CN110699318A - T细胞培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于培养T细胞的添加剂，其包括白介素‑2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子‑α和趋化因子配体5以及任选的特异性培养成分。另外，本发明还提供了包含该添加剂的T细胞培养基及培养T细胞的方法，可以提高T细胞的增殖率，同时可以提高具有增殖活性T细胞以及免疫功能活化T细胞的比例并减少T细胞发生细胞凋亡的状况。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体而言，本发明涉及一种T细胞培养基及培养方法，其能提高T细胞的增殖率，同时可以提高具有增殖活性的T细胞以及免疫功能活化的T细胞的比例并减少T细胞发生细胞凋亡的状况，并且其只需稍加改变即可灵活地应对不同T细胞的培养。
背景技术
T细胞为淋巴细胞的一种，其来自于人体骨髓的造血干细胞（Hematopoietic stemcells, HSC），T细胞由胸腺迁移到胸腺内而分化成熟，T细胞在胸腺内分化成熟后进一步移居到淋巴组织中。T细胞还可进一步分为毒杀型T细胞（Cytotoxic T cell）及辅助型T细胞（Helper T cell）、调节型T细胞（Regulatory T cell）以及记忆型T细胞（Memory T cell），各类T细胞皆在人体免疫反应中扮演重要角色。因此，近年来T细胞常被用于进行有关于免疫系统的实验研究或是相关范畴的应用，然而，当要以T细胞进行实验研究或是将T细胞应用于其他范畴时，都需要增殖出足够的T细胞。
中国专利申请CN102168067A公开了一种调节性T细胞的诱导培养方法，其中主要使用了细胞因子和地西他滨来联合诱导；中国专利申请CN105154402A公开了一种培养基及其应用，其中包括转铁蛋白、孕酮、干细胞生长因子、IL-2、IL-4等，主要用于CAR-T细胞的培养；中国专利申请CN104278012A公开了一种成人调节性T细胞体外扩增培养基及其使用方法，其中包括转化生长因子-β、骨形态发生蛋白-4、IL-2、IL-4等；中国专利申请CN105969729A公开了一种T细胞培养基及其制备方法，其在RPMI-1640培养基的基础上进一步添加了IL-2、内皮细胞生长因子、转铁蛋白等。
然而，令人意外的是，本发明人研究获得了新的T细胞培养基及其中的添加剂，没有为现有技术所公开和教导。尤其是该T细胞培养基中的添加剂能方便、灵活地与现有的含谷氨酰胺的无血清培养基混合配制成优化的T细胞培养基，分别针对不同T细胞的培养，用于提高T细胞的增殖率，提高具有增殖活性的T细胞以及免疫功能活化的T细胞的比例并减少T细胞发生细胞凋亡的状况。
发明内容
发明简述
本发明要解决的技术问题在于提供一种新的T细胞培养基及其中的添加剂，用于体外培养T细胞。该T细胞培养基中的添加剂能方便、灵活地与现有的含谷氨酰胺的无血清培养基混合配制成优化的T细胞培养基，分别针对不同T细胞的培养，用于提高T细胞的增殖率，提高具有增殖活性的T细胞以及免疫功能活化的T细胞的比例并减少T细胞发生细胞凋亡的状况。
具体而言，在第一方面，本发明提供了用于培养T细胞的添加剂，其包括白介素-2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-α和趋化因子配体5以及任选的特异性培养成分，其中特异性培养成分选自抗-CD3抗体、唑来膦酸和半乳糖苷基神经酰胺中的一种。。
优选本发明第一方面的添加剂由白介素-2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-α和趋化因子配体5以及任选的特异性培养成分组成，其中特异性培养成分选自抗-CD3抗体、唑来膦酸和半乳糖苷基神经酰胺中的一种。
也优选在本发明第一方面的添加剂中，所述T细胞是αβ T细胞、γδ T细胞或NK T细胞。
也优选在本发明第一方面的添加剂中，白介素-2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-α和趋化因子配体5以及任选的抗-CD3抗体、唑来膦酸和半乳糖苷基神经酰胺的比例为10-6000IU：1-300pg：1-3000pg：50-1500pg：10-100ng：1-20nmol：20-200ng。
更优选在本发明第一方面的添加剂中，白介素-2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-α和趋化因子配体5以及任选的抗-CD3抗体、唑来膦酸和半乳糖苷基神经酰胺的比例为100-4000IU：20-80pg：200-800pg：500-1200pg：20-80ng：3-10 nmol：50-150ng。
特别优选在本发明第一方面的添加剂中，白介素-2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-α和趋化因子配体5以及任选的抗-CD3抗体、唑来膦酸和半乳糖苷基神经酰胺的比例为200-3000IU：40pg：400pg：1000pg：50ng：5 nmol：100ng。
在第二方面，本发明提供了T细胞培养基，其由含谷氨酰胺的无血清培养基和本发明第一方面的添加剂组成。
优选在本发明第二方面的培养基中，所述T细胞是αβ T细胞、γδ T细胞或NK T细胞。
也优选在本发明第二方面的培养基中，所述含谷氨酰胺的无血清培养基是AIM-V、X-VIVO 15或Cellgro SCGM。
也优选在本发明第二方面的培养基中，白介素-2的浓度为10-6000IU/mL，优选为100-4000IU/mL，更优选为200-3000IU/mL。
在第三方面，本发明提供了体外培养T细胞的方法，其包括用本发明第二方面的培养基对样本培养出T细胞的步骤。
优选在本发明第三方面的方法中，本发明第二方面的培养基中的本发明第一方面的添加剂中的特异性培养成分和所述T细胞选自以下3组之一：
（1）抗-CD3抗体和αβ T细胞；
（2）唑来膦酸和γδ T细胞；以及
（3）半乳糖苷基神经酰胺和NK T细胞。
也优选在本发明第三方面的方法中，所述样本含单核细胞，优选含外周血液单核细胞。
发明详述
本发明提供了新的用于培养T细胞的添加剂、含有该添加剂的T细胞培养基和使用该T细胞培养基培养T细胞的方法等。
本发明的用于培养T细胞的添加剂包括白介素-2（interleukin-2, 简称为IL2）、碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor, 简称为bFGF）、转化生长因子-α（Transforming growth factor-α, 简称为TGF-α）和趋化因子配体5（Chemokineligand 5, 简称为CCL5）以及任选的特异性培养成分。
在本文中，术语“任选”表示选择或者不选择，即本发明第一方面的添加剂可以包含特异性培养成分，也可以不包含特异性培养成分。当不需要特异性增殖特定种类的T细胞时，本发明第一方面的添加剂无需包含特异性培养成分，因而本发明第一方面的添加剂可以由白介素-2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-α和趋化因子配体5组成；当需要特异性增殖αβ T细胞时，本发明第一方面的添加剂中的特异性培养成分是抗-CD3抗体；当需要特异性增殖γδ T细胞时，本发明第一方面的添加剂中的特异性培养成分是唑来膦酸；或者，当需要特异性增殖NK T细胞时，本发明第一方面的添加剂中的特异性培养成分是半乳糖苷基神经酰胺。
抗-CD3抗体可以是抗-CD3的多克隆抗体，也可以是抗-CD3的单克隆抗体，优选是抗-CD3的单克隆抗体。
本发明第一方面的添加剂可以包含溶剂，如水。由于本发明第一方面的添加剂要添加在含谷氨酰胺的无血清培养基中使用，会被稀释，所以该添加剂中的溶质浓度要大于在T细胞培养是所使用的浓度。例如，白介素-2的使用浓度为100-4000IU/mL，则5×含该添加剂的溶液中的白介素-2的浓度为500-20000 IU/mL。优选本发明第一方面的添加剂的溶质由白介素-2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-α和趋化因子配体5以及任选的特异性培养成分组成。
本发明第一方面的添加剂中白介素-2的使用浓度为100-4000IU/mL，碱性成纤维细胞生长因子的为20-80pg/mL，转化生长因子-α的为200-800pg/mL，趋化因子配体5的为500-1200pg /mL，（如果选择，）抗-CD3抗体的为20-80ng/mL，（如果选择，）唑来膦酸的为3-10 nmol /mL，以及（如果选择，）半乳糖苷基神经酰胺的为50-150ng /mL。因此在本发明第一方面的添加剂中，各成分以相应的比例存在。
优选本发明第一方面的添加剂中各蛋白质成分的来源生物体与所培养的T细胞的来源生物体相同，例如，用于培养人T细胞的添加剂优选包含人白介素-2、人碱性成纤维细胞生长因子、人转化生长因子-α和人趋化因子配体5。
本发明的T细胞培养基由含谷氨酰胺的无血清培养基和本发明第一方面的添加剂组成。含谷氨酰胺的无血清培养基是本领域技术人员所知晓的，有许多已经可以通过商业渠道获得，例如，AIM-V、X-VIVO 15和Cellgro SCGM等。通常市售的无血清培养基是高浓度的无血清培养基，例如5×或10×无血清培养基，需要稀释使用。如果使用的是相应的不含谷氨酰胺的无血清培养基，则谷氨酰胺可以单独添加，或者可以包含在本发明第一方面的添加剂中添加。
在本文中，本发明第二方面的培养基中的无血清培养基指的是1×无血清培养基，即高浓度的无血清培养基需要稀释至1×无血清培养基。稀释通常用水稀释。稀释需要考虑本发明第一方面的添加剂中的溶剂量。最终稀释获得的本发明第二方面的培养基中的本发明第一方面的添加剂中的各成分的量也要达到其使用浓度，例如其中白介素-2的浓度为10-6000IU/mL。
本发明的体外培养T细胞的方法包括用本发明第二方面的培养基对样本培养出T细胞的步骤。当不需要特异性增殖特定种类的T细胞时，本发明第二方面的培养基无需包含特异性培养成分本发明第二方面的培养基；当需要特异性增殖αβ T细胞时，本发明第二方面的培养基需要包含抗-CD3抗体；当需要特异性增殖γδ T细胞时，本发明第二方面的培养基需要包含唑来膦酸；或者，当需要特异性增殖NK T细胞时，本发明第二方面的培养基需要包含半乳糖苷基神经酰胺。
在本文中，样本指的是包含有培养成为T细胞潜力的细胞的离体样品，如血液或血液分离物，通常其含有单核细胞，如外周血液单核细胞。分离方法包括但不限于，密度梯度离心和磁性细胞分离法（magnetic cell separation）。
培养可以在细胞培养皿或培养瓶中进行，也可以在适宜大规模培养的条件下培养，例如在生物反应器中进行培养。培养也可以在封闭系统（closed system）中进行，例如，以一次性生物反应器(single-use bioreactor, SUB)来培养T细胞。
本发明的有益效果包括，提高T细胞的增殖率，提高具有增殖活性的T细胞以及免疫功能活化的T细胞的比例并减少T细胞发生细胞凋亡的状况，配制方便且灵活，能分别针对不同T细胞的培养。
本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。
附图说明
图1为本发明实施例1的T细胞增殖培养实验的实验结果图；
图2为本发明实施例1的具有增殖活性T细胞比例分析中对照组样本的前方散射光(forward scatter, FSC)/侧方散射光(side scatter, SSC)散点图；
图3为本发明实施例1的具有增殖活性T细胞比例分析中实验组样本的FSC/SSC散点图；
图4为本发明实施例1的具有增殖活性T细胞比例分析中对照组样本的CD3+/Ki67+细胞表面标记散点图；
图5为本发明实施例1的具有增殖活性T细胞比例分析中实验组样本的CD3+/Ki67+细胞表面标记散点图；
图6为本发明实施例1的具有增殖活性T细胞比例分析的结果图；
图7为本发明实施例1的T细胞凋亡比例分析中实验组样本的Annexin V/PI标记散点图；
图8为本发明实施例1的T细胞凋亡比例分析中对照组样本的Annexin V/PI标记散点图；
图9为本发明实施例1的T细胞凋亡比例分析的结果图；
图10为实施例1的免疫功能活化T细胞比例分析中对照组样本的CD3+/CD69+细胞表面标记散点图；
图11为本发明实施例1的免疫功能活化T细胞比例分析中实验组样本的CD3+/CD69+细胞表面标记散点图；
图12为本发明实施例1的免疫功能活化T细胞比例分析的结果图；
图13为本发明实施例2的T细胞增殖培养实验的实验结果图；以及
图14为本发明实施例3的T细胞增殖培养实验的实验结果图。
具体实施方式
为充分了解本发明的目的、特征及功效，借由下述具体的实施例，并配合所附的图式，对本发明做详细说明。
实施例1 αβ T细胞的增殖培养及分析
（1）实施例1的T细胞培养基的制备：
在本实施例1中，是以液体无血清培养基AIM-V (可购自Thermo, Co.)（内含有左旋谷氨酰胺（L-Glutamine））作为T细胞培养基的基底，并分别加入浓度为3000 IU/mL的白介素-2（interleukin-2, 简称为IL2）、浓度为50 ng/mL的抗-CD3（即anti-CD3）抗体(可购自北京同立海源生物科技有限公司)、浓度为40 pg/mL的碱性成纤维细胞生长因子（basicFibroblast Growth Factor, 简称为bFGF）、浓度为400 pg/mL的转化生长因子-α（Transforming growth factor-α, 简称为TGF-α）以及浓度为1000 pg/mL的趋化因子配体5（Chemokine ligand 5, 简称为CCL5），即可得到T细胞培养基。
（2）实施例1的T细胞增殖培养实验：
首先，准备血液样本，以聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque）密度梯度离心纯化法从血液样本中分离出外周血液单核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC），外周血液单核细胞中含有T细胞，同时，血液中的T细胞中大多数都是αβ T细胞。当外周血液单核细胞培养于含有IL2、anti-CD3抗体及谷氨酰胺且为无血清培养基的促T细胞增殖培养基时，会特别促使外周血液单核细胞中的αβ T细胞增殖，使得细胞液中的αβ T细胞占据大部分比例。亦即，通过将外周血液单核细胞培养于含有IL2、anti-CD3抗体及谷氨酰胺的促T细胞增殖培养基中，经过一段时间的细胞增殖或是进行细胞继代培养，最终即可取得αβ T细胞，
接着，准备6个T-175细胞培养瓶，其中3个细胞培养瓶内分别加入20ml如前所述的T细胞培养基，以作为实验组。另外3个细胞培养瓶加入20ml的对照组T细胞培养基，对照组的T细胞培养基与实验组的T细胞培养基的成分大致相同，唯一差别在于，对照组的T细胞培养基内不含bFGF、TGF-α及CCL5这三种成分。随后，在每个细胞培养瓶中加入以前述方式取得的αβ T细胞，每个细胞培养瓶中的细胞个数为1x108个，并将上述的6个细胞培养瓶放入细胞培养箱中，在37℃、二氧化碳浓度5%的条件下进行培养。每隔2-3天从各个细胞培养瓶中取细胞液样本进行细胞计数，并依据实验组样本及对照组样本中的细胞增殖情形，将实验组及对照组中的细胞液样本换置到容量较大的细胞培养瓶中，再将新鲜的实验组T细胞培养基及新鲜的对照组T细胞培养基分别加入实验组及对照组的T细胞培养瓶中，借此使各个细胞培养液样本中的细胞浓度维持于1-5x106 cells/ml的范围内，实验组样本及对照组样本皆同时连续培养14天。
图1 显示实施例1的T细胞增殖培养实验的实验结果。由图1可见，实验组样本与对照组样本中的αβ T细胞数量皆随着时间而增加，并且，在培养到第7天后，实验组样本的αβT细胞数量相较对照组样本的αβ T细胞数量大幅增长，因此，由实施例1的T细胞增殖培养实验结果可知，T细胞培养基中的IL2及anti-CD3抗体皆有助于αβ T细胞的增殖，而bFGF、TGF-α及CCL5的配方组合还可大幅提高αβ T细胞的增殖率。
（3）实施例1的具增殖活性T细胞比例分析：
依前述实施1的T细胞增殖培养实验中的T细胞培养方法分别培养3个实验组T细胞样本及3个对照组T细胞样本，将实验组T细胞样本及对照组T细胞样本培养14天后，分别从实验组的细胞液样本及对照组的细胞液样本中取出分析样本放入流式细胞仪中，侦测具有增殖活性T细胞表面上的分子标记CD3及Ki67。
参照图2及图3，图2为对照组样本的前方散射光(forward scatter, FSC)/侧方散射光(side scatter, SSC)散点图，图3为实验组样本的FSC/SSC散点图，实验组样本及对照组样本的FSC/ SSC散点图中虚线框所圈选的较为集中的细胞群体即为T细胞。
参照图4及图5，图4为对照组样本的T细胞群体的CD3+/Ki67+细胞表面标记散点图，图5为实验组样本的T细胞群体的CD3+/Ki67+细胞表面标记散点图，在图4及图5中，同时呈现细胞表面标记CD3及细胞表面标记Ki67的T细胞即为具增殖活性的T细胞，经由图4及图5的比较可以看到，实验组样本中的具有增殖活性T细胞的数量明显多于对照组样本中的具有增殖活性T细胞的数量。
图6为显示实验组样本及对照组样本中的具有增殖活性T细胞的比例分析图，由图6中可见，实验组样本中具有增殖活性的T细胞占所有T细胞的比例约为75％，对照组样本中具有增殖活性的T细胞占所有T细胞的比例约为58％。因此，由具有增殖活性T细胞的比例分析结果可知，T细胞培养基中的bFGF、TGF-α及CCL5配方组合有助于提高具增殖活性T细胞的比例。
（4）实施例1的T细胞凋亡比例(apoptosis)分析：
依前述实施例1的T细胞增殖培养实验中的T细胞培养方法分别培养3个实验组T细胞样本及3个对照组T细胞样本，将实验组T细胞样本及对照组T细胞样本同时连续培养14天后，分别从实验组的细胞液样本及对照组的细胞液样本中取出分析样本，并将分析样本以膜联蛋白-萤光素组合物（Annexin V-FITC）及碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)进行染色，实验组的细胞液样本及对照组的细胞液样本经Annexin V及PI染色标记后放入流式细胞仪中进行分析，凋亡T细胞可经由Annexin V及PI的染色标记而被流式细胞仪侦测到。
参见图7及图8，图7显示实验组样本的T细胞Annexin V/PI标记散点图，图8显示对照组样本的T细胞Annexin V/PI标记散点图，在图7及图8中，方框中呈现Annexin V/PI标记的T细胞即为凋亡的T细胞，经由图7及图8的比较可以看到，实验组样本中的凋亡T细胞数量明显少于对照组样本中的凋亡T细胞数量。
图9为显示实验组样本及对照组样本中的凋亡T细胞比例图，由图9中可见，实验组样本中的凋亡T细胞占所有T细胞的比例约为9％，对照组样本中的凋亡T细胞占所有T细胞的比例约为20％。因此，由T细胞凋亡比例分析结果可知，T细胞培养基中的bFGF、TGF-α及CCL5配方组合有助于减少T细胞发生细胞凋亡的状况。
（5）实施例1的免疫功能活化T细胞比例分析：
依前述实施1的T细胞增殖培养实验中的T细胞培养方法分别培养3个实验组T细胞样本及3个对照组T细胞样本，将实验组T细胞样本及对照组T细胞样本培养14天后，分别从实验组的细胞液样本及对照组的细胞液样本中取出分析样本放入流式细胞仪中，侦测免疫功能活化的T细胞其表面上的分子标记CD3及CD69。
参照图10及图11，图10为对照组样本的T细胞群体的CD3+/ CD69+细胞表面标记散点图，图11为实验组样本的T细胞群体的CD3+/ CD69+细胞表面标记散点图，在图10及图11中，同时呈现细胞表面标记CD3及细胞表面标记CD69的T细胞即为免疫功能被活化的T细胞，经由图10及图11的比较可以看到，实验组样本中免疫功能被活化的T细胞数量多于对照组样本中免疫功能被活化的T细胞数量。
图12为显示实验组样本及对照组样本中免疫功能被活化的T细胞比例分析图，由图12中可见，实验组样本中免疫功能被活化的T细胞占所有T细胞的比例约为17％，对照组样本中免疫功能被活化的T细胞占所有T细胞的比例约为11％。因此，由活化T细胞比例分析结果可知，T细胞培养基中的bFGF、TGF-α及CCL5配方组合有助于提高免疫功能被活化的T细胞的比例。
实施例2 γδ T细胞的增殖培养
（1）实施例2的T细胞培养基的制备：
本实施例2的T细胞培养基用于培养γδ T细胞，本实施例2的T细胞培养基与实施例1的T细胞培养基的制备方式及成分大致相同，唯一差别在于：本实施例2的T细胞培养基中的IL-2浓度为1000 IU/mL，且不含有anti-CD3抗体，另外本实施例2的T细胞培养基还加入5μM的唑来膦酸（Zoledronic acid）。
（2）实施例2的T细胞增殖培养实验：
首先，通过类似上述实施例1中的αβ T细胞取得方式，将外周血液单核细胞培养在本实施例2的T细胞培养基中，可促使外周血液单核细胞中的γδ T细胞大量增殖，经过一段时间的细胞增殖或是进行细胞继代培养，最终即可取得γδ T细胞。接着，准备6个T-175细胞培养瓶，其中3个细胞培养瓶内分别加入10ml实施例2的T细胞培养基，以作为实验组。另外3个细胞培养瓶加入10ml的对照组T细胞培养基，对照组的T细胞培养基与实验组的T细胞培养基的成分大致相同，唯一差别在于，对照组的T细胞培养基内不含bFGF、TGF-α及CCL5这三种成分。随后，在每个细胞培养瓶中加入以前述方式取得的γδ T细胞，每个细胞培养瓶中的细胞个数为1x107个，并将上述的6个细胞培养瓶放入细胞培养箱中，在37℃、二氧化碳浓度5%的条件下进行培养。每隔3-4天从各个细胞培养瓶中取细胞液样本进行细胞计数，并依据实验组样本及对照组样本中的细胞增殖情形，将实验组及对照组中的细胞液样本换置到容量较大的细胞培养瓶中，再将新鲜的实验组T细胞培养基及新鲜的对照组T细胞培养基分别加入实验组及对照组的T细胞培养瓶中，借此使各个细胞培养液样本中的细胞浓度维持于1-2x106 cells/ml的范围内，实验组样本及对照组样本皆同时连续培养16天。
图13 显示实施例2的T细胞增殖培养实验的实验结果。由图13可见，实验组样本与对照组样本中的γδ T细胞数量皆随着时间而增加，并且，在培养到第9天后，实验组样本的γδ T细胞数量相较对照组样本的γδ T细胞数量大幅增长，因此，由实施例2的T细胞增殖培养实验结果可知，T细胞培养基中的IL2及唑来膦酸皆有助于γδ T细胞的增殖，而bFGF、TGF-α及CCL5的配方组合还可大幅提高γδ T细胞的增殖率。
实施例3 NK T细胞的增殖培养及分析
（1）实施例3的T细胞培养基的制备：
本实施例3的T细胞培养基是用于培养自然杀手T细胞（Natural killer T cell, NKTcell），本实施例3的T细胞培养基与实施例1的αβ T细胞培养基的制备方式及成分大致相同，唯一差别在于，本实施例3的T细胞培养基中的IL-2浓度为200 IU/mL，且不含有anti-CD3抗体，另外本实施例3的T细胞培养基还加入100 ng/mL的半乳糖苷基神经酰胺（α-GalactosylCeramide, 简称为α-GalCer）。
（2）实施例3的T细胞增殖培养实验：
首先，准备血液样本，以Ficoll-Hypaque密度梯度离心纯化法从血液样本中分离出外周血液单核细胞，并利用anti-iNKT微珠（anti-iNKT microbeads）组从外周血液单核细胞中分离取得TCR α-chain Vα24-Jα18 NKT细胞。
接着，准备6个T-175细胞培养瓶，其中3个细胞培养瓶内分别加入10ml实施例3的T细胞培养基，以作为实验组。另外3个细胞培养瓶加入10ml的对照组T细胞培养基，对照组的T细胞培养基与实验组的T细胞培养基的成分大致相同，唯一差别在于，对照组的T细胞培养基内不含bFGF、TGF-α及CCL5这三种配方。随后，在每个细胞培养瓶中加入以前述方式取得的NKT细胞，每个细胞培养瓶中的细胞个数为1x106个，并将上述的6个细胞培养瓶放入细胞培养箱中，在37℃、二氧化碳浓度5%的条件下进行培养。每隔3-4天从各个细胞培养瓶中取细胞液样本进行细胞计数，并依据实验组样本及对照组样本中的细胞增殖情形，将实验组及对照组中的细胞液样本换置到容量较大的细胞培养瓶中，再将新鲜的实验组T细胞培养基及新鲜的对照组T细胞培养基分别加入实验组及对照组的T细胞培养瓶中，借此使各个细胞培养液样本中的细胞浓度维持于1-2x106 cells/ml的范围内，实验组样本及对照组样本皆同时连续培养9天。
图14显示实施例3的T细胞增殖培养实验的实验结果。由图14可见，实验组样本与对照组样本中的NK T细胞数量皆随着时间而增加，并且，从第0天开始，实验组样本的NK T细胞数量相较对照组样本的NKT细胞数量大幅增长，因此，由实施例3的T细胞增殖培养实验结果可知，T细胞培养基中的IL2及α-GalCer皆有助于NKT细胞的增殖，而bFGF、TGF-α及CCL5的配方组合更可大幅提高NKT细胞的增殖率。
上述实施例中的T细胞培养基及利用所述T细胞培养基来培养T细胞的T细胞培养方法借由bFGF、TGF-α及CCL5的配方组合，可大幅提高T细胞的增殖率，同时，bFGF、TGF-α及CCL5的配方组合还能够提高具增殖活性T细胞以及免疫功能活化T细胞的比例并减少T细胞发生细胞凋亡的状况。此外，在上述实施例的T细胞培养基中，IL-2有助于提高各类T细胞的增殖率，几乎是必不可少的；anti-CD3抗体有助于特异性提高αβ T细胞的增殖率；唑来膦酸有助于特异性提高γδ T细胞的增殖率；α-GalCer有助于特异性提高NKT细胞的增殖率。
Claims (10)
1.用于培养T细胞的添加剂，其包括白介素-2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-α和趋化因子配体5以及任选的特异性培养成分，其中特异性培养成分选自抗-CD3抗体、唑来膦酸和半乳糖苷基神经酰胺中的一种。
2.权利要求1所述的添加剂，其由白介素-2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-α和趋化因子配体5以及任选的特异性培养成分组成，其中特异性培养成分选自抗-CD3抗体、唑来膦酸和半乳糖苷基神经酰胺中的一种。
3.权利要求1或2所述的添加剂，其中，白介素-2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-α和趋化因子配体5以及任选的抗-CD3抗体、唑来膦酸和半乳糖苷基神经酰胺的比例为10-6000IU：1-300pg：1-3000pg：50-1500pg：10-100ng：1-20nmol：20-200ng，优选为100-4000IU：20-80pg：200-800pg：500-1200pg：20-80ng：3-10 nmol：50-150ng，更优选为200-3000IU：40pg：400pg：1000pg：50ng：5 nmol：100ng。
4.T细胞培养基，其由含谷氨酰胺的无血清培养基和权利要求1-3之一所述的添加剂组成。
5.权利要求4所述的培养基，其中所述含谷氨酰胺的无血清培养基是AIM-V、X-VIVO 15或Cellgro SCGM。
6.权利要求1或4所述的添加剂或培养基，其中，所述T细胞是αβ T细胞、γδ T细胞或NKT细胞。
7.权利要求4所述的培养基，其中白介素-2的浓度为10-6000IU/mL，优选为100-4000IU/mL，更优选为200-3000IU/mL。
8.体外培养T细胞的方法，其包括用权利要求4-7之一所述的培养基对样本培养出T细胞的步骤。
9.权利要求8所述的方法，其中，权利要求4-7之一所述的培养基中的权利要求1-3之一所述的添加剂中的特异性培养成分和所述T细胞选自以下3组之一：
（1）抗-CD3抗体和αβ T细胞；
（2）唑来膦酸和γδ T细胞；以及
（3）半乳糖苷基神经酰胺和NK T细胞。
10.权利要求8所述的方法，其中，样本含单核细胞，优选含外周血液单核细胞。
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