CN101137747B - 用于产生人工骨髓样环境的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞生物学和医学领域，涉及产生人工骨髓样环境的组合物和体外方法及其用途。

Description

用于产生人工骨髓样环境的组合物及其用途
发明领域
本发明属于细胞生物学和医学领域并涉及产生人工骨髓样环境的组合物和体外方法及其用途。
背景技术
在人体内，在骨腔内存在称为“骨髓微环境”(BME)的特定环境，其构成了用于形成至少十种不同类型的血细胞和为骨再生所需的细胞以及众多干细胞/祖细胞的主要部位，所述干细胞/祖细胞能够产生多种分化细胞。人体健康关键取决于不同血细胞的连续供给，这些血细胞是通过称为“造血作用”的过程生成的。BME可能指导少数可能在体内循环的多能干细胞和祖细胞(SPC)，以产生多至十种不同类型的包含整个造血过程的成熟血细胞。由于SPC广泛地分布在体内，天然机制起作用以a)使得SPC从骨髓外归巢至BME内(称为SPC-归巢)，b)通过促进SPC和BME之间适合的粘附相互作用使得SPC保留在BME内(称为移植)，c)使得静止SPC转化为活化形式以促进它们的增殖，d)使得SPC在面对许多通常为抵触信号时能抗细胞凋亡而存活(称为SPC存活)，e)指导SPC沿着自我更新途径(产生更多的SPC)或谱系定型和分化(产生更多的成熟血细胞)途径增殖。由此，BME在涉及SPC的造血作用中的作用可被解释为是一系列的步骤，该步骤被单独调节并精密平衡，以便确保在个体的整个一生中有效的多谱系血细胞形成。涉及SPC机能(归巢、移植、从静止起活化、诱导活化的SPC静止、细胞存活、自我更新、谱系定型和沿分化的增殖)的整个过程导致持续和最佳的血细胞生成，该过程由BME所调节，但是科学家还不完全了解这种调节中所涉及的确切机制，并且在现有技术中没有能在体外或体内产生BME样环境以调节以上列举的一个或多个步骤以及使多种其它用途能够实现的方法。
到目前为止，现有技术认为存在于骨髓中的佐细胞仅在它们的直接临近区域贡献多种细胞因子和生长调节剂以便形成SPC所需的微环境，并因此以造血作用所需的这些组分的被动源形式起作用。在文献中流行另一种观点，即只有罕见的佐细胞群有能力支持SPC发育。但是，本申请人不同意现有技术的这种看法，并发现如果提供合适的条件，未经选择的佐细胞可向SPC提供高级信号。现在，本申请人开发了有助于形成人工骨髓样环境的组合物，在该人工骨髓样环境中可增强或调节血细胞形成。本发明公开的组合物和方法能使得造血作用的所有步骤都可以被基本改善。此外，本发明强调需要SPC与佐细胞或包含ABME的细胞的短暂接触以便显示预期效应，因而强调佐细胞确实起了积极作用。由此，在现有技术中，试图扩展SPC。但是到目前为止，还没有可能通过在体外产生有效的人工BME来基本改善或调节血细胞形成。本发明满足了这种需求。
发明目的
本发明的主要目的是提供有助于形成人工骨髓样环境的组合物，在该人工骨髓样环境中可增强或调节血细胞形成。
另一目的是提供制备这种环境的方法。
附图说明
图1A-1D：图1显示当将单核细胞接种在不同类型培养基中时造血集落的形成。
图2A-2E：图2B代表通过将MNC与间充质细胞混合而测定的集落形成结果，2C，2D和2E在包括间充质细胞分别与生物、化学或免疫造血调节剂(hematomodulator)的接触步骤之后。图2A显示没有间充质细胞情况下仅从MNC中形成的集落的性质。
图3A-3B显示当单独使用TGFβ1和FGF-2时各自形成的等效的ABME。
图4A-4E显示多种造血调节剂(hematopoietic modulators)对集落形成和造血细胞发育的作用。
图5显示免疫造血调节剂的作用及其功效。
图6(a-c)显示当用适合的造血调节剂处理时，存在于ABME中的间充质细胞表达增加量的趋化分子，如SDF 1α，并由此导致SPC的增强的迁移或归巢和粘附，图6(d-f)。
图7显示通过选择不同造血调节剂的合适组合来调节造血作用。长条代表当使用固定量的MNC时形成的造血集落以及通过采用活化和抑制类型的造血调节剂在造血细胞上形成的ABME。
图8(a-b)显示通过使HSPC与用合适的造血调节剂产生的ABME接触而改变HSPC的谱系定型。
图9(a-d)显示通过用合适的造血调节剂处理细胞存活因子时ABME中细胞存活因子的增加。
图10(a-b)显示通过使用合适的造血调节剂，SPC中自我更新分裂的增加。图10(c)显示在制备的支持自我更新的ABME细胞中，信号分子Jagged 1的增加的表达。
图11(a-b)显示通过使用合适的造血调节剂在常氧条件下在细胞中产生低氧环境。
图12显示两种或多种给定的间充质细胞群与给定的造血调节剂接触时形成ABME的相对功效的评价。
图13显示就ABME形成而言筛选刺激或抑制性造血调节剂。
发明详细说明
I.组合物
因此，本发明一方面涉及可用于形成人工体外骨髓环境(ABME)以调节血细胞形成的组合物，包含
(i)间充质细胞，
(ii)选自生物试剂、化学试剂和免疫试剂的造血调节剂；以及
(iii)用于产生AMBE和实施这项技术的培养基。
本文所用的术语“造血调节剂”指，与不使用时的对照相比，能够体外改变造血作用的一个或多个步骤的试剂，通过它们或者形成一个或多个谱系中的更多种血细胞或者改变两个或多个谱系中血细胞的相对比例，这些试剂通过其对间充质细胞的细胞内信号或对SPC或对二者的调节作用来发挥作用。这种试剂可以为生物试剂、化学试剂或免疫试剂。造血调节剂对于形成体外BME是必须的，并且本发明提供了造血调节剂的一些实例。已发现三类造血调节剂有效；a)生物学的，b)化学的和c)免疫的。这些调节剂本文称为造血调节剂(“hematopoietic modulators”或“hematomodulators”)。
生物造血调节剂：
所述生物试剂或生物造血调节剂可以选自1)由细胞制备的适合的条件培养基；2)生长因子和细胞刺激物，如转化生长因子β(TGFβ)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)，或3)天然蛋白，如纤连蛋白、vibronectin、层粘连蛋白、胶原和它们的含有整联蛋白结合结构域或活化结构域的片段以及它们的受体的调节剂，如整联蛋白。所述天然蛋白包括衍生自跨种和属的天然产生的同源基因的蛋白，以及它们的合成产生的功能同源物或模拟物。这些生物造血调节剂通过在靶细胞中产生或维持多种细胞内信号而起作用，其中所述细胞内信号有益于SPC归巢、SPC自我更新、SPC移植、以及用于分化和强健血细胞形成的SPC谱系定型。所述生物试剂在组合物中的浓度范围可以为0.1纳摩尔至50微摩尔。
化学造血调节剂：
用作造血调节剂的化学试剂或化学造血调节剂可以为靶细胞中特异性细胞内信号传导的增强剂(boosters)或调节剂，这些特异性细胞内信号传导有益于SPC归巢、SPC自我更新、SPC移植、以及用于分化和强健血细胞形成的SPC谱系定型。这种化学试剂在结构上可以与或不与蛋白、多肽或其功能同源物相关，并且可以用作特异性细胞内信号的增强剂。所述化学造血调节剂可以选自：
(i)蛋白激酶C增强剂，(ii)环磷酸鸟苷(cGMP)活化的过程的增强剂，包括蛋白激酶，(iii)黏着斑激酶的增强剂，(iv)同时活化PI3激酶、PD激酶、Akt激酶和Akt活化途径的其它下游成员的增强剂，(v)Ca++信号传导的调节剂，包括Ca++-钙调蛋白依赖性蛋白激酶，(vi)整合素连接激酶的增强剂以及(vii)组合增强剂，包含两种或多种选自(i)至(vi)的增强剂的适合组合。迄今为止描述的肽和蛋白试剂通过它们的三个字母码来遵循并详细说明各天然氨基酸，并以N末端开始，以C末端结束描述序列字符串。
蛋白激酶C增强剂可以为脂质样物质，例如天然或合成的二酰基甘油、法尼基硫代三唑，或非脂质化学物质，例如Indolactam V，佛波酯组的成员如12-O-十四酰佛波13-乙酸酯，或在细胞中抑制二酰基甘油脂肪酶以便在细胞中产生的二酰基甘油能够在更长的时间起作用的试剂，如1，6-双(环己基肟基羰基氨基)己烷(U-57908)。用于cGMP活化的过程的增强剂可以为cGMP样化合物，其可以容易地进入细胞并直接或间接增强包括蛋白激酶在内的cGMP依赖性过程。这些化合物可以为8-(4-氯苯基硫代)鸟苷3’，5’-环单磷酸盐、腺苷3’，5’-硫代单磷酸酯(monophophothioate)-Rp-异构体盐或抑制cGMP在细胞内被其特异性磷酸二酯酶破坏的化合物，如扎普司特(zaprinast)和西地那非(Sildenafil)以及它们的功能同源物。所述黏着斑激酶增强剂可以为蛋白或甚至为能够与间充质细胞或尤其与多种存在于它们细胞表面的整合素分子相互作用的肽基序，作为相互作用的结果，黏着斑激酶被活化，并且同时产生、增强或维持细胞内的整合素受体相关信号。本文描述了线性肽性质的造血调节剂，在所有情况下，其具有以氨基酸的标准三字母码描述的肽/蛋白序列并且该序列从氨基端开始，以羧基端氨基酸结束。肽造血调节剂的实例为：Trp-Gln-Pro-Pro-Arg-Ala-Arg-Ile，包含序列基序″Arg-Gly-Asp-丝氨酸″的线性或“头尾环状肽”或其功能同源物；整合素连接激酶、PI3激酶和Akt激酶的增强剂例如为肽Trp-Gln-Pro-Pro-Arg-Ala-Arg-IIe、包含″Arg-Gly-Asp-Ser″序列基序的线性或环状肽以及蛋白TGFβ1。
所述化学试剂可以为钙动员剂，其从细胞内储库中释放Ca++，或经由活化Ca++通道使得细胞外Ca++离子进入细胞，结果是包括蛋白激酶在内的几种Ca++依赖性酶被活化，这种造血调节剂例如为毒胡萝卜素、环匹阿尼酸和8-(N，N-二乙氨基)辛基-3，4，5-三甲氧基苯甲酸酯(TMB-8)。所述化学造血剂可以为间充质细胞内的酪氨酸激酶抑制剂，例如为3-氨基-2，4，-二氰基-5-(3’，4，5’-三羟基苯基)戊-2，4-dienonitrile(Tyrphostin AG183，别名Tyrphostin A51)。
所述化学造血调节剂可以为FGF受体功能的调节剂，例如肽Ala-Pro-Ser-Gly-His-Tyr-Lys-Gly，其被用于间充质细胞上以形成ABME同样地或作为由其它诸如TGFβ1的造血调节剂形成的ABME的协同增强剂。
此外，造血调节剂可以为促进或增进通过可扩散的化学信使的信号传导的试剂，该化学信使例如一氧化氮、基质细胞衍生因子-1α(以下称为“SDF-1α”)和基质细胞衍生因子-1β(以下称为“SDF-1β”)。本发明人已发现间充质细胞能够产生一氧化氮、SDF-1α和SDF-1β，并且在形成ABME组合物之后，这些化学信使由ABME以增加量产生。一氧化氮、SDF-1α和SDF-1β被包括进ABME的功能机制中，以刺激强健的造血作用，如下文所阐明的。SDF-1α和SDF-1β分子用作SPC的吸引剂，使得SPC从远距离趋化迁移到达ABME。在从间充质细胞中分泌的SDF-1α和SDF-1β增加情况下，由它们形成的趋化梯度更强，并到达更远的距离，有效地增加它们的影响范围并促进从较大容量的围绕ABME的环境中收集SPC。SDF-1α和SDF-1β帮助移植，并且还作为SPC及由其衍生的子代的增殖诱导剂，由此促进了强健的造血作用。
发明人确定造血调节剂可在形成ABME的间充质细胞中增加诸如间隙连接蛋白43(Connexin 43)的间隙连接蛋白的表达。间隙连接蛋白43在天然造血作用过程中起重要作用，促进细胞间的通讯。
发明人确定在ABME中增加的一氧化氮含量有益于强健的血细胞形成。一氧化氮是高反应活性的，非常快速地与分子氧结合，从而被破坏。因此，促进间充质细胞中氧含量的有效下降或在间充质细胞中诱导低氧的试剂会增进延长的一氧化氮信号传导并对ABME的功能有有益作用。细胞的低氧状态也是新基因表达的促进剂，其中包括释放促进ABME功能、内皮细胞的动员和活化的VEGF，以形成新的血管来促进血管发生和血管生成，它们与血细胞的体内形成密切相关。包括降低氧压的环境有利于SPC表面上的CXCR4受体的表达，具有增加的CXCR4分子的这种SPC更好地通过SDF-1介导的化学吸引而被导向和吸引向ABME。例如将间充质细胞与一氧化氮和几种化合物形成的可逆加合物接触，通过从“一氧化氮供体”向靶细胞人工引入这种可扩散信使可增加间充质细胞中的一氧化氮，例如使该靶细胞与用如下化合物形成的一氧化氮的可逆加合物接触来人工引入该可扩散信使，该化合物例如为S-亚硝基青霉胺(SNP)、2-(N，N-二甲氨基)-diazenolate-2-氧化物(DEANONOate)等，接触过的细胞显示了更好的ABME相关特性。
所述造血调节剂可以为化学试剂，其为包含能够活化间充质细胞的整合素受体、黏着斑激酶、bFGF受体的线性或环状肽。如α5∶β的调节剂、α2∶β1的调节剂、α2b∶β3的调节剂、αV∶β5的调节剂、αV∶β3的调节剂、α4∶β1的调节剂、纤连蛋白粘附促进因子(FAK活化剂)、整合素调节剂如Arg-Gly-Asp-Ser)、bFGF调节剂如Ala-Pro-Ser-Gly-His-Tyr-Lys-Gly、天然纤连蛋白或含有多种整合素相互作用结构域、细胞结合结构域、肝素结合结构域和明胶结合结构域的纤连蛋白的亚片段。所述化学试剂的量可以为约0.1至100微摩尔。
所述造血调节剂可以为化学物质，其能够防止包括氧依赖性死亡结构域基序的蛋白或转录因子的细胞内降解，其实例为HIF-1α。
免疫造血调节剂：
本文所定义的免疫造血调节剂可以为抗体或其功能同源物，其能够活化细胞粘附信号，尤其是来自诸如间充质细胞的靶细胞中的整合素受体的细胞粘附信号。所选择的免疫造血调节剂的非限定性实例为针对整合素β亚基的活化抗体。可以足以引起靶细胞聚集50％或更多的浓度使用这种免疫造血调节剂。
启动型造血调节剂：
为了达到更好的结果，一些生物、化学或免疫造血调节剂可以任选地在它们用于ABME之前被用于接触SPC来启动或活化它们。一些启动型造血调节剂的实例为：聚(ADP-核糖)聚合酶抑制剂(3氨基苯甲酰胺)、用于TGFβ1的潜伏相关肽、含有糖偶联物的可溶的或细胞表面相关的甘露糖6-磷酸酯、IGFI和IGFII效应子、cGMP信号传导的增强剂。
当上述这些试剂为蛋白时，它包括它们的同源物、合成产生的分子或人工工程化的分子。
用在本发明中的间充质细胞指从肝脏、骨髓髂嵴、股骨和肋骨中获得的细胞或间充质干细胞。通常，对细胞进行选择以使得它们不能够形成造血集落。此外，这些细胞在性质上可能是同质的或异质的，并且可能包括诸如成纤维细胞、巨噬细胞、成骨细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等细胞。
上面提及的生长培养基为适于培养动物细胞的培养基。该培养基可以选自Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、Dulbecco改良的eagle培养基(DMEM)、Alpha-Minimum essential medium(MEM)、RPMI-1640，补加有胎牛血清(FBS)，并任选地补加有甲基纤维素、促红细胞生成素、造血生长和分化因子以及白介素。
在实施该技术时，可分离出在与ABME接触的初始循环(通常48-72小时的短时间段)内扩增的SPC，并通过将这种与新鲜ABME的接触重复一个或多个循环来进一步扩增SPC以进一步获得收益。
II.试剂盒
本发明还提供了可用于产生人工骨髓环境(ABME)的一种或多种试剂盒，并且将它用于多种用途，包括实现对血细胞形成的一个或多个独立步骤的调节，所述试剂盒包含：
a)一种或多种造血调节剂，其可以为选自在先前部分描述过的试剂中的生物、化学或免疫试剂，
b)用于造血调节剂的稀释剂，包括二甲基亚砜、磷酸盐缓冲液、IMDM，
c)适于培养间充质细胞的培养基，例如具有在先前部分中所描述的生长补充剂的Dulbecco′s培养基、RPMI-1640，IMDM，
d)可用于去除用过的造血调节剂的洗涤溶液，例如磷酸盐缓冲液或IMDM，
e)可用于收集ABME的细胞和/或再循环活化的SPC以进一步应用的溶液，例如包含蛋白水解酶、抑制剂和乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液，
f)启动干祖细胞的造血调节剂溶液(这些试剂与在先前部分中描述过的试剂相同)，
g)在使用被启动的干祖细胞之前用于除去启动试剂的洗涤溶液，如磷酸缓冲盐水或IMDM
h)用于体外血细胞形成的培养基，包含用于ABME的支持板或支架、ABME的细胞、前造血生长、分化和存活因子、生长培养基和任选的甲基纤维素、血清、适合的支架，以及
i)使用说明书。
所述支架可以包含纤连蛋白、胶原的二维或三维基质的基底或任何其它类似基底。
所述试剂盒可任选地包括其它试剂，用于i)评估给定的间充质细胞群形成ABME的性能，ii)从潜在的造血调节功能方面定量筛选生物、化学和免疫实体，iii)制备ABME并启动SPC以用于强健的血细胞形成，iv)制备ABME以改变体外在单一或多个谱系中形成的血细胞的组成，v)诱导存在于给定样品中在的SPC静止。该试剂系统以商业上包装的形式作为组合物或混合物(其中应考虑试剂的相容性)存在于测试装置构造中，或更典型地为测试试剂盒，即一个或多个容纳必需试剂的容器、装置或类似物的成套组合，并且通常包括用于实施测定的书面说明书。
上文提及的启动剂的具体实例列在下表中：
造血调节剂   实例
生物试剂1    人转化生长因子β1
化学试剂1    (-)Indolactam V
免疫试剂        针对人整合素β3的活化抗体
生物试剂2       HuFGF2
生物试剂-CM     按文中所述方法制备的条件培养
                基
化学试剂15      人TGFβ1的潜伏相关肽
化学试剂16      含有甘露糖6P基序的蛋白
化学试剂11(a-e) 能够活化如表II中所述的多种整
                合素的肽
化学抑制剂11f   抑制整合素α4∶β1受体功能的肽
化学物质12      cAMPSrp异构体
                在SPC中抑制cAMP依赖的过程
化学试剂3       Ca++螯合剂BAPTA的二溴衍生
                物
III协同作用
到目前为止，由于骨髓中用于血细胞生长的条件是最有利的，现有技术认为血细胞的增殖和生长可能仅发生在骨髓中(体内)。并且在体外难以产生这些条件和实现增强的血细胞生长。与这些假定相反，本发明人已开发了新的组合物和试剂盒，它协助形成有益于血细胞的调节的生长和增殖的体外环境。通过采用适合的细胞和培养基的组合来形成所述环境，其中所述培养基补加有造血调节剂和任选的用于ABME细胞的支持物。由此产生的环境非常适于造血作用并类似于天然BME。该ABME促进(i)通过更强的化学吸引增强归巢；(ii)通过促进间充质细胞和SPC之间的细胞粘附而增强移植；(iii)通过减少诸如Bad的前凋亡分子而增强SPC抗凋亡信号的存活，(iv)SPC沿骨髓和淋巴谱系的定型(v)活化静止的SPC以增强它们沿自我更新和分化途径的增殖以及(vi)在需要时诱导SPC静止。
此外，发现只有当使用本发明所述组合物的所有成分时，该组合物能够形成人工骨髓样环境并促进SPC和造血细胞生长。间充质细胞，当将其就此使用而未用造血调节剂处理时，既不维持也不产生有效的人工骨髓样环境(BME)。只有所述成分(即，所述细胞和含有恰当的造血调节剂的处理培养基)的组合产生此结果。因此，本发明所述组合物和试剂盒是协同作用，并令人惊讶地发现产生人工骨髓样环境，当单独使用所述成分时观察不到此结果。因此，所述组合物和试剂盒时协同作用。
IV.方法
在一个实施方案中，本发明提供了形成人工骨髓环境的方法，包括步骤：
(i)获得间充质细胞并将它们在合适的生长培养基中培养，
(ii)使该间充质细胞与造血调节剂接触20分钟至24小时，由此它们的细胞内信号传导途径被活化并且它们获得骨髓环境样性能；
(iii)获得干祖细胞(SPC)并任选地启动它们，
(iv)使在以上步骤(ii)中处理的间充质细胞与SPC接触，它们任选地与造血调节剂接触，以活化细胞内信号传导途径，使得它们能协同参与ABME形成更多的血细胞；
(v)使启动的SPC与ABME或活化的间充质细胞在培养基中接触20分钟或更长时间以在体外实现SPC-归巢、SPC-移植、SPC-活化、SPC-自我更新、SPC-沿淋巴和骨髓谱系的定型，于是产生强健的造血作用。也可出于特定目的通过适当选择造血调节剂以诱导SPC静止来应用该方法。
所述间充质细胞可以包括得自髂嵴的细胞、从成人肋骨或股骨中收集的骨髓细胞，并且可以在适当条件下将其维持在合适的培养基中，由此它们生长并在3-4次连续传代后在3-6周时在常规细胞培养中产生107或更多的间充质细胞，所述培养基例如为补加有20％人或胎牛血清的Iscove’s Modified Dulbeccos’Medium(IMDM)。“细胞培养条件”包括无菌条件下在37℃和5-7％二氧化碳的潮湿气氛中在合适的细胞培养级塑料器皿(Becton-Dickinson，USA)中维持该培养。
如上所述，所采用的用于血细胞形成的培养基可以为含有20％血清并补加有诸如IL-1β、IL-3、和IL-6的白介素、干细胞因子、诸如促红细胞生成素和GM-CSF、G-CSF的谱系特异性生长因子；以及到0.8％程度的甲基纤维素，所述培养在培养条件下维持12-14天，由此血细胞集落良好地生长或形成集落，并且所述生长对于进一步的分析和应用来说是清楚可见的/可辨别的。以类似方式设计的用于评估ABME功能的定量性质的测定法以下称为“用于ABME的定量的造血集落形成测定(HCFA-ABME)”。
用于产生ABME的间充质细胞的量取决于准备用ABME处理的SPC的数量，该方法可适当地调整以适应所需的间充质细胞数量的增加或减少。通常，间充质细胞的量可以为靶SPC的1.5倍。
使间充质细胞与造血调节剂接触的步骤可以通过用造血调节剂在含有20％血清的IMDM中的合适溶液/悬浮液覆盖间充质细胞并将该细胞在标准细胞培养条件下保持0.5-24小时的时间来实现，由此细胞被活化并且ABME样性能被诱导，其持续足够长的时间以保持有用，即使在撤除造血调节剂之后。
任选地，可将SPC或含有SPC的细胞群(实例：从骨髓中分离的单核细胞、来自脐带血的有核细胞、在动员SPC之后来自外周血的有核细胞)与制备的ABME混合，以使得ABME细胞与所使用的SPC细胞相比过量近1.5倍。SPC和ABME可以被悬浮在普通的培养基中，在合适的培养条件下保持在一起至少30分钟的时间。当SPC被附着到合适表面时，可使ABME细胞覆盖或围绕着它们。此外，可用包含IMDM、20％血清和0.8％甲基纤维素并根据每一具体应用补加有所需的其它试剂的培养基覆盖ABME和SPC。
为了获得最优结果，待使用的特定造血调节剂的浓度和给定批次的间充质细胞的待接触时间可以变化，这些具体细节需要在每一单独情况中确定，本文描述的浓度范围和造血调节剂的处理持续时间仅作为指导。
在另一实施方案中，所述方法适于分区室培养，该培养能够减少在孵育过程中通过扩散原位产生的造血作用的抑制剂，其中ABME和SPC细胞被包含在一个区室中，含有必需的或期望的生长和分化因子的培养基或造血调节剂从分开的和可替换的区室中接触该细胞。
在另一实施方案中，所述方法适合于流动培养系统，其中ABME和SPC细胞被包含在支持物/区室中，使得包含培养基的应用培养基、含有造血调节剂的接触培养基、洗涤溶液、分化培养基能以编程化的方式滤过或流过这些细胞，以便避免原位天然产生的造血抑制剂的积累并使得能连续为细胞提供营养而改善结果。
发明人在他们的研究过程中发现，当发现ABME准备好或发现SPC被活化以促进强健的造血作用时，不是必须使间充质细胞与造血调节剂连续接触。当同等数量的SPC与间充质细胞接触作为参照或在类似实验条件下与ABME接触时，明显大量的SPC被募集到ABME，并且当它们进一步被处理用于HCFA时，与参照相比发现在ABME中集落数量有显著增加，这暗示增强的归巢、更有效的移植和强健的血细胞形成。这种结果表明存在于样品中的活化的SPC的比例增加，进一步暗示一些SPC可能已经脱离了静止状态并进入了活化状态和/或可能已经经历自我更新以增加活化的SPC细胞的比例。
在另一实施方案中，本发明人已鉴定出负造血调节剂，其调节ABME的功能以致于正常的SPC获得相当的静止状态。这种调节使得开发出能区分在细胞周期调节特征方面有差异的正常SPC和病理SPC的方案。因而，所述方法支持在体外使用抗肿瘤药物以便选择性破坏白血病SPC的治疗方案，避免了与体内化疗有关的不良副作用。
现通过以下实施例来说明本发明，这些实施例仅用于说明目的，不意味着限制本发明的范围或发明思想。
实施例
实施例1
a)获得和制备间充质细胞：
将得自髂嵴或肋骨的骨髓细胞良好地分散在Iscove′s ModifiedDulbecco Medium(IMDM)中以获得单细胞悬浮液，并通过每次用2-3000 RPM(500-1000Xg)离心5分钟收集细胞来以相同的培养基将细胞至少洗涤三次。将经过洗涤的骨髓细胞(至少108细胞)在IMDM和20％胎牛或人血清中在细胞培养条件下保持7天。由此在几天后获得在典型的标准组织培养级塑料器皿(T-25烧瓶，Becton Dickinson，USA)上的粘附细胞层，将它们用纯IMDM洗涤，并在相同的培养基中在几次标准细胞培养传代中进一步扩展。通常，在三次传代之后，丧失内在的造血作用，即丧失在甲基纤维素测定中其产生造血集落的能力。由108骨髓细胞开始在3-6次传代之后至少获得107间充质细胞。以这种方式获得的间充质细胞适于通过以下描述的方法产生ABME。
b)制备适用于ABME的SPC.
将在以上步骤(a)中获得的洗涤的骨髓细胞小心地在Ficoll-Hypaque梯度上分层(密度1.007，Sigma Chemical Company，St.Louis，USA)，并以1500 RPM(1000Xg)在Kubota离心机(KubotaCorporation′Bunkyo-ku，东京，113-0033，日本)的水平转子中离心15分钟。从交界层收集单核细胞(MNC)，并通过连续的1000Xg离心和重悬浮用IMDM洗涤3次。随后将MNC以合适的密度(105-107 MNC/ml]悬浮在补加有20％人或胎牛血清的IMDM中。这里制备的MNC本身就可用于ABME。所述SPC很可能在体内在类似于这里分离的MNC的环境中被发现。
出于说明目的，用MNC以及高度富集的表达CD34+抗原的SPC测试所述方式以模拟以上两种情况。尽管可以使用任何其它适合的方法，但当需要时，可按照制造商的说明，通过采用CD34+细胞分离试剂盒(Dynal，Smestad，N-0309，Oslo，Norway)从MNC组分中常规地回收CD34+细胞。CD34+细胞也可在用合适的方法使它们从骨髓动员后通过白细胞分离法收集或从脐带血收集。在被提供至ABME之前或之后由它们的CD34-(CD34阴性)前体形成的CD34+细胞也可产生期望的结果。以此方式制备的SPC也依然适于用合适的造血调节剂启动。c)间充质细胞刺激来自固定数量的SPC的造血作用：
进行了几个实验以确定间充质细胞对SPC细胞命运施加直接影响。在一组实验中，间充质细胞被分别培养，使近50,000个细胞暴露于典型HCFA培养基，该培养基包含在IMDM中的0.8％甲基纤维素和20-30％血清以及过量的多种纯化的和人特异性的细胞因子和造血集落刺激生长因子(得自Stem cell Technologies，Toronto，Canada)。更具体地，通常用在HCFA中的造血生长因子的量为每毫升2国际单位(2 I.U.ml-1)的促红细胞生成素(EPO)、每毫升50纳克(50ng.ml-1)的干细胞因子(SCF)以及各每毫升20纳克(20ng/ml-1)的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-3(IL-3)和白介素-6(IL-6){所有的生长因子和细胞因子均得自Stem cell Technologies，温哥华，加拿大}。尽管提供了过量的所有需要的生长因子，但发现通过本文所述方法制备的间充质细胞在集落形成测定培养基中自身不能形成造血集落。
在另一组实验中，将50,000同样的间充质细胞首先与近100,000MNC混合，在37℃保持至少30分钟并进行集落形成测定。在几个实验中，与仅使用MNC细胞的参照相比，当这两种细胞类型混合时观察到造血集落数量和细胞性的一致改善。增加的范围为1.5至10倍。因此，仅使用间充质细胞获得的集落形成的改善在样品间是高度变化和不可预知的。仅当MNC和间充质细胞一起处理时才以增加的数量和细胞性形成造血集落的事实证明间充质细胞产生了新的环境，其中存在于MNC中的SPC更加多产。这种增加导致预先存在但静止的SPC活化，由于自我更新而形成新的SPC，以及两种因素的组合。
d)使造血调节剂接触间充质细胞产生更好的结果：
造血调节剂的实际使用需要对它们的剂量和所采用的接触时间进行优化，因为不同批次的间充质细胞可能对相同造血调节剂有不同的应答。根据很多实验，发明人确定通常方便的起始点为：使用1-25纳克/ml(就它们的活性成分而言)的生物造血调节剂，10纳摩尔/升至500微摩尔/升溶液的化学造血调节剂以及10-50皮摩尔/升溶液的免疫造血调节剂。
为了产生ABME，用接触培养基覆盖间充质细胞一段合适的时间(8-24小时)并去除该间充质细胞，所述接触培养基包含在具有20％人血清或胎牛血清的IMDM中含有的造血调节剂。然后将接触过的细胞用不含造血调节剂的接触培养基(IMDM+20％FCS)洗涤两次，就此使用，或在收集该间充质细胞后使用，其现在可代表体外ABME的组合物。任选地，ABME细胞可被配置在支持物上，这些支持物将它们在二维或三维上进行分配以得到更好结果。取必需数量的MNC/SPC和ABME的细胞，并将它们保持在一起一段合适的持续时间(0.5-6小时)，之后将它们进行处理以用于体外造血集落形成测定或造血作用。
因此，本发明人进行了4组实验：(a)其中使单核细胞暴露于未经任何处理的间充质细胞；(b)其中使MNC暴露于与生物试剂[TGFβ1]接触的间充质细胞；(c)使MNC暴露于与化学试剂1[12-o-十四酰基佛波，13乙酸酯/(-)Indolactam V，在此给出试剂名称]接触的间充质细胞以及(d)使MNC暴露于用免疫试剂[活化的抗整合素β3抗体]处理的间充质细胞。结果显示在图1中(如下)：
(A)在这种情况下，几乎没有形成低细胞性的血细胞集落；
(B)形成了血细胞集落，与(A)相比其具有更多的数量和更高的细胞性；
(C)观察到大的细胞集落，令人惊讶的是比(A)大至少4倍并且比(B)大；
(D)形成了密集的细胞集落，令人惊讶的是其大于(A)或(B)。
实施例2
生物造血调节剂的作用
制备方法包括：使MNC(＞107细胞)保存在1毫升培养基中，所述培养基包含IMDM、20％血清和适合的调节剂(例如促红细胞生成素和GM-CSF)，所述造血调节剂必需为合适量(例如：促红细胞生成素2I.U.ml-1；GM-CSF 20-50ng.ml-1)以使得在37℃和细胞培养条件下从细胞中释放造血调节剂-CM。在合适的时长(8-96小时)之后，通过在冷冻Kubota离心机中离心去除该细胞(5000Xg，15分钟)，将作为上清液获得的生物造血调节剂-CM就此使用，或在进一步处理以浓缩存在的活性成分后使用。对CM的处理通常在-4℃的冷冻环境中进行并利用亲和层析原理。简而言之，取固定在基质(例如肝素琼脂糖)上的合适的亲和配体，在低盐缓冲液使所述造血调节剂-CM吸附于其上，利用加样缓冲液洗去未被吸附的组分，首先通过高盐(例如1.5摩尔NaCl)缓冲液选择性洗脱造血调节剂-CM的活性成分，然后将其浓缩并用储存缓冲液平衡，保存在-70℃用于将来使用。其它的两种生物造血调节剂，即，生物试剂-1和生物试剂-2被分别鉴定为TGFβ1和FGF-2。
在合适的条件下，生物造血调节剂-CM，TGFβ1和FGF-2产生等效的ABME；然而，在各种情况下形成的ABME的性质不同。通常，生物造血调节剂-CM，TGFβ1和FGF-2以在IMDM和20％人或胎牛血清中1-25纳克.ml-1的浓度范围用来在细胞培养条件下接触间充质细胞8-24小时，以产生ABME。如图2所示，只有当使用造血调节剂(图2C，2D和2E)时，在培养物中较强的ABME相关特性才变得明显，但是当不使用间充质细胞时(图2A)或使用了间充质细胞但没有生物造血调节剂时(图2B)，在培养物中较强的ABME相关特性变得不明显。这些图显示了在每种情况中形成的血细胞的密度，其与集落的细胞性相关。只有当间充质细胞与造血调节剂接触时才形成最好的集落。
实施例3：生物造血调节剂对集落形成的作用
本发明人通过实验确定：当分别使用TGFβ1和FGF-2时，通过使用它们获得的ABME在由间充质细胞产生ABME方面近乎等效，每种这类ABME可与亲本的间充质细胞自由混合而没有显著的弱化。
采用间充质细胞进行了一组与定量的谱系特异性集落形成测定有关的实验：(A)不与任何生物试剂接触[图3A对照]或在与TGFβ1[图3A生物试剂1]或FGF-2[图3A生物试剂2]接触后。显然，沿包括粒细胞-红细胞-单核细胞和巨噬细胞(GEMM)、红系爆式集落形成单位(BFU-E)和粒细胞-巨噬细胞(GM)在内的几种特定谱系的集落形成被两种ABME均一刺激，并且TGFβ1和FGF-2在产生各自的维持这种作用的ABME方面近乎等效。特别地，对GEMM集落形成的刺激表明ABME能够刺激多能祖细胞以形成更多的相当于自我更新的新的多能细胞。
在图3B中，申请人证实在单独测试时通过使用TGFβ1或FGF-2产生的ABME均与未处理的间充质细胞相容。因此，这两种ABME中的每一种均适于与未处理的间充质细胞混合。相反，当这两种ABME以等比例混合时，与单独的ABME相比，该组合为较弱的ABME。这显然证实它们在性质上是相互拮抗的并且不相同。
实施例4：化学造血调节剂对集落形成的作用
本发明人已测试了几种造血调节剂，它们调节细胞内信号产生和/或维持，例如多种蛋白激酶的功能，尤其是如下激酶的功能：cGMP依赖性激酶、脂质依赖性激酶(例如：PKC)、磷脂酰肌醇磷酸依赖性激酶和家族PI3K，PDK，Akt，pBad，mTOR)，细胞粘附依赖性激酶(FAK，ILK)，受体酪氨酸激酶(例如：FGFR，VEGFR，IGF-IR，IGF-2R)，受体丝氨酸/苏氨酸激酶(例如：TGFβ1受体)以及细胞内Ser/Thr激酶(例如：MAPK激酶和p38 MAPK激酶)，Ca++离子依赖性激酶(Ca++-CaM依赖的激酶)，这表明任何能够引起这类功能的新分子都暗示为可能的造血调节剂。
为了产生ABME，使间充质细胞用含有20％人或胎牛血清并且还存在有适量造血调节剂的IMDM接触合适的时长(5分钟至24小时)。制备有效的造血调节剂溶液和接触间充质细胞的时长需要小心优化，由于更高的造血调节剂浓度或更长的接触时间都不能保证更好的结果；造血调节剂的有用范围是1纳摩尔至100微摩尔，接触时间为5分钟至24小时。
在另一方面，本发明人确定，一些生物试剂和化学试剂的组合可协同作用并比它们中的任一种单独使用时导致更好的ABME生成。
在另一方面，本发明人确定，合适的化学造血调节剂可用于抑制血细胞形成。这些在本发明中描述为“负造血调节剂”，以表明它们促进SPC静止。如果这种造血调节剂占优势，则可弱化另一种造血调节剂的刺激作用。
图4A显示使用不同的造血调节剂产生能够刺激血细胞在多种谱系中的差异形成的ABME。图4B和4C显示化学造血调节剂对集落形成的作用。图4D显示生物和化学造血调节剂的组合的作用，该作用能够显示在形成ABME方面的协同性。图4E显示负造血调节剂剂量依赖地弱化ABME。
实施例5：免疫造血调节剂
本发明人已经确定，能够通过整合素受体活化间充质细胞上的粘附相互作用的抗体试剂或其功能同源物起造血调节剂作用。此外，这类免疫造血调节剂可以与生物造血调节剂和/或化学造血调节剂协同作用，以便在体外产生更好的ABME。这类免疫造血调节剂可在包含含有20％人或胎牛血清的IMDM的培养基中以10-100微克.ml-1的范围使用。使间充质细胞与这种培养基在培养条件下接触合适的时长(1-24小时)，由此间充质细胞形成ABME。在另一方面，可以将免疫造血调节剂的使用与化学和/或生物造血调节剂的使用相结合，以获得更好的结果。
如图5所示，当使用间充质细胞时，形成仅少量的血细胞集落(对照：黑条)。相反，当使用50微克每毫升的悬浮在含有20％人或胎牛血清的IMDM中的免疫造血调节剂溶液接触间充质细胞1小时时，该间充质细胞形成高度有效的ABME，导致体外集落和血细胞形成的增强。
实施例6：通过在使SPC接触ABME之前启动SPC来进一步改善结果。
SPC或在其中具有SPC的MNC群也可用特异的化学试剂来分别启动，以便在与ABME接触后它们能形成更多更好的血细胞集落。与没有启动的细胞相比，对SPC的启动本身可形成更好和更多的集落，但是当启动的SPC与ABME混合时获得最好的结果。本发明人已鉴定出至少十种能够启动SPC并导致改善的集落/血细胞形成的不同的化学物质，表明这种方法也可用于鉴定新的启动试剂(潜伏相关肽、3-氨基苯甲酰胺、IGF-I&II、含甘露糖6p的糖偶联物)。这种启动试剂能够活化与整合素介导的粘附、IGF-I受体、甘露糖6-磷酸酯/IGF-II受体、cGMP依赖性功能有关的信号，或抑制SPC上的聚(ADP-核糖磷酸)聚合酶功能，这表明与这些启动试剂功能上类似的任何新分子都可被认为是启动试剂。由于这些启动试剂显著调节造血作用，它们也被接受为造血调节剂。
实施例7：调节归巢：
实验A：
将5×105间充质细胞生长在35mm直径的Petri培养皿(BectonDickinson，USA)上的含有20％血清的IMDM中。在该细胞汇合后，去除该培养基，用磷酸盐缓冲盐水(GIBCO-BRL)(PBS)洗涤该细胞两次，将培养基换成含有10ngml-1TGFβ1的处理培养基，并将该培养皿返回到37℃下5％CO2中的标准细胞培养环境中。4小时后，去除处理培养基，用PBS洗涤细胞两次，用含有0.5％血清的1ml IMDM覆盖并在37℃下5％CO2中继续孵育。18小时之后，收集条件培养基并测定其在体外支持CD34+SPC归巢的能力。在另一平行实验中，使用等量的间充质细胞，其中不使用TGF-β1，从这个实验中获得的条件培养基用作比较的参照。结果显示在图6(a-c)中。观察到在用TGFβ1处理间充质细胞之后(由此形成活性ABME)，显著更大量的SDF-1α被释放，其能够在ABME附近建立趋化梯度，吸引SPC向其靠近，由此促进它们的归巢。如图6(a-b)所示，与经TGFβ1处理的间充质细胞相比，未经处理的间充质细胞不显示或显示少量的归巢。在这种情况下，可通过添加适量的针对SDF-1α或其受体CXCR-4的中和抗体以中和其对SPC的化学吸引的作用，或通过外源添加SDF-1α来破坏该梯度，从而调节归巢，这表明了本方法的特异性。
实验B
使间充质细胞在无菌的1cm×1cm的玻璃盖玻片上生长至接近汇合，用含有10ngml-1 TGF-β1的处理培养基将其覆盖，并在潮湿的无菌气氛和5％CO2中孵育18小时。然后用PBS洗涤该盖玻片，将由此产生的ABME用0.2ml含有20％血清的IMDM中的2×106 MNC或2×105 CD34+细胞覆盖。在37℃下1小时后，用PBS洗涤该盖玻片，固定细胞并用CD34+特异性抗体(克隆HPCA1，Becton Dickinson，USA)染色。结果显示在图6(d-f)中。对所附着的CD34+细胞计数并与在不使用TGF-β1的平行参照实验中所附着的类似细胞的数量进行比较。与参照盖玻片相比，发现在间充质细胞上由TGFβ1形成的ABME具有显著更大数量的附着的CD34+细胞，这表明使这些细胞归巢至ABME优于单独的间充质细胞。从图6(d-f)可见，当用TGF-β1处理间充质细胞时，CD34+细胞对间充质细胞的粘附增加。
实施例8：调节移植
移植实验用于确定在图6d中观察到的CD34+细胞对ABME的粘附是否是功能上相关的，以及，如果是这样的话，ABME是采用何种机制来促进这种移植。
将间充质细胞(24孔板中5×104细胞/孔)在加有20％胎牛血清的IMDM中生长直到它们接近汇合。去除培养基并用PBS洗涤两次。采用选择性活化间充质细胞中αiib∶β3整合素信号传导的化学造血调节剂[生物素-Ser-Gly-Ser-Gly-Cys*-Asn-Pro-Arg-Gly-Asp  (Tyr-OMe)Arg-Cys*Lys(在C*-C*之间环化)，10微克ml-1，18小时]来制备ABME。所形成的ABME用PBS洗涤两次，在存在或不存在另一种抑制αiib∶β3整合素相互作用的肽[1-金刚烷乙酰基-Cys*Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-C(在Cys*-Cys*之间环化)]的情况下，用0.2ml的CD34+SPC细胞(105ml-1)悬液覆盖1小时。孵育结束后，将细胞用PBS洗涤两次，并进行造血集落形成测定(HCFA)。对于造血集落形成，从多孔培养皿中收集ABME细胞连同附着的SPC，并将它们重悬浮在1ml的IMDM中，该IMDM含有20％血清、0.8％甲基纤维素和过量的多种纯化的和人特异性的细胞因子和造血集落刺激生长因子(得自Stem cell Technologies，温哥华，安大略省，加拿大)。更具体地，在IICFA中通常使用的造血生长因子的量为每毫升2国际单位(2 I.U.ml-1)的促红细胞生成素(EPO)，每毫升50纳克(50ng.ml-1)的干细胞因子(SCF)和各每毫升20纳克(20ng.ml-1)的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，白介素1β(IL-1β)，白介素-3(IL-3)和白介素-6(IL-6)。将细胞孵育12-14天，直至造血集落变大。结果显示在图7中。可观察到通过肽化学调节剂形成的ABME能够形成明显更多数量的造血集落，其中当这种造血调节剂功能被抑制性肽抑制时，集落数量以抑制剂剂量依赖性方式减少。这些结果清楚表明，由SPC至ABME通过αiib∶β3整合素相互作用建立的接触是功能上相关的，并且当损害时不利于ABME的功能。
因此，这些结果清楚地显示通过造血调节剂促进SPC对BME的粘附是功能上相关的，并且其等同于体外SPC移植，另外，这种移植可在体外被调节。
实施例9：调节谱系定型
造血作用过程中SPC的谱系定型可影响所形成的成熟血细胞的组成。谱系定型实验旨在显示有可能通过恰当使用ABME来改变在两谱系中成熟的血细胞形成的组成。
使间充质细胞(24孔培养皿中5×104细胞/孔)在加有20％胎牛血清的IMDM中生长，直至它们接近汇合。去除培养基并用PBS洗涤两次。通过分别使用两种生物造血调节剂(TGFβ1 10ngml-1，bFGF10ngml-1，18小时)制备两种不同的ABME。用PBS洗涤形成的ABME两次并用0.2ml的CD34+SPC细胞悬浮液(105ml-1)在37℃下覆盖1小时。然后，在洗涤后收集该培养皿中的所有细胞并用于HCFA。在14天后，收集形成的成熟血细胞，在显微镜下检查等份的悬浮液以鉴别和计数成熟的淋巴和骨髓细胞。结果显示在图8a中。观察到当使用通过bFGF制备的ABME时，产生更多的淋巴细胞，而当TGFβ1用于制备ABME时，其支持更多的骨髓细胞形成。这些结果使人信服地证实，使用通过选择特定的造血调节剂而制备的ABME可用于调节谱系定型并改变在所形成的成熟血细胞中骨髓细胞和淋巴细胞的组成或比例。
本实验旨在显示所形成的成熟血细胞的组成可相对于红细胞和骨髓细胞变化。使间充质细胞(24孔培养皿中5×104细胞/孔)在加有20％胎牛血清的IMDM中生长，直至它们接近汇合。去除培养基并用PBS洗涤两次。将在一个孔中的细胞用钙离子螯合剂BAPTA的二溴衍生物(DiBromo derivative)(5微摩尔)处理1个小时，而另一孔仅接受没有BAPTA衍生物的培养基。在37℃孵育1小时后，向两孔加入TGFβ1(10ng ml-1)，再继续孵育18小时。洗涤在两孔中形成的ABME并用于采用CD34+SPC的HCFA。14天后，收集成熟的血细胞并定量红细胞和骨髓细胞谱系。结果显示在图8b中。结果显示当二溴BAPTA衍生物被用来形成ABME时，与不使用二溴BAPTA的对照实验相比在骨髓细胞和红细胞群的比例方面有显著差异。
实施例10：调节细胞存活
本实验旨在确定ABME是否具有促进细胞存活的性质。当间充质细胞被用于研究是否存在诸如磷酸(丝氨酸473)Akt/PKB、磷-Bad的促存活(pro-survival)分子时，发现这些实体以非常小量存在于细胞中。但是，当间充质细胞被用于制备ABME时，发现ABME细胞中诸如磷酸(丝氨酸473)Akt/PKB和磷-Bad的促存活因子，活化的一氧化氮合成酶显著上调。这些结果表明ABME中的促存活因子被活化，因而在它们与ABME接触时其可被转移至SPC。在另一组实验中，通过使用3氨基苯甲酰胺抑制聚(ADP-核糖)聚合酶，在SPC中上调了促存活信号。这些结果显示在图9(a-d)中。这些结果表明，在这种处理之后，SPC能够协同地增加所形成的造血集落的数量，表明可在体外调节SPC-细胞存活。
实施例11：调节自我更新
实验A
本实验旨在研究存在于MNC中的静止的原始祖细胞当与ABME接触时是否能被刺激，由此形成由混合谱系(GEMM)构成的更多集落。
使间克质细胞在加有20％胎牛血清的IMDM生长，直至它们接近汇合。去除培养基，并用PBS洗涤两次。通过使用生物造血调节剂，即TGFβ1(20ng m-1)来制备ABME。将所形成的ABME用PBS洗涤两次，用非酶溶液(Sigma)解离该细胞。将固定数量的MNC(即2×105)与各种剂量的解离的间充质细胞(2×104，5×104和1×105)混合并孵育1小时。孵育结束后，将细胞进行造血集落形成测定(HCFA)。当ABME的细胞而不是对照的间充质细胞用在实验中时，观察到GEMM集落形成的清楚的剂量依赖性增加(图10a)。此外，来自ABME的最低浓度的细胞(2×104)在刺激GEMM形成方面比最高浓度的间充质细胞(1×105)更有效，显示效率增加了近10倍。
实验B
本实验旨在研究ABME是否在SPC自我更新方面提供益处。
使间充质细胞在无菌的1cm×X1cm玻璃盖玻片上生长至接近汇合，用含有10 ngml-1 TGF-β1的处理培养基覆盖并在潮湿的无菌气氛和5％CO2中孵育18小时。随后用PBS洗涤该盖玻片，用2×105 CD34+细胞在0.2ml含有20％血清的IMDM中的悬浮液覆盖由此产生的ABME。在1小时后洗涤细胞，将结合的细胞用含有20％血清和0.8％甲基纤维素和生长因子的培养基覆盖。48小时后使用CD34+特异性抗体(克隆HPCA1，Becton Dickinson，USA)监测CD34+细胞数量的变化。结果显示在图10b中。与另一不使用TGFβ1的实验相比，发现ABME支持更多的CD34+细胞增殖。此外，确定与间充质细胞相比，ABME含有显然更大量的自我更新促进剂Jagged 1(图10c)。
实施例12：在常氧条件下诱导低氧：
这些实验旨在研究在常氧条件下使用特异的造血调节剂产生低氧的可能性。
实验A
根据在上述实验#1中的详细描述，采用生物调节剂即TGFβ1处理间充质细胞以用于形成ABME。在指定的时间后使该细胞固定并用针对HIF 1α的抗体免疫染色，其中HIF 1α为与低氧相关的特异转录因子。与对照细胞相比，在经TGF1处理的间充质细胞中发现清楚的HIF 1α的核表达(图11a)。
实验B
根据在上述实施例7(a)中的详细描述，采用生物调节剂即TGFβ1处理间充质细胞以用于形成ABME，并将该间充质细胞与200μMHypoxy探针(Chemicon，USA)一起孵育48小时。固定该细胞，用特异于检测标记(Chemicon)的抗体免疫染色。结果显示在图11b中。观察到通过使用TGFβ1产生的ABME显示出高度结合标记物，这表明存在低氧条件。
实施例13：评估间充质细胞在造血功能中的适用性。
按实施例8中描述的方式，可进行多种间充质细胞的筛选，以评估它们在ABME形成中的潜在应用。结果显示在图12中，其中比较了当与从两独立的骨髓样品中培养的间充质细胞群接触时造血调节剂的有效性。因而，采用相同批次的SPC并保持一种已知的造血调节剂作为参照点，可评估任何给定的间充质细胞样品的“ABME形成能力”。
实施例14：筛选造血调节剂
除了采用具有多种潜在的造血调节剂补充物的处理培养基之外，可按实施例8中描述的方式采用间充质细胞筛选新的造血调节剂。结果显示在图13中，其中描述了刺激性和抑制性造血调节剂在ABME形成方面的差别作用。如果加入已知的造血调节剂作为参照点，并且如果使用相同批次的SPC，则可评估测试物质相对于参照造血调节剂的诱导ABME的能力，并且可被标记为正/负；有效/低效/无效造血调节剂等。
本发明中所用的材料：
本发明中使用的所有材料都可商业购得。诸如骨髓细胞、SPC、间充质细胞、培养基、生长和分化因子、白介素、血清、抗体的生物材料均得自生物技术公司，如Cambrex Bioscience(Cambrex生物科学)，USA；American Type Culture Collections(美国典型培养物收藏所)，USA；GIBCO-BRL，USA；Sigma Chemical Company(Sigma化学公司)，USA；Santacruz Biotechnology(Santacruz生物技术)，USA；Neomarker，USA；Becton Dickinson，USA；Stem Cell Technologies(干细胞技术)，温哥华，加拿大；Bachem，瑞士；Alexis Corporation，瑞士；PromegaCorporation，USA；Peprotech，U.K.等。细胞分离成品来自Dynal，挪威；甲基纤维素来自Sigma Chemical Company，USA；细胞培养相关塑料器皿来自Becton Dickinson，USA；Corning，Costar，USA；细胞培养相关设备如二氧化碳孵育箱来自Forma，USA；光学设备如各种类型的显微镜来自Zeiss，德国；Olympus Corporation(奥林巴斯公司)，日本和Nikon(尼康)，日本。
本发明的优点和工业应用：
本发明的组合物可用于产生ABME，其可用于：
a)调节天然或人工造血作用的不同步骤，
b)评估健康和患病骨髓细胞中的骨髓功能，
c)在不影响体内内源性细胞因子和生长/分化因子的水平情况下快速增强天然造血作用，
d)通过刺激自体的造血作用，最小化或消除在SPC移植中观察到的移植物对宿主疾病，
e)通过引入合适的遗传或分子实体在设计新功能方面体外使用移植的SPC，
f)在体外选择性破坏可移植和不可移植的SPC，
g)在体外促进一个或多个谱系中的血细胞的强健生长，
h)通过现有技术中公知的方法从骨髓清除白血病祖细胞，
i)在常氧条件下促进细胞的低氧状态，
j)在正常和病理SPC中诱导静止，
k)发现调节造血作用中一个或多个步骤的新药物，
l)发现能分化SPC至非造血细胞命运的新药物或反之亦然，
m)通过细胞介导的或抗体介导的免疫反应指导新形成的免疫细胞破坏选定的生物靶标，
n)指导新形成的免疫细胞不伤害自身的正常靶细胞，以防止自身免疫疾病的不良作用，
o)通过诱导耐受指导新形成的免疫细胞接受同种异体的组织移植物。
已经充分地描述了本发明，但本领域技术人员应理解的是在不脱离本发明的精神和范围的前提下，无需过量的实验就可在大范围的等同参数、浓度和条件下实施本发明。

Claims (9)

1.组合物，其用于形成用于调节SPC功能和骨髓过程的数个步骤的人工骨髓样环境，包含：
a]间充质细胞的培养物；
b]能够活化a]的细胞中的细胞内信号传导途径的一种造血调节剂或多种造血调节剂；其中所述造血调节剂选自如下中的任一种：生物试剂、化学试剂、免疫试剂及上述试剂的一种或多种的组合；
c]培养基，其选自Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、Dulbecco改良的eagle培养基(DMEM)、α-最低基础培养基(α-MEM)、RPMI-1640，所述培养基补加有：i)适合的血清或适合的血清替代物；ii)并任选地还补加有在a]的细胞中促进低氧状态造血调节剂、甲基纤维素、促红细胞生成素、干细胞因子(SCF)、造血生长和分化因子、白介素1β、白介素3和白介素6；和
d]用于a]的细胞的支持物，所述支持物包含细胞外基质成分或能够在二维或三维上形成基质的它们的模拟物，
其中所述单个或多个造血调节剂选自如下表1中所述的造血调节剂并以表1中所列的浓度使用：
表1
Figure FSB00001117310700011
Figure FSB00001117310700021
Figure FSB00001117310700031
Figure FSB00001117310700041
Figure FSB00001117310700051
并且，
其中所述造血调节剂的浓度为表1中所述的浓度；选自人血清、胎牛血清或源于哺乳动物源的血清的任何血清以20％-30％体积/体积的范围使用、或使用适合的血清替代物；促红细胞生成素以2IU/ml的范围使用；纯化的生长和分化因子，即，干细胞因子(SCF)以50纳克/ml的浓度使用，以及各20纳克/ml使用的GM-CSF、G-CSF、IL-1β、IL-3和IL-6，甲基纤维素以0.8％wt/wt使用，以及使用IMDM培养基。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述间充质细胞是从包含一种或多种来源的哺乳动物中获得，即得自脐带血、胎盘、骨髓。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述哺乳动物为人。
4.如权利要求1、2或3所述的组合物，其中所述间充质细胞得自髂嵴、肋骨、股骨的骨髓或任何其它骨样品。
5.用于产生人工骨髓样环境的方法，包括如下步骤：
a使用权利要求1c]中所述的培养基，将权利要求1a]、权利要求2、3和4所述的间充质细胞维持在所述培养基中，
b使权利要求5的步骤a中维持的所述间充质细胞与权利要求1b]所述的一种造血调节剂或多种造血调节剂接触至少30分钟，由此在所述间充质细胞中促进内皮细胞特性和/或诱导低氧状态并且所述间充质细胞被活化以形成人工骨髓样环境，
c任选地，洗涤权利要求5的步骤b中获得的所述人工骨髓样环境细胞以除去所述造血调节剂，
d使权利要求5的步骤(b和/或c)中产生的人工骨髓样环境的细胞与SPC就此接触，或任选地在用权利要求1的B(o)节所列的启动造血调节剂处理它们之后再与SPC接触，以便活化SPC-功能和人工骨髓样环境的骨髓过程，所述人工骨髓样环境具有与SPC归巢、SPC移植、自我更新相关的特性，并产生更大量的能够在体外和体内强健地刺激血细胞形成的SPC，和
e任选地，通过反复使用权利要求5的步骤d，将在权利要求5的步骤d后获得的所述SPC处理一个或多个周期，以逐渐地扩增SPC群和其定型的祖细胞以实现更大的收益。
6.权利要求5的方法，用于使用权利要求1a]、权利要求2、3和4所述的间充质细胞来鉴定用作新的、产生人工骨髓样环境的造血调节剂的生物实体、化学实体或免疫实体。
7.权利要求5的方法，用于比较来源于多种组织样品的间充质细胞的作为前体细胞形成人工骨髓样环境的相对效力。
8.权利要求5的方法，用于使用权利要求1的B(n)节的合适的造血调节剂在常氧条件下在间充质细胞中诱导并维持低氧状态。
9.用于从间充质细胞产生人工骨髓样环境、调节SPC功能和骨髓过程、在间充质细胞中诱导低氧状态、包括刺激血细胞形成的试剂盒或多个试剂盒，包括：
a.一种或多种造血调节剂，其为权利要求1b]所述的生物调节剂、化学调节剂或免疫调节剂，或它们的合适的组合；
b.造血调节剂的稀释剂；
c.用于培养间充质细胞的权利要求1c]的所述培养基；
d.用于去除用过的造血调节剂的洗涤溶液；
e.用于收集所述人工骨髓样环境的细胞或/和活化的SPC以进一步应用的溶液；
f.启动干细胞和祖细胞的权利要求1的B(o)节所述的造血调节剂溶液；
g.在使用被启动的SPC之前用于除去所用过的启动-造血调节剂的洗涤溶液；
h.用于体外血细胞形成的培养基，包括人工骨髓样环境的支持板或支架；人工骨髓样环境的细胞；前造血生长、分化和存活因子，即权利要求3所述的人SCF、促红细胞生成素、白介素1β、白介素3和白介素6或它们的功能模拟物；生长培养基和任选的甲基纤维素；血清；和
i.使用说明书。
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