CN113454207A - 用新型芳香族化合物扩增自然杀伤细胞和ilc3细胞 - Google Patents

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张晓奎
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Abstract

本文提供了使用三阶段扩增和分化法，利用包括干细胞动员因子的培养基产生自然杀伤(NK)细胞和/或ILC3细胞的方法。本文还提供了使用通过本文所描述的三阶段法产生的NK细胞和/或ILC3细胞以及NK细胞和/或ILC3细胞群遏制肿瘤细胞增殖的方法，以及对患有癌症或病毒感染的个体进行治疗的方法，所述治疗方法包括向患有所述癌症或病毒感染的个体施用通过本文所描述的三阶段法产生的NK细胞和/或ILC3细胞以及NK细胞和/或ILC3细胞群。

Description

用新型芳香族化合物扩增自然杀伤细胞和ILC3细胞
技术领域
本文提供了在包括干细胞动员因子的培养基中由造血干细胞或祖细胞群产生自然杀伤(NK)细胞和/或ILC3细胞群的方法，例如，在包括干细胞动员因子的培养基中从来自胎盘例如来自胎盘灌注液(例如，人胎盘灌注液)或其它组织例如脐带血或外周血的细胞的造血干细胞或祖细胞产生NK细胞和/或ILC3细胞的三阶段法。本文进一步提供了使用本文所描述的胎盘灌注液、NK细胞和/或ILC3细胞和/或NK祖细胞来例如遏制肿瘤细胞的增殖或抑制病原体感染例如病毒感染的方法。在某些实施例中，由本文所描述的三阶段法产生的NK细胞和/或ILC3细胞和/或NK祖细胞与一种或多种免疫调节化合物组合使用和/或用一种或多种免疫调节化合物处理。
背景技术
自然杀伤(NK)细胞是构成先天免疫系统的主要组分的细胞毒性淋巴细胞。
NK细胞响应于干扰素或巨噬细胞源性细胞因子而被激活。NK细胞的细胞毒性活性主要由两种类型的表面受体调节，所述两种类型的表面受体可以被视为“激活受体”或“抑制受体”，但是一些受体例如CD94和2B4(CD244)可以根据配体相互作用以任何方式工作。
除了其它活性，NK细胞还在宿主对肿瘤的排斥中发挥作用并且已被示出能够杀伤病毒感染的细胞。自然杀伤细胞可以被缺乏主要组织相容性复合体(MHC)蛋白或显示出更低水平的MHC蛋白的细胞激活。自我MHC I类表达水平改变或降低的癌细胞会导致诱导NK细胞敏感性。来自外周血的经过激活和扩增的NK细胞以及在一些情况下LAK细胞已被用于晚期癌症患者的离体疗法和体内治疗中，其中在抗击如以下等骨髓相关疾病方面取得了一定成功：白血病；乳腺癌；以及某些类型的淋巴瘤。
尽管NK细胞在杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞方面具有有利的性质，但在本领域仍然需要开发高效的方法来产生并扩增保留杀肿瘤功能的自然杀伤细胞。
NK细胞是先天淋巴样细胞(ILC)。先天淋巴样细胞通过其发育对转录因子ID2的依赖性而相关。一种类型的ILC(已知为ILC3细胞)在文献中被描述为表达RORγt并产生IL-22并且在成人的免疫应答中发挥作用，而未显现出细胞毒性效应物，如穿孔素、颗粒酶和死亡受体(Montaldo等人,2014,《免疫(Immunity)》41:988-1000；Killig等人,2014,《免疫学前沿(Front.Immunol.)》5:142；Withers等人,2012,《免疫学杂志(J.Immunol.)》189(5):2094-2098)。
发明内容
本文提供了使细胞扩增并分化以产生自然杀伤(NK)细胞和/或ILC3细胞的方法，所述细胞例如造血细胞，如造血干细胞，例如CD34+造血干细胞。具体地，本发明关注于促进造血干细胞和祖细胞的增殖/扩增以由所述造血祖细胞产生更多分化的NK和/或ILC3细胞群的新型芳香族化合物(干细胞动员剂/因子)。这些化合物以及其合成和验证在共同提交的申请号___中进行了更详细的描述，所述申请通过引用并入本文。
在一方面，本文提供了产生NK细胞群和/或ILC3细胞群的方法，所述方法包括如本文所描述的三个阶段(并在本文被称为“三阶段法”)。通过本文所提供的三阶段法产生的自然杀伤细胞和/或ILC3细胞在本文中被称为“通过三阶段法产生的NK细胞”、“通过三阶段法产生的ILC3细胞”或“通过三阶段法产生的NK细胞和/或ILC3细胞”。在某些实施例中，所述方法包括一个或多个另外的步骤或中间步骤。在某些实施例中，所述方法不包括接触(例如，培养)细胞的任何第四步骤或中间步骤。
在一方面，本文提供了一种产生NK细胞的方法，所述方法包括：在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞例如CD34+干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；随后在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及随后在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和(任选地)低分子量肝素(LMWH)的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群，其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-，并且其中至少70％例如80％的所述自然杀伤细胞是活的。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。在某些实施例中，此类自然杀伤细胞包括自然杀伤细胞CD16-。在某些实施例中，此类自然杀伤细胞包括自然杀伤细胞CD94+。在某些实施例中，此类自然杀伤细胞包括自然杀伤细胞CD94+或CD16+。在某些实施例中，此类自然杀伤细胞包括自然杀伤细胞CD94-或CD16-。在某些实施例中，此类自然杀伤细胞包括自然杀伤细胞CD94+和CD16+。在某些实施例中，此类自然杀伤细胞包括自然杀伤细胞CD94-和CD16-。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基和所述第三培养基中的至少一个、两个或全部三个不是培养基
Figure BDA0003186938500000031
在某些实施例中，所述第三培养基缺乏添加的脱硫酸化糖胺聚糖。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏脱硫酸化糖胺聚糖。
在一方面，本文提供了一种产生NK细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-和CD11a+。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生NK细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞因子(SCF)和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-和CD11a+。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生NK细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏SCF、干细胞动员剂和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-和CD11a。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生NK细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；以及(d)从所述第三细胞群中分离CD11a+细胞以产生第四细胞群；其中所述第四细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-和CD11a+。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在某些实施例中，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和脱中胚蛋白(EOMES)。在某些实施例中，所述自然杀伤细胞不表达RAR相关孤儿受体γ(RORγt)或白细胞介素-1受体1(IL1R1)。
在一方面，本文提供了一种产生ILC3细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生ILC3细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括干细胞动员剂、IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生ILC3细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括SCF、IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生ILC3细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括干细胞动员剂、SCF、IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生ILC3细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；以及(d)从所述第三细胞群中分离CD11a-细胞以产生第四细胞群；其中所述第四细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在某些实施例中，所述ILC3细胞表达RORγt和IL1R1。在某些实施例中，所述ILC3细胞不表达穿孔素或EOMES。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏添加的脱硫酸化糖胺聚糖。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏脱硫酸化糖胺聚糖。
在某些实施例中，所述造血干细胞或祖细胞是哺乳动物细胞。在具体实施例中，所述造血干细胞或祖细胞是人细胞。在具体实施例中，所述造血干细胞或祖细胞是灵长类动物细胞。在具体实施例中，所述造血干细胞或祖细胞是犬科动物细胞。在具体实施例中，所述造血干细胞或祖细胞是啮齿动物细胞。在具体实施例中，所述造血干细胞或祖细胞是来自除人、灵长类动物、犬科动物或啮齿动物以外的哺乳动物的细胞。
在某些方面，在所述第一培养基中培养的所述造血干细胞或祖细胞是CD34+干细胞或祖细胞。在某些方面，所述造血干细胞或祖细胞是胎盘造血干细胞或祖细胞。在某些方面，所述胎盘造血干细胞或祖细胞从胎盘灌注液获得或可获得(例如，从自胎盘灌注液中分离的有核细胞获得或可获得)。在某些方面，所述造血干细胞或祖细胞从脐带血获得或可获得。在某些方面，所述造血干细胞或祖细胞是胎儿肝细胞。在某些方面，所述造血干细胞或祖细胞是动员的外周血细胞。在某些方面，所述造血干细胞或祖细胞是骨髓细胞。
在某些方面，三阶段法中使用的所述第一培养基包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)。在某些方面，三阶段法中使用的第一培养基除了干细胞动员剂和Tpo外还包括低分子量肝素(LMWH)、Flt-3配体(Flt-3L)、干细胞因子(SCF)、IL-6、IL-7、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)中的一种或多种。在某些方面，所述第一培养基不包括添加的LMWH。在某些方面，所述第一培养基不包括添加的脱硫酸化糖胺聚糖。在某些方面，所述第一培养基不包括LMWH。在某些方面，所述第一培养基不包括脱硫酸化糖胺聚糖。在某些方面，三阶段法中使用的第一培养基除了干细胞动员剂和Tpo外还包括Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，三阶段法中使用的第一培养基除了干细胞动员剂和Tpo外还包括Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，所述Tpo在所述第一培养基中以1ng/mL到100ng/mL、1ng/mL到50ng/mL、20ng/mL到30ng/mL或约25ng/mL的浓度存在。在某些方面，当LMWH存在于第一培养基中时，LMWH以1U/mL到10U/mL的浓度存在；Flt-3L以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；SCF以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL到0.50ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，Flt-3L以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；SCF以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL到0.50ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，当LMWH存在于第一培养基中时，LMWH以4U/mL到5U/mL的浓度存在；Flt-3L以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL到0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL到0.30ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，Flt-3L以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL到0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL到0.30ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，当LMWH存在于第一培养基中时，LMWH以约4.5U/mL的浓度存在；Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约.25ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约.25ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些实施例中，所述第一培养基不是
Figure BDA0003186938500000081
在某些方面，三阶段法中使用的所述第二培养基包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo。在某些方面，三阶段法中使用的第二培养基除了干细胞动员剂和IL-15外还包括LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种。在某些方面，第二培养基不包括添加的LMWH。在某些方面，第二培养基不包括添加的脱硫酸化糖胺聚糖。在某些方面，第二培养基不包括LMWH。在某些方面，第二培养基不包括脱硫酸化糖胺聚糖。在某些方面，三阶段法中使用的第二培养基除了干细胞动员剂和IL-15外还包括IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，三阶段法中使用的第二培养基除了干细胞动员剂和IL-15外还包括Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，所述IL-15在所述第二培养基中以1ng/mL到50ng/mL、10ng/mL到30ng/mL或约20ng/mL的浓度存在。在某些方面，当LMWH存在于所述第二培养基中时，LMWH以1U/mL到10U/mL的浓度存在；Flt-3L以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；SCF以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL到0.50ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，当LMWH存在于第二培养基中时，LMWH在第二培养基中以4U/mL到5U/mL的浓度存在；Flt-3L以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL到0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL到0.30ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，Flt-3L以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL到0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL到0.30ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，当LMWH存在于第二培养基中时，LMWH在第二培养基中以4U/mL到5U/mL的浓度存在；Flt-3L以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL到0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL到0.30ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，Flt-3L以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL到0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL到0.30ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，当LMWH存在于第二培养基中时，LMWH在第二培养基中以约4.5U/mL的浓度存在；Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些实施例中，所述第二培养基不是
Figure BDA0003186938500000091
在某些方面，所述干细胞动员因子是具有式(I)、(I-A)、(I-B)、(I-C)或(I-D)的化合物，如下文所描述的。
在某些方面，三阶段法中使用的所述第三培养基包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH。在某些方面，三阶段法中使用的第三培养基除了IL-2和IL-15外还包括SCF、IL-6、IL-7、G-CSF或GM-CSF中的一种或多种。在某些方面，三阶段法中使用的第三培养基除了IL-2和IL-15外还包括SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，所述IL-2在所述第三培养基中以10U/mL到10,000U/mL的浓度存在，并且所述IL-15在所述第三培养基中以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在。在某些方面，所述IL-2在所述第三培养基中以100U/mL到10,000U/mL的浓度存在，并且所述IL-15在所述第三培养基中以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在。在某些方面，所述IL-2在所述第三培养基中以300U/mL到3,000U/mL的浓度存在，并且所述IL-15在所述第三培养基中以10ng/mL到30ng/mL的浓度存在。在某些方面，所述IL-2在所述第三培养基中以约1,000U/mL的浓度存在，并且所述IL-15在所述第三培养基中以约20ng/mL的浓度存在。在某些方面，在所述第三培养基中，SCF以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL到0.50ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，在所述第三培养基中，SCF以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL到0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL到0.30ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在所述第三培养基中，SCF以约22ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约20ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些实施例中，所述第三培养基不是
Figure BDA0003186938500000101
在某些方面，第三培养基包括100ng/mL IL-7、1000ng/mL IL-2、20ng/mL IL-15以及干细胞动员剂并且缺乏SCF。在某些方面，第三培养基包括20ng/mL IL-7、1000ng/mL IL-2、20ng/mL IL-15以及干细胞动员剂并且缺乏SCF。在某些方面，第三培养基包括20ng/mLIL-7、20ng/mL IL-15以及干细胞动员剂干细胞动员剂并且缺乏SCF。在某些方面，第三培养基包括100ng/mL IL-7、22ng/mL SCF、1000ng/mL IL-2和20ng/mL IL-15并且缺乏干细胞动员剂。在某些方面，第三培养基包括22ng/mL SCF、1000ng/mL IL-2、20ng/mL IL-15并且缺乏干细胞动员剂。在某些方面，第三培养基包括20ng/mL IL-7、22ng/mL SCF、1000ng/mLIL-2和20ng/mL IL-15并且缺乏干细胞动员剂。在某些方面，第三培养基包括20ng/mL IL-7、22ng/mL SCF和1000ng/mL IL-2并且缺乏干细胞动员剂。
在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
通常，特别叙述的培养基组分并非指所述培养基的不确定组分中的可能成分，例如，血清。例如，所述Tpo、所述IL-2和所述IL-15不包括在所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基的不确定组分内，例如，所述Tpo、所述IL-2和所述IL-15不包括在血清内。进一步地，所述LMWH、所述Flt-3、所述SCF、所述IL-6、所述IL-7、所述G-CSF和/或所述GM-CSF不包括在所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基的不确定组分内，例如，所述LMWH、所述Flt-3、所述SCF、所述IL-6、所述IL-7、所述G-CSF和/或所述GM-CSF不包括在血清内。
在某些方面，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基包括人AB血清。在某些方面，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基中的任何一种包括1％到20％人AB血清、5％到15％人AB血清或约2％、5％或10％人AB血清。
在某些方面，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基中的任何一种包括2-巯基乙醇。在某些方面，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基中的任何一种包括庆大霉素(gentamycin)。
在某些实施例中，在本文所描述的三阶段法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天，之后在所述第二培养基中进行所述培养。在某些实施例中，将细胞在所述第二培养基中培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天，之后在所述第三培养基中进行所述培养。在某些实施例中，将细胞在所述第三培养基中培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天或超过30天。
在一个实施例中，在本文所描述的三阶段法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养7-13天以产生第一细胞群；将所述第一细胞群在所述第二培养基中培养2-6天以产生第二细胞群；并且将所述第二细胞群在所述第三培养基中培养10-30天，即，将细胞培养共19-49天。
在一个实施例中，在本文所描述的三阶段法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养8-12天以产生第一细胞群；将所述第一细胞群在所述第二培养基中培养3-5天以产生第二细胞群；并且将所述第二细胞群在所述第三培养基中培养15-25天，即，将细胞培养共26-42天。
在具体实施例中，在本文所描述的三阶段法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养约10天以产生第一细胞群；将所述第一细胞群在所述第二培养基中培养约4天以产生第二细胞群；并且将所述第二细胞群在所述第三培养基中培养约21天，即，将细胞培养共约35天。
在某些方面，所述第一培养基、所述第二培养基和所述第三培养基中的所述培养均在静置培养条件下例如在培养皿或培养瓶中执行。在某些方面，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基中的至少一种中的所述培养在旋转瓶中执行。在某些方面，所述第一培养基和所述第二培养基中的所述培养在静置培养条件下进行，并且所述第三培养基中的所述培养在旋转瓶中执行。
在某些方面，所述培养在旋转瓶中执行。在其它方面，所述培养在G-Rex装置中执行。在又其它方面，所述培养在WAVE生物反应器中执行。
在某些方面，所述造血干细胞或祖细胞最初以1×104个到1×105个细胞/毫升接种于所述第一培养基中。在具体方面，所述造血干细胞或祖细胞最初以约3×104个细胞/毫升接种于所述第一培养基中。
在某些方面，所述第一细胞群最初以5×104个到5×105个细胞/毫升接种于所述第二培养基中。在具体方面，所述第一细胞群最初以约1×105个细胞/毫升接种于所述第二培养基中。
在某些方面，所述第二细胞群最初以1×105个到5×106个细胞/毫升接种于所述第三培养基中。在某些方面，所述第二细胞群最初以1×105个到1×106个细胞/毫升接种于所述第三培养基中。在具体方面，所述第二细胞群最初以约5×105个细胞/毫升接种于所述第三培养基中。在更具体的方面，在旋转瓶中，所述第二细胞群最初以约5×105个细胞/毫升接种于所述第三培养基中。在具体方面，所述第二细胞群最初以约3×105个细胞/毫升接种于所述第三培养基中。在更具体的方面，在静置培养中，所述第二细胞群最初以约3×105个细胞/毫升接种于所述第三培养基中。
在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的自然杀伤细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少5000倍。在某些方面，所述三阶段法所产生的自然杀伤细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少10,000倍。在某些方面，所述三阶段法所产生的自然杀伤细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少50,000倍。在某些方面，所述三阶段法所产生的自然杀伤细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少75,000倍。在某些方面，通过7-氨基放线菌素D(7AAD)染色来确定所述自然杀伤细胞的活力。在某些方面，通过膜联蛋白-V染色来确定所述自然杀伤细胞的活力。在具体方面，通过7-AAD染色和膜联蛋白-V染色两者来确定所述自然杀伤细胞的活力。在某些方面，通过台盼蓝染色来确定所述自然杀伤细胞的活力。
在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的ILC3细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少5000倍。在某些方面，所述三阶段法所产生的ILC3细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少10,000倍。在某些方面，所述三阶段法所产生的ILC3细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少50,000倍。在某些方面，所述三阶段法所产生的ILC3细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少75,000倍。
在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少20％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在某些方面，三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少40％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在某些方面，三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少60％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在某些方面，三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少70％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在某些方面，三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少75％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在某些方面，三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少80％CD56+CD3-自然杀伤细胞。
在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少20％CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞。在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少40％CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞。在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少60％CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞。在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少80％CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞。
在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的ILC3细胞包括至少20％CD56+CD3-CD11a-ILC3细胞。在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的ILC3细胞包括至少40％CD56+CD3-CD11a-ILC3细胞。在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的ILC3细胞包括至少60％CD56+CD3-CD11a-ILC3细胞。在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少80％CD56+CD3-CD11a-ILC3细胞。
在某些方面，当本文所公开的三阶段法所产生的自然杀伤细胞与K562细胞以10:1的比率在体外共培养时，所述自然杀伤细胞针对所述K562细胞表现出至少20％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的自然杀伤细胞与K562细胞以10:1的比率在体外共培养时，所述自然杀伤细胞针对所述K562细胞表现出至少35％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的自然杀伤细胞与K562细胞以10:1的比率在体外共培养时，所述自然杀伤细胞针对所述K562细胞表现出至少45％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的自然杀伤细胞与K562细胞以10:1的比率在体外共培养时，所述自然杀伤细胞针对所述K562细胞表现出至少60％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的自然杀伤细胞与K562细胞以10:1的比率在体外共培养时，所述自然杀伤细胞针对所述K562细胞表现出至少75％的细胞毒性。
在某些方面，当本文所公开的三阶段法所产生的ILC3细胞与K562细胞以10:1的比率在体外共培养时，所述ILC3细胞针对所述K562细胞表现出至少20％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的ILC3细胞与K562细胞以10:1的比率在体外共培养时，所述ILC3细胞针对所述K562细胞表现出至少35％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的ILC3细胞与K562细胞以10:1的比率在体外共培养时，所述ILC3细胞针对所述K562细胞表现出至少45％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的ILC3细胞与K562细胞以10:1的比率在体外共培养时，所述ILC3细胞针对所述K562细胞表现出至少60％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的ILC3细胞与K562细胞以10:1的比率在体外共培养时，所述ILC3细胞针对所述K562细胞表现出至少75％的细胞毒性。
在某些方面，在所述第三培养步骤之后，低温保存所述第三细胞群，例如，所述自然杀伤细胞群。在某些方面，在所述第四培养步骤之后，低温保存所述第四细胞群，例如，所述自然杀伤细胞群。
在某些方面，本文提供了包括自然杀伤细胞即通过本文所描述的三阶段法产生的自然杀伤细胞的细胞群。因此，本文提供了通过本文所描述的三阶段法产生的分离的自然杀伤细胞群。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞群包括至少20％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞群包括至少40％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞群包括至少60％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞群包括至少80％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在具体实施例中，自然杀伤细胞群被调配成适合于在体内使用例如适合于在人体内使用的药物组合物。
在某些方面，本文提供了包括ILC3细胞即通过本文所描述的三阶段法产生的自然杀伤细胞的细胞群。在具体实施例中，包括ILC3细胞的细胞群被调配成适合于在体内使用例如适合于在人体内使用的药物组合物。
在一个实施例中，本文提供了分离的NK祖细胞群，其中所述NK祖细胞根据本文所描述的三阶段法产生。在具体实施例中，NK祖细胞群被调配成适合于在体内使用例如适合于在人体内使用的药物组合物。
在另一个实施例中，本文提供了分离的成熟NK细胞群，其中所述成熟NK细胞根据本文所描述的三阶段法产生。在具体实施例中，成熟NK细胞群被调配成适合于在体内使用例如适合于在人体内使用的药物组合物。
在另一个实施例中，本文提供了分离的ILC3群，其中所述ILC3细胞根据本文所描述的三阶段法产生。在具体实施例中，分离的ILC3群被调配成适合于在体内使用例如适合于在人体内使用的药物组合物。
在另一个实施例中，本文提供了细胞群，其中所述细胞群是通过本文所描述的方法产生的第三细胞群。在另一个实施例中，本文提供了细胞群，其中所述细胞群是通过本文所描述的方法产生的第四细胞群。
在另一个实施例中，本文提供了分离的NK细胞群，其中所述NK细胞被激活，其中所述激活的NK细胞根据本文所描述的三阶段法产生。在具体实施例中，分离的NK群被调配成适合于在体内使用例如适合于在人体内使用的药物组合物。
因此，在另一方面，本文提供了使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群用于遏制肿瘤细胞增殖、治疗病毒感染或治疗癌症例如血癌和实体瘤的用途。在某些实施例中，NK细胞群与免疫调节化合物例如本文所描述的免疫调节化合物或沙利度胺(thalidomide))接触或与其组合使用。在某些实施例中，NK细胞群用免疫调节化合物例如本文所描述的免疫调节化合物或沙利度胺处理或与其组合使用。
在具体实施例中，所述癌症是实体瘤。在另一个实施例中，所述癌症是血癌。在具体实施例中，癌症是成胶质细胞瘤、原发性导管癌、白血病、急性T细胞白血病、慢性髓系淋巴瘤(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、肺癌、结肠腺癌、组织细胞性淋巴瘤、结直肠癌、结直肠腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤或视网膜母细胞瘤。在更具体的实施例中，癌症是AML。在更具体的实施例中，癌症是多发性骨髓瘤。
在另一个具体实施例中，产生NK细胞群的造血细胞例如造血干细胞或祖细胞从胎盘灌注液、脐带血或外周血获得。在一个实施例中，产生NK细胞群的造血细胞例如造血干细胞或祖细胞从胎盘例如从胎盘灌注液获得。在一个实施例中，产生NK细胞群的造血细胞例如造血干细胞或祖细胞从脐带血获得。在一个实施例中，产生NK细胞群的造血细胞例如造血干细胞或祖细胞并非从外周血获得。在另一个具体实施例中，产生NK细胞群的造血细胞例如造血干细胞或祖细胞是来自胎盘灌注液和脐带血(例如，与灌注液来自同一胎盘的脐带血)的组合细胞。在另一个具体实施例中，所述脐带血从除获得所述胎盘灌注液的胎盘以外的胎盘中分离。在某些实施例中，组合细胞可以通过汇集或组合脐带血和胎盘灌注液来获得。在某些实施例中，脐带血和胎盘灌注液按以下体积比组合以获得组合细胞：100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等。在具体实施例中，脐带血和胎盘灌注液以10:1到1:10、5:1到1:5或3:1到1:3的比率组合。在另一个具体实施例中，脐带血和胎盘灌注液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比率组合。在更具体的实施例中，脐带血和胎盘灌注液以8.5:1.5(85％:15％)的比率组合。
在某些实施例中，脐带血和胎盘灌注液以如按照总有核细胞(TNC)含量确定的以下比率组合以获得组合细胞：100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等。在具体实施例中，脐带血和胎盘灌注液以10:1到10:1、5:1到1:5或3:1到1:3的比率组合。在另一个具体实施例中，脐带血和胎盘灌注液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比率组合。
因此，在一个实施例中，本文提供了一种治疗患有癌症或病毒感染的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的来自使用本文所描述的三阶段法产生的分离的NK细胞群的细胞。在某些实施例中，所述癌症是实体瘤。在某些实施例中，所述癌症是血液学癌症。在具体实施例中，所述血液学癌症是白血病。在另一个具体实施例中，所述血液学癌症是淋巴瘤。在另一个具体实施例中，所述血液学癌症是急性髓系白血病。在另一个具体实施例中，所述血液学癌症是慢性淋巴细胞白血病。在另一个具体实施例中，所述血液学癌症是慢性骨髓性白血病。在某些方面，所述自然杀伤细胞在所述接触或所述施用之前已被低温保存。在其它方面，所述自然杀伤细胞在所述接触或所述施用之前尚未被低温保存。
在具体实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群在所述施用之前已经用免疫调节化合物例如本文所描述的免疫调节化合物或沙利度胺进行处理。在具体实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群在所述施用之前已经用IL2和IL12以及IL18、IL12和IL15、IL12和IL18、IL2和IL12和IL15以及IL18或IL2和IL15以及IL18进行处理。在另一个具体实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的分离的NK细胞群在所述施用之前已经用IL2、IL12、IL18或IL15中的一种或多种进行预处理。在另一个具体实施例中，所述方法包括向个体施用：(1)有效量的使用本文所描述的三阶段法产生的分离的NK细胞群；以及(2)有效量的免疫调节化合物或沙利度胺。此语境中的“有效量”意指NK细胞群中的细胞以及任选地免疫调节化合物或沙利度胺的量使所述癌症或所述感染的一种或多种症状与尚未施用所述NK细胞群以及任选地免疫调节化合物或沙利度胺的患有所述癌症或所述感染的个体相比得到可检测改善。在具体实施例中，所述免疫调节化合物是来那度胺(lenalidomide)或泊马度胺(pomalidomide)。在另一个实施例中，所述方法另外包括向个体施用抗癌化合物，例如，下文所描述的抗癌化合物中的一种或多种。
在另一个实施例中，本文提供了一种遏制肿瘤细胞的增殖的方法，所述方法包括使治疗有效量的NK细胞群接近肿瘤细胞，例如，使肿瘤细胞与NK细胞群中的细胞接触。在下文中，除非另外提出，否则术语“接近”是指足够接近以引发期望的结果；例如，在某些实施例中，术语接近是指接触。在某些实施例中，所述接触在体外进行。在某些实施例中，所述接触离体进行。在其它实施例中，所述接触在体内进行。在所述遏制肿瘤细胞的增殖的方法中可以使用多个NK细胞，所述方法包括使治疗有效量的NK细胞群接近肿瘤细胞，例如，使肿瘤细胞与NK细胞群中的细胞接触。在某些实施例中，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞、头颈癌细胞或肉瘤细胞。在某些实施例中，所述肿瘤细胞为原发性导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓系淋巴瘤(CML)细胞、慢性骨髓性白血病(CML)细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞或视网膜母细胞瘤细胞。
在一个实施例中，本文提供了用于在遏制肿瘤细胞的增殖的方法中使用的多个自然杀伤细胞，所述方法包括使肿瘤细胞与所述多个自然杀伤细胞接触，其中所述自然杀伤细胞通过本文所描述的方法产生。在某些实施例中，所述接触在人个体内进行。在某些实施例中，所述方法包括向所述个体施用所述自然杀伤细胞。在某些实施例中，所述肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在某些实施例中，所述肿瘤细胞是急性髓系白血病(AML)细胞。在某些实施例中，所述个体患有复发性/难治性AML。在某些实施例中，所述个体患有使针对AML的至少一种非先天淋巴样细胞(ILC)治疗剂失效的AML。在某些实施例中，所述个体为65岁或更大并且处于第一缓解期。在某些实施例中，所述个体在施用所述NK细胞之前已经用氟达拉滨(fludarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)或两者进行调控。在某些实施例中，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞、头颈癌细胞或肉瘤细胞。在某些实施例中，所述肿瘤细胞为原发性导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓系淋巴瘤(CML)细胞、慢性骨髓性白血病(CML)细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞或视网膜母细胞瘤细胞。在某些实施例中，所述肿瘤细胞为实体瘤细胞、肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞或多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞。在某些实施例中，所述自然杀伤细胞与抗CD33抗体、抗CD20抗体、抗CD138抗体或抗CD32抗体一起施用。在某些实施例中，所述NK细胞在所述接触或所述施用之前已被或尚未被低温保存。
分离的NK细胞群或其药物组合物的施用可以是全身或局部的。在具体实施例中，施用是肠胃外的。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群或其药物组合物是通过注射、输注、静脉内(IV)施用、股动脉内施用或瘤内施用。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群或其药物组合物是用装置、基质或支架执行的。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群或其药物组合物是通过注射。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群或其药物组合物是经由导管。在具体实施例中，NK细胞的注射为局部注射。在更具体的实施例中，局部注射直接进入实体瘤(例如，肉瘤)中。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群或其药物组合物是通过用注射器注射。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群或其药物组合物是经由导引递送。在具体实施例中，通过注射向受试者施用分离的NK细胞群或其药物组合物是由腹腔镜检查、内窥镜检查、超声、计算机断层扫描、磁共振或放射学辅助的。
在具体实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的分离的NK细胞群在所述接触或接近之前已经用免疫调节化合物，例如本文下文中所描述的免疫调节化合物或沙利度胺、和/或IL2和IL12以及IL18、IL12和IL15、IL12和IL18、IL2和IL12和IL15以及IL18或IL2和IL15以及IL18进行处理。在另一个具体实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的分离的NK细胞群在所述接触或接近之前已经用IL2、IL12、IL18或IL15中的一种或多种进行处理。在另一个具体实施例中，另外使有效量的免疫调节化合物例如本文下文中所描述的免疫调节化合物或沙利度胺接近肿瘤细胞，例如，使肿瘤细胞与免疫调节化合物或沙利度胺接触。此语境中的“有效量”意指NK细胞群中的细胞以及任选地免疫调节化合物或沙利度胺的量使所述肿瘤细胞与当量数量的未与NK细胞群中的细胞以及任选地免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近的肿瘤细胞相比得到可检测遏制。在另一个具体实施例中，所述方法进一步包括使有效量的抗癌化合物例如下文所描述的抗癌化合物接近肿瘤细胞，例如，使肿瘤细胞与抗癌化合物接触。
在此方法的具体实施例中，肿瘤细胞是血癌细胞。在另一个具体实施例中，肿瘤细胞是实体瘤细胞。在另一个实施例中，肿瘤细胞为原发性导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓系淋巴瘤(CML)细胞、急性骨髓性白血病细胞(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)细胞、成胶质细胞瘤细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、视网膜母细胞瘤细胞、结直肠癌细胞、前列腺癌细胞或结直肠腺癌细胞。在更具体的实施例中，肿瘤细胞是AML细胞。在更具体的实施例中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在另一个具体实施例中，所述接触或接近在体外进行。在另一个具体实施例中，所述接触或接近离体进行。在另一个具体实施例中，所述接触或接近在体内进行。在更具体的实施例中，所述体内接触或接近在人体内进行。在具体实施例中，所述肿瘤细胞是实体瘤细胞。在具体实施例中，所述肿瘤细胞是肝肿瘤细胞。在具体实施例中，所述肿瘤细胞是肺肿瘤细胞。在具体实施例中，所述肿瘤细胞是胰腺肿瘤细胞。在具体实施例中，所述肿瘤细胞是肾肿瘤细胞。在具体实施例中，所述肿瘤细胞是多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞与抗体一起施用。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞与抗CD33抗体一起施用。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞与抗CD20抗体一起施用。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞与抗CD138抗体一起施用。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞与抗CD32抗体一起施用。
在另一方面，本文提供了一种治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用：(1)来那度胺；(2)美法仑；以及(3)NK细胞，其中所述NK细胞可有效治疗所述个体的多发性骨髓瘤。在具体实施例中，所述NK细胞是脐带血NK细胞或由脐带血造血细胞例如造血干细胞产生的NK细胞。在另一个实施例中，所述NK细胞已经通过本文所描述的用于产生NK细胞的方法中的任何方法产生，例如，用于使用三阶段法产生NK细胞群的方法。在另一个实施例中，所述NK细胞在所述施用之前已经扩增。在另一个实施例中，所述来那度胺、所述美法仑和/或所述NK细胞彼此分开施用。在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的某些具体实施例中，所述NK细胞群通过如本文所描述的三阶段法产生。
在另一方面，本文提供了一种治疗患有急性骨髓性白血病(AML)的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用NK细胞(任选地通过用IL2和IL12以及IL18、IL12和IL15、IL12和IL18、IL2和IL12和IL15以及IL18或IL2和IL15以及IL18进行预处理而被激活)，其中所述NK细胞可有效治疗所述个体的AML。在具体实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的分离的NK细胞群在所述施用之前已经用IL2、IL12、IL18或IL15中的一种或多种进行预处理。在具体实施例中，所述NK细胞是脐带血NK细胞或由脐带血造血细胞例如造血干细胞产生的NK细胞。在另一个实施例中，所述NK细胞已经通过本文所描述的用于产生NK细胞的方法中的任何方法产生，例如，用于使用如本文阐述的三阶段法产生NK细胞群的方法。在治疗患有AML的个体的方法的某些具体实施例中，所述NK细胞群通过如本文所描述的三阶段法产生。在特定实施例中，待通过前述方法治疗的AML包括难治性AML、不良预后AML或儿童AML。在某些实施例中，所述个体患有使针对AML的至少一种非自然杀伤细胞或非先天淋巴样细胞治疗剂失效的AML。在具体实施例中，所述个体为65岁或更大并且处于第一缓解期。在具体实施例中，在施用所述自然杀伤细胞之前，所述个体已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或两者进行调控。在另一方面，本文提供了一种治疗患有慢性淋巴细胞白血病(CLL)的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效剂量的：(1)来那度胺；(2)美法仑；(3)氟达拉滨；以及(4)NK细胞，例如，使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群，其中所述NK细胞可有效治疗所述个体的所述CLL。在具体实施例中，所述NK细胞是脐带血NK细胞或由脐带血造血细胞例如造血干细胞产生的NK细胞。在另一个实施例中，所述NK细胞已经通过本文所描述的用于产生NK细胞的方法中的任何方法产生，例如，用于使用本文所描述的三阶段法产生NK细胞群的方法。在上述方法中任何方法的具体实施例中，所述来那度胺、所述美法仑、所述氟达拉滨和扩增后的NK细胞分开施用于所述个体。在治疗患有CLL的个体的方法的某些具体实施例中，所述NK细胞群通过如本文所描述的三阶段法产生。
在另一个实施例中，本文提供了一种遏制肿瘤细胞的增殖的方法，所述方法包括使治疗有效量的ILC3细胞群接近所述肿瘤细胞，例如，使所述肿瘤细胞与ILC3细胞群中的细胞接触。在下文中，除非另外提出，否则术语“接近”是指足够接近以引发期望的结果；例如，在某些实施例中，术语接近是指接触。在某些实施例中，所述接触在体外进行。在某些实施例中，所述接触离体进行。在其它实施例中，所述接触在体内进行。在所述遏制肿瘤细胞的增殖的方法中可以使用多个ILC3细胞，所述方法包括使治疗有效量的ILC3细胞群接近肿瘤细胞，例如，使肿瘤细胞与ILC3细胞群中的细胞接触。在某些实施例中，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞、头颈癌细胞或肉瘤细胞。在某些实施例中，所述肿瘤细胞为原发性导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓系淋巴瘤(CML)细胞、慢性骨髓性白血病(CML)细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞或视网膜母细胞瘤细胞。
在一个实施例中，本文提供了用于在遏制肿瘤细胞的增殖的方法中使用的多个ILC3细胞，所述方法包括使肿瘤细胞与所述多个ILC3细胞接触，其中所述ILC3细胞通过本文所描述的方法产生。
在某些实施例中，所述接触在人个体内进行。在某些实施例中，所述方法包括向所述个体施用所述ILC3细胞。在某些实施例中，所述肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。在某些实施例中，所述肿瘤细胞是急性髓系白血病(AML)细胞。在某些实施例中，所述个体患有复发性/难治性AML。在某些实施例中，所述个体患有使针对AML的至少一种非先天淋巴样细胞(ILC)治疗剂失效的AML。在某些实施例中，所述个体为65岁或更大并且处于第一缓解期。在某些实施例中，所述个体在施用所述ILC3细胞之前已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或两者进行调控。在某些实施例中，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞、头颈癌细胞或肉瘤细胞。在某些实施例中，所述肿瘤细胞为原发性导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓系淋巴瘤(CML)细胞、慢性骨髓性白血病(CML)细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞或视网膜母细胞瘤细胞。在某些实施例中，所述肿瘤细胞为实体瘤细胞、肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞或多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞。在某些实施例中，所述ILC3细胞与抗CD33抗体、抗CD20抗体、抗CD138抗体或抗CD32抗体一起施用。在某些实施例中，所述ILC3细胞在所述接触或所述施用之前已被或尚未被低温保存。
分离的ILC3细胞群或其药物组合物的施用可以是全身或局部的。在具体实施例中，施用是肠胃外的。在具体实施例中，向受试者施用分离的ILC3细胞群或其药物组合物是通过注射、输注、静脉内(IV)施用、股动脉内施用或瘤内施用。在具体实施例中，向受试者施用分离的ILC3细胞群或其药物组合物是用装置、基质或支架执行的。在具体实施例中，向受试者施用分离的ILC3细胞群或其药物组合物是通过注射。在具体实施例中，向受试者施用分离的ILC3细胞群或其药物组合物是经由导管。在具体实施例中，ILC3细胞的注射为局部注射。在更具体的实施例中，局部注射直接进入实体瘤(例如，肉瘤)中。在具体实施例中，向受试者施用分离的ILC3细胞群或其药物组合物是通过用注射器注射。在具体实施例中，向受试者施用分离的ILC3细胞群或其药物组合物是经由导引递送。在具体实施例中，通过注射向受试者施用分离的ILC3细胞群或其药物组合物是由腹腔镜检查、内窥镜检查、超声、计算机断层扫描、磁共振或放射学辅助的。
在具体实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的分离的ILC3细胞群在所述接触或接近之前已经用免疫调节化合物例如本文下文中所描述的免疫调节化合物或沙利度胺和/或IL2和IL12以及IL18、IL12和IL15、IL12和IL18、IL2和IL12和IL15以及IL18或IL2和IL15以及IL18进行处理。在具体实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的分离的NK细胞群在所述接触或接近之前已经用IL2、IL12、IL18或IL15中的一种或多种进行处理。在另一个具体实施例中，另外使有效量的免疫调节化合物例如本文下文中所描述的免疫调节化合物或沙利度胺接近肿瘤细胞，例如，使肿瘤细胞与免疫调节化合物或沙利度胺接触。此语境中的“有效量”意指ILC3细胞群中的细胞以及任选地免疫调节化合物或沙利度胺的量使所述肿瘤细胞与当量数量的未与ILC3细胞群中细胞以及任选地免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近的肿瘤细胞相比得到可检测遏制。在另一个具体实施例中，所述方法进一步包括使有效量的抗癌化合物例如下文所描述的抗癌化合物接近肿瘤细胞，例如，使肿瘤细胞与抗癌化合物接触。
在此方法的具体实施例中，肿瘤细胞是血癌细胞。在另一个具体实施例中，肿瘤细胞是实体瘤细胞。在另一个实施例中，肿瘤细胞为原发性导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓系淋巴瘤(CML)细胞、急性骨髓性白血病细胞(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)细胞、成胶质细胞瘤细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、视网膜母细胞瘤细胞、结直肠癌细胞、前列腺癌细胞或结直肠腺癌细胞。在另一个具体实施例中，所述接触或接近在体外进行。在另一个具体实施例中，所述接触或接近离体进行。在另一个具体实施例中，所述接触或接近在体内进行。在更具体的实施例中，所述体内接触或接近在人体内进行。在具体实施例中，所述肿瘤细胞是实体瘤细胞。在具体实施例中，所述肿瘤细胞是肝肿瘤细胞。在具体实施例中，所述肿瘤细胞是肺肿瘤细胞。在具体实施例中，所述肿瘤细胞是胰腺肿瘤细胞。在具体实施例中，所述肿瘤细胞是肾肿瘤细胞。在具体实施例中，所述肿瘤细胞是多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞。在具体实施例中，所述ILC3细胞与抗体一起施用。在具体实施例中，所述ILC3细胞与抗CD33抗体一起施用。在具体实施例中，所述ILC3细胞与抗CD20抗体一起施用。在具体实施例中，所述ILC3细胞与抗CD138抗体一起施用。在具体实施例中，所述ILC3细胞与抗CD32抗体一起施用。
在另一方面，本文提供了一种治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用：(1)来那度胺；(2)美法仑；以及(3)ILC3细胞，其中所述ILC3细胞可有效治疗所述个体的多发性骨髓瘤。在具体实施例中，所述ILC3细胞是脐带血ILC3细胞或由脐带血造血细胞例如造血干细胞产生的ILC3细胞。在另一个实施例中，所述ILC3细胞已经通过本文所描述的用于产生ILC3细胞的方法中的任何方法产生，例如，用于使用三阶段法产生ILC3细胞群的方法。在另一个实施例中，所述ILC3细胞在所述施用之前已经扩增。在另一个实施例中，所述来那度胺、所述美法仑和/或所述ILC3细胞彼此分开施用。在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的某些具体实施例中，所述ILC3细胞群通过如本文所描述的三阶段法产生。
在另一方面，本文提供了一种治疗患有急性骨髓性白血病(AML)的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用ILC3细胞(任选地通过用IL2和IL12以及IL18、IL12和IL15、IL12和IL18、IL2和IL12和IL15以及IL18或IL2和IL15以及IL18进行预处理而被激活)，其中所述ILC3细胞可有效治疗所述个体的AML。在具体实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的分离的NK细胞群在所述施用之前已经用IL2、IL12、IL18或IL15中的一种或多种进行预处理。在具体实施例中，所述ILC3细胞是脐带血ILC3细胞或由脐带血造血细胞例如造血干细胞产生的ILC3细胞。在另一个实施例中，所述ILC3细胞已经通过本文所描述的用于产生ILC3细胞的方法中的任何方法产生，例如，用于使用如本文阐述的三阶段法产生ILC3细胞群的方法。在治疗患有AML的个体的方法的某些具体实施例中，所述ILC3细胞群通过如本文所描述的三阶段法产生。在特定实施例中，待通过前述方法治疗的AML包括难治性AML、不良预后AML或儿童AML。在某些实施例中，所述个体患有使针对AML的至少一种非ILC3细胞或非先天淋巴样细胞治疗剂失效的AML。在具体实施例中，所述个体为65岁或更大并且处于第一缓解期。在具体实施例中，所述个体在施用所述ILC3细胞之前已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或两者进行调控。在另一方面，本文提供了一种治疗患有慢性淋巴细胞白血病(CLL)的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效剂量的：(1)来那度胺；(2)美法仑；(3)氟达拉滨；以及(4)ILC3细胞，例如，使用本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群，其中所述ILC3细胞可有效治疗所述个体的所述CLL。在具体实施例中，所述ILC3细胞是脐带血ILC3细胞或由脐带血造血细胞例如造血干细胞产生的ILC3细胞。在另一个实施例中，所述ILC3细胞已经通过本文所描述的用于产生ILC3细胞的方法中的任何方法产生，例如，用于使用本文所描述的三阶段法产生ILC3细胞群的方法。在上述方法中任何方法的具体实施例中，所述来那度胺、所述美法仑、所述氟达拉滨和扩增后的ILC3细胞分开施用于所述个体。在治疗患有CLL的个体的方法的某些具体实施例中，所述ILC3细胞群通过如本文所描述的三阶段法产生。
在某些实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群被低温保存，例如，使用本文所描述的方法低温保存。在某些实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群在低温保存培养基例如本文所描述的低温保存培养基中低温保存。在具体实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的NK祖细胞群和/或NK细胞群的低温保存包括：(1)制备细胞悬浮溶液，所述细胞悬浮溶液包括使用本文所描述的三阶段法产生的NK祖细胞群和/或NK细胞群；(2)将低温保存培养基添加到来自步骤(1)的细胞悬浮溶液中以获得低温保存的细胞悬浮液；(3)将来自步骤(3)的低温保存的细胞悬浮液冷却以获得低温保存的样品；以及(4)在-80℃以下储存低温保存的样品。
在上述治疗或肿瘤遏制方法的某些实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群与其它自然杀伤细胞例如从胎盘灌注液、脐带血或外周血中分离或通过不同方法由造血细胞产生的自然杀伤细胞组合。在具体实施例中，自然杀伤细胞群与来自另一个来源或通过不同方法制得的自然杀伤细胞按以下比率组合：约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等。
在某些实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群被低温保存，例如，使用本文所描述的方法低温保存。在某些实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群在低温保存培养基例如本文所描述的低温保存培养基中低温保存。在具体实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的ILC3祖细胞群和/或ILC3细胞群的低温保存包括：(1)制备细胞悬浮溶液，所述细胞悬浮溶液包括使用本文所描述的三阶段法产生的ILC3祖细胞群和/或ILC3细胞群；(2)将低温保存培养基添加到来自步骤(1)的细胞悬浮溶液中以获得低温保存的细胞悬浮液；(3)将来自步骤(3)的低温保存的细胞悬浮液冷却以获得低温保存的样品；以及(4)在-80℃以下储存低温保存的样品。
在上述治疗或肿瘤遏制方法的某些实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群与其它ILC3细胞例如从胎盘灌注液、脐带血或外周血中分离或通过不同方法由造血细胞产生的ILC3细胞组合。在具体实施例中，ILC3细胞群与来自另一个来源或通过不同方法制得的ILC3细胞按以下比率组合：约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等。
在另一方面，本文提供了一种在化疗后修复胃肠道的方法，所述方法包括向个体施用多个ILC3细胞，其中所述ILC3细胞通过本文所描述的三阶段法产生。在所述在化疗后修复胃肠道的方法中可以使用多个ILC3细胞，所述方法包括向个体施用多个ILC3细胞，其中所述ILC3细胞通过本文所描述的三阶段法产生。
在另一方面，本文提供了一种保护个体免受辐射伤害的方法，所述方法包括向个体施用多个ILC3细胞，其中所述ILC3细胞通过本文所描述的三阶段法产生。在所述保护个体免受辐射伤害的方法中可以使用多个ILC3细胞，所述方法包括向个体施用多个ILC3细胞，其中所述ILC3细胞通过本文所描述的三阶段法产生。在所述方法的某些方面，所述ILC3细胞用作骨髓移植辅料。
在另一方面，本文提供了一种重构个体的胸腺的方法，所述方法包括向个体施用多个ILC3细胞，其中所述ILC3细胞通过本文所描述的三阶段法产生。在所述重构个体的胸腺的方法中可以使用多个ILC3细胞，所述方法包括向个体施用多个ILC3细胞，其中所述ILC3细胞通过本文所描述的三阶段法产生。
在另一方面，本文提供了一种组合物，所述组合物包括通过本文所描述的三阶段法产生的分离的NK细胞。在具体实施例中，所述NK细胞由造血细胞例如从胎盘灌注液、脐带血和/或外周血中分离的造血干细胞或祖细胞产生。在另一个具体实施例中，所述NK细胞占所述组合物中的细胞的至少70％。在另一个具体实施例中，所述NK细胞占所述组合物中的细胞的至少80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些实施例中，所述组合物中至少80％、82％、84％、86％、88％或90％的NK细胞是CD3-和CD56+。在某些实施例中，所述组合物中至少65％、70％、75％、80％、82％、84％、86％、88％或90％的NK细胞是CD16-。在某些实施例中，所述组合物中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的NK细胞是CD94+。
在某些方面，本文提供了一种自然杀伤细胞群CD56+CD3-CD117+CD11a+，其中所述自然杀伤细胞表达穿孔素和/或EOMES并且不表达RORγt、芳烃受体和IL1R1中的一种或多种。在某些方面，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和EOMES并且不表达RORγt、芳烃受体或IL1R1中的任何一种。在某些方面，所述自然杀伤细胞另外表达T-bet、GZMB、NKp46、NKp30和NKG2D。在某些方面，所述自然杀伤细胞表达CD94。在某些方面，所述自然杀伤细胞不表达CD94。
在某些方面，本文提供了一种ILC3细胞群CD56+CD3-CD117+CD11a-，其中所述ILC3细胞表达RORγt、芳烃受体和IL1R1中的一种或多种并且不表达CD94、穿孔素和EOMES中的一种或多种。在某些方面，所述ILC3细胞表达RORγt、芳烃受体和IL1R1并且不表达CD94、穿孔素或EOMES中的任何一种。在某些方面，所述ILC3细胞另外表达CD226和/或2B4。在某些方面，所述ILC3细胞另外表达IL-22、TNFα和DNAM-1中的一种或多种。在某些方面，所述ILC3细胞表达CD226、2B4、IL-22、TNFα和DNAM-1。
在某些方面，本文提供了一种产生包括自然杀伤细胞和ILC3细胞的细胞群的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；以及(d)从所述第三细胞群中分离CD11a+细胞和CD11a-细胞；以及(e)将所述CD11a+细胞与所述CD11a-细胞按以下比率组合以产生第四细胞群：50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40或1:50。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以50:1的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以20:1的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以10:1的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以5:1的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以1:1的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以1:5的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以1:10的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以1:20的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以1:50的比率组合。
在某些方面，所述群中的多个NK细胞以比外周血自然杀伤细胞可检测地更高的水平表达以下中的一种或多种：microRNAS dme-miR-7、hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsa-let-7e、hsa-let-7g、hsa-miR-103、hsa-miR-106a、hsa-miR-10b、hsa-miR-1183、hsa-miR-124、hsa-miR-1247、hsa-miR-1248、hsa-miR-1255A、hsa-miR-126、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-155、hsa-miR-15a、hsa-miR-16、hsa-miR-17、hsa-miR-181a、hsa-miR-182、hsa-miR-192、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-200a、hsa-miR-20a、hsa-miR-214、hsa-miR-221、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-30b、hsa-miR-30c、hsa-miR-31、hsa-miR-335、hsa-miR-374b、hsa-miR-454、hsa-miR-484、hsa-miR-513C、hsa-miR-516-3p、hsa-miR-520h、hsa-miR-548K、hsa-miR-548P、hsa-miR-600、hsa-miR-641、hsa-miR-643、hsa-miR-874、hsa-miR-875-5p和hsa-miR-92a-2。在某些方面，所述群中的多个NK细胞以比外周血自然杀伤细胞可检测地更低的水平表达以下中的一种或多种：microRNASmiR188-5p、miR-339-5p、miR-19a、miR-34c、miR-18a、miR-500、miR-22、miR-222、miR-7a、miR-532-3p、miR-223、miR-26b、miR-26a、miR-191、miR-181d、miR-322和miR342-3p。在某些方面，所述群中的多个NK细胞以与外周血自然杀伤细胞相当的水平表达microRNAS miR-181a、miR-30b和miR30c中的一种或多种。
在具体实施例中，所述NK细胞来自单个个体，即，所述造血干细胞和祖细胞来自单个个体。在更具体的实施例中，所述NK细胞包括来自至少两个不同个体的自然杀伤细胞，即，所述造血干细胞和祖细胞来自至少两个不同个体。在另一个具体实施例中，所述NK细胞来自与意在用NK细胞治疗的个体不同的个体，即，所述造血干细胞和祖细胞来自与意在用NK细胞治疗的个体不同的个体。在另一个具体实施例中，所述NK细胞已经与免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近的量和时间足以使所述NK细胞比当量数量的未与所述免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近的自然杀伤细胞即NK细胞可检测地更多地表达颗粒酶B或穿孔素。在另一个具体实施例中，包括所述NK细胞的组合物另外包括免疫调节化合物或沙利度胺。在某些实施例中，免疫调节化合物为下文所描述的化合物，例如，被氨基取代的异吲哚啉化合物。在某些实施例中，免疫调节化合物为来那度胺。在某些实施例中，免疫调节化合物为泊马度胺。
在另一个具体实施例中，包括所述NK细胞的组合物另外包括一种或多种抗癌化合物，例如，下文所描述的抗癌化合物中的一种或多种。
在更具体的实施例中，组合物包括通过本文所描述的三阶段法产生的NK细胞和来自另一个来源或通过另一种方法制得的自然杀伤细胞。在具体实施例中，所述另一个来源为胎盘血和/或脐带血。在另一个具体实施例中，所述另一个来源为外周血。在更具体的实施例中，NK细胞与来自另一个来源或通过另一种方法制得的自然杀伤细胞按以下比率组合：约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等。
在另一个具体实施例中，组合物包括使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞和分离的胎盘灌注液或分离的胎盘灌注液细胞。在更具体的实施例中，所述胎盘灌注液与所述NK细胞来自同一个体。在另一个更具体的实施例中，所述胎盘灌注液包括与所述NK细胞来自不同个体的胎盘灌注液。在另一个具体实施例中，所述胎盘灌注液中的所有或基本上所有(例如，大于90％、95％、98％或99％)细胞为胎儿细胞。在另一个具体实施例中，胎盘灌注液或胎盘灌注液细胞包括胎儿细胞和母体细胞。在更具体的实施例中，所述胎盘灌注液中的胎儿细胞占所述灌注液中的细胞的不到约90％、80％、70％、60％或50％。在另一个具体实施例中，所述灌注液通过使0.9％NaCl溶液通过胎盘脉管系统来获得。在另一个具体实施例中，所述灌注液包括培养基。在另一个具体实施例中，所述灌注液已经进行了处理以去除红细胞。在另一个具体实施例中，所述组合物包括免疫调节化合物，例如，下文所描述的免疫调节化合物，例如，被氨基取代的异吲哚啉化合物。在另一个具体实施例中，组合物另外包括一种或多种抗癌化合物，例如，下文所描述的抗癌化合物中的一种或多种。
在另一个具体实施例中，组合物包括使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞以及胎盘灌注液细胞。在更具体的实施例中，所述胎盘灌注液细胞与所述NK细胞来自同一个体。在另一个更具体的实施例中，所述胎盘灌注液细胞与所述NK细胞来自不同个体。在另一个具体实施例中，组合物包括分离的胎盘灌注液和分离的胎盘灌注液细胞，其中所述分离的胎盘灌注液和所述分离的胎盘灌注液细胞来自不同个体。在包括胎盘灌注液的上述实施例中的任何实施例的另一个更具体的实施例中，所述胎盘灌注液包括来自至少两个个体的胎盘灌注液。在包括胎盘灌注液细胞的上述实施例中的任何实施例的另一个更具体的实施例中，所述分离的胎盘灌注液细胞来自至少两个个体。在另一个具体实施例中，所述组合物包括免疫调节化合物。在另一个具体实施例中，组合物另外包括一种或多种抗癌化合物，例如，下文所描述的抗癌化合物中的一种或多种。
在另一方面，本文提供了一种组合物，例如，药物组合物，所述组合物包括分离的NK细胞群，例如，通过本文所描述的三阶段法的任何实施例产生的NK细胞群。在具体实施例中，所述分离的NK细胞群由造血细胞例如从胎盘例如从胎盘灌注液、脐带血和/或外周血中分离的造血干细胞或祖细胞产生。在另一个具体实施例中，所述分离的NK细胞群占所述组合物中的细胞的至少70％。在另一个具体实施例中，所述分离的NK细胞群占包括所述组合物中的细胞的至少80％、85％、90％、95％、98％或99％。在另一个具体实施例中，所述NK细胞占所述组合物中的细胞的至少70％。在某些实施例中，所述组合物中至少80％、82％、84％、86％、88％或90％的NK细胞是CD3-和CD56+。在某些实施例中，所述组合物中至少65％、70％、75％、80％、82％、84％、86％、88％或90％的NK细胞是CD16-。在某些实施例中，所述组合物中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的NK细胞是CD94+。
在另一个具体实施例中，所述组合物中的所述分离的NK细胞来自单个个体，即，所述造血干细胞和祖细胞来自单个个体。在更具体的实施例中，所述分离的NK细胞包括来自至少两个不同个体的NK细胞，即，所述造血干细胞和祖细胞来自至少两个不同个体。在另一个具体实施例中，所述组合物中的所述分离的NK细胞来自与意在用NK细胞治疗的个体不同的个体，即，所述造血干细胞和祖细胞来自与意在用NK细胞治疗的个体不同的个体。在另一个具体实施例中，所述NK细胞已经与免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近的量和时间足以使所述NK细胞比当量数量的未与所述免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近的自然杀伤细胞即NK细胞可检测地更多地表达颗粒酶B或穿孔素。在另一个具体实施例中，所述组合物另外包括免疫调节化合物或沙利度胺。在某些实施例中，免疫调节化合物为下文所描述的化合物。
在另一个具体实施例中，组合物另外包括一种或多种抗癌化合物，例如，下文所描述的抗癌化合物中的一种或多种。
在更具体的实施例中，组合物包括来自另一个来源或通过另一种方法制得的NK细胞。在具体实施例中，所述另一个来源为胎盘血和/或脐带血。在另一个具体实施例中，所述另一个来源为外周血。在更具体的实施例中，所述组合物中的NK细胞群与来自另一个来源或通过另一种方法制得的NK细胞按以下比率组合：约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等。
在另一个具体实施例中，组合物包括NK细胞群和分离的胎盘灌注液或分离的胎盘灌注液细胞。在更具体的实施例中，所述胎盘灌注液与所述NK细胞群来自同一个体。在另一个更具体的实施例中，所述胎盘灌注液包括与所述NK细胞群来自不同个体的胎盘灌注液。在另一个具体实施例中，所述胎盘灌注液中的所有或基本上所有(例如，大于90％、95％、98％或99％)细胞为胎儿细胞。在另一个具体实施例中，胎盘灌注液或胎盘灌注液细胞包括胎儿细胞和母体细胞。在更具体的实施例中，胎儿细胞占所述胎盘灌注液中的细胞的不到约90％、80％、70％、60％或50％。在另一个具体实施例中，所述灌注液通过使0.9％NaCl溶液通过胎盘脉管系统来获得。在另一个具体实施例中，所述灌注液包括培养基。在另一个具体实施例中，所述灌注液已经进行了处理以去除红细胞。在另一个具体实施例中，所述组合物包括免疫调节化合物，例如，下文所描述的免疫调节化合物，例如，被氨基取代的异吲哚啉化合物。在另一个具体实施例中，组合物另外包括一种或多种抗癌化合物，例如，下文所描述的抗癌化合物中的一种或多种。
在另一个具体实施例中，组合物包括NK细胞群和胎盘灌注液细胞。在更具体的实施例中，所述胎盘灌注液细胞与所述NK细胞群来自同一个体。在另一个更具体的实施例中，所述胎盘灌注液细胞与所述NK细胞群来自不同个体。在另一个具体实施例中，组合物包括分离的胎盘灌注液和分离的胎盘灌注液细胞，其中所述分离的胎盘灌注液和所述分离的胎盘灌注液细胞来自不同个体。在包括胎盘灌注液的上述实施例中的任何实施例的另一个更具体的实施例中，所述胎盘灌注液包括来自至少两个个体的胎盘灌注液。在包括胎盘灌注液细胞的上述实施例中的任何实施例的另一个更具体的实施例中，所述分离的胎盘灌注液细胞来自至少两个个体。在另一个具体实施例中，所述组合物包括免疫调节化合物。在另一个具体实施例中，组合物另外包括一种或多种抗癌化合物，例如，下文所描述的抗癌化合物中的一种或多种。
3.1.术语
如本文所使用的，术语“免疫调节化合物”和“IMiDTM”不涵盖沙利度胺。
如本文所使用的，“来那度胺”意指3-(4'氨基异吲哚啉-1'-酮)-1-哌啶-2,6-二酮(化学文摘服务社(Chemical Abstracts Service)命名)或3-(4-氨基-1,3-二氢-1-氧代-2H-异吲哚-2-基)-2,6-哌啶二酮(国际纯粹与应用化学联合会(International Union ofPure and Applied Chemistry，IUPAC)命名)。如本文所使用的，“泊马度胺”意指4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮。
如本文所使用的，“多能”当指细胞时意指细胞具有分化成另一种细胞类型的细胞的能力。在某些实施例中，“多能细胞”是能够生长成哺乳动物的大约260种细胞类型的子集的细胞。不同于多潜能细胞，多能细胞不具备形成所有细胞类型的能力。
如本文所使用的，“饲养细胞”是指与第二类型的细胞共培养以提供第二类型的细胞可以维持在其中并且或许增殖的环境的一种类型的细胞。在不受任何理论束缚的情况下，饲养细胞可以向靶细胞提供例如肽、多肽、电信号、有机分子(例如，类固醇)、核酸分子、生长因子(例如，bFGF)、其它因子(例如，细胞因子)和代谢营养素。在某些实施例中，饲养细胞以单层生长。
如本文所使用的，使用本文所描述的方法产生的“自然杀伤细胞”或“NK细胞”在没有进一步修饰的情况下包含来自任何组织来源的自然杀伤细胞。
如本文所使用的，使用本文所描述的方法产生的“ILC3细胞”在无进一步修饰的情况下包含来自任何组织来源的ILC3细胞。
如本文所使用的，“胎盘灌注液”意指已经通过胎盘例如人胎盘的至少一部分例如通过胎盘脉管系统的灌注溶液并且包含在通过胎盘期间通过灌注溶液收集的多个细胞。
如本文所使用的，“胎盘灌注液细胞”意指从胎盘灌注液中分离或可分离的有核细胞，例如，总有核细胞。
如本文所使用的，“肿瘤细胞遏制”、“肿瘤细胞增殖的遏制”等包含通过以下来减缓肿瘤细胞群的生长：例如通过杀伤所述肿瘤细胞群中的肿瘤细胞中的一个或多个，例如通过使例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞或NK细胞群与肿瘤细胞群接触或接近，例如使肿瘤细胞群与使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞或NK细胞群接触。在某些实施例中，所述接触在体外或离体进行。在其它实施例中，所述接触在体内进行。
如本文所使用的，术语“造血细胞”包含造血干细胞和造血祖细胞。
如本文所使用的，“不确定组分”是培养基领域中指代其成分一般没有提供或量化的组分的专门术语。“不确定组分”的实例包含但不限于血清，例如人血清(例如，人AB血清)和胎儿血清(例如，胎牛血清或胎小牛血清))。
如本文所使用的，“+”当用于指示特定细胞标志物的存在时意指细胞标志物：在相对于同种型对照的荧光激活细胞分选中可检测地存在；或者在定量或半定量RT-PCR中在背景上方可检测到。
如本文所使用的，“-”当用于指示特定细胞标志物的存在时意指细胞标志物：在相对于同种型对照的荧光激活细胞分选中不存在；或者在定量或半定量RT-PCR中在背景上方不可检测到。
附图说明
图1示出了化合物CRL1-CRL11对NK细胞的扩增。
图2示出了化合物CRL12-CRL22对NK细胞的扩增。
图3示出了NK细胞相对于SR1阳性对照的扩增。
图4示出了衍生出NK细胞的CD34+细胞的扩增。
图5示出了扩增后的NK培养物的细胞毒性。
图6示出了PNK细胞高表达编码细胞毒性机制的基因。图6A：CYNK细胞与外周血源性NK细胞(PB-NK)以1:1的比率组合并且使用10X Genomics Chromium平台和Illumina测序在单细胞水平上进行基因表达分析。生物信息学分析利用了10XGenomics Cell Ranger分析流程。转录分析仅限于颗粒酶B(GZMB)表达性细胞。图6B：将PNK细胞和PB-NK细胞描绘为不同的群的代表性tSNE绘图。图6C：选定的NK细胞相关基因的tSNE绘图。数据代表两个供体。
图7示出了PNK细胞和PB-NK细胞差异地表达编码NK细胞受体的基因。在外周血NK细胞(PB-NK)和CD11a+珠纯化的PNK细胞中通过实时定量PCR分析的选定的NK细胞受体基因的表达。上文中的替代性名称指示选定的标志物的直方图。数据表示CYNK细胞和PBNK细胞的三个供体的平均值±SD(n＝3)。*p<0.05；**p<0.005；***p<0.001。
图8示出了PB-NK细胞和CYNK细胞的门控策略。将CYNK细胞和PBMC细胞解冻并用靶向NK细胞受体的荧光团偶联抗体进行染色。所述图展现了代表性点绘图和用于鉴定CYNK细胞和PB-NK细胞的门控策略。关于群的进一步表征，参见图9。
图9示出了CYNK细胞和PB-NK细胞上的表面蛋白的差异表达。如图8所指示的，对CYNK细胞和PB-NK细胞进行预先门控。
图10示出了CYNK细胞基于表面蛋白表达形成不同于PB-NK细胞的细胞群。展现了CYNK细胞和PB-NK细胞基于其表面标志物的差异聚类的tSNE绘图。tSNE绘图使用FlowJo软件由流式细胞术数据生成。
具体实施方式
本文提供了由造血细胞例如造血干细胞或祖细胞产生并扩增NK细胞和/或ILC3细胞的新型方法。本文还提供了由造血细胞例如造血干细胞或祖细胞产生NK细胞群和/或ILC3细胞群的方法，例如，三阶段法。用于产生NK细胞和/或ILC3细胞以及NK细胞群和/或ILC3细胞群的造血细胞(例如，CD34+造血干细胞)可以从任何来源获得，例如但不限于胎盘、脐带血、胎盘血、外周血、脾或肝。在某些实施例中，NK细胞和/或ILC3细胞或NK细胞群和/或ILC3细胞群由扩增后的造血细胞例如造血干细胞和/或造血祖细胞产生。在一个实施例中，造血细胞从此类细胞的来源例如胎盘，例如从胎盘灌注液、脐带血、胎盘血、外周血、脾、肝(例如，胎肝)和/或骨髓收集。
用于产生NK细胞和/或ILC3细胞以及NK细胞群和/或ILC3细胞群的造血细胞可以从任何动物物种获得。在某些实施例中，造血干细胞或祖细胞是哺乳动物细胞。在具体实施例中，所述造血干细胞或祖细胞是人细胞。在具体实施例中，所述造血干细胞或祖细胞是灵长类动物细胞。在具体实施例中，所述造血干细胞或祖细胞是犬科动物细胞。在具体实施例中，所述造血干细胞或祖细胞是啮齿动物细胞。
5.1.造血细胞
可用于本文所公开方法中的造血细胞可以是能够分化成NK细胞和/或ILC3细胞的任何造血细胞，例如，前体细胞、造血祖细胞、造血干细胞等。造血细胞可以从如骨髓、脐带血、胎盘血、外周血、肝等或其组合等组织来源获得。造血细胞可以从胎盘获得。在具体实施例中，造血细胞从胎盘灌注液获得。在一个实施例中，造血细胞不从脐带血获得。在一个实施例中，造血细胞不从外周血获得。来自胎盘灌注液的造血细胞可以包括胎儿造血细胞和母体造血细胞的混合物，例如，其中母体细胞占造血细胞总数的大于5％的混合物。在某些实施例中，来自胎盘灌注液的造血细胞包括至少约90％、95％、98％、99％或99.5％的胎儿细胞。
在另一个具体实施例中，由其产生了使用本文所描述的三阶段法产生NK细胞群和/或ILC3细胞群的造血细胞例如造血干细胞或祖细胞从胎盘灌注液、脐带血、胎肝、动员的外周血或骨髓获得。在另一个具体实施例中，由其产生了使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群和/或ILC3细胞群的造血细胞例如造血干细胞或祖细胞是来自胎盘灌注液和脐带血(例如，来自与灌注液相同的胎盘的脐带血)的组合细胞。在另一个具体实施例中，所述脐带血从除获得所述胎盘灌注液的胎盘以外的胎盘中分离。在某些实施例中，组合细胞可以通过汇集或组合脐带血和胎盘灌注液来获得。在某些实施例中，脐带血和胎盘灌注液按以下体积比组合以获得组合细胞：100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等。在具体实施例中，脐带血和胎盘灌注液以10:1到1:10、5:1到1:5或3:1到1:3的比率组合。在另一个具体实施例中，脐带血和胎盘灌注液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比率组合。在更具体的实施例中，脐带血和胎盘灌注液以8.5:1.5(85％:15％)的比率组合。
在某些实施例中，脐带血和胎盘灌注液以按总有核细胞(TNC)含量计的以下比率组合以获得组合细胞：100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等。在具体实施例中，脐带血和胎盘灌注液以10:1到10:1、5:1到1:5或3:1到1:3的比率组合。在另一个具体实施例中，脐带血和胎盘灌注液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比率组合。
在另一个具体实施例中，由其产生了使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群和/或ILC3细胞群的造血细胞例如造血干细胞或祖细胞来自脐带血和胎盘灌注液两者，但其中所述脐带血是从除获得所述胎盘灌注液的胎盘以外的胎盘中分离的。
在某些实施例中，造血细胞是CD34+细胞。在具体实施例中，可用于本文所公开的方法中的造血细胞是CD34+CD38+或CD34+CD38-。在更具体的实施例中，造血细胞是CD34+CD38-Lin-。在另一个具体实施例中，造血细胞是以下中的一种或多种：CD2-、CD3-、CD11b-、CD11c-、CD14-、CD16-、CD19-、CD24-、CD56-、CD66b-和/或血型糖蛋白A-。在另一个具体实施例中，造血细胞是CD2-、CD3-、CD11b-、CD11c-、CD14-、CD16-、CD19-、CD24-、CD56-、CD66b-和血型糖蛋白A-。在另一个更具体的实施例中，造血细胞是CD34+CD38-CD33-CD117-。在另一个更具体的实施例中，造血细胞是CD34+CD38-CD33-CD117-CD235-CD36-。
在另一个实施例中，造血细胞是CD45+。在另一个具体实施例中，造血细胞是CD34+CD45+。在另一个实施例中，造血细胞是Thy-1+。在具体实施例中，造血细胞是CD34+Thy-1+。在另一个实施例中，造血细胞是CD133+。在具体实施例中，造血细胞是CD34+CD133+或CD133+Thy-1+。在另一个具体实施例中，CD34+造血细胞是CXCR4+。在另一个具体实施例中，CD34+造血细胞是CXCR4-。在另一个实施例中，造血细胞针对KDR(血管生长因子受体2)呈阳性。在具体实施例中，造血细胞是CD34+KDR+、CD133+KDR+或Thy-1+KDR+。在某些其它实施例中，造血细胞针对醛脱氢酶(ALDH+)呈阳性，例如，细胞是CD34+ALDH+。
在某些其它实施例中，CD34+细胞是CD45-。在具体实施例中，CD34+细胞例如CD34+、CD45-细胞表达以下中的一种或多种或全部：miRNAhsa-miR-380、hsa-miR-512、hsa-miR-517、hsa-miR-518c、hsa-miR-519b、hsa-miR-520a、hsa-miR-337、hsa-miR-422a、hsa-miR-549和/或hsa-miR-618。
在某些实施例中，造血细胞是CD34-。
造血细胞也可以缺乏指示谱系定向(lineage commitment)或发育天然性(developmal naiveté)的缺乏的某些标志物。例如，在另一个实施例中，造血细胞是HLA-DR-。在具体实施例中，造血细胞是CD34+HLA-DR-、CD133+HLA-DR-、Thy-1+HLA-DR-或ALDH+HLA-DR-。在另一个实施例中，造血细胞针对谱系标志物CD2、CD3、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b和血型糖蛋白A中的一种或多种或全部呈阴性。
因此，在存在指示未分化状态的标志物的基础上或者在不存在指示已经发生了至少某种谱系分化的谱系标志物的基础上，可以选择造血细胞用于本文所公开的方法中。下文详细讨论了在存在或不存在特异性标志物的基础上分离细胞(包含造血细胞)的方法。
在本文所提供的方法中使用的造血细胞可以是基本上同质的群，例如，包括至少约95％、至少约98％或至少约99％的来自单个组织来源的造血细胞的群或者包括表现出相同造血细胞相关细胞标志物的造血细胞的群。例如，在各个实施例中，造血细胞可以包括至少约95％、98％或99％的来自骨髓、脐带血、胎盘血、外周血或胎盘例如胎盘灌注液的造血细胞。
在本文所提供的方法中使用的造血细胞可以从单个个体例如从单个胎盘或从多个个体获得，例如，可以汇集。在造血细胞从多个个体获得并被汇集的情况下，造血细胞可以从相同组织来源获得。因此，在各个实施例中，汇集的造血细胞全部来自胎盘例如胎盘灌注液、全部来自胎盘血、全部来自脐带血、全部来自外周血等。
在某些实施例中，在本文所公开的方法中使用的造血细胞包括来自两种或更多种组织来源的造血细胞。例如，在某些实施例中，当来自两个或更多个来源的造血细胞被组合以用于本文的方法中时，用于使用本文所描述的三阶段法产生自然杀伤细胞的多个造血细胞包括来自胎盘例如胎盘灌注液的造血细胞。在各个实施例中，用于产生使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群和/或ILC3细胞群的造血细胞包括来自以下的造血细胞：胎盘和脐带血；胎盘和外周血；胎盘和胎盘血或胎盘和骨髓。在一个实施例中，造血细胞包括来自胎盘灌注液的造血细胞结合来自脐带血的造血细胞，其中脐带血和胎盘来自相同个体，即，其中灌注液和脐带血是匹配的。在造血细胞包括来自两种组织来源的造血细胞的实施例中，来自所述来源的造血细胞可以按以下比率组合：例如，1:10、2:9、3:8、4:7:、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。
5.1.1.胎盘造血干细胞
在某些实施例中，在本文所提供的方法中使用的造血细胞是胎盘造血细胞。在一个实施例中，胎盘造血细胞是CD34+。在具体实施例中，胎盘造血细胞主要(例如，至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％)是CD34+CD38-细胞。在另一个具体实施例中，胎盘造血细胞主要(例如，至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％)是CD34+CD38+细胞。胎盘造血细胞可以通过本领域技术人员已知的任何手段例如通过灌注从产后哺乳动物(例如，人)胎盘获得。
在另一个实施例中，胎盘造血细胞是CD45-。在具体实施例中，造血细胞是CD34+CD45-。在另一个具体实施例中，胎盘造血细胞是CD34+CD45+。
5.2.自然杀伤细胞和/或ILC3细胞以及自然杀伤细胞群和/或ILC3细胞群的产生
通过本发明方法产生NK细胞和/或ILC3细胞以及NK细胞群和/或ILC3细胞群包括对造血细胞群进行扩增。在细胞扩增期间，造血细胞群内的多个造血细胞分化成NK细胞和/或ILC3细胞。在一方面，本文提供了一种产生NK细胞的方法，所述方法包括：在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞例如CD34+干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；随后在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及随后在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群，其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-，并且其中至少70％例如至少80％的所述自然杀伤细胞是活的。在某些实施例中，此类自然杀伤细胞包括自然杀伤细胞CD16-。在某些实施例中，此类自然杀伤细胞包括自然杀伤细胞CD94+。在某些实施例中，此类自然杀伤细胞包括自然杀伤细胞CD94+或CD16+。在某些实施例中，此类自然杀伤细胞包括自然杀伤细胞CD94-或CD16-。在某些实施例中，此类自然杀伤细胞包括自然杀伤细胞CD94+和CD16+。在某些实施例中，此类自然杀伤细胞包括自然杀伤细胞CD94-和CD16-。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生NK细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-和CD11a+。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生NK细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞因子(SCF)和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-和CD11a+。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生NK细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏SCF、干细胞动员剂和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-和CD11a+。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生NK细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；以及(d)从所述第三细胞群中分离CD11a+细胞以产生第四细胞群；其中所述第四细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-和CD11a+。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在上述实施例中的任何实施例中的某些实施例中，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和EOMES。在某些实施例中，所述自然杀伤细胞不表达RORγt或IL1R1。
在一方面，本文提供了一种产生ILC3细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生ILC3细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括干细胞动员剂、IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生ILC3细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括SCF、IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生ILC3细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括干细胞动员剂、SCF、IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在一方面，本文提供了一种产生ILC3细胞的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；以及(d)从所述第三细胞群中分离CD11a-细胞或从其中去除CD11a+细胞以产生第四细胞群；其中所述第四细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在某些实施例中，所述ILC3细胞表达RORγt和IL1R1。在某些实施例中，所述ILC3细胞不表达穿孔素或EOMES。
5.2.1.使用三阶段法的NK细胞群和/或ILC3细胞群产生
在一个实施例中，本文提供了一种产生NK细胞群和/或ILC3细胞群的三阶段法。在某些实施例中，扩增和分化如本文所描述的造血细胞以根据本文所描述的三阶段法产生NK细胞群和/或ILC3细胞群的方法包括将包括所述造血细胞的细胞群维持在介于约2×104个细胞每毫升与约6×106个细胞每毫升之间。在某些方面，所述造血干细胞或祖细胞最初以1×104个到1×105个细胞/毫升接种于所述第一培养基中。在具体方面，所述造血干细胞或祖细胞最初以约3×104个细胞/毫升接种于所述第一培养基中。
在某些方面，所述第一细胞群最初以5×104个到5×105个细胞/毫升接种于所述第二培养基中。在具体方面，所述第一细胞群最初以约1×105个细胞/毫升接种于所述第二培养基中。
在某些方面，所述第二细胞群最初以1×105个到5×106个细胞/毫升接种于所述第三培养基中。在某些方面，所述第二细胞群最初以1×105个到1×106个细胞/毫升接种于所述第三培养基中。在具体方面，所述第二细胞群最初以约5×105个细胞/毫升接种于所述第三培养基中。在更具体的方面，在旋转瓶中，所述第二细胞群最初以约5×105个细胞/毫升接种于所述第三培养基中。在具体方面，所述第二细胞群最初以约3×105个细胞/毫升接种于所述第三培养基中。在更具体的方面，在静置培养中，所述第二细胞群最初以约3×105个细胞/毫升接种于所述第三培养基中。
在某个实施例中，三阶段法包括第一阶段(“阶段1”)，所述第一阶段包括将造血干细胞或祖细胞例如CD34+干细胞或祖细胞在第一培养基中培养指定的时间段，例如，如本文所描述的，以产生第一细胞群。在某些实施例中，第一培养基包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)。在某些实施例中，第一培养基除了干细胞动员剂和Tpo外还包括LMWH、Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种。在具体实施例中，第一培养基除了干细胞动员剂和Tpo外还包括LMWH、Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在具体实施例中，第一培养基缺乏添加的LMWH。在具体实施例中，第一培养基缺乏添加的脱硫酸化糖胺聚糖。在具体实施例中，第一培养基缺乏LMWH。在具体实施例中，第一培养基缺乏脱硫酸化糖胺聚糖。在具体实施例中，除了干细胞动员剂和Tpo外，Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在具体实施例中，第一培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞抑制蛋白-1α(MIP-1α)或两者。
在某些实施例中，随后，在“阶段2”中，将所述细胞在第二培养基中培养指定的时间段，例如，如本文所描述的，以产生第二细胞群。在某些实施例中，第二培养基包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo。在某些实施例中，第二培养基除了干细胞动员剂和IL-15外还包括LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种。在某些实施例中，第二培养基除了干细胞动员剂和IL-15外还包括LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在具体实施例中，第二培养基缺乏添加的LMWH。在具体实施例中，第二培养基缺乏添加的脱硫酸化糖胺聚糖。在具体实施例中，第二培养基缺乏肝素，例如，LMWH。在具体实施例中，第二培养基缺乏脱硫酸化糖胺聚糖。在某些实施例中，第二培养基除了干细胞动员剂和IL-15外还包括Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在具体实施例中，第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞抑制蛋白-1α(MIP-1α)或两者。
在某些实施例中，随后，在“阶段3”中，将所述细胞在第三培养基中培养指定的时间段，例如，如本文所描述的，以产生第三细胞群，例如，自然杀伤细胞。在某些实施例中，第三培养基包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH。在某些实施例中，第三培养基除了IL-2和IL-15外还包括SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种。在某些实施例中，第三培养基除了IL-2和IL-15外还包括SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在具体实施例中，第一培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L中的一种、两种或所有三种。在具体实施例中，第三培养基缺乏添加的脱硫酸化糖胺聚糖。在具体实施例中，第三培养基缺乏脱硫酸化糖胺聚糖。在具体实施例中，第三培养基缺乏肝素，例如，LMWH。
在具体实施例中，三阶段法用于产生NK细胞群和/或ILC3细胞群。在某些实施例中，三阶段法在不存在基质饲养细胞支持时进行。在某些实施例中，三阶段法在不存在外源地添加的类固醇(例如，可的松(cortisone)、氢化可的松(hydrocortisone)或其衍生物)时进行。
在某些方面，三阶段法中使用的所述第一培养基包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)。在某些方面，三阶段法中使用的第一培养基除了干细胞动员剂和Tpo外还包括低分子量肝素(LMWH)、Flt-3配体(Flt-3L)、干细胞因子(SCF)、IL-6、IL-7、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)中的一种或多种。在某些方面，三阶段法中使用的第一培养基除了干细胞动员剂和Tpo外还包括LMWH、Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，三阶段法中使用的第一培养基除了干细胞动员剂和Tpo外还包括Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在具体方面，第一培养基缺乏添加的LMWH。在具体方面，第一培养基缺乏添加的脱硫酸化糖胺聚糖。在具体实施例中，第一培养基缺乏LMWH。在具体方面，第一培养基缺乏脱硫酸化糖胺聚糖。在某些方面，所述Tpo在所述第一培养基中以1ng/mL到100ng/mL、1ng/mL到50ng/mL、20ng/mL到30ng/mL或约25ng/mL的浓度存在。在其它方面，所述Tpo在第一培养基中以100ng/mL到500ng/mL、200ng/mL到300ng/mL或约250ng/mL的浓度存在。在某些方面，当LMWH存在于第一培养基中时，LMWH以1U/mL到10U/mL的浓度存在；Flt-3L以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；SCF以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL到0.50ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，Flt-3L以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；SCF以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL到0.50ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，当LMWH存在于第一培养基中时，LMWH以4U/mL到5U/mL的浓度存在；Flt-3L以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL到0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL到0.30ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，Flt-3L以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL到0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL到0.30ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，当LMWH存在于第一培养基中时，LMWH以约4.5U/mL的浓度存在；Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约.25ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约.25ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些实施例中，所述第一培养基另外包括以下中的一种或多种：抗生素，如庆大霉素；抗氧化剂，如转铁蛋白、胰岛素和/或β-巯基乙醇；亚硒酸钠；抗坏血酸；乙醇胺；以及谷胱甘肽。在某些实施例中，为第一培养基提供基底的培养基是本领域技术人员已知的细胞/组织培养基，例如，可商购获得的细胞/组织培养基，如SCGMTM、STEMMACSTM、
Figure BDA0003186938500000431
X-VIVOTM 10、X-VIVOTM 15、OPTMIZER、
Figure BDA0003186938500000432
H3000、CELLGRO COMPLETETM、DMEM:Ham's F12(“F12”)(例如，2:1比率，或者高葡萄糖或低葡萄糖DMEM)、高级DMEM(Gibco)、EL08-1D2、MyelocultTMH5100、IMDM和/或RPMI-1640；或者是包括通常包含在已知细胞/组织培养基中的组分的培养基，如包含在以下中的组分：
Figure BDA0003186938500000441
Figure BDA0003186938500000442
X-VIVOTM 10、X-VIVOTM 15、OPTMIZER、
Figure BDA0003186938500000443
H3000、CELLGRO COMPLETETM、DMEM:Ham's F12(“F12”)(例如，2:1比率，或者高葡萄糖或低葡萄糖DMEM)、高级DMEM(Gibco)、EL08-1D2、MyelocultTMH5100、IMDM和/或RPMI-1640。在某些实施例中，所述第一培养基不是
Figure BDA0003186938500000444
在上述实施例中的任何实施例中的具体实施例中，第一培养基缺乏LIF、MIP-1α或两者。
在某些方面，三阶段法中使用的所述第二培养基包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo。在某些方面，三阶段法中使用的第二培养基除了干细胞动员剂和IL-15外还包括LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种。在某些方面，三阶段法中使用的第二培养基除了干细胞动员剂和IL-15外还包括LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，三阶段法中使用的第二培养基除了干细胞动员剂和IL-15外还包括Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在具体方面，第二培养基缺乏添加的LMWH。在具体方面，第二培养基缺乏添加的脱硫酸化糖胺聚糖。在具体方面，第二培养基缺乏LMWH。在具体方面，第二培养基缺乏脱硫酸化糖胺聚糖。在某些方面，所述IL-15在所述第二培养基中以1ng/mL到50ng/mL、10ng/mL到30ng/mL或约20ng/mL的浓度存在。在某些方面，当LMWH存在于所述第二培养基中时，LMWH以1U/mL到10U/mL的浓度存在；Flt-3L以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；SCF以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL到0.50ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，在所述第二培养基中，Flt-3L以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；SCF以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL到0.50ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，当LMWH存在于第二培养基中时，LMWH在第二培养基中以4U/mL到5U/mL的浓度存在；Flt-3L以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL到0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL到0.30ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，Flt-3L以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL到0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL到0.30ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，当LMWH存在于第二培养基中时，LMWH在第二培养基中以4U/mL到5U/mL的浓度存在；Flt-3L以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL到0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL到0.30ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，Flt-3L以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL到0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL到0.30ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，当LMWH存在于第二培养基中时，LMWH在第二培养基中以约4.5U/mL的浓度存在；Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些实施例中，所述第二培养基另外包括以下中的一种或多种：抗生素，如庆大霉素；抗氧化剂，如转铁蛋白、胰岛素和/或β-巯基乙醇；亚硒酸钠；抗坏血酸；乙醇胺；以及谷胱甘肽。在某些实施例中，为第二培养基提供基底的培养基是本领域技术人员已知的细胞/组织培养基，例如，可商购获得的细胞/组织培养基，如SCGMTM、STEMMACSTM、
Figure BDA0003186938500000451
X-VIVOTM 10、X-VIVOTM 15、OPTMIZER、
Figure BDA0003186938500000452
H3000、CELLGRO COMPLETETM、DMEM:Ham's F12(“F12”)(例如，2:1比率，或者高葡萄糖或低葡萄糖DMEM)、高级DMEM(Gibco)、EL08-1D2、MyelocultTMH5100、IMDM和/或RPMI-1640；或者是包括通常包含在已知细胞/组织培养基中的组分的培养基，如包含在以下中的组分：
Figure BDA0003186938500000453
X-VIVOTM 10、X-VIVOTM 15、OPTMIZER、
Figure BDA0003186938500000454
H3000、CELLGROCOMPLETETM、DMEM:Ham's F12(“F12”)(例如，2:1比率，或者高葡萄糖或低葡萄糖DMEM)、高级DMEM(Gibco)、EL08-1D2、MyelocultTMH5100、IMDM和/或RPMI-1640。在某些实施例中，所述第二培养基不是
Figure BDA0003186938500000461
在上述实施例中的任何实施例中的具体实施例中，第一培养基缺乏LIF、MIP-1α或两者。
在某些方面，三阶段法中使用的所述第三培养基包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH。在某些方面，三阶段法中使用的所述第三培养基包括IL-2和IL-15并且缺乏LMWH。在某些方面，三阶段法中使用的所述第三培养基包括IL-2和IL-15并且缺乏SCF和LMWH。在某些方面，三阶段法中使用的所述第三培养基包括IL-2和IL-15并且缺乏SCF、干细胞动员剂和LMWH。在某些方面，三阶段法中使用的所述第三培养基包括干细胞动员剂、IL-2和IL-15并且缺乏LMWH。在某些方面，三阶段法中使用的所述第三培养基包括SCF、IL-2和IL-15并且缺乏LMWH。在某些方面，三阶段法中使用的所述第三培养基包括干细胞动员剂、SCF、IL-2和IL-15并且缺乏LMWH。在某些方面，三阶段法中使用的所述第三培养基包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH。在某些方面，三阶段法中使用的第三培养基除了IL-2和IL-15外还包括SCF、IL-6、IL-7、G-CSF或GM-CSF中的一种或多种。在某些方面，三阶段法中使用的第三培养基除了IL-2和IL-15外还包括SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，所述IL-2在所述第三培养基中以10U/mL到10,000U/mL的浓度存在，并且所述IL-15在所述第三培养基中以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在。在某些方面，所述IL-2在所述第三培养基中以100U/mL到10,000U/mL的浓度存在，并且所述IL-15在所述第三培养基中以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在。在某些方面，所述IL-2在所述第三培养基中以300U/mL到3,000U/mL的浓度存在，并且所述IL-15在所述第三培养基中以10ng/mL到30ng/mL的浓度存在。在某些方面，所述IL-2在所述第三培养基中以约1,000U/mL的浓度存在，并且所述IL-15在所述第三培养基中以约20ng/mL的浓度存在。在某些方面，在所述第三培养基中，SCF以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL到0.50ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，在所述第三培养基中，SCF以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL到0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL到0.30ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以0.005ng/mL到0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在所述第三培养基中，SCF以约22ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约20ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；并且GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些方面，第三培养基包括100ng/mL IL-7、1000ng/mL IL-2、20ng/mL IL-15和10干细胞动员剂并且缺乏SCF。在某些方面，第三培养基包括20ng/mL IL-7、1000ng/mL IL-2、20ng/mL IL-15以及干细胞动员剂并且缺乏SCF。在某些方面，第三培养基包括20ng/mL IL-7、20ng/mL IL-15以及干细胞动员剂并且缺乏SCF。在某些方面，第三培养基包括100ng/mL IL-7、22ng/mL SCF、1000ng/mL IL-2和20ng/mL IL-15并且缺乏干细胞动员剂。在某些方面，第三培养基包括22ng/mL SCF、1000ng/mL IL-2、20ng/mL IL-15并且缺乏干细胞动员剂。在某些方面，第三培养基包括20ng/mL IL-7、22ng/mL SCF、1000ng/mL IL-2和20ng/mL IL-15并且缺乏干细胞动员剂。在某些方面，第三培养基包括20ng/mL IL-7、22ng/mL SCF和1000ng/mL IL-2并且缺乏干细胞动员剂。在上述实施例中的任何实施例中的具体实施例中，第一培养基缺乏LIF、MIP-1α、Flt-3L中的一种、两种或所有三种。
在某些实施例中，所述第三培养基另外包括以下中的一种或多种：抗生素，如庆大霉素；抗氧化剂，如转铁蛋白、胰岛素和/或β-巯基乙醇；亚硒酸钠；抗坏血酸；乙醇胺；以及谷胱甘肽。在某些实施例中，为第三培养基提供基底的培养基是本领域技术人员已知的细胞/组织培养基，例如，可商购获得的细胞/组织培养基，如SCGMTM、STEMMACSTM、
Figure BDA0003186938500000471
X-VIVOTM 10、X-VIVOTM 15、OPTMIZER、
Figure BDA0003186938500000472
H3000、CELLGROCOMPLETETM、DMEM:Ham's F12(“F12”)(例如，2:1比率，或者高葡萄糖或低葡萄糖DMEM)、高级DMEM(Gibco)、EL08-1D2、MyelocultTMH5100、IMDM和/或RPMI-1640；或者是包括通常包含在已知细胞/组织培养基中的组分的培养基，如包含在以下中的组分：
Figure BDA0003186938500000473
X-VIVOTM10、X-VIVOTM 15、OPTMIZER、
Figure BDA0003186938500000474
H3000、CELLGRO COMPLETETM、DMEM:Ham's F12(“F12”)(例如，2:1比率，或者高葡萄糖或低葡萄糖DMEM)、高级DMEM(Gibco)、EL08-1D2、MyelocultTMH5100、IMDM和/或RPMI-1640。在某些实施例中，所述第三培养基不是
Figure BDA0003186938500000475
通常，特别叙述的培养基组分并非指所述培养基的不确定组分中的可能成分。例如，所述Tpo、所述IL-2和所述IL-15不包括在所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基的不确定组分内，例如，所述Tpo、所述IL-2和所述IL-15不包括在血清内。进一步地，所述LMWH、所述Flt-3、所述SCF、所述IL-6、所述IL-7、所述G-CSF和/或所述GM-CSF不包括在所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基的不确定组分内，例如，所述LMWH、所述Flt-3、所述SCF、所述IL-6、所述IL-7、所述G-CSF和/或所述GM-CSF不包括在血清内。
在某些方面，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基包括人AB血清。在某些方面，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基中的任何一种包括1％到20％人AB血清、5％到15％人AB血清或约2％、5％或10％人AB血清。
在某些实施例中，在本文所描述的三阶段法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。在某些实施例中，在本文所描述的三阶段法中，将细胞在所述第二培养基中培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。在某些实施例中，在本文所描述的三阶段法中，细胞在所述第三培养基中培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天或超过30天。
在具体实施例中，在本文所描述的三阶段法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养7-13天以产生第一细胞群，之后在所述第二培养基中进行所述培养；将所述第一细胞群在所述第二培养基中培养2-6天以产生第二细胞群，之后在所述第三培养基中进行所述培养；并且将所述第二细胞群在所述第三培养基中培养10-30天，即，将细胞培养共19-49天。
在具体实施例中，在本文所描述的三阶段法中，在本文所描述的三阶段法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养8-12天以产生第一细胞群，之后在所述第二培养基中进行所述培养；将所述第一细胞群在所述第二培养基中培养3-5天以产生第二细胞群，之后在所述第三培养基中进行所述培养；并且将所述第二细胞群在所述第三培养基中培养15-25天，即，将细胞培养共26-42天。
在具体实施例中，在本文所描述的三阶段法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养约10天以产生第一细胞群，之后在所述第二培养基中进行所述培养；将所述第一细胞群在所述第二培养基中培养约4天以产生第二细胞群，之后在所述第三培养基中进行所述培养；并且将所述第二细胞群在所述第三培养基中培养约21天，即，将细胞培养共约35天。
在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的自然杀伤细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少5000倍。在某些方面，所述三阶段法所产生的自然杀伤细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少10,000倍。在某些方面，所述三阶段法所产生的自然杀伤细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少50,000倍。在某些方面，所述三阶段法所产生的自然杀伤细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少75,000倍。在某些方面，通过7-氨基放线菌素D(7AAD)染色来确定所述自然杀伤细胞的活力。在某些方面，通过膜联蛋白-V染色来确定所述自然杀伤细胞的活力。在具体方面，通过7-AAD染色和膜联蛋白-V染色两者来确定所述自然杀伤细胞的活力。在某些方面，通过台盼蓝染色来确定所述自然杀伤细胞的活力。
在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的ILC3细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少5000倍。在某些方面，所述三阶段法所产生的ILC3细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少10,000倍。在某些方面，所述三阶段法所产生的ILC3细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少50,000倍。在某些方面，所述三阶段法所产生的ILC3细胞比最初接种于所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少75,000倍。
在某些方面，三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少20％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在某些方面，三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少40％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在某些方面，三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少60％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在某些方面，三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少70％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在某些方面，三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少80％CD56+CD3-自然杀伤细胞。
在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少20％CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞。在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少40％CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞。在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少60％CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞。在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少80％CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞。
在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的ILC3细胞包括至少20％CD56+CD3-CD11a-ILC3细胞。在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的ILC3细胞包括至少40％CD56+CD3-CD11a-ILC3细胞。在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的ILC3细胞包括至少60％CD56+CD3-CD11a-ILC3细胞。在某些方面，本文所公开的三阶段法所产生的自然杀伤细胞包括至少80％CD56+CD3-CD11a-ILC3细胞。
在某些方面，当三阶段法所产生的自然杀伤细胞与K562细胞以10:1的比率在体外或离体共培养时，所述自然杀伤细胞针对所述K562细胞表现出至少20％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的自然杀伤细胞与K562细胞以10:1的比率在体外或离体共培养时，所述自然杀伤细胞针对所述K562细胞表现出至少35％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的自然杀伤细胞与K562细胞以10:1的比率在体外或离体共培养时，所述自然杀伤细胞针对所述K562细胞表现出至少45％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的自然杀伤细胞与K562细胞以10:1的比率在体外或离体共培养时，所述自然杀伤细胞针对所述K562细胞表现出至少60％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的自然杀伤细胞与K562细胞以10:1的比率在体外或离体共培养时，所述自然杀伤细胞针对所述K562细胞表现出至少75％的细胞毒性。
在某些方面，当三阶段法所产生的ILC3细胞与K562细胞以10:1的比率在体外或离体共培养时，所述ILC3细胞针对所述K562细胞表现出至少20％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的ILC3细胞与K562细胞以10:1的比率在体外或离体共培养时，所述ILC3细胞针对所述K562细胞表现出至少35％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的ILC3细胞与K562细胞以10:1的比率在体外或离体共培养时，所述ILC3细胞针对所述K562细胞表现出至少45％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的ILC3细胞与K562细胞以10:1的比率在体外或离体共培养时，所述ILC3细胞针对所述K562细胞表现出至少60％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段法所产生的ILC3细胞与K562细胞以10:1的比率在体外或离体共培养时，所述ILC3细胞针对所述K562细胞表现出至少75％的细胞毒性。
在某些方面，在所述第三培养步骤之后，低温保存所述第三细胞群，例如，所述自然杀伤细胞群和/或所述ILC3细胞群。在某些方面，在所述第四步骤之后，低温保存所述第四细胞群，例如，所述自然杀伤细胞群和/或所述ILC3细胞群。
在某些方面，本文提供了包括自然杀伤细胞即通过本文所描述的三阶段法产生的自然杀伤细胞的细胞群。因此，本文提供了通过本文所描述的三阶段法产生的分离的自然杀伤细胞群。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞群包括至少20％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞群包括至少40％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞群包括至少60％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞群包括至少80％CD56+CD3-自然杀伤细胞。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞群包括至少60％CD16-细胞。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞群包括至少80％CD16-细胞。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞群包括至少20％CD94+细胞。在具体实施例中，所述自然杀伤细胞群包括至少40％CD94+细胞。
在某些方面，本文提供了一种自然杀伤细胞群CD56+CD3-CD117+CD11a+，其中所述自然杀伤细胞表达穿孔素和/或EOMES并且不表达RORγt、芳烃受体(AHR)和IL1R1中的一种或多种。在某些方面，所述自然杀伤细胞表达穿孔素和EOMES并且不表达RORγt、芳烃受体或IL1R1中的任何一种。在某些方面，所述自然杀伤细胞另外表达T-bet、GZMB、NKp46、NKp30和NKG2D。在某些方面，所述自然杀伤细胞表达CD94。在某些方面，所述自然杀伤细胞不表达CD94。
在某些方面，本文提供了一种ILC3细胞群CD56+CD3-CD117+CD11a-，其中所述ILC3细胞表达RORγt、芳烃受体和IL1R1中的一种或多种并且不表达CD94、穿孔素和EOMES中的一种或多种。在某些方面，所述ILC3细胞表达RORγt、芳烃受体和IL1R1并且不表达CD94、穿孔素或EOMES中的任何一种。在某些方面，所述ILC3细胞另外表达CD226和/或2B4。在某些方面，所述ILC3细胞另外表达IL-22、TNFα和DNAM-1中的一种或多种。在某些方面，所述ILC3细胞表达CD226、2B4、IL-22、TNFα和DNAM-1。
在某些方面，本文提供了一种产生包括自然杀伤细胞和ILC3细胞的细胞群的方法，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；以及(d)从所述第三细胞群中分离CD11a+细胞和CD11a-细胞；以及(e)将所述CD11a+细胞与所述CD11a-细胞按以下比率组合以产生第四细胞群：50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40或1:50。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以50:1的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以20:1的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以10:1的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以5:1的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以1:1的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以1:5的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以1:10的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以1:20的比率组合。在某些方面，在所述第四细胞群中，所述CD11a+细胞和所述CD11a-细胞以1:50的比率组合。
5.3.干细胞动员因子
5.3.1.化学定义
为了便于理解本文所阐述的干细胞动员因子的公开内容，下文定义了许多术语。
通常，本文所使用的命名法以及本文所描述的生物学、细胞生物学、生物化学、有机化学、药物化学和药理学中的实验室程序是众所周知且本领域中常用的命名法和实验室程序。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语通常具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
术语“约”或“大约”意指如本领域的普通技术人员确定的特定值的可接受误差，这将部分取决于如何测量或确定值。在某些实施例中，术语“约”或“大约”意指在1个、2个、3个或4个标准偏差内。在某些实施例中，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的50％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.05％内。
如本文所使用的，任何一个或多个“R”基团(如但不限于Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Rf、Rg、Rh、Rm、RG、RJ、RK、RU、RV、RY和RZ)表示可以与指示的原子连接的取代基。R基团可以是被取代的或未被取代的。如果将两个“R”基团描述为“结合在一起”，则R基团和其所连接的原子可以形成环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂环。例如但不限于，如果NRaRb基团的Ra和Rb被指示为“结合在一起”，则意味着两者彼此共价键合以形成环：
Figure BDA0003186938500000531
另外，如果两个“R”基团被描述为作为替代方案与其所连接的一个或多个原子“结合在一起”以形成环，则R基团不限于先前所定义的变量或取代基。
无论何时将基团描述为“被任选取代的”，所述基团可以是未被取代的或被指示的取代基中的一个或多个取代基取代。同样地，当将基团描述为“未被取代的或被取代的(如果被取代的话)”时，一个或多个取代基可以选自一个或多个指示的取代基。如果未指示取代基，则意味着指示的“被任选取代的”或“被取代的”基团可以被单独地且独立地选自以下的一个或多个基团取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、酰烷基、羟基、烷氧基、烷氧基烷基、氨基烷基、氨基酸、芳基、杂芳基、杂环基、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)、杂环基(烷基)、羟基烷基、酰基、氰基、卤素、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-胺基、N-胺基、S-磺酰胺基、N-磺酰胺基、C-羧基、O-羧基、异氰酸基、氰硫基、异硫氰基、叠氮基、硝基、甲硅烷基、亚磺酰基、亚硫酰基、磺酰基、卤代烷基、卤代烷氧基、三卤代甲磺酰基、三卤代甲磺酰胺基、氨基、经单取代的氨基和经双取代的氨基。
如本文所使用的，其中“a”和“b”为整数的“Ca到Cb”是指烷基、烯基或炔基中的碳原子数或者环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂脂环基的环中的碳原子数。即，烷基、烯基、炔基、环烷基的一个或多个环、环烯基的一个或多个环、芳基的一个或多个环、杂芳基的一个或多个环或者杂脂环基的一个或多个环可以含有“a”到“b”个碳原子(包含a个和b个)。因此，例如，“C1到C4烷基”基团是指具有1到4个碳的所有烷基，即，CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、(CH3)2CH-、CH3CH2CH2CH2-、CH3CH2CH(CH3)-和(CH3)3C-。如果相对于烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基或杂脂环基未指定“a”和“b”，则应假定这些定义中所描述的最宽范围。
如本文所使用的，“烷基”是指包括完全饱和(无双键或三键)烃基的直链或支链烃链。烷基可以具有1到20个碳原子(无论其在本文何时出现，如“1到20”等数值范围是指在给定范围内的每个整数；例如，“1到20个碳原子”意味着烷基可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等直到且包含20个碳原子组成，但是在未指定数值范围的情况下，本定义还涵盖存在术语“烷基”)。烷基还可以是具有1到10个碳原子的中等大小烷基。烷基还可以是具有1到6个碳原子的低级烷基。化合物的烷基可以命名为“C1-C4烷基”或类似名称。仅举例来讲，“C1-C4烷基”指示在烷基链中存在一到四个碳原子，即烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基包含决不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。烷基可以是被取代或未被取代的。
如本文所使用的，“烯基”是指在直链或支链烃链中含有一个或多个双键的烷基。烯基的实例包含丙二烯基、乙烯基甲基和次乙基。烯基可以是未被取代或被取代的。
如本文所使用的，“炔基”是指在直链或支链烃链中含有一个或多个三键的烷基。炔基的实例包含乙炔基和丙炔基。炔基可以是未被取代的或被取代的。
如本文所使用的，“环烷基”是指完全饱和(无双键或三键)的单环或多环烃环系统。当由两个或更多个环构成时，环可以以稠合方式接合在一起。环烷基可以在一个或多个环中含有3到10个原子或在一个或多个环中含有3到8个原子。环烷基可以是未被取代的或被取代的。典型的环烷基包含但决不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
如本文所使用的，“环烯基”是指在至少一个环中含有一个或多个双键的单环或多环烃环系统；但是，如果双键多于一个，则双键无法在所有环中形成完全离域π电子系统(否则如本文所定义的，所述基团将会是“芳基”)。环烯基可以在一个或多个环中含有3到10个原子或在一个或多个环中含有3到8个原子。当由两个或更多个环构成时，环可以以稠合方式连接在一起。环烯基可以是未被取代的或被取代的。
如本文所使用的，“芳基”是指在所有环中具有完全离域π电子系统的碳环(全碳)单环或多环芳香族环系统(包含两个碳环共享化学键的稠合环系统)。芳基中的碳原子数可以变化。例如，芳基可以是C6-C14芳基、C6-C10芳基或C6芳基。芳基的实例包含但不限于苯、萘和薁。芳基可以是被取代的或未被取代的。
如本文所使用的，“杂芳基”是指含有一个、两个、三个或更多个杂原子(即，除碳以外的元素，包含但不限于氮、氧和硫)的单环或多环芳香族环系统(具有完全离域π电子系统的环系统)。杂芳基的一个或多个环中的原子数可以变化。例如，杂芳基可以在一个或多个环中含有4到14个原子、在一个或多个环中含有5到10个原子或在一个或多个环中含有5到6个原子。此外，术语“杂芳基”包含稠合环系统，在所述稠合环系统中，两个环(如至少一个芳基环和至少一个杂芳基环或至少两个杂芳基环)共享至少一个化学键。杂芳基环的实例包含但不限于本文所描述的那些和以下：呋喃、呋咱、噻吩、苯并噻吩、酞嗪、吡咯、噁唑、苯并噁唑、1,2,3-噁二唑、1,2,4-噁二唑、噻唑、1,2,3-噻二唑、1,2,4-噻二唑、苯并噻唑、咪唑、苯并咪唑、吲哚、吲唑、吡唑、苯并吡唑、异噁唑、苯并异噁唑、异噻唑、三唑、苯并三唑、噻二唑、四唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、嘌呤、蝶啶、喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹喔啉、噌啉和三嗪。杂芳基可以是被取代的或未被取代的。
如本文所使用的，“杂环基”或“杂脂环基”是指三元、四元、五元、六元、七元、八元、九元、十元直到18元单环、双环和三环环系统，其中碳原子与1到5个杂原子一起构成所述环系统。然而，杂环可以任选地含有以此类方式定位成使得在所有环中不存在完全离域π电子系统的一个或多个不饱和键。一个或多个杂原子是除碳之外的元素，包含但不限于氧、硫和氮。杂环可以进一步含有一个或多个羰基官能团或硫代羰基官能团，以使定义包含氧代系统和硫代系统，如内酰胺、内酯、环状酰亚胺、环状硫代酰亚胺和环状氨基甲酸酯。当由两个或更多个环构成时，环可以以稠合方式接合在一起。另外，杂环基中的任何氮可以被季铵化。杂环基或杂脂环基可以是未被取代的或被取代的。此类“杂环基”或“杂脂环基”的实例包含但不限于本文所描述的那些和以下：1,3-二噁英、1,3-二噁烷、1,4-二噁烷、1,2-二氧戊环、1,3-二氧戊环、1,4-二氧戊环、1,3-氧硫杂环己烷、1,4-氧硫杂环己二烯、1,3-氧硫杂环戊烷、1,3-二硫杂环戊二烯、1,3-二硫杂环戊环、1,4-氧硫杂环己烷、四氢-1,4-噻嗪、1,3-噻嗪烷、2H-1,2-噁嗪、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巴比妥酸、硫代巴比妥酸、二氧代哌嗪、乙内酰脲、二氢尿嘧啶、三噁烷、六氢-1,3,5-三嗪、咪唑啉、咪唑烷、异噁唑啉、异噁唑烷、噁唑啉、噁唑烷、噁唑烷酮、噻唑啉、噻唑烷、吗啉、环氧乙烷、哌啶N-氧化物、哌啶、哌嗪、吡咯烷、吡咯烷酮(pyrrolidone)、吡咯烷酮(pyrrolidione)、4-哌啶酮、吡唑啉、吡唑烷、2-氧代吡咯烷、四氢吡喃、4H-吡喃、四氢噻喃、硫吗啉、硫吗啉亚砜、硫吗啉砜以及其苯并稠合的类似物(例如，苯并咪唑烷酮、四氢喹啉和3,4-亚甲二氧基苯基)。
如本文所使用的，“芳烷基”和“芳基(烷基)”是指作为取代基经由低级亚烷基连接的芳基。芳烷基的低级亚烷基和芳基可以是被取代的或未被取代的。实例包含但不限于苄基、2-苯基烷基、3-苯基烷基和萘基烷基。
如本文所使用的，“杂芳烷基”和“杂芳基(烷基)”是指作为取代基经由低级亚烷基连接的杂芳基。杂芳烷基的低级亚烷基和杂芳基可以是被取代的或未被取代的。实例包含但不限于2-噻吩基烷基、3-噻吩基烷基、呋喃基烷基、噻吩基烷基、吡咯基烷基、吡啶基烷基、异噁唑基烷基、咪唑基烷基以及其苯并稠合的类似物。
“杂脂环基(烷基)”和“杂环基(烷基)”是指作为取代基经由低级亚烷基连接的杂环基或杂脂环基。杂脂环基(烷基)的低级亚烷基和杂环基可以是被取代的或未被取代的。实例包含但不限于四氢-2H-吡喃-4-基(甲基)、哌啶-4-基(乙基)、哌啶-4-基(丙基)、四氢-2H-噻喃-4-基(甲基)和1,3-噻嗪烷-4-基(甲基)。
“低级亚烷基”是形成用于经由其末端碳原子连接分子片段的键的直链-CH2-系拴基团。实例包含但不限于亚甲基(-CH2-)、乙烯(-CH2CH2-)、丙烯(-CH2CH2CH2-)和丁烯(-CH2CH2CH2CH2-)。低级亚烷基可以通过用“被取代的”定义下所列出的一个或多个取代基置换低级亚烷基的一个或多个氢而被取代。
如本文所使用的，“烷氧基”是指式-OR，其中R是如本文所定义的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基(烷基)、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)或杂环基(烷基)。烷氧基的非限制性列表为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、苯氧基和苯甲酰氧基。烷氧基可以是被取代的或未被取代的。
如本文所使用的，“酰基”是指作为取代基经由羰基连接的氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基(烷基)、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)或杂环基(烷基)。实例包含甲酰基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基和丙烯酰基。酰基可以是被取代的或未被取代的。
如本文所使用的，“酰烷基”是指作为取代基经由低级亚烷基连接的酰烷基。实例包含芳基-C(＝O)-(CH2)n-和杂芳基-C(＝O)-(CH2)n-，其中n为1到6范围内的整数。
如本文所使用的，“烷氧基烷基”是指作为取代基经由低级亚烷基连接的烷氧基。实例包含C1-4烷基-O-(CH2)n-，其中n为1到6范围内的整数。
如本文所使用的，“氨基烷基”是指作为取代基经由低级亚烷基连接的被任选取代的氨基。实例包含H2N(CH2)n-，其中n为1到6范围内的整数。
如本文所使用的，“羟基烷基”是指氢原子中的一个或多个被羟基置换的烷基。示例性羟基烷基包含但不限于2-羟基乙基、3-羟基丙基、2-羟基丙基和2,2-二羟基乙基。羟基烷基可以是被取代的或未被取代的。
如本文所使用的，“卤代烷基”是指氢原子中的一个或多个被卤素置换的烷基(例如，单卤代烷基、二卤代烷基和三卤代烷基)。此类基团包含但不限于氯甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯-氟烷基、氯-二氟烷基和2-氟异丁基。卤代烷基可以是被取代的或未被取代的。
如本文所使用的，“卤代烷氧基”是指氢原子中的一个或多个被卤素置换的烷氧基(例如，单卤代烷氧基、二卤代烷氧基和三卤代烷氧基)。此类基团包含但不限于氯甲氧基、氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯-氟烷基、氯-二氟烷氧基和2-氟异丁氧基。卤代烷氧基可以是被取代的或未被取代的。
“亚磺酰基”是指“-SR”基团，其中R可以为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基(烷基)、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)或杂环基(烷基)。亚磺酰基可以是被取代的或未被取代的。
“亚硫酰基”是指“-S(＝O)-R”基团，其中R可以与关于亚磺酰基所定义的相同。亚硫酰基可以是被取代的或未被取代的。
“磺酰基”是指“SO2R”基团，其中R可以与关于亚磺酰基所定义的相同。磺酰基可以是被取代的或未被取代的。
“O-羧基”是指“RC(＝O)O-”基团，其中R可以为如本文所定义的氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基(烷基)、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)或杂环基(烷基)。O-羧基可以是被取代的或未被取代的。
术语“酯”和“C-羧基”是指“-C(＝O)OR”基团，其中R可以与关于O-羧基所定义的相同。酯和C-羧基可以是被取代的或未被取代的。
“硫代羰基”是指“-C(＝S)R”基团，其中R可以与关于O-羧基所定义的相同。硫代羰基可以是被取代的或未被取代的。
“三卤代甲磺酰基”是指“X3CSO2-”基团，其中每个X为卤素。
“三卤代甲磺酰胺基”是指“X3CS(O)2N(RA)-”基团，其中每个X为卤素，并且RA是氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基(烷基)、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)或杂环基(烷基)。
如本文所使用的术语“氨基”是指-NH2基团。
如本文所使用的，术语“羟基”是指-OH基团。
“氰基”是指“-CN”基团。
如本文所使用的术语“叠氮基”是指-N3基团。
“异氰酸基”是指“-NCO”基团。
“氰硫基”是指“-CNS”基团。
“异硫氰基”是指“-NCS”基团。
“羰基”是指C＝O基团。
“S-磺酰胺基”是指“-SO2N(RARB)”基团，其中RA和RB可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基(烷基)、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)或杂环基(烷基)。S-磺酰胺基可以是被取代的或未被取代的。
“N-磺酰胺基”是指“RSO2N(RA)-”基团，其中R和RA可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基(烷基)、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)或杂环基(烷基)。N-磺酰胺基可以是被取代的或未被取代的。
“O-氨基甲酰基”是指“-OC(＝O)N(RARB)”基团，其中RA和RB可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基(烷基)、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)或杂环基(烷基)。O-氨基甲酰基可以是被取代的或未被取代的。
“N-氨基甲酰基”是指“ROC(＝O)N(RA)-”基团，其中R和RA可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基(烷基)、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)或杂环基(烷基)。N-氨基甲酰基可以是被取代的或未被取代的。
“O-硫代氨基甲酰基”是指“-OC(＝S)-N(RARB)”基团，其中RA和RB可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基(烷基)、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)或杂环基(烷基)。O-硫代氨基甲酰基可以是被取代的或未被取代的。
“N-硫代氨基甲酰基”是指“ROC(＝S)N(RA)-”基团，其中R和RA可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基(烷基)、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)或杂环基(烷基)。N-硫代氨基甲酰基可以是被取代的或未被取代的。
“C-胺基”是指“-C(＝O)N(RARB)”基团，其中RA和RB可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基(烷基)、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)或杂环基(烷基)。C-胺基可以是被取代的或未被取代的。
“N-胺基”是指“RC(＝O)N(RA)-”基团，其中R和RA可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基(烷基)、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)或杂环基(烷基)。N-胺基可以是被取代的或未被取代的。
“脲”基是指“N(R)-C(＝O)-NRARB”基团，其中RA可以为氢或烷基，并且RA和RB可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基(烷基)、芳基(烷基)、杂芳基(烷基)或杂环基(烷基)。脲可以是被取代的或未被取代的。
如本文所使用的，术语“卤素原子”或“卤素”意指元素周期表第7列的放射稳定原子中的任何一个原子，如氟、氯、溴和碘。
如本文所使用的，除非另外说明，否则
Figure BDA0003186938500000591
指示单键或双键。
在未指定取代基的数量(例如，卤代烷基)的情况下，可以存在一个或多个取代基。例如，“卤代烷基”可以包含相同或不同的卤素中的一个或多个。作为另一实例，“C1-C3烷氧基苯基”可以包含含有一个、两个或三个原子的相同或不同烷氧基中的一个或多个。
如本文所使用的，除非另外指示，否则任何保护性基团、氨基酸和其它化合物的缩写根据其常见用途或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Commission on BiochemicalNomenclature)(参见《生物化学(Biochem.)》11:942-944(1972))均为公认的缩写。
在某些实施例中，“光学活性”和“对映异构活性”是指对映异构体过量不小于约50％、不小于约70％、不小于约80％、不小于约90％、不小于约91％、不小于约92％、不小于约93％、不小于约94％、不小于约95％、不小于约96％、不小于约97％、不小于约98％、不小于约99％、不小于约99.5％或不小于约99.8％的分子集合。在某些实施例中，按所讨论的两种对映异构体的总重量计，化合物包括约95％或更多的期望对映异构体和约5％或更少的较不优选的对映异构体。
在描述光学活性化合物时，前缀R和S用于表示光学活性化合物关于其一个或多个手性中心的绝对构型。(+)和(-)用于表示光学活性化合物的旋光性，即，通过光学活性化合物使偏振光平面旋转的方向。前缀(-)指示光学活性化合物是左旋的，即，化合物使偏振光平面向左或逆时针旋转。前缀(+)指示光学活性化合物是右旋的，即，化合物使偏振光平面向右或顺时针旋转。然而，旋光性的符号(+)和(-)与化合物的绝对构型R和S无关。
术语“同位素变体”是指这样的化合物，所述化合物在构成此类化合物的原子中的一个或多个原子处含有非天然比例的同位素。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的一种或多种同位素，包含但不限于氢(1H)、氘(2H)、氚(3H)、碳-11(11C)、碳-12(12C)、碳-13(13C)、碳-14(14C)、氮-13(13N)、氮-14(14N)、氮-15(15N)、氧-14(14O)、氧-15(15O)、氧-16(16O)、氧-17(17O)、氧-18(18O)、氟-17(17F)、氟-18(18F)、磷-31(31P)、磷-32(32P)、磷-33(33P)、硫-32(32S)、硫-33(33S)、硫-34(34S)、硫-35(35S)、硫-36(36S)、氯-35(35Cl)、氯-36(36Cl)、氯-37(37Cl)、溴-79(79Br)、溴-81(81Br)、碘-123(123I)、碘-125(125I)、碘-127(127I)、碘-129(129I)和碘-131(131I)。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”呈稳定形式，即，是非放射性的。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的一种或多种同位素，包含但不限于氢(1H)、氘(2H)、碳-12(12C)、碳-13(13C)、氮-14(14N)、氮-15(15N)、氧-16(16O)、氧-17(17O)、氧-18(18O)、氟-17(17F)、磷-31(31P)、硫-32(32S)、硫-33(33S)、硫-34(34S)、硫-36(36S)、氯-35(35Cl)、氯-37(37Cl)、溴-79(79Br)、溴-81(81Br)和碘-127(127I)。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”呈不稳定形式，即，是放射性的。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的一种或多种同位素，包含但不限于氚(3H)、碳-11(11C)、碳-14(14C)、氮-13(13N)、氧-14(14O)、氧-15(15O)、氟-18(18F)、磷-32(32P)、磷-33(33P)、硫-35(35S)、氯-36(36Cl)、碘-123(123I)、碘-125(125I)、碘-129(129I)和碘-131(131I)。应理解的是，在根据技术人员的判断可行的情况下，在如本文所提供的化合物中，例如，任何氢可以为2H，或例如，任何碳可以为13C，或例如，任何氮可以为15N，或例如，任何氧可以为18O。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的氘(D)。
术语“溶剂化物”是指由以化学计量量或非化学计量量存在的一个或多个溶质分子(例如，本文所提供的化合物)和一个或多个溶剂分子形成的复合体或聚集体。合适的溶剂包含但不限于水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和乙酸。在某些实施例中，溶剂是药学上可接受的。在一个实施例中，复合体或聚集体呈结晶形式。在另一个实施例中，复合体或聚集体呈非结晶形式。当溶剂是水时，溶剂化物是水合物。水合物的实例包含但不限于半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、四水合物和五水合物。
短语“对映异构体、对映异构体的混合物、两个或更多个非对映异构体的混合物或其同位素变体；或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药”具有与短语“(i)对映异构体、对映异构体的混合物、两个或更多个非对映异构体的混合物或其中所提及的化合物的同位素变体；(ii)其中所提及的化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药；或(iii)对映异构体、对映异构体的混合物、两个或更多个非对映异构体的混合物或其中所提及的化合物的同位素变体的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药”相同的含义。
5.3.2.干细胞动员化合物
在某些方面，所述干细胞动员因子是具有式(I)、(I-A)、(I-B)、(I-C)或(I-D)的化合物，如下文所描述的。
式(I)
本文所公开的一些实施例涉及式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其具有以下结构：
Figure BDA0003186938500000611
其中：每个
Figure BDA0003186938500000612
可以独立地表示单键或双键；RJ可以选自由-NRaRb、-ORb和＝O组成的组；其中如果RJ为＝O，则接合G和J的
Figure BDA0003186938500000613
表示单键且G为N并且所述N被RG取代；否则接合G和J的
Figure BDA0003186938500000614
表示双键且G为N；Ra可以为氢或C1-C4烷基；Rb可以为Rc或-(C1-C4烷基)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：-OH、-O(C1-C4烷基)、-O(C1-C4卤代烷基)；-C(＝O)NH2；未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分可以被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；RK可以选自由以下组成的组：氢、未被取代的C1-6烷基；被取代的C1-6烷基；-NH(C1-4烷基)；-N(C1-4烷基)2、未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分可以被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；RG可以选自由氢、C1-4烷基和-(C1-4烷基)-C(＝O)NH2组成的组；RY和RZ可以各自独立地不存在或选自由以下组成的组：氢、卤代基、C1-6烷基、-OH、-O-(C1-4烷基)、-NH(C1-4烷基)和-N(C1-4烷基)2；或者RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成选自以下的环：
Figure BDA0003186938500000621
Figure BDA0003186938500000622
其中所述环可以任选地被一个、两个或三个独立地选自以下的基团取代：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-OH、-O-(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、未被取代的C6-C10芳基、被1-5个卤原子取代的C6-C10芳基以及-O-(C1-4卤代烷基)；并且其中如果RY和RZ结合在一起形成
Figure BDA0003186938500000623
则RJ可以为-ORb或＝O；Rd可以为氢或C1-C4烷基；Rm可以选自由C1-4烷基、卤代基和氰基组成的组；J可以为C；并且X、Y和Z可以各自独立地为N或C，其中任何碳原子的化合价按需用氢原子填充。
在一些实施例中，
Figure BDA0003186938500000624
可以表示单键。在其它实施例中，
Figure BDA0003186938500000625
可以表示双键。在一些实施例中，接合Y和Z的
Figure BDA0003186938500000626
可以表示单键。在其它实施例中，接合Y和Z的
Figure BDA0003186938500000627
可以表示双键。在一些实施例中，当接合G和J的
Figure BDA0003186938500000628
表示单键时，G可以为N并且所述N被RG取代。在其它实施例中，当接合G和J的
Figure BDA0003186938500000629
表示双键时，G可以为N。在一些实施例中，当接合G和J的
Figure BDA00031869385000006210
表示双键时，则接合J和RJ的
Figure BDA00031869385000006211
可以为单键。在一些实施例中，当接合G和J的
Figure BDA00031869385000006212
表示双键时，则接合J和RJ的
Figure BDA00031869385000006213
可以不为双键。在一些实施例中，当接合J和RJ的
Figure BDA00031869385000006214
表示双键时，则接合G和J的
Figure BDA00031869385000006215
可以为单键。在一些实施例中，当接合J和RJ的
Figure BDA00031869385000006216
表示双键时，则接合G和J的
Figure BDA00031869385000006217
可以不为双键。
在一些实施例中，RJ可以为-NRaRb。在其它实施例中，RJ可以是-ORb。在仍其它实施例中，RJ可以为＝O。在一些实施例中，当RJ为＝O时，则接合G和J的
Figure BDA00031869385000006218
表示单键且G为N并且所述N被RG取代。在一些实施例中，RG为-CH2CH2-C(＝O)NH2。
在一些实施例中，Ra可以为氢。在一些实施例中，Ra可以为C1-C4烷基。例如，Ra可以为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
在一些实施例中，Rb可以为Rc。在一些实施例中，Rb可以为-(C1-C4烷基)-Rc。例如，Rb可以为-CH2-Rc、-CH2CH2-Rc、-CH2CH2CH2-Rc或-CH2CH2CH2CH2-Rc。在一些实施例中，当Rb为-CH2CH2-Rc时，Rc可以为-O(C1-C4烷基)。在其它实施例中，当Rb为-CH2CH2-Rc时，Rc可以为-O(C1-C4卤代烷基)。在仍其它实施例中，当Rb为-CH2CH2-Rc时，Rc可以为-C(＝O)NH2。
在一些实施例中，Rc可以为-OH。在一些实施例中，Rc可以为-O(C1-C4烷基)。在一些实施例中，Rc可以为-O(C1-C4卤代烷基)。在一些实施例中，Rc可以为-C(＝O)NH2。在一些实施例中，Rc可以为未被取代的C 6-10芳基。在一些实施例中，Rc可以为被取代的C6-10芳基。在一些实施例中，Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基。在一些实施例中，Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基。在一些实施例中，当Rc部分被指示为“被取代的”时，所述部分可以被一个或多个例如一个、两个、三个或四个取代基E取代。在一些实施例中，E可以为-OH。在一些实施例中，E可以为C1-C4烷基。在一些实施例中，E可以为C1-C4卤代烷基。在一些实施例中，E可以为-O(C1-C4烷基)。在一些实施例中，E可以为-O(C1-C4卤代烷基)。
在一些实施例中，当Rb为-CH2CH2-Rc时，Rc可以为未被取代的C6-10芳基。在其它实施例中，当Rb为-CH2CH2-Rc时，Rc可以为被取代的C6-10芳基。在仍其它实施例中，当Rb为-CH2CH2-Rc时，Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基。在又仍其它实施例中，Rb可以为-(C1-C4烷基)-Rc并且Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基。当Rc部分被指示为“被取代的”时，所述部分可以被一个或多个例如一个、两个、三个或四个取代基E取代。在一些实施例中，E可以为-OH。在其它实施例中，E可以为C1-C4烷基。在仍其它实施例中，E可以为C1-C4卤代烷基。在仍其它实施例中，E可以为-O(C1-C4烷基)。在仍其它实施例中，E可以为-O(C1-C4卤代烷基)。
在一些实施例中，当Rb为-CH2CH2-Rc时，Rc可以为苯基。在其它实施例中，当Rb为-CH2CH2-Rc时，Rc可以为萘基。在仍其它实施例中，当Rb为-CH2CH2-Rc时，Rc可以为羟基苯基。在仍其它实施例中，当Rb为-CH2CH2-Rc时，Rc可以为吲哚基。
在一些实施例中，RK可以为氢。在其它实施例中，RK可以为未被取代的C1-6烷基。例如，在一些实施例中，RK可以为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基(支链和直链)或己基(支链和直链)。在其它实施例中，RK可以为被取代的C1-6烷基。在其它实施例中，RK可以为-NH(C1-4烷基)。例如，在一些实施例中，RK可以为-NH(CH3)、-NH(CH2CH3)、-NH(异丙基)或-NH(仲丁基)。在其它实施例中，RK可以为-N(C1-4烷基)2。
在一些实施例中，RK可以为未被取代的C6-10芳基。在其它实施例中，RK可以为被取代的C6-10芳基。在其它实施例中，RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基。在其它实施例中，RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基。当RK部分被指示为“被取代的”时，所述部分可以被一个或多个例如一个、两个、三个或四个取代基取代基Q取代。在一些实施例中，Q可以为-OH。在其它实施例中，Q可以为C1-4烷基。在仍其它实施例中，Q可以为C1-4卤代烷基。在仍其它实施例中，Q可以为卤代基。在仍其它实施例中，Q可以为氰基。在仍其它实施例中，Q可以为-O-(C1-4烷基)。在仍其它实施例中，Q可以为-O-(C1-4卤代烷基)。
在一些实施例中，RK可以为苯基或萘基。在其它实施例中，RK可以为苯并噻吩基。在其它实施例中，RK可以为苯并噻吩基。在其它实施例中，RK可以为苯并噻吩基。在仍其它实施例中，RK可以为吡啶基。在又仍其它实施例中，RK可以为被一个或多个取代基Q取代的吡啶基。例如，RK可以为甲基吡啶基、乙基吡啶基、氰基吡啶基、氯吡啶基、氟吡啶基或溴吡啶基。
在一些实施例中，RG可以为氢。在一些实施例中，RG可以为C1-4烷基。在一些实施例中，RG可以为-(C1-4烷基)-C(＝O)NH2。
在一些实施例中，RY和RZ可以独立地不存在。在其它实施例中，RY和RZ可以独立地为氢。在其它实施例中，RY和RZ可以独立地为卤代基。在其它实施例中，RY和RZ可以独立地为C1-6烷基。在其它实施例中，RY和RZ可以独立地为-OH。在仍其它实施例中，RY和RZ可以独立地为-O-(C1-4烷基)。在其它实施例中，RY和RZ可以独立地为-NH(C1-4烷基)。例如，RY和RZ可以独立地为-NH(CH3)、-NH(CH2CH3)、-NH(异丙基)或-NH(仲丁基)。在其它实施例中，RY和RZ可以独立地为-N(C1-4烷基)2。
在一些实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成环。在一些实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000641
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000651
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000652
在仍其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000653
在又仍其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000654
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000655
在又其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000656
在又仍其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000657
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000658
在仍其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成和
Figure BDA0003186938500000659
在一些实施例中，当RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成环时，所述环可以被独立地选自C1-C4烷基、-N(C1-C4烷基)2、氰基、未被取代的苯基和被1-5个卤原子取代的苯基的一个、两个或三个基团取代。
在一些实施例中，当RY和RZ结合在一起形成
Figure BDA0003186938500000661
时，那么RJ可以为-ORb或＝O。
在一些实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000662
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000663
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000664
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000665
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000666
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000667
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000671
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000672
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000673
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成
Figure BDA0003186938500000674
在一些实施例中，当RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成环时，所述环可以被独立地选自C1-C4烷基、-N(C1-C4烷基)2、氰基、未被取代的苯基和被1-5个卤原子取代的苯基的一个、两个或三个基团取代。在一些实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以为
Figure BDA0003186938500000675
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以为
Figure BDA0003186938500000676
在仍其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以为
Figure BDA0003186938500000677
在又仍其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以为
Figure BDA0003186938500000678
在其它实施例中，RY和RZ连同其所连接的原子可以为
Figure BDA0003186938500000679
在一些实施例中，Rd可以为氢。在其它实施例中，Rd可以为C1-C4烷基。例如，Rd可以为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。在仍其它实施例中，Rd可以为卤代基。在其它实施例中，Rd可以为氰基。
在一些实施例中，Rm可以为氢。在其它实施例中，Rm可以为C1-C4烷基。例如，Rm可以为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。在仍其它实施例中，Rm可以为卤代基。例如，Rm可以为氟、氯、溴或碘。在其它实施例中，Rm可以为氰基。
在一些实施例中，X、Y和Z可以各自独立地为N或C，其中任何碳原子的化合价按需用氢原子填充。在一些实施例中，X可以为N，Y可以为N，并且Z可以为N。在其它实施例中，X可以为N，Y可以为N，并且Z可以为CH。在一些实施例中，X可以为N，Y可以为CH，并且Z可以为N。在仍其它实施例中，X可以为CH，Y可以为N，并且Z可以为N。在又仍其它实施例中，X可以为CH，Y可以为CH，并且Z可以为N。在其它实施例中，X可以为CH，Y可以为N，并且Z可以为CH。在又其它实施例中，X可以为N，Y可以为CH，并且Z可以为CH。在其它实施例中，X可以为CH，Y可以为CH，并且Z可以为CH。
在一些实施例中，Ra可以为氢；Rb可以为-(C1-C4烷基)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：-C(＝O)NH2；未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；RK可以选自由以下组成的组：氢、未被取代的C1-6烷基；-NH(C1-4烷基)；-N(C1-4烷基)2、未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；RG可以为-(C1-4烷基)-C(＝O)NH2；RY和RZ可以各自独立地不存在或选自由以下组成的组：氢、C1-6烷基和-NH(C1-4烷基)；或者RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成选自以下的环：
Figure BDA0003186938500000691
Figure BDA0003186938500000692
其中所述环可以任选地被一个、两个或三个独立地选自以下的基团取代：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-OH、-O-(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、未被取代的C6-C10芳基、被1-5个卤原子取代的C6-C10芳基以及-O-(C1-4卤代烷基)；Rd可以为C1-C4烷基；Rm可以为氰基；并且X、Y和Z可以各自独立地为N或C，其中任何碳原子的化合价按需用氢原子填充。
在一些实施例中，Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：未被取代的苯基、被取代的苯基、吲哚基和-C(＝O)NH2；RK可以选自由以下组成的组：氢、甲基、被取代的吡啶基、未被取代的苯并噻吩基和-NH(C1-C4烷基)；RG可以为-CH2CH2-C(＝O)NH2；RY可以为-NH(C1-C4烷基)；RZ可以不存在或为氢；或者RY和RZ连同其所连接的原子可以接合在一起以形成选自以下的环：
Figure BDA0003186938500000693
Figure BDA0003186938500000694
Figure BDA0003186938500000695
其中所述环可以任选地被一个、两个或三个独立地选自以下的基团取代：C1-C4烷基、-N(C1-C4烷基)2、氰基、未被取代的苯基和被1-5个卤原子取代的苯基；Rd可以为C1-C4烷基；Rm可以为氰基；并且X可以为N或CH。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000696
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；或者Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E为-OH；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；或者RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基、被一个或多个Q取代，其中Q可以选自氰基、卤代基或C1-C4烷基；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000701
Figure BDA0003186938500000702
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000703
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；或者Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E为-OH；RK可以为氢、C1-4烷基或具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；并且RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000704
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000705
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；或者Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E为-OH；RK可以为氢、C1-4烷基或具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；并且RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000706
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000707
可以为双键，Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E可以为-OH；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RY可以为-NH(C1-4烷基)；RZ可以为氢；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；Z可以为C；并且接合Y和Z的
Figure BDA0003186938500000711
可以为双键。在一些实施例中，式(I)化合物可以为4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-6-(异丙基氨基)嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000712
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc，Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E可以为-OH；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RY和RZ结合在一起为
Figure BDA0003186938500000713
其中环被C1-C4烷基取代；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000714
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc，Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E可以为-OH；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RY和RZ结合在一起为
Figure BDA0003186938500000715
Rd可以为C1-C4烷基；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-7-异丙基-6,7-二氢-5H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000716
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc，Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E可以为-OH；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RY和RZ结合在一起为
Figure BDA0003186938500000717
Rd可以为C1-C4烷基；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为2-(苯并[b]噻吩-3-基)-4-((4-羟基苯乙基)氨基)-7-异丙基-5,7-二氢-6H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮。
在一些实施例中，当RJ为-ORb时,G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000721
可以为双键；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为-C(＝O)NH2；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000722
Rd可以为C1-C4烷基；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为3-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基)氧基)丙酰胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000723
可以为双键；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E为-OH；RK为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000724
其中所述环被-N(C1-4烷基)2取代；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-8-(二甲基氨基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000725
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q为氰基；RY可以为-NH(C1-4烷基)；RZ可以不存在；J可以为C；X可以为C；Y可以为C；Z可以为N；并且接合Y和Z的
Figure BDA0003186938500000726
可以为双键。在一些实施例中，式(I)化合物可以为5-(2-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)-6-(仲丁基氨基)嘧啶-4-基)烟腈。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000727
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为未被取代的C1-6烷基；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000731
其中环被未被取代的C6-C10芳基取代；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；Z可以为C。。在一些实施例中，式(I)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-甲基-6-苯基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-胺。
在一些实施例中，当RJ可以为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000732
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为氢；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000733
其中环被被取代的C6-C10芳基取代；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-胺。
在一些实施例中，当RJ为＝O时，G可以为被RG取代的N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000734
可以为单键；RG可以为-(C1-4烷基)-C(＝O)NH2；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000735
Rd可以为C1-C4烷基；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为3-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-1-基)丙酰胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000736
可以为双键，Ra可以为氢，Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q可以为卤代基；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000737
J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000741
可以为双键；Ra可以为氢，Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q可以为氰基；RY和RZ结合在一起为
Figure BDA0003186938500000742
J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)喹唑啉-2-基)烟腈。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000743
可以为双键；Ra可以为氢，Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为-NH(C1-4烷基)；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000744
J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为N4-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-N2-(仲丁基)喹唑啉-2,4-二胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000745
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E为-OH；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000746
其中环被氰基取代；Rd可以为C1-C4烷基；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为2-(苯并[b]噻吩-3-基)-4-((4-羟基苯乙基)氨基)-7-异丙基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲腈。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000747
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000751
其中环被C1-4烷基取代；J可以为C；X可以为C；Y可以为N；并且Z可以为C；其中任何碳原子的化合价按需用氢原子填充。在一些实施例中，式(I)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-6-(苯并[b]噻吩-3-基)-3-异丙基咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000752
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E为-OH；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000753
其中环可以被C1-4烷基取代；J可以为C；X可以为C；Y可以为N；并且Z可以为C；其中任何碳原子的化合价按需用氢原子填充。在一些实施例中，式(I)化合物可以为4-(2-((6-(苯并[b]噻吩-3-基)-3-异丙基咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-基)氨基)乙基)苯酚。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000754
表示双键；Ra可以为氢，Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q为氰基；RY和RZ结合在一起为
Figure BDA0003186938500000755
其中环被C1-C4烷基取代；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)烟腈。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000756
表示双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q为卤代基；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000761
其中环被C1-C4烷基取代；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000762
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q为卤代基；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000763
J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000764
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q为C1-C4烷基；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000765
J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-甲基吡啶-3-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000766
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q为C1-C4烷基；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000771
其中环被C1-C4烷基取代；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-7-异丙基-2-(5-甲基吡啶-3-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000772
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q为氰基；RY和RZ结合在一起可以为
Figure BDA0003186938500000773
J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I)化合物可以为5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基)烟腈。
在一些实施例中，本文提供了式(I)化合物，其中所述化合物可以选自：4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-6-(异丙基氨基)嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚；4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚；4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-7-异丙基-6,7-二氢-5H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚；2-(苯并[b]噻吩-3-基)-4-((4-羟基苯乙基)氨基)-7-异丙基-5,7-二氢-6H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮；3-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基)氧基)丙酰胺；4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-8-(二甲基氨基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚；5-(2-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)-6-(仲丁基氨基)嘧啶-4-基)烟腈；N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-甲基-6-苯基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-胺；N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-胺；3-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-1-基)丙酰胺；
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-胺；5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)喹唑啉-2-基)烟腈；N4-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-N2-(仲丁基)喹唑啉-2,4-二胺；2-(苯并[b]噻吩-3-基)-4-((4-羟基苯乙基)氨基)-7-异丙基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲腈；N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-6-(苯并[b]噻吩-3-基)-3-异丙基咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺；4-(2-((6-(苯并[b]噻吩-3-基)-3-异丙基咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-基)氨基)乙基)苯酚；5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)烟腈；N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-胺；N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-胺；N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-甲基吡啶-3-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-胺；N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-7-异丙基-2-(5-甲基吡啶-3-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-胺；5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基)烟腈；以及其药学上可接受的盐。式(I-A)
在本文所提供的一些实施例中，式(I)化合物可以具有式(I-A)的结构：
Figure BDA0003186938500000781
(I-A)，包含其药学上可接受的盐，其中：RJ可以为-NRaRb；Ra可以为氢或C1-C4烷基；Rb可以为Rc或-(C1-C4烷基)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；RK可以选自由以下组成的组：氢、未被取代的C1-6烷基；-NH(C1-4烷基)；-N(C1-4烷基)2、未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；Y和Z可以各自为C；X可以为N或CH；W可以为O或S；并且Re可以为氢或C1-C4烷基。
在一些实施例中，Ra可以为氢。在其它实施例中，Ra可以为C1-C4烷基。
在一些实施例中，Rb可以为-(C1-C4烷基)-Rc。例如，Rb可以为-CH2-Rc、-CH2CH2-Rc、-CH2CH2CH2-Rc或-CH2CH2CH2CH2-Rc。
在一些实施例中，Rc可以为-OH。在一些实施例中，Rc可以为-O(C1-C4烷基)。在一些实施例中，Rc可以为-O(C1-C4卤代烷基)。在一些实施例中，Rc可以为-C(＝O)NH2。在一些实施例中，Rc可以为未被取代的C 6-10芳基。在一些实施例中，Rc可以为被取代的C6-10芳基。在一些实施例中，Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基。在一些实施例中，Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基。在一些实施例中，当Rc部分被指示为“被取代的”时，所述部分可以被一个或多个例如一个、两个、三个或四个取代基E取代。在一些实施例中，E可以为-OH。在一些实施例中，E可以为C1-C4烷基。在一些实施例中，E可以为C1-C4卤代烷基。在一些实施例中，E可以为-O(C1-C4烷基)。在一些实施例中，E可以为-O(C1-C4卤代烷基)。在一些实施例中，Rc可以为苯基。在其它实施例中，Rc可以为羟基苯基。在仍其它实施例中，Rc可以为吲哚基。
在一些实施例中，RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基。在一些实施例中，RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中所述被取代的杂芳基可以被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)。在一些实施例中，RK可以为吡啶基。在其它实施例中，RK可以为被一个或多个取代基Q取代的吡啶基。例如，RK可以为甲基吡啶基、乙基吡啶基、氰基吡啶基、氯吡啶基、氟吡啶基或溴吡啶基。
在一些实施例中，Re可以为氢。在一些实施例中，Re可以为C1-C4烷基。例如，Re可以为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
在一些实施例中，Ra可以为氢；Rb可以为-(C1-C4烷基)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；RK可以选自由以下组成的组：具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中所述被取代的杂芳基被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；并且Re可以为C1-C4烷基。
在一些实施例中，Ra可以为氢；Rb可以为-(CH2-CH2)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：被取代的苯基和未被取代的吲哚基；其中所述被取代的苯基被一个取代基E取代，其中E可以为-OH；RK可以选自由以下组成的组：未被取代的苯并噻吩基和被取代的吡啶基；其中所述被取代的吡啶基被一个取代基Q取代，其中Q可以选自由以下组成的组：C1-4烷基、卤代基和氰基；并且Re可以为异丙基。
在一些实施例中，当W为O时，RJ可以为-NRaRb；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基和-O(C1-C4烷基)；RK可以选自由以下组成的组：具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-C1-4烷基、卤代基、氰基和-O-(C1-4烷基)；Y和Z可以各自为C；X可以为N或CH；并且Re可以为氢或C1-C4烷基。
在一些实施例中，当W为S时，RJ可以为-NRaRb；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基和-O(C1-C4烷基)；RK可以选自由以下组成的组：具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-C1-4烷基、卤代基、氰基和-O-(C1-4烷基)；Y和Z可以各自为C；X可以为N或CH；并且Re可以为氢或C1-C4烷基。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q为C1-C4烷基；W可以为S；Re可以为C1-C4烷基；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I-A)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-7-异丙基-2-(5-甲基吡啶-3-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；Ra可以为氢，Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q为氰基；W可以为S；Re可以为C1-C4烷基；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I-A)化合物可以为5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)烟腈。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q为卤代基；W可以为S；Re可以为C1-C4烷基；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I-A)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc，Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E可以为-OH；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；W可以为S；Re可以为C1-C4烷基；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I-A)化合物可以为4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q为卤代基；W可以为O；Re可以为氢；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I-A)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000822
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q为C1-C4烷基；W可以为O；Re可以为氢；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I-A)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-甲基吡啶-3-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G为N；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q为氰基；W可以为O；Re可以为氢；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I-A)化合物可以为5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基)烟腈。
在一些实施例中，式(I-A)化合物或其药学上可接受的盐可以选自由以下组成的组：N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-7-异丙基-2-(5-甲基吡啶-3-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-胺；5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)烟腈；N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-胺；4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚；N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-胺；N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-甲基吡啶-3-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-胺；以及5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基)烟腈。式(I-B)
在本文所提供的其它实施例中，式(I)化合物可以具有式(I-B)的结构：
Figure BDA0003186938500000821
(I-B)，包含其药学上可接受的盐，其中：Ra可以为氢或C1-C4烷基；Rb可以为Rc或-(C1-4烷基)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：-OH、-O(C1-C4烷基)、-O(C1-C4卤代烷基)；-C(＝O)NH2；未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；RK可以选自由以下组成的组：氢、未被取代的C1-6烷基；被取代的C1-6烷基；-NH(C1-4烷基)；-N(C1-4烷基)2、未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；RG可以选自由氢、C1-4烷基和-(C1-4烷基)-C(＝O)NH2组成的组；Rf可以选自由氢、C1-4烷基、未被取代的C6-C10芳基以及被1-5个卤原子取代的C6-C10芳基组成的组；U可以为N或CRU；V可以为S或NRV；RU可以选自由氢、C1-4烷基、卤代基和氰基组成的组；RV可以为氢或C1-C4烷基；其中当U为CRU且V为NRV时，RU选自由C1-4烷基、卤代基和氰基组成的组；Y和Z可以各自为C；并且X可以为N或CH。
在一些实施例中，Ra可以为氢。在其它实施例中，Ra可以为C1-C4烷基。
在一些实施例中，Rb可以为-(C1-C4烷基)-Rc。例如，Rb可以为-CH2-Rc、-CH2CH2-Rc、-CH2CH2CH2-Rc或-CH2CH2CH2CH2-Rc。在某些实施例中，Rb可以为-(CH2CH2)-Rc。在某些实施例中，Rb可以为-(CH2CH2)-C(＝O)NH2。在某些实施例中，Rb可以为-(CH2CH2)-(吲哚基)。在某些实施例中，Rb可以为-(CH2CH2)-(羟基苯基)。
在一些实施例中，Rc可以为-OH。在一些实施例中，Rc可以为-O(C1-C4烷基)。在一些实施例中，Rc可以为-O(C1-C4卤代烷基)。在一些实施例中，Rc可以为-C(＝O)NH2。在一些实施例中，Rc可以为未被取代的C 6-10芳基。在一些实施例中，Rc可以为被取代的C6-10芳基。在一些实施例中，Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基。在一些实施例中，Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基。在一些实施例中，当Rc部分被指示为“被取代的”时，所述部分可以被一个或多个例如一个、两个、三个或四个取代基E取代。在一些实施例中，E可以为-OH。在一些实施例中，E可以为C1-C4烷基。在一些实施例中，E可以为C1-C4卤代烷基。在一些实施例中，E可以为-O(C1-C4烷基)。在一些实施例中，E可以为-O(C1-C4卤代烷基)。
在一些实施例中，RK可以为氢。在其它实施例中，RK可以为C1-C4烷基。例如，RK可以为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。在一些实施例中，RK可以选自由以下组成的组：具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中所述被取代的杂芳基可以被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)。在某些实施例中，RK可以为苯并噻吩基。在其它实施例中，RK可以为被一个或多个取代基Q取代的吡啶基。例如，RK可以为甲基吡啶基、乙基吡啶基、氰基吡啶基、氯吡啶基、氟吡啶基或溴吡啶基。
在一些实施例中，RG可以选自由氢、C1-4烷基和-(C1-4烷基)-C(＝O)NH2组成的组。在某些实施例中，RG可以为-(CH2CH2)-C(＝O)NH2。
在一些实施例中，Rf可以为氢。在其它实施例中，Rf可以为C1-4烷基。例如，Rf可以为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。在一些实施例中，Rf可以为未被取代的C6-C10芳基。在其它实施例中，Rf可以为被1-5个卤原子取代的C6-C10芳基。在某些实施例中，Rf可以为被1-5个卤原子取代的苯基。在某些实施例中，Rf可以为氟苯基。
在一些实施例中，U可以为N。在其它实施例中，U可以为CRU。
在一些实施例中，V可以为S。在其它实施例中，V可以为NRV。
在一些实施例中，RU可以为氢。在一些实施例中，RU可以为C1-4烷基。在其它实施例中，RU可以为卤代基。例如，RU可以为氟、氯、溴或碘。在仍其它实施例中，RU可以为氰基。
在一些实施例中，RV可以为氢。在其它实施例中，RV可以为C1-4烷基。例如，RV可以为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。在一些实施例中，Y和Z可以各自为C并且X可以为N。在其它实施例中，Y和Z可以各自为C并且X可以为CH。
在一些实施例中，Ra可以为氢；Rb可以为-(C1-4烷基)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：-C(＝O)NH2、未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分可以被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；RK可以选自由以下组成的组：具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中所述被取代的杂芳基被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；RG为C1-4烷基或-(C1-4烷基)-C(＝O)NH2组成的组；Rf可以选自由氢、未被取代的苯基以及被1-5个卤原子取代的苯基组成的组；Y和Z可以各自为C；并且X可以为CH。
在一些实施例中，Ra可以为氢；Rb可以为-(CH2-CH2)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：-C(＝O)NH2、被取代的苯基和未被取代的吲哚基；其中所述被取代的苯基被一个取代基E取代，其中E可以为-OH；RK可以选自由以下组成的组：未被取代的苯并噻吩基和被取代的吡啶基；其中所述被取代的吡啶基被一个取代基Q取代，其中Q可以选自由以下组成的组：C1-4烷基、卤代基和氰基；RG可以为(-CH2CH2)-C(＝O)NH2；Rf可以选自由氢、苯基和氟苯基组成的组；Y和Z可以各自为C；并且X可以为CH。
在一些实施例中，当V为S时，Ra可以为氢或C1-C4烷基；Rb可以为Rc或-(CH2-CH2)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：-C(＝O)NH2；未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基和-O(C1-C4烷基)；RK可以选自由以下组成的组：氢、未被取代的C1-6烷基；被取代的C1-6烷基；-NH(C1-4烷基)；以及-N(C1-4烷基)2；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、卤代基、氰基和-O-(C1-4烷基)；RG可以选自由氢、C1-4烷基和-(C1-4烷基)-C(＝O)NH2组成的组；Rf可以选自由氢、C1-4烷基、未被取代的C6-C10芳基以及被1-5个卤原子取代的C6-C10芳基组成的组；U可以为CRU；RU可以选自由氢、C1-4烷基、卤代基和氰基组成的组；Y和Z可以各自为C；并且X可以为N。
在一些实施例中，当V为NRV时，Ra可以为氢或C1-C4烷基；Rb可以为Rc或-(CH2-CH2)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：-C(＝O)NH2；未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4和-O(C1-C4烷基)；RK可以选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、卤代基、氰基和-O-(C1-4烷基)；RG可以选自由氢、C1-4烷基和-(C1-4烷基)-C(＝O)NH2组成的组；Rf可以为氢；U可以为N或CRU；RU可以选自由C1-4烷基、卤代基和氰基组成的组；RV可以为氢或C1-C4烷基；Y和Z可以各自为C；并且X可以为N或CH。
在一些实施例中，当RJ为-ORb时,G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000861
可以为双键；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为-C(＝O)NH2；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；U可以为N；V可以为NRv；Rv可以为C1-C4烷基；Rf可以为氢；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I-B)化合物可以为3-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基)氧基)丙酰胺。
在一些实施例中，当RJ为＝O时，G可以为被RG取代的N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000862
可以为单键；RG可以为-(C1-4烷基)-C(＝O)NH2；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；U可以为N；V可以为NRv；Rv可以为C1-C4烷基；Rf可以为氢；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I-B)化合物可以为3-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-1-基)丙酰胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000863
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E为-OH；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；U可以为CRU；Ru可以为氰基；V可以为NRv；Rv可以为C1-C4烷基；Rf可以为氢；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I-B)化合物可以为2-(苯并[b]噻吩-3-基)-4-((4-羟基苯乙基)氨基)-7-异丙基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲腈。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000872
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为未被取代的C1-6烷基；U可以为CRU；Ru可以为氢；V可以为S；Rf可以为苯基；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；Z可以为C。在一些实施例中，式(I-B)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-甲基-6-苯基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-胺。
在一些实施例中，当RJ可以为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000873
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为氢；U可以为CRU；Ru可以为氢；V可以为S；Rf可以为氟苯基；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I-B)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-胺。
在一些实施例中，式(I-B)化合物或其药学上可接受的盐可以选自由以下组成的组：3-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基)氧基)丙酰胺；3-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-1-基)丙酰胺；2-(苯并[b]噻吩-3-基)-4-((4-羟基苯乙基)氨基)-7-异丙基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲腈；N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-甲基-6-苯基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-胺；以及N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-胺。式(I-C)
在本文所提供的仍其它实施例中，式(I)化合物可以具有式(I-C)的结构：
Figure BDA0003186938500000871
(I-C)，包含其药学上可接受的盐，其中：RJ可以为-NRaRb；Ra可以为氢或C1-C4烷基；Rb可以为Rc或-(C1-C4烷基)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；RK可以选自由以下组成的组：氢、未被取代的C1-6烷基；-NH(C1-4烷基)；-N(C1-4烷基)2、未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；A可以为N或CH；B可以为N或CH；Rg可以选自由氢、C1-4烷基和-N(C1-4烷基)2组成的组；Y和Z可以各自为C；并且X可以为N或CH。
在一些实施例中，RK可以为-NH(C1-4烷基)。例如，在一些实施例中，RK可以为-NH(CH3)、-NH(CH2CH3)、-NH(异丙基)或-NH(仲丁基)。在一些实施例中，RK可以为未被取代的苯并噻吩基。在其它实施例中，RK可以为被取代的吡啶基。例如，RK可以为甲基吡啶基、乙基吡啶基、氰基吡啶基、氯吡啶基、氟吡啶基或溴吡啶基。
在一些实施例中，A可以为N并且B可以为N。在其它实施例中，A可以为N并且B可以为CH。在仍其它实施例中，A可以为CH并且B可以为N。在又仍其它实施例中，A可以为CH并且B可以为CH。
在一些实施例中，Rg可以为氢。在其它实施例中，Rg可以为-N(C1-4烷基)2。在某些实施例中，Rg可以为-N(CH3)2。
在一些实施例中，Ra可以为氢；Rb可以为-(C1-C4烷基)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；RK可以选自由以下组成的组：-NH(C1-4烷基)；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中所述被取代的杂芳基被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；并且Rg可以为氢或-N(C1-4烷基)2。
在一些实施例中，Ra可以为氢；Rb可以为-(C1-C4烷基)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：被取代的苯基和未被取代的吲哚基；其中所述被取代的苯基被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；RK可以选自由以下组成的组：-NH(C1-4烷基)；未被取代的苯并噻吩基；以及被取代的吡啶基；其中所述被取代的吡啶基被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；并且Rg可以为氢或-N(C1-4烷基)2。
在一些实施例中，Ra可以为氢；Rb可以为-(CH2CH2)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：被取代的苯基和未被取代的吲哚基；其中所述被取代的苯基被一个取代基E取代，其中E可以为-OH；RK可以选自由以下组成的组：-NH(仲丁基)；未被取代的苯并噻吩基和被取代的吡啶基；其中所述被取代的吡啶基被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：C1-4烷基、卤代基和氰基；并且Rg可以为氢或-N(CH3)2。
在一些实施例中，当A为C且B为C时，RJ可以为-NRaRb；G可以为N；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E为-OH；或者具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；Rg可以为氢；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z为C。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E为-OH；RK为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；A可以为N；B可以为N；Rg可以为-N(C1-4烷基)2；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z为C。在一些实施例中，式(I-C)化合物可以为4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-8-(二甲基氨基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；Ra可以为氢，Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q可以为卤代基；A可以为CH；B可以为CH；Rg可以为氢；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I-C)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000902
可以为双键；Ra可以为氢，Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个Q取代，其中Q可以为氰基；A可以为CH；B可以为CH；Rg可以为氢；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I-C)化合物可以为5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)喹唑啉-2-基)烟腈。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000903
可以为双键；Ra可以为氢，Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；RK可以为-NH(C1-4烷基)；A可以为CH；B可以为CH；Rg可以为氢；J可以为C；X可以为N；Y可以为C；并且Z可以为C。在一些实施例中，式(I-C)化合物可以为N4-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-N2-(仲丁基)喹唑啉-2,4-二胺。
在一些实施例中，式(I-C)化合物或其药学上可接受的盐可以选自由以下组成的组：4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-8-(二甲基氨基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚；N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-胺；5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)喹唑啉-2-基)烟腈；以及N4-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-N2-(仲丁基)喹唑啉-2,4-二胺。式(I-D)
在本文所提供的又仍其它实施例中，式(I)化合物可以具有式(I-D)的结构：
Figure BDA0003186938500000901
(I-D)，包含其药学上可接受的盐，其中：RJ可以为-NRaRb；Ra可以为氢或C1-C4烷基；Rb可以为Rc或-(C1-4烷基)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；RK可以选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；Rh可以为氢或C1-4烷基；D可以为N或CH；Y可以为N；Z可以为C；并且X可以为N或CH。
在一些实施例中，Rh可以为氢。在其它实施例中，Rh可以为C1-4烷基。例如，Rh可以为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
在一些实施例中，D可以为N。在其它实施例中，D可以为CH。
在一些实施例中，当D为N时，Y可以为N，Z可以为C，并且X可以为N。在其它实施例中，当D为N时，Y可以为N，Z可以为C，并且X可以为CH。在一些实施例中，当D为CH时，Y可以为N，Z可以为C，并且X可以为N。在其它实施例中，当D为CH时，Y可以为N，Z可以为C，并且X可以为CH。
在一些实施例中，Ra可以为氢；Rb可以为-(C1-4烷基)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；RK可以选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；并且Rh可以为氢或C1-4烷基。
在一些实施例中，Ra可以为氢；Rb可以为-(C1-C4烷基)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：被取代的苯基和未被取代的吲哚基；其中所述被取代的苯基被一个或多个取代基E取代，其中每个E可以独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；RK可以为未被取代的苯并噻吩基；并且Rh可以为氢或C1-4烷基。
在一些实施例中，Ra可以为氢；Rb可以为-(CH2-CH2)-Rc；Rc可以选自由以下组成的组：被取代的苯基和未被取代的吲哚基；其中所述被取代的苯基被一个取代基E取代，其中E可以为-OH；RK可以为未被取代的苯并噻吩基；并且Rh可以为氢或C1-4烷基。
在一些实施例中，当D为N时，RJ为-NRaRb；G可以为N；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；或者为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E为-OH；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；Rh可以为C1-4烷基；J可以为C；X可以为C；Y可以为N；并且Z可以为C；其中任何碳原子的化合价按需用氢原子填充。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基或被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E为-OH；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；D可以为N；Rh可以为C1-4烷基；J可以为C；X可以为C；Y可以为N；并且Z可以为C；其中任何碳原子的化合价按需用氢原子填充。在一些实施例中，式(I-D)化合物可以为N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-6-(苯并[b]噻吩-3-基)-3-异丙基咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺。
在一些实施例中，当RJ为-NRaRb时，G可以为N；接合G和J的
Figure BDA0003186938500000921
可以为双键；Ra可以为氢；Rb可以为-CH2CH2-Rc；Rc可以为被一个或多个E取代的被取代的C6-10芳基，其中E为-OH；RK可以为具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；D可以为N；Rh可以为C1-4烷基；J可以为C；X可以为C；Y可以为N；并且Z可以为C；其中任何碳原子的化合价按需用氢原子填充。在一些实施例中，式(I-D)化合物可以为4-(2-((6-(苯并[b]噻吩-3-基)-3-异丙基咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-基)氨基)乙基)苯酚。
在一些实施例中，式(I-D)化合物或其药学上可接受的盐可以选自由以下组成的组：N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-6-(苯并[b]噻吩-3-基)-3-异丙基咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺；以及4-(2-((6-(苯并[b]噻吩-3-基)-3-异丙基咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-基)氨基)乙基)苯酚。
本文所提供的化合物可以是对映异构纯的如单一对映异构体或单一非对映异构体或者是立体异构混合物如对映异构体的混合物，例如，两个对映异构体的外消旋混合物；或两个或更多个非对映异构体的混合物。如此，本领域技术人员将认知到，对于在体内经历差向异构作用的化合物而言，呈其(R)形式的化合物的施用与呈其(S)形式的化合物的施用等效。用于各个对映异构体的制备/分离的常规技术包含：由合适的光学纯前体的合成、由非手性起始材料的不对称合成或对映异构混合物的分解，例如，手性色谱、重结晶、分解、非对映异构盐形成或衍生成非对映异构加合物、然后分离。
5.4.NK细胞的分离
分离自然杀伤细胞的方法在本领域是已知的并且可以用于分离自然杀伤细胞，例如，使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞。例如，NK细胞可以例如通过在一个实施例中用针对CD56和CD3的抗体对细胞进行染色并选择CD56+CD3-细胞来分离或富集。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使NK细胞富集CD56+CD3-细胞。NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的细胞可以使用可商购获得的试剂盒例如NK细胞分离试剂盒(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))进行分离。NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的细胞还可以通过去除包括NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的细胞的细胞群中的除NK细胞以外的细胞来分离或富集。例如，NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的细胞可以通过使用例如针对CD3、CD4、CD14、CD19、CD20、CD36、CD66b、CD123、HLA DR和/或CD235a(血型糖蛋白A)中的一种或多种的抗体耗竭显示非NK细胞标志物的细胞来分离或富集。阴性分离可以使用可商购获得的试剂盒例如NK细胞阴性分离试剂盒(戴诺生物技术公司(Dynal Biotech)进行。可以另外对通过这些方法分离的细胞进行分选，例如，以分离CD11a+细胞和CD11a-细胞和/或CD117+细胞和CD117-细胞和/或CD16+细胞和CD16-细胞和/或CD94+和CD94-。在某些实施例中，对细胞例如通过本文所描述的三步法产生的细胞进行分选以分离CD11a+细胞和CD11a-细胞。在具体实施例中，分离CD11a+细胞。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使细胞富集CD11a+细胞。在具体实施例中，分离CD11a-细胞。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使细胞富集CD11a-细胞。在某些实施例中，对细胞进行分选以分离CD117+细胞和CD117-细胞。在具体实施例中，分离CD117+细胞。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使细胞富集CD117+细胞。在具体实施例中，分离CD117-细胞。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使细胞富集CD117-细胞。在某些实施例中，对细胞进行分选以分离CD16+细胞和CD16-细胞。在具体实施例中，分离CD16+细胞。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使细胞富集CD16+细胞。在具体实施例中，分离CD16-细胞。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使细胞富集CD16-细胞。在某些实施例中，对细胞进行分选以分离CD94+细胞和CD94-细胞。在具体实施例中，分离CD94+细胞。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使细胞富集CD94+细胞。在具体实施例中，分离CD94-细胞。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使细胞富集CD94-细胞。在某些实施例中，使用磁性分离执行分离。在某些实施例中，使用流式细胞术执行分离。
分离ILC3细胞的方法在本领域是已知的并且可以用于分离ILC3细胞，例如，使用本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞。例如，ILC3细胞可以例如通过在一个实施例中用针对CD56、CD3和CD11a的抗体对细胞进行染色并选择CD56+CD3-CD11a-细胞来分离或富集。ILC3细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的细胞还可以通过去除包括ILC3细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的细胞的细胞群中的除ILC3细胞以外的细胞来分离或富集。例如，ILC3细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的细胞可以通过使用例如针对CD3、CD4、CD11a、CD14、CD19、CD20、CD36、CD66b、CD94、CD123、HLA DR和/或CD235a(血型糖蛋白A)中的一种或多种的抗体耗竭显示非ILC3细胞标志物的细胞来分离或富集。可以另外对通过这些方法分离的细胞进行分选，例如，以分离CD117+细胞和CD117-细胞。NK细胞可以例如通过在一个实施例中用针对CD56、CD3、CD94和CD11a的抗体对细胞进行染色并选择CD56+CD3-CD94+CD11a+细胞来分离或富集。NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的细胞还可以通过去除包括NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的细胞的细胞群中的除NK细胞以外的细胞来分离或富集。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使NK细胞富集CD56+CD3-CD94+CD11a+细胞。
在一个实施例中，ILC3细胞通过选择CD56+CD3-CD11a-细胞来分离或富集。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使ILC3细胞富集CD56+CD3-CD11a-细胞。在一个实施例中，ILC3细胞通过选择CD56+CD3-CD11a-CD117+细胞来分离或富集。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使ILC3细胞富集CD56+CD3-CD11a-CD117+细胞。在一个实施例中，ILC3细胞通过选择CD56+CD3-CD11a-CD117+CDIL1R1+细胞来分离或富集。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使ILC3细胞富集CD56+CD3-CD11a-CD117+CDIL1R1+细胞。
在一个实施例中，NK细胞通过选择CD56+CD3-CD94+CD11a+细胞来分离或富集。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使NK细胞富集CD56+CD3-CD94+CD11a+细胞。在一个实施例中，NK细胞通过选择CD56+CD3-CD94+CD11a+CD117-细胞来分离或富集。在某些实施例中，与使用本文所描述的三阶段法产生的总细胞相比，使NK细胞富集CD56+CD3-CD94+CD11a+CD117-细胞。
细胞分离可以通过例如流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)或者在一个实施例中使用与特异性抗体缀合的微珠的磁性细胞分选来完成。细胞可以例如使用磁性激活细胞分选(MACS)技术即用于基于颗粒结合包括一个或多个特异性抗体例如抗CD56抗体的磁珠(例如，直径约0.5-100μm)的能力来分离颗粒的方法来分离。磁性细胞分离可以使用例如AUTOMACSTM分离器(美天旎生物技术公司)来执行并实现自动化。可以对磁性微球执行各种有用的修饰，包含特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体的共价加成。然后将珠与细胞混合以实现结合。然后使细胞通过磁场以分离出具有特异性细胞表面标志物的细胞。在一个实施例中，这些细胞然后可以被分离并与磁珠再混合，所述磁珠与针对另外的细胞表面标志物的抗体偶联。使细胞再次通过磁场，从而分离结合了两种抗体的细胞。然后将此类细胞稀释到单独的培养皿中，如用于克隆分离的微量滴定培养皿。
5.5.胎盘灌注液
NK细胞和/或ILC3细胞例如根据本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群和/或ILC3细胞群可以由造血细胞产生，所述造血细胞例如，来自任何来源例如胎盘组织、胎盘灌注液、脐带血、胎盘血、外周血、脾、肝等的造血干细胞或祖细胞。在某些实施例中，造血干细胞是来自胎盘灌注液和来自用于生成胎盘灌注液的相同胎盘的脐带血的组合造血干细胞。可以例如通过美国专利第7,045,148号和第7,468,276号以及美国专利申请公开第2009/0104164号中公开的方法获得的包括胎盘灌注液细胞的胎盘灌注液，所述美国专利的公开内容特此以其全文并入。
5.5.1.细胞收集组合物
可以通过使用胎盘细胞收集组合物对哺乳动物例如人产后胎盘进行灌注来收集可以从中分离造血干细胞或祖细胞或例如与NK细胞和/或ILC3细胞例如根据本文所提供的三阶段法产生的NK细胞群和/或ILC3细胞群组合可用于肿瘤遏制或对具有肿瘤细胞、癌症或病毒感染的个体的治疗的胎盘灌注液和灌注液细胞。可以通过用任何生理上可接受的溶液例如盐水溶液培养基或更复杂的细胞收集组合物对胎盘进行灌注来从胎盘收集灌注液。相关的美国申请公开第2007/0190042号中详细描述了适合于对胎盘进行灌注并且收集和保存灌注液细胞的细胞收集组合物，所述美国申请公开通过引用以其全文并入本文。
细胞收集组合物可以包括适合于干细胞的收集和/或培养的任何生理上可接受的溶液，例如，盐水溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水、克雷布斯溶液(Kreb's solution)、改良克雷布斯溶液、伊格尔溶液(Eagle's solution)、0.9％NaCl等)、培养基(例如，DMEM、H.DMEM等)等。
细胞收集组合物可以包括一种或多种组分，所述一种或多种组分倾向于保存胎盘细胞，即，从收集的时间到培养的时间防止胎盘细胞死亡或延迟胎盘细胞的死亡、减少细胞群中死亡的胎盘细胞的数量等。此类组分可以是：例如，凋亡抑制剂(例如，半胱天冬酶抑制剂或JNK抑制剂)；血管扩张剂(例如，硫酸镁、抗高血压药物、心房利钠肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼屈嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等)；坏死抑制剂(例如，2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊基氨基-马来酰亚胺、二硫代氨基甲酸吡咯烷或氯硝西泮(clonazepam))；TNF-α抑制剂；和/或载氧全氟碳化物(例如，全氟溴辛烷、全氟溴癸烷等)。
细胞收集组合物可以包括一种或多种组织降解酶，例如，金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、透明质酸酶、RNA酶或DNA酶等。此类酶包含但不限于胶原酶(例如，胶原酶I、II、III或IV、来自溶组织梭状芽胞杆菌(Clostridium histolyticum)的胶原酶等)；分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、释放酶(LIBERASE)、透明质酸酶等。
细胞收集组合物可以包括杀菌或抑菌有效量的抗生素。在某些非限制性实施例中，抗生素为大环内酯(macrolide)(例如，妥布霉素(tobramycin))、头孢菌素(cephalosporin)(例如，头孢氨苄(cephalexin)、头孢拉啶(cephradine)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢克洛(cefaclor)、头孢克肟(cefixime)或头孢羟氨苄(cefadroxil))、克拉霉素(clarithromycin)、红霉素(erythromycin)、青霉素(penicillin)(例如，青霉素V)或喹诺酮(quinolone)(例如，氧氟沙星(ofloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)或诺氟沙星(norfloxacin))、四环素(tetracycline)、链霉素(streptomycin)等。在特定实施例中，抗生素针对革兰氏(+)和/或革兰氏(-)细菌例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等具有活性。
细胞收集组合物还可以包括以下化合物中的一种或多种：腺苷(约1mM到约50mM)；D-葡萄糖(约20mM到约100mM)；镁离子(约1mM到约50mM)；在一个实施例中以足以维持内皮完整性和细胞活力的量存在的分子量大于20,000道尔顿的大分子(例如，以约25g/l到约100g/l或约40g/l到约60g/l存在的合成或天然存在的胶体、多糖如右旋糖酐或聚乙二醇)；抗氧化剂(例如，以约25μM到约100μM存在的叔丁基羟基茴香醚、丁羟甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E)；还原剂(例如，以约0.1mM到约5mM存在的N-乙酰半胱氨酸)；防止钙进入细胞中的药剂(例如，以约2μM到约25μM存在的维拉帕米(verapamil))；硝酸甘油(例如，约0.05g/L到约0.2g/L)；在一个实施例中以足以有助于防止残余血液凝固的量存在的抗凝血剂(例如，以约1000单位/升到约100,000单位/升的浓度存在的肝素或水蛭素)；或含有阿米洛利(amiloride)的化合物(例如，以约1.0μM到约5μM存在的阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、六亚甲基阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利)。
5.5.2.胎盘的收集和处理
通常，在生产之后，人胎盘在其排出后立即回收。在一个实施例中，在经过知情同意之后并且在取得患者的完整病史且完整病史与胎盘相关联后，从患者回收胎盘。在一个实施例中，病史在分娩后继续。
在回收灌注液前，去除脐带血和胎盘血。在某些实施例中，在分娩后，对胎盘中的脐带血进行回收。可以对胎盘进行常规脐带血回收过程。通常在重力的帮助下使用针或套管，以对胎盘进行放血(参见例如，Anderson,美国专利第5,372,581号；Hessel等人,美国专利第5,415,665号)。通常将针或套管放置在脐静脉并且可以轻轻按摩胎盘以帮助将脐带血从胎盘中排出。可以在商业上执行此类脐带血回收，例如，新泽西州锡达诺尔斯的生命银行公司(LifeBank Inc.,Cedar Knolls,N.J.)、ViaCord公司、脐带血库(Cord BloodRegistry)和赛科细胞公司(CryoCell)。在一个实施例中，对胎盘进行重力引流，而不需要进一步操纵，以最小化脐带血回收期间的组织破坏。
通常，将胎盘从分娩室或产房转运到另一个地方例如实验室，以便回收脐带血并收集灌注液。可以在无菌的绝热转运装置中来转运胎盘(将胎盘的温度维持在20-28℃之间)，例如，通过将近端脐带被夹紧的胎盘放置在无菌拉链锁塑料袋中，所述塑料袋然后放置在隔绝容器中。在另一个实施例中，在基本上如美国专利第7,147,626号中所描述的脐带血收集试剂盒中转运胎盘。在一个实施例中，在分娩后四到二十四小时将胎盘递送到实验室。在某些实施例中，在脐带血回收前例如在插入胎盘盘中的4-5cm(厘米)内将近端脐带夹紧。在其它实施例中，在脐带血回收之后但在对胎盘进行进一步处理之前将近端脐带夹紧。
在收集灌注液前，可以在室温下或在5到25℃(摄氏度)的温度下在无菌条件下储存胎盘。胎盘可以储存超过四十八小时的时间段或者在对胎盘进行灌注以去除任何残余脐带血之前储存四到二十四小时的时间段。可以在5℃到25℃(摄氏度)的温度下将胎盘储存在抗凝血溶液中。合适的抗凝血溶液是本领域中众所周知的。例如，可以使用肝素钠或华法林钠溶液。在一个实施例中，抗凝血溶液包括肝素溶液(例如，在1:1000溶液中1％w/w)。在一些实施例中，在收集胎盘灌注液之前，将放血后的胎盘储存不超过36小时。
5.5.3.胎盘灌注
对哺乳动物胎盘进行灌注并获得胎盘灌注液的方法例如在Hariri,美国专利第7,045,148号和第7,255,879号中以及在美国申请公开第2009/0104164号、第2007/0190042号和第20070275362号(作为美国专利第8,057,788号发表)中公开，所述美国专利的公开内容特此通过全文引用的方式并入本文。
可以通过使灌注溶液例如上文所描述的盐水溶液、培养基或细胞收集组合物通过胎盘脉管系统来获得灌注液。在一个实施例中，通过使灌注溶液通过脐动脉和脐静脉之一或两者来对哺乳动物胎盘进行灌注。灌注溶液流过胎盘可以使用例如重力流进入胎盘中来完成。例如，使用泵例如蠕动泵迫使灌注溶液通过胎盘。脐静脉可以例如用连接到无菌连接设备如无菌管的套管例如
Figure BDA0003186938500000981
或塑料套管进行插管。将无菌连接设备连接到灌注歧管。
在灌注准备时，可以以使得脐动脉和脐静脉位于胎盘的最高点的方式对胎盘进行定向。可以通过使灌注溶液通过胎盘脉管系统或通过胎盘脉管系统和周围组织来对胎盘进行灌注。在一个实施例中，将脐动脉和脐静脉同时连接到移液管，所述移液管通过柔性连接器连接到灌注溶液的储液器。将灌注溶液通入脐静脉和脐动脉中。灌注溶液从血管壁渗出和/或通过血管壁进入胎盘的周围组织中并且从妊娠期间附着于母体的子宫的胎盘的表面收集于合适的敞开器皿中。还可以通过脐带开口引入灌注溶液并使灌注溶液从与母体子宫壁相接的胎盘壁开口中流出或渗出。在另一个实施例中，使灌注溶液通过脐静脉并从脐动脉收集或通过脐动脉并从脐静脉收集，即，仅通过胎盘脉管系统(胎儿组织)。
在一个实施例中，例如，将脐动脉和脐静脉同时连接到例如移液管，所述移液管通过柔性连接器连接到灌注溶液的储液器。将灌注溶液通入脐静脉和脐动脉中。灌注溶液从血管壁渗出和/或通过血管壁进入胎盘的周围组织中并且从妊娠期间附着于母体的子宫的胎盘的表面收集于合适的敞开器皿中。还可以通过脐带开口引入灌注溶液并使灌注溶液从与母体子宫壁相接的胎盘壁开口中流出或渗出。通过此方法(其可以被称为“盘状(pan)”法)收集的胎盘细胞通常是胎儿细胞和母体细胞的混合物。
在另一个实施例中，使灌注溶液通过脐静脉并从脐动脉收集或通过脐动脉并从脐静脉收集。通过此方法(其可以被称为“闭路”法)收集的胎盘细胞通常几乎仅为胎儿细胞。
在一个实施例中，可以如下执行闭路灌注法。在生产后约48小时内获得产后胎盘。将脐带夹紧并在夹紧的上方切割。可以丢弃脐带或者可以对脐带进行处理以回收例如脐带干细胞和/或处理脐带膜以用于产生生物材料。可以在灌注期间保留羊膜或者可以例如使用手指钝性剥离使羊膜与绒毛膜分离。如果羊膜在灌注前与绒毛膜分离，则可以例如丢弃羊膜或对羊膜进行处理，例如以通过酶消化获得干细胞或产生例如羊膜生物材料，例如，美国申请公开第2004/0048796号中所描述的生物材料。在例如使用无菌纱布清理了胎盘的所有可见的血块和残余血液后，例如通过部分地切割脐带膜以暴露脐带的横截面来使脐带血管暴露。对血管进行鉴定并例如通过将闭合的鳄鱼夹钳推进通过每条血管的切割端来打开血管。然后将设备例如连接到灌注装置或蠕动泵的塑料管插入到胎盘动脉中的每一个中。泵可以是适合于此目的的任何泵，例如，蠕动泵。然后将连接到无菌收集储液器例如血袋如250mL收集袋的塑料管插入到胎盘静脉中。可替代地，将连接到泵的管插入到胎盘静脉中，并且将到一个或多个收集储液器的试管插入到胎盘动脉中的一个或两个中。然后用一定体积的灌注溶液例如约750ml的灌注溶液对胎盘进行灌注。然后例如通过离心收集灌注液中的细胞。
在一个实施例中，在灌注期间将近端脐带夹紧，并且，更具体地，可以在脐带插入胎盘盘中的4-5cm(厘米)内将近端脐带夹紧。
通常用脐带血和/或胎盘血的残余红细胞对在放血过程期间从哺乳动物胎盘中首次收集的灌注液进行着色。随着灌注继续进行并且残余的脐带血细胞从胎盘中洗出，灌注液越来越无色。虽然通常30到100mL的灌注液足以初始地冲洗来自胎盘的血液，但可以根据观察的结果使用更多或更少的灌注液。
在某些实施例中，虽然在灌注(例如，通过重力引流)前从胎盘中去除脐带血，但不用溶液冲洗(例如，灌注)胎盘以去除残余血液。在某些实施例中，在灌注(例如，通过重力引流)前从胎盘中去除脐带血，且用溶液冲洗(例如，灌注)胎盘以去除残余血液。
用于对胎盘进行灌注的灌注液的体积可以根据待收集的胎盘细胞的数量、胎盘的大小、待从单个胎盘中进行收集的数量等而变化。在各个实施例中，灌注液的体积可以为50mL到5000mL、50mL到4000mL、50mL到3000mL、100mL到2000mL、250mL到2000mL、500mL到2000mL或750mL到2000mL。通常，在放血后用700-800mL的灌注液对胎盘进行灌注。
可以在几小时或几天内多次对胎盘进行灌注。在胎盘将被灌注多次的情况下，可以在无菌条件下在容器或其它合适的器皿中维持或培养胎盘并用以下对胎盘进行灌注：细胞收集组合物；或标准灌注溶液(例如，生理盐水溶液，如磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)，有或没有抗凝血剂(例如，肝素、华法林钠、香豆素、双香豆素)和/或有或没有抗微生物剂(例如，β-巯基乙醇(0.1mM))；抗生素，如链霉素(例如，40-100μg/ml)、青霉素(例如，40U/ml)、两性霉素B(例如，0.5μg/ml)。在一个实施例中，在不收集灌注液的情况下将分离的胎盘维持或培养一段时间，使得胎盘在灌注并收集灌注液之前被维持或培养1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时或2天或3天或更多天。可以将灌注后的胎盘维持一个或多个另外的时间例如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时或更多个小时并且第二次用例如700-800mL灌注液进行灌注。可以将胎盘灌注1次、2次、3次、4次、5次或更多次，例如，每1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时一次。在一个实施例中，重复对胎盘的灌注和对灌注溶液的收集(例如胎盘细胞收集组合物)，直到回收的有核细胞的数量降到100个细胞/毫升以下为止。可以单独对在不同时间点的灌注液进行进一步处理，以回收时间依赖性细胞群，例如，总有核细胞。还可以汇集来自不同时间点的灌注液。
5.5.4.胎盘灌注液和胎盘灌注液细胞
通常，来自单次胎盘灌注的胎盘灌注液包括约1亿到约5亿个有核细胞，包含可以通过本文所公开的方法由其产生NK细胞和/或ILC3细胞(例如，根据本文所描述的三阶段法产生的NK细胞和/或ILC3细胞)的造血细胞。在某些实施例中，胎盘灌注液或灌注液细胞包括CD34+细胞，例如，造血干细胞或祖细胞。在更具体的实施例中，此类细胞可以包括CD34+CD45-干细胞或祖细胞、CD34+CD45+干细胞或祖细胞等。在某些实施例中，灌注液或灌注液细胞在从其中分离造血细胞之前被低温保存。在某些其它实施例中，胎盘灌注液包括或灌注液细胞包括仅胎儿细胞或胎儿细胞和母体细胞的组合。
5.6.NK细胞
5.6.1.通过三阶段法产生的NK细胞
在另一个实施例中，本文提供了分离的NK细胞群，其中所述NK细胞根据上文所描述的三阶段法产生。
在一个实施例中，本文提供了通过本文所描述的三阶段法产生的分离的NK细胞群，其中所述NK细胞群包括比通过本文所描述的三阶段法产生的NK祖细胞群更大的百分比的CD3-CD56+细胞，所述NK祖细胞群例如通过除了用于产生NK祖细胞群的第三培养步骤的持续时间比用于产生NK细胞群的第三培养步骤的持续时间更短外相同的三阶段法产生的NK祖细胞群。在具体实施例中，所述NK细胞群包括约70％或更多(在一些实施例中75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)CD3-CD56+细胞。在另一个具体实施例中，所述NK细胞群包括不少于80％、85％、90％、95％、98％或99％CD3-CD56+细胞。在另一个具体实施例中，所述NK细胞群包括介于约70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％或95％-99％之间的CD3-CD56+细胞。
在某些实施例中，所述NK细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为NKp46+的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述NK细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为CD16-的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述NK细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为CD16+的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述NK细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为CD94-的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述NK细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为CD94+的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述NK细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为CD11a+的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述NK细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为NKp30+的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述NK细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为CD161+的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述NK细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为DNAM-1+的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述NK细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为T-bet+的CD3-CD56+细胞。
在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群包括CD117+细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群包括NKG2D+细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群包括NKp44+细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群包括CD244+细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群包括表达穿孔素的细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群包括表达EOMES的细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群包括表达颗粒酶B的细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群包括分泌IFNγ、GM-CSF和/或TNFα的细胞。
5.7.ILC3细胞
5.7.1.通过三阶段法产生的ILC3细胞
在另一个实施例中，本文提供了分离的ILC3细胞群，其中所述ILC3细胞根据上文所描述的三阶段法产生。
在一个实施例中，本文提供了通过本文所描述的三阶段法产生的分离的ILC3细胞群，其中所述ILC3细胞群包括比通过本文所描述的三阶段法产生的ILC3祖细胞群更大的百分比的CD3-CD56+细胞，所述ILC3祖细胞群例如通过除了用于产生ILC3祖细胞群的第三培养步骤的持续时间比用于产生ILC3细胞群的第三培养步骤的持续时间更短外相同的三阶段法产生的ILC3祖细胞群。在具体实施例中，所述ILC3细胞群包括约70％或更多(在一些实施例中75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)CD3-CD56+细胞。在另一个具体实施例中，所述ILC3细胞群包括不少于80％、85％、90％、95％、98％或99％CD3-CD56+细胞。在另一个具体实施例中，所述ILC3细胞群包括介于约70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％或95％-99％之间的CD3-CD56+细胞。
在某些实施例中，所述ILC3细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为NKp46-的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述ILC3细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为CD16-的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述ILC3细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为IL1R1+的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述ILC3细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为CD94-的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述ILC3细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为RORγt+的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述ILC3细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为CD11a-的CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述ILC3细胞群中的所述CD3-CD56+细胞包括另外为T-bet+的CD3-CD56+细胞。
在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群包括CD117+细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群包括NKG2D-细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群包括NKp30-细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群包括CD244+细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群包括DNAM-1+细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群包括表达AHR的细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群包括不表达穿孔素的细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群包括不表达EOMES的细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群包括不表达颗粒酶B的细胞。在一个实施例中，通过本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群包括分泌IL-22和/或IL-8的细胞。
在某些方面，通过本文所描述的三阶段法产生的细胞群包括比率为50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40或1:50的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为50:1的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为20:1的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为10:1的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为5:1的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为1:1的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为1:5的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为1:10的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为1:20的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为1:50的CD11a+细胞和CD11a-细胞。
在某些方面，本文所描述的细胞群通过将CD11a+细胞与CD11a-细胞以50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40或1:50的比率组合以产生组合细胞群来产生。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以50:1的比率组合的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以20:1的比率组合的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以10:1的比率组合的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以5:1的比率组合的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以1:1的比率组合的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以1:5的比率组合的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以1:10的比率组合的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以1:20的比率组合的CD11a+细胞和CD11a-细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以1:50的比率组合的CD11a+细胞和CD11a-细胞。
在某些方面，通过本文所描述的三阶段法产生的细胞群包括比率为50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40或1:50的NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为50:1的NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为20:1的NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为10:1的NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为5:1的NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为1:1的NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为1:5的NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为1:10的NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为1:20的NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的细胞群包括比率为1:50的NK细胞和ILC3细胞。
在某些方面，本文所描述的细胞群通过将NK细胞与ILC3细胞以50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40或1:50的比率组合以产生组合细胞群来产生。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以50:1的比率组合NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以20:1的比率组合NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以10:1的比率组合NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以5:1的比率组合NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以1:1的比率组合NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以1:5的比率组合NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以1:10的比率组合的NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以1:20的比率组合的NK细胞和ILC3细胞。在某些方面，本文所描述的组合细胞群包括以1:50的比率组合的NK细胞和ILC3细胞。
5.8.NK细胞和/或ILC3细胞结合胎盘灌注液
本文进一步提供了包括根据本文所描述的三阶段法的NK细胞和/或ILC3细胞结合胎盘灌注液、胎盘灌注液细胞和/或贴壁胎盘细胞例如以用于遏制一个或多个肿瘤细胞的增殖的组合物。
5.8.1.NK细胞和/或ILC3细胞和灌注液或灌注液细胞的组合
本文进一步提供了包括根据本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群和/或ILC3细胞的组合以及胎盘灌注液和/或胎盘灌注液细胞的组合物。在一个实施例中，例如，本文提供了补充有使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞的一定体积的胎盘灌注液。在补充有NK细胞和ILC3细胞的一定体积的胎盘灌注液的具体实施例中，NK细胞和ILC3细胞以如本文所描述的比率存在。在具体实施例中，例如，每毫升的胎盘灌注液补充有约1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个或更多个使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞。在另一个实施例中，胎盘灌注液细胞补充有使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞。在某些其它实施例中，当胎盘灌注液细胞与使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞组合时，胎盘灌注液细胞通常占细胞总数的约、大于约或小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％或1％。在某些其它实施例中，当使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞与多个胎盘灌注液细胞和/或组合的自然杀伤细胞组合时，NK细胞和/或ILC3细胞或NK细胞群通常占细胞总数的约、大于约或小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％或1％。在某些其它实施例中，当使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞用于补充胎盘灌注液时，悬浮细胞的溶液(例如，盐水溶液、培养基等)的体积占灌注液加细胞的总体积的约、大于约或小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％或1％，其中NK细胞和/或ILC3细胞在补充前被悬浮到约1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个或更多个细胞每毫升。
在其它实施例中，上述细胞组合中的任何组合进而与来自脐带血的脐带血细胞或有核细胞组合。
本文进一步提供了从两个或更多个来源例如两个或更多个胎盘获得并组合例如汇集的汇集的胎盘灌注液。此类汇集的灌注液可以包括来自每个来源的大约等体积的灌注液或可以包括来自每个来源的不同体积。来自每个来源的相对体积可以随机选择或可以基于：例如，一种或多种细胞因子例如细胞因子、生长因子、激素等的浓度或量；来自每个来源的灌注液中的胎盘细胞的数量；或来自每个来源的灌注液的其它特性。来自相同胎盘的多次灌注的灌注液可以以类似方式汇集。
类似地，本文提供了从两个或更多个来源例如两个或更多个胎盘获得并汇集的胎盘灌注液细胞和胎盘源性中间自然杀伤细胞。此类汇集的细胞可以包括来自所述两个或更多个来源的大约相等数量的细胞或来自汇集的来源中的一个或多个的不同数量的细胞。来自每个来源的细胞的相对数量可以基于例如待汇集的细胞中的一种或多种特异性细胞类型的数量例如CD34+细胞等的数量来选择。
本文进一步提供了已经过测定以确定预期来自例如给定数量的NK细胞和/或ILC3细胞或NK细胞群和/或ILC3细胞群或给定体积的灌注液的肿瘤遏制程度或量(即，效价)的使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞以及此类细胞与胎盘灌注液和/或胎盘灌注液细胞的组合。例如，在肿瘤细胞将会以其它方式增殖的条件下使一定试样或样品数量的细胞接触或接近已知数量的肿瘤细胞，并且将肿瘤细胞在胎盘灌注液、灌注液细胞、胎盘自然杀伤细胞或其组合存在的情况下随时间推移(例如，1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周或更长)的增殖速率与当量数量的肿瘤细胞在灌注液、灌注液细胞、胎盘自然杀伤细胞或其组合不存在的情况下的增殖进行比较。细胞的效价可以表示为例如将肿瘤细胞生长遏制例如约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％等所需的细胞数量或溶液体积。
在某些实施例中，使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞作为药用级可施用单位提供。此类单位可以以离散体积提供，例如，15mL、20mL、25mL、30nL、35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL、65mL、70mL、75mL、80mL、85mL、90mL、95mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL、450mL、500mL等。此类单位可以被设置成含有指定数量的细胞，例如，NK细胞和/或ILC3细胞或NK细胞群和/或ILC3细胞群结合其它NK细胞和/或ILC3细胞或灌注液细胞，例如，1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个或更多个细胞每毫升或者1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个、1×1011个或更多个细胞每单位。在具体实施例中，单位可以包括约、至少约或至多约1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个或更多个NK细胞每毫升或者1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个、1×1011个或更多个细胞每单位。此类单位可以被设置成含有指定数量的NK细胞和/或ILC3细胞或NK细胞群和/或ILC3细胞群和/或其它细胞中的任何细胞。
在上述实施例中，NK细胞和/或ILC3细胞或NK细胞群和/或ILC3细胞群或NK细胞和/或ILC3细胞或NK细胞群和/或ILC3细胞群与其它NK细胞和/或ILC3细胞、灌注液细胞或灌注液的组合可以对于受体是自体的(即，从受体获得)或与受体同种异体(即，从所述受体的至少一个其它个体获得)。
在某些实施例中，对每单位的细胞进行标记以指定以下中的一种或多种：体积、细胞数量、细胞类型、是否已使单位富集特定类型细胞和/或单位中的给定数量细胞的效价或单位的给定毫升数，即，单位中的细胞是否使特定的一种或多种类型的肿瘤细胞的增殖得到可测量的遏制。
5.8.2.NK细胞和/或ILC3细胞与贴壁胎盘干细胞的组合
在其它实施例中，使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群和/或ILC3细胞群单独地或与胎盘灌注液或胎盘灌注液细胞组合地补充有分离的贴壁胎盘细胞，例如，胎盘干细胞和胎盘多能细胞，如例如在Hariri美国专利第7,045,148号和第7,255,879号中以及在美国专利申请公开第2007/0275362号中所描述的，所述美国专利的公开内容通过全文引用的方式并入本文。在具体实施例中，NK细胞和ILC3细胞、NK细胞和ILC3细胞以如本文所描述的比率存在。“贴壁胎盘细胞”意指细胞贴附于组织培养表面，例如，组织培养塑料。可用于本文所公开的组合物和方法中的贴壁胎盘细胞通常不是滋养细胞、胚胎生殖细胞或胚胎干细胞。
使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞例如NK细胞群和/或ILC3细胞群单独或与胎盘灌注液或胎盘灌注液细胞组合可以补充有例如，1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个或更多个贴壁胎盘细胞每毫升或者1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个、1×1011个或更多个贴壁胎盘细胞。组合中的贴壁胎盘细胞可以为例如已经在例如1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、12次、14次、16次、18次、20次、22次、24次、26次、28次、30次、32次、34次、36次、38次或40次群体倍增或更多次群体倍增内培养的贴壁胎盘细胞。
分离的贴壁胎盘细胞当在原代培养物中培养或在细胞培养物中扩增时贴附到组织培养底物，例如，组织培养容器表面(例如，组织培养塑料)。贴壁胎盘细胞在培养中呈大体上成纤维样星状外观，其中许多胞质突从中心细胞体延伸。然而，贴壁胎盘细胞在形态上可区别于在相同条件下培养的成纤维细胞，因为贴壁胎盘细胞表现出比成纤维细胞更多的数量的此类胞质突。在形态学上，贴壁胎盘细胞也可区别于造血干细胞，所述造血干细胞在培养中通常呈更圆的或鹅卵石形态。
可用于本文所提供的组合物和方法中的分离的贴壁胎盘细胞和贴壁胎盘细胞群表达多种标志物，所述多种标志物可以用于鉴定和/或分离细胞或包括贴壁胎盘细胞的细胞群。可用于本文所提供的组合物和方法中的贴壁胎盘细胞和贴壁胎盘细胞群包含直接从胎盘或其任何部分(例如，羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜板、胎盘子叶、脐带等)获得的贴壁胎盘细胞和含有贴壁胎盘细胞的细胞群。在一个实施例中，贴壁胎盘干细胞群是培养中的贴壁胎盘干细胞群(即，其中的两个或更多个)，例如，容器例如袋中的群。
贴壁胎盘细胞通常表达标志物CD73、CD105和CD200和/或OCT-4并且不表达CD34、CD38或CD45。贴壁胎盘干细胞还可以表达HLA-ABC(MHC-1)和HLA-DR。这些标志物可以用于鉴定贴壁胎盘细胞并且区别贴壁胎盘细胞与其它细胞类型。因为贴壁胎盘细胞可以表达CD73和CD105，所以其可以具有间充质干细胞样特性。CD34、CD38和/或CD45的表达的缺乏将贴壁胎盘干细胞坚定为非造血干细胞。
在某些实施例中，本文所描述的分离的贴壁胎盘细胞可检测地遏制癌细胞增殖或肿瘤生长。
在某些实施例中，分离的贴壁胎盘细胞是分离的胎盘干细胞。在某些实施例中，分离的贴壁胎盘细胞是分离的胎盘多能细胞。在具体实施例中，分离的贴壁胎盘细胞为CD34-、CD10+和CD105+，如通过流式细胞术所检测的。在更具体的实施例中，分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞为胎盘干细胞。在另一个更具体的实施例中，分离的CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞为多能贴壁胎盘细胞。在另一个具体的实施例中，分离的CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞具有分化成神经表型细胞、成骨表型细胞或成软骨表型细胞的潜力。在更具体的实施例中，分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞另外为CD200+。在另一个更具体的实施例中，分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞另外为CD90+或CD45-，如通过流式细胞术所检测的。在另一个更具体的实施例中，分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞另外为CD90+或CD45-，如通过流式细胞术所检测的。在更具体的实施例中，CD34-、CD10+、CD105+、CD200+贴壁胎盘细胞另外为CD90+或CD45-，如通过流式细胞术所检测的。在另一个更具体的实施例中，CD34-、CD10+、CD105+、CD200+贴壁胎盘细胞另外为CD90+和CD45-，如通过流式细胞术所检测的。在另一个更具体的实施例中，CD34-、CD10+、CD105+、CD200+、CD90+、CD45-贴壁胎盘细胞另外为CD80-和CD86-，如通过流式细胞术所检测的。
在一个实施例中，分离的贴壁胎盘细胞为CD200+、HLA-G+。在具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为CD73+和CD105+。在另一个具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为CD34-、CD38-或CD45-。在更具体的实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为CD34-、CD38-、CD45-、CD73+和CD105+。在另一个实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞当在允许形成类胚体的条件下培养时产生一种或多种类胚体。
在另一个实施例中，分离的贴壁胎盘细胞为CD73+、CD105+、CD200+。在所述群的具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为HLA-G+。在另一个具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为CD34-、CD38-或CD45-。在另一个具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为CD34-、CD38-和CD45-。在更具体的实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为CD34-、CD38-、CD45-和HLA-G+。在另一个具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞当在允许形成类胚体的条件下培养时产生一种或多种类胚体。
在另一个实施例中，分离的贴壁胎盘细胞为CD200+、OCT-4+。在具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为CD73+和CD105+。在另一个具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为HLA-G+。在另一个具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为CD34-、CD38-和CD45-。在更具体的实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+和HLA-G+。在另一个具体实施例中，分离的贴壁胎盘细胞当在允许形成类胚体的条件下培养时产生一种或多种类胚体。
在另一个实施例中，分离的贴壁胎盘细胞为CD73+、CD105+和HLA-G+。在具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为CD34-、CD38-或CD45-。在另一个具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还CD34-、CD38-和CD45-。在另一个具体实施例中，所述贴壁干细胞还为OCT-4+。在另一个具体实施例中，所述贴壁干细胞还为CD200+。在更具体的实施例中，所述贴壁干细胞还为CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+和CD200+。
在另一个实施例中，分离的贴壁胎盘细胞为CD73+、CD105+干细胞，其中所述细胞在允许形成类胚体的条件下产生一个或多个类胚体。在具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为CD34-、CD38-或CD45-。在另一个具体实施例中，分离的贴壁胎盘细胞还为CD34-、CD38-和CD45-。在另一个具体实施例中，分离的贴壁胎盘细胞还为OCT-4+。在更具体的实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为OCT-4+、CD34-、CD38-和CD45-。
在另一个实施例中，贴壁胎盘干细胞为OCT-4+干细胞，其中所述贴壁胎盘干细胞当在允许形成类胚体的条件下培养时产生一个或多个类胚体，并且其中所述干细胞已被鉴定为可检测地遏制癌细胞增殖或肿瘤生长。
在各个实施例中，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的所述分离的贴壁胎盘细胞为OCT-4+。在上述群的具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为CD73+和CD105+。在另一个具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为CD34-、CD38-或CD45-。在另一个具体实施例中，所述干细胞为CD200+。在更具体的实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞还为CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-和CD45-。在另一个具体实施例中，所述分离的贴壁胎盘细胞已经扩增例如传代至少一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或至少20次。
在上述实施例中的任何实施例的更具体的实施例中，分离的贴壁胎盘细胞表达ABC-p(胎盘特异性ABC转运蛋白；参见例如，Allikmets等人,《癌症研究(Cancer Res)》58(23):5337-9(1998))。
在另一个实施例中，分离的贴壁胎盘细胞CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、CD200+、CD34-和CD133-。在另一个实施例中，分离的贴壁胎盘细胞构成性地分泌IL-6、IL-8和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)。
上文提及的分离的贴壁胎盘细胞中的每一个可以包括直接从哺乳动物胎盘获得并分离的细胞或已培养并传代至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、12次、14次、16次、18次、20次、25次、30次或更多次的细胞或其组合。肿瘤细胞遏制性多个上文所描述的分离的贴壁胎盘细胞可以包括约、至少或不超过1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个、1×1011个或更多个分离的贴壁胎盘细胞。
5.8.3.包括贴壁胎盘细胞条件培养基的组合物
本文还提供了包括使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群和/或ILC3细胞群的组合物和另外地条件培养基的用途，其中所述组合物是肿瘤遏制性的或可有效治疗癌症或病毒感染。在具体实施例中，NK细胞和ILC3细胞以如本文所描述的比率存在。如本文所描述的贴壁胎盘细胞可以用于产生肿瘤细胞遏制性、抗癌或抗病毒的条件培养基，即，包括由具有可检测的肿瘤细胞遏制效应、抗癌效应或抗病毒效应的细胞分泌或排泄的一个或多个生物分子的培养基。在各个实施例中，条件培养基包括细胞已增殖(即，已培养)至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多天的培养基。在其它实施例中，条件培养基包括此类细胞已生长到至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％汇合或高达100％汇合的培养基。此类条件培养基可以用于支持单独的细胞群的培养，例如，胎盘细胞或另一种类的细胞。在另一个实施例中，本文所提供的条件培养基包括分离的贴壁胎盘细胞例如分离的贴壁胎盘干细胞或分离的贴壁胎盘多能细胞以及除分离的贴壁胎盘细胞以外的细胞例如非胎盘干细胞或多能细胞已得到培养的培养基。
此类条件培养基可以与使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞、胎盘灌注液或胎盘灌注液细胞中的任何一个或其任何组合组合以形成肿瘤细胞遏制性、抗癌或抗病毒的组合物。在某些实施例中，组合物包括按体积计小于一半的条件培养基，例如，约或小于约50体积％、45体积％、40体积％、35体积％、30体积％、25体积％、20体积％、15体积％、10体积％、5体积％、4体积％、3体积％、2体积％或1体积％。
因此，在一个实施例中，本文提供了一种组合物，所述组合物包括使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞以及来自分离的贴壁胎盘细胞的培养物的培养基，其中所述分离的贴壁胎盘细胞：(a)贴附到底物；并且(b)为CD34-、CD10+和CD105+；其中所述组合物可检测地遏制肿瘤细胞的生长或增殖或者是抗癌或抗病毒的。在具体实施例中，分离的贴壁胎盘细胞为CD34-、CD10+和CD105+，如通过流式细胞术所检测的。在更具体的实施例中，分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞为胎盘干细胞。在另一个更具体的实施例中，分离的CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞为多能贴壁胎盘细胞。在另一个具体的实施例中，分离的CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞具有分化成神经表型细胞、成骨表型细胞或成软骨表型细胞的潜力。在更具体的实施例中，分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞另外为CD200+。在另一个更具体的实施例中，分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞另外为CD90+或CD45-，如通过流式细胞术所检测的。在另一个更具体的实施例中，分离的CD34-、CD10+、CD105+贴壁胎盘细胞另外为CD90+或CD45-，如通过流式细胞术所检测的。在更具体的实施例中，CD34-、CD10+、CD105+、CD200+贴壁胎盘细胞另外为CD90+或CD45-，如通过流式细胞术所检测的。在另一个更具体的实施例中，CD34-、CD10+、CD105+、CD200+贴壁胎盘细胞另外为CD90+和CD45-，如通过流式细胞术所检测的。在另一个更具体的实施例中，CD34-、CD10+、CD105+、CD200+、CD90+、CD45-贴壁胎盘细胞另外为CD80-和CD86-，如通过流式细胞术所检测的。
在另一个实施例中，本文提供了一种组合物，所述组合物包括使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞以及来自分离的贴壁胎盘细胞的培养物的培养基，其中所述分离的贴壁胎盘细胞：(a)贴附到底物；并且(b)表达CD200和HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200，或表达CD200和OCT-4，或表达CD73、CD105和HLA-G，或表达CD73和CD105并促进在包括胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个类胚体(当所述群在允许形成类胚体的条件下培养时)，或表达OCT-4并促进在包括胎盘干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个类胚体(当所述群在允许形成类胚体的条件下培养时)；其中所述组合物可检测地遏制肿瘤细胞的生长或增殖或者是抗癌或抗病毒的。在具体实施例中，组合物进一步包括多个所述分离的胎盘贴壁细胞。在另一个具体实施例中，组合物包括多个非胎盘细胞。在更具体的实施例中，所述非胎盘细胞包括CD34+细胞，例如，造血祖细胞，如外周血造血祖细胞、脐带血造血祖细胞或胎盘血造血祖细胞。非胎盘细胞还可以包括干细胞，如间充质干细胞，例如，骨髓源性间充质干细胞。非胎盘细胞还可以为一种或多种类型的成年细胞或细胞系。在另一个具体实施例中，组合物包括抗增殖剂，例如，抗MIP-1α或抗MIP-1β抗体。
在具体实施例中，由上文所描述的细胞或细胞组合之一调控的培养基从与多个肿瘤细胞以约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1的分离的贴壁胎盘细胞:肿瘤细胞比共培养的多个分离的贴壁胎盘细胞获得。例如，条件培养基或上清液可以从包括约1×105个分离的贴壁胎盘细胞、约1×106个分离的贴壁胎盘细胞、约1×107个分离的贴壁胎盘细胞或约1×108个分离的贴壁胎盘细胞或更多的培养物获得。在另一个具体实施例中，条件培养基或上清液从包括以下的共培养物获得：约1×105个到约5×105个分离的贴壁胎盘细胞和约1×105个肿瘤细胞；约1×106个到约5×106个分离的贴壁胎盘细胞和约1×106个肿瘤细胞；约1×107个到约5×107个分离的贴壁胎盘细胞和约1×107个肿瘤细胞；或约1×108个到约5×108个分离的贴壁胎盘细胞和约1×108个肿瘤细胞。
5.9.细胞的保存
可以将细胞例如使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群和/或ILC3细胞群或包括造血干细胞或祖细胞的胎盘灌注液细胞保存，即，放置在允许长期储存的条件下或在抑制细胞因例如凋亡或坏死而死亡的条件下。
胎盘灌注液可以通过使细胞收集组合物通过胎盘的至少一部分例如通过胎盘脉管系统来产生。细胞收集组合物包括起作用以保存灌注液内含有的细胞的一种或多种化合物。此类胎盘细胞收集组合物可以包括凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或载氧全氟碳化物，如相关的美国申请公开第20070190042号中所描述的，所述美国申请公开的公开内容通过全文引用的方式特此并入。
在一个实施例中，通过使灌注液或胎盘细胞群接近包括凋亡抑制剂和载氧全氟碳化物的细胞收集组合物从哺乳动物例如人产后胎盘收集灌注液或细胞群，其中与未接触或接近凋亡抑制剂的细胞群相比，所述凋亡抑制剂存在的量和时间足以减少或防止胎盘细胞(例如，贴壁胎盘细胞，例如，胎盘干细胞或胎盘多能细胞)群凋亡。例如，可以用细胞收集组合物对胎盘进行灌注，并且从胎盘中分离胎盘细胞，例如，总有核胎盘细胞。在具体实施例中，凋亡抑制剂是半胱天冬酶抑制剂。在另一个具体实施例中，所述凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在更具体的实施例中，所述JNK抑制剂不调节贴壁胎盘细胞例如贴壁胎盘干细胞或贴壁胎盘多能细胞的分化或增殖。在另一个实施例中，细胞收集组合物包括呈分离相的所述凋亡抑制剂和所述载氧全氟碳化物。在另一个实施例中，细胞收集组合物包括呈乳剂的所述凋亡抑制剂和所述载氧全氟碳化物。在另一个实施例中，细胞收集组合物另外包括乳化剂，例如，卵磷脂。在另一个实施例中，在使胎盘细胞接近细胞收集组合物时，所述凋亡抑制剂和所述全氟碳化物介于约0℃与约25℃之间。在另一个更具体的实施例中，在使胎盘细胞接近细胞收集组合物时，所述凋亡抑制剂和所述全氟碳化物介于约2与10℃之间或介于约2℃与约5℃之间。在另一个更具体的实施例中，所述接近在转运所述细胞群期间执行。在另一个更具体的实施例中，所述接近在所述细胞群的冷冻和解冻期间执行。
在另一个实施例中，胎盘灌注液和/或胎盘细胞可以通过使灌注液和/或细胞接近凋亡抑制剂和器官保存化合物来收集并保存，其中与未接触或接近凋亡抑制剂的灌注液或胎盘细胞相比，所述凋亡抑制剂存在的量和时间足以减少或防止细胞的凋亡。在具体实施例中，器官保存化合物是UW溶液(在美国专利第4,798,824号中进行了描述；也被称为VIASPANTM；还参见Southard等人,《移植术(Transplantation)》49(2):251-257(1990)或Stern等人,美国专利第5,552,267号中所描述的溶液，所述美国专利的公开内容通过全文引用的方式特此并入)。在另一个实施例中，所述器官保存组合物为羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖或其组合。在另一个实施例中，胎盘细胞收集组合物另外包括呈两相或呈乳剂的载氧全氟碳化物。
在所述方法的另一个实施例中，在灌注期间使胎盘细胞接近包括凋亡抑制剂和载氧全氟碳化物的细胞收集组合物、器官保存化合物或其组合。在另一个实施例中，在通过灌注收集之后使胎盘细胞接近所述细胞收集化合物。
通常，在胎盘细胞收集、富集和分离期间，优选的是最小化或消除由于缺氧和机械应力而引起的细胞应力。因此，在所述方法的另一个实施例中，在所述保存期间，使胎盘灌注液或胎盘细胞群在收集、富集或分离期间暴露于缺氧条件不到六小时，其中缺氧条件是指氧浓度低于正常血氧浓度。在更具体的实施例中，在所述保存期间，使所述灌注液或所述胎盘细胞群暴露于所述缺氧条件不到两小时。在另一个更具体的实施例中，在收集、富集或分离期间，使所述胎盘细胞群暴露于所述缺氧条件下不到一小时或不到三十分钟或不暴露于缺氧条件。在另一个具体实施例中，在收集、富集或分离期间，使所述胎盘细胞群不暴露于剪切应力。
细胞，例如胎盘灌注液细胞、造血细胞例如CD34+造血干细胞；使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞；本文所提供的分离的贴壁胎盘细胞可以低温保存例如在小容器例如安瓿或隔瓶中的低温保存培养基中。在某些实施例中，将本文所提供的细胞以约1×104-5×108个细胞每毫升的浓度低温保存。在具体实施例中，将本文所提供的细胞以约1×106-1.5×107个细胞每毫升的浓度低温保存。在更具体的实施例中，将本文所提供的细胞以约1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、1.5×107个细胞每毫升的浓度低温保存。
合适的低温保存培养基包含但不限于生理盐水、培养基，包含例如生长培养基或细胞冷冻培养基例如可商购获得的细胞冷冻培养基，例如，C2695、C2639或C6039(西格玛公司(Sigma))；
Figure BDA0003186938500001151
CS2、
Figure BDA0003186938500001152
CS5或
Figure BDA0003186938500001153
CS10(生物生命解决方案公司(BioLife Solutions))。在一个实施例中，低温保存培养基包括浓度为例如约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(v/v)的DMSO(二甲亚砜)。低温保存培养基可以包括另外的药剂，例如，甲基纤维素、右旋糖酐、白蛋白(例如，人血清白蛋白)、海藻糖和/或甘油。在某些实施例中，低温保存培养基包括约1％-10％DMSO、约25％-75％右旋糖酐和/或约20％-60％人血清白蛋白(HSA)。在某些实施例中，低温保存培养基包括约1％-10％DMSO、约25％-75％海藻糖和/或约20％-60％人HSA。在具体实施例中，低温保存培养基包括5％DMSO、55％右旋糖酐和40％HSA。在更具体的实施例中，低温保存培养基包括5％DMSO、55％右旋糖酐(在生理盐水中10％w/v)和40％HSA。在另一个具体实施例中，低温保存培养基包括5％DMSO、55％海藻糖和40％HSA。在更具体的实施例中，低温保存培养基包括5％DMSO、55％海藻糖(在生理盐水中10％w/v)和40％HSA。在另一个具体实施例中，低温保存培养基包括
Figure BDA0003186938500001154
CS5。在另一个具体实施例中，低温保存培养基包括
Figure BDA0003186938500001155
CS 10。
本文所提供的细胞可以通过各种方法中的任何一种并且在细胞培养、扩增或分化的任何阶段低温保存。例如，本文所提供的细胞可以在从来源组织或器官例如胎盘灌注液或脐带血中分离后立即进行低温保存或在上文所概述的方法的第一步骤、第二步骤或第三步骤期间或之后进行低温保存。在某些实施例中，造血细胞例如造血干细胞或祖细胞在从来源组织或器官中分离后约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、45分钟内或约1小时、2小时、4小时、6小时、10小时、12小时、18小时、20小时或24小时内进行低温保存。在某些实施例中，所述细胞在从来源组织或器官中分离后1天、2天或3天内进行低温保存。在某些实施例中，所述细胞在如上文所描述的第一培养基中培养约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天或28天后进行低温保存。在一些实施例中，所述细胞在如上文所描述的第一培养基中培养约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天或28天并且在如上文所描述的第二培养基中培养约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天或28天后进行低温保存。在一些实施例中，当使用本文所描述的三阶段法制得NK细胞时，所述细胞在第一培养基中培养约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天后进行低温保存；和/或在第二培养基中培养约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天后进行低温保存；和/或在第三培养基中培养约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天后进行低温保存。在具体实施例中，NK细胞和/或ILC3细胞使用本文所描述的三阶段法制得，并且所述细胞在以下之后进行低温保存：在第一培养基中培养10天；在第二培养基中培养4天；以及在第三培养基中培养21天。
在一方面，本文提供了一种低温保存NK细胞群和/或ILC3细胞群例如通过本文所描述的三阶段法产生的NK细胞和/或ILC3细胞的方法。在一个实施例中，所述方法包括：在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞例如CD34+干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；随后在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及随后在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群，其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-、CD16-或CD16+以及CD94+或CD94-，并且其中至少70％或至少80％的所述自然杀伤细胞是活的；以及接下来，将所述NK细胞低温保存在低温保存培养基中。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。在具体实施例中，所述低温保存步骤进一步包括：(1)制备细胞悬浮溶液；(2)将低温保存培养基添加到来自步骤(1)的细胞悬浮溶液中以获得低温保存的细胞悬浮液；(3)将来自步骤(3)的低温保存的细胞悬浮液冷却以获得低温保存的样品；以及(4)在-80℃以下储存低温保存的样品。在某些实施例中，所述方法不包含中间步骤。
在一个实施例中，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-和CD11a+；以及接下来，将所述NK细胞低温保存在低温保存培养基中。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。在具体实施例中，所述低温保存步骤进一步包括：(1)制备细胞悬浮溶液；(2)将低温保存培养基添加到来自步骤(1)的细胞悬浮溶液中以获得低温保存的细胞悬浮液；(3)将来自步骤(3)的低温保存的细胞悬浮液冷却以获得低温保存的样品；以及(4)在-80℃以下储存低温保存的样品。在某些实施例中，所述方法不包含中间步骤。
在一个实施例中，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞因子(SCF)和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-和CD11a+；以及接下来，将所述NK细胞低温保存在低温保存培养基中。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。在具体实施例中，所述低温保存步骤进一步包括：(1)制备细胞悬浮溶液；(2)将低温保存培养基添加到来自步骤(1)的细胞悬浮溶液中以获得低温保存的细胞悬浮液；(3)将来自步骤(3)的低温保存的细胞悬浮液冷却以获得低温保存的样品；以及(4)在-80℃以下储存低温保存的样品。在某些实施例中，所述方法不包含中间步骤。
在一个实施例中，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏SCF、干细胞动员剂和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-和CD11a+；以及接下来，将所述NK细胞低温保存在低温保存培养基中。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。在具体实施例中，所述低温保存步骤进一步包括：(1)制备细胞悬浮溶液；(2)将低温保存培养基添加到来自步骤(1)的细胞悬浮溶液中以获得低温保存的细胞悬浮液；(3)将来自步骤(3)的低温保存的细胞悬浮液冷却以获得低温保存的样品；以及(4)在-80℃以下储存低温保存的样品。在某些实施例中，所述方法不包含中间步骤。
在一个实施例中，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；以及(d)从所述第三细胞群中分离CD11a+细胞以产生第四细胞群；其中所述第四细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-和CD11a+；以及接下来，将所述NK细胞低温保存在低温保存培养基中。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。在具体实施例中，所述低温保存步骤进一步包括：(1)制备细胞悬浮溶液；(2)将低温保存培养基添加到来自步骤(1)的细胞悬浮溶液中以获得低温保存的细胞悬浮液；(3)将来自步骤(3)的低温保存的细胞悬浮液冷却以获得低温保存的样品；以及(4)在-80℃以下储存低温保存的样品。在某些实施例中，所述方法不包含中间步骤。
在一个实施例中，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-；以及接下来，将所述ILC3细胞低温保存在低温保存培养基中。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。在具体实施例中，所述低温保存步骤进一步包括：(1)制备细胞悬浮溶液；(2)将低温保存培养基添加到来自步骤(1)的细胞悬浮溶液中以获得低温保存的细胞悬浮液；(3)将来自步骤(3)的低温保存的细胞悬浮液冷却以获得低温保存的样品；以及(4)在-80℃以下储存低温保存的样品。在某些实施例中，所述方法不包含中间步骤。
在一个实施例中，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括干细胞动员剂、IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-；以及接下来，将所述ILC3细胞低温保存在低温保存培养基中。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。在具体实施例中，所述低温保存步骤进一步包括：(1)制备细胞悬浮溶液；(2)将低温保存培养基添加到来自步骤(1)的细胞悬浮溶液中以获得低温保存的细胞悬浮液；(3)将来自步骤(3)的低温保存的细胞悬浮液冷却以获得低温保存的样品；以及(4)在-80℃以下储存低温保存的样品。在某些实施例中，所述方法不包含中间步骤。
在一个实施例中，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括SCF、IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-；以及接下来，将所述ILC3细胞低温保存在低温保存培养基中。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。在具体实施例中，所述低温保存步骤进一步包括：(1)制备细胞悬浮溶液；(2)将低温保存培养基添加到来自步骤(1)的细胞悬浮溶液中以获得低温保存的细胞悬浮液；(3)将来自步骤(3)的低温保存的细胞悬浮液冷却以获得低温保存的样品；以及(4)在-80℃以下储存低温保存的样品。在某些实施例中，所述方法不包含中间步骤。
在一个实施例中，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及(c)在包括干细胞动员剂、SCF、IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；其中所述第三细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-；以及接下来，将所述ILC3细胞低温保存在低温保存培养基中。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。在具体实施例中，所述低温保存步骤进一步包括：(1)制备细胞悬浮溶液；(2)将低温保存培养基添加到来自步骤(1)的细胞悬浮溶液中以获得低温保存的细胞悬浮液；(3)将来自步骤(3)的低温保存的细胞悬浮液冷却以获得低温保存的样品；以及(4)在-80℃以下储存低温保存的样品。在某些实施例中，所述方法不包含中间步骤。
在一个实施例中，所述方法包括：(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；以及(d)从所述第三细胞群中分离CD11a-细胞以产生第四细胞群；其中所述第四细胞群包括ILC3细胞CD56+、CD3-和CD11a-；以及接下来，将所述ILC3细胞低温保存在低温保存培养基中。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。在具体实施例中，所述低温保存步骤进一步包括：(1)制备细胞悬浮溶液；(2)将低温保存培养基添加到来自步骤(1)的细胞悬浮溶液中以获得低温保存的细胞悬浮液；(3)将来自步骤(3)的低温保存的细胞悬浮液冷却以获得低温保存的样品；以及(4)在-80℃以下储存低温保存的样品。在某些实施例中，所述方法不包含中间步骤。
可以在控速冷冻器中例如在低温保存期间以约0.1、0.3、0.5、1或2℃/分钟的速率冷却本文所提供的细胞。在一个实施例中，低温保存温度为约-80℃到约-180℃或约-125℃到约-140℃。可以在解冻以供使用前将低温保存的细胞转移到液氮。在一些实施例中，例如，一旦安瓿达到约-90℃，就将所述低温保存的细胞转移到液氮储存区域。低温保存的细胞可以在约25℃到约40℃的温度下解冻，更具体地可以被解冻到约37℃的温度。在某些实施例中，低温保存的细胞在被低温保存约1小时、2小时、4小时、6小时、10小时、12小时、18小时、20小时或24小时或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天或28天后解冻。在某些实施例中，低温保存的细胞在被低温保存约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月或28个月后解冻。在某些实施例中，低温保存的细胞在被低温保存约1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或10年后解冻。
合适的解冻培养基包含但不限于生理盐水、勃脉力培养基(plasmalyte culturemedium)，包含例如生长培养基，例如RPMI培养基。在某些实施例中，解冻培养基包括培养基补充物中的一种或多种(例如，营养素、细胞因子和/或因子)。适合于解冻本文所提供的细胞的培养基补充物包含例如但不限于如人AB血清、胎牛血清(FBS)或胎小牛血清(FCS)等血清、维生素、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、氨基酸(例如，左旋谷酰胺)、脂肪酸(例如，油酸、亚油酸或棕榈酸)、胰岛素(例如，重组人胰岛素)、转铁蛋白(铁饱和人转铁蛋白)、β-巯基乙醇、干细胞因子(SCF)、Fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)、如白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-15(IL-15)等细胞因子、促血小板生成素(Tpo)或肝素。在具体实施例中，可用于本文所提供的方法中的解冻培养基包括RPMI。在另一个具体实施例中，所述解冻培养基包括勃脉力。在另一个具体实施例中，所述解冻培养基包括约0.5％-20％FBS。在另一个具体实施例中，所述解冻培养基包括约1％、2％、5％、10％、15％或20％FBS。在另一个具体实施例中，所述解冻培养基包括约0.5％-20％HSA。在另一个具体实施例中，所述解冻培养基包括约1％、2.5％、5％、10％、15％或20％HSA。在更具体的实施例中，所述解冻培养基包括RPMI和约10％FBS。在另一个更具体的实施例中，所述解冻培养基包括勃脉力和约5％HSA。
本文所提供的低温保存方法可以进行优化以允许长期储存或在抑制细胞因例如凋亡或坏死而死亡的条件下优化。在一个实施例中，如通过例如自动细胞计数器或台盼蓝法确定的，解冻后细胞包括大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的活细胞。在另一个实施例中，解冻后细胞包括约0.5％、1％、5％、10％、15％、20％或25％的死细胞。在另一个实施例中，解冻后细胞包括约0.5％、1％、5％、10％、15％、20％或25％的早期凋亡细胞。在另一个实施例中，约0.5％、1％、5％、10％、15％或20％的解冻后细胞在解冻后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天或28天后经历凋亡，例如，如通过凋亡测定(例如，TO-PRO3或AnnV/PI凋亡测定试剂盒)所确定的。在某些实施例中，解冻后细胞在使用本文所提供的方法进行培养、扩增或分化后再低温保存。
5.10.包括NK细胞和/或ILC3细胞的组合物
5.10.1.使用三阶段法产生的NK细胞和/或ILC3细胞
在一些实施例中，本文提供了一种组合物，例如，药物组合物，所述组合物包括使用本文所描述的三阶段法产生的分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群。在具体实施例中，所述分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群由造血细胞例如从胎盘灌注液、脐带血和/或外周血中分离的造血干细胞或祖细胞产生。在另一个具体实施例中，所述分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群占组合物中的细胞的至少50％。在另一个具体实施例中，所述分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群例如CD3-CD56+细胞占组合物中的细胞的至少80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些实施例中，所述分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群中不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的细胞为CD3-CD56+细胞。在某些实施例中，所述CD3-CD56+细胞是CD16-。
使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群和/或ILC3细胞群可以被调配成药物组合物以供体内使用。此类药物组合物包括药学上可接受的载体例如用于体内施用的盐水溶液或其它被接受的生理上可接受的溶液中的NK细胞群和/或ILC3细胞群。本发明的药物组合物可以包括本文其它地方所描述的NK细胞群和/或ILC3细胞群中的任何一种。
本发明的药物组合物包括包含50％活细胞或更多的细胞群(即，细胞群中至少50％的细胞是功能性的或活着的)。优选地，细胞群中至少60％的细胞是活的。更优选地，药物组合物中的细胞群中至少70％、80％、90％、95％或99％的细胞是活的。
本发明的药物组合物可以包括：例如促进移植的一种或多种化合物；稳定剂，如白蛋白、右旋糖酐40、明胶、羟乙基淀粉等。
当调配为可注射溶液时，在一个实施例中，本发明的药物组合物包括约1.25％HSA和2.5％右旋糖酐。可以使用适合于细胞产物的施用的其它可注射调配物。
在一个实施例中，本文所提供的组合物例如药物组合物适合于全身或局部施用。在具体实施例中，本文所提供的组合物例如药物组合物适合于肠胃外施用。在具体实施例中，本文所提供的组合物例如药物组合物适合于注射、输注、静脉内(IV)施用、股动脉内施用或瘤内施用。在具体实施例中，本文所提供的组合物例如药物组合物适合于经由装置、基质或支架施用。在具体实施例中，本文所提供的组合物例如药物组合物适合于注射。在具体实施例中，本文所提供的组合物例如药物组合物适合于经由导管施用。在具体实施例中，本文所提供的组合物例如药物组合物适合于局部注射。在更具体的实施例中，本文所提供的组合物例如药物组合物适合于直接局部注射到实体瘤(例如，肉瘤)中。在具体实施例中，本文所提供的组合物例如药物组合物适合于通过注射器注射。在具体实施例中，本文所提供的组合物例如药物组合物适合于经由导引递送施用。在具体实施例中，本文所提供的组合物例如药物组合物适合于由腹腔镜检查、内窥镜检查、超声、计算机断层扫描、磁共振或放射学辅助的注射。
在某些实施例中，包括使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞的组合物例如本文所提供的药物组合物作为药用级可施用单位提供。此类单位可以以离散体积提供，例如，15mL、20mL、25mL、30nL、35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL、65mL、70mL、75mL、80mL、85mL、90mL、95mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL、450mL、500mL等。此类单位可以被设置成含有指定数量的细胞，例如，NK细胞和/或ILC3细胞，例如，1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个或更多个细胞每毫升或者1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个、1×1011个或更多个细胞每单位。在具体实施例中，单位可以包括约、至少约或至多约1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个或更多个NK细胞和/或ILC3细胞每毫升或者1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个、1×1011个或更多个细胞每单位。此类单位可以被设置成含有指定数量的NK细胞和/或ILC3细胞或NK细胞群和/或ILC3细胞群和/或其它细胞中的任何细胞。在具体实施例中，NK细胞和ILC3细胞以本文所提供的比率存在。
在另一个具体实施例中，所述组合物中的所述分离的NK细胞和/或ILC3细胞来自单个个体。在更具体的实施例中，所述分离的NK细胞和/或ILC3细胞包括来自至少两个不同个体的NK细胞和/或ILC3细胞。在另一个具体实施例中，所述组合物中的所述分离的NK细胞和/或ILC3细胞来自与意在用NK细胞和/或ILC3细胞治疗的个体不同的个体。在另一个具体实施例中，所述NK细胞已经与免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近的量和时间足以使所述NK细胞比当量数量的未与所述免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近的自然杀伤细胞即NK细胞可检测地更多地表达颗粒酶B或穿孔素。在另一个具体实施例中，所述组合物另外包括免疫调节化合物或沙利度胺。在某些实施例中，免疫调节化合物为下文所描述的化合物。参见例如美国专利第7,498,171号，所述美国专利的公开内容通过全文引用的方式特此并入。在某些实施例中，免疫调节化合物是被氨基取代的异吲哚啉。在一个实施例中，免疫调节化合物是3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮；3-(4'氨基异吲哚啉-1'-酮)-1-哌啶-2,6-二酮；4-(氨基)-2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))异吲哚啉-1,3-二酮；或4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮。在另一个实施例中，免疫调节化合物是泊马度胺或来那度胺。在另一个实施例中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物：
Figure BDA0003186938500001251
其中X和Y中的一个为C＝O，X和Y中的另一个为C＝O或CH2，并且R2为氢或低级烷基；或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映异构体、非对映异构体、外消旋体或立体异构体混合物。在另一个实施例中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物：
Figure BDA0003186938500001261
其中X和Y中的一个为C＝O并且另一个为CH2或C＝O；
R1为H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、C(O)R3、C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3'、C(S)NR3R3'或(C1-C8)烷基-O(CO)R5；
R2为H、F、苄基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基或(C2-C8)炔基；
R3和R3'独立地为(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基、(C0-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、(C1-C8)烷基-O(CO)R5或C(O)OR5；
R4为(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C4)烷基-OR5、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)杂环烷基或(C0-C4)烷基-(C2-C5)杂芳基；
R5为(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基或(C2-C5)杂芳基；
每次出现的R6独立地为H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C2-C5)杂芳基或(C0-C8)烷基-C(O)O-R5；或者R6基团可以接合以形成杂环烷基；
n为0或1；并且
*表示手性碳中心；
或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映异构体、非对映异构体、外消旋体或立体异构体混合物。在另一个实施例中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物：
Figure BDA0003186938500001262
其中：
X和Y中的一个为C＝O并且另一个为CH2或C＝O；
R为H或CH2OCOR'；
(i)R1、R2、R3或R4中的每一个独立于其它基团为卤代基、具有1到4个碳原子的烷基或具有1到4个碳原子的烷氧基；或者(ii)R1、R2、R3或R4中的一个为硝基或-NHR5并且R1、R2、R3或R4中的其余基团为氢；
R5为氢或具有1到8个碳的烷基；
R6为氢、具有1到8个碳原子的烷基、苯并、氯或氟；
R'为R7-CHR10-N(R8R9)；
R7为间亚苯基或对亚苯基或-(CnH2n)-，其中n的值为0到4；
R8和R9中的每一个独立于其它基团结合为氢或具有1到8个碳原子的烷基，或者R8和R9结合在一起为四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中X1为-O-、-S-或-NH-；
R10为氢或具有到8个碳原子的烷基或苯基；并且
*表示手性碳中心；
或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映异构体、非对映异构体、外消旋体或立体异构体混合物。
在另一个具体实施例中，组合物另外包括一种或多种抗癌化合物，例如，下文所描述的抗癌化合物中的一种或多种。
在更具体的实施例中，组合物包括来自另一个来源或通过另一种方法制得的NK细胞和/或ILC3细胞。在具体实施例中，所述另一个来源为胎盘血和/或脐带血。在另一个具体实施例中，所述另一个来源为外周血。在更具体的实施例中，所述组合物中的NK细胞群和/或ILC3细胞群与来自另一个来源或通过另一种方法制得的NK细胞和/或ILC3细胞按以下比率组合：约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等。
在另一个具体实施例中，组合物包括使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群和/或ILC3细胞群以及分离的胎盘灌注液或分离的胎盘灌注液细胞。在更具体的实施例中，所述胎盘灌注液与所述NK细胞群和/或所述ILC3细胞群来自同一个体。在另一个更具体的实施例中，所述胎盘灌注液包括与所述NK细胞群和/或所述ILC3细胞群来自不同个体的胎盘灌注液。在另一个具体实施例中，所述胎盘灌注液中的所有或基本上所有(例如，大于90％、95％、98％或99％)细胞为胎儿细胞。在另一个具体实施例中，胎盘灌注液或胎盘灌注液细胞包括胎儿细胞和母体细胞。在更具体的实施例中，所述胎盘灌注液中的胎儿细胞占所述灌注液中的细胞的不到约90％、80％、70％、60％或50％。在另一个具体实施例中，所述灌注液通过使0.9％NaCl溶液通过胎盘脉管系统来获得。在另一个具体实施例中，所述灌注液包括培养基。在另一个具体实施例中，所述灌注液已经进行了处理以去除红细胞。在另一个具体实施例中，所述组合物包括免疫调节化合物，例如，下文所描述的免疫调节化合物，例如，被氨基取代的异吲哚啉化合物。在另一个具体实施例中，组合物另外包括一种或多种抗癌化合物，例如，下文所描述的抗癌化合物中的一种或多种。
在另一个具体实施例中，组合物包括NK细胞群和/或ILC3细胞群和胎盘灌注液细胞。在更具体的实施例中，所述胎盘灌注液细胞来自与所述NK细胞群和/或ILC3细胞群来自同一个体。在另一个更具体的实施例中，所述胎盘灌注液细胞来自与所述NK细胞群和/或所述ILC3细胞群来自不同个体。在另一个具体实施例中，组合物包括分离的胎盘灌注液和分离的胎盘灌注液细胞，其中所述分离的胎盘灌注液和所述分离的胎盘灌注液细胞来自不同个体。在包括胎盘灌注液的上述实施例中的任何实施例的另一个更具体的实施例中，所述胎盘灌注液包括来自至少两个个体的胎盘灌注液。在包括胎盘灌注液细胞的上述实施例中的任何实施例的另一个更具体的实施例中，所述分离的胎盘灌注液细胞来自至少两个个体。在另一个具体实施例中，所述组合物包括免疫调节化合物。在另一个具体实施例中，组合物另外包括一种或多种抗癌化合物，例如，下文所描述的抗癌化合物中的一种或多种。
5.11.使用三阶段法产生的NK细胞和/或ILC3细胞的用途
本文所提供的使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞例如根据本文所描述的三阶段法产生的NK细胞和/或ILC3细胞可以用于治疗患有癌症的个体例如具有实体瘤细胞和/或血癌细胞的个体或患有病毒感染的个人的方法中。在一些此类实施例中，有效剂量的使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞的范围为1×104个到5×104个、5×104个到1×105个、1×105个到5×105个、5×105个到1×106个、1×106个到5×106个、5×106个到1×107个或更多个细胞/千克体重。使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞还可以用于遏制肿瘤细胞的增殖的方法中。
5.11.1.患有癌症的个体的治疗
在一个实施例中，本文提供了一种治疗患有癌症例如血癌或实体瘤的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的使用本文所描述的方法产生的NK细胞，例如，使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群。在一个实施例中，本文提供了一种治疗患有癌症例如血癌或实体瘤的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的使用本文所描述的方法产生的ILC3细胞，例如，使用本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群。在某些实施例中，个体具有自然杀伤细胞的缺乏，例如，针对个体的癌症具有活性的NK细胞的缺乏。在具体实施例中，所述方法另外包括向所述个体施用分离的胎盘灌注液或分离的胎盘灌注液细胞，例如，治疗有效量的胎盘灌注液或分离的胎盘灌注液细胞。在另一个具体实施例中，所述方法另外包括向所述个体施用有效量的免疫调节化合物例如上文所描述的免疫调节化合物或沙利度胺。如本文所使用的，“有效量”是例如使个体所患癌症的一种或多种症状得到可检测的改善或使个体所患癌症的一种或多种症状的进展减轻或使个体所患癌症的一种或多种症状消除的量。
分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物的施用可以是全身或局部的。在具体实施例中，施用是肠胃外的。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物是通过注射、输注、静脉内(IV)施用、股动脉内施用或瘤内施用。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物是用装置、基质或支架执行的。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物是通过注射。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物是经由导管。在具体实施例中，NK细胞和/或ILC3细胞的注射为局部注射。在更具体的实施例中，局部注射直接进入实体瘤(例如，肉瘤)中。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物是通过用注射器注射。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物是经由导引递送。在具体实施例中，通过注射向受试者施用分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物是由腹腔镜检查、内窥镜检查、超声、计算机断层扫描、磁共振或放射学辅助的。
在具体实施例中，癌症为血癌，例如，白血病或淋巴瘤。在更具体的实施例中，癌症为：急性白血病，例如，急性T细胞白血病、急性骨髓性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病、急性成髓细胞白血病、急性成巨核细胞白血病、前体B急性成淋巴细胞白血病、前体T急性成淋巴细胞白血病、伯基特氏白血病(Burkitt's leukemia，伯基特氏淋巴瘤)或急性双表型白血病；慢性白血病，例如，慢性髓系淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性单核细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤或B细胞幼淋巴细胞白血病；毛细胞淋巴瘤；T细胞幼淋巴细胞白血病；或淋巴瘤，例如，组织细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(例如，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(
Figure BDA0003186938500001301
macroglobulinemia))、脾边缘带淋巴瘤、浆细胞瘤(例如，浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病或重链病)、淋巴结外边缘带B细胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、淋巴结边缘带B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、T细胞大颗粒性淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、淋巴结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻型、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾型T细胞淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、蕈样真菌病(塞扎里综合征(Sezary syndrome))、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增殖性病症(例如，原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤或淋巴瘤样丘疹病)、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、未指定的间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)或结节性淋巴细胞为主的霍奇金氏淋巴瘤。在另一个具体实施例中，癌症为多发性骨髓瘤或骨髓发育不良综合征。
在某些其它具体的实施例中，癌症为实体瘤，例如，癌，如腺癌、肾上腺皮质癌、结肠腺癌、结直肠腺癌、结直肠癌、导管细胞癌、肺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑素瘤(例如，恶性黑素瘤)、非黑素瘤皮肤癌或未指定的癌；硬纤维瘤；促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤；内分泌肿瘤；尤文肉瘤(Ewing sarcoma)；生殖细胞瘤(例如，睾丸癌、卵巢癌、绒毛膜癌、内胚窦瘤、生殖细胞瘤等)；肝母细胞瘤；肝细胞癌；成神经细胞瘤；非横纹肌肉瘤软组织肉瘤；骨肉瘤；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；或威尔姆氏瘤(Wilms tumor)。在另一个实施例中，实体瘤为胰腺癌或乳腺癌。在其它实施例中，实体瘤为听神经瘤；星形细胞瘤(例如，I级毛细胞性星形细胞瘤、II级低级星形细胞瘤、III级间变性星形细胞瘤或IV级多形性成胶质细胞瘤)；脊索瘤；颅咽管瘤；胶质瘤(例如，脑干胶质瘤；室管膜瘤；混合型胶质瘤；视神经胶质瘤；或亚室管膜瘤)；成胶质细胞瘤；成神经管细胞瘤；脑膜瘤；转移性脑瘤；少突神经胶质瘤；松果体母细胞瘤；垂体瘤；原始神经外胚层肿瘤；或神经鞘瘤。在另一个实施例中，癌症为前列腺癌。在另一个实施例中，癌症为肝癌。在另一个实施例中，癌症为肺癌。在另一个实施例中，癌症为肾癌。
在某些实施例中，患有癌症例如血癌或实体瘤的个体例如具有自然杀伤细胞的缺乏的个体是在所述施用之前已经接受了骨髓移植的个体。在某些实施例中，骨髓移植是为了治疗所述癌症。在某些其它实施例中，骨髓移植是为了治疗除所述癌症以外的病状。在某些实施例中，除所述骨髓移植外，个体还接受了免疫抑制剂。在某些实施例中，已经接受了骨髓移植的个体在所述施用时表现出移植物抗宿主病(GVHD)的一种或多种症状。在某些其它实施例中，在GVHD的症状显现之前向已经接受了骨髓移植的个体施用所述细胞。
在某些具体实施例中，患有癌症例如血癌的个体在所述施用前已经接受了至少一个剂量的TNFα抑制剂，例如，
Figure BDA0003186938500001311
(依那西普(Enbrel))。在具体实施例中，所述个体在诊断出所述癌症的1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月内接受所述剂量的TNFα抑制剂。在具体实施例中，已接受一定剂量的TNFα抑制剂的个体表现出急性髓系白血病。在更具体的实施例中，已接受一定剂量的TNFα抑制剂并且表现出急性髓系白血病的个体进一步表现出血细胞中的5号染色体的长臂的缺失。在另一个实施例中，患有癌症例如血癌的个体表现出费城染色体。
在某些其它实施例中，所述个体的癌症例如血癌或实体瘤对于一种或多种抗癌药而言是难治的。在具体实施例中，癌症对于
Figure BDA0003186938500001312
(甲磺酸伊马替尼)而言是难治的。
在某些实施例中，所述个体的癌症例如血癌对至少一种抗癌药有应答；在此实施例中，以辅助治疗的形式或与所述抗癌药以组合疗法的形式添加了胎盘灌注液、分离的胎盘灌注液细胞、分离的自然杀伤细胞，例如胎盘自然杀伤细胞，例如胎盘源性中间自然杀伤细胞、分离的组合自然杀伤细胞或本文所描述的NK细胞和/或其组合以及任选地免疫调节化合物。在某些其它实施例中，患有癌症例如血癌的个体在所述施用前已经用至少一种抗癌药进行治疗并且已经复发。在某些实施例中，待治疗的个体患有难治性癌症。在一个实施例中，利用本文所描述的细胞的癌症治疗方法使免于(例如，防止或延迟)癌症的复发。在一个实施例中，本文所描述的癌症治疗方法使癌症的缓解期为1个月或更久、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月或更久、1年或更久、2年或更久、3年或更久或4年或更久。
在一个实施例中，本文提供了一种治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用：(1)来那度胺；(2)美法仑；以及(3)NK细胞，其中所述NK细胞可有效治疗所述个体的多发性骨髓瘤。在具体实施例中，所述NK细胞是脐带血NK细胞或由脐带血造血细胞例如造血干细胞产生的NK细胞。在另一个实施例中，所述NK细胞已经通过本文所描述的用于产生NK细胞的三阶段法产生。在另一个实施例中，所述来那度胺、所述美法仑和/或所述NK细胞彼此分开施用。在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的某些具体实施例中，所述NK细胞通过包括以下的方法产生：在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞例如CD34+干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；随后在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及随后在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群，其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-、CD16-或CD16+以及CD94+或CD94-，并且其中至少70％或至少80％的所述自然杀伤细胞是活的。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在另一个实施例中，本文提供了一种治疗患有急性骨髓性白血病(AML)的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用NK细胞(任选地通过用仅IL2或仅IL-15、IL2和IL12以及IL18、IL12和IL15、IL12和IL18、IL2和IL12以及IL15和IL18或IL2和IL15以及IL18进行预处理而被激活)，其中所述NK细胞可有效治疗所述个体的AML。在具体实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的分离的NK细胞群在所述施用之前已经用IL2、IL12、IL18或IL15中的一种或多种进行预处理。在具体实施例中，所述NK细胞是脐带血NK细胞或由脐带血造血细胞例如造血干细胞产生的NK细胞。在另一个实施例中，所述NK细胞已经通过本文所描述的用于产生NK细胞的三阶段法产生。在治疗患有AML的个体的方法的某些具体实施例中，所述NK细胞通过如本文所描述的三阶段法产生。在特定实施例中，待通过前述方法治疗的AML包括难治性AML、不良预后AML或儿童AML。本领域中已知的用于施用NK细胞以便治疗难治性AML、不良预后AML或儿童AML的方法可以被适配成用于此目的；参见例如，Miller等人,2005,《血液(Blood)》105:3051-3057；Rubnitz等人,2010,《临床肿瘤学杂志(J ClinOncol.)》28:955-959，所述文献中的每一个通过全文引用的方式并入本文。在某些实施例中，所述个体患有使针对AML的至少一种非自然杀伤细胞治疗剂失效的AML。在具体实施例中，所述个体为65岁或更大并且处于第一缓解期。在具体实施例中，在施用所述自然杀伤细胞之前，所述个体已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或两者进行调控。
在一个实施例中，本文提供了一种治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用：(1)来那度胺；(2)美法仑；以及(3)ILC3细胞，其中所述ILC3细胞可有效治疗所述个体的多发性骨髓瘤。在具体实施例中，所述ILC3细胞是脐带血ILC3细胞或由脐带血造血细胞例如造血干细胞产生的ILC3细胞。在另一个实施例中，所述ILC3细胞已经通过本文所描述的用于产生ILC3细胞的三阶段法产生。在另一个实施例中，所述来那度胺、所述美法仑和/或所述ILC3细胞彼此分开施用。在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的某些具体实施例中，所述ILC3细胞通过包括以下的方法产生：在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞例如CD34+干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；随后在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及随后在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群，其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-、CD16-或CD16+以及CD94+或CD94-，并且其中至少70％或至少80％的所述自然杀伤细胞是活的。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在另一个实施例中，本文提供了一种治疗患有急性骨髓性白血病(AML)的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用ILC3细胞(任选地通过用IL2和IL12以及IL18、IL12和IL15、IL12和IL18、IL2和IL12以及IL15和IL18或IL2和IL15以及IL18进行预处理而被激活)，其中所述ILC3细胞可有效治疗所述个体的AML。在具体实施例中，使用本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群已经在所述施用之前用IL2、IL12、IL18或IL15中的一种或多种进行预处理。在具体实施例中，所述ILC3细胞是脐带血ILC3细胞或由脐带血造血细胞例如造血干细胞产生的ILC3细胞。在另一个实施例中，所述ILC3细胞已经通过本文所描述的用于产生ILC3细胞的三阶段法产生。在治疗患有AML的个体的方法的某些具体实施例中，所述ILC3细胞通过如本文所描述的三阶段法产生。在特定实施例中，待通过前述方法治疗的AML包括难治性AML、不良预后AML或儿童AML。本领域中已知的用于施用ILC3细胞以便治疗难治性AML、不良预后AML或儿童AML的方法可以被适配成用于此目的；参见例如，Miller等人,2005,《血液》105:3051-3057；Rubnitz等人,2010,《临床肿瘤学杂志》28:955-959，所述文献中的每一个通过全文引用的方式并入本文。在某些实施例中，所述个体患有使针对AML的至少一种非自然杀伤细胞治疗剂失效的AML。在具体实施例中，所述个体为65岁或更大并且处于第一缓解期。在具体实施例中，在施用所述自然杀伤细胞之前，所述个体已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或两者进行调控。
在治疗患有AML的个体的方法的其它具体实施例中，所述NK细胞通过包括以下的方法产生：在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞例如CD34+干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；随后在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及随后在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群，其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-、CD16-或CD16+以及CD94+或CD94-，并且其中至少70％或至少80％的所述自然杀伤细胞是活的。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
在另一个实施例中，本文提供了一种治疗患有慢性淋巴细胞白血病(CLL)的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效剂量的：(1)来那度胺；(2)美法仑；(3)氟达拉滨；以及(4)NK细胞，例如，使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞，其中所述NK细胞可有效治疗所述个体的所述CLL。在具体实施例中，所述NK细胞是脐带血NK细胞或由脐带血造血干细胞产生的NK细胞。在另一个实施例中，所述NK细胞已经通过本文所描述的用于产生NK细胞的三阶段法产生。在上述方法中任何方法的具体实施例中，所述来那度胺、所述美法仑、所述氟达拉滨和扩增后的NK细胞分开施用于所述个体。在治疗患有CLL的个体的方法的某些具体实施例中，所述NK细胞通过包括以下的方法产生：在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞例如CD34+干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；随后在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及随后在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群，其中所述第三细胞群包括自然杀伤细胞CD56+、CD3-、CD16-或CD16+以及CD94+或CD94-，并且其中至少70％或至少80％的所述自然杀伤细胞是活的。在某些实施例中，所述第一培养基和/或所述第二培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。在某些实施例中，所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和FMS样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)。在具体实施例中，所述第一培养基和所述第二培养基缺乏LIF和MIP-1α，并且所述第三培养基缺乏LIF、MIP-1α和Flt3L。在某些实施例中，所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基均不包括肝素，例如，低分子量肝素。
5.11.2.肿瘤细胞增殖的遏制
本文进一步提供了一种遏制肿瘤细胞的增殖的方法，所述方法包括使使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群接近肿瘤细胞，例如使肿瘤细胞与使用本文所描述的方法产生的NK细胞接触。因此，在遏制肿瘤细胞的增殖的方法中可以使用多个NK细胞，所述方法包括使治疗有效量的NK细胞群接近肿瘤细胞，例如，使肿瘤细胞与NK细胞群中的细胞接触。任选地，使分离的胎盘灌注液或分离的胎盘灌注液细胞接近肿瘤细胞和/或使用本文所描述的方法产生的NK细胞。在另一个具体实施例中，另外使免疫调节化合物例如上文所描述的免疫调节化合物或沙利度胺接近肿瘤细胞和/或使用本文所描述的方法产生的NK细胞，使得肿瘤细胞的增殖与未接近使用本文所描述的方法产生的NK细胞相同类型的肿瘤细胞相比可检测地减少。任选地，使分离的胎盘灌注液或分离的胎盘灌注液细胞接近已经接触或接近免疫调节化合物的肿瘤细胞和/或使用本文所描述的方法产生的NK细胞。
本文还提供了一种遏制肿瘤细胞的增殖的方法，所述方法包括使使用本文所描述的方法产生的ILC3细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群接近肿瘤细胞，例如使肿瘤细胞与使用本文所描述的方法产生的ILC3细胞接触。因此，遏制肿瘤细胞的增殖的方法中可以使用多个ILC3细胞，所述方法包括使治疗有效量的ILC3细胞群接近肿瘤细胞，例如，使肿瘤细胞与ILC3细胞群中的细胞接触。任选地，使分离的胎盘灌注液或分离的胎盘灌注液细胞接近使用本文所描述的方法产生的肿瘤细胞和/或ILC3细胞。在另一个具体实施例中，另外使免疫调节化合物，例如，上文所描述的免疫调节化合物或沙利度胺接近肿瘤细胞和/或使用本文所描述的方法产生的ILC3细胞，使得肿瘤细胞的增殖与未接近使用本文所描述的方法产生的ILC3细胞相同类型的肿瘤细胞相比可检测地减少。任选地，使分离的胎盘灌注液或分离的胎盘灌注液细胞接近已经接触或接近免疫调节化合物的肿瘤细胞和/或使用本文所描述的方法产生的ILC3细胞。
如本文所使用的，在某些实施例中，关于细胞的“接触”或“接近”在一个实施例中涵盖胎盘灌注液、胎盘灌注液细胞、自然杀伤细胞例如根据本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群、ILC3细胞例如根据本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群和/或分离的组合自然杀伤细胞与肿瘤细胞之间的直接物理例如细胞-细胞接触。在另一个实施例中，“接触”涵盖同一物理空间中的存在，将例如胎盘灌注液、胎盘灌注液细胞、自然杀伤细胞例如胎盘中间自然杀伤细胞、本文所描述的自然杀伤细胞例如根据本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群、本文所描述的ILC3细胞例如根据本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群和/或分离的组合自然杀伤细胞与肿瘤细胞放置在同一容器(例如，培养皿、多孔板)中。在另一个实施例中，胎盘灌注液、胎盘灌注液细胞、组合自然杀伤细胞、胎盘中间自然杀伤细胞或本文所描述的自然杀伤细胞例如根据本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群或本文所描述的ILC3细胞例如根据本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群与肿瘤细胞的“接触”是例如通过向个体例如包括肿瘤细胞的人例如癌症患者注射或输注胎盘灌注液或细胞，例如，胎盘灌注液细胞、组合自然杀伤细胞、自然杀伤细胞，例如，胎盘中间自然杀伤细胞或ILC3细胞来完成的。在免疫调节化合物和/或沙利度胺的背景下，“接触”意指例如细胞和免疫调节化合物和/或沙利度胺在物理上直接彼此接触或放置在同一物理容积内(例如，细胞培养容器或个体)。
在具体实施例中，肿瘤细胞为血癌细胞，例如，白血病细胞或淋巴瘤细胞。在更具体的实施例中，癌症为：急性白血病，例如，急性T细胞白血病细胞、急性骨髓性白血病(AML)细胞、急性早幼粒细胞白血病细胞、急性成髓细胞白血病细胞、急性成巨核细胞白血病细胞、前体B急性成淋巴细胞白血病细胞、前体T急性成淋巴细胞白血病细胞、伯基特氏白血病(伯基特氏淋巴瘤)细胞或急性双表型白血病细胞；慢性白血病细胞，例如，慢性髓系淋巴瘤细胞、慢性骨髓性白血病(CML)细胞、慢性单核细胞白血病细胞、慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤细胞或B细胞幼淋巴细胞白血病细胞；毛发细胞淋巴瘤细胞；T细胞幼淋巴细胞白血病细胞；或淋巴瘤细胞，例如，组织细胞性淋巴瘤细胞、淋巴浆细胞性淋巴瘤细胞(例如，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症细胞)、脾边缘带淋巴瘤细胞、浆细胞瘤细胞(例如，浆细胞骨髓瘤细胞、浆细胞瘤细胞、单克隆免疫球蛋白沉积病或重链病)、淋巴结外边缘带B细胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)细胞、淋巴结边缘带B细胞淋巴瘤(NMZL)细胞、滤泡性淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤细胞、血管内大B细胞淋巴瘤细胞、原发性渗出性淋巴瘤细胞、T细胞大颗粒性淋巴细胞白血病细胞、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤细胞、淋巴结外NK/T细胞淋巴瘤——鼻型细胞、肠病型T细胞淋巴瘤细胞、肝脾型T细胞淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤细胞、蕈样真菌病(塞扎里综合征)、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增殖性病症(例如，原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤或淋巴瘤样丘疹病)细胞、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤细胞、外周T细胞淋巴瘤——未指定细胞、间变性大细胞淋巴瘤细胞、霍奇金氏淋巴瘤细胞或结节性淋巴细胞为主的霍奇金氏淋巴瘤细胞。在另一个具体实施例中，肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞或骨髓发育不良综合征细胞。
在具体实施例中，肿瘤细胞为实体瘤细胞，例如，癌细胞，例如，腺癌细胞、肾上腺皮质癌细胞、结肠腺癌细胞、结直肠腺癌细胞、结直肠癌细胞、导管细胞癌细胞、肺癌细胞、甲状腺癌细胞、鼻咽癌细胞、黑素瘤细胞(例如，恶性黑素瘤细胞)、非黑素瘤皮肤癌细胞或未指定的癌细胞；硬纤维瘤细胞；促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤细胞；内分泌肿瘤细胞；尤文肉瘤细胞；生殖细胞瘤细胞(例如，睾丸癌细胞、卵巢癌细胞、绒毛膜癌细胞、内胚窦瘤细胞、生殖细胞瘤细胞等)；肝母细胞瘤细胞；肝细胞癌细胞；成神经细胞瘤细胞；非横纹肌肉瘤软组织肉瘤细胞；骨肉瘤细胞；视网膜母细胞瘤细胞；横纹肌肉瘤细胞；或威尔姆氏瘤细胞。在另一个实施例中，肿瘤细胞为胰腺癌细胞或乳腺癌细胞。在其它实施例中，实体瘤细胞为听神经瘤细胞；星形细胞瘤细胞(例如，I级毛细胞性星形细胞瘤细胞、II级低级星形细胞瘤细胞、III级间变性星形细胞瘤细胞或IV级多形性成胶质细胞瘤细胞)；脊索瘤细胞；颅咽管瘤细胞；胶质瘤细胞(例如，脑干胶质瘤细胞；室管膜瘤细胞；混合型胶质瘤细胞；视神经胶质瘤细胞；或亚室管膜瘤细胞)；成胶质细胞瘤细胞；成神经管细胞瘤细胞；脑膜瘤细胞；转移性脑瘤细胞；少突神经胶质瘤细胞；松果体母细胞瘤细胞；垂体瘤细胞；原始神经外胚层肿瘤细胞；或神经鞘瘤细胞。在另一个实施例中，肿瘤细胞为前列腺癌细胞。
如本文所使用的，“治疗上有益的”和“治疗益处”包含但不限于，例如，减小肿瘤的大小；减轻或停止肿瘤的扩增；减少或防止转移性疾病；减少每单位体积组织样品例如血液样品中癌细胞的数量；临床上改善所述个体所患的特定癌症或肿瘤的任何症状、减轻个体所患的特定癌症的任何症状或停止其恶化等。
5.11.3.使用NK细胞和/或ILC3细胞以及其它抗癌药剂的癌症治疗
利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群治疗来患有癌症的个体可以是包含一种或多种其它抗癌药剂的抗癌疗法方案的一部分。同样地，利用使用本文所描述的方法产生的ILC3细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群来治疗患有癌症的个体可以是包含一种或多种其它抗癌药剂的抗癌疗法方案的一部分。另外地或可替代地，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞对患有癌症的个体的治疗可以用于补充包含一种或多种其它抗癌药剂的抗癌疗法。此类抗癌药剂在本领域是众所周知的并且包含抗炎剂、免疫调节剂、细胞毒性剂、癌症疫苗、化疗药物、HDAC抑制剂(例如，HDAC6i(ACY-241))和siRNA。除了使用本文所描述的方法产生的NK细胞和任选地灌注液、灌注液细胞、除使用本文所描述的方法产生的NK细胞外的自然杀伤细胞外，还可以施用于患有癌症的个体例如具有肿瘤细胞的个体的特定抗癌药剂包含但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿可达佐；阿克罗宁；阿多来新；阿霉素；adrucil；阿地白细胞介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美坦醌；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；门冬酰胺酶(例如，来自欧文氏菌属菊黄(Erwinia chrysan)；Erwinaze)曲林菌素；安维汀(贝伐单抗)；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苄替哌；比卡鲁胺；盐酸必桑郡；二甲磺酸双奈法德(bisnafide dimesylate)；比折来新；硫酸博莱霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡米诺霉素；卡折来新；西地芬戈；塞来昔布(COX-2抑制剂)；柔红霉素；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克立那托(crisnatol mesylate)；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；亚丝醌(diaziquone)；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸(eflomithine hydrochloride)；依沙芦星；爱施巴(Elspar)；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；凡毕复(Etopophos)；艾托卜宁；盐酸法屈唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；善唯达(Idamycin)；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；异丙铂；伊立替康；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；丝裂霉素；密脱克罗明(mitocromin)；丝裂菌褶素；丝裂马菌素；丝裂霉素C；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；甲基丝裂霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；Proleukin；巯基嘌呤(Purinethol)；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑霉素；Rheumatrex；利波腺苷；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；斯巴佛斯酸钠(sparfosate sodium)；司帕霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲菌素；磺氯苯脲；泰博立德(Tabloid)；他利霉素；替可加兰钠；泰索帝；喃氟啶；盐酸替洛蒽醌；替莫卟吩；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；噻替派；噻唑羧胺核苷；替拉扎明；Toposar；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；Trexall；磷酸曲西瑞宾；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸醛基长春碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；以及盐酸佐柔比星。
其它抗癌药包含但不限于：20-表-1,25二羟基维生素D3；5-氮杂胞苷；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；阿斯扶威(acylfulvene)；腺环戊醇；阿多来新；阿地白细胞介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；氨密多西(amidox)；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背侧化形态发生蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；阿宿拉克林(asulacrine)；阿他美坦；阿莫司汀；阿西那斯它汀1(axinastatin 1)；阿西那斯它汀2；阿西那斯它汀3；阿扎司琼；阿扎脱辛(azatoxin)；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；巴拉诺尔(balanol)；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯唑氯辛(benzochlorins)；苯甲酰星形孢菌素；β内酰胺衍生物；β-阿类汀(beta-alethine)；亚阿克拉霉素B(betaclamycin B)；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；必桑郡；双吖丙啶基精胺；双萘法德；双脱汀尼A(bistratene A)；比折来新；布赖氟雷(breflate)；溴匹立明；布朵替坦；丁硫氨酸亚砜胺；钙泊三醇；钙磷酸蛋白C；伊立替康(camptosar)(也称为开普拓(Campto)；抗癌妥(irinotecan))喜树碱衍生物；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧基胺基三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨源性抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；粟树精胺；CC-122；CC-220；CC-486；杀菌肽B；西曲瑞克；chlorlns；氯代喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；克林斯姆汀A(collismycin A)；克林斯姆汀B；康普瑞汀A4；康普瑞汀类似物；康那根宁(conagenin)；克拉泊西汀(crambescidin 816)；克雷斯托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；克由若辛A(curacin A)；环戊烷拉喹(cyclopentanthraquinones)；环铂(cycloplatam)；噻泊米辛(cypemycin)；阿糖胞苷烷磷酯；溶细胞因子；噻脱斯汀(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；dehydrodidenmin B；德舍瑞林；地塞米松；第西佛斯米(dexifosfamide)；右丙亚胺；右维拉帕米(dexverapamil)；亚丝醌；膜海鞘素B；第多克斯(didox)；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮杂胞苷；9-二氢紫杉醇；二氧杂霉菌素；二苯螺莫司汀；多西他赛；二十二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；多柔比星；屈洛昔芬；屈大麻酚；多卡米辛SA(duocarmycin SA)；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决可单抗；依洛尼塞；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌氮芥类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法屈唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；氟拉沃匹瑞多(flavopiridol)；氟卓斯汀；福噜斯特酮(fluasterone)；氟达拉滨(例如，Fludara)；盐酸氟代柔红霉素；福酚美克；福美司坦；福司曲星；福莫司汀；四非丁钆(gadoliniumtexaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；白明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；合普素凡(hepsulfam)；调蛋白；六亚甲基二乙酰胺；高哈林通碱(homoharringtonine)(HHT，高三尖杉酯碱(omacetaxine mepesuccinate))；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；伊马替尼(例如，
Figure BDA0003186938500001411
)、咪喹莫特(imiquimod)；免疫增强药肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍；碘多柔比星；甘薯黑斑霉醇(ipomeanol),4-；伊罗普拉；伊索拉定；艾索本加唑(isobengazole)；艾索合莫哈力抗林B(isohomohalicondrin B)；伊他司琼；亚普拉可诺林(jasplakinolide)；卡哈拉莱F(kahalalide F)；三乙酸片螺素N(lamellarin-Ntriacetate)；兰瑞肽；莱那米辛(leinamycin)；来格司亭；香菇多糖硫酸酯；莱普脱斯达汀(leptolstatin)；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞干扰素α；亮丙瑞林(leuprolide)+雌性激素+黄体酮；抑那通(leuprorelin)；左旋咪唑；利阿唑；线性聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；例索克林安7(lissoclinamide 7)；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛索立宾；勒托替康；特可萨啡林镏(lutetium texaphyrin)；力索啡林(lysofylline)；裂解肽；美坦辛；吗诺斯它汀A(mannostatin A)；马马司他；马索罗酚；乳腺丝抑蛋白；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；美巴伦(merbarone)；美特莱林(meterelin)；蛋氨酸酶；胃复安；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；丝裂毒素成纤维细胞生长因子——皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫格拉莫斯提(molgramostim)；抗EGFR抗体(例如，爱必妥(西妥昔单抗)；抗CD19抗体；抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)；抗CS-1抗体(例如，埃罗妥珠单抗(BMS/艾伯维公司(AbbVie))；抗CD38抗体(例如，达雷木单抗(Genmab/杨森生物科技集团(Janssen Biotech))；抗CD138抗体(例如，因达单抗(indatuximab)(Biotest AGDreieich))；抗PD-1抗体；抗PD-L1抗体(例如，度伐单抗(durvalumab)(阿斯利康公司(AstraZeneca)))；抗NKG2A抗体(例如，莫纳利珠单抗(monalizumab)(IPH2201；因内特制药公司(Innate Pharma))；抗DLL4抗体(例如，登西珠单抗(demcizumab)(安可医疗公司(Oncomed)/新基公司(Celgene))；抗DLL4和抗VEGF双特异性抗体；抗RSPO3抗体；抗TIGIT抗体；ICOS激动剂抗体；抗二唾液酸神经节苷脂(GD2)抗体(例如，单克隆抗体3F8或ch14.18)；抗ErbB2抗体(例如，赫赛汀)；人绒毛膜促性腺激素；单磷酰脂质A+分枝杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；芥末抗癌剂；米卡泊氧化物B(mycaperoxide B)；分枝杆菌细胞壁提取物；密瑞泊伦(myriaporone)；N-乙酰基地那林；N取代的苯甲酰胺；那法瑞林；那格瑞斯第(nagrestip)；纳洛酮+戊唑辛；纳帕林(napavin)；纳啡特品(naphterpin)；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；尼鲁米特；尼萨米辛(nisamycin)；一氧化氮调节剂；硝基氧抗氧化剂；尼图林(nitrullyn)；奥利默森(oblimersen)
Figure BDA0003186938500001421
O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；奥可森诺(okicenone)；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；奥拉辛(oracin)；口腔细胞因子诱导物；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂(例如，Floxatin)；奥呷诺辛(oxaunomycin)；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕拉氨(palauamine)；帕密脱合唑辛(palmitoylrhizoxin)；帕米膦酸；人参炔三醇；帕诺米芬；帕拉巴汀(parabactin)；泊泽尼普定；培门冬酶；培地辛(peldesine)；木聚硫钠；喷司他丁；朋脱若唑(pentrozole)；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏醇；芬那兹诺辛(phenazinomycin)；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；毕西巴尼；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；普莱斯汀A(placetin A)；普莱斯汀B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂复合体；铂化合物；铂-三胺复合体；卟吩姆钠；甲基丝裂霉素；强的松；丙基双茚酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂、微藻；蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑吖啶(pyrazoloacridine)；吡啶氧基化血红蛋白聚氧乙烯缀合物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼斯基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；脱甲基化瑞替普汀；乙酸铼186；根霉素；酶性核酸；RII维甲酰胺(RII retinamide)；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；噜必吉诺B1(rubiginone B1)；噜泊基(ruboxyl)；沙芬戈；萨因脱匹(saintopin)；SarCNU；萨考啡脱A(sarcophytol A)；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老源性抑制剂1；正义寡核苷酸；信号转导抑制剂；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；索沃罗(solverol)；生长调节素结合蛋白；索纳明；斯帕磷酸；霉素D；螺莫司汀；斯耐潘定(splenopentin)；软海绵素1；角鲨胺；斯第匹氨(stipiamide)；溶基质素抑制剂；素飞诺辛(sulfinosine)；超活性血管活性肠肽拮抗剂；素若第斯它(suradista)；苏拉明；苦马豆素；他莫司汀；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；喃氟啶；呔鲁拉利(tellurapyrylium)；端粒酶抑制剂；替莫卟吩；替尼泊苷；四氯脱氧化物；四唑茗(tetrazomine)；萨力巴拉斯汀(thaliblastine)；西奥考拉林(thiocoraline)；促血小板生成素；促血小板生成素模拟物；胸腺法新；促胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；乙基初卟啉锡；替拉扎明；二氯二茂钛；脱普森汀(topsentin)；托瑞米芬；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦源性生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；瓦瑞奥林B(variolin B)；维克替比(Vectibix)(帕尼单抗)；维拉雷琐；藜芦胺；维尔丁斯；维替泊芬；长春瑞滨；长春花碱；维它汀(vitaxin)；伏氯唑；Welcovorin(甲酰四氢叶酸(leucovorin))；希罗达(Xeloda)(卡培他滨)；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；以及净司他丁斯酯(zinostatinstimalamer)。
利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体可以是包含一种或多种免疫检查点调节剂的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，免疫检查点调节剂调节免疫检查点分子，如CD28、OX40、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、疱疹病毒侵入介导物(HVEM)、T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域蛋白-3(TIM-3)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)、T细胞激活的V结构域免疫球蛋白遏制因子(VISTA)、B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、PD-1和/或PD-L1。在某些实施例中，免疫检查点分子是抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，免疫检查点调节剂是免疫检查点分子的激动剂。在某些实施例中，免疫检查点分子是CD28、OX40、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、ICOS(CD278)、诱导型T细胞共刺激因子和/或疱疹病毒侵入介导物(HVEM)。在某些实施例中，免疫检查点调节剂是抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，免疫检查点调节剂是免疫检查点分子的拮抗剂。在某些实施例中，免疫检查点分子是T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域含有性-3(TIM-3)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)、T细胞激活的V结构域免疫球蛋白遏制因子(VISTA)、B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、PD-1和/或PD-L1。在某些实施例中，免疫检查点调节剂是抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，免疫检查点调节剂是抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体或其抗体结合片段结合PD-1。在某些实施例中，结合PD-1的抗体或其抗体结合片段是纳武单抗(
Figure BDA0003186938500001431
BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538；百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)、小野制药有限公司(Ono Pharmaceuticals,Inc.))、派姆单抗(
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兰伯丽珠单抗(lambrolizumab)，MK-3475；默克集团(Merck))、皮地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011；治愈技术公司(CureTech)、麦迪韦逊公司(Medivation))；MEDI0680(AMP-514；医学免疫公司(MedImmune)、阿斯利康公司)；PDR-001(诺华公司(Novartis))、SHR1210或INCSHR1210；因赛特公司(Incyte)、江苏恒瑞医药股份有限公司(Jiangsu Hengrui))。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合PD-L1。在某些实施例中，结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段为度伐单抗(MEDI4736；医学免疫公司、阿斯利康公司)、BMS-936559(MDX-1105；百时美施贵宝公司)、阿维鲁单抗(avelumab)(MSB0010718C；默克雪兰诺公司(Merck Serono)、辉瑞公司(Pfizer))或阿特朱单抗(MPDL-3280A；基因技术公司(Genentech)、罗氏公司(Roche))。在某些实施例中，抗体或其抗体结合片段结合LAG-3。在某些实施例中，结合LAG-3的抗体或其抗体结合片段为BMS-986016(百时美施贵宝公司)、GSK2831781(葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline)或LAG525(诺华公司)。在某些实施例中，抗体或其抗体结合片段结合CTLA-4。在某些实施例中，结合CTLA-4的抗体或其抗体结合片段为伊匹单抗(ipilimumab)(YERVOYTM、BMS-734016、MDX010、MDX-101；百时美施贵宝公司)或替西利姆单抗(tremelimumab)(CP-675,206；医学免疫公司、阿斯利康公司)。在某些实施例中，抗体或其抗体结合片段结合OX40。在某些实施例中，结合OX40的抗体或其抗体结合片段为MEDI6469(医学免疫公司、阿斯利康公司)、MEDI0562(医学免疫公司、阿斯利康公司)或KHK4083(协和发酵麒麟株式会社(Kyowa Hakko Kirin))。在某些实施例中，抗体或其抗体结合片段结合GITR。在某些实施例中，结合GITR的抗体或其抗体结合片段为TRX518(锐璞生物医药公司(Leap Therapeutics))或MEDI1873(医学免疫公司、阿斯利康公司)。在某些实施例中，抗体或其抗体结合片段结合CD137(4-1BB)。在某些实施例中，结合CD137(4-1BB)的抗体或其抗体结合片段为PF-2566(PF-05082566；辉瑞公司)或乌瑞鲁单抗(urelumab)(BMS-663513；百时美施贵宝公司)。在某些实施例中，抗体或其抗体结合片段结合CD27。在某些实施例中，结合CD27的抗体或其抗体结合片段为伐瑞鲁单抗(varilumab)(CDX-1127；塞德斯治疗剂公司(Celldex Therapeutics))。
在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含来那度胺或泊马度胺的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含HDAC抑制剂的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含抗CS-1抗体的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含抗CD38抗体的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含抗CD138抗体的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含抗PD-1抗体的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含抗PD-L1抗体的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含抗NKG2A抗体的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗；
Figure BDA0003186938500001451
)的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含CC-122的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含CC-220的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含抗DLL4抗体(例如，登西珠单抗)的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含抗DLL4和抗VEGF双特异性抗体的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含抗RSPO3抗体的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含抗TIGIT抗体的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含ICOS激动剂抗体的抗癌疗法方案的一部分。在某些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群来治疗患有癌症的个体是包含高哈林通碱(例如，高三尖杉酯碱)的抗癌疗法方案的一部分。
在一些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的NK细胞来治疗患有癌症的个体是用于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗癌疗法方案的一部分。在一些实施例中，利用使用本文所描述的方法产生的ILC3细胞来治疗患有癌症的个体是用于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗癌疗法方案的一部分。在一个实施例中，ADCC方案包括一种或多种抗体(例如，前述段落中所描述的抗体)与使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞的组合施用。使用此类ADCC方法可以治疗若干种类型的癌症，包含但不限于急性成淋巴细胞白血病(ALL)或其它B细胞恶性肿瘤(淋巴瘤和白血病)、成神经细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌和头颈癌。在具体实施例中，ADCC疗法包括以下抗体中的一种或多种与使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞的组合施用：抗EGFR抗体(例如，爱必妥(西妥昔单抗)、抗CD19抗体、抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)、抗二唾液酸神经节苷脂(GD2)抗体(例如，单克隆抗体3F8或ch14.18)或抗ErbB2抗体(例如，赫赛汀)。在一个实施例中，ADCC方案包括抗CD33抗体与使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞的组合施用。在一个实施例中，ADCC方案包括抗CD20抗体与使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞的组合施用。在一个实施例中，ADCC方案包括抗CD138抗体与使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞的组合施用。在一个实施例中，ADCC方案包括抗CD32抗体与使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞的组合施用。
5.11.4.病毒感染的治疗
在另一个实施例中，本文提供了一种治疗患有病毒感染的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的使用本文所描述的方法产生的NK细胞，例如，使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群。在另一个实施例中，本文提供了一种治疗患有病毒感染的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的ILC3细胞，例如，使用本文所描述的三阶段法产生的ILC3细胞群。在某些实施例中，个体具有自然杀伤细胞的缺乏，例如，针对个体的病毒感染具有活性的NK细胞或其它先天淋巴样细胞的缺乏。在某些具体实施例中，所述施用另外包括向个体施用以下中的一种或多种：分离的胎盘灌注液、分离的胎盘灌注液细胞、分离的自然杀伤细胞例如胎盘自然杀伤细胞例如胎盘源性中间自然杀伤细胞、分离的组合自然杀伤细胞和/或其组合。在某些具体实施例中，使使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞在所述施用之前接触或接近免疫调节化合物例如上述免疫调节化合物或沙利度胺。在某些其它具体实施例中，所述施用包括除使用本文所描述的方法产生的所述NK细胞和/或所述ILC3细胞外还向所述个体施用免疫调节化合物例如上文所描述的免疫调节化合物或沙利度胺，其中所述量是例如使所述病毒感染的一种或多种症状得到可检测的改善、所述病毒感染的一种或多种症状的进展减轻或所述病毒感染的一种或多种症状消除的量。在具体实施例中，病毒感染为腺病毒科、小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳头状核糖核酸病毒科、弹状病毒科或披盖病毒科中的病毒的感染。在更具体的实施例中，所述病毒为人免疫缺陷病毒(HIV)、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、脊髓灰质炎病毒、艾巴氏病毒(EBV)、1型单纯疱疹病毒(HSV1)、2型单纯疱疹病毒(HSV2)、人巨细胞病毒(CMV)、8型人疱疹病毒(HHV8)、带状疱疹病毒(herpes zoster virus)(水痘带状疱疹病毒(VZV)或带状疱疹病毒(shingles virus))、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)、流感病毒(例如，甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒或托高土病毒属(thogotovirus))、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、乳头瘤病毒、狂犬病病毒或风疹病毒。
在其它更具体的实施例中，所述病毒为A类腺病毒，血清型12、18或31；B类腺病毒，血清型3、7、11、14、16、34、35或50；C类腺病毒，血清型1、2、5或6；D类，血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、36、37、38、39、42、43、44、45、46、47、48、49或51；E类，血清型4；或F类，血清型40或41。
在某些其它更具体的实施例中，病毒为阿波依病毒(Apoi virus，APOIV)、阿洛病毒(Aroa virus，AROAV)、巴格扎病毒(bagaza virus，BAGV)、班齐病毒(Banzi virus，BANV)、博博衣病毒(Bouboui virus，BOUV)、卡西帕科利病毒(Cacipacore virus，CPCV)、凯里岛病毒(Carey Island virus，CIV)、牛骨脊病毒(Cowbone Ridge virus，CRV)、登革病毒(DENV)、埃杰山病毒(Edge Hill virus，EHV)、加德格兹谷病毒(Gadgets Gully virus，GGYV)、伊列乌斯病毒(Ilheus virus，ILHV)、以色列土耳其脑膜脑脊髓炎病毒(ITV)、日本脑炎病毒(JEV)、朱格拉病毒(Jugra virus，JUGV)、胡蒂亚帕病毒(Jutiapa virus，JUTV)、卡达姆病毒(kadam virus，KADV)、凯杜古病毒(Kedougou virus，KEDV)、科科贝拉病毒(Kokobera virus，KOKV)、库坦戈病毒(Koutango virus，KOUV)、科萨努尔森林病病毒(Kyasanur Forest disease virus，KFDV)、兰加特病毒(Langat virus，LGTV)、米班病毒(Meaban virus，MEAV)、摩多克病毒(Modoc virus，MODV)、蒙大拿鼠耳蝙蝠脑白质炎病毒(MMLV)、墨累谷脑炎病毒(MVEV)、恩塔亚病毒(Ntaya virus，NTAV)、鄂木斯克出血热病毒(OHFV)、玻瓦桑病毒(Powassan virus，POWV)、热伯维病毒(Rio Bravo virus，RBV)、皇家农场病毒(Royal Farm virus，RFV)、萨博亚病毒(Saboya virus，SABV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、萨尔别霍病毒(Sal Vieja virus，SVV)、圣帕利塔病毒(San Perlita virus，SPV)、索马里兹礁病毒(Saumarez Reef virus，SREV)、塞皮克病毒(Sepik virus，SEPV)、坦布苏病毒(Tembusu virus，TMUV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、秋列尼病毒(Tyuleniy virus，TYUV)、乌干达S病毒(UGSV)、乌苏图病毒(Usutu virus，USUV)、韦塞尔斯布朗病毒(WESSV)、西尼罗河病毒(WNV)、雅温德病毒(YAOV)、黄热病病毒(YFV)、横须贺病毒(Yokose virus，YOKV)或寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)。
在其它实施例中，作为包含一种或多种其它抗病毒药剂的抗病毒疗法方案的一部分，向患有病毒感染的个体施用使用本文所描述的方法产生的NK细胞以及任选地胎盘灌注液和/或灌注液细胞。可以向患有病毒感染的个体施用的具体抗病毒药剂包含但不限于：咪喹莫特、普达非洛(podofilox)、鬼臼脂(podophyllin)、干扰素α(IFNα)、reticolos、壬苯醇醚-9、阿昔洛韦(acyclovir)、泛昔洛韦(famciclovir)、伐昔洛韦(valaciclovir)、更昔洛韦(ganciclovir)、西多福韦(cidofovir)；金刚烷胺、金刚乙胺；利巴韦林(ribavirin)；扎那米韦(zanamavir)和奥斯他伟(oseltaumavir)；蛋白酶抑制剂，如茚地那韦(indinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、利托那韦(ritonavir)或沙奎那韦(saquinavir)；核苷类逆转录酶抑制剂，如地达诺新(didanosine)、拉米夫定(lamivudine)、司他夫定(stavudine)、扎西他滨(zalcitabine)或齐多夫定(zidovudine)；以及非核苷类逆转录酶抑制剂，如奈韦拉平(nevirapine)或依法韦伦(efavirenz)。
5.11.5.ILC3细胞的其它治疗用途
本文提供了可以在如本文所提供的所有方法中使用的ILC3细胞。在以下方面公开了可以使用ILC3细胞的示例性方法。
在另一方面，本文提供了一种在化疗后修复胃肠道的方法，所述方法包括向个体施用多个ILC3细胞，其中所述ILC3细胞所述通过本文所描述的三阶段法。
在另一方面，本文提供了一种保护个体免受辐射伤害的方法，所述方法包括向个体施用多个ILC3细胞，其中所述ILC3细胞通过本文所描述的三阶段法产生。在某些方面，所述ILC3细胞用作骨髓移植的辅料。
在另一方面，本文提供了一种重构个体的胸腺的方法，所述方法包括向个体施用多个ILC3细胞，其中所述ILC3细胞通过本文所描述的三阶段法产生。
在另一方面，本文提供了一种提高个体对病原体的保护性免疫力的方法，所述方法包括向个体施用多个ILC3细胞，其中所述ILC3细胞通过本文所描述的三阶段法产生。在某些方面，执行提高对病原体的保护性免疫力以治疗肠道感染。在某些方面，执行提高对病原体的保护性免疫力以防止肠道感染。在某些方面，肠道感染为鼠柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)。
在另一方面，本文提供了一种肿瘤排斥的方法，所述方法包括向个体施用多个ILC3细胞，其中所述ILC3细胞已经通过本文所描述的三阶段法产生。
在另一方面，本文提供了一种维持器官发生期间的组织完整性的方法，所述方法包括向个体施用多个ILC3细胞，其中所述ILC3细胞已经通过本文所描述的三阶段法产生。
在另一方面，本文提供了一种组织修复的方法，所述方法包括向个体施用多个ILC3细胞，其中所述ILC3细胞已经通过本文所描述的三阶段法产生。
在另一方面，本文提供了一种调节炎症的方法，所述方法包括向个体施用多个ILC3细胞，其中所述ILC3细胞已经通过本文所描述的三阶段法产生。
5.11.6.施用
对细胞例如胎盘灌注液细胞例如来自胎盘灌注液的有核细胞、组合自然杀伤细胞、ILC3细胞和/或分离的自然杀伤细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群的数量的确定以及对免疫调节化合物例如免疫调节化合物或沙利度胺的量的确定可以独立于彼此执行。
分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物的施用可以是全身或局部的。在具体实施例中，施用是肠胃外的。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物是通过注射、输注、静脉内(IV)施用、股动脉内施用或瘤内施用。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物是用装置、基质或支架执行的。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物是通过注射。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物是经由导管。在具体实施例中，NK细胞和/或ILC3细胞的注射为局部注射。在更具体的实施例中，局部注射直接进入实体瘤(例如，肉瘤)中。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物是通过用注射器注射。在具体实施例中，向受试者施用分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物是经由导引递送。在具体实施例中，通过注射向受试者施用分离的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其药物组合物是由腹腔镜检查、内窥镜检查、超声、计算机断层扫描、磁共振或放射学辅助的。
5.11.6.1.细胞的施用
在某些实施例中，以对个体产生可检测的治疗益处的任何量或数量例如有效量使用例如向个体施用使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞，例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群和/或ILC3细胞群，其中个体患有病毒感染、癌症或肿瘤细胞，例如，具有肿瘤细胞、实体瘤或血癌的个体，例如，癌症患者。可以将此类细胞以细胞的绝对数量施用于此类个体，例如，可以向所述个体施用约、至少约或至多约1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个或1×1011个使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞。在其它实施例中，可以按细胞的相对数量向此类个体施用使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞，例如，可以向所述个体施用每千克个体约、至少约或至多约1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个或1×1011个使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞。在其它实施例中，可以按细胞的相对数量向此类个体施用使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞，例如，可以向所述个体施用每千克个体约、至少约或至多约1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个或5×108个使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞。可以根据使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞以及任选地胎盘灌注液细胞和/或除使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞以外的自然杀伤细胞的数量与所述个体中肿瘤细胞的数量(例如，估计数量)之间的近似比向此类个体施用使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞。例如，可以将使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞与个体的肿瘤细胞数量按以下比率施用于所述个体：约、至少约或至多约1:1、1:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。此类个体的肿瘤细胞数量可以例如通过对来自个体的组织样品例如血液样品、活检等中的肿瘤细胞数量进行计数来估计。在具体实施例中，例如，针对实体瘤，所述计数与对一个或多个肿瘤的成像组合地执行以获得近似的肿瘤体积。在具体实施例中，除了使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞、任选地胎盘灌注液细胞和/或除使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞以外的自然杀伤细胞外，还向个体施用免疫调节化合物或沙利度胺，例如，有效量的免疫调节化合物或沙利度胺。
在某些实施例中，遏制例如个体的肿瘤细胞的增殖的方法、对具有个体自然杀伤细胞的缺乏的个体的治疗或者对患有病毒感染的个体的治疗或者对患有癌症的个体例如具有肿瘤细胞、血癌或实体瘤的个体的治疗包括使肿瘤细胞接近向所述个体施用使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞以及胎盘灌注液和/或胎盘灌注液细胞中的一种或多种的组合。在具体实施例中，所述方法另外包括使肿瘤细胞接近向个体施用免疫调节化合物或沙利度胺。
在具体实施例中，例如，对具有个体自然杀伤细胞的缺乏例如NK细胞数量上的缺乏或NK细胞对癌症、肿瘤或病毒感染的细胞的反应性的缺乏的个体的治疗或者对患有癌症或病毒感染的个体的治疗或者对肿瘤细胞增殖的遏制包括使所述肿瘤细胞接近或向所述个体施用补充有分离的胎盘灌注液细胞或胎盘灌注液的使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞。在具体实施例中，约1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个或更多个使用本文所描述的方法产生的NK细胞每毫升或者1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个、1×1011个或更多个使用本文所描述的方法产生的NK细胞补充有每毫升约或至少约1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个或更多个分离的胎盘灌注液细胞或者1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个、1×1011个或更多个分离的胎盘灌注液细胞。在其它更具体的实施例中，约1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个或更多个使用本文所描述的方法产生的NK细胞或者1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个、1×1011个或更多个使用本文所描述的方法产生的NK细胞补充有约或至少约1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL、65mL、70mL、75mL、80mL、85mL、90mL、95mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL、450mL、500mL、550mL、600mL、650mL、700mL、750mL、800mL、850mL、900mL、950mL或1000mL的灌注液或约1单位的灌注液。
在另一个具体实施例中，对具有个体自然杀伤细胞的缺乏的个体的治疗、对患有癌症的个体的治疗、对患有病毒感染的个体的治疗或者对肿瘤细胞增殖的遏制包括使肿瘤细胞接近或向个体施用使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞，其中所述细胞补充有贴壁胎盘细胞，例如，贴壁胎盘干细胞或多能细胞，例如，CD34-、CD10+、CD105+、CD200+组织培养塑料-贴壁胎盘细胞。在具体实施例中，使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞补充有约1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个或更多个贴壁胎盘干细胞每毫升或者1×104个、5×104个、1×105个、5×105个、1×106个、5×106个、1×107个、5×107个、1×108个、5×108个、1×109个、5×109个、1×1010个、5×1010个、1×1011个或更多个贴壁胎盘细胞，例如，贴壁胎盘干细胞或多能细胞。
在另一个具体实施例中，对具有个体自然杀伤细胞的缺乏的个体的治疗、对患有癌症的个体的治疗、对患有病毒感染的个体的治疗或者对肿瘤细胞增殖的遏制使用免疫调节化合物或沙利度胺与使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞组合地执行，其中所述细胞补充有条件培养基，例如，由CD34-、CD10+、CD105+、CD200+组织培养塑料-贴壁胎盘细胞调控的培养基，例如，0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.1mL、0.8mL、0.9mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL的干细胞条件培养基每单位灌注液或者每104个、105个、106个、107个、108个、109个、1010个或1011个使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞。在某些实施例中，组织培养塑料-贴壁胎盘细胞为美国专利第7,468,276号和第8,057,788号中所描述的多能贴壁胎盘细胞，所述美国专利的公开内容通过全文引用的方式并入本文。在另一个具体实施例中，所述方法另外包括使肿瘤细胞接近或向个体施用免疫调节化合物或沙利度胺。
在另一个具体实施例中，对具有个体自然杀伤细胞的缺乏的个体的治疗、对患有癌症的个体的治疗、对患有病毒感染的个体的治疗或者对肿瘤细胞增殖的遏制，其中使用本文所描述的方法产生的所述NK细胞和/或所述ILC3细胞补充有胎盘灌注液细胞，使胎盘灌注液细胞接近白细胞介素-2(IL-2)一段时间，然后再进行所述接近。在某些实施例中，所述一段时间为所述接近之前的约、至少或至多1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时或48小时。
使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞以及任选地灌注液或灌注液细胞可以在抗癌疗法期间向患有病毒感染的个体、患有癌症的个体或具有肿瘤细胞的个体施用一次；或者可以在疗法期间施用多次，例如，每1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时或23小时一次或者每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天一次或者每1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、24周、36周或更多周一次。在使用细胞和免疫调节化合物或沙利度胺的实施例中，免疫调节化合物或沙利度胺和细胞或灌注液可以：例如在同一调配物中一起施用于个体；例如在单独的调配物中在大约相同的时间单独施用；或可以例如按不同的给药时间表或在一天中的不同时间单独施用。类似地，在使用细胞和抗病毒化合物或抗癌化合物的实施例中，抗病毒化合物或抗癌化合物和细胞或灌注液可以：例如在同一调配物中一起施用于个体；例如在单独的调配物中在大约相同的时间单独施用；或可以例如按不同的给药时间表或在一天中的不同时间单独施用。使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞以及灌注液或灌注液细胞可以在不考虑使用本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞、灌注液或灌注液细胞在过去是否已经施用于个体的情况下施用。
6.试剂盒
本文提供了一种药物包或试剂盒，所述药物包或试剂盒包括用本文所描述的组合物中的一种或多种填充的一个或多个容器，例如，包括通过本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞例如使用本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群和/或ILC3细胞群的组合物。与一个或多个此类容器任选地相关联的可以是呈由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，所述公告反映了机构对针对人类施用在制造、使用或销售方面的许可。
本文所涵盖的试剂盒可以根据本文所描述的方法使用，例如，遏制肿瘤细胞的生长的方法和/或治疗癌症例如血癌的方法和/或治疗病毒感染的方法。在一个实施例中，试剂盒在一个或多个容器中包括通过本文所描述的方法产生的NK细胞和/或ILC3细胞或其组合物。在具体实施例中，本文提供了包括通过本文所描述的三阶段法产生的NK细胞群和/或ILC3细胞群或其组合物的试剂盒。
7.实例
7.1.实例1：由造血干细胞或组细胞产生自然杀伤细胞的三阶段法
将CD34+细胞在以下培养基调配物中培养指示的天数，并且取得细胞试样以评估细胞计数、细胞活力、自然杀伤细胞分化的表征和功能评价。
阶段1培养基：90％干细胞生长培养基(SCGM)
Figure BDA0003186938500001541
10％人AB血清，补充有25ng/mL或250ng/mL重组人促血小板生成素(TPO)、25ng/mL重组人Flt3L、27ng/mL重组人干细胞因子(SCF)、25ng/mL重组人IL-7、0.05ng/mL或0.025ng/mL重组人IL-6、0.25ng/mL或0.125ng/mL重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、0.01ng/mL或0.025ng/mL重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、0.10％庆大霉素和1到10μm StemRegenin-1(SR-1)或其它干细胞动员剂。
阶段2培养基：90％SCGM、10％人AB血清，补充有25ng/mL重组人Flt3L、27ng/mL重组人SCF、25ng/mL重组人IL-7、20ng/mL重组人IL-15、0.05ng/mL或0.025ng/mL重组人IL-6、0.25ng/mL或0.125ng/mL重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、0.01ng/mL或0.025ng/mL重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、0.10％庆大霉素和1到10μm SR1或其它干细胞动员剂。
阶段3培养基：90％STEMMACSTM、10％人AB血清、0.025mM 2-巯基乙醇(55mM)，补充有22ng/mL重组人SCF、1000U/mL重组人IL-2、20ng/mL重组人IL-7、20ng/mL重组人IL-15、0.05ng/mL或0.025ng/mL重组人IL-6、0.25ng/mL或0.125ng/mL重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、0.01ng/mL或0.025ng/mL重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和0.10％庆大霉素。
将细胞在第0天以3×104个细胞/毫升接种于阶段1培养基中，并且通过CD34+和CD45+计数来测试细胞的纯度并通过7AAD染色来测试细胞的活力。在第5天对细胞进行计数并用阶段1培养基接种至1×105个细胞/毫升的浓度。在第7天对细胞进行计数并用阶段1培养基接种至1×105个细胞/毫升的浓度。
在第10天，对细胞进行计数并在阶段2培养基中接种至1×105个细胞/毫升的浓度。在第12天，对细胞进行计数并阶段2培养基中接种至3×105个细胞/毫升的浓度。在第14天，对细胞进行计数并接种于阶段3培养基中。将细胞在阶段3培养基中维持到第35天。
可替代地，使用以下方案直至第14天：将细胞在第0天以7.5×103个细胞/毫升接种于阶段1培养基中，并且通过CD34+和CD45+计数来测试细胞的纯度并通过7AAD染色来测试细胞的活力。在第7天对细胞进行计数并用阶段1培养基接种至3×105个细胞/毫升的浓度。在第9天对细胞进行计数并用阶段2培养基接种至3×105个细胞/毫升的浓度。在第12天，对细胞进行计数并阶段2培养基中接种至3×105个细胞/毫升的浓度。在第14天，对细胞进行计数并阶段2培养基中接种至3×105个细胞/毫升的浓度。
通过用新鲜培养基稀释培养物或通过对细胞的离心和对新鲜培养基的重悬/添加来执行在传代时将细胞接种于其中。
对于收获，使细胞在400×g下旋转七分钟，然后将团粒悬浮于等体积的勃脉力A中。使悬浮液在400×g下旋转七分钟，并且将所得团粒以靶细胞浓度悬浮于10％HSA(w/v)、60％勃脉力A(v/v)中。然后使细胞滤过70μm网孔，对最终的容器进行填充，对细胞试样进行活力、细胞毒性、纯度和细胞计数测试并且将其余的细胞包装。
7.2.实例2：用于NK细胞的扩增的干细胞动员剂的选择
对以下化合物促进NK细胞群在体外的扩增的能力进行了研究：
4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-6-(异丙基氨基)嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚)(“CRL1”)
Figure BDA0003186938500001561
4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚))(“CRL2”)
Figure BDA0003186938500001562
4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-7-异丙基-6,7-二氢-5H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚(“CRL3”)
Figure BDA0003186938500001563
2-(苯并[b]噻吩-3-基)-4-((4-羟基苯乙基)氨基)-7-异丙基-5,7-二氢-6H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(“CRL4”)
Figure BDA0003186938500001564
3-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基)氧基)丙酰胺(“CRL5”)
Figure BDA0003186938500001571
4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-8-(二甲基氨基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚(“CRL6”)
Figure BDA0003186938500001572
5-(2-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)-6-(仲丁基氨基)嘧啶-4-基)烟腈(“CRL7”)
Figure BDA0003186938500001573
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-甲基-6-苯基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-胺(“CRL8”)
Figure BDA0003186938500001574
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-胺(“CRL9”)
Figure BDA0003186938500001581
3-(2-(苯并[b]噻吩-33-基)-9-异丙基-6-氧-6,9-二氢-1H-嘌呤-1-基)丙酰胺(“CRL10”)
Figure BDA0003186938500001582
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-胺(“CRL11”)
Figure BDA0003186938500001583
5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)喹唑啉-2-基)烟腈(“CRL12”)
Figure BDA0003186938500001584
N4-(2-(1H-吲哚-3-基))乙基)-N2-(仲丁基)喹唑啉-2,4-二胺(“CRL13”)
Figure BDA0003186938500001591
2-(苯并[b]噻吩-3-基)-4-((4-羟基苯乙基)氨基)-7-异丙基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲腈(“CRL14”)
Figure BDA0003186938500001592
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-6-(苯并[b]噻吩-3-基)-3-异丙基咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺(“CRL15”)
Figure BDA0003186938500001593
4-(2-((6-(苯并[b]噻吩-3-基)-3-异丙基咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-基)氨基)乙基)苯酚(“CRL16”)
Figure BDA0003186938500001594
5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)烟腈(“CRL17”)
Figure BDA0003186938500001601
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-胺(“CRL18”)
Figure BDA0003186938500001602
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-胺(“CRL19”)
Figure BDA0003186938500001603
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-甲基吡啶-3-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-胺(“CRL20”)
Figure BDA0003186938500001604
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-7-异丙基-2-(5-甲基吡啶-3-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-胺(“CRL21”)
Figure BDA0003186938500001611
以及
5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基)烟腈(“CRL22”)
Figure BDA0003186938500001612
7.3.实例3：三阶段NK细胞的表征
方法
将UCB CD34+细胞在包含促血小板生成素、SCF、Flt3配体、IL-7、IL-15和IL-2在内的细胞因子存在的情况下培养35天以产生三阶段NK细胞，如实例1中所描述的。使用多色流式细胞术来确定三阶段NK细胞的表型特性。
对于生物测试，提供化合物以进行培养以评价其对NK细胞扩增和分化的影响。具体地，将CD34+细胞的供体(干细胞科技公司(StemCell Technology))按照NK培养方案进行体外解冻和扩增。在前14天的培养期间，将每种CRL化合物溶解于DMSO中并以10μM的浓度添加到培养物中。将SR1(10μM)用作阳性对照化合物，而将没有任何化合物的仅DMSO用作阴性对照。在第35天培养结束时，针对K562肿瘤细胞系对细胞的细胞扩增、自然杀伤(NK)细胞分化和细胞毒性进行表征。由于化合物的数量较大，因此在CRL1-11和CRL12-22两个实验中执行了测试。针对每个实验使用了相同的供体。两个实验中还均包含阳性对照和阴性对照。
结果
细胞扩增数据表明，22种化合物中有20种在10μM浓度下支持NK扩增。除CRL7和CRL13外，其余化合物均在35天内使NK扩增2,000～15,000倍(图1和图2)。在所有化合物中，CRL19、20和22支持细胞扩增的效果最好并且在第35天展现出与SR1类似的扩增水平(图3)。在培养的第14天的CD34细胞扩增示出类似的趋势：大多数化合物支持CD34细胞的扩增，并且CRL19、20和22在第14天实现了最高CD34细胞扩增(图4)。
使用经过化合物培养的细胞与K562肿瘤细胞以10:1的效应物:靶标比(图5)运行细胞毒性测定以评价细胞功能。结果表明，用化合物培养的细胞在10:1的E:T比下杀伤30～60％的K562细胞，这表明细胞呈现NK功能。对于两个供体，用CRL17、18、19和21培养的细胞相比于用SR1培养的那些细胞展现出类似或更大的杀伤活性。
结论：
总之，发现除CRL7和CRL13外的所有化合物均支持PNK-007的扩增和分化。利用化合物的扩增在35天内的范围为2,000～15,000倍，并且培养达到了70％以上的NK细胞。在这些化合物中，CRL19、20和22在PNK-007培养中展现出与SR1非常类似的扩增、分化和细胞毒性曲线。与SR1相比，CRL17、18和21所产生的扩增略少，但CD56+/CD11a+亚群增加并且细胞的杀伤活性也增加。
7.4实例4：三阶段NK细胞的进一步表征
方法
细胞：从干细胞科技公司获取冷冻的PBMC。使用人NK细胞富集试剂盒(干细胞科技公司)根据制造商的说明书从健康供体的新鲜血液中分离外周血源性NK(PB-NK)细胞。由脐带血源性CD34+干细胞生成CYNK细胞(参考文献：Zhang等人,《癌症免疫疗法杂志(JImmunother Cancer)》2015)。简而言之，将CD34+细胞在包含促血小板生成素、SCF、Flt3配体、IL-7、IL-15和IL-2在内的细胞因子存在的情况下培养35天。在分析前将PBNK细胞和CYNK细胞低温保存。
磁激活的细胞分选：将PNK细胞根据制造商的说明书(美天旎生物技术公司)用PE小鼠抗人CD11a(BD)和使用抗PE微珠浓缩的CD11a+PNK细胞进行染色。
单细胞RNA测序：将CYNK细胞与PB-NK以1:1的比率组合并使用10X GenomicsChromium平台和Illumina测序在单细胞水平上进行基因表达分析。生物信息学分析利用了10X Genomics Cell Ranger分析流程。
流式细胞术：将低温保存的细胞在37℃水浴中快速解冻并在RPMI1640+10％hiFBS(热灭活胎牛血清，Gibco)中洗涤一次，然后是PBS中的LIVE/DEADTMFixable Aqua Stain。将细胞用FACS缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤，然后在阻断溶液(Brilliant Stain缓冲液、小鼠IgG2a同种型k对照和人BD Fc阻断剂(均来自BD公司))中温育。将细胞用FACS缓冲液洗涤并在冰上与荧光团偶联抗体在FACS缓冲液中温育25分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤，之后在Fortessa X20流式细胞仪(BD公司)上进行分析。
qRT-PCR：使用Quick-RNA Miniprep试剂盒(凯杰公司(Qiagen))根据制造商的说明书从细胞中分离RNA。使用SuperScript IV逆转录酶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))以标准反应合成cDNA。使用Taqman基因表达测定(应用生物系统公司(Applied Biosystems))执行RT-PCR。使用ΔΔCt法相对于GAPDH(Hs02758991)计算表达水平。
结果
CYNK细胞在体外高效地杀伤各种肿瘤细胞系，然而，CYNK细胞用来诱导细胞死亡的机制仍然了解甚少(参考文献)。为了阐明激活NK细胞受体、细胞内信号传导通路和CYNK细胞发挥其功能作用所所采用的分子机制，使用了单细胞RNA测序(scRNAseq)作为无偏方法来比较CYNK细胞与外周血NK细胞(PB-NK)(图6A)。无偏转录聚类揭示了在CYNK细胞与PB-NK细胞之间区别开来的两个明显特征(图6B)。表1和表2分别列出了PB-NK细胞和CYNK细胞中的每个簇的前50个上调的基因。在PB-NK细胞中表达较高的基因集包含与NK细胞功能作用相关联的基因，包含FGFBP2、颗粒酶(GZMH、GZMM)、CXCR4、KLRF1、KLF2、IFNG(表1)。
已知编码成纤维细胞生长因子结合蛋白的FGFBP2由细胞毒性淋巴细胞分泌。
颗粒酶是储存在NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒性颗粒体中的一组丝氨酸蛋白酶(参考文献)。虽然GzmA和GzmB在释放到其细胞质后会诱导靶细胞死亡并且已经得到了广泛的研究，但关于GzmH、GzmK和GzmM的功能作用却知之甚少。
CXCR4调节NK细胞向骨髓的归巢。
KLRF1编码激活C型凝集素样免疫受体NKp80，其在与激活诱导的C型凝集素(AICL)结合后被激活，从而诱导NK细胞的细胞毒性和细胞因子分泌。
调节NK细胞增殖和存活两者的转录因子KLF2。
NK细胞源性IFN-γ(IFNG基因)是从激活的NK细胞分泌的关键免疫调节因子，所述免疫调节因子通过调节树突状细胞和T细胞的应答来促进适应性免疫应答。
表1：每PB-NK簇的前50个上调的基因。
Figure BDA0003186938500001641
Figure BDA0003186938500001651
CYNK簇中的编码与NK细胞功能作用相关联的因子的靠前的差异表达的基因包含表面受体和共受体(CD96、NCR3、CD59、KLRC1)、TNFSF10、免疫检查点基因(TNFRSF18、TNFRSF4、HAVCR2)、NK细胞受体衔接分子基因(FCER1G和LAT2)(表2)。
表2：每CYNK簇的前50个上调的基因。
Figure BDA0003186938500001652
Figure BDA0003186938500001661
为了更好地理解细胞毒性应答是如何在CYNK细胞中引发的，具体分析了对人工选择的基因的表达，所述人工选择的基因编码引导靶标检测到细胞溶解应答的经过充分表征的蛋白质，其中主要关注NK细胞受体和衔接分子(表3)。差异基因表达分析示出，两个关键的细胞毒性分子穿孔素(PRF1)和颗粒酶B(GZMB)在CYNK细胞中高表达。类似地，除了KLRF1(编码NKp80)外，在CYNK细胞与PB-NK细胞之间差异表达的大多数受体在CYNK细胞上表达得更高。在图6C中的tSNE绘图上可视化对选择的NK细胞效应物和受体基因的表达。编码NK细胞细胞毒性机制的组分的基因的表达升高与CYNK细胞针对大范围的靶细胞的高细胞毒性活性密切相关。
表3：编码调节NK细胞细胞毒性功能的因子的靠前的差异表达的基因。排除了整个簇中每个细胞的计数<1的基因。
Figure BDA0003186938500001662
Figure BDA0003186938500001671
接下来，通过定量实时PCR(qRT-PCR)分析了CYNK细胞和PB-NK细胞的转录曲线，所述qRT-PCR关注的是在scRNAseq数据集中高表达和/或差异表达的选择的NK细胞相关基因(图7)。从分离或培养后新鲜解冻的原初细胞中提取RNA。qRT-PCR展现了在CYNK细胞和PB-NK细胞中相对于管家基因GAPDH对CD69、KLRK1和KLRB1的高表达，而分别针对NKG2D和CD161/KLRB1编码的KLRK1和KLRB1在PB-NK细胞中的表达显著更高。之前通过scRNAseq(表3)看到的由KLRF1基因编码的NKp80的显著差异表达通过qRT-PCR得到证实。类似地，与CYNK细胞相比，KLRD1在PB-NK上的表达更高。总之，数据示出了与CYNK细胞相比，PB-NK细胞上的抑制性杀伤细胞凝集素样受体(KLRB1、KLRD1、KLRF1)表达的表达更高。编码抑制性NKG2A和激活NKG2C的两种C型凝集素受体基因KLRC1和KLRC2在CYNK细胞中更高地表达。在自然细胞毒性受体(NCR)中，只有NCR2(编码NKp44)在CYNK细胞中以高表达差异表达并且在PB-NK细胞中几乎不表达。两种共激活NK细胞受体基因CD244(2B4)和CD226(DNAM-1)在PB-NK细胞中的表达略高于在CYNK细胞中的表达。除了典型的配体激活的NK细胞受体基因，还分析了对抗体依赖性细胞介导的细胞毒性所需的编码Fc受体CD16的FCGR3A的表达。虽然scRNAseq数据未展现出FCGR3A的显著差异表达，但通过qRT-PCR，FCGR3A在PB-NK细胞中高表达并且在CYNK细胞中的表达水平非常低。还通过qRT-PCR分析了对通过scRNAseq高差异表达并在CYNK簇中升高的两种基因TNFRSF18和TNFSF10的表达。PCR数据证实，相对于在PB-NK细胞中的低水平表达，针对GITR和TRAIL编码的这些基因分别在CYNK细胞上高表达。
最后，使用流式细胞术通过表面蛋白表达对CYNK细胞相对于PB-NK进行表征。基于通过scRNAseq和qRT-PCR的转录表征选择靶向各种NK细胞受体的抗体(表1-3，图6和图7)。NK细胞表达高水平的NK细胞标志物CD56并且缺乏分别对T细胞、B细胞和髓系细胞标志物CD3、CD19和CD14的表达(图8)。虽然大多数PB-NK细胞以低水平表达CD56，但一小部分PB-NK细胞以在CYNK细胞中看到的水平表达CD56(图9)。NCR分析展现了NKp44在CYNK细胞中的高表达，而NKp44在PB-NK中以低水平表达，从而充分对应了转录分析(图7)。另一方面，NKp80在PB-NK细胞上表达并且在CYNK上表达很少，这也证实了KLRF1表达的转录数据(表1和图7)。CD16在CYNK细胞上几乎不表达，而大多数PB-NK细胞以高水平表达CD16。因此，CD16蛋白的表达也充分对应了转录分析(表1和图7)。杀伤细胞凝集素样受体的表达在CYNK细胞与PB-NK细胞之间具有可比性，其中针对NKG2D、NKG2C、CD94(NKG2C)和NKG2A，CYNK细胞展现出比PB-NK细胞更高的平均荧光强度。由TNFRSF18编码的检查点抑制剂分子GITR在PB-NK细胞上不表达，但在所有CYNK细胞上均高表达，这与qRT-PCR数据密切相关。
使用流式细胞术数据集(图8和图9)来执行对CYNK和PB-NK细胞群上的表面标志物表达的无偏分析(图10)。将抗体染色的CYNK细胞和PBMC细胞混合以便获取并通过流式细胞术进行分析。从tSNE绘图中可以明显看出，当观察CD56阳性细胞和CD3/CD14/CD19阳性细胞在绘图上的定位时，CYNK细胞和PB-NK细胞与彼此并与其它外周血细胞分开聚类。NKp44(CD336)和GITR(CD357)的高表达使得能够鉴定CYNK细胞，因为GITR在PBMC子集中的任何细胞类型中都几乎不表达。另一方面，PB-NK细胞高表达在CYNK细胞上不表达的CD16和NKp80。总而言之，已经鉴定出了以高置信度区分CYNK细胞与PB-NK的细胞表面标志物。
等同物：
本发明不应限于本文所描述的具体实施例的范围。实际上，根据前文的描述和附图，除了所描述的修改之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说也将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
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Claims (95)

1.一种产生包括自然杀伤细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；
(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及
(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和低分子量肝素(LMWH)中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；
其中所述第三细胞群包括CD56+CD3-自然杀伤细胞，并且其中所述自然杀伤细胞中的至少80％是活的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三细胞群包括CD94+或CD16+自然杀伤细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三细胞群包括CD94-或CD16-自然杀伤细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三细胞群包括CD94+CD16+自然杀伤细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三细胞群包括CD94-CD16-自然杀伤细胞。
6.一种产生包括自然杀伤细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；
(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及
(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；
其中所述第三细胞群包括CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第三培养基缺乏干细胞因子(SCF)。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第三培养基缺乏LMWH。
9.根据权利要求7所述的方法，其包括另外的步骤(d)：从所述第三细胞群中分离CD11a+细胞以产生第四细胞群；
其中所述第四细胞群包括CD56+CD3-CD11a+自然杀伤细胞。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其中所述自然杀伤细胞表达穿孔素和EOMES。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其中所述自然杀伤细胞不表达RORγt或IL1R1。
12.一种产生包括ILC3细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；
(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；以及
(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；
其中所述第三细胞群包括CD56+CD3-CD11a-ILC3细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第三培养基包括干细胞动员剂。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述第三培养基包括SCF。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述第三培养基包括干细胞动员剂和SCF。
16.一种产生包括ILC3细胞的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在包括干细胞动员剂和促血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群；
(b)在包括干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)并且缺乏Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群以产生第二细胞群；
(c)在包括IL-2和IL-15并且缺乏干细胞动员剂和LMWH中的每一种的第三培养基中培养所述第二细胞群以产生第三细胞群；以及
(d)从所述第三细胞群中分离CD11a-细胞以产生第四细胞群；
其中所述第四细胞群包括CD56+CD3-CD11a-ILC3细胞。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其中所述ILC3细胞表达RORγt和IL1R1。
18.根据权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述ILC3细胞不表达穿孔素或EOMES。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述第三培养基缺乏脱硫酸糖胺聚糖。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞是哺乳动物细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞是人细胞。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞是灵长类动物细胞。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞是犬科动物细胞。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞是啮齿动物细胞。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞是来自除人、灵长类动物、犬科动物或啮齿动物以外的哺乳动物的细胞。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞是CD34+造血干细胞。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞是胎盘细胞。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述胎盘细胞是从人胎盘灌注液获得或可获得的。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述胎盘细胞是从自人胎盘灌注液中分离的有核细胞获得或可获得的。
30.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞是从脐带血获得或可获得的。
31.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞是胎儿肝细胞。
32.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞是动员的外周血细胞。
33.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞或祖细胞是骨髓细胞。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述Tpo在所述第一培养基中以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述Tpo在所述第一培养基中以20ng/mL到30ng/mL的浓度存在。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述Tpo在所述第一培养基中以约25ng/mL的浓度存在。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述IL-15在所述第二培养基中以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述IL-15在所述第二培养基中以10ng/mL到30ng/mL的浓度存在。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述IL-15在所述第二培养基中以约20ng/mL的浓度存在。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述IL-2在所述第三培养基中以10U/mL到10,000U/mL的浓度存在，并且所述IL-15在所述第三培养基中以1ng/mL到50ng/mL的浓度存在。
41.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述IL-2在所述第三培养基中以300U/mL到3,000U/mL的浓度存在，并且所述IL-15在所述第三培养基中以10ng/mL到30ng/mL的浓度存在。
42.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述IL-2在所述第三培养基中以约1,000U/mL的浓度存在，并且所述IL-15在所述第三培养基中以约20ng/mL的浓度存在。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述Tpo、所述IL-2和所述IL-15不包括在所述第一培养基、所述第二培养基或所述第三培养基的不确定组分内。
44.根据权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述Tpo、所述IL-2和所述IL-15不包括在血清内。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述干细胞动员剂是式(I)化合物具有以下结构：
Figure FDA0003186938490000041
包含其药学上可接受的盐，其中：
每个
Figure FDA0003186938490000042
独立地表示单键或双键；
RJ选自由-NRaRb、-ORb和＝O组成的组；其中如果RJ为＝O，则接合G和J的
Figure FDA0003186938490000051
表示单键且G为N并且所述N被RG取代；否则接合G和J的
Figure FDA0003186938490000052
表示双键且G为N；
Ra为氢或C1-C4烷基；
Rb为Rc或-(C1-C4烷基)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：-OH、-O(C1-C4烷基)、-O(C1-C4卤代烷基)；-C(＝O)NH2；未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；
RK选自由以下组成的组：氢、未被取代的C1-6烷基；被取代的C1-6烷基；-NH(C1-4烷基)；-N(C1-4烷基)2、未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；
RG选自由氢、C1-4烷基和-(C1-4烷基)-C(＝O)NH2组成的组；
RY和RZ各自独立地不存在或选自由以下组成的组：氢、卤代基、C1-6烷基、-OH、-O-(C1-4烷基)、-NH(C1-4烷基)和-N(C1-4烷基)2；
或者RY和RZ连同其所连接的原子接合在一起以形成选自以下的环：
Figure FDA0003186938490000053
Figure FDA0003186938490000054
其中所述环任选地被一个、两个或三个独立地选自以下的基团取代：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-OH、-O-(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、未被取代的C6-C10芳基、被1-5个卤原子取代的C6-C10芳基以及-O-(C1-4卤代烷基)；并且其中如果RY和RZ结合在一起形成
Figure FDA0003186938490000061
则RJ为-ORb或＝O；
Rd为氢或C1-C4烷基；
Rm选自由C1-4烷基、卤代基和氰基组成的组；
J为C；并且
X、Y和Z各自独立地为N或C，其中任何碳原子的化合价按需用氢原子填充。
46.根据权利要求45所述的方法，其中：
Ra为氢；
Rb为-(C1-C4烷基)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：-C(＝O)NH2；未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；
RK选自由以下组成的组：氢、未被取代的C1-6烷基；-NH(C1-4烷基)；-N(C1-4烷基)2、未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；
RG为-(C1-4烷基)-C(＝O)NH2；
RY和RZ各自独立地不存在或选自由以下组成的组：氢、C1-6烷基和-NH(C1-4烷基)；
或者RY和RZ连同其所连接的原子接合在一起以形成选自以下的环：
Figure FDA0003186938490000062
Figure FDA0003186938490000071
其中所述环任选地被一个、两个或三个独立地选自以下的基团取代：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-OH、-O-(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、未被取代的C6-C10芳基、被1-5个卤原子取代的C6-C10芳基以及-O-(C1-4卤代烷基)；
Rd为C1-C4烷基；
Rm为氰基；并且
X、Y和Z各自独立地为N或C，其中任何碳原子的化合价按需用氢原子填充。
47.根据权利要求45所述的方法，其中，其中：
Ra为氢；
Rb为-CH2CH2-Rc；
Rc选自由以下组成的组：未被取代的苯基、被取代的苯基、吲哚基和-C(＝O)NH2；
RK选自由以下组成的组：氢、甲基、被取代的吡啶基、未被取代的苯并噻吩基和-NH(C1-C4烷基)；
RG为-CH2CH2-C(＝O)NH2；
RY为-NH(C1-C4烷基)；
RZ不存在或为氢；
或者RY和RZ连同其所连接的原子接合在一起以形成选自以下的环：
Figure FDA0003186938490000072
Figure FDA0003186938490000073
其中所述环任选地被一个、两个或三个独立地选自以下的基团取代：C1-C4烷基、-N(C1-C4烷基)2、氰基、未被取代的苯基和被1-5个卤原子取代的苯基；
Rd为C1-C4烷基；
Rm为氰基；并且
X为N或CH。
48.根据权利要求45所述的方法，其中，其中：
Ra为氢；
Rb为-CH2CH2-Rc；
Rc选自由以下组成的组：未被取代的苯基、被取代的苯基、吲哚基和-C(＝O)NH2；其中所述被取代的苯基被一个取代基E取代，其中E为-OH；
RK选自由以下组成的组：氢、甲基、被取代的吡啶基、未被取代的苯并噻吩基和-NH(仲丁基)；其中被取代的吡啶基部分被一个取代基Q取代，其中Q选自由以下组成的组：C1-4烷基、卤代基和氰基；
RG为-CH2CH2-C(＝O)NH2；
RY为-NH(异丙基)或-NH(仲丁基)；
RZ不存在或为氢；
或者RY和RZ连同其所连接的原子接合在一起以形成选自以下的环：
Figure FDA0003186938490000081
Figure FDA0003186938490000082
其中所述环任选地被一个、两个或三个独立地选自以下的基团取代：C1-C4烷基、氰基、未被取代的苯基和4-氟苯基；
Rd为异丙基；
Rm为氰基；并且
X为N或CH。
49.根据权利要求45所述的方法，其中所述式(I)化合物具有式(I-A)的结构：
Figure FDA0003186938490000091
包含其药学上可接受的盐，其中：
RJ为-NRaRb；
Ra为氢或C1-C4烷基；
Rb为Rc或-(C1-C4烷基)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；
RK选自由以下组成的组：氢、未被取代的C1-6烷基；-NH(C1-4烷基)；-N(C1-4烷基)2、未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；
Y和Z各自为C；
X为N或CH；
W为O或S；并且
Re为氢或C1-C4烷基。
50.根据权利要求49所述的方法，其中：
Ra为氢；
Rb为-(C1-C4烷基)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；
RK选自由以下组成的组：具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中所述被取代的杂芳基被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；并且
Re为C1-C4烷基。
51.根据权利要求49所述的方法，其中：
Ra为氢；
Rb为-(CH2-CH2)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：被取代的苯基和未被取代的吲哚基；其中所述被取代的苯基被一个取代基E取代，其中E为-OH；
RK选自由以下组成的组：未被取代的苯并噻吩基和被取代的吡啶基；其中所述被取代的吡啶基被一个取代基Q取代，其中Q选自由以下组成的组：C1-4烷基、卤代基和氰基；并且
Re为异丙基。
52.根据权利要求49所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的组或以下的药学上可接受的盐：
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-7-异丙基-2-(5-甲基吡啶-3-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-胺；
5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)烟腈；
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-胺；
4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-7-异丙基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚；
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-胺；
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-甲基吡啶-3-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-胺；以及
5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基)烟腈。
53.根据权利要求45所述的方法，其中所述式(I)化合物具有式(I-B)的结构：
Figure FDA0003186938490000101
包含其药学上可接受的盐，其中：
Ra为氢或C1-C4烷基；
Rb为Rc或-(C1-4烷基)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：-OH、-O(C1-C4烷基)、-O(C1-C4卤代烷基)；-C(＝O)NH2；未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；
RK选自由以下组成的组：氢、未被取代的C1-6烷基；被取代的C1-6烷基；-NH(C1-4烷基)；-N(C1-4烷基)2、未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；
RG选自由氢、C1-4烷基和-(C1-4烷基)-C(＝O)NH2组成的组；
Rf选自由氢、C1-4烷基、未被取代的C6-C10芳基和被1-5个卤原子取代的C6-C10芳基组成的组；
U为N或CRU；
V为S或NRV；
RU选自由氢、C1-4烷基、卤代基和氰基组成的组；
RV为氢或C1-C4烷基；
其中当U为CRU且V为NRV时，RU选自由C1-4烷基、卤代基和氰基组成的组；
Y和Z各自为C；并且
X为N或CH。
54.根据权利要求53所述的方法，其中：
Ra为氢；
Rb为-(C1-4烷基)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：-C(＝O)NH2、未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；
RK选自由以下组成的组：具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中所述被取代的杂芳基被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；
RG为C1-4烷基或-(C1-4烷基)-C(＝O)NH2；
Rf选自由氢、未被取代的苯基和被1-5个卤原子取代的苯基组成的组；
Y和Z各自为C；并且
X为CH。
55.根据权利要求53所述的方法，其中：
Ra为氢；
Rb为-(CH2-CH2)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：-C(＝O)NH2、被取代的苯基和未被取代的吲哚基；其中所述被取代的苯基被一个取代基E取代，其中E为-OH；
RK选自由以下组成的组：未被取代的苯并噻吩基和被取代的吡啶基；其中所述被取代的吡啶基被一个取代基Q取代，其中Q选自由以下组成的组：C1-4烷基、卤代基和氰基；
RG为-(CH2CH2)-C(＝O)NH2；
Rf选自由氢、苯基和氟苯基组成的组；
Y和Z各自为C；并且
X为CH。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的组或以下的药学上可接受的盐：
3-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基)氧基)丙酰胺；
3-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-1-基)丙酰胺；
2-(苯并[b]噻吩-3-基)-4-((4-羟基苯乙基)氨基)-7-异丙基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲腈；
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-甲基-6-苯基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-胺；以及
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-胺。
57.根据权利要求45所述的方法，其中所述式(I)化合物具有式(I-C)的结构：
Figure FDA0003186938490000131
包含其药学上可接受的盐，其中：
RJ为-NRaRb；
Ra为氢或C1-C4烷基；
Rb为Rc或-(C1-C4烷基)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；
RK选自由以下组成的组：氢、未被取代的C1-6烷基；-NH(C1-4烷基)；-N(C1-4烷基)2、未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；
A为N或CH；
B为N或CH；
Rg选自由氢、C1-4烷基和-N(C1-4烷基)2组成的组；
Y和Z各自为C；并且
X为N或CH。
58.根据权利要求57所述的方法，其中：
Ra为氢；
Rb为-(C1-C4烷基)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；
RK选自由以下组成的组：-NH(C1-4烷基)；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中所述被取代的杂芳基被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；并且
Rg为氢或-N(C1-4烷基)2。
59.根据权利要求57所述的方法，其中：
Ra为氢；
Rb为-(C1-C4烷基)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：被取代的苯基和未被取代的吲哚基；其中所述被取代的苯基被一个或多个取代基E取代，其中每个E独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；
RK选自由以下组成的组：-NH(C1-4烷基)；未被取代的苯并噻吩基；以及被取代的吡啶基；其中所述被取代的吡啶基被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；并且
Rg为氢或-N(C1-4烷基)2。
60.根据权利要求57所述的方法，其中：
Ra为氢；
Rb为-(CH2CH2)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：被取代的苯基和未被取代的吲哚基；其中所述被取代的苯基被一个取代基E取代，其中E为-OH；
RK选自由以下组成的组：-NH(仲丁基)；未被取代的苯并噻吩基和被取代的吡啶基；其中所述被取代的吡啶基被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q独立地选自由以下组成的组：C1-4烷基、卤代基和氰基；并且
Rg为氢或-N(CH3)2。
61.根据权利要求57所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的组或以下的药学上可接受的盐：
4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-8-(二甲基氨基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚；
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-2-(5-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-胺；
5-(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)喹唑啉-2-基)烟腈；以及
N4-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-N2-(仲丁基)喹唑啉-2,4-二胺。
62.根据权利要求45所述的方法，其中所述式(I)化合物具有式(I-D)的结构：
Figure FDA0003186938490000151
包含其药学上可接受的盐，其中：
RJ为-NRaRb；
Ra为氢或C1-C4烷基；
Rb为Rc或-(C1-4烷基)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；
RK选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；
Rh为氢或C1-4烷基；
D为N或CH；
Y为N；
Z为C；并且
X为N或CH。
63.根据权利要求62所述的方法，其中：
Ra为氢；
Rb为-(C1-4烷基)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的Rc部分被一个或多个取代基E取代，其中每个E独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；
RK选自由以下组成的组：未被取代的C6-10芳基；被取代的C6-10芳基；具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的未被取代的五元到十元杂芳基；以及具有1-4个选自由O、N和S组成的组的原子的被取代的五元到十元杂芳基；其中指示为被取代的RK部分被一个或多个取代基Q取代，其中每个Q独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤代基、氰基、-O-(C1-4烷基)和-O-(C1-4卤代烷基)；并且
Rh为氢或C1-4烷基。
64.根据权利要求62所述的方法，其中：
Ra为氢；
Rb为-(C1-C4烷基)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：被取代的苯基和未被取代的吲哚基；其中所述被取代的苯基被一个或多个取代基E取代，其中每个E独立地选自由以下组成的组：-OH、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-O(C1-C4烷基)和-O(C1-C4卤代烷基)；
RK为未被取代的苯并噻吩基；并且
Rh为氢或C1-4烷基。
65.根据权利要求62所述的方法，其中：
Ra为氢；
Rb为-(CH2-CH2)-Rc；
Rc选自由以下组成的组：被取代的苯基和未被取代的吲哚基；其中所述被取代的苯基被一个取代基E取代，其中E为-OH；
RK为未被取代的苯并噻吩基；并且
Rh为氢或C1-4烷基。
66.根据权利要求62所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的组或以下的药学上可接受的盐：
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-6-(苯并[b]噻吩-3-基)-3-异丙基咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-胺；以及
4-(2-((6-(苯并[b]噻吩-3-基)-3-异丙基咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-基)氨基)乙基)苯酚。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的组或以下的药学上可接受的盐：
5-(2-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)-6-(仲丁基氨基)嘧啶-4-基)烟腈；
4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-6-(异丙基氨基)嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚；
4-(2-((2-(苯并[b]噻吩-3-基)-7-异丙基-6,7-二氢-5H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基)乙基)苯酚；以及
2-(苯并[b]噻吩-3-基)-4-((4-羟基苯乙基)氨基)-7-异丙基-5,7-二氢-6H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮。
68.根据权利要求1至67中任一项所述的方法，其中所述第一培养基不包括LMWH。
69.根据权利要求1至68中任一项所述的方法，其中所述第一培养基不包括脱硫酸糖胺聚糖。
70.根据权利要求1至69中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包括Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一个。
71.一种自然杀伤细胞群，其通过根据权利要求1至70中任一项所述的方法来产生。
72.一种ILC3细胞群，其通过根据权利要求1至70中任一项所述的方法来产生。
73.一种遏制肿瘤细胞的增殖的方法，所述方法包括使所述肿瘤细胞与多个自然杀伤细胞和/或ILC3细胞接触，其中所述自然杀伤细胞通过根据权利要求70中任一项所述的方法来产生。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述接触在体外进行。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述接触在体内进行。
76.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞为急性髓系白血病(AML)细胞。
77.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞、头颈癌细胞或肉瘤细胞。
78.根据权利要求73到75中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞为原发性导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性髓系淋巴瘤(CML)细胞、慢性骨髓性白血病(CML)细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞或视网膜母细胞瘤细胞。
79.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞为实体瘤细胞。
80.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞为肝肿瘤细胞。
81.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞为肺肿瘤细胞。
82.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞为胰腺肿瘤细胞。
83.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞为肾肿瘤细胞。
84.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞为多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞。
85.根据权利要求73至84中任一项所述的方法，其中所述自然杀伤细胞在所述接触或所述施用之前被低温保存。
86.根据权利要求73至84中任一项所述的方法，其中所述自然杀伤细胞在所述接触或所述施用之前未被低温保存。
87.一种自然杀伤细胞，其特征在于对选自由以下组成的组的一种或多种标志物的表达低于所述标志物在外周血自然杀伤细胞中的表达：FGFBP2、GZMH、CCL3L3、GZMM、CXCR4、ZEB2、KLF2、LITAF、RORA、LYAR、CNOT1、IFNG、DUSP2、ATG2A、CD7、PMAIP1、PPP2R5C、NR4A2、ZFP36L2、PIK3R1、KLRF1、SNHG9、MT2A、RGS2、CHD1、DUSP1、EML4、ZFP36、ZC3H12A、DNAJB6、SBDS、IRF1、TSC22D3、TSPYL2、PNRC1、ISCA1、JUNB、WHAMM、RICTOR、TNFAIP3、EPC1、MVD、CLK1、ARL4C、REL、KMT2E、YPEL5、AMD1、BTG2和IDS；和/或对选自由以下组成的组的一种或多种标志物的表达高于所述标志物在外周血自然杀伤细胞中的表达：NDFIP2、LINC00996、MAL、CCL1、MB、SPINK2、C15orf48、CAMK1、KLRC1、TNFSF10、TNFRSF18、IL32、CAPG、AC092580.4、S100A11、TNFRSF4、ENO1、FCER1G、CCND2、KRT81、MRPS6、ANXA2、PTGER2、GLO1、HAVCR2、PYCARD、LAT2、SLC16A3、COTL1、PKM、TALDO1、CD96、NCR3、KRT86、STMN1、LTB、ARPC1B、ARPC5、FKBP1A、TIMP1、GZMK、CD59、PGK1、RGS10、EVL、RAC2、LGALS1、ITGB7、TUBB、PGAM1、PRF1、GZMB、IL2RB、KLRC2和KLRB1。
88.根据权利要求87所述的自然杀伤细胞，其特征在于对选自由以下组成的组的一种或多种标志物的表达低于所述标志物在外周血自然杀伤细胞中的表达：FGFBP2、GZMH、CCL3L3、GZMM、CXCR4、ZEB2、KLF2、LITAF、RORA、LYAR、CNOT1、IFNG、DUSP2、ATG2A、CD7、PMAIP1、PPP2R5C、NR4A2、ZFP36L2、PIK3R1、KLRF1、SNHG9、MT2A、RGS2、CHD1、DUSP1、EML4、ZFP36、ZC3H12A、DNAJB6、SBDS、IRF1、TSC22D3、TSPYL2、PNRC1、ISCA1、JUNB、WHAMM、RICTOR、TNFAIP3、EPC1、MVD、CLK1、ARL4C、REL、KMT2E、YPEL5、AMD1、BTG2和IDS。
89.根据权利要求87或权利要求88所述的自然杀伤细胞，其中对选自由以下组成的组的2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种标志物的表达低于所述标志物在外周血自然杀伤细胞中的表达：FGFBP2、GZMH、CCL3L3、GZMM、CXCR4、ZEB2、KLF2、LITAF、RORA、LYAR、CNOT1、IFNG、DUSP2、ATG2A、CD7、PMAIP1、PPP2R5C、NR4A2、ZFP36L2、PIK3R1、KLRF1、SNHG9、MT2A、RGS2、CHD1、DUSP1、EML4、ZFP36、ZC3H12A、DNAJB6、SBDS、IRF1、TSC22D3、TSPYL2、PNRC1、ISCA1、JUNB、WHAMM、RICTOR、TNFAIP3、EPC1、MVD、CLK1、ARL4C、REL、KMT2E、YPEL5、AMD1、BTG2和IDS。
90.根据权利要求87所述的自然杀伤细胞，其特征在于对选自由以下组成的组的一种或多种标志物的表达高于所述标志物在外周血自然杀伤细胞中的表达：NDFIP2、LINC00996、MAL、CCL1、MB、SPINK2、C15orf48、CAMK1、KLRC1、TNFSF10、TNFRSF18、IL32、CAPG、AC092580.4、S100A11、TNFRSF4、ENO1、FCER1G、CCND2、KRT81、MRPS6、ANXA2、PTGER2、GLO1、HAVCR2、PYCARD、LAT2、SLC16A3、COTL1、PKM、TALDO1、CD96、NCR3、KRT86、STMN1、LTB、ARPC1B、ARPC5、FKBP1A、TIMP1、GZMK、CD59、PGK1、RGS10、EVL、RAC2、LGALS1、ITGB7、TUBB、PGAM1、PRF1、GZMB、IL2RB、KLRC2和KLRB1。
91.根据权利要求87至90中任一项所述的自然杀伤细胞，其中对选自由以下组成的组的2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种标志物的表达高于所述标志物在外周血自然杀伤细胞中的表达：NDFIP2、LINC00996、MAL、CCL1、MB、SPINK2、C15orf48、CAMK1、KLRC1、TNFSF10、TNFRSF18、IL32、CAPG、AC092580.4、S100A11、TNFRSF4、ENO1、FCER1G、CCND2、KRT81、MRPS6、ANXA2、PTGER2、GLO1、HAVCR2、PYCARD、LAT2、SLC16A3、COTL1、PKM、TALDO1、CD96、NCR3、KRT86、STMN1、LTB、ARPC1B、ARPC5、FKBP1A、TIMP1、GZMK、CD59、PGK1、RGS10、EVL、RAC2、LGALS1、ITGB7、TUBB、PGAM1、PRF1、GZMB、IL2RB、KLRC2和KLRB1。
92.根据权利要求87至91中任一项所述的自然杀伤细胞，其中所述自然杀伤细胞是造血干细胞源性自然杀伤细胞。
93.根据权利要求87至92中任一项所述的自然杀伤细胞，其中所述自然杀伤细胞是CD34+造血干细胞源性自然杀伤细胞。
94.根据权利要求92或权利要求93所述的自然杀伤细胞，其中所述造血干细胞是胎盘源性造血干细胞。
95.根据权利要求87至94中任一项所述的自然杀伤细胞，其中所述自然杀伤细胞通过根据权利要求1至70中任一项所述的方法来制备。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220265712A1 (en) * 2019-06-14 2022-08-25 Celularity Inc. Populations of natural killer cells for treating cancers
US20220273716A1 (en) * 2019-07-25 2022-09-01 Celularity Inc. Populations of natural killer cells comprising a cd38 chimeric antigen receptor
US20220000919A1 (en) * 2020-01-29 2022-01-06 Celularity Inc. Placental derived natural killer cells for treatment of coronavirus infections
WO2022144632A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for differentiating stem cells into nk cells
WO2022155585A2 (en) * 2021-01-15 2022-07-21 City Of Hope Methods of preparing and expanding type i innate lymphoid cells and therapeutic uses thereof
WO2023278628A1 (en) * 2021-06-29 2023-01-05 Celularity Inc. Human placental hematopoietic stem cell derived natural killer cells in acute myeloid leukemia (aml) remission with minimal residual disease (mrd) or relapsed/refractory aml
KR20240063899A (ko) * 2021-09-08 2024-05-10 가부시키가이샤 가이아바이오메디신 세포의 처리 방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101466363A (zh) * 2006-05-03 2009-06-24 西姆莱斯有限责任两合公司 Ah受体拮抗剂
AU2013203936A1 (en) * 2008-10-30 2013-05-02 Novartis Ag Compounds that expand hematopoietic stem cells
TW201732037A (zh) * 2015-10-15 2017-09-16 安瑟吉納西斯公司 自然殺手細胞及ilc3細胞及其用途
WO2018141857A1 (en) * 2017-02-01 2018-08-09 Phenex Pharmaceuticals Ag Aryl hydrocarbon receptor (ahr) modulator compounds

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4798824A (en) 1985-10-03 1989-01-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Perfusate for the preservation of organs
US5190556A (en) 1991-03-19 1993-03-02 O.B. Tech, Inc. Cord cutter sampler
US5552267A (en) 1992-04-03 1996-09-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Solution for prolonged organ preservation
US5372581A (en) 1993-07-21 1994-12-13 Minneapolis Children's Services Corporation Method and apparatus for placental blood collection
EP2322601A1 (en) 2000-12-06 2011-05-18 Anthrogenesis Corporation Method of collecting placental stem cells
JP2004528021A (ja) 2001-02-14 2004-09-16 アンスロジェネシス コーポレーション 分娩後の哺乳動物の胎盤、その使用およびそれに由来する胎盤幹細胞
US20030187515A1 (en) 2002-03-26 2003-10-02 Hariri Robert J. Collagen biofabric and methods of preparing and using the collagen biofabric
US7498171B2 (en) 2002-04-12 2009-03-03 Anthrogenesis Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
US7147626B2 (en) 2004-09-23 2006-12-12 Celgene Corporation Cord blood and placenta collection kit
CN101374941A (zh) 2005-12-29 2009-02-25 人类起源公司 采集和保存胎盘干细胞的改良组合物及其使用方法
KR20200123283A (ko) 2005-12-29 2020-10-28 안트로제네시스 코포레이션 태반 줄기 세포 집단
KR101645311B1 (ko) 2007-09-26 2016-08-03 안트로제네시스 코포레이션 인간 태반 관류액으로부터의 혈관형성 세포
WO2016109661A1 (en) * 2014-12-31 2016-07-07 Anthrogenesis Corporation Natural killer cells and uses thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101466363A (zh) * 2006-05-03 2009-06-24 西姆莱斯有限责任两合公司 Ah受体拮抗剂
AU2013203936A1 (en) * 2008-10-30 2013-05-02 Novartis Ag Compounds that expand hematopoietic stem cells
TW201732037A (zh) * 2015-10-15 2017-09-16 安瑟吉納西斯公司 自然殺手細胞及ilc3細胞及其用途
WO2018141857A1 (en) * 2017-02-01 2018-08-09 Phenex Pharmaceuticals Ag Aryl hydrocarbon receptor (ahr) modulator compounds

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUMAN & EXPERIMENTAL TOXICOLOGY 等: "Effects of occupational polycyclic aromatic hydrocarbon exposure on T-lymphocyte functions and natural killer cell activity in asphalt and coke oven workers", 《HUMAN & EXPERIMENTAL TOXICOLOGY》, vol. 23, pages 317 - 322 *
JAN SPANHOLTZ 等: "High Log-Scale Expansion of Functional Human Natural Killer Cells from Umbilical Cord Blood CD34-Positive Cells for Adoptive Cancer Immunotherapy", 《PLOS ONE》, vol. 5, no. 2, XP055376087, DOI: 10.1371/journal.pone.0009221 *
MATHEW G. ANGELOS 等: "Aryl hydrocarbon receptor inhibition promotes hematolymphoid development from human pluripotent stem cells", 《BLOOD》, vol. 129, no. 26, pages 3428 - 3438 *

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