KR101318965B1 - 인공적인 골수-유사 환경을 형성하는 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

인공적인 골수-유사 환경을 형성하는 조성물 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 생물학 및 의학 분야에 속하며 인공적인 골수-유사 환경을 형성하는 조성물 및 인 비트로(in vitro) 방법 및 그의 용도에 관한 것이다.
인공적인 골수 유사 환경(ABME), 조혈, 조혈 조절제, 줄기/전구 세포(SPC).

Description

인공적인 골수-유사 환경을 형성하는 조성물 및 그의 용도{A composition for creating an artificial bone-marrow like environment and use thereof}
본 발명은 세포 생물학 및 의학 분야에 속하며 인공적인 골수-유사 환경을 형성하는 조성물 및 인 비트로(in vitro) 방법 및 그의 용도에 관한 것이다.
인간에서, 10종 이상의 상이한 혈액 세포 및 뼈의 재생(rejuvenation)에 필요한 세포 및 광범위한 분화된 세포들을 생성할 수 있는 줄기/전구 세포(stem/progenitor cell:SPC)를 형성하는 주요 부위를 구성하는 "골수 미세환경(Bone marrow micro-environment)"(BME)이라 불리는 특화된 환경이 골강(bone cavity) 내에 존재한다. 인간의 건강은 "조혈(hematopoiesis)"이라 불리는 과정에 의해 생성되는 상이한 혈액 세포들의 지속적인 공급에 결정적으로 의존한다. BME는 전체의 조혈 과정을 구성하는 10종의 상이한 성숙 혈액 세포(mature blood cell)를 생성하기 위해 체내에서 순환할 수 있는 소수의 다능성(pluripotent) 줄기 및 전구 세포(SPC)를 지배할 수 있다. SPC는 체내에서 널리 분포되기 때문에, a) 골수 외부의 SPC가 BME로 귀소할 수 있게 하고(SPC-귀소(SPC-Homing)라 칭함), b) SPC와 BME 간의 적합한 부착성 상호작용(adhesive interaction)을 촉진하여 SPC를 BME 내에 유지시키고(융합(engraftment)이라 칭함), c) SPC의 증식을 촉진하기 위해 정지상 태의(quiescent) SPC의 활성화된 형태로의 전환을 가능하게 하고, d) 복수의 종종 상충되는 신호에도 불구하고 SPC가 아폽토시스(apoptosis)를 견뎌낼 수 있게 하고(SPC의 생존), e) SPC가 자기 재생의 경로(보다 많은 SPC를 생성하기 위해) 또는 계통 결정(lineage commitment) 및 분화 경로(보다 많은 성숙 혈액 세포를 생성하기 위해)를 따라 증식하도록 지시하기 위해 자연적인 메카니즘이 작동한다. 따라서, SPC를 포함하는 조혈에서 BME의 역할은 개별적으로 조절되고 정교하게 조화되어 개체의 생애를 통해 효율적인 복수-계통(multi-lineage) 혈액 세포 형성을 확보하는 일련의 단계들로 이해될 수 있다.
지속적이고 최적인 혈액 세포 생성을 가져오는 SPC 기능(귀소, 융합, 정지상태로부터의 활성화, 활성화된 SPC로부터 정지상태의 유도, 세포-생존, 자기 재생, 분화에 따른 계통 결정 및 증식)과 관계된 전체 과정이 BME에 의해 조절되나 이 조절에 관계된 정확한 메카니즘은 과학자들에 의해 완전히 이해되지 않고 있으며 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서 전술된 하나 이상의 단계를 조절하고 다양한 이용을 가능하게 하는 BME-유사 환경을 형성하는 방법은 종래 기술에 존재하지 않는다.
지금까지 종래 기술에서는, 골수에 존재하는 부속 세포들(accessory cells)은 SPC에 의해 요구되는 미세환경의 형성을 위해 그들의 인접한 주변에서 다양한 시토카인 및 성장 조절제를 기여할 뿐이고 따라서 조혈을 위해 요구되는 그와 같은 성분들의 수동적 원천(passive source)로 기능하는 것으로 이해되었다. 문헌에서 우세한 또 다른 관점은 부속 세포의 일부 집단만이 SPC 발달(development)을 지지 할 수 있는 능력을 갖는다는 것이다. 그러나, 본 출원인은 종래 기술의 그와 같은 의견에 반대하고 선택되지 않은 부속 세포들이 적합한 조건이 주어지면 SPC에 양질의(superior) 신호를 제공할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 출원인은 이제 혈액 세포 형성이 증강되거나 조절될 수 있는 인공적인 골수 유사 환경(ABME)의 생성을 보조하는 조성물을 개발하였다. 본 발명에 의해 개시된 조성물 및 방법은 조혈 과정의 모든 단계들이 실질적으로 개선될 수 있게 한다. 또한, 본 발명은 바람직한 효과가 발현되기 위해서는 ABME를 포함하는 부속 세포 또는 부속 세포들과 SPC의 단시간 접촉이 요구된다는 것을 강조하고, 따라서 부속 세포들이 적극적인 역할을 수행한다는 것을 강조한다. 따라서, 종래 기술에서, SPC를 확대하기 위한 시도들이 이루어졌다. 그러나, 현재까지 인 비트로에서 효과적인 인공적인 BME를 조성하는 것에 의해 혈액 세포 형성을 실질적으로 개선 또는 조절할 수 없었다. 본 발명은 이 요구를 충족시킨다.
본 발명의 목적은 혈액 세포 형성이 증강되거나 또는 조절될 수 있는 인공적인 골수 유사 환경의 개발을 보조하는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 그와 같은 환경을 준비하는 방법을 제공하는 것이다.
발명의 상세한 설명
I. 조성물:
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 혈액 세포 형성을 조절하는 인공적인 인-비트로 골수 환경(artificial in-vitro bone marrow environment:ABME)의 개발에 유용한 조성물로서:
(i) 중간엽 세포,
(ii) 생물학적 작용제, 화학적 작용제 및 면역학적 작용제로부터 선택된 조혈 조절제(hematopoietic modulator), 및
(iii) ABME를 형성하고 이를 구현하기 위한 배지를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 '조혈 조절제(hematopoietic modulator)'라는 용어는 인 비트로 조혈에서 중간엽 세포의 세포내 신호 또는 SPC 또는 양자 모두에 대한 조절성 효과를 통해 작용하고, 상기 조절제가 사용되지 않은 기준(reference)으로부터, 하나 이상의 계통의 혈액 세포들이 보다 많이 형성되거나 또는 둘 이상의 계통의 혈액 세포들의 상대적 비율이 변화되는 하나 이상의 단계를 변형시킬 수 있는 작용제를 의미한다. 그와 같은 작용제는 생물학적 작용제, 화학적 작용제 또는 면역학적 작용제일 수 있다. 조혈 조절제(hematomodulator)는 인공적인 인 비트로 BME의 개발에 필수적이고 본 발명은 조혈 조절제의 일부 예를 제공한다. 세 종류의 조혈 조절제가 효과적인 것으로 발견되었다; a) 생물학적 조절제, b) 화학적 조절제 및 면역학적 조절제. 본 명세서에서 이 조절제들을 '조혈 조절제(hematopoietic modulators 또는 hematomodulators)'로 칭한다.
생물학적 조혈 조절제:
생물학적 작용제 또는 생물학적 조혈 조절제는 1) 세포로부터 제조된 적합한 조건 배지(conditioned medium); 2) 전환 성장 인자 베타(TGFβ), 섬유아 세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 같은 성장 인자 및 세포 자극자(cell stimulator), 또는 3) 피브로넥틴, 비브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 및 인테그린 결합 도메인 또는 활성화 도메인(activating domain)을 포함하는 그들의 단편과 같은 천연 단백질 및 인테그린과 같은 그들의 수용체의 조절제로부터 선택될 수 있다. 상기 천연 단백질은 다양한 종 및 속에 존재하는 동종기원의 유전자(homologous gene)로부터 유래된 단백질 및 그들의 합성에 의해 생성된 기능적 동족체(homologue) 또는 모방체(mimetics)를 포함한다. 그와 같은 생물학적 조혈 조절제는 표적 세포에서 SPC-귀소, SPC-자기 재생, SPC-융합, SPC-분화 계통 결정 및 강건한 혈액 세포 형성(commitment to lineages for differentiation and robust blood cell formation)에 유용한 복수의 세포내 신호를 생성 또는 유지하는 것에 의해 작용한다. 조성물에서 상기 생물학적 작용제의 범위는 약 0.1 nM(nano-molar) 내지 50 μM(micro-molar)일 수 있다.
화학적 조혈 조절제:
조혈 조절제로 이용되는 화학적 작용제 또는 화학적 조혈 조절제는 표적 세포에서 SPC-귀소, SPC-자기 재생, SPC-융합, SPC-분화 계통 결정 및 강건한 혈액 세포 형성에 유용한 특정한 세포내 신호 전달의 부스터(booster) 또는 조절제일 수 있다. 그와 같은 화학적 작용제는 단백질, 펩티드 또는 그들의 기능성 동족체와 구조적으로 관련되거나 또는 관련되지 않을 수 있고 특정한 세포내 신호의 부스터로서 작용할 수 있다. 화학적 조혈 조절제는 하기로부터 선택될 수 있다:
(i) 단백질 키나아제 C 부스터, (ii) 상기 단백질 키나아제를 포함하는 시클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP)에 의해 활성화되는 과정의 부스터, (iii) FAK(focal adhesion kinase)의 부스터, (iv) PI3-키나아제, PD-키나아제, Akt 키나아제 및 Akt 활성화 경로의 기타 하류(downstream) 구성원을 동시에 활성화시키는 부스터, (v) Ca++-칼모듈린-의존성 단백질 키나아제를 포함한 Ca++-신호전달의 조절제, (vi) 인테그린 연관 키나아제(integrin linked kinase)의 부스터, 및 (vii) (i) 내지 (vi)으로부터 선택된 둘 이상의 부스터의 적합한 조합을 포함하는, 조합형 부스터(combinational booster). 전술된 펩티드 및 단백질 시약은 삼 문자 코드(three letter code)를 따르고 이에 의해 개별적인 천연 아미노산을 특정하고 서열의 문자열(string)은 N-말단으로부터 시작하여 C-말단으로 종료된다.
단백질 키나아제 C 부스터는 천연 또는 합성 디아실 글리세롤과 같은 지질 유사 물질, 파르네실 티오트리아졸 또는 (-) 인돌락탐 V와 같은 비-지질(non-lipid) 화합물, 12-O-테트라데카노일 포르볼 13-아세테이트에 의해 대표되는 포르볼 에스테르 군의 구성원, 또는 세포에서 디아실글리세롤 리파아제 효소를 억제하여 세포 내에서 생성된 디아실 글리세롤이 보다 긴 기간 동안 기능할 수 있게 하는 작용제, 예를 들면, 1,6-비스(시클로헥실옥시미노카르보닐아미노) 헥산(U-57908)일 수 있다. cGMP에 의해 활성화되는 과정의 부스터는 cGMP 유사 화합물일 수 있고, 이는 용이하게 세포로 진입하고 직접적으로 또는 간접적으로 단백질 키나아제를 포함하는 cGMP-의존성 과정을 촉진할 수 있다. 그와 같은 화합물은 8-(4-클로로페닐티오)구아노신3',5'-시클릭 모노포스페이트 염, 아데노신 3',5'-시클릭 모노포스포티오에이트-Rp-이성질체 염 또는 세포 내에서 특정한 포스포디에스테라아제에 의한 cGMP의 파괴를 억제하는 화합물, 예를 들면, 자프리나스트(Zaprinast) 및 실데나필 및 그의 기능성 동족체일 수 있다. FAK 부스터는 중간엽 세포 또는 특히 FAK가 활성화되고 동시에 세포 내에서 인테그린 수용체-관련 신호가 생성, 증강 또는 유지되게 하는 세포 표면에 존재하는 다양한 인테그린 분자들과 상호작용할 수 있는 단백질 또는 펩티드 모티프일 수 있다. 선형 펩티드 속성의 조혈 조절제가 본 명세서에 기재되며 모든 경우에, 아미노산에 대한 표준 삼 문자 코드로 기재된 펩티드/단백질 서열을 가지며 상기 서열은 아미노 말단으로부터 시작하여 카르복시 말단 아미노산으로 종료된다. 펩티드 조혈 조절제의 예는: Trp-Gln-Pro-Pro-Arg-Ala-Arg-Ile, 서열 모티프 "Arg-Gly-Asp-Serine"을 포함하는 선형 또는 "헤드 투 테일 고리형 펩티드(head to tail cyclic peptides)" 또는 그의 기능성 동족체;이고, 인테그린 관련 키나아제, PI3키나아제(PI3Kinase) 및 Akt-키나아제의 부스터는 펩티드 Trp- Gln-Pro-Pro-Arg-Ala-Arg-Ile, 서열 모티프 "Arg-Gly-Asp-Ser"을 포함하는 선형 또는 고리형 펩티드, 및 단백질 TGFβ1에 의해 예시된다.
화학적 작용제는 세포내 저장소(intracelluar store)로부터 Ca++ 이온을 방출하거나 또는 Ca++ 채널의 활성화를 통해 보다 많은 외래 Ca++가 세포로 진입할 수 있게 하여, 단백질 키나아제를 포함한 여러 개의 Ca++ 의존성 효소를 활성화시키는 칼슘 동원 작용제(Calcium mobilizing agent)이고, 그와 같은 조혈 조절제는 타프시카르긴(thapsigargin), 시클로피아존산(cyclopiazonic acid) 및 8-(N,N-디에틸아미노)옥틸-3,4,5-트리메톡시벤조에이트(TMB-8)에 의해 예시된다. 화학적 조혈 조절제는 중간엽 세포 내에 있는 티로신 키나아제의 억제제, 예를 들면, 3-아미노-2,4,-디시아노-5-(3',4,5'-트리히드록시페닐)펜타-2,4-디에노니트릴(Tyrphostin AGl 83, synonym Tyrphostin A51)일 수 있다.
화학적 조혈 조절제는 펩티드 Ala-Pro-Ser-Gly-His-Tyr-Lys-Gly과 같은 FGF 수용체 기능의 조절제일 수 있고, 이는 중간엽 세포에서 그 자체로 또는 또 다른 조혈 조절제, 예를 들면, TGFβl에 의해 형성된 ABME의 상승적 부스터(synergistic booster)로 이용된다.
또한, 조혈 조절제는 확산가능한 화학적 메신저를 통해 신호전달을 촉진하거나 양성하는 작용제, 예를 들면, 일산화질소, 간질 세포 유래 인자(Stromal cell Derived Factor)-1 알파(이하에서 "SDF-1알파"로 지칭됨) 및 간질 세포 유래 인자-1 베타(이하에서 "SDF-1베타"로 지칭됨)일 수 있다. 본 발명자들은 중간엽 세포가 일산화질소, SDF-1 알파 및 SDF-1 베타를 생성할 수 있고 ABME의 조성물이 형성된 후, 이 화학적 메신저가 ABME에 의해 증가된 양으로 생성된다는 것을 발견하였다. 일산화질소, SDF-1 알파 및 SDF-1 베타는 이하에서 설명되는 바와 같이 강건한 조혈을 촉진하기 위해 ABME의 기능적 메카니즘에 관여된다. SDF-1 알파 및 SDF-1 베타 분자는 SPC의 유인제(attractant)로 작용하고 원거리로부터 ABME에 도달하는 SPC의 화학주성 이동(chemotactic navigation)을 가능하게 한다. 중간엽 세포로부터 SDF-1 알파, SDF-1 베타의 분비가 증가되는 상황에서, 그들에 의해 형성된 화학주성 구배(chemotactic gradient)가 보다 강하게 되고 보다 긴 거리에 도달하여 효과적으로 그들의 영향력 범위를 증가시키고 ABME를 둘러싼 보다 많은 용량의 환경으로부터 SPC의 수집을 촉진한다. SDF-1 알파 및 SDF-1 베타는 융합을 보조하고 또한 SPC 및 그로부터 유래된 자손의 증식의 유도자로 작용하여, 강건한 조혈을 촉진한다.
본 발명자들은 조혈 조절제가 ABME를 형성하는 중간엽 세포들에서 커넥신(Connexin) 43과 같은 간극 결합(gap junction) 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는 것으로 결론지었다. 커넥신 43은 천연 조혈 과정 동안 세포간 소통을 촉진하는 중요한 역할을 수행한다.
본 발명자들은 ABME에서 증가된 일산화질소 함량이 강건한 혈액 세포 형성에 대해 유용한 효과를 갖는다는 것을 발견했다. 일산화질소는 반응성이 높고 산소 분자와 매우 신속하게 결합하며 결과적으로 파괴된다. 따라서, 중간엽 세포 내에서 산소 함량의 효과적인 감소를 촉진하거나 또는 상기 세포들 내에서 저산소 상태(hypoxia)를 유도하는 작용제는 연장된 일산화질소 신호전달을 조성하고 ABME의 기능에 유용한 효과를 발휘할 것이다. 세포의 저산소 상태는 또한 인 비보에서 혈액 세포 형성과 긴밀하게 관계되는 ABME 기능, 혈관 형성(vasculogenesis) 및 혈관 신생(angiogenesis)를 촉진하는 신규한 혈관을 형성하기 위한 내피 세포의 동원 및 활성화를 촉진하는 VEGF의 분비를 포함한 신규한 유전자 발현의 촉진자이다. 감소된 산소 분압(oxygen tension)을 포함하는 환경은 SPC의 표면상에서 CXCR4 수용체의 발현을 촉진하고, 증가된 CXCR4 분자를 갖는 SPC는 SDF-1에 의해 매개되는 화학적-유인(chemo-attraction)을 통해 ABME를 향해 보다 잘 유도되고 유인된다. 중간엽 세포에서 일산화질소는 S-니트로소 페니실라민(SNP), 2-(N,N-디메틸아미노)-디아제놀레이트-2-옥시드(DEANNOATE) 등과 같은 여러 화합물에 의해 형성된 일산화질소의 가역적 부가물(adduct)과 표적 세포들을 접촉시키는 것에 의해 예시되는 바와 같이, "일산화질소 공여체(Nitric Oxide Donor)"로부터 표적 세포로의 이 확산가능한 메신저의 인공적 도입에 의해 증가될 수 있고, 보다 우수한 ABME 관련 특성들이 접촉된 세포들에 의해 보여진다.
조혈 조절제는 중간엽 세포의 인테그린 수용체, FAK(Focal Adhesion Kinase), bFGF-수용체를 활성화시킬 수 있는 모티프를 포함하는 선형 또는 고리형 펩티드인 화학적 작용제일 수 있다. 그와 같은 조절제는 알파5:베타1의 조절제, 알파2:베타1의 조절제, 알파2b:베타3의 조절제, 알파V:베타5의 조절제, 알파V:베타3의 조절제, 알파4:베타1의 조절제, 피브로넥틴 부착 촉진 인자(FAK-활성자), Arg-Gly-Asp-Ser과 같은 인테그린 조절제, Ala- Pro-Ser-Gly-His-Tyr-Lys-Gly과 같은 bFGF 조절자, 다양한 인테그린 상호작용 도메인, 세포 결합 도메인, 헤파린 결합 도메인 및 젤라틴 결합 도메인을 포함하는 천연 피브로넥틴 또는 피브로넥틴의 서브-단편인 화학적 작용제일 수 있다. 상기 화학적 작용제의 양은 약 0.1 내지 100 μM일 수 있다.
조혈 조절제는 산소 의존성 사망 도메인(oxygen dependent death domain) 모티프를 포함하는 단백질 또는 전사 인자의 세포내 분해를 방지할 수 있는 화학적 작용제일 수 있고, 그 예는 HIF-1α이다.
면역학적 조혈 조절제:
본 명세서에 정의된 면역학적 조혈 조절제는 세포의 부착 신호(celluar adhesive signal), 특히, 중간엽 세포와 같은 표적 세포에서 인테그린 수용체로부터 유래된 신호를 활성화시킬 수 있는 항체 또는 그의 기능성 동족체일 수 있다. 면역학적 조혈 조절제의 선택된 비한정적인 예는 인테그린 베타 서브유닛에 대한 활성화 항체이다. 그와 같은 면역학적 조혈 조절제는 50% 이상까지 표적 세포들의 응집을 유발하기에 충분한 농도로 사용될 수 있다.
감작성 조혈 조절제( Priming hematomodulators ):
생물학적 조혈 조절제, 화학적 조혈 조절제 또는 면역학적 조혈 조절제의 일부는 보다 나은 결과를 위해 SPC를 ABME와 함께 사용하기 전에 감작시키거나(prime) 또는 활성화시키기 위해 SPC를 접촉하기 위해 사용될 수 있다. 감작성 조혈 조절제의 일부 예는: 폴리(ADP-리보오스) 폴리머라아제 억제제(3 아미노 벤자미드), TGF 베타1의 잠복기 관련(latency associated) 펩티드, 가용성 또는 세포 표면에 결합된 만노오스 6-포스페이트 함유 글리코-컨쥬게이트, IGFI 및 IGFII 효과기(effector), cGMP 신호전달의 부스터이다.
전술된 작용제가 단백질인 경우, 이는 그들의 동족체, 합성에 의해 생성되거나 또는 인공적으로 조작된 분자를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 중간엽 세포는 간, 골수, 장골능(iliac crest), 대퇴골 및 늑골로부터 유래된 세포 또는 중간엽-줄기 세포(mesenchymal-stem cell)를 의미한다. 통상적으로, 선택된 세포들은 조혈성 콜로니(hematopoietic colony)를 형성할 수 없는 것으로 선택된다. 또한, 이 세포들은 동종기원 또는 이종기원일 수 있고 섬유모세포, 대식세포, 조골세포, 내피세포 및 연근육(smooth-muscle) 세포와 같은 세포를 포함한다.
전술된 성장 배지는 동물 세포를 배양하기에 적합한 배지이다. 배지는 우태혈청(FBS)로 보충되고, 선택적으로 메틸 셀룰로오스, 에리트로포이에틴, 조혈성 성장 및 분화 인자 및 인터루킨으로 보충된 RPMI-1640, 알파-최소 필수 배지(Alpha-Minimum essential medium)(MEM), 둘벡코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium)(DMEM), 이스코브 변형 둘벡코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM)로부터 선택될 수 있다.
본 기술을 실시하면서, ABME 접촉의 최초 사이클, 통상적으로 48-72시간의 짧은 시간 동안 증폭된 SPC가 분리되고 추가적인 잇점을 얻기 위해 하나 이상의 사이클 동안 신선한 ABME와의 그와 같은 접촉을 반복하는 것에 의해 더 증폭될 수 있다.
II. 키트
본 발명은 또한 인공적인 골수 환경(ABME)를 형성하고 혈액 세포 형성의 하나 이상의 개별적인 단계의 조절을 달성하는 것과 같은 다양한 응용을 위해 이를 사용하기에 유용하고:
a) 이전 섹션에서 기술된 것들로부터 선택된 생물학적 작용제, 화학적 작용제 또는 면역학적 작용제일 수 있는 하나 이상의 조혈 조절제,
b) 디메틸 술폭시드, 인산염 완충액, IMDM을 포함하는 조혈 조절제용 희석제,
c) 중간엽 세포의 배양에 적합한 배지, 예를 들면, 이전 섹션에서 기술된 바와 같은 성장 보충제를 포함하는 IMDM, RPMI-1640, 둘벡코 배지;
d) 인산염 완충 염수(PBS) 또는 IMDM과 같은, 사용된 조혈 조절제를 제거하기에 유용한 세척 용액;
e) 단백질 가수분해 효소, 억제제 및 에틸렌디아민 테트타아세트산(EDTA)을 포함하는 용액과 같은, ABME의 세포들을 채취하고 및/또는 추가적인 사용을 위해 활성화된 SPC를 재생(recycle)시키기에 적합한 용액;
f) 줄기 전구 세포를 감작(prime)시키는 조혈 조절제(그와 같은 작용제는 이전 섹션에 기재된 것과 동일함) 용액;
g) 인산염 완충 염수 또는 IMDM과 같은, 감작된 줄기 전구 세포를 이용하기 전에 감작성 작용제(priming agent)를 제거하는 세척 용액;
h) ABME용 지지 주형(template) 또는 지지체(scaffold), ABME의 세포, 프로-조혈성(pro-hematopoietic) 성장 인자, 분화 인자 및 생존 인자, 성장 배지 및 선택적으로 메틸셀룰로오스, 혈청, 적합한 지지체를 포함하는 인 비트로 혈액 세포 형성용 배지 및
i) 설명 매뉴얼를 포함하는 키트 또는 복수 개의 키트를 제공한다.
지지체는 피브로넥틴, 콜라겐의 이차 이상의 매트릭스(two or more dimensional matrix)인 기질 또는 다른 유사한 기질을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 선택적으로 i) ABME를 형성하기 위해 주어진 중간엽 세포 모집단의 품질을 평가하고, ii) 생물학적 물질(entity), 화학적 물질 및 면역학적 물질의 잠재적인 조혈조절 기능을 정량적으로 평가하고, iii) 강건한 혈액 세포 형성을 위해 ABME를 준비하고 SPC를 감작하며, iv) 단일의 계통 또는 복수의 계통에서 인 비트로에서 형성된 혈액 세포의 조성을 변형시키기 위해 ABME를 준비하고, v) 주어진 시료에 존재하는 SPC에서 정지 상태를 유도하기 위한 다른 시약을 포함할 수 있다. 시약 시스템은 상용의 포장된 형태로, 시약들의 융화성(compatibility)이 허용하는 조성물 또는 혼합물로, 테스트 장치 구조(configuration)로, 또는 보다 일반적으로는 테스트 키트, 즉, 필요한 시약을 담은 하나 이상의 용기, 장치 또는 그 등가물의 포장된 조합으로 제공되며 일반적으로 분석의 실시를 위한 서면 설명서를 포함한다.
전술된 감작 작용제의 구체적인 예들이 하기에 열거된다:
조혈 조절제(Hematomodulator) 예
생물학적 작용제 1 인간 전환 성장 인자(TGF) 베타1
화학적 작용제 1 (-) 인돌락탐 V
면역학적 작용제 인간 인테그린 베타3에 대한 활성화 항체
생물학적 작용제 2 HuFGF-2
생물학적 작용제-CM 본 명세서에 기재된 방법에 따라 제조된 조건 배지
화학적 작용제 15 인간 TGF 베타1의 잠복기 관련 펩티드
화학적 작용제 16 만노오스 6P 함유 단백질
화학적 작용제 11(a-e) 표 II에 기재된 바와 같은 다양한 인테그린을 활성화시킬 수 있는 펩티드
화학적 억제제 11f 인테그린 알파4:베타1 수용체 기능을 억제하는 펩티드
화합물 12 SPC에서 cAMP-의존성 과정을 억제하는 cAMPS rp 이성질체
화학적 작용제 3 Ca++ 킬레이트제 BAPTA의 디브로모 유도체
III. 상승작용(SYNERGY):
종래 기술은 혈액 세포의 성장을 위한 조건은 골수 내에서 가장 적합(conducive)하기 때문에, 혈액 세포의 증식 및 성장은 (신체 내에서) 골수에서만 일어날 수 있는 것으로 판단해왔다. 신체 외부에서 그와 같은 조건을 생성하고 혈액 세포의 증가된 성장을 달성하는 것은 어려운 것으로 생각되었다. 이와 같은 추정과 대조적으로, 본 발명자들은 혈액 세포의 조절된 성장 및 증식에 적합한 인-비트로 환경을 형성하는 것을 도와주는 신규한 조성물 및 키트를 개발하였다. 적합한 세포 및 조혈 조절제로 보충된 배지 및 선택적으로 ABME 세포를 위한 지지(support)를 사용하여 상기 환경이 개발된다. 그와 같이 형성된 환경은 조혈에 매우 적합하고 천연의 BME와 유사하다. ABME는: (i) 보다 강한 화학적-유인(chemo-attraction)에 의해 증강된 귀소; (ii) 중간엽 세포 및 SPC 간의 세포 부착을 촉진하는 것에 의한 증가된 융합; (iii) Bad와 같은 프로-아폽톱시스 분자(pro-apoptotic molecule)를 감소시키는 것에 의한 아폽톱시스 신호에 대한 SPC의 증강된 생존, (iv) SPC의 골수 및 림프 계통으로의 결정(SPC commitment along myeloid and lymphoid lineages) (v) 자기-재생 경로 및 분화 경로를 통한 증식을 조성하기 위한 정지상태 SPC의 활성화 및 (vi) 필요한 경우 SPC 정지상태의 유도를 촉진한다.
또한, 본 발명의 조성물은 인공적인 골수 유사 환경을 형성하고 그의 모든 성분들이 이용되는 경우에만 SPC와 조혈 세포의 성장을 촉진할 수 있다는 것이 발견되었다. 조혈 조절제에 의한 처리 없이, 그 자체로 이용되는 경우, 중간엽 세포는 유지되지 않고, 또한 효율적인 인공적인 골수-유사 환경(BME)이 생성되지도 않는다. 이 결과를 가져오는 것은 성분들의 조합(즉, 적합한 조혈 조절제를 포함하는 처리 배지 및 세포들)뿐이다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 키트는 상승적이며(synergistic), 놀랍게도 인공적인 골수 유사 환경을 형성하는 것으로 발견되었고, 이는 성분들이 단독으로 이용되는 경우에는 관찰되지 않는다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 키트는 상승적이다.
IV. 방법
일 구체예에서, 본 발명은 인공적인 골수 환경을 형성하는 방법으로서:
(i) 중간엽 세포를 수득하고 상기 세포를 적합한 성장 배지에서 배양하는 단계;
(ii) 상기 중간엽 세포를 20분 내지 24시간 동안 조혈 조절제와 접촉시켜서 그의 세포내 신호전달 경로를 활성화시키고 상기 중간엽 세포는 골수 환경 유사 특성들을 수득하는 단계;
(iii) 줄기전구세포(stem progenitor cell: SPC)를 수득하고 선택적으로 상기 세포들을 감작(prime)시키는 단계;
(iv) 상기 단계 (ii)에서 처리된 중간엽 세포를 선택적으로 조혈 조절제와 접촉된 SPC와 접촉시켜서, ABME와 그들의 상승적 참여가 보다 많은 혈액 세포들을 형성할 수 있도록 세포내 신호전달 경로를 활성화시키는 단계;
(v) 상기 감작된 SPC를 배지에서 ABME 또는 활성화된 중간엽 세포와 20분 이상의 기간 동안 접촉시켜서 인 비트로 SPC-귀소(Homing), SPC-융합(engraftment), SPC-활성화, SPC-자기 재생, SPC-강건한 조혈을 생성하는 림프 및 골수 계통으로의 SPC-계통 결정을 달성하는 단계;를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 또한 특정한 목적을 위해 SPC 정지상태(quiescence)를 유도하는 조혈 조절제의 적합한 선택에 의해 이용될 수 있다.
중간엽 세포들은 장골능으로부터 수득가능한 세포, 성인 늑골 또는 대퇴골로부터 채취된 골수 세포를 포함할 수 있고 20% 인간 혈청 또는 우태혈청으로 보충된 이스코브 변형 둘벡코 배지(IMDM)와 같은 적합한 배양 배지에서 일상적인 세포 배양에서 3-4회의 계대 배양(serial passage) 후 약 3-6주 내에 107개 이상의 중간엽 세포를 생성할 수 있는 조건에서 유지될 수 있다. "세포 배양 조건(cell culture condition)"은 적합한 세포 배양 등급의 플라스틱 용기(Becton-Dickinson, USA)에서 배양물을 37℃, 5-7% 이산화탄소의 가습 대기(humidified atmosphere)에서 무균 조건 하에 유지하는 것을 포함한다.
전술된 바와 같이, 사용된 혈액 세포 형성용 배지는 20% 혈청으로 보충되고 IL-1 베타, IL-3, 및 IL-6과 같은 인터루킨, 줄기 세포 인자, 에리트로포이에틴 및 GM-CSF, G-CSF와 같은 계통 특이적 성장 인자 및 메틸 셀룰로오스로 0.8%까지 보충된 IMDM일 수 있고, 상기 배양은 혈액 세포 콜로니들이 잘 성장하거나 또는 콜리니를 형성하고 그 성장이 추가적인 분석 및 사용을 위해 가시적이고/구별가능하게 되는 조건에서 12-14일간 유지된다. ABME 기능의 정량적 특성을 평가하기 위해 유사한 방식으로 설계된 분석을 이하에서 "ABME의 정량적 조혈 콜로니 형성 분석(HCFA-ABME)'라 부른다.
ABME 형성을 위해 사용되는 중간엽 세포의 양은 ABME에 의해 처리될 SPC의 수에 의존적이고, 본 발명의 방법은 요구되는 중간엽 세포의 수의 증가 또는 감소를 충족시키기 위해 적합하게 그 규모가 조절될 수 있다. 일반적으로, 중간엽 세포의 양은 표적 SPC의 1.5배일 수 있다.
중간엽 세포를 조혈 조절제와 접촉시키는 단계는 중간엽 세포를 20% 혈청을 포함하는 IMDM에 담긴 조혈 조절제의 적합한 용액/현탁액으로 뒤덮는 단계 및 상기 세포들을 0.5 내지 24시간 동안 표준 세포 배양 조건에서 유지시켜서 상기 세포들이 활성화되고, ABME-유사 특성들이 유도되어 조혈 조절제의 적용이 제거된 후에도 충분한 지속시간 동안 유용하게 유지되게 하는 단계에 의해 달성될 수 있다.
선택적으로, SPC 또는 SPC를 포함하는 세포의 집단(예: 골수로부터 유래한 단핵 세포, 제대혈로부터 유래한 유핵 세포, SPC의 동원 후 말초혈액으로부터 유래한 유핵 세포)이 ABME 세포가 사용된 SPC 세포에 비해 약 1.5배 초과하는 양이 되도록 준비된 ABME와 혼합될 수 있다. SPC 및 ABME는 공통의 배지에 현탁되고 적합한 배양 조건 하에서 30분 이상의 기간 동안 함께 유지될 수 있다. SPC가 적합한 표면에 부착되는 경우, ABME 세포는 그들 위에 또는 그들 주위에 코팅될 수 있다. 또한, 각 적용에 따라 필요한 다른 시약으로 보충된, IMDM, 20% 혈청 및 0.8% 메틸셀룰로오스를 포함하는 배지가 ABME 및 SPC를 코팅하기 위해 사용될 수 있다.
특정한 조혈 조절제가 사용되는 농도 및 주어진 배치(batch)의 중간엽 세포가 최적의 결과를 얻기 위해 접촉될 지속 시간은 다양할 수 있고 이의 정확한 세부사항은 개별적인 경우에서 결정되며, 본 명세서에 기재된 조혈 조절제의 유용한 농도 범위 및 그들의 처리 시간은 가이드라인으로서만 작용한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 인큐베이션 동안 확산에 의해 인 시투로(in situ)로 생성되는 조혈의 억제제를 감소시킬 수 있는 구획형 배양(compartmental culture)으로 개조되고 상기에서 ABME 및 SPC 세포들이 하나의 구획에 수용되고 필요하거나 원하는 성장 인자 또는 조혈 조절제를 포함하는 배양 배지는 별개의 대체가능한 구획으로부터의 세포와 접촉된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 유동 배양 시스템(flow culture system)으로 개조되고, 상기에서 ABME 및 SPC 세포들은 하나의 지지/구획에 수용되어, 배양 배지를 포함하는 적용 배지(application media), 조혈 조절제를 포함하는 접촉 배지(contacting media), 세척 용액, 분화 배지(differentiation media)가 인 시투로 생성되는 조혈 억제제의 축적을 피하고 결과를 개선하기 위해 세포에 대한 지속적인 영양공급을 허용할 목적을 위해 프로그래밍된 방식으로 세포들을 통해 삼출(percolate)하거나 또는 흐를 수 있게 된다.
본 발명자들은 연구 동안 ABME가 준비되거나 또는 SCP가 강건한 조혈을 촉진하기 위해 활성화된 것으로 발견되는 경우, 중간엽 세포와 조혈 조절제의 접촉을 지속하는 것이 반드시 요구되는 것은 아니라는 것을 발견했다. 동일한 수의 SPC가 기준(reference)으로서 중간엽 세포와 접촉하거나 또는 다른 모든 것은 유사한 실험적 조건 하에서 ABME와 접촉하는 경우, 상당히 많은 수의 SPC가 ABME로 보충되고 그들이 HCFA를 위해 더 처리되는 경우, 기준 대비 ABME에서 상당한 콜로니 수의 증가가 관찰되어, 증강된 귀소, 보다 효과적인 융합 및 강건한 혈액 세포 형성을 시사한다. 이 결과는 시료에 존재하는 활성화된 SPC의 비율의 증가를 의미하고 또한, 일부 SPC는 정지 상태를 벗어나서 활성화된 상태로 진입했고 및/또는 활성화된 SPC 세포의 비율을 증가시키기 위해 자기 재생을 수행했다는 것을 시사한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명자들은 정상적인 SPC가 정지 상태와 동등한 상태에 도달하도록 ABME의 기능을 조절하는 네가티브 조혈 조절제를 확인하였다. 그와 같은 조절(modulation)은 세포 사이클 조절 특성의 차이를 갖는 정상 SPC와 병적인 SPC를 구별하는 프로토콜의 개발을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 방법은 인 비트로에서 혈관신생 억제 약물(anti-neoplastic drug)을 사용하여 인 비보에서 화학요법과 연관된 유해한 부작용을 방지하는 백혈병 SPC의 선택적 파괴를 위한 치료방법을 지원한다.
이하에서 본 발명은 예시를 위해서만 제공되고 본 발명 또는 발명 개념의 범위를 한정하도록 의도되지 않는 하기의 실시예들에 의해 예시된다.
도 1A 내지 도 1D: 도 1은 단핵 세포가 상이한 종류의 배지에 도말(plating)된 경우 조혈 콜로니의 형성을 도시한다.
도 2A 내지 도 2E: 도 2B는 MNC와 중간엽 세포들을 혼합하는 것에 의한 콜로니 형성 분석의 결과를 보여주고, 도 2C, 도 2D 및 도 2E는 중간엽 세포들을 각각 생물학적 조혈 조절제, 화학적 조혈 조절제 또는 면역학적 조혈 조절제와 접촉시키는 단계 후의 콜로니 형성 분석의 결과를 보여준다. 도 2A는 중간엽 세포 없이 MNC 단독으로부터 형성된 콜로니의 속성을 보여준다.
도 3A 내지 도 3B는 별개로 사용된 경우, 각각 TGFβl 및 FGF-2의 사용으로 동등한 효력의 ABME가 형성된다는 것을 보여준다.
도 4A 내지 도 4E는 콜로니 형성 및 조혈 세포의 형성에 대한 다양한 조혈 조절제의 효과를 도시한다.
도 5는 면역학적 조혈 조절제의 효과 및 그의 효능을 도시한다.
도 6(a-c)는 ABME에 존재하는 중간엽 세포가 적합한 조혈 조절제로 처리되는 경우 SDF1α와 같은 화학주성(chemotactic) 분자의 증가된 양을 발현하고, 이에 의해 도 6(d-f)의 SPC의 증강된 이동 또는 귀소 및 부착을 가져온다는 것을 보여준다.
도 7은 상이한 조혈 조절제의 적합한 조합을 선택하는 것에 의한 조혈의 조절을 도시한다. 막대는 고정된 수의 MNC가 사용된 경우 형성된 조혈 콜로니 및 활 성형 및 억제형 조혈 조절제의 사용에 의해 중간엽 세포 상에 형성된 ABME를 나타낸다.
도 8 (a-b)는 HSPC를 적합한 조혈 조절제에 의해 형성된 ABME와 접촉하는 것에 의한 HSPC의 계통 결정의 변화를 보여준다.
도 9(a-d)는 세포 생존 인자들을 적합한 조혈 조절제로 처리하는 경우 ABME에서 세포 생존 인자들의 증가를 보여준다.
도 10(a-b)는 적합한 조혈 조절제를 사용하는 것에 의한 SPC의 자기 재생 분열의 증가를 도시한다. 도 10(c)는 자기 재생을 지지하는 준비된 ABME 세포에서 신호전달 분자 Jagged 1의 증가된 발현을 도시한다.
도 11(a-b)는 정상 산소(normoxic) 조건 하의 세포에서 적합한 조혈 조절제의 사용에 의한 저산소(hypoxic) 환경의 생성을 도시한다.
도 12는 주어진 조혈 조절제와 접촉된 경우, 둘 이상의 주어진 중간엽 모집단의 ABME를 형성하는 상대적 효능의 평가를 도시한다.
도 13은 ABME 형성에 대한 촉진성 또는 억제성 조혈 조절제의 스크리닝을 도시한다.
실시예 1
a) 중간엽 세포의 수득 및 배양:
장골능 또는 늑골로부터 수득된 골수 세포를 이스코브 변형 둘벡코 배지(IMDM)에 잘 분산시켜서 단일 세포 현탁액(single cell suspension)을 수득하고 동일한 배지로 3회 이상, 매회 원심분리기로 2-3000 RPM(500-1000Xg)에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하는 것에 의해 세척하였다. 세척된 골수 세포(108 개 이상의 세포)를 세포 배양 조건 하에서 IMDM 및 20% 우태혈청 또는 인간 혈청에서 7일까지 유지하였다. 그에 의해 수일 내에 수득된 일반적인 표준 조직 배양 등급 플라스틱 용기(T-25 플라스크, Becton Dickinson, USA) 상의 부착성 세포층을 순수한 IMDM으로 세척하고 동일한 배지에서 표준 세포 배양의 수회의 계대 배양으로 더 확장시켰다. 통상적으로, 3회의 계대 후에, 고유의 조혈, 즉, 메틸셀룰로오스 분석에서 조혈 콜로니를 생성하는 능력이 상실되었다. 3-6회의 계대 후에, 108 개의 골수 세포로부터 107개 이상의 중간엽 세포를 수득하였다. 이와 같이 수득된 중간엽 세포들은 하기에 기재된 방법에 의한 ABME의 생성에 적합했다.
b) ABME와의 사용에 적합한 SPC의 제조.
단계 a)에서 수득된 세척된 골수 세포를 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)(밀도 1.007, Sigma Chemical Company, St. Louis, USA)의 구배 상에 조심스럽게 층으로 올리고 쿠보타(Kubota) 원심분리기(Kubota Corporation' Bunkyo-ku, Tokyo, 113-0033, Japan)의 스윙 아웃 로터(swing out rotor)에서 1500 RPM (1000Xg)으로 15분간 원심분리하였다. 인터페이스 층으로부터 단핵 세포(MNC)를 채취하고 순차적인 1000Xg에서의 원심분리 및 재현탁에 의해 IMDM으로 3회 세척하였다. 그 후, MNC 를 20% 인간 혈청 또는 우태아혈청으로 보충된 IMDM에 적합한 농도(105 내지 107개의 MNC/ml)로 현탁시켰다. 이에 의해 준비된 MNC는 그대로 ABME와 함께 사용될 수 있었다. SPC는 인 비보에서 본 실험에서 분리된 MNC에 유사한 환경에서 발견될 것 같다.
예시의 목적으로, 전술된 두 조건을 시뮬레이션하기 위해 고도로 선별된(enriched) CD34+ 항원 발현 SPC 및 MNC 모두로 본 발명의 방법을 테스트하였다. 필요한 경우, 임의의 다른 적합한 방법이 이용될 수 있으나, 제조사의 설명서에 따라 CD34+-세포 분리 키트(Dynal, Smestad, N-0309, Oslo, Norway)를 이용하여 CD34+ 세포들을 MNC 분획으로부터 관례대로 회수하였다. CD34+-세포들은 또한 적합한 방법에 의해 골수로부터 또는 제대혈로부터의 동원 후에 백혈구 성분채집술(leukapheresis)에 의해 채취될 수 있다. ABME로의 제시 전 또는 후에 그들의 CD34-(CD34 음성) 전구체로부터 형성된 CD34+ 세포들도 원하는 결과를 가져왔다. 이 방법으로 준비된 SPC도 적합한 조혈 조절제에 의한 감작을 위해 적합했다.
c) 중간엽 세포는 고정된 수의 SPC로부터 조혈을 촉진한다:
중간엽 세포가 SPC 세포-운명에 대해 직접적인 영향력을 발휘하는지 여부를 결정하기 위해 여러 실험을 수행하였다. 일 세트의 실험에서, 중간엽 세포들을 별도로 배양하고 그들 중 약 50,000개를 과량의 다양한 정제된 인간 특이적 시토카인 및 조혈 콜로니 자극 성장 인자(Stem cell Technologies, Toronto, Canada)와 함께 IMDM에 담긴 0.8% 메틸 셀룰로오스 및 20-30% 혈청을 포함하는 통상적인 HCFA 배지에 노출시켰다. 보다 상세하게는, HCFA에서 관례적으로 사용된 조혈 성장 인자의 양은 단위 밀리리터당 2 I.U.(International Unit)(2 I.U.ml-1)의 에리트로포이에틴(EPO), 단위 밀리티터당 50 나노그램(50 ng.ml-1)의 줄기 세포 인자(SCF) 및 단위 밀리리터당 20 나노그램(20 ng.ml-1)의 과립구-대식세포-콜로니 자극 인자(GM-SCF), 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 인터루킨-1 베타(IL-1β), 인터루킨-3(IL-3) 및 인터루킨-6(IL-6)였다{모든 성장인자 및 시토카인은 Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada로부터 구함}. 본 발명에 기재된 방법에 의해 제조된 중간엽 세포는 과량의 모든 요구되는 성장 인자들이 제공되어도 콜로니 형성 분석 배지에서 그 자체로는 조혈 콜로니를 형성할 수 없는 것으로 발견되었다.
또 다른 세트의 실험에서, 먼저 50,000개의 동일한 중간엽 세포들을 약 100,000개의 MNC와 혼합하고 37℃에서 30분 이상 유지하고 콜로니 형성 분석을 위해 처리하였다. 여러 실험에서, 이 두 종류의 세포를 혼합한 경우, MNC 세포만 사용된 기준(reference)에 비해 조혈 콜로니의 수 및 세포성(cellularity)의 일관성 있는 개선을 관찰하였다. 증가는 1.5 내지 10배의 범위였다. 따라서, 중간엽 세포만의 사용에 의해 수득된 콜로니 형성의 증강은 매우 가변적이고 시료들 간에 예측가능하지 않았다. MNC 및 중간엽 세포들이 함께 처리된 경우에만 조혈 콜로니가 증가된 수 및 세포성으로 형성된다는 사실은 MNC에 존재하는 SPC가 보다 생산적인, 중간엽 세포에 의해 형성된 새로운 환경의 증거이다. 이 증가는 기존에 존재했으나, 정지상태인 SPC의 활성화 및 자기-재생에 따른 신규한 SPC의 형성 및 상기 두 인자들의 조합을 가져왔다.
d) 중간엽 세포 상에서 조혈 조절제를 접촉시키는 것은 보다 우수한 결과를 가져온다:
조혈 조절제의 실질적인 응용은 그들의 투여량 및 적용될 접촉의 지속시간에 대하여 최적화를 필요로 하며, 이는 상이한 배치의 중간엽 세포들이 동일한 조혈 조절제에 대해 상이하게 반응할 수 있기 때문이다. 다수의 실험으로부터, 본 발명자들은 일반적으로 편리한 출발점은: 1-25 나노그램/ml(활성성분 기준) 범위의 생물학적 조혈 조절제, 10 nM 내지 500 μM 용액 범위의 화학적 조혈 조절제 및 10-50 pM 용액 범위의 면역학적 조혈 조절제일 수 있는 것으로 결정하였다.
ABME를 형성하기 위해, 중간엽 세포들을 바람직한 기간(8 내지 24시간) 동안 20% 인간 혈청 또는 우태혈청을 포함하는 IMDM에 담긴 조혈 조절제를 포함하는 접촉 배지로 덮고 방치한 후 제거하였다. 상기 접촉된 세포들을 그 후 조혈 조절제를 포함하지 않는 접촉 배지(IMDM + 20% FCS)를 이용하여 2회 세척하고 그대로 사용하거나 또는 중간엽 세포들을 채취한 후 이용하였고, 이는 인 비트로 ABME의 조성을 나타낸다. 선택적으로, ABME 세포들을 보다 나은 결과를 위해 이차원 이상으로 분포시킬 지지(support) 상에 배치시킬 수 있었다. 필요한 수의 MNC/SPC 및 ABME 세포를 취하고 적합한 지속시간(0.5 내지 6시간의 범위) 동안 함께 유지하고 그 후 인 비트로 조혈 콜로니 형성 분석 또는 조혈을 위해 처리하였다.
따라서, 본 발명자들은 4 세트의 실험을 수행하였다: (a) 단핵 세포들을 아무 처리 없이 중간엽 세포에 노출시키는 실험; (b) MNC를 생물학적 작용제[TGFβl]와 접촉되었던 중간엽 세포에 노출시키는 실험; (c) MNC를 화학적 작용제 1[12-o-테트라데카노일 포르볼, 13 아세테이트/(-)인돌락탐 V:본 명세서에서 주어진 명칭]과 접촉되었던 중간엽 세포에 노출시키는 실험; 및 (d) 면역학적 작용제[활성화, 항 인테그린 베타 3 항체]로 처리한 중간엽 세포에 노출시키는 실험. 그 결과를 도 1에 도시하며 하기와 같다:
(A) 이 상황에서, 낮은 세포성의 매우 소수의 혈액 세포 콜로니가 형성됨;
(B) (A) 보다 많은 수로 보다 높은 세포성을 갖는 혈액 세포 콜로니가 형성됨;
(C) 세포들의 큰 콜로니, 놀랍게도, (A)보다 4배 이상 크고 (B)보다 큰 콜로니가 관찰됨;
(D) (A) 또는 (B)보다 놀라울 정도로 큰 고밀도의(dense) 세포 콜로니가 형성됨.
실시예 2:
생물학적 조혈 조절제의 효과
제조 방법은 하기를 포함한다: MNC (>107개의 세포)를 37℃의 세포 배양 조건에서 세포로부터 조혈 조절제-CM을 방출하기에 적합한 양(예:에리트로포이에틴 2 I.U.ml-1; GM-CSF 20-50 ng.nl-1)으로 필요한 적합한 조절제(예를 들면, 에리트로포이에틴 및 GM-CSF) 및 20% 혈청, IMDM을 포함하는 배지 1 밀리리터에서 유지하였다. 적합한 기간(8 내지 96시간) 후에, 상기 세포들을 냉장 쿠보타 원심분리기(5000Xg, 15분)에서 원심분리하여 제거하고 생물학적 조혈 조절제-CM을 상층액으로 수득하여, 그대로 사용하거나 또는 존재하는 활성 성분들을 농축하기 위한 추가적인 처리 후에 사용하였다. CM의 처리는 ~4℃의 저온(chilled) 환경에서 수행하고 친화성(affinity) 크로마토그래피의 원리를 이용하였다. 요약하면, 매트릭스 상에 고정화된 적합한 친화성 리간드(예를 들면, 헤파린 세파로오스)를 취하고, 저염 완충액(low salt buffer)에서 조혈 조절제-CM을 상기 리간드에 부착시키고, 부착되지 않은 성분들을 로딩(loading) 완충액으로 세척하여 제거하고, 조혈 조절제-CM의 활성 성분을 먼저 선택적으로 고 염 완충액(예를 들면, 1.5 M NaCl)에 의해 용리시키고, 농축하고 보관 완충액(storage buffer)으로 평형화시키고, 이후의 이용을 위해 -70℃에서 보관하였다. 나머지 두 개의 생물학적 조혈 조절제, 즉, 생물학적 작용제-1 및 생물학적 작용제-2는 각각 TGFβl 및 FGF-2로 확인되었다.
생물학적 조혈 조절제-CM, TGFβl 및 FGF-2는 적합한 조건 하에서 동등하게 효율적인 ABME를 형성한다; 그러나, 각 경우에 형성된 ABME의 속성은 다르다. 통상적으로, 생물학적 조혈 조절제-CM, TGF-βl 및 FGF-2는 ABME를 생성하기 위해 세포 배양 조건 하에서 중간엽 세포를 8-24시간 동안 접촉하기 위해 IMDM 및 20% 인간 혈청 또는 우태혈청에 1-25 ng.ml-1의 농도 범위로 이용된다. 도 2에 도시된 바와 같이, 보다 강한 ABME 관련 특성들은 조혈 조절제가 사용되는 경우에만(도 2c, 2d 및 2e) 배양에서 명백해지나, 중간엽 세포가 사용되지 않거나(도 2a) 또는 생물학적 조혈 조절제 없이 사용되는 경우(도 2b)에는 명백하지 않았다. 상기 도면들은 각 경우에 형성된 혈액 세포들의 농도를 도시하며, 이는 콜로니의 세포성(cellularity)와 관계된다. 최상의 콜로니는 중간엽 세포가 조혈 조절제와 접촉되는 경우에만 형성되었다.
실시예 3: 콜로니 형성에 대한 생물학적 조혈 조절제의 효과
본 발명자들은 실험에 의해 TGFβl 및 FGF-2의 사용에 의해 수득된 ABME가 이들이 각각 사용되는 경우 중간엽 세포로부터 ABME를 형성하는 데 있어서 거의 동등한 효능을 가지며 각각의 그와 같은 ABME가 부모 중간엽 세포(parental mesenchymal cell)에 의한 유의성 있는 약화 없이 자유롭게 혼합될 수 있다는 것을 발견하였다.
중간엽 세포를 이용하여 정량적인, 계통-특이적 콜로니 형성 분석과 관련된 일련의 실험을 수행하였다: (A) 생물학적 작용제와의 접촉 없음[도 3A 대조구] 또는 TGFβl과의 접촉 후[도 3A 생물학적 작용제 1] 또는 FGF-2 [도 3A 생물학적 작용제 2]. 과립구-적혈구-단핵구 및 대식세포(Granulocyte-Erythroid-Monocyte and Macrophage:GEMM), 버스트 형성 단위-적혈구(Burst Forming Unit-Erythroid: BFU-E) 및 과립구-대식세포(Granulocyte- Macrophage: GM)를 포함한 여러 특정한 계통에 따른 콜로니 형성은 상기 두 ABME에 의해 균일하게 자극되고 TGFβl 및 FGF-2는 이 효과를 유지시키는 개별적인 ABME의 형성에 있어 거의 동일한 효력을 가진다는 것이 명백하다. 특히, GEMM 콜로니 형성의 자극은 ABME가 자기-재생과 동등하게 보다 많은 새로운 다능성(multipotent) 세포를 형성하기 위해 다능성 전구세포를 자극할 수 있다는 것을 보여준다.
도 3B에서, 본 발명자들은 TGFβl 또는 FGF-2의 사용에 의해 형성된 ABME가 개별적으로 테스트되는 경우 무처리 중간엽 세포와 융화될 수 있다(compatible)는 것을 입증하였다. 따라서, 이와 같은 두 개의 ABME 각각은 무처리 중간엽 세포와의 혼합에 적합하다. 대조적으로, 상기 두 개의 ABME가 동일한 비율로 혼합되는 경우, 그 조합은 개별적인 것보다 더 약한 ABME이다. 이는 그들이 속성에 있어 상호 간에 대항적이고(antagonistic) 동일하지 않다는 것을 명확하게 입증한다.
실시예 4: 콜로니 형성에 대한 화학적 조혈 조절제의 효과
본 발명자들은 다양한 단백질 키나아제, 특히, cGMP-의존성 키나아제, 지질-의존성 키나아제(예를 들면, PKC), 포스파티딜 이노시톨 포스페이트 의존성 키나아제 및 패밀리(PI3K, PDK, Akt, pBad, mTOR), 세포-부착(cell-adhesion) 의존성 키나아제(FAK, ILK), 수용체 티로신 키나아제(예: FGFR, VEGFR, IGF-IR, IGF-2R), 수용체-세린/쓰레오닌 키나아제(예: TGFβl 수용체) 및 세포내 Ser/Thr 키나아제(예: MAPK-키나아제 및 p38 MAPK 키나아제), Ca++ 이온 의존성 키나아제(Ca++-CaM 의존성 키나아제)의 기능과 같은 세포내 신호 생성 및/또는 유지를 조절하는 여러 조혈 조 절제를 테스트하였고, 이는 그와 같은 기능을 수행할 수 있는 임의의 신규한 분자는 잠재적인 조혈 조절제라는 것을 암시적으로 나타낸다.
ABME 형성을 위해, 중간엽 세포들을 20% 인간 혈청 또는 우태혈청 및 적합한 양의 조혈 조절제를 포함하는 IMDM을 이용하여 적합한 지속시간(5분 내지 24시간) 동안 접촉시켰다. 효과적인 조혈 조절제 용액의 제조 및 중간엽 세포를 접촉하는 지속시간은 더 높은 농도의 조혈 조절제나 보다 긴 시간의 접촉 시간 중 어느 것도 보다 나은 결과를 보장하는 것은 아니기 때문에 세심한 최적화가 요구된다; 조혈 조절제의 유용한 범위는 1 nM 내지 100 μM이고 접촉 지속시간은 5분 내지 24시간이다.
또 다른 양태에서, 본 발명자들은 생물학적 작용제 및 화학적 작용제의 일부 조합은 상승적으로 작용하고 그들 중 하나가 각각 사용된 경우에 비해 보다 우수한 ABME 형성을 가져올 수 있는 것으로 결정하였다.
또 다른 양태에서, 본 발명자들은 혈액 세포 형성을 억제하기 위해 적합한 화학적 조혈 조절제가 이용될 수 있다는 것을 결정하였다. 이들은 SPC 정지상태(quiescence)를 촉진한다는 것을 나타내기 위해 본 발명에서 "네가티브 조혈 조절제(negative hematomodulator)"로 기재된다. 그와 같은 조혈 조절제는, 우성(dominant)인 경우, 또 다른 조혈 조절제의 자극 활성을 약화시킬 수 있다.
도 4A는 상이한 조혈 조절제의 사용이 다양한 계통에서 혈액 세포 형성을 차별적으로 자극할 수 있는 ABME를 형성한다는 것을 보여준다. 도 4B 및 도 4C는 콜로니 형성에 대한 화학적 조혈 조절제의 효과를 보여준다. 도 4D는 생물학적 조혈 조절제 및 화학적 조혈 조절제의 조합의 효과가 ABME의 형성에서 상승효과를 보일 수 있다는 것을 보여준다. 도 4E는 네가티브 조혈 조절제에 의한 ABME의 투여량 의존적 약화를 도시한다.
실시예 5: 면역학적 조혈 조절제:
본 발명자들은 인테그린 수용체를 통해 중간엽 세포 상에서 부착성 상호작용을 활성화할 수 있는 항체 시약 또는 그의 기능적 동족체가 조혈 조절제로 작용한다는 것을 결정하였다. 또한, 그와 같은 면역학적 조혈 조절제는 인 비트로에서 보다 나은 ABME를 형성하기 위해 생물학적 조혈 조절제 및/또는 화학적 조혈 조절제와 상승적으로 작용할 수 있다. 그와 같은 면역학적 조혈 조절제는 20% 인간 혈청 또는 우태혈청을 포함하는 IMDM을 포함하는 배지에서 10-100 ㎍.ml-1의 범위에서 유용하다. 중간엽 세포들이 ABME를 형성하는 배양 조건 하에서 중간엽 세포들을 적합한 기간(1 내지 24시간의 범위) 동안 이 배지와 접촉시켰다. 또 다른 양태에서, 보다 나은 결과를 얻기 위해, 면역학적 조혈 조절제의 사용을 화학적 조혈 조절제 및/또는 생물학적 조혈 조절제의 사용과 조합할 수 있다.
도 5에 도시된 바와 같이, 중간엽 세포들이 이용되는 경우(대조구: 흑색 막대), 매우 적은 수의 혈액 콜로니들이 형성되었다. 대조적으로, 20% 인간 혈청 또는 우태혈청을 포함하는 IMDM에 밀리리터당 50 마이크로그램의 농도인 면역학적 조혈 조절제(인간 베타3 인테그린 서브유닛에 대한 항체)의 용액을 중간엽 세포와 1 시간 동안 접촉시키기 위해 사용한 경우, 중간엽 세포들은 고도로 효과적인 ABME를 형성하여 인 비트로에서 콜로니 및 혈액 세포 형성의 증강을 가져왔다.
실시예 6: SPC를 ABME와 접촉시키기 전에 감작하는 것에 의해 결과를 더욱 개선함.
SPC 또는 그들 중에 SPC를 갖는 MNC 집단은 특정한 화학적 작용제에 의해 별개로 감작될 수 있어서 그들은 ABME와 접촉된 후에 보다 많고 보다 양호한 혈액 세포 콜로니를 형성할 것이다. SPC의 감작은 감작 없는 경우의 세포들에 비해 보다 양호하고 많은 콜로니를 형성하나, 최상의 결과는 감작된 SPC가 ABME와 조합되는 경우에 수득된다. 본 발명자들은 SPC를 감작할 수 있어서 개선된 콜로니/혈액 세포 형성을 초래하는 10 종 이상의 화학물질을 확인하였고 이는 이 방법이 또한 신규한 감작제(priming agent)의 확인에 유용하다는 것을 의미한다(잠복기 관련 펩티드, 3-아미노벤자미드, IGF-I & II, 만노오스 6-p 함유 글리콜 컨쥬게이트). 감작제는 인테그린 매개 부착, IGF-I 수용체, 만노오스 6-포스페이트/IGF-II 수용체, cGMP-의존성 기능과 관련된 신호를 활성화시키거나, 또는 SPC에 대한 폴리(ADP-리보오스 포스페이트) 폴리머라아제 기능을 억제할 수 있고, 이는 이들에 대해 기능적으로 동일한 신규한 분자는 감작제로 인정될 수 있다는 것을 의미한다. 이 감작제들은 조혈을 유의성 있게 조절하기 때문에, 그들은 또한 조혈 조절제로 인정될 수 있다.
실시예 7: 귀소의 조절:
실험 A
5X105개의 중간엽 세포들을 20% 혈청을 함유한 IMDM으로 35 mm 직경의 페트리 디쉬(Becton Dickinson, USA) 상에서 배양하였다. 세포들이 전면성장하여 합류( confluent)된 후, 배지를 제거하고 상기 세포들을 인산염 완충 염수(GIBCO-BRL)(PBS)로 2회 세척하고 배지를 10 ng.ml-1의 TGFβl을 함유한 처리 배지(treatment medium)으로 교체하고 상기 디쉬를 다시 37℃, 5% CO2의 표준 세포 배양 환경으로 복귀시켰다. 4시간 후에, 상기 처리 배지를 제거하고 세포들을 PBS로 세척하고 0.5% 혈청을 함유한 IMDM 1ml로 덮고 37℃, 5% CO2에서의 배양을 지속하였다. 18시간 후에, 조건 배지(conditioned medium)를 채취하고 CD34+ SPC의 인 비트로 귀소를 지원하는 능력에 대해 분석하였다. 또 다른 병행 실험에서, 동일한 수의 중간엽 세포들을 이용하고, TGF-βl은 사용하지 않았으며, 이 실험으로부터 수득된 조건 배지를 비교를 위한 기준(reference)으로 이용하였다. 결과를 도 6(a-c)에 도시한다. 중간엽 세포를 TGFβl으로 처리하고, 이에 의해 그들이 활성의 ABME를 형성한 후, 유의성 있게 더 많은 양의 SDF-1α가 분비되어, ABME 주위에 SPC를 유인하기 위해 화학주성 구배를 설정할 있고, 따라서, 그들의 귀소를 촉진한다는 것을 발견하였다. 도 6(a-b)에 도시된 바와 같이, 무처리 중간엽 세포들은 TGF-βl으로 처리된 중간엽 세포들에 비해 전혀 귀소를 보이지 않거나 한계 수준(marginal)의 귀소를 보인다. 이 경우, 귀소는 SPC의 화학-유인에 대한 효과를 중화시키기 위해 SDF-1α 또는 그의 수용체 CXCR-4에 적당한 양의 중화 항체를 첨가하거나 외래 SDF-1α의 첨가에 의해 구배를 파괴하는 것에 의해 조절될 수 있고, 이는 상기 과정의 특이성을 나타낸다.
실험 B
중간엽 세포를 무균상태의 lcm X lcm 유리 커버슬립 상에서 합류점 부근(near confluence)까지 배양하고 10ngml-1의 TGF-βl을 함유한 처리 배지로 뒤덮고 가습된 무균상태의 대기 및 5% CO2에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 상기 커버슬립을 PBS로 세척하고 그에 의해 형성된 ABME를 20% 혈청을 함유한 IMDM 0.2 ml에 담긴 2 X lO6개의 MNC 또는 2 X 105개의 CD34+ 현탁액으로 뒤덮었다. 37℃에서 1시간 후, 상기 커버슬립을 PBS로 세척하고 상기 세포들을 고정하고 CD34+ 특이적 항체(클론 HPCAl, Becton Dickinson, USA)로 염색하였다. 그 결과를 도 6(d-f)에 도시한다. 부착된 CD34+ 세포의 수를 측정하고 TGF-βl이 사용되지 않았던 병행의 기준 실험에서 부착되었던 유사한 세포의 수와 비교하였다. 중간엽 세포 상에서 TGFβl에 의해 형성된 ABME는 기준(reference) 커버슬립에 비해 유의성 있게 더 많은 수의 CD34+ 세포들이 부착되게 하였으며, 이는 이 세포들의 ABME로의 귀소가 중간엽 세포 단독에 비해 탁월하다는 것을 의미한다. 도 6(d-f)로부터, 중간엽 세 포들이 TGF-βl으로 처리된 경우 중간엽 세포로의 CD34+ 세포들의 증가된 부착이 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 8: 융합의 조절
융합 실험은 도 6d에 도시된 바와 같이 CD34+ 세포의 ABME로의 부착이 기능적으로 적절한지 여부 및 그렇다면 그와 같은 융합을 촉진하기 위해 어떤 메카니즘이 이용되고 있는지를 결정하는 것에 관한 것이었다.
중간엽 세포(24 웰 디쉬에서 웰 당 5X104개의 세포)를 합류점 부근에 도달할때까지 20% 우태혈청을 함유한 IMDM에서 배양하였다. 상기 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척하였다. 중간엽 세포에서 αiib:β3 인테그린 신호전달을 선택적으로 활성화시키는 화학적 조혈 조절제 [Biotin-Ser-Gly-Ser-Gly-Cys*-Asn-Pro-Arg-Gly-Asp (Tyr-OMe)Arg-Cys*Lys(C*-C*간에 고리형성), 10 ㎍.ml-1, 18 시간]를 이용하여 ABME를 준비하였다. 상기 형성된 ABME를 PBS로 2회 세척하고 CD34+ SPC 세포(105 ml-1)의 현탁액 0.2 ml로 뒤덮고, αiib:β3 인테그린의 상호작용을 억제하는 또 다른 펩티드[l-아다만탄아세틸-Cys*Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-C(Cys*-Cys*간 고리 형성)]의 존재 또는 부재 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션의 완료 후에, 상기 세포들을 PBS로 2회 세척하고 조혈 콜로니 형성 분석(HCFA)을 위해 처리하였다. 조혈 콜로니 형성을 위해, 부착된 SPC를 갖는 ABME 세포들을 멀티-웰 디쉬로부 터 채취하고, 20%의 혈청, 0.8% 메틸 셀룰로오스 및 과량의 다양한 정제된 인간 특이적 시토카인 및 조혈 콜로니 자극 성장 인자(Stem cell Technologies, Vancouver, Ontario, Canada)를 함유한 1 ml의 IMDM에 재현탁시켰다. 보다 상세하게는, HCFA에서 관례적으로 사용된 조혈 성장 인자의 양은 단위 밀리리터당 2 국제 유닛(2 I.U.ml-1)의 에리트로포이에틴(EPO), 단위 밀리리터당 50 나노그램의 줄기 세포 인자(SCF) 및 단위 밀리리터당 20 나노그램의 과립구-대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 인터루킨-1 베타(IL-lβ), 인터루킨-3(IL-3) 및 인터루킨-6(IL-6)였다. 세포들을 조혈 콜로니가 커질 때까지 12-14일간 배양하였다. 그 결과가 도 7에 도시된다. 펩티드 화학적 조절제에 의해 형성된 ABME는 유의성 있게 더 많은 수의 조혈 콜로니를 형성할 수 있었고, 반면에, 이 조혈 조절제 기능이 억제성 펩티드에 의해 억제되는 경우, 콜로니 수는 억제제 투여량 의존적 방식으로 감소되었다. 상기 결과는 αiib:β3 인테그린 상호작용을 통하여 ABME에 대해 SPC에 의해 구축된 접촉은 기능적으로 적절하고 손상된 경우, AMBE의 기능을 약화시킨다는 것을 명확하게 보여준다.
따라서, 이 결과들은 조혈 조절제에 의한 SPC의 ABME로의 부착의 촉진은 기능적으로 적절하고 인 비트로에서 SPC 융합과 동등하며, 또한 이 융합은 인 비트로에서 조절될 수 있다는 것을 명확하게 보여준다.
실시예 9: 계통 결정의 조절
조혈 동안 SPC의 계통 결정(lineage commitment)은 형성된 성숙 혈액 세포(mature blood cell)의 조성에 영향을 미칠 수 있다. 계통 결정 실험은 ABME의 적합한 이용에 의해 두 계통에서 성숙 혈액 세포 형성의 조성을 변화시킬 수 있는지 여부를 입증하는 것에 관한 것이었다.
중간엽 세포(24 웰 디쉬에서 웰 당 5X104개의 세포)를 합류점 부근에 도달할때까지 20% 우태혈청을 함유한 IMDM에서 배양하였다. 배지를 제거하고 세포들을 PBS로 2회 세척하였다. 두 개의 생물학적 조혈 조절제(TGFβl l0 ngml-1, bFGF lOngml-1, 18 시간)를 각각 사용하여 두 개의 상이한 ABME를 준비하였다. 형성된 ABME를 PBS로 2회 세척하고 CD34+ SPC 세포(105 ml-1)의 현탁액 0.2 ml로 뒤덮고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 상기 디쉬의 모든 세포들을 채취하고 HCFA에서 사용하였다. 14일 후에, 형성된 성숙 혈액 세포를 채취하고 현탁액의 분량을 현미경 하에서 관찰하여 성숙 림프구 및 골수 세포를 확인하고 계수하였다. 그 결과가 도 8a에 도시된다. bFGF에 의해 준비된 ABME이 사용된 경우, 보다 많은 수의 림프구 세포가 생성되었고 ABME를 위해 TGFβl이 사용된 경우, 이는 보다 많은 수의 골수 세포 형성을 지지한다는 것을 관찰하였다. 이 결과는 특정한 조혈 조절제를 선택하는 것에 의해 준비된 ABME가 계통 결정을 조절하고 형성된 성숙 혈액 세포에서 골수 세포 및 림프구 세포의 조성 또는 비율을 변경하기 위해 이용될 수 있다는 것을 명확하게 보여준다.
본 실험은 형성된 성숙 혈액 세포의 조성이 적혈구 및 골수 세포에 대해 변할 수 있다는 것을 입증하는 것에 관한 것이었다. 중간엽 세포(24 웰 디쉬에서 웰 당 5X104개의 세포)를 합류점 부근에 도달할때까지 20% 우태혈청을 함유한 IMDM에서 배양하였다. 배지를 제거하고 세포들을 PBS로 2회 세척하였다. 하나의 웰에 있는 세포들을 1시간 동안 칼슘 이온 킬레이트제 BAPTA(5 μM)의 디브로모 유도체로 처리하고, 또 다른 웰에는 상기 BAPTA 유도체를 포함하지 않는 배지를 넣었다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 상기 두 개의 웰에 TGFβl을 첨가하고(1Ong ml-1) 추가로 18시간 동안 인큐베이션을 지속하였다. 상기 두 개의 웰에서 형성된 ABME를 세척하고 CD34+ SPC를 이용한 HCFA를 위해 이용하였다. 14일 후에, 성숙 혈액 세포를 채취하고 적혈구 및 골수세포 계통의 세포들을 정량하였다. 그 결과가 도 8b에 도시된다. 결과는 디브로모 BAPTA 유도체가 ABME 형성을 위해 이용되는 경우, 디브로모 BAPTA가 이용되지 않은 기준 실험에 비해 골수세포 및 적혈구 세포 집단의 비율에 상당한 차이가 있다는 것을 보여주었다.
실시예 10: 세포 생존의 조절
본 실험은 ABME가 세포 생존을 촉진하는 특성을 갖는지 여부를 결정하는 것에 관한 것이었다. 포스포(세린 473) Akt/PKB, 포스포르-배드(phosphor-Bad)와 같은 프로-생존 분자(pro-survival molecule)의 존재 여부에 대해 중간엽 세포를 조 사하여, 이 물질들(entities)이 상기 세포 내에 매우 소량으로 존재한다는 것을 발견하였다. 그러나, 중간엽 세포가 ABME를 준비하기 위해 이용되는 경우, ABME의 세포에 포스포르(세린 473) Akt/PKB 및 포스포-배드, 활성화된 일산화질소 신타아제(Nitric Oxide Synthase)와 같은 프로-생존 인자의 상당한 상향조절(upregulation)이 있다는 것을 발견하였다. 이 결과들은 ABME에서 프로-생존 인자들이 활성화되고 따라서 그들이 ABME와의 접촉 동안 SPC로 이전될 수 있다는 것을 보여준다. 또 다른 세트의 실험에서, SPC에서 프로-생존 신호가 3 아미노 벤자미드를 이용하는 것에 의한 폴리(ADP-리보오스) 폴리머라아제의 억제에 의해 상향조절되었다. 그 결과는 도 9(a-d)에 도시된다. 결과는 이 처리 후에, SPC가 형성된 조혈 콜로니의 수를 상승적으로 증가시킬 수 있다는 것을 보여주었고, 이는 SPC-세포 생존이 인 비트로에서 조절될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 11: 자기 재생의 조절.
실험 A
본 실험은 MNC에 존재하는 정지상태의 원시적 전구세포들(quiescent primitive progenitors)이 ABME와 접촉되는 경우 자극되고 이에 의해 혼합된 계통으로 구성된 모다 많은 콜로니를 형성하는지 여부를 조사하는 것에 관한 것이었다. 중간엽 세포를 합류점 부근에 도달할 때까지 20% 우태혈청을 함유한 IMDM에서 배양하였다. 상기 배지를 제거하고 세포들을 PBS로 2회 세척하였다. 생물학적 조혈 조 절제, 즉, TGF 베타 l(20ngml-l)을 이용하여 ABME을 준비하였다. 형성된 ABME를 PBS로 2회 세척하고 세포들을 비-효소 용액(non-enzymatic solution)(Sigma)로 분리시켰다. 고정된 수의 MNC, 즉, 2X105개의 MNC를 다양한 양의 분리된 중간엽 세포(2xlO4, 5xlO4 및 1x1O5)와 혼합하고 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션의완료 후에, 조혈 콜로니 형성 분석(HCFA)를 위해 세포들을 처리하였다. ABME의 세포들을 대조구 중간엽 세포에 대비한 실험에서 사용한 경우, GEMM 콜로니 형성의 명확한 투여량 의존적 증가가 관찰되었다(도 10a). ABME로부터 유래된 둘째로 낮은 농도의 세포(2xlO4)가 중간엽 세포의 가장 높은 농도(1xlO5)보다 GEMM 형성의 자극에서 더 효율적이었고, 이는 효율성의 약 10배 증가를 나타낸다.
실험 B
본 실험은 SPC-자기 재생에 대해 ABME가 장점을 제공하는지 여부를 조사하는 것에 관한 것이었다.
중간엽 세포를 무균상태의 lcm X lcm 유리 커버슬립 상에서 합류점 부근까지 배양하고 10ngml-1의 TGF-βl을 함유한 처리 배지로 뒤덮고 가습된 무균상태의 대기 및 5% CO2에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 상기 커버슬립을 PBS로 세척하고 그에 의해 형성된 ABME를 20% 혈청을 함유한 IMDM 0.2 ml에 담긴 2 X 105개의 CD34+ 현탁액으로 뒤덮었다. 1시간 후, 상기 세포들을 세척하고 결합된 세포들을 20% 혈청, 0.8% 메틸 셀룰로오스 및 성장 인자를 함유한 배지로 뒤덮었다. 48시간 후에 CD34+ 세포 수의 변화를 CD34+ 특이적 항체(클론 HPCAl, Becton Dickinson, USA)로 모니터링하였다. 그 결과를 도 10b에 도시한다. ABME는 TGFβl이 사용되지 않은 또 다른 실험에 비해 보다 많은 CD34+ 세포의 증식을 지지하는 것으로 관찰되었다. 또한, ABME는 중간엽 세포에 비해, 훨씬 더 많은 양의 자기 재생의 촉진자(promoter), Jagged 1을 포함하는 것으로 결정되었다(도 10c).
실시예 12: 정상 산소 조건에서 저산소 상태의 유도:
본 실험은 특정한 조혈 조절제를 이용하여 정상 산소 조건에서 저산소 상태를 형성하는 가능성을 조사하는 것에 관한 것이었다.
실험 A
생물학적 조절제, 즉, TGF 베타l을 이용하여 전술된 실험#1에 기재된 바와 같이 중간엽 세포들을 ABME 형성을 위해 처리하였다. 표시된 시간의 경과 후에 상기 세포들을 고정시키고 저산소 상태(hypoxia)에 대한 특이적 전사 인자인 HIF lα에 대한 항체로 면역-염색하였다. 대조구 세포 대비, TGF 베타l으로 처리된 중간엽 세포에서는 HIF lα의 명확한 핵 발현(nuclear expression)이 관찰되었다.
실험 B
생물학적 조절제, 즉, TGF 베타l을 이용하여 전술된 실시예 7(a)에 기재된 바와 같이 중간엽 세포들을 ABME 형성을 위해 처리하고 200 μM의 히폭시(저산소 상태) 프로브와 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 세포들을 고정하고 상기 표지의 검출에 특이적인 항체(Chemicon)로 면역-염색시켰다. 그 결과를 도 11b에 도시한다. TFG 베타-1의 사용에 의해 형성된 ABME는 표지의 높은 결합을 보여주는 것으로 관찰되었고 이는 저산소 조건의 존재를 나타낸다.
실시예 13: 중간엽 세포의 조혈 기능에서의 적합성에 대한 평가
실시예 8에 기재된 방식으로, 다양한 중간엽 세포들의 ABME 형성에서의 잠재적 유용성을 평가하기 위한 스크리닝이 수행될 수 있다. 그 결과는 도 12에 도시되며, 상기 도면에서 두 개의 별개의 골수 시료로부터 배양된 중간엽 세포 집단과 접촉된 경우 조혈 조절제의 효능이 비교되었다. 동일한 배치의 SPC를 이용하고 하나의 공지된 조혈 조절제를 기준점(reference point)으로 이용하여, 주어진 중간엽 세포 시료의 "ABME 형성 능력(ABME formation capacity)"을 평가할 수 있다.
실시예 14: 조혈 조절제의 스크리닝:
실시예 8에 기재된 방식으로, 중간엽 세포를 사용하고 다양한 잠재적 조혈 조절제의 보충을 함유한 처리 배지를 사용하여 신규한 조혈 조절제가 스크리닝될 수 있다. 그 결과를 도 13에 도시하며, 상기 도면에 ABME 형성에 대하여 촉진성 조 혈 조절제 대 억제성 조혈 조절제의 차별적인 효과가 도시된다. 공지된 조혈 조절제가 기준점으로 포함되고 동일한 배치의 SPC가 사용되는 경우, 기준 조혈 조절제에 대비해 테스트 물질의 ABME를 유도하는 능력이 평가될 수 있고 포지티브/네가티브; 강력한(potent)/덜 강력한(less potent)/효과없는(ineffective) 조혈 조절제 등으로 표시될 수 있다.
본 발명에서 사용된 재료:
본 발명에서 사용된 모든 재료는 구매 가능하다. 골수 세포, SPC, 중간엽 세포, 배양 배지, 성장 및 분화 인자, 인터루킨, 혈청, 항체와 같은 생물학적 재료는 Cambrex Bioscience, USA; American Type Culture Collections, USA; GIBCO-BRL,USA; Sigma Chemical Company, USA; Santacruz Biotechnology, USA; Neomarker, USA; Becton Dickinson, USA; Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada; Bachem, Switzerland; Alexis Corporation, Switzerland; Promega Corporation, USA; Peprotech, U.K.; 등과 같은 생물공학 회사로부터 입수하였다. 세포 분리 제품(cell separation product)는 Dynal, Norway로 부터 구입하고; 메틸 셀룰로오스는 Sigma Chemical Company, USA로부터; 세포-배양 관련 플라스틱 용기들은 Becton Dickinson, USA; Corning, Costar, USA로부터 입수하고; 이산화탄소 인큐베이터와 같은 세포 배양 관련 장비들은 Forma, USA의 제품이었고; 다양한 종류의 현미경과 같은 광학 장비는 Zeiss, Germany; Olympus Corporation, Japan 및 Nikon, Japan의 제품이었다.
본 발명의 장점 및 산업상 이용가능성:
본 발명의 조성물은:
a) 자연적인 또는 인공적인 조혈의 개별적인 단계들을 조절하고,
b) 건강한 골수 세포 및 질병 상태의 골수 세포에서 골수 기능을 평가하고,
c) 체내에서 내인성 시토카인 및 성장/분화 인자의 수준에 영향을 미치지 않으면서 자연적인 조혈을 신속하게 증가시키며,
d) 자가 조혈(autologous hematopoiesis)을 자극하는 것에 의해 SPC 이식에서 관찰되는 이식편대 숙주병(Graft vs Host disease)을 최소화하거나 제거하고,
e) 적합한 유전적 또는 분자적 물질(genetic or molecular entities)을 도입하는 것에 의한 신규한 기능의 생성(engineering)에서 인 비트로 융합된 SPC(in vitro engrafted SPC)를 이용하며,
f) 인 비트로에서 융합가능한(engraftable) SPC 및 융합가능하지 않은(non-engraftable) SPC를 선택적으로 파괴하고,
g) 인 비트로에서 하나 이상의 계통에서 혈액 세포의 강건한 성장을 촉진하며,
h) 해당 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 골수로부터 백혈병 전구 세포(leukemia progenitor cell)를 제거하고,
i) 정상 산소 조건 하에서 세포들에서 저산소 상태를 조성하며,
j) 정상 SPC 및 병적인 SPC에서 정지상태를 유도하고,
k) 조혈 과정의 하나 이상의 단계를 조절할 신규한 약물을 발견하며,
1) SPC의 비-조혈 세포 운명으로의 분화 또는 조혈 세포 운명으로의 분화를 가능하게 할 신규한 약물을 발견하고,
m) 세포-매개 면역 반응 또는 항체-매개 면역 반응에 의해 선택된 생물학적 표적을 파괴하도록 새로 형성된 면역 세포들을 훈련시키며.
n) 자가 면역 질환의 쇠약하게 하는 효과를 예방하기 위해 새로 형성된 면역 세포들이 자신의 정상적인 표적 세포에 작용하지 않도록(spare) 훈련시키고,
o) 내성(tolerance)을 유도하여 동종의(allogenic) 조직 이식물을 허용하도록 새롭게 형성된 면역 세포를 훈련시키는데 유용할 ABME의 형성을 위해 이용될 수 있다.
본 발명이 완전히 기재되었기 때문에, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 과도한 실험 없이, 본 발명의 원리 및 범위를 벗어나지 않으면서 광범위한 동등한 파라미터, 농도 및 조건 내에서 동일한 발명이 실시될 수 있는 것으로 이해할 것이다.

Claims (17)

  1. CD34+ 조혈 줄기 세포 및 전구 세포(CD34+ 조혈 SPC) 귀소(Homing), 융합(engraftment) 및 자기 재생을 촉진하고, CD34+ 조혈 SPC 증식을 조절하며, 정상 산소 농도 조건에서 저산소 상태를 유도하고 유지하는, 인공 골수 미세 환경(ABME)의 형성용 조성물로서:
    a] 인간 중간엽 세포의 배양물;
    b] 전환 성장 인자 베타 1(TGFβ1)인 것인 a]의 중간엽 세포의 세포내 신호전달을 유도하는 조혈 조절제(hematopoietic modulator),
    c] 혈청, 및 인터루킨 1 베타, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 줄기 세포 인자(SCF), 및 에리트로포이에틴으로부터 선택된 추가적인 보충제, 및 a]의 중간엽 세포에서 저산소 상태를 촉진하는 조혈 조절제인 TGFβ1으로 보충된 이스코브 변형 둘벡코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium:IMDM), 둘벡코 변형 이글 배지(DMEM), 알파-미니멈 필수 배지(α-MEM), RPMI-1640으로부터 선택된 세포 배양용 배지;
    d] 세포외 매트릭스(extra cellular matrix) 단백질의 구성성분을 포함하는 세포 지지체(support)로서, 상기 세포외 매트릭스 단백질은 피브로넥틴, 콜라겐, 비트로넥틴, 및 라미닌인 것인 세포 지지체;를 포함하는, 인공 골수 미세 환경(ABME)의 형성용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 c]의 배지는 5 내지 30%의 우태혈청, 2 I.U./ml의 에리트로포이에틴, 1 내지 10 ng/ml의 TGFβ1, 50 ng/ml의 줄기 세포 인자, 및 1-10 nM의 인터루킨 1 베타, 인터루킨 3, 및 인터루킨 6으로부터 선택된 인터루킨을 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 TGFβ1은 1 내지 50 pM 또는 1 내지 10 ng/ml의 유효 농도로 이용되는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 세포는 인간 제대혈 및 태반으로부터 배양되는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 세포는 인간 장골능(iliac crest), 늑골(rib bone), 또는 대퇴골(femur bone)의 골수로부터 배양되는 것인 조성물.
  6. CD34+ 조혈 줄기 세포 및 전구 세포(CD34+ 조혈 SPC) 귀소, 융합 및 자기 재생을 촉진하고, CD34+ 조혈 SPC 증식을 조절하며, 정상 산소 농도 조건에서 저산소 상태를 유도하고 유지하는, 인공 골수 미세 환경(ABME)을 형성하는 방법으로서, 상기 방법은:
    i) 혈청, 및 인터루킨 1 베타, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 줄기 세포 인자, 및에리트로포이에틴으로부터 선택된 추가적인 보충제, 및, 중간엽 세포에서 저산소 상태를 촉진하는 조혈 조절제인 TGFβ1으로 보충된 이스코브 변형 둘벡코 배지(IMDM), 둘벡코 변형 이글 배지(DMEM), 알파-미니멈 필수 배지(α-MEM), RPMI-1640으로부터 선택된 세포 배양용 배지에서 중간엽 세포를 확장시키는 단계,
    ii) 단계 i)에서 준비된 중간엽 세포를 30분 이상 동안 1 내지 50 pM 또는 1 내지 10 ng/ml의 TGFβ1과 접촉시키고 이에 의해 상기 중간엽 세포에서 세포내 신호전달 및 저산소 상태를 유도하고 상기 중간엽 세포를 활성화시켜 CD34+ 조혈 SPC 자기 재생 및 분화를 촉진하는 ABME를 형성시키는 단계,
    iii) 단계 i)의 중간엽 세포를 에리트로포이에틴(2 I.U./ml)과 골수 단핵 세포의 인큐베이션으로부터 수득된 조건 배지로 구성된 조혈 조절제와 접촉시켜, CD34+ 조혈 SPC 자기 재생 및 분화를 촉진하는 ABME를 형성시키는 단계,
    iv) 단계 i)의 중간엽 세포를 FGF-2와 30분 이상 동안 접촉시켜 CD34+ 조혈 SPC 자기 재생 및 분화를 촉진하는 ABME를 형성시키는 단계,
    v) 단계 i)의 중간엽 세포를 우성 저해성(dominant inhibitory) 조혈 조절제인 시클로-1-아다만탄 아세틸-Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys(1번과 8번 위치의 두 개의 Cys 간에 고리를 형성함)과 접촉시켜, CD34+ 조혈 SPC 증식을 저해시키는 ABME를 형성시키는 단계,
    vi) 단계 ii) 내지 v) 중 하나에서 형성된 ABME의 세포를 세척하여 사용된 조혈 조절제를 제거하는 단계,
    vii) 단계 ii) 내지 vi) 중 하나에서 형성된 ABME의 세포를 그대로 CD34+ 조혈 SPC와 접촉시키거나 또는 감작성(priming) 조혈 조절제로 처리한 후 접촉시켜, CD34+ 조혈 SPC-귀소, CD34+ 조혈 SPC-융합, 및 자기 재생을 촉진하고, CD34+ 조혈 SPC 증식을 조절하는 단계로서, 상기 감작성 조혈 조절제는 폴리-ADP 리보오스 폴리머라아제 억제제인 3-아미노벤즈아미드인 것인 단계, 및
    viii) 단계 vii)에서 수득된 CD34+ 조혈 SPC를 단계 ii) 내지 vii) 중 하나에서 형성된 ABME와 접촉시키는 사이클을 1회 이상 수행하여, CD34+ 조혈 SPC 귀소, 융합, 및 자기 재생의 촉진, 및 CD34+ 조혈 SPC 증식 조절을 더 강화시키는 단계를 포함하고, 선택적으로
    ix) 단계 viii)에서 수득된 CD34+ 조혈 SPC를 단계 v)에서 형성된 ABME와 시클로-1-아다만탄 아세틸-Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys(1번과 8번 위치의 두 개의 Cys 간에 고리를 형성함)를 이용하여 접촉시켜, CD34+ 조혈 SPC 증식을 억제시키는 단계를 더 포함하는, 인공 골수 환경(ABME)을 형성하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 방법은 CD34+ 조혈 SPC-귀소, CD34+ 조혈 SPC-융합, 자기 재생 및 CD34+ 조혈 SPC 증식의 조절에 대해, 단계 i)에 따라 준비된 중간엽 세포의 시료를 이용하여, 단계 ii) 내지 ix)에서 수득된 2개 이상의 ABME 시료를 비교하기 위한 것인 방법.
  8. 삭제
  9. 제6항에 있어서, 상기 단계 i)의 중간엽 세포는 인간 제대혈, 태반, 장골능, 늑골 또는 대퇴골로부터 수득된 것인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 방법은 CD34+ 조혈 SPC 증식을 저해시키는 ABME를 형성시키는 것인 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제6항에 있어서, 상기 방법은 단계 i) 내지 vii)에 따라 형성된 ABME의 중간엽 세포에서 정상 산소 농도 조건 하에 저산소 상태를 유도하고 유지하는 것인 방법.
  14. CD34+ 조혈 줄기 세포 및 전구 세포(CD34+ 조혈 SPC) 귀소, 융합 및 자기 재생을 촉진하고, CD34+ 조혈 SPC 증식을 조절하며, 정상 산소 농도 조건에서 저산소 상태를 유도하고 유지하는, 인공 골수 미세 환경(ABME)을 형성하는 것에 의해 제6항, 제7항, 제9항, 제10항, 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실시하기 위한 키트로서:
    a) 전환 성장 인자 베타 1(TGFβ1)인 것인 조혈 조절제,
    b) 디메틸 술폭시드, 인산염 완충액, 및 IMDM으로부터 선택되는 하나 이상의 희석제,
    c) 혈청, 및 인터루킨 1 베타, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 줄기 세포 인자, 및 에리트로포이에틴으로부터 선택된 추가적인 보충제, 및, 중간엽 세포에서 저산소 상태를 촉진하는 조혈 조절제인 TGFβ1으로 보충된 이스코브 변형 둘벡코 배지(IMDM), 둘벡코 변형 이글 배지(DMEM), 알파-미니멈 필수 배지(α-MEM), RPMI-1640으로부터 선택된 세포 배양용 배지;
    d) 우성 저해성 조혈 조절제인 시클로-1-아다만탄 아세틸-Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys(1번과 8번 위치의 두 개의 Cys 간에 고리를 형성함);
    e) 인산염 완충 염수(PBS) 및 IMDM을 포함하는, 사용된 조혈 조절제를 제거하는 세척 용액;
    f) 단백질 가수분해 효소, 억제제 및 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)을 포함하는, 세포 수집용 용액
    g) 감작성 조혈 조절제인 3-아미노벤즈아미드;
    h) 피브로넥틴, 콜라겐, 비트로넥틴, 및 라미닌을 포함하는 ABME용 지지 주형(template) 또는 지지체(scaffold), ABME의 세포, TGFβ1, bFGF, 에리트로포이에틴, 줄기 세포 인자, 인터루킨 1 베타, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 메틸셀룰로오스, 및 혈청을 포함하는, CD34+ 조혈 SPC 증식 조절용 배지, 및
    i) 설명 매뉴얼을 포함하는 것인 키트.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
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