.0当量)在甲酸(3mL)中的混合物中添加Ac2O(3滴)。将混合物在室温下搅拌0.5h。将反应通过水淬灭并且过滤。将滤饼溶解在EA中并且用Na2SO4干燥。去除EA以得到呈浅黄色固体的化合物17.2(105mg，92％)。
在0℃下向化合物17.2(105mg，0.471mmol，1.0当量)在MeOH(10mL)中的混合物中添加NaBH4(54mg，1.41mmol，3.0当量)。将混合物搅拌0.5h。将混合物用EA和水萃取。将有机层经Na2SO4干燥并且在压力下浓缩以得到残余物，将其通过MeOH洗涤以得到呈白色固体的化合物1.017(70mg，66％)。LCMS:[M-1]-＝224。1H NMR(400MHz,DMSO):δ10.23(s,1H),8.27(s,1H),7.88(s,1H),7.68-7.66(m,2H),7.51(d,J＝7.6Hz,1H),7.36-7.18(m,2H),5.81(m,1H),5.41(d,J＝7.6Hz,1H)。
实施例18：2-(甲基氨基)-9H-芴-9-醇(化合物1.018)的合成
Figure BDA0003443861290000881
将化合物18.1(1g，3.88mmol，1.0当量)、化合物18.2(520mg，7.76mmol，2.0当量)、Pd2(dba)3(348mg，0.38mmol，0.1当量)、BINAP(486mg，0.78mmol，0.2当量)和NaOtBu(1.49g，15.52mmol，4.0当量)在PhMe(10mL)中的混合物在100℃下回流16h。通过TLC监测反应。然后将混合物用H2O(10mL)稀释，用EA(3x10mL)萃取。将有机层用盐水洗涤。将残余物经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过在硅胶上的柱色谱法纯化(PE/EA，5:1)以得到化合物18.3(500mg，62％)。TLC：PE:EA＝5:1，UV 254nm。Rf(化合物18.1)＝0.7。Rf(化合物18.3)＝0.5。
在氮气气氛下向化合物18.3(500mg，2.39mmol，1.0当量)在MeOH(5mL)中的混合物中添加NaBH4(181mg，4.78mmol，2.0当量)。将混合物在室温下搅拌2h。通过TLC监测反应。然后将混合物用H2O淬灭，用EA(2x10mL)萃取。将有机层用盐水洗涤。将残余物经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化以得到呈黄色固体的化合物1.018(150mg，30％)。LCMS:[M+42]＝253 1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ7.64-7.60(m,2H),7.52-7.48(m,1H),7.30-7.25(m,1H),7.24-7.20(m,1H),7.13(s,1H),6.93-6.89(m,1H),5.40(s,1H),2.83(s,3H)。
实施例19：N-(3-氧代-2,3-二氢-1H-茚-5-基)乙酰胺(化合物1.019)的合成
Figure BDA0003443861290000882
向化合物19.1(1g，5.6mmol，1.0当量)在CH3OH(20mL)中的溶液中添加Pd/C(100mg，10％wt)。将所得溶液在H2下在室温下搅拌14h。将混合物过滤以得到滤液，在真空中去除以得到呈棕色固体的化合物19.2(0.8g，96％)，其不经进一步纯化而直接用于下一步骤。
在N2下在0℃下向化合物19.2(100mg，0.68mmol，1.0当量)和TEA(206mg2.04mmol，3.0当量)在DMF(10mL)中的混合物中缓慢添加化合物19.3。将混合物温热至室温并且搅拌14h。将反应混合物倒入50ml水中并且用EA(3x50ml)萃取。将有机相用盐水洗涤并且经无水Na2SO4干燥。将混合物在减压下浓缩以得到残余物，将残余物通过在硅胶上的柱色谱法纯化(PE:EA＝3:1)以获得呈白色固体的化合物1.019(70mg，45％)。TLC：PE:EA＝3:1，Rf(化合物1.019)＝0.4，LC-MS:[M+MeCN+H]+＝273.15。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(dd,J＝4.0and8.0Hz,1H),7.66(d,J＝4.0,1H),7.54(s,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,2H),3.10(m,J＝8.0Hz,2H)。
实施例20：的合成N-(9-乙氧基-9H-芴-2-基)乙酰胺(化合物1.021)和N-(9-羟基-9H-芴-2-基)乙酰胺(化合物1.029)
Figure BDA0003443861290000891
在0℃下向化合物20.1(100mg，0.42mmol，1.0当量)在四氢呋喃/甲醇(3mL/1mL)中的混合物中添加硼氢化钠(32mg，0.84mmol，2.0当量)。将混合物在氮气气氛下在室温下搅拌30min。通过TLC监测反应。然后向混合物中添加水(3mL)、乙酸乙酯(3mL)并且过滤。将残余物经硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以获得呈白色固体的化合物1.029(61mg，61％)。TLC：石油醚:乙酸乙酯，1:1，UV 254nm。Rf：(化合物20.1)＝0.5；Rf：(化合物1.029)＝0.2。LCMS:[M-1]:238。1H NMR(DMSO,400MHz):δ9.84(s,1H),7.89(s,1H),7.65-7.62(m,2H),7.52-7.48(t,J＝8.0Hz,2H),7.33-7.29(t,J＝7.4Hz,1H),7.23-7.20(t,J＝7.2Hz,1H),5.79(s,1H),5.39(s,1H)和2.04-2.03(d,J＝1.6Hz,3H)。
Figure BDA0003443861290000892
将化合物1.029(80mg，0.33mmol，1.0当量)、氧化银(465mg，2.0mmol，6.0当量)和碘乙烷(156mg，1.0mmol，3.0当量)在1,2-二氯乙烷(5mL)中的混合物在60℃下搅拌16h。通过LCMS监测反应。然后将混合物过滤。将残余物经硫酸钠干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC纯化以获得呈浅黄色固体的化合物1.021(20mg，12％)。LCMS:[M+1]:268。1HNMR(DMSO,400MHz):δ10.05(s,1H),7.89(s,1H),7.70.7.68(d,J＝8.0Hz,2H),7.57-7.52(m,2H),7.38-7.35(t,J＝7.2Hz,1H),7.27-7.23(t,J＝7.4Hz,1H),5.52(s,1H),3.36-3.32(m,2H),2.05(s,3H)和1.10-1.07(t,J＝7.0Hz,3H)。
实施例21：乙酸2-乙酰胺基-9H-芴-9-基酯(化合物1.022)的合成
Figure BDA0003443861290000893
将化合物1.029(50mg，0.21mmol，1.0当量)和4-二甲基氨基吡啶(2.44mg，0.02mmol，0.1当量)在乙酸/乙酸酐(1mL/1mL)中的混合物在70℃下搅拌16h。通过LCMS监测反应。然后将混合物过滤，添加水(2mL)，用乙酸乙酯(3x2mL)萃取。然后将混合物用甲醇洗涤以获得呈白色固体的化合物1.022(8mg，14％)。LCMS:[M+23]:304。1H NMR(DMSO,400MHz):δ10.07(s,1H),7.79(s,1H),7.73-7.71(d,J＝8.0Hz,2H),7.65-7.63(dd,J＝8.4Hz,1.4Hz,1H),7.51-7.49(d,J＝7.2Hz,1H),7.42-7.39(t,J＝7.6Hz,1H),7.27-7.23(t,J＝7.4Hz,1H),6.66(s,1H),2.14-2.12(d,J＝4.8Hz,3H)和2.03(s,3H)。
实施例22：N-(9-乙氧基-9H-芴-2-基)新戊酰胺(化合物1.023)的合成
Figure BDA0003443861290000901
如实施例10中所述制备化合物1.010。将化合物1.010(100mg，0.356mmol，1.0当量)、氧化银(247mg，1.068mmol，3.0当量)和碘乙烷(166mg，1.068mmol，3.0当量)在1,2-二氯乙烷(10mL)中的混合物在65℃下搅拌16h。通过LCMS监测反应。然后将混合物过滤。将残余物经硫酸钠干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC纯化以获得呈白色固体的化合物1.023(13mg，12％)。TLC：石油醚:乙酸乙酯，5:1，UV 254nm。Rf：(化合物1.010)＝0.1；Rf：(化合物1.023)＝0.5。LCMS:[M+1]:310。1H NMR(DMSO,400MHz):δ9.29(s,1H),7.94(s,1H),7.72-7.67(m,3H),7.54-7.53(d,J＝7.6Hz,1H),7.38-7.34(t,J＝7.2Hz,1H),7.27-7.23(td,J＝7.4Hz,0.8Hz,1H),5.51(s,1H),3.42-3.35(m,2H),1.23(s,9H)和1.18-1.07(m,3H)。
实施例23：乙酸2-新戊酰胺基-9H-芴-9-基酯(化合物1.024)的合成
Figure BDA0003443861290000902
如实施例10中所述制备化合物1.010。将化合物1.010(50mg，0.178mmol，1.0当量)和4-二甲基氨基吡啶(21.7mg，0.178mmol，1.0当量)在乙酸/乙酸酐(3mL/3mL)中的混合物在70℃下搅拌16h。通过TLC监测反应。然后将混合物过滤，添加水(5mL)，用乙酸乙酯(3x5mL)萃取。然后将混合物用甲醇洗涤以获得呈白色固体的化合物1.024(23mg，40％)。TLC：石油醚:乙酸乙酯，5:1，UV 254nm。Rf：(化合物1.010)＝0.1；Rf：(化合物1.024)＝0.4。LCMS:[M-1]:322。1H NMR(DMSO,400MHz):δ9.34(s,1H),7.86(s,1H),7.74-7.73(m,3H),7.51-7.49(m,1H),7.41(m,1H),7.26(m,1H),6.68(s,1H),2.15(s,3H)和1.22(s,9H)。
实施例24：N-(9-甲氧基-9H-芴-2-基)新戊酰胺(化合物1.025)的合成
Figure BDA0003443861290000903
如实施例10中所述制备化合物1.010。将化合物1.010(50mg，0.178mmol，1.0当量)、氧化银(123.7mg，0.534mmol，3.0当量)和碘甲烷(38mg，0.267mmol，1.5当量)在1,2-二氯乙烷(10mL)中的混合物在40℃下搅拌16h。通过LCMS监测反应。然后将混合物过滤。将残余物经硫酸钠干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC纯化以获得呈白色固体的化合物1.025(6.6mg，12.5％)。TLC：石油醚:乙酸乙酯，5:1，UV 254nm。Rf：(化合物1.010)＝0.1；Rf：(化合物1.025)＝0.5。LCMS:[M+23]:318。1H NMR(DMSO,400MHz):δ9.29(s,1H),7.95(m,1H),7.72-7.70(m,3H),7.54-7.53(m,1H),7.38-7.36(m,1H),7.28-7.27(m,1H),5.51(s,1H),3.09(s,3H)和1.30-1.23(m,9H)。
实施例25：N-(9-氰基-9H-芴-2-基)新戊酰胺(化合物1.026)的合成
Figure BDA0003443861290000911
向化合物21.1(52.4mg，0.27mmol，1.5当量)在乙醇(5mL)中的混合物中添加tBuOK(30mg，0.27mmol，1.5当量)并且在室温下搅拌5min。向混合物中添加如实施例5中所述制备的化合物1.005(50mg，0.18mmol，1.0当量)。将混合物在氮气气氛下在室温下搅拌2h。通过TLC监测反应。然后将混合物过滤，添加水(20mL)，用乙酸乙酯(3x20mL)萃取。将有机层用盐水洗涤。将残余物经硫酸钠干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC纯化以获得呈白色固体的化合物1.026(20mg，38％)。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.80(s,1H),7.68-7.58(m,4H),7.53-7.33(m,4H),4.56(s,1H)和1.31(s,9H)。
实施例26：二乙酸9-氧代-9H-芴-2,7-二基酯(化合物1.027)的合成
Figure BDA0003443861290000912
将化合物22.1(50mg，0.236mmol，1.0当量)、乙酸酐(96.28mg，0.944mmol，4.0当量)和4-二甲基氨基吡啶(2.879mg，0.0236mmol，0.1当量)在吡啶(10mL)中的混合物在室温下搅拌5min。通过LCMS监测反应。然后将混合物过滤，添加水(5mL)，用乙酸乙酯(3x5mL)萃取。然后将混合物用1N HCl洗涤。将残余物通过制备型HPLC纯化以获得呈黄色固体的化合物1.027(5.3mg，7.5％)。LCMS:[M+42]:338。1H NMR(DMSO,400MHz):δ8.85-7.83(m,1H),7.41-7.42(m,2H),7.39-7.37(m,2H)和2.30(s,6H)。
实施例27：N-(9-(羟基亚氨基)-9H-芴-2-基)新戊酰胺(化合物1.028)的合成
Figure BDA0003443861290000921
如实施例5中所述制备化合物1.005。向化合物1.005(200mg，0.72mmol，1.0当量)在乙醇(5mL)中的混合物中添加化合物22.1(100mg，1.44mmol，2.0当量)。将混合物在氮气气氛下在回流下搅拌16h。通过TLC监测反应。然后将混合物经硫酸钠干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过在硅胶上的柱色谱法纯化以获得呈白色固体的化合物1.028(150mg，71％)。TLC：石油醚:乙酸乙酯，2:1，UV 254nm。Rf：(化合物1.005)＝0.4；Rf：(化合物1.028)＝0.2。LCMS:[M+42]:336。1H NMR(CD3OD,400MHz):δ8.58(s,1H),7.67-7.62(m,4H),7.34-7.32(m,1H),7.24-7.22(m,1H),4.56(s,1H)和1.30(s,9H)。
实施例28：新戊酸9-羟基-9H-芴-2-基酯(化合物1.030)的合成
Figure BDA0003443861290000922
将化合物24.1(100mg，0.51mmol，1.0当量)和碳酸钠(162mg，1.53mmol，3.0当量)在THF(10mL)中的溶液冷却至0℃并且添加化合物24.2(74mg，0.61mmol，1.2当量)。将所得混合物从0℃至室温搅拌过夜。通过TLC监测反应混合物的进程。反应完成后，将混合物过滤，用水(1500mL)稀释并且然后用二氯甲烷(100mL)萃取。将有机层经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过制备型TLC纯化(PE/EtOAc＝10:1)以提供呈黄色固体的化合物24.3(105mg，73％)。
在氮气气氛下向化合物24.3(105mg，0.375mmol，1.0当量)在甲醇(5mL)中的溶液中添加硼氢化钠(17mg，0.45mmol，1.2当量)。将所得溶液在室温下搅拌1小时。通过TLC监测反应混合物的进程。反应完成后，将混合物在减压下浓缩并且将残余物通过制备型TLC纯化(PE/EtOAc＝10:1)。获得呈黄色固体的希望的化合物1.030，20.1mg，产率为19％。TLC：己烷/乙酸乙酯(10:1)。Rf：(化合物24.3)＝0.5；Rf：(化合物1.030)＝0.3；LC-MS:281.00[M-1]-。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.64-7.57(m,3H),7.40-7.27(m,3H),7.08-7.03(m,1H),5.55(s,1H),3.46(s,1H),1.36(s,9H)。
实施例29：N-(9-羟基-9H-芴-2-基)四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺(化合物1.031)的合成
Figure BDA0003443861290000923
将化合物25.1(160mg，1.23mmol，1.0当量)在亚硫酰氯(5mL)中的混合物在氮气气氛下在85℃下回流2h。通过TLC监测反应。然后将混合物用水稀释，过滤，用水洗涤。将残余物经硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以获得化合物25.2(160mg，粗品)，其不经进一步纯化而直接用于下一步骤。
在0℃下向化合物25.3(190mg，1.03mmol，1.0当量)和碳酸钠(436.72mg，4.12mmol，4.0当量)在干四氢呋喃(10mL)中的混合物中添加化合物25.2(160mg，1.23mmol，1.2当量)。将混合物在氮气气氛下在室温下搅拌过夜。通过LCMS监测反应。然后将混合物用水稀释，过滤，用水洗涤。将残余物经硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以获得呈黄色固体的化合物25.4(260mg，粗品)。TLC：石油醚:乙酸乙酯，5:1，UV 254nm。Rf：(化合物25.3)＝0.5，Rf：(化合物25.4)＝0.45。
在0℃下向化合物25.4(150mg，0.488mmol，1.0当量)在甲醇(5mL)中的混合物中添加硼氢化钠(92.32mg，2.44mmol，4.5当量)。将混合物在氮气气氛下在室温下搅拌5min。通过TLC监测反应。向混合物中添加水，然后将其过滤并且用水洗涤。将残余物经硫酸钠干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化以获得呈白色固体的化合物1.031(73mg，48％)。TLC：石油醚:乙酸乙酯，5:1，UV 254nm。Rf：(化合物25.4)＝0.6；Rf：(化合物1.031)＝0.2。LCMS:[M+1]:310。1H NMR(DMSO,400MHz):δ9.57(s,1H),8.02(s,1H),7.63(m,2H),7.57(m,1H),7.50(m,1H),7.33-7.29(m,1H),7.24-7.20(m,1H),5.40(s,1H),4.02-3.99(m,2H),3.52-3.46(m,1H),1.91-1.81(m,2H)和1.56-1.43(m,4H)。
实施例30：4-羟基-N-(9-羟基-9H-芴-2-基)苯甲酰胺(化合物1.032)的合成
Figure BDA0003443861290000931
将化合物26.1(216mg，1.2mmol，1.0当量)在亚硫酰氯(2mL)中的混合物在氮气气氛下在80℃下搅拌1h。通过TLC监测反应。然后将混合物用甲醇淬灭。将残余物经硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以获得呈浅黄色油状物的化合物26.2(245mg，粗品)，其不经进一步纯化而直接用于下一步骤。
在0℃下向化合物26.3(195mg，1.0mmol，1.0当量)和碳酸钠(530mg，5.0mmol，5.0当量)在干四氢呋喃(5mL)中的混合物中添加化合物26.2(238.2mg，1.2mmol，1.2当量)。在氮气气氛下将混合物在室温下搅拌2h。通过LCMS监测反应。然后将混合物过滤并且将滤液在减压下浓缩以获得呈浅黄色固体的化合物26.4(530mg，粗品)，其不经进一步纯化而直接用于下一步骤。
向化合物26.4(530mg，1.0mmol，1.0当量)在四氢呋喃(5mL)中的溶液中添加碳酸钾(276mg，2.0mmol，2.0当量)。将混合物在氮气气氛下在室温下搅拌过夜。通过LCMS监测反应。然后将悬浮液过滤并且将滤液在减压下浓缩以获得呈红色固体的化合物26.5(400mg，粗品)，其不经进一步纯化而直接用于下一步骤。
在0℃下向化合物26.5(400mg，1.27mmol，1.0当量)在甲醇(5mL)中的混合物中添加硼氢化钠(129mg，3.81mmol，3.0当量)。将混合物在氮气气氛下在室温下搅拌4h。通过TLC监测反应。将溶液通过酸制备型HPLC纯化以获得呈白色固体的化合物1.032(86.7mg，21％)。LCMS:[M+1]:318。1H NMR(DMSO,400MHz):δ10.07-10.05(d,J＝9.2Hz,2H),8.06(s,1H),7.84(m,2H),7.60(m,3H),7.52(m,1H),7.31(m,1H),7.21(m,1H),6.85-6.83(d,J＝8.4Hz,2H),5.82-5.80(d,J＝7.6Hz,1H)和5.44-5.42(d,J＝7.6Hz,1H)。
实施例31：3-(9-羟基-9H-芴-2-基)-1,1-二甲基脲(化合物1.033)的合成
Figure BDA0003443861290000941
在空气下将化合物27.1(200mg，1.026mmol，1.0当量)、化合物27.2(220mg，2.05mmol，2.0当量)、4-二甲基氨基吡啶(125mg，1.02mmol，1.0当量)和吡啶(324mg，4.1mmol，4.0当量)顺序地添加到配备有搅拌棒和隔垫的反应管中。通过注射筒添加二氯甲烷(10mL)，将所得混合物在环境温度下剧烈搅拌24h。在此时间之后，将烧瓶的内容物用乙酸乙酯萃取。将获得的溶液通过硅胶和无水硫酸镁的塞过滤，并且然后通过旋转蒸发浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化，用己烷/乙酸乙酯洗脱，以提供化合物27.3(150mg，55％)。TLC：石油醚:乙酸乙酯，2:1，UV 254nm Rf：(化合物27.1)＝0.5；Rf：(化合物27.3)＝0.2。
在0℃下向化合物27.3(120mg，0.45mmol，1.0当量)在甲醇(5mL)中的混合物中添加硼氢化钠(68.6mg，1.8mmol，4.0当量)。将混合物在氮气气氛下在室温下搅拌1h。通过TLC监测反应。然后向混合物中添加水，过滤并且用水洗涤。将残余物经硫酸钠干燥并且在减压下浓缩。将残余物用甲醇洗涤以获得呈白色固体的化合物1.033(46mg，81％)。TLC：石油醚:乙酸乙酯，3:1，UV 254nm。Rf：(化合物27.3)＝0.5；Rf：(化合物1.033)＝0.3。LCMS:[M+1]:269。1H NMR(d6-DMSO,400MHz):δ8.33(s,1H),7.75(s,1H),7.55(m,2H),7.50-7.48(d,J＝7.2Hz,1H),7.44-7.43(d,J＝2.0Hz,1H),7.42-7.41(d,J＝1.6Hz,1H),7.29-7.27(m,1H),7.21-7.19(m,1H),5.74-5.72(d,J＝7.6Hz,1H),5.38-5.36(d,J＝7.6Hz,1H)和2.91(s,6H)。
实施例32：2,2,2-三氯-N-(9-羟基-9H-芴-2-基)乙酰胺(化合物1.034)的合成
Figure BDA0003443861290000942
在0℃下向化合物27.1(150mg，0.77mmol，1.0当量)和碳酸钠(326mg，3.08mmol，4.0当量)在干四氢呋喃(6mL)中的混合物中添加化合物28.1(277mg，1.54mmol，2.0当量)。在氮气气氛下将混合物在室温下搅拌10min。通过TLC监测反应。然后将混合物用水稀释，过滤，用水洗涤。将残余物经硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以获得呈白色固体的化合物28.2(150mg，58％)。TLC：石油醚:乙酸乙酯，2:1，UV 254nm，Rf：(化合物27.1)＝0.4；Rf：(化合物28.2)＝0.6。
向化合物28.2(150mg，0.44mmol，1.0当量)在甲醇(5mL)中的混合物中添加硼氢化钠(68mg，1.76mmol，4.0当量)。将混合物在氮气气氛下在室温下搅拌1h。通过TLC监测反应。然后将混合物用饱和氯化铵淬灭，用水稀释，过滤并且用水洗涤。将残余物经硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以获得呈白色固体的化合物1.034(45mg，30％)。LCMS:[M+1]:343。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ10.86(s,1H),7.91(s,1H),7.77-7.71(dd,J＝16.0Hz 8.0Hz,2H),7.62-7.60(d,J＝8.0Hz,1H),7.55-7.54(d,J＝7.6Hz,1H),7.35-7.33(m,1H),7.29-7.27(m,1H),5.88-5.86(d,J＝7.6Hz,1H)和5.47-5.45(d,J＝7.6Hz,1H)。
实施例33：分离和使用式I的化合物增强源自非动员外周血的造血干细胞
本实施例证明了在用式I的化合物的培养物中HSC的增强。
材料和方法
从供体外周血中分离CD34+细胞。使用ficoll paque进行标准血沉棕黄层分离。将细胞沉淀并且与未标记的CD64抗体一起孵育。然后使用生物素化的CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11b、CD14、CD16、CD19、CD20、CD45RA、CD56、CD235(在一些实施例中，也可以使用CD15、CD25和其他谱系特异性抗体)使细胞经受阴性耗尽。使用链霉抗生物素珠耗尽结合这些抗体的细胞。然后使富集的祖细胞汇集物经受针对CD34+的细胞分选。
将分离的CD34+细胞在含10％(v/v)热灭活胎牛血清(FBS)的不含酚红的αMEM的体外培养基中孵育。当测试式I的化合物时，使用两种内部对照：阳性对照(+SF条件)和基线对照(即，基本条件(“仅细胞因子”))。
表2中描述了用于测试的化合物的培养基组分和浓度。培养物还包含含有青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素溶液，以避免污染。包括对照，因为所获得的样品中的扩增量因个体而异。
表2：基本条件(仅细胞因子)；阳性对照(+SF条件)；和+式I条件(添加式I的化合物的条件)的培养基中包含的另外组分。
Figure BDA0003443861290000951
Figure BDA0003443861290000961
在3％氧气(由氮气控制)和5％CO2下孵育培养物。
在每次需要更新培养基时，单独添加小分子组分并且是新鲜的。细胞因子可以储存在一起。培养基更新应至少每几天进行一次。
在指示的日期，取出一半体积的细胞培养物用于数据分析(使用BD FACS ARIA II的流式细胞术)。根据测试条件用新鲜培养基补充培养体积。报告的数据解释了此程序中引入的稀释因子。
对每种测试的化合物(化合物1.001-1.023)进行单独的实验。
结果
化合物1.001至1.023的扩增效果显示在图1-图23中。每个图中的图表报告了在第2天与第7天之间细胞的倍数变化。图中的每个柱报告了在所测试的式I的化合物的指定浓度下细胞的倍数变化。细虚线报告了基本条件(即仅细胞因子)的扩增效果，并且粗虚线报告了+SF条件(500nM SF1670)的扩增效果。总的来说，这些数据证明了式I的化合物提供了在培养物中积极的HSC扩增效果。
下表3总结了化合物1.001至1.023(样品化合物)在指示浓度下的相对扩增效果。表3中的数据报告为相对扩增效果。相对扩增效果是图1-图23中每一个所示的倍数变化的归一化值。其计算如下所示：
Figure BDA0003443861290000962
表3：在含有指示浓度的化合物1.001-1.023(样品化合物)的培养物中，用式I的化合物的处理对CD34+/CD133+细胞(“CD133效果”)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(“CD90效果”)的相对扩增效果。
Figure BDA0003443861290000963
Figure BDA0003443861290000971
表3中呈现的式I的化合物对CD34+/CD133+和CD34+/CD133+/CD90+细胞的相对扩增效果的报告值(例如，+、++和+++)在下面示出，其中“x”是计算的相对倍数变化。
相对倍数变化 值
x<0.2 +
0.2≤x<0.55 ++
0.55≤x<0.9 +++
0.9≤x<1.25 ++++
1.25≤x +++++
实施例34：使用式I的化合物在培养物中增强源自脐带血的造血干细胞
本实施例描述了当在化合物1.008的存在下培养时源自脐带血的造血干细胞的培养。在19天的体外孵育内，培养物中的HSC数量持续增加。
材料和方法
将冷冻的脐带血样品解冻并且逐渐达到室温。将解冻的脐带血在不含酚红、10％(v/v)热灭活胎牛血清(FBS)的αMEM的体外培养基中孵育。测试了四个样品：基本条件、+SF条件、+1.008条件和+1.008/+ER条件。
表4中描述了包含在每个条件中的组分。测试的每种条件还包含含有青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素溶液，以避免污染。
表4：基本条件、+SF条件、+1.008条件(含化合物1.008)、+1.008/+ER条件的培养基中包含的另外组分。
Figure BDA0003443861290000972
Figure BDA0003443861290000981
在3％氧气(由氮气控制)和5％CO2下孵育培养物。
在每次需要更新培养基时，单独添加小分子组分并且是新鲜的。细胞因子可以储存在一起。培养基更新应至少每几天进行一次。
在指示的日期，取出不同量的细胞培养物用于数据分析(使用BD FACS ARIA II的流式细胞术)以及避免细胞过度拥挤。根据测试条件用新鲜培养基补充培养体积。报告的数据解释了此程序中引入的稀释因子。
结果
+1.008条件的流式细胞术分析证明，即使在培养19后，造血干细胞仍能维持并且继续扩增(图24A-E)。事实上，图25A-4E示出了在培养19天后，在+1.008的存在下培养的脐带血样品中，从第2天起CD34+细胞(图25B)和CD34+/CD133+细胞(图25C)具有大于50倍增加，从第2天起CD34+/CD133+/CD90+细胞(图25D)具有约20倍增加，并且从第2天起CD34+/CD133+/CD90+/CD38低/-细胞(图25E)具有超过12倍增加。在添加ER50891的情况下，这些水平甚至进一步提高。
实施例35：使用式I的化合物增强源自脐带血的造血干细胞
材料和方法
来自脐带血的CD34+细胞购自STEMCELL Technologies。使用阳性免疫磁性分离技术从脐带血样品中分离原代人CD34+细胞。将细胞解冻并且逐渐达到室温。将样品洗涤，然后置于含各100ng/ml的FLT3L、TPO、SCF和IL-6的StemSpan中过夜培养。十八至二十四小时后(第1天)，对细胞进行计数和免疫表型分析(在Invitrogen Attune NxT细胞仪上的流式细胞术)。
将大约1000个活细胞铺板到96孔板的每个孔中；用流式细胞术定量每孔分配的确切细胞数量以供以后计算。
使用不含酚红、10％(v/v)热灭活胎牛血清的αMEM制备用于测试式I的化合物的培养基。培养条件还包含含有青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素溶液，以避免污染。表5中描述了用于测试的化合物的另外的培养基组分和浓度。
表5：基本条件(仅细胞因子)、+式I条件的培养基中包含的另外组分。
Figure BDA0003443861290000982
Figure BDA0003443861290000991
在一式两份孔中以0.5、2和8μM测试化合物1.005、1.006、1.007、1.008、1.009、1.010、1.013、1.014、1.015、1.021、1.022、1.023、1.024、1.025、1.026、1.027、1.028和1.029。在一式三份孔中以0.1、0.316、1.0、3.16和10μM测试化合物1.030-1.035。在一式两份孔中以0.149、0.310、0.647、1.351、2.819和10μM测试化合物1.036。在单孔中以0.253、0.527、1.100、2.296、4.792和10μM测试化合物1.037。
本实验的所有孵育均在3％氧气(由氮气控制)和5％CO2下进行。培养七天后，从孔中收集细胞并且分析表型(在Invitrogen Attune NxT细胞仪上的流式细胞术)。
结果
化合物1.005、1.006、1.007、1.008、1.009、1.010、1.013、1.014、1.015、1.021、1.022、1.023、1.024、1.025、1.026、1.027、1.028、1.029、1.030、1.031、1.032、1.033、1.034、1.035、1.036和1.037的扩增效果显示在图26-图51中。
每个图中的图表报告了在第1天与第7天之间细胞的倍数变化。图中的每个点报告了在所测试的式I的化合物的指定浓度下指示数量的重复的平均倍数变化。误差条显示在该浓度下测量的最大和最小倍数变化。虚线报告了基本条件(即仅细胞因子)的扩增效果。总的来说，这些数据证明了用式I的化合物的处理提供了在培养物中对脐带血来源的HSC积极的扩增效果。
下表6总结了筛选的化合物在指示浓度下的相对扩增效果。表6中的数据报告为相对扩增效果。相对扩增效果是每个图所示的倍数变化的归一化值。其计算如下所示：
Figure BDA0003443861290000992
表6：在含有指示浓度的所指示的化合物的培养物中，用式I的化合物的处理对CD34+/CD133+细胞(“CD133效果”)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(“CD90效果”)的相对扩增效果。
Figure BDA0003443861290000993
Figure BDA0003443861290001001
表6中呈现的式I的化合物对CD34+/CD133+和CD34+/CD133+/CD90+细胞的相对扩增效果的报告值(例如，+、++和+++)在下面示出，其中“x”是计算的相对倍数变化。
相对倍数变化 值
x<1.44 +
1.44≤x<1.8 ++
1.8≤x<2.16 +++
2.16≤x<2.52 ++++
2.52≤x +++++
实施例36：使用式I的化合物长期增强源自动员外周血、非动员外周血和脐带血的造血干细胞。
本实施例证明了使用源自不同来源的HSC进行21天培养对造血干细胞的增强和扩增。
材料和方法
来自动员外周血的CD34+细胞购自STEMCELL Technologies。使用G-CSF动员来自志愿者供体的血液。在收集前，向志愿者施用最多10μg/kg/天的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)持续3-5天。使用阳性免疫磁性分离技术从动员外周血白细胞去除术样品中分离原代人CD34+细胞。
来自脐带血的CD34+细胞购自STEMCELL Technologies。使用阳性免疫磁性分离技术从脐带血样品中分离原代人CD34+细胞。
来自非动员外周血的CD34+细胞购自STEMCELL Technologies。使用阳性免疫磁性分离技术从血液样品中分离原代人CD34+细胞。
将来自每种来源的低温保存的CD34+细胞样品解冻并且逐渐达到室温。将样品洗涤，然后置于含各100ng/ml的FLT3L、TPO、SCF和IL-6的StemSpan中过夜培养。
在3％氧气(由氮气控制)和5％CO2下孵育培养物。
二十四小时后(第1天)，对细胞进行计数和免疫表型分析(在Invitrogen AttuneNxT细胞仪上的流式细胞术)。表7中描述了用于测试的化合物的培养基组分和浓度。培养条件还包含含有青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素溶液，以避免污染。将大约1000个细胞添加到每个脐带血和动员外周血烧瓶(5ml总体积)或96孔板的孔中(200μl总体积)。将大约2000个细胞添加到每个非动员外周血烧瓶(5ml总体积)或96孔板的孔中(200μl总体积)。定量每种条件分配的确切细胞数量，用于以后计算从第1天起的倍数变化。
在第7天和第10天分析孔，在孵育的第14和21天分析烧瓶。用流式细胞术定量细胞数量和表型。在第14天，如在第1天那样制备用于烧瓶的新鲜条件，并且将细胞以1:20分割到新的烧瓶中。另外七天后(培养的第21天)，再次用流式细胞术对细胞数量和表型进行定量。在第21天计算的细胞数量解释了细胞的传代。
表7：基本条件(仅细胞因子)、+1.010条件中包括的培养基组分。
Figure BDA0003443861290001002
Figure BDA0003443861290001011
一式四份地制备在96孔板中的条件；一式两份地制备在烧瓶中的条件。在以上指示的培养天数中，从孔或烧瓶中收集细胞并且分析表型(在Invitrogen Attune NxT细胞仪上的流式细胞术)。
结果
+1.010条件的流式细胞术分析证明，来自多样来源的造血干细胞在培养物中得以维持并且继续扩增长达21天(参见图52-图54)。事实上，图52示出了在脐带血中，存在大于300倍的CD34+细胞扩增(图52B)，大于600倍的CD34+/CD133+细胞扩增(图52C)，大于1000倍的CD34+/CD133+/CD90+细胞扩增(图52D)，大于1500倍的CD34+/CD133+/CD90+/CD38低/-细胞扩增(图52E)和大于200倍的CD34+/CD133+/CD90+/CD45RA-细胞扩增(图52F)。在动员外周血(图53)中，存在大于20倍的CD34+细胞扩增(图53B)，大于40倍的CD34+/CD133+细胞扩增(图53C)，大于60倍的CD34+/CD133+/CD90+细胞扩增(图53D)，大于60倍的CD34+/CD133+/CD90+/CD38低/-细胞扩增(图53E)和大于30倍的CD34+/CD133+/CD90+/CD45RA-细胞扩增(图53F)。在非动员外周血(图54)中，存在大于九倍的CD34+细胞扩增(图54B)，大于40倍的CD133+细胞扩增(图54C)，和大于60倍的CD90+细胞扩增(图54D)，大于200倍的CD34+/CD133+/CD90+/CD38低/-细胞扩增(图54E)和大于30倍的CD34+/CD133+/CD90+/CD45RA-细胞扩增(图54F)。在所有情况下，用化合物1.010的扩增远远超过仅用细胞因子的扩增。
实施例37：在大气O2下使用式I的化合物增强造血干细胞
本实施例证明了在大气氧气下使用式I的化合物的造血干细胞的增强和扩增。
材料和方法
来自脐带血的CD34+细胞购自STEMCELL Technologies。使用阳性免疫磁性分离技术从脐带血样品中分离原代人CD34+细胞。将细胞解冻并且逐渐达到室温。将样品洗涤，然后置于含各100ng/ml的FLT3L、TPO、SCF和IL-6的StemSpan SFEM中过夜培养。
将培养物在大气氧气(大约20％)和5％CO2下孵育。
十八小时后(第1天)，对细胞进行计数和免疫表型分析(在Invitrogen AttuneNxT细胞仪上的流式细胞术)。使用StemSpan SFEM制备培养基，具有用于表8中所述的用于所测试的化合物的另外的组分和浓度。培养条件还包含含有青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素溶液，以避免污染。将五mL相应条件添加到25cm2烧瓶中。将大约1000个细胞添加到每个烧瓶中；定量每个烧瓶的确切细胞数量，用于以后计算从第1天起的倍数变化。
在孵育九天时，用流式细胞术定量细胞数量和表型。
表8：基本条件(仅细胞因子)、+化合物1.010条件的培养基中包含的另外组分。
Figure BDA0003443861290001021
一式两份地制备条件。
结果
+式I条件的流式细胞术分析证明，当在大气氧气下培养九天时，化合物1.010对造血干细胞具有积极的扩增效果。事实上，图55示出了CD34+细胞的扩增多于150倍(图55B)以及CD34+/CD133+(图55C)和CD34+/CD133+/CD90+细胞(图55D)的扩增均多于200倍。
实施例38：在式I的化合物中长期体外扩增脐带血CD34+细胞后，粒细胞谱系、单核细胞谱系、红系谱系和巨核细胞谱系细胞的衍生。
本实施例证明了通过在含有式I的化合物的培养基中将细胞培养延长的时间段超乎寻常地扩增可源自脐带血CD34+细胞的各种谱系的分化细胞的数量的能力。图56中提供了本实施例的示意性概述。
材料和方法
来自脐带血的CD34+细胞购自STEMCELL Technologies。由供应商使用阳性免疫磁性分离技术从脐带血样品中分离原代人CD34+细胞。将细胞解冻，逐渐达到室温，然后洗涤。
将细胞置于含各100ng/ml的FLT3L、TPO、SCF和IL-6的StemSpan中过夜培养。十八小时后(第1天)，对细胞进行计数和免疫表型分析(在Invitrogen Attune NxT细胞仪上的流式细胞术)。
将这些细胞的一部分洗涤并且直接置于各种“分化培养物”中，下面所述。将剩余的细胞置于“HSC扩增培养物”中，下面所述。将大约1000个活细胞铺板到一式两份25cm2烧瓶中；用流式细胞术定量每个烧瓶分配的确切细胞数以供以后计算。在StemSpan无血清扩增培养基中制备用于扩增CD34+细胞数量的培养基，并且添加到每个孔中(每个烧瓶4ml总体积)，用于对照或+式I条件。扩增培养条件还包含含有青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素溶液，以避免污染。用于测试的化合物的另外的培养基组分和浓度如表9中所述。扩增培养物的所有孵育均在3％氧气(由氮气控制)和5％CO2下进行。
表9：对照和+式I条件的扩增细胞培养基中包含的另外组分。
Figure BDA0003443861290001031
在培养14、31和52天后，如在第一天那样制备新鲜培养基，并且将细胞以1:20传代到新鲜的25cm2烧瓶中。
在培养的第21天和第42天，将来自一式两份烧瓶的细胞汇集，并且使用CD34MicroBead Kit-UltraPure(Miltenyi Biotec)将CD34+细胞再富集。通过流式细胞术验证CD34纯度。然后将CD34+细胞放回在一式两份烧瓶中的培养物中，在第21天时每个烧瓶10,000个细胞或在第42天时每个烧瓶20,000个细胞。
在扩增培养21天和63天后，在传代或CD34再富集之前，从每个烧瓶中采集样品用于表型分析(在Invitrogen Attune NxT细胞仪上的流式细胞术)。为这些分析计算的细胞数量考虑了在先前日期的细胞传代。通过将在后期日期(21和63)的细胞数量除以在第1天定量的CD34+细胞数量来计算CD34+细胞的倍数扩增。
在第21天和第63天，将CD34+富集的细胞置于分化培养物中，下面所述。
使用来自STEMCELL technologies的红系、髓系(粒细胞和单核细胞)和巨核细胞HemaTox试剂盒按照制造商的说明开始分化培养。简而言之，通过以下方式制备谱系培养基：将用于红细胞(SCF、IL-3和EPO)、髓系(即混合的粒细胞/单核细胞、SCF、TPO、G-CSF和GM-CSF)或巨核细胞(SCF、IL-6、IL-9和TPO)谱系分化的细胞因子混合料添加到其各自试剂盒的培养基中，然后针对红系或髓系培养添加大约30-100个CD34+细胞或针对巨核系培养300-1000个CD34+细胞。对铺板的确切细胞数量进行定量以供以后分析。分化培养物的所有孵育均在3％氧气(由氮气控制)和5％CO2下进行。
在红系或髓系培养七天或巨核系培养十天后，使用流式细胞术对分化的细胞输出进行定量。使用抗CD71和抗CD235a抗体定量红系输出，并且使用抗CD41和抗CD42b抗体定量巨核细胞谱系输出。使用CD14和CD15抗体一前一后地评估粒细胞和单核细胞谱系输出，其中粒细胞谱系细胞是CD15+/CD14-并且单核细胞谱系细胞是CD14+/CD15-。
计算多个量以评估在+式I条件中CD34+细胞的扩增对谱系分化细胞的输出的作用。“按每个测定CD34+细胞的输出”描述了分化细胞输出/个置于分化培养物中的CD34+细胞，并且通过以下方式计算：将谱系阳性细胞总数除以在第1、21或63天开始分化培养时定量的输入CD34+细胞数量。“按每个扩增第1天CD34+细胞的输出”描述了在扩增细胞培养(如果扩增)和然后分化培养两者后可从单个CD34+细胞产生的给定谱系的分化细胞的数量，并且通过以下方式计算：将按每个测定CD34+细胞的输出乘以从第1天至分析日(第21天或第63天)CD34+细胞的倍数扩增。“按每个库存CBU的谱系输出”描述了可使用来自全脐带血单位的CD34+细胞产生的给定谱系的分化细胞的数量，并且通过以下方式计算：将按每个扩增第1天CD34+细胞的输出乘以2x106(在公共脐带血储库中保持的平均脐带中的CD34+细胞的数量的保守估计)(Sun,J.,Allison,J.,McLaughlin,C.,Sledge,L.,Waters-Pick,B.,Wease,S.和Kurtzberg,J.(2010).Differences in quality between privately andpublicly banked umbilical cord blood units:a pilot study of autologous cordblood infusion in children with acquired neurologic disorders.Transfusion(巴黎)50,1980-1987)。此按每个库存CBU的谱系输出提供了衡量可源自单一脐带血单位(cordblood unit)(可用作制造治疗产品的输入)的治疗单位的数量的能力，并且能够与当前的最先进方法进行比较。在相关治疗剂量基准可用的情况下，此按每个库存CBU的谱系输出用于计算可从单一储存CBU单位制备的治疗单位的数量。我们计算了用于粒细胞前体的治疗单位，使用500亿(5x1010)个细胞/个剂量作为保守基准(Valentini,C.G.,Farina,F.,Pagano,L.和Teofili,L.(2017).Granulocyte Transfusions:A CriticalReappraisal.Biol.Blood Marrow Transplant.23,2034-2041)。对于巨核细胞，我们基于20个血小板/个巨核细胞前体进行估计(Mattia,G.,Vulcano,F.,Milazzo,L.,Barca,A.,Macioce,G.,Giampaolo,A.和Hassan,H.J.(2002).Different ploidy levels ofmegakaryocytes generated from peripheral or cord blood CD34+cells arecorrelated with different levels of platelet release.Blood 99,11)以及治疗剂量为3000亿(3x1011)个血小板(Kaufman,R.M.,Djulbegovic,B.,Gernsheimer,T.,Kleinman,S.,Tinmouth,A.T.,Capocelli,K.E.,Cipolle,M.D.,Cohn,C.S.,Fung,M.K.,Grossman,B.J.等人(2015).Platelet Transfusion:A Clinical Practice Guideline From theAABB.Ann.Intern.Med.162,205)。
为了理解含有红细胞和巨核细胞祖细胞的群体的分化特征，我们分析了带有早期和晚期分化标记物的细胞的细胞比例。红细胞分化的标志首先是出现CD71，然后是CD235a，然后是CD71的缺失。巨核细胞分化的标志首先是出现CD41，然后是出现CD42b。(在随后的实施例39中彻底检查粒细胞分化。)
红细胞分化的频率计算为CD71和/或CD235a阳性的细胞的数量除以总细胞数量。成熟红细胞分化计算为CD71+/CD235a+和CD71-/CD235a+细胞数量除以CD71和/或CD235a阳性的细胞的总数。成熟红细胞分化通过以下方式计算：将CD71-/CD235a+细胞数量除以CD71和/或CD235a阳性的细胞的总数。
巨核细胞分化频率通过以下方式计算：将CD41+细胞数量除以总细胞数量。成熟巨核细胞频率通过以下方式计算：将CD41+/CD42b+细胞数量除以CD41+细胞总数。
结果
图57中示出的倍数CD34+细胞扩增的流式细胞术分析显示，在+式I条件中的培养显著增加了源自起始细胞的总CD34+细胞数量，并且其程度比在对照条件中的培养更大。事实上，图57A示出了在第21天，+式I条件使CD34+细胞扩增600倍，而对照条件使CD34+细胞仅扩增大约125倍。图57B示出了到63天时，绝对扩增幅度以及对照条件与+式I条件之间的差异甚至更加明显，其中与在对照条件中的7,700倍相比，+式I能够实现244,000倍的CD34+细胞扩增。
图58示出了如所预期，体外扩增培养使从输入CD34+细胞产生的给定谱系的细胞的数量(“按每个测定CD34+细胞的输出”)减少。这对于红系(图58A)、单核细胞(图58B)、粒细胞(图58C)和巨核细胞(图58D)谱系是正确的。
尽管按每个测定CD34+细胞的输出下降，图59示出了在+式I条件中总CD34+细胞的大量扩增驱动在CD34+扩增培养后分化细胞类型的总输出的总体增加。事实上，与未培养细胞的输出相比，在分化之前在+式I条件中的扩增培养增加了所有谱系的按每个扩增第1天CD34+细胞的输出。+式I培养物使红系谱系输出在第21天增加301倍并且在第63天增加91,000倍(图59A)，使单核细胞谱系在第21天增加800倍并且在第63天增加108,000倍(图59B)，使总粒细胞谱系输出在第21天增加370倍并且在第63天增加67,000倍(图59C)，并且使总巨核细胞谱系输出在第21天增加18倍并且在第63天增加3,400倍(图59D)。
在计算可从典型地在库存脐带血单位中发现的CD34+细胞产生的治疗剂量数量时，+式I扩增培养物的全疗法促进作用变得清楚。事实上，图60A示出了尽管未扩增脐带血的分化培养导致远少于单一治疗单位的粒细胞祖细胞(0.01剂量)，式I扩增的CD34+细胞的分化培养导致在扩增培养21天后2.8剂量的粒细胞祖细胞并且在扩增培养63天后接近530剂量的粒细胞祖细胞。这几乎是在第21天从对照扩增细胞产生的剂量数量的三倍，并且是在第63天对照扩增细胞剂量数量的20倍。此外，图60B示出了未扩增脐带血结果的分化培养也导致远少于甚至单一剂量的巨核细胞祖细胞(0.01剂量)，而63天的式I扩增培养能够产生34剂量的巨核细胞祖细胞。较短的培养时间或对照扩增条件导致一个剂量的分数。
为了理解含有红细胞和巨核细胞祖细胞的群体的分化特征，我们分析了带有总和晚期分化标记物的细胞的细胞比例。图61A中呈现了总体分化定型，其证明了在红系分化培养七天后，平均50％的在式I条件中扩增21天的细胞以及75％的在式I条件中扩增63天的细胞具有红细胞分化标记物。图61B中示出的巨核细胞分化培养物低得多分数的分化细胞，与其低的按每个测定CD34+细胞的输出匹配。图62示出了两种分化培养物在早期亚型与成熟亚型之间分割。具体地，图62A示出了在红系分化培养七天时，平均46％的在式I条件中扩增21天的细胞以及86％的在式I条件中扩增63天的细胞是CD235a阳性的。任一个样品中都没有检测到CD71-/CD235a+细胞。在先前扩增细胞培养21或63天后，置于巨核细胞分化培养物中的式I扩增的CD34+细胞(在图62B中示出)具有大约50％CD42b+细胞。
实施例39：源自在+式I条件中扩增的脐带血的粒细胞前体的表型和功能。
本实施例证明，在粒细胞分化培养物中七天的细胞主要是早期粒细胞前体。此外，我们证明了在粒细胞分化培养之前脐带血CD34+细胞数量多于300倍的扩增不会引起异常模式的粒细胞分化，并且导致当分化为成熟粒细胞时有效力地激活抗微生物功能的功能细胞。
材料和方法
来自脐带血的CD34+细胞购自STEMCELL Technologies。由供应商使用阳性免疫磁性分离技术从脐带血样品中分离原代人CD34+细胞。将细胞解冻，逐渐达到室温，然后洗涤。
将细胞置于含各100ng/ml的FLT3L、TPO、SCF和IL-6的StemSpan中过夜培养。十八小时后(第1天)，对细胞进行计数和免疫表型分析(在Invitrogen Attune NxT细胞仪上的流式细胞术)。
将这些细胞的一部分洗涤并且直接置于“粒细胞分化培养物”中，下面所述。
将剩余的细胞置于“HSC扩增培养物”中。将大约2000个活细胞铺板到一式两份25cm2烧瓶中；用流式细胞术定量每孔分配的确切细胞数以供以后计算。在StemSpan无血清扩增培养基中制备用于扩增CD34+细胞数量的培养基，并且添加到每个孔中(每个烧瓶4ml总体积)。扩增培养条件还包含含有青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素溶液，以避免污染。上表9中描述了用于测试的条件的另外的培养基组分和浓度。
扩增培养物的所有孵育均在3％氧气(由氮气控制)和5％CO2下进行。在培养14天后，如在第一天那样制备新鲜培养基，并且将来自每个孔的细胞传代到新鲜的25cm2烧瓶中。
在扩增培养21天后，从每个烧瓶中采集样品用于表型分析(在Invitrogen AttuneNxT细胞仪上的流式细胞术)。
将来自一式两份烧瓶的剩余细胞汇集，并且使用CD34 MicroBead Kit-UltraPure(Miltenyi Biotec)将CD34+细胞再富集。通过流式细胞术验证CD34纯度。然后将富集的CD34+细胞置于粒细胞分化培养物中，下面所述。
粒细胞分化培养
在化合物1.010(未扩增粒细胞分化培养物)中培养之前、在化合物1.010(+式I扩增的分化培养物)中培养21天后或在对照条件(对照扩增的分化培养物)中培养21天后，开始粒细胞分化培养。将纯化的CD34+细胞以1000个细胞/孔铺板在48孔板中的通过将StemSpan SFEM与含有SCF、TPO、G-CSF和GM-CSF(STEMCELL)的StemSpan 100X髓系扩增补充物(为粒细胞分化而配制)组合制造的粒细胞分化培养基中。将细胞以300μl/孔铺板。将未扩增的细胞一式三份地铺板；将式I和对照扩增的细胞一式四份地铺板。然后将板置于大气氧气和5％CO2的加湿培养箱中。用流式细胞术定量每孔分配的确切细胞数量以供以后计算。
在第7天和第10天，制备另外的分化培养基并且将细胞传代到新鲜孔中。
在粒细胞分化培养第7天和第13天，取出一部分培养物用于通过流式细胞术进行粒细胞分化的分析和定量。将细胞用针对CD16、CD15、CD14、CD13、CD11b和CD34的抗体染色。将细胞门控为早幼粒细胞(CD34-/CD14-/CD15+/CD16-/CD13高/CD11b-)、中幼粒细胞(CD34-/CD14-/CD15+/CD16-/CD13dim/CD11b+)和“晚幼粒细胞+”(CD34-/CD14-/CD15+/CD11b+/CD13+/CD16+)的粒细胞前体群体。早幼粒细胞是最不成熟的亚群，中幼粒细胞处于中等成熟水平，并且“晚幼粒细胞+”包括处于最高粒细胞成熟水平的细胞，包括晚幼粒细胞和成熟嗜中性粒细胞。计算粒细胞前体亚群的分数表示和总数。在第13天计算的细胞数量解释了传代。
在粒细胞分化培养第13天，取出一部分培养物，用于通过吞噬作用和呼吸爆发的两个单独测定体外分析粒细胞功能。
在吞噬作用测定中，测量培养的细胞在摄取细菌方面的功能。将仅在酸性环境(诸如吞噬作用后的细胞吞噬体)中时才发出荧光的pHrodo绿色金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生物颗粒(ThermoFisher)首先用调理试剂处理以针对吞噬作用来标记颗粒。然后将颗粒添加到细胞中并且在37℃下孵育45分钟。在此时间段内在“冰”上孵育冰对照样品以防止内吞作用并且能够测量背景荧光。在此孵育后，将细胞用针对CD15和CD14的抗体染色，彻底洗涤，然后在Attune流式细胞仪上通过流式细胞术进行分析。针对吞噬颗粒的存在定量CD15+/CD14-细胞。
在呼吸爆发测定中，测量细胞产生活性氧种类(用于杀死摄入的细菌)的能力。将细胞首先用二氢罗丹明-123(是仅在其被氧化成罗丹明123后才发出荧光的试剂)脉冲15分钟。在此孵育之后，将细胞用200nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)处理30分钟，以非特异性地激活呼吸爆发。还制备不含PMA的对照样品。在此孵育后，将细胞用针对CD15和CD14的抗体染色，彻底洗涤，然后在Attune流式细胞仪上通过流式细胞术进行分析。针对罗丹明123荧光定量CD15+/CD14-细胞，表明氧化爆发的激活。
结果
在此实验中，用化合物1.010的HSC培养在第21天使总CD34+细胞数量增加314倍，如图63所示。这种扩增虽然比先前的实验更小，但在来自不同供体的脐带之间看到在典型变化范围内，并且足以开始分析粒细胞分化。
置于粒细胞分化培养物中七天的绝大部分化合物式I扩增的CD34+细胞仅进展到最早可鉴定的粒细胞分化阶段，带有早幼粒细胞的表型标记物。具体地，图64示出了粒细胞分化标记物的流式细胞术分析结果，证明55％的培养细胞是早幼粒细胞(CD34-/CD14-/CD15+/CD13+/CD11b-/CD16-)，15％已稍微进一步进展到中幼粒细胞(CD34-/CD14-/CD15+/CD13低/CD11b+/CD16-)，并且仅8％已经开始完全分化，上调CD16并且变成晚幼粒细胞(CD34-/CD14-/CD15+/CD13+/CD11b+/CD16+)。没有检测到具有指示完全分化为嗜中性粒细胞的高CD16的细胞。此外，到这点时，仅1.9％的细胞仍然表达CD34，并且仅20％的细胞保持未分化，不表达CD15。
在粒细胞分化培养物中培养另外六天至总共13天的细胞的分析证明，从未扩增的CD34+细胞分化的CD15+细胞和从式I扩增的CD34+细胞分化的CD15+细胞具有相似的早幼粒细胞、中幼粒细胞和晚幼粒细胞阶段分数。表10呈现了阶段第1天粒细胞分化培养物和+式I扩增的粒细胞分化培养物在粒细胞分化培养第13天的嗜中性白细胞前体阶段的定量。比较未扩增的与+式I扩增的分化培养物中的各亚群体中细胞的比例而计算的P-值证明，在不同发育阶段中CD15+细胞的分布不存在统计学上显著的差异。这种相似性在图65中说明，描绘了在未扩增分化培养物(图65A)和+式I扩增的分化培养物(图65B)中这些亚群体中的每一个中细胞的分数。
表10-在培养物中CD15+细胞的分化
Figure BDA0003443861290001071
+式I扩增的细胞的效力在图66中进一步突出，呈现了吞噬作用(图66A)和呼吸爆发(图66B)测定的结果。具体地，图66A示出了57％的来自第1天粒细胞分化培养物的CD15+细胞和89％的来自+式I粒细胞分化培养物的CD15+细胞是吞噬金黄色链球菌(Streptococcus aureus)颗粒阳性的，将其有利地与阳性对照(81％阳性)相比。类似地，图66B示出了84％的来自未扩增粒细胞分化培养物的CD15+细胞和56％的来自式I扩增的分化培养物的细胞在用PMA刺激时激活呼吸爆发。这是与阳性对照可比较的，阳性对照是53％阳性的。总之，功能测定证明在式I条件中扩增培养后分化的绝大多数CD15+细胞激活抗微生物功能。
实施例40：通过在式I的化合物中扩增，增强从脐带血中衍生淋巴细胞前体。
本实施例证明，通过在+式I条件中初始扩增CD34+细胞，可以显著增加在淋巴细胞分化培养物中衍生的淋巴细胞前体的数量。
材料和方法
来自脐带血的CD34+细胞购自STEMCELL Technologies。由供应商使用阳性免疫磁性分离技术从脐带血样品中分离原代人CD34+细胞。将细胞解冻，逐渐达到室温，然后洗涤。
将细胞置于含各100 ng/ml的FLT3L、TPO、SCF和IL-6的StemSpan中过夜培养。十八小时后(第1天)，对细胞进行计数和免疫表型分析(在Invitrogen Attune NxT细胞仪上的流式细胞术)。
将这些细胞的一部分洗涤并且直接置于“淋巴细胞分化培养物”中，下面所述。
将剩余的细胞置于“HSC扩增培养物”中。将大约5000个活细胞铺板到一式两份25cm2烧瓶中；用流式细胞术定量每个烧瓶分配的确切细胞数以供以后计算。在StemSpan无血清扩增培养基中制备用于扩增CD34+细胞数量的培养基，并且添加到每个烧瓶中(每个烧瓶4 ml总体积)。扩增培养条件还包含含有青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素溶液，以避免污染。上表9中描述了用于测试的条件的另外的培养基组分和浓度。
扩增培养物的所有孵育均在3％氧气(由氮气控制)和5％CO2下进行。在培养七至十四天后，如在第一天那样制备新鲜培养基，并且将来自每个烧瓶的细胞的1/10传代到新鲜的25 cm2烧瓶中。
在扩增培养21天后，从每个烧瓶中采集样品用于表型分析(在Invitrogen AttuneNxT细胞仪上的流式细胞术)。
将来自一式两份烧瓶的剩余细胞汇集，并且使用CD34 MicroBead Kit-UltraPure(Miltenyi Biotec)将CD34+细胞再富集。通过流式细胞术验证CD34纯度。然后将富集的CD34+细胞置于分化培养物中，下面所述。
淋巴细胞分化培养
在式I(第1天淋巴细胞分化培养物)中培养之前、在式I(+式I扩增的淋巴细胞分化培养物)中培养21天后或在对照条件(对照扩增的淋巴细胞分化培养物)中培养21天后，开始淋巴细胞分化培养(L Diff培养)。
在淋巴细胞分化培养开始前一天，通过在4℃下在PBS中孵育过夜将24孔板用人IgG1的Fc部分与Notch配体δ样4的融合蛋白(Fc-DLL4)包被。在即将开始淋巴细胞分化培养之前，将孔用PBS洗涤。可替代地，可以通过相同的方法将板用Fc-DLL4和人IgG1的Fc部分与血管细胞粘附分子1的融合蛋白(Fc-VCAM-1)共包被。
将纯化的CD34+细胞以20,000个细胞/孔铺板在24孔板中的淋巴细胞分化培养物中：含20％FBS和各100ng/ml的IL-7、FLT3L、SCF和TPO的IMDM(Gibco)。将细胞以300μl/孔一式三份地铺板，然后置于大气氧气和5％CO2的加湿培养箱中。用流式细胞术定量每孔分配的确切细胞数量以供以后计算。
在培养的第六天，重复板包被程序，为第七天的传代做准备。
在第7、10和14天，通过流式细胞术分析细胞以定量早期胸腺祖细胞(CD34+/CD45RA-/CD7+)、前T1(CD7++/CD5-)、前T2(CD7++/CD5+)和前T(CD7++/CD5+/CD1a+)-从最早到最成熟-的T-谱系表型。在一些情况下，通过将透化细胞针对细胞内CD3进行染色来进一步鉴定T细胞。NK细胞前体被鉴定为标记物NKP46+和/或CD56+呈阳性并且不存在CXCR4-。
在培养第七天，通过以下方式去除髓系细胞：将细胞用针对CD34和CD7的抗体染色并且在BD FACS Aria II上分选以去除CD34-/CD7-细胞。可替代地，可以省略此分选步骤。将剩余的细胞群体再铺板到DLL4包被的板上在淋巴细胞分化培养基中。可替代地，可以将细胞铺板到Fc-DLL4/Fc-VCAM-1共包被的板上。
实施例41：通过在式I的化合物中扩增，增强从脐带血中衍生淋巴细胞前体。
本实施例证明，通过在+式I条件中初始扩增CD34+细胞，可以显著增加在淋巴细胞分化培养物中衍生的淋巴细胞前体的数量。
材料和方法
来自脐带血的CD34+细胞购自STEMCELL Technologies。由供应商使用阳性免疫磁性分离技术从脐带血样品中分离原代人CD34+细胞。将来自两个单独的脐带血样品的细胞解冻，逐渐达到室温，然后洗涤。
对于两个样品，通过在含各100ng/ml的FLT3L、TPO、SCF和IL-6的StemSpan中过夜培养将细胞引发。十八小时后(第1天)，对细胞进行计数和免疫表型分析(在InvitrogenAttune NxT细胞仪上的流式细胞术)。
将来自一个样品的细胞的一部分洗涤并且直接置于“淋巴细胞分化培养物”中，下面所述。
将剩余的来自两个样品的细胞置于“HSC扩增培养物”中14天(“14天扩增”)或21天(“21天扩增”)。定量置于HSC扩增培养物中的细胞数量，用于下述“倍数扩增”计算。在StemSpan无血清扩增培养基中制备用于扩增CD34+细胞数量的培养基，并且添加到每个烧瓶中(每个烧瓶4ml总体积)。扩增培养条件还包含含有青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素溶液，以避免污染。上表9中描述了用于测试的条件的另外的培养基组分和浓度。扩增培养物的所有孵育均在3％氧气(由氮气控制)和5％CO2下进行。
在扩增培养期间，如果细胞密度大于≥1e5个细胞/mL，则将细胞的部分传代到一个或多个较大烧瓶(75cm2或225cm2)中。在培养12-14天后，从每个烧瓶中采集样品用于计数和表型分析(在Invitrogen Attune NxT细胞仪上的流式细胞术)。然后使用CD34MicroBeadKit-UltraPure(Miltenyi Biotec)将CD34+细胞再富集。通过流式细胞术验证CD34纯度。对于14天的扩增，这种富集发生在第14天，并且这些富集的CD34+细胞用于接种淋巴细胞分化培养物，下面所述。对于21天的扩增，这种富集发生在第12天，此后如在第一天那样制备新鲜培养基，并且将CD34+细胞接种在新鲜的75cm2烧瓶中并且培养另外九天。记录接种的细胞的数量，用于下述的“倍数扩增”计算。
在扩增培养21天后，从21天扩增烧瓶中采集样品用于计数和表型分析(在Invitrogen Attune NxT细胞仪上的流式细胞术)。然后使用CD34 MicroBead Kit-UltraPure(Miltenyi Biotec)将CD34+细胞再富集。通过流式细胞术验证CD34纯度，并且记录计数用于计算按每个测定CD34+细胞的输出，下面所述。然后将富集的CD34+细胞置于分化培养物中，下面所述。
淋巴系祖细胞分化培养
在式I(第1天淋巴细胞分化培养物)中培养之前、在+式I(14天+式I扩增的淋巴细胞分化培养物)中培养14天后、在对照条件(14天DMSO扩增的淋巴细胞分化培养物)中培养14天后或在+式I(21天+式I扩增的淋巴细胞分化培养物)中培养21天后，开始淋巴系祖细胞分化培养(L Diff培养)。
通过在室温下孵育两小时，将12孔未TC处理的板用StemSpan淋巴系分化包被材料(STEMCELL Technologies)包被。在即将开始淋巴细胞分化培养之前，将孔用PBS洗涤。
将纯化的CD34+细胞以20,000个细胞/孔铺板在包含StemSpan SFEM II培养基(STEMCELL Technologies)与StemSpan淋巴系祖细胞扩增补充物(STEMCELLTechnologies)的淋巴系祖细胞扩增培养基(“LPEM”)中。将细胞以500μl/孔一式两份地铺板，然后置于大气氧气和5％CO2的加湿培养箱中。用流式细胞术定量每孔分配的确切细胞数量以供以后计算。
在第三天或第五天，添加另外500μl/孔的LPEM，然后在第七天和第十一天，取出一半培养基并且用新鲜LPEM替代。
在第七天和第十四天，通过流式细胞术分析细胞以定量CD7+/CD5-、CD5+/CD7-和CD7+/CD5+的淋巴系谱系表型以及成熟B细胞(CD19+)、T细胞(CD3+)或NK细胞(CD56+)的存在。
在淋巴系祖细胞分化培养14天后，将细胞置于T细胞和NK细胞成熟培养物中。
对于T细胞成熟培养，将24孔未TC处理的板用StemSpan淋巴系分化包被材料(STEMCELL Technologies)根据制造商的说明进行包被。在即将开始T细胞成熟培养之前，将孔用PBS洗涤。将来自淋巴细胞分化培养物的细胞以50,000个细胞/孔铺板在500μl T细胞祖细胞成熟培养基中，所述培养基包含StemSpan SFEM II培养基与StemSpan T细胞祖细胞成熟补充物。
对于NK细胞成熟培养，将来自淋巴细胞分化培养物的细胞以25,000个细胞/孔铺板在具有250μl NK细胞分化培养基的TC处理的48孔板中，所述培养基包含StemSpan SFEMII培养基与StemSpan NK细胞分化补充物和根据制造商的说明制备(除了用100nM的UM171取代方案中要求的1μM UM729)的UM171(STEMCELL Technologies)。
在培养4天后，通过添加等体积的在第14天添加的相同培养基来补充NK细胞和T细胞成熟培养物的培养基。在NK细胞或T细胞成熟培养的第21天和第25天，通过在不干扰细胞的情况下去除一半总体积的培养基并且添加如第14天那样新鲜制备的培养基来进行半培养基更换。
在NK细胞和T细胞成熟培养7天和14天后(分别从淋巴系分化培养开始起21天和28天)，将细胞用针对CD56、CD3、CD161、CD94和CD16的抗体染色并且通过流式细胞术进行分析以定量T和NK谱系表型。
将T细胞成熟培养继续另外14天，以50,000-75,000个细胞/孔铺板到用如上淋巴系分化包被材料新鲜包被的24孔未TC处理的板中。在这14天时间段内继续培养，并且每3-4天进行半培养基更换。
在淋巴系祖细胞分化和T细胞成熟培养总共42天后，将来自14天+式I扩增的淋巴细胞分化培养物和14天DMSO扩增的淋巴细胞分化培养物的T细胞如下置于CD8成熟培养物中：将24孔板用如上淋巴细胞分化包被培养基包被。将细胞以50,000个细胞/孔铺板到CD8SP T细胞成熟培养基中，所述培养基包含StemSpan SFEM II、T细胞祖细胞成熟培养基、ImmunoCult人CD3/CD28 T细胞激活剂(STEMCELL Technologies)和根据制造商的说明制备的IL-15(10ng/mL，STEMCELL Technologies)。在此成熟培养基中培养6天后，通过针对CD3、CD8α、CD4、CD56进行染色并且在Attune NxT流式细胞仪上进行流式细胞术对细胞进行成熟T细胞表型分析。
计算量
计算许多量来描述分化培养输出以及扩增和分化培养的组合效果。这些量及其关系如下所述，一些另外描绘在图67中。
通过将最终计数除以在培养分割期间或在CD34+富集后再接种的细胞的分数来计算给定细胞群体的“校正计数”以解释在培养过程中弃去的细胞。
通过将在第14天或第21天CD34+细胞的校正计数除以在引发后第1天接种的CD34+细胞的计数来计算CD34+细胞的“倍数扩增”。
“按每个测定CD34+细胞的输出”描述了分化细胞输出/置于分化培养物中的CD34+细胞，并且通过以下方式计算：将谱系阳性细胞的校正计数除以在1、14、28、42或64天扩增培养后置于分化培养开始时定量的CD34+细胞的数量。
“度量输出(scaled output)”(或度量输出/个CD34+细胞)描述了在扩增细胞培养(如果扩增)、然后分化培养两者后可从单一CD34+细胞产生的给定谱系的分化细胞的数量。此量通过以下方式计算：将按每个测定CD34+细胞的输出乘以从第1天至分化培养开始日(第14、28、42或64天)的CD34+细胞倍数扩增。此量与上面实施例38中所用的“按每个扩增d1-CD34+细胞的输出”同义。
计算“倍数增强(相对于未扩增)”以完全捕获在分化培养之前在+式I条件中扩增培养的益处。此量通过以下方式计算：将给定细胞群的度量输出的输出除以来自置于分化培养物中的未扩增细胞的该细胞群体的按每个测定CD34+细胞的输出，如下等式所示。相对于相同分化培养天数计算每个倍数增加，例如，通过以下方式计算分化六天的细胞倍数增加：将分化六天的扩增细胞的度量输出除以分化六天的未扩增细胞的输出。在细胞分化14天的情况下，未扩增细胞中的确切匹配不可用，因此使用在分化第13天的输出作为分母。
Figure BDA0003443861290001101
“成人外周血单位当量/CBU”通过以下方式计算：将每种条件的度量输出(每个CD34+细胞)乘以106(脐带血单位中CD34+细胞数量的保守估计)，然后将该量除以典型地在一单位的捐赠的成人外周血中发现的CD56+、CD3+或CD8+细胞的数量：5x107(CD56+)、109(CD3+)或3x108，根据Invitrogen(https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/I-076357％20cell％20count％20table％20topp_WEB.pdf)。
结果
图68中示出的倍数CD34+细胞扩增的流式细胞术分析显示，在+式I条件中的培养显著增加了源自起始细胞的总CD34+细胞数量，并且其程度比在对照条件中的培养更大。事实上，图68示出了在第14天天，+式I条件使CD34+细胞扩增35倍，而对照条件使CD34+细胞仅扩增7倍。在21天扩增条件中，+式I条件使CD34+细胞扩增了245倍。
图69示出了体外扩增培养有时使从输入CD34+细胞产生的给定祖细胞群体的细胞的数量(“按每个测定CD34+细胞的输出”)减少。这对于CD10+(图69A)和CD7+CD5-(图69B)群体是正确的。在+式I条件中21天的培养未显示出CD7-CD5+(图69C)和CD5+CD7+(图69D)群体的显著抑制，尽管在+式I条件中14天培养是这样的。
尽管有时看到按每个测定CD34+细胞的输出下降，图70和图71示出了与未扩增细胞和在对照条件中扩增的细胞两者相比，在+式I条件中总CD34+细胞的大量扩增驱动在CD34+扩增培养后祖细胞群体的总输出的总体增加。事实上，CD10+谱系输出的总的按每个扩增第1天CD34+细胞的输出在+式I扩增培养物中14天后增强了5倍并且在第21天增强了37倍(图71A)，CD7+/CD5-谱系输出在+式I扩增培养物中14天后增强了6.3倍并且在+式I扩增培养物中21天后增强了46倍(图71B)，总CD7-/CD5+谱系输出在+式I扩增培养物中14天后增强了11倍并且在+式I扩增培养物中21天后增强了180倍(图71C)，并且总CD7+/CD5+谱系输出在+式I扩增培养物中14天后增强了5.8倍并且在+式I扩增培养物中21天后增强了238倍(图71D)。
在淋巴系分化培养前14天中看到早期淋巴系祖细胞的扩增，并且上述也与分化细胞衍生能力增强相匹配。事实上，尽管在NK分化28天后在CD56+细胞(图72A)中以及在T祖细胞成熟28天后在CD3+细胞(图72B)和CD8+细胞(图72C)中观察到按每个测定CD34+细胞的输出的预期下降，但CD34+细胞的先前扩增导致CD56+细胞(图73A)、CD3+细胞(图73B)和CD8+细胞(图73C)的总体数量更高。这种扩增的值清楚地示出在图74中，其描绘了“成人外周血单位当量/CBU”，说明了相对于在典型单位(470ml)的捐赠全血中发现的数量，由给定分化培养物产生的细胞数量。对于NK细胞的优点最明显(图74A)，NK细胞在外周血中相对稀少，使得在NK细胞培养之前在+式I条件中的21天扩增产生5000当量的供体NK细胞。与NK细胞相比，T细胞在外周血中相对更丰富。尽管如此，我们的首先在+式I条件中扩增的细胞的T细胞成熟培养然而产生15或18当量的供体总CD3+或CD3+/CD8+细胞(图74B-C)，而未扩增、对照扩增或14天扩增的培养物仅产生单一供体的细胞的分数，单一供体的细胞产率的从6％至49％。在+式I条件中先前扩增的益处可以清楚地在图75中看到，其描绘了由于在开始分化培养之前在+式I条件中扩增，CD56+细胞(图75A)、CD3+细胞(图75B)和CD8+细胞(图75C)输出的倍数增强。
在细胞分化的另外测量中，表11中示出了对于NK和CD8 T细胞，达到成熟表型的细胞的百分比。此数据显示，可以从首先在+式I条件中扩增14天的CD34+细胞成熟出CD8α+和CD56+细胞两者的高纯群体，其中CD56+NK细胞达到总活细胞的93％并且CD8α+细胞占CD3+细胞的95％。NK细胞也获得了早期成熟标记物，包括CD161，但没有显示出晚期成熟标记物CD16或CD94的普遍表达。
表11-从+式I扩增的CD34+细胞成熟NK和T细胞培养物。
Figure BDA0003443861290001111
Figure BDA0003443861290001121
实施例42：用于在+式I条件中扩增培养后增强粒细胞前体和成熟粒细胞的衍生的分化培养基条件。
本实施例证明，即使CD34+细胞在+式I条件中的初始扩增相对短，粒细胞前体的数量也可以显著增加，并且虽然这种CD34+扩增增强在测试的每种培养基中的分化，但我们的新型分化培养条件相对于公开且商业上可用的从脐带血CD34+细胞生产粒细胞祖细胞的方法提供了许多优点。
材料和方法
来自脐带血的低温保存的CD34+细胞购自STEMCELL Technologies。由供应商使用阳性免疫磁性分离技术从脐带血样品中分离原代人CD34+细胞。将细胞解冻，逐渐达到室温，然后洗涤。
通过在含各100ng/mL的FLT3L、TPO、SCF和IL-6的StemSpan SFEM I中过夜培养将细胞引发以进行扩增。十八至二十四小时后(第1天)，对细胞进行计数和免疫表型分析(在Invitrogen Attune NxT细胞仪上的流式细胞术)。
然后将细胞置于此处所述的“HSC扩增培养物”中，或直接置于含STEMCELL的髓系StemSpan髓系扩增补充物(粒细胞)的分化培养物中。在StemSpan SFEM II(STEMCELL)中制备用于扩增CD34+细胞数量的培养基，并且添加到一式两份25cm2烧瓶中(每个烧瓶4ml总体积)。扩增培养条件还包含含有青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素溶液，以避免污染。用于测试的条件的另外的培养基组分和浓度如上表9中所述。扩增培养物的所有孵育均在3％氧气(由氮气控制)和5％CO2下进行。
在扩增培养期间，采集样品用于细胞计数和表型分析。当细胞密度大于≥1e5个细胞/mL时，将细胞按1:10至1:20分割并且再接种到相同尺寸的烧瓶中或传代到更大烧瓶中(75cm2或225cm2)。
在培养14、28、42和64天后，从烧瓶中采集样品用于表型分析(在InvitrogenAttune NxT细胞仪上的流式细胞术)。然后使用CD34 MicroBead Kit-UltraPure(MiltenyiBiotec)将CD34+细胞再富集。通过流式细胞术验证CD34纯度。在第14、28、42和64天，将这些CD34+细胞的多个部分置于各种分化培养物中，下面所述。在第14、28和42天，将剩余的CD34+细胞放回扩增培养物中，如在第一天那样制备新鲜的扩增培养基，并且将细胞接种到新鲜的25cm2烧瓶中。如上实施例中所述进行分割和再接种。
祖细胞分化和成熟培养物
在CD34扩增培养14、28、42和64天后开始祖细胞分化培养。通过在一系列分化培养基中培养细胞六或七天创建分化序列。制造分化培养基，其含纯化的细胞因子：SCF、G-CSF、GM-CSF、FLT3L、IL-3、IL-6、TPO(均来自R&D Systems)，在StemSpan SFEM I或RPMI+10％FBS中制备，如下表12A和表12B中所示。在分化培养开始时，将大约5,000-10,000个CD34+细胞接种到在12孔板中的表13中指示的“第0天培养基”中。在第二天或第三天，将一部分细胞接种到序列中的后续培养基中。如果在给定日期将培养基更换为不同的分化培养基，则首先将细胞置于15mL锥形管中并且以300x g离心5分钟。在重新悬浮于新培养基中和重新铺板之前去除所有上清液。在第6天或第7天，如表13和表15所示，分析一部分细胞。
通过以下方式进行成熟培养：继续表13中的分化序列，在分化培养基中总共10-14天，以通过表14中所示分化序列的培养驱动细胞从早期祖细胞朝向成熟嗜中性粒细胞。在表14和表16所指示的天数，采集每种培养物的一部分进行分析(在Attune NxT细胞仪上的流式细胞术)。
计算量
计算许多量来描述分化培养输出以及扩增和分化培养的组合效果。这些量及其关系如实施例41所述和图68所描绘。
表12A-实施例42中所用的细胞因子/生长因子混合料
Figure BDA0003443861290001131
Figure BDA0003443861290001141
表12B-实施例42中所用的细胞因子+小分子混合料
Figure BDA0003443861290001142
表13-用于六或七天祖细胞分化培养的分化序列
Figure BDA0003443861290001143
表14-用于祖细胞成熟培养的分化序列
(10-14天分化培养)
Figure BDA0003443861290001144
Figure BDA0003443861290001151
结果
如在先前实施例中，在+式I(扩增细胞培养物)条件中的培养导致相对于起始和相对于置于对照条件中的细胞两者而言CD34+细胞的显著扩增。事实上，如图76中所示，通过在对照条件中培养仅导致CD34+细胞数量在第14天扩增约69倍、在第28天66至140倍、在第42天10至12倍并且在第64天约3.5倍，而在+式I条件中的培养导致第14天约270倍扩增、在第28天940至3,500倍扩增、在第42天7,700至12,000倍扩增并且在第64天约86,000倍。
用于从+式I扩增的CD34+细胞衍生CD15+细胞的优化分化培养基
在表12中所述的分化培养基和表13和表14中所述的分化序列中，大多数是新衍生的，而一些基于已公开的方案，特别是QS和AN(QS来自Gupta,D.,Shah,H.P.,Malu,K.,Berliner,N.和Gaines,P.(2014).Differentiation and Characterization of MyeloidCells.In Current Protocols in Immunology,J.E.Coligan,B.E.Bierer,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober编辑,美国新泽西州霍博肯:John Wiley&Sons,Inc.；AN来自Jie,Z.,Zhang,Y.,Wang,C.,Shen,B.,Guan,X.,Ren,Z.,Ding,X.,Dai,W.和Jiang,Y.(2017).Large-scale ex vivo generation of human neutrophils from cordblood CD34+cells.PLOS ONE 12,e0180832)。在许多情况下，新衍生的分化培养基和序列表现优于先前公开的那些，特别是当用已在+式I条件中扩增延长的时间段的CD34+细胞开始时(将来自Gupta和Jie的条件的CD15+细胞的按每个CD34的输出(第4行和第6行)与表15中的其他行进行比较)。如下参考表所见，这些差异早在分化培养物中6或7天就很明显。
表15-比较分化培养基的短期分化培养
Figure BDA0003443861290001152
例如，Jie及同事(2017)显示，在仅细胞因子的CD34+扩增培养六天后，在分化培养基A中培养三天、然后在培养基N中培养导致优异的扩增(分化序列AN)。然而，在+式I条件中扩增42天后，将细胞维持在培养基A中分化培养慢六天(分化序列AA)，而不是过渡到培养基N中(分化序列AN)，导致CD15+细胞的按每个CD34+的输出为226％。比较表15第3行(AA)与第6行(AN)。
类似地，Gupta等人规定在培养基Q中培养三天，然后在培养基S中培养三天。在原始出版物中，使用的培养基是RPMI+10％FBS。我们选择使用SFEM I以便使结果与我们的其他培养条件更具可比性，因为在SFEM I中的培养典型地优于在RPMI+FBS中的培养。此培养基序列(QS，表15中第4行)比测试的大多数其他序列表现更差，并且在长达第六或七天测试的十五个培养序列中是第三低扩增的。
总之，用由Jie等人和Gupta等人规定的条件实现的CD15+细胞的较差输出证明，开发用于新鲜分离的脐带血CD34+细胞的粒细胞分化条件的先前工作没有提供用于扩增已在+式I条件中扩增的细胞的可靠指导。为了从在式I条件中扩增的CD34+细胞的分化粒细胞祖细胞的最佳输出，需要新颖的条件和序列。
由在分化培养之前在+式I条件中扩增培养导致的总CD15+祖细胞的输出增加
在分化培养之前CD34+细胞的大量扩增导致CD15+细胞的度量输出相应地大量增加，特别是在早期分化培养时间点时。事实上，表16和图77显示在分化培养之前在+式I条件中CD34+扩增14、28、42和64天使CD15+细胞输出在第六天或第七天分别增加大约400至640倍(图77A，条件AA和TT)、800至1,100倍(图77B，条件BB和HH)、2,200至16,000倍(图77C，条件AA、AN、CC、CN、QS和QE)和约43,000倍(图77D，条件TT)。在分化培养的第10、12、13和14天，看到倍数增强相对较低但然而显著倍数增加。这是因为相对于未扩增细胞的成熟，在扩增培养后开始CD15+细胞在分化培养物中更快成熟，下面更详细地讨论。
表16-在一系列分化序列中，通过在+式I条件中的扩增培养增强CD15+输出
Figure BDA0003443861290001161
Figure BDA0003443861290001171
a-STEMCELL的髓系StemSpan髓系扩增补充物(粒细胞)
使用+式I扩增的CD34+细胞进行分化培养使CD15+祖细胞的纯度增加且衍生更快
除了由在分化培养开始前在“+式I条件”中的扩增培养导致总CD15+祖细胞的输出在数量上更优越之外，图78和图79示出了与现有方法相比，新描述的培养条件既增加所得培养物的纯度又增加可产生相对纯的CD15+细胞培养物的速度。作为基准，我们使用STEMCELL的髓系扩增补充物(目录号02693)，根据制造商的网站(着重强调)其“被配制为选择性促进从人脐带血分离的CD34+细胞的扩增和粒细胞分化”。另外，制造商网站上有在用此补充物制造的分化培养基在培养的细胞群体的特征的表，复制在下表17中。
表17-随附STEMCELL的髓系扩增补充物的信息
Figure BDA0003443861290001172
在此表中值得注意的是由在此培养基中14天导致的CD15+细胞的百分比，其具有47％的平均值并且置信限为39％-55％。通过比较，图78示出了在培养基A、B、C、H或T中分化培养之前在+式I条件中扩增14、28和42天的细胞一致地超过47％，到6至7天的CD15+阈值(图78A)接近86％-98％，到培养9或10天CD15+阳性(图78B)，并且将这种高的CD15+细胞纯度维持第13或14天(图78C)。
图79示出了图78中所示的总CD15+细胞的快速增加伴随有成熟CD15+细胞的增加，如通过其CD15+/CD11b+表面表型的获得测量，表明细胞早在第6天到第7天就已经成熟到或超过嗜中性粒细胞分化的中幼粒细胞阶段(图79A)并且这种成熟维持在第9-10天(图79B)并且直至第13-14天(图79C)。
作为在+式I条件中扩增的细胞恰当地成熟为粒细胞的能力的另外证明，我们定量了已另外上调常用粒细胞标记物CD66b的CD15+细胞的百分比。图80示出了在培养9或12天后，分别在培养基B或培养基H中培养的CD15+细胞的超过35％已上调CD66b。
尽管出于清楚理解的目的，前述发明已通过说明和举例的方式被稍微详细地描述，但本领域技术人员应理解，可以在所附权利要求的范围内实践某些改变和修改。另外，将本文提供的每篇参考文献通过引用以其整体并入，其程度就如同每篇参考文献均单独地通过引用并入一样。在本申请与本文提供的参考文献存在冲突的情况下，应以本申请为准。

Claims (186)

1.一种用于在培养物中制备寡能和单能粒细胞祖细胞群体的方法，所述方法包括使扩增的CD34+细胞源与一组粒细胞谱系调节剂在培养物中接触，从而制造寡能和单能粒细胞祖细胞群体，
其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少200倍增加。
2.一种用于在培养物中制备寡能和单能祖细胞群体的方法，所述方法包括使扩增的CD34+细胞源与一组谱系调节剂在培养物中接触，从而制造寡能和单能祖细胞群体，
其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少20倍增加。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述原始的CD34+细胞源选自骨髓、脐带血、动员外周血、和非动员外周血。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述原始的CD34+细胞源是动员外周血。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述原始的CD34+细胞源是脐带血。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述原始的CD34+细胞源是骨髓。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述原始的CD34+细胞源是非动员外周血。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少100倍增加。
9.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少500倍增加。
10.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少1,000倍增加。
11.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少5,000倍增加。
12.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少10,000倍增加。
13.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少25,000倍增加。
14.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少50,000倍增加。
15.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少100,000倍增加。
16.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少150,000倍增加。
17.根据权利要求2所述的方法，其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少500倍增加，并且所述原始的CD34+细胞源是脐带血。
18.根据权利要求2所述的方法，其中所述扩增的CD34+细胞源源自原始的CD34+细胞源，与所述原始的CD34+细胞源相比，CD34+细胞的数量已经过至少20倍增加，并且所述原始的CD34+细胞源是骨髓或动员的血。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述扩增的CD34+细胞源通过以下方式制备：使在培养物中的所述原始的CD34+细胞源与有效量的式I的化合物
Figure FDA0003443861280000021
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物接触，从而使来自在培养物中的所述原始的CD34+细胞源的CD34+细胞的数量增加；
其中
A是稠合环状部分，所述稠合环状部分选自苯基、C3-6环烷基、杂环烷基、和杂芳基；
其中每个杂环烷基包含从3至6个环成员，具有1至3个氮原子环成员，并且
每个杂芳基包含5至6个环成员，具有1至3个氮原子环成员；
R1选自-C(O)-NRb-R1a、-NRb-C(O)-R1a、-NRb-C(O)-R1b、-NRb-X1-C(O)-R1a、-C(O)-X1-NRb-R1a、-X1-C(O)-NRb-R1a、-X1-NRb-C(O)-R1a、-NRb-C(O)-X1-C(O)-R1b、-C(O)-NRb-X1-C(O)-R1b、-NRb-C(O)-O-R1a、-O-C(O)-NRb-R1a、-X1-NRb-C(O)-O-R1a、-X1-O-C(O)-NRb-R1a、-NRb-R1a、和-C(O)-R1a；
R1a选自H、C1-10烷基；C1-10卤代烷基；
R1b选自-ORa、-NRaRb，
每个R2独立地选自卤素、-CN、-C1-8烷基、-C2-8烯基、C2-8炔基、C1-8卤代烷基、-C1-8烷氧基、-X1-C1-8烷氧基、-C(O)-R2a、-NRb-C(O)-R2a、-SRa、-X1-SRa、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb、-X1-NRaRb、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-X1-S(O)2Ra、和-X1-S(O)2NRaRb
每个R3独立地选自卤素、-CN、-C1-8烷基、-C2-8烯基、C2-8炔基、C1-8卤代烷基、-C1-8烷氧基、-X1-C1-8烷氧基、-C(O)-R3a、-SRa、-X1-SRa、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb、-X1-NRaRb、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-X1-S(O)2Ra、和-X1-S(O)2NRaRb；
每个R2a和R3a独立地选自H、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb、和-X1-NRaRb；
R4a选自-ORa和-NRaRb；
R4b是H；或R4a和R4b组合形成氧代基或肟部分；
每个Ra和Rb独立地选自H和C1-4烷基；
每个X1是C1-4亚烷基；
下标n是从0至3的整数；并且
下标m是从0至2的整数。
20.根据权利要求19所述的方法，其中
A是稠合环状部分，所述稠合环状部分选自C3-6环烷基、杂环烷基、和苯基，
其中每个杂环烷基包含从3至6个环成员，具有1至3个氮原子环成员。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中
A是稠合环状部分，所述稠合环状部分选自C3-6环烷基和苯基。
22.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中
A是稠合苯基。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中
R4a是-ORa；R4b是H；或R4a和R4b组合形成氧代基部分。
24.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中
R4a是-ORa；并且R4b是H。
25.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中
R4a是-NRaRb；并且R4b是H。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中
R1选自-C(O)-NRb-R1a、-NRb-C(O)-R1a、-NRb-X1-C(O)-R1a、-C(O)-X1-NRb-R1a、-X1-C(O)-NRb-R1a、-X1-NRb-C(O)-R1a、-NRb-C(O)-X1-C(O)-R1b、-C(O)-NRb-X1-C(O)-R1b、-NRb-C(O)-O-R1a、-O-C(O)-NRb-R1a、-NRb-R1a、和-C(O)-R1a。
27.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中
R1选自-C(O)-NH-R1a、-NH-C(O)-R1a、-NH-C(O)-O-R1a、-O-C(O)-NH-R1a、-NH-R1a、和-C(O)-R1a。
28.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中
R1选自-NH-C(O)-R1a、-NH-C(O)-R1b、-NH-C(O)-O-R1a、和-NRb-R1a。
29.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中
R1选自-NH-C(O)-R1a、-NH-C(O)-R1b、和-NH-C(O)-O-R1a。
30.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中
R1是-NH-C(O)-R1a。
31.根据权利要求19至30中任一项所述的方法，其中
每个R2独立地选自卤素、-C1-8烷基、C1-8卤代烷基、-C1-8烷氧基、-X1-C1-8烷氧基、-C(O)-R2a、-NRb-C(O)-R2a-SRa、-X1-SRa、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb、-X1-NRaRb、-O-C(O)-Ra。
32.根据权利要求19至31中任一项所述的方法，其中
每个R3独立地选自卤素、-C1-8烷基、-C1-8卤代烷基、-C1-8烷氧基、-X1-C1-8烷氧基、-C(O)-R3a、-SRa、-X1-SRa、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb、-X1-NRaRb、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-X1-S(O)2Ra、和-X1-S(O)2NRaRb。
33.根据权利要求19至32中任一项所述的方法，其中
每个R2和R3独立地选自卤素、-C1-8烷基、C1-8卤代烷基、-C1-8烷氧基、-X1-C1-8烷氧基、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb、-X1-NRaRb、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-X1-S(O)2Ra、和-X1-S(O)2NRaRb。
34.根据权利要求19至32中任一项所述的方法，其中
每个R2和R3独立地选自卤素、-C1-8烷基、C1-8卤代烷基、-C1-8烷氧基、-X1-C1-8烷氧基、-ORa、-NRb-C(O)-R2a-X1-ORa、-NRaRb、和-X1-NRaRb。
35.根据权利要求19至32中任一项所述的方法，其中
每个R2和R3独立地选自卤素、-C1-8烷基、C1-8卤代烷基、-ORa、-X1-ORa、-NRaRb、和-X1-NRaRb。
36.根据权利要求19至32中任一项所述的方法，其中
每个R2和R3独立地选自-ORa、-X1-ORa、-NRaRb或-X1-NRaRb。
37.根据权利要求19至36中任一项所述的方法，其中
R1a是C1-6烷基或C1-6卤代烷基。
38.根据权利要求19至36中任一项所述的方法，其中
R1a是C1-6烷基。
39.根据权利要求19至36中任一项所述的方法，其中
R1a是C2-6烷基或C1-6卤代烷基。
40.根据权利要求19至36中任一项所述的方法，其中
R1a是C2-6烷基。
41.根据权利要求19至36中任一项所述的方法，其中
R1b是-ORa。
42.根据权利要求19至36中任一项所述的方法，其中
R1b是-OH。
43.根据权利要求19至42中任一项所述的方法，其中
每个Ra和Rb独立地选自H和C1-2烷基。
44.根据权利要求19至43中任一项所述的方法，其中
每个X1是C1-2亚烷基。
45.根据权利要求19至43中任一项所述的方法，其中
每个X1是C1亚烷基。
46.根据权利要求19至45中任一项所述的方法，其中
下标n是从1至3的整数。
47.根据权利要求19至45中任一项所述的方法，其中
下标n是1。
48.根据权利要求19至45中任一项所述的方法，其中
下标n是0。
49.根据权利要求19至48中任一项所述的方法，其中
下标m是从1至2的整数。
50.根据权利要求19至48中任一项所述的方法，其中
下标m是0。
51.根据权利要求19至48中任一项所述的方法，其中
下标m是1。
52.根据权利要求19至51中任一项所述的方法，其中所述式I的化合物具有式I-1或I-2的结构
Figure FDA0003443861280000041
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R4a选自-ORa和-NRaRb；
R4b是H。
53.根据权利要求26至51中任一项所述的方法，其中所述式I的化合物具有式Ia的结构
Figure FDA0003443861280000042
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述式Ia的化合物具有式Ia’的结构
Figure FDA0003443861280000043
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述式Ia的化合物具有式Ia1或Ia2的结构
Figure FDA0003443861280000051
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R4a选自-ORa和-NRaRb；
R4b是H。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述式Ia1或Ia2的化合物具有式Ia1’或Ia2’的结构
Figure FDA0003443861280000052
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
57.根据权利要求26至51中任一项所述的方法，其中所述式I的化合物具有式Ib或Ic的结构
Figure FDA0003443861280000053
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述式Ib的化合物具有式Ib1或Ib2的结构。
Figure FDA0003443861280000054
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R4a选自-ORa和-NRaRb；
R4b是H。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述式Ic的化合物具有式Ic1或Ic2的结构。
Figure FDA0003443861280000055
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其中
R4a选自-ORa和-NRaRb；
R4b是H。
60.根据权利要求52至59中任一项所述的方法，其中R4a是-OH或-NH2。
61.根据权利要求52至59所述的方法，其中R4a是-OH。
62.根据权利要求19至51中任一项所述的方法，其中所述式I的化合物具有式II的结构
Figure FDA0003443861280000061
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
63.根据权利要求62所述的方法，其中
R1选自-NH-C(O)-R1a、-NH-C(O)-O-R1a；-NH-X1-C(O)-R1a和-NH-R1a；
每个R2和R3独立地选自-NH2、-OH、-X1-NH2、-X1-OH；
R1a选自C1-6烷基；和C1-6卤代烷基；
每个X1是C1-2亚烷基；
下标n是从0至2的整数；并且
下标m是0或1。
64.根据权利要求62或权利要求63所述的方法，其中所述式II的化合物具有式IIa的结构
Figure FDA0003443861280000062
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述式IIa的化合物具有式IIa’的结构
Figure FDA0003443861280000063
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述式IIa的化合物具有式IIa1的结构
Figure FDA0003443861280000064
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
67.根据权利要求65或权利要求66所述的方法，其中
R1选自-NH-C(O)-R1a；
R2独立地选自-NH2或-OH；
R1a选自C1-6烷基；和C1-6卤代烷基；并且
下标n是0或1。
68.根据权利要求62或权利要求63所述的方法，其中所述式II的化合物具有式IIb或IIc的结构
Figure FDA0003443861280000071
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述式IIb或IIc的化合物具有式IIb1或IIc1的结构
Figure FDA0003443861280000072
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
70.根据权利要求69所述的方法，其中
R1选自-NH-C(O)-R1a；
R2独立地选自-NH2或-OH；
R1a选自C1-6烷基；和C1-6卤代烷基；并且
下标n是0或1。
71.根据权利要求19至51中任一项所述的方法，其中所述式I的化合物具有式III的结构
Figure FDA0003443861280000073
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
72.根据权利要求71所述的方法，其中
R1选自-NH-C(O)-R1a、-NH-X1-C(O)-R1a、-NH-R1a、-O-C(O)-R1a、和卤基；
R1a选自C1-6烷基；和C1-6卤代烷基；
每个R2和R3独立地选自-NH2、-OH、-X1-NH2、-X1-OH；
每个X1是C1-2亚烷基；
下标n是从0至2的整数；并且
下标m是0或1。
73.根据权利要求71或权利要求72所述的方法，其中所述式III的化合物具有式IIIa的结构
Figure FDA0003443861280000081
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
74.根据权利要求71或权利要求72所述的方法，其中所述式III的化合物具有式IIIa’的结构
Figure FDA0003443861280000082
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
75.根据权利要求71或权利要求72所述的方法，其中所述式III的化合物具有式IIIa1的结构
Figure FDA0003443861280000083
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
76.根据权利要求74或权利要求75所述的方法，其中
R1是-NH-C(O)-R1a；
R2选自-NH2或-OH；
R1a选自C1-6烷基；和C1-6卤代烷基；并且
下标n是0或1。
或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。
77.根据权利要求19所述的方法，其中所述化合物选自表1。
78.根据权利要求19-77中任一项所述的方法，其进一步包括：使在培养物中的所述原始的CD34+细胞源与选自以下的一种或多种药剂接触：促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)、p38 MAPK抑制剂、表皮生长因子(EGF)、JAK/STAT抑制剂、白介素3(IL-3)、白介素6(IL-6)、人生长激素(HGH)、fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、VEGF-C和ALK5/SMAD调节剂或抑制剂。
79.根据权利要求19-77中任一项所述的方法，其进一步包括：使在培养物中的所述原始的CD34+细胞源与促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、和fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3L)接触。
80.根据权利要求19-77中任一项所述的方法，其进一步包括：使在培养物中的所述原始的CD34+细胞源与fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、和白介素3(IL-3)接触。
81.根据权利要求19-77中任一项所述的方法，其进一步包括：使在培养物中的所述原始的CD34+细胞源与fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、白介素3(IL-3)、和白介素6(IL-6)接触。
82.根据权利要求19-77中任一项所述的方法，其进一步包括：使在培养物中的所述原始的CD34+细胞源与促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、和白介素6(IL-6)接触。
83.根据权利要求19至82中任一项所述的方法，其中在用所述式I的化合物培养之前，使所述原始的CD34+细胞源与引发培养物接触。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述引发培养物包含促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、和白介素6(IL-6)。
85.根据权利要求2至82中任一项所述的方法，其中所述一组谱系调节剂是一组红系谱系调节剂，从而制造寡能和单能红细胞祖细胞群体。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述寡能和单能红细胞祖细胞群体包含CD71+的细胞表面表型。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述寡能和单能红细胞祖细胞群体进一步包含CD45-的细胞表面表型。
88.根据权利要求85至87中任一项所述的方法，其中所述寡能和单能红细胞祖细胞群体包含CD235a+的细胞表面表型。
89.根据权利要求85中任一项所述的方法，其中所述寡能和单能红细胞祖细胞群体包含CD45-、CD71-和CD235a+的细胞表面表型。
90.根据权利要求86至89中任一项所述的方法，其中在培养7天后，所述寡能和单能红细胞祖细胞群体占总细胞的至少25％至40％。
91.根据权利要求85至90中任一项所述的方法，其中所述一组红系谱系调节剂包括SCF、IL-3和EPO。
92.一种寡能和单能红细胞祖细胞群体，其为根据权利要求85至91中任一项所述的。
93.一种治疗剂，其包含根据权利要求92所述的寡能和单能红细胞祖细胞群体。
94.一种药物组合物，其包含根据权利要求92所述的治疗剂和至少一种生理上可接受的载体。
95.一种治疗需要红系重建的个体的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求93所述的治疗剂或根据权利要求94所述的药物组合物。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述个体疑似患有癌症。
97.根据权利要求95所述的方法，其中所述方法用作除化疗之外的补充治疗。
98.根据权利要求95所述的方法，其中所述方法用于缩短化疗治疗之间的时间。
99.一种治疗有需要的个体的贫血的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求93所述的治疗剂或根据权利要求94所述的药物组合物。
100.根据权利要求99所述的方法，其进一步包括施用EPO。
101.一种治疗有需要的个体的癌症的方法，其包括
a)基因修饰根据权利要求92所述的群体以表达包含在癌细胞处或附近结合的靶向部分的第一外源多肽和具有抗癌功能的第二外源多肽；
b)以及向所述有需要的个体施用所述经基因修饰的根据权利要求92所述的群体。
102.根据权利要求2至82中任一项所述的方法，其中所述一组谱系调节剂是一组巨核细胞谱系调节剂，从而制造寡能和单能巨核细胞祖细胞群体。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述寡能和单能巨核细胞祖细胞群体包含CD41+的细胞表面表型。
104.根据权利要求102所述的方法，其中所述寡能和单能巨核细胞祖细胞群体包含CD41+/CD42b+的细胞表面表型。
105.根据权利要求103至104中任一项所述的方法，其中在培养7天后，所述寡能和单能巨核细胞祖细胞群体占总细胞的至少20％。
106.根据权利要求102至105中任一项所述的方法，其中所述一组巨核细胞谱系调节剂包括SCF、IL-6、IL-9、和TPO。
107.一种寡能和单能巨核细胞祖细胞群体，其为根据权利要求102至106中任一项所述的。
108.一种治疗剂，其包含根据权利要求107所述的寡能和单能巨核细胞祖细胞群体。
109.一种药物组合物，其包含根据权利要求108所述的治疗剂和至少一种生理上可接受的载体。
110.一种治疗需要巨核系重建的个体的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求108所述的治疗剂或根据权利要求109所述的药物组合物。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述个体疑似患有癌症。
112.根据权利要求110所述的方法，其中所述方法用作除化疗之外的补充治疗。
113.根据权利要求110所述的方法，其中所述方法用于缩短化疗治疗之间的时间。
114.一种治疗有需要的个体的血小板减少症的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求108所述的治疗剂或根据权利要求109所述的药物组合物。
115.根据权利要求114所述的方法，其进一步包括施用艾曲波帕或罗米司亭。
116.根据权利要求2至82中任一项所述的方法，其中所述一组谱系调节剂是一组粒细胞谱系调节剂，从而制造寡能和单能粒细胞祖细胞群体。
117.根据权利要求1或权利要求116所述的方法，其中所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体包含CD15+的细胞表面表型。
118.根据权利要求1或权利要求117所述的方法，其中所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体进一步包含CD14-和/或CD34-的细胞表面表型。
119.根据权利要求1或116至118中任一项所述的方法，其中所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体包含CD11b+和/或CD16+的细胞表面表型。
120.根据权利要求1、权利要求116或权利要求117所述的方法，其中所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体包含CD66b+的细胞表面表型。
121.根据权利要求1或116至120中任一项所述的方法，其中所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体包含早期粒细胞祖细胞。
122.根据权利要求1或116至121中任一项所述的方法，其中所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体包含中幼粒细胞。
123.根据权利要求121或122所述的方法，其中所述早期粒细胞祖细胞和/或中幼粒细胞群体包含CD15+/HLA-DR+的细胞表面表型。
124.根据权利要求1或116至120中任一项所述的方法，其中所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体进一步包含HLA-DR-的细胞表面表型。
125.根据权利要求1、116至120、123或124所述的方法，其中所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体进一步包含CD11b-和/或CD16-的细胞表面表型。
126.根据权利要求1、116至120或124中任一项所述的方法，其中所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体进一步包含CD11b+的表型。
127.根据权利要求1、116至120、123、124或126所述的方法，其中所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体进一步包含CD16-的表型。
128.根据权利要求1、116至120、123、124或126中任一项所述的方法，其中所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体进一步包含CD16+的表型。
129.根据权利要求1或117至128中任一项所述的方法，其中在培养7天后，所述寡能和单能粒细胞祖细胞群体占总细胞的至少70％。
130.如权利要求1或116至129中任一项所述的方法，其中所述一组粒细胞谱系调节剂包含SCF、TPO、GM-CSF、和G-CSF。
131.一种寡能和单能粒细胞祖细胞群体，其为根据权利要求1或116至130中任一项所述的。
132.一种治疗剂，其包含根据权利要求131所述的寡能和单能粒细胞祖细胞群体。
133.一种药物组合物，其包含根据权利要求131所述的治疗剂和至少一种生理上可接受的载体。
134.一种治疗需要粒系重建的个体的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求132所述的治疗剂或根据权利要求133所述的药物组合物。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述个体疑似患有癌症。
136.根据权利要求134所述的方法，其中所述方法用作除化疗之外的补充治疗。
137.根据权利要求134所述的方法，其中所述方法用于缩短化疗治疗之间的时间。
138.一种治疗有需要的个体的嗜中性粒细胞减少症的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求132所述的治疗剂或根据权利要求133所述的药物组合物。
139.根据权利要求138所述的方法，其进一步包括施用G-CSF或聚乙二醇化G-CSF。
140.一种治疗有需要的个体的癌症的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求132所述的治疗剂或根据权利要求133所述的药物组合物与抗癌生物制剂的组合。
141.根据权利要求2至82中任一项所述的方法，其中所述一组谱系调节剂是一组单核细胞谱系调节剂，从而制造寡能和单能单核细胞祖细胞群体。
142.根据权利要求141所述的方法，其中所述寡能和单能单核细胞祖细胞群体包含CD14+的细胞表面表型。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述寡能和单能单核细胞祖细胞群体进一步包含CD15低/-的细胞表面表型。
144.根据权利要求142至143中任一项所述的方法，其中在培养5天后，所述寡能和单能单核细胞祖细胞占总细胞的至少50％。
145.根据权利要求141至144中任一项所述的方法，其中所述一组单核细胞谱系调节剂包括SCF、TPO、FLT3L、M-CSF、和GM-CSF。
146.一种寡能和单能单核细胞祖细胞群体，其为根据权利要求141至145中任一项所述的。
147.一种治疗剂，其包含根据权利要求146所述的寡能和单能单核细胞祖细胞群体。
148.一种药物组合物，其包含根据权利要求147所述的治疗剂和至少一种生理上可接受的载体。
149.一种治疗需要单核系重建的个体的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求147所述的治疗剂或根据权利要求148所述的药物组合物。
150.根据权利要求149所述的方法，其中所述个体疑似患有癌症。
151.根据权利要求149所述的方法，其中所述方法用作除化疗之外的补充治疗。
152.根据权利要求149所述的方法，其中所述方法用于缩短化疗治疗之间的时间。
153.一种治疗有需要的个体的单核细胞减少症的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求147所述的治疗剂或根据权利要求148所述的药物组合物。
154.一种治疗有需要的个体的癌症的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求147所述的治疗剂或根据权利要求148所述的药物组合物与抗癌生物制剂的组合。
155.根据权利要求2至82中任一项所述的方法，其中所述一组谱系调节剂是一组淋巴细胞谱系调节剂，从而制造寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体。
156.根据权利要求155所述的方法，其中所述寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体包含CD7+的细胞表面表型。
157.根据权利要求155或权利要求156所述的方法，其中所述寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体包含具有细胞内CD3(iCD3)表型的细胞。
158.根据权利要求155所述的方法，其中所述寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体包含CD7+和CD5+的细胞表面表型。
159.根据权利要求155所述的方法，其中所述寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体包含CD7+/CD5+/CD1a+的细胞表面表型。
160.根据权利要求156至159中任一项所述的方法，其中在培养7天后，所述寡能和单能淋巴细胞祖细胞占总细胞的至少40％。
161.根据权利要求160所述的方法，其中所述一组淋巴细胞谱系调节剂包括notch配体、细胞粘附分子、IL-7、FLT3L、SCF和TPO。
162.根据权利要求160或权利要求161所述的方法，其中所述notch配体是Notch配体δ样4(DLL4)。
163.根据权利要求160或权利要求161所述的方法，其中所述细胞粘附分子是血管细胞粘附分子1(VCAM-1)。
164.根据权利要求160至163中任一项所述的方法，其中所述notch配体和/或所述细胞粘附分子固定在用于培养的表面上。
165.根据权利要求155至164中任一项所述的方法，其中所述一组淋巴细胞谱系调节剂进一步包括FBS。
166.一种寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体，其为根据权利要求155至165中任一项所述的。
167.一种治疗剂，其包含根据权利要求166所述的寡能和单能淋巴细胞祖细胞群体。
168.一种药物组合物，其包含根据权利要求167所述的治疗剂和至少一种生理上可接受的载体。
169.一种治疗需要淋巴系重建的个体的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求167所述的治疗剂或根据权利要求168所述的药物组合物。
170.根据权利要求169所述的方法，其中所述个体疑似患有癌症。
171.根据权利要求169所述的方法，其中所述方法用作除化疗之外的补充治疗。
172.根据权利要求169所述的方法，其中所述方法用于缩短化疗治疗之间的时间。
173.一种治疗有需要的个体的淋巴细胞减少症的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求167所述的治疗剂或根据权利要求168所述的药物组合物。
174.一种治疗有需要的个体的癌症的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求167所述的治疗剂或根据权利要求168所述的药物组合物与抗癌生物制剂的组合。
175.一种用于在培养物中制备寡能和单能祖细胞群体的系统，所述系统包含
(a)在培养物中的CD34+细胞源；
(b)包含式I的化合物的扩增细胞培养基；和
(c)包含一组红系谱系调节剂、巨核细胞谱系调节剂、粒细胞谱系调节剂、单核细胞谱系调节剂或淋巴细胞谱系调节剂的分化培养基。
176.根据权利要求175所述的系统，其中所述CD34+细胞源选自骨髓、脐带血、动员外周血、和非动员外周血。
177.根据权利要求176所述的系统，其中所述CD34+细胞源是脐带血。
178.根据权利要求176所述的系统，其中所述CD34+细胞源是动员外周血。
179.根据权利要求176所述的系统，其中所述CD34+细胞源是非动员外周血。
180.根据权利要求175-179中任一项所述的系统，其进一步包含(b-1)用于所述扩增细胞培养基的约20％氧气。
181.根据权利要求175-179中任一项所述的系统，其进一步包含(b-1)用于所述扩增细胞培养基的含有低氧气的气氛。
182.根据权利要求175-181中任一项所述的系统，其进一步包含(c-1)用于所述分化培养基的约20％氧气。
183.根据权利要求175-181中任一项所述的系统，其进一步包含(c-1)用于所述分化培养基的含有低氧气的气氛。
184.根据权利要求175-183中任一项所述的系统，其中所述CD34+细胞源是人类。
185.一种试剂盒，其包含：
(a)扩增细胞培养基础培养基或扩增细胞培养补料培养基；和式I的化合物；和
(b)分化培养基础培养基或分化培养补料培养基和一组红系谱系调节剂、巨核细胞谱系调节剂、粒细胞谱系调节剂、单核细胞谱系调节剂或淋巴细胞谱系调节剂。
186.根据权利要求185所述的试剂盒，其进一步包含(c)用于在培养物中维持和/或扩增造血干细胞以及用于使扩增的HSC定向分化为希望谱系的寡能和单能祖细胞的书面说明书。
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