KR20090065865A - 생착능이 증가된 조혈줄기세포의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생착능이 증가된 조혈줄기세포의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 조혈줄기세포 및 전구세포를 함유하는 리니지(Lineage) 음성 세포군을 분리하여 사이토카인을 포함한 무혈청 배양배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 생착능이 증가된 조혈줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조혈줄기세포는 기존 제대혈, 골수 등의 치료용 줄기세포보다 이식 시 생착능을 현저히 증가시킴으로써 제대혈의 이식범위를 성인으로까지 확대할 수 있도록 하며, 백혈병 등의 난치병의 세포치료제로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

조혈줄기세포, 리니지 음성(Lineage negative) 세포군, 제대혈, 체외확장배양

Description

생착능이 증가된 조혈줄기세포의 제조방법{Method for Preparing Hematopoietic Stem Cells Having Improved Engraftment}

본 발명은 생착능이 증가된 조혈줄기세포의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 조혈줄기세포 및 전구세포를 함유하는 리니지(Lineage) 음성세포군을 분리하여 사이토카인을 포함한 무혈청 배양배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 생착능이 증가된 조혈줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.

종래에는 인간의 난치병 치료를 위하여 장기 이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역거부, 공급 장기 부족, 벡터 개발이나 질환유전자에 대한 지식부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다. 이에 줄기세포에 대한 관심이 고조되며, 이를 이용한 기술은 난치병 치료의 새로운 가능성으로 제시되고 있다.

이의 일환으로, 제대혈 조혈줄기세포는 악성빈혈 소아환자에게 성공적으로 이식된 이래로 백혈병 환자를 대상으로 하는 조혈줄기세포 이식치료에 활발히 사용되고 있다. 기존의 골수 이식은 조직적 합성 항원이 일치하는 공여자를 찾기가 어 렵고, 골수를 얻기 위해 공여자가 마취와 같은 의학적 행위와 골수 채취로 인한 공여자의 안전에 대한 우려로 인한 어려움이 있었다. 반면, 제대혈 조혈줄기세포 이식은 조직적합성 항원에 대한 제한이 상대적으로 적으며, 이식 후 흔히 나타나는 이식편대 숙주병의 빈도 및 병증이 적게 나타난다는 장점을 지니고 있었다. 또한, 제대혈은 분만 후에 버려지는 탯줄에서 채혈되므로 산모와 아기에게 어떠한 위해도 없으며, 냉동 상태로 장기간 보관될 수 있으므로 필요할 경우 즉시 이식에 활용할 수 있다는 장점을 지니고 있기 때문에 최근 소아 백혈병 환자에 대한 조혈모세포 이식에 많이 사용되었으며, 최근에 발표된 조혈줄기세포 이식 성적에 대한 보고에서 제대혈 조혈줄기세포 이식이 골수 조혈줄기세포 이식보다 훨씬 높은 이식성공률을 보이는 것으로 알려짐으로써 제대혈 조혈줄기세포의 질적인 우위성이 증명되었다 (Eapen et al ., Lancet, 369:1947, 2007)).

그러나, 성인을 대상으로 하는 제대혈 조혈줄기세포의 이식은 여전히 한계가 있었는데, 제대혈의 근본적 한계로서 혈액의 양이 한정적이므로 제대혈에 포함되어 있는 유핵세포의 수도 한정적일 수밖에 없었다. 한편, 제대혈 조혈줄기세포 이식 후에 생착시간이 오래 걸리는 것이 이식된 유핵세포 수가 적다는 것과도 관련이 있는 것으로 알려져 있었다.

이에 최근 제대혈 이식의 한계를 극복하기 위한 다양한 노력이 시도되어, 다수의 제대혈을 동시에 이식하는 방법, 중간엽줄기세포를 동시에 이식하는 방법 및 공여자의 면역세포를 추가로 공급하는 방법 등이 시도되고 있는데, 또 다른 새로운 방법은 제대혈 조혈줄기세포를 선별하여 체외 배양을 통해 증식시킴으로써 이식에 필요한 세포를 확보하고자 하는 시도이다.

1990년 중반부터 제대혈 조혈줄기세포의 체외배양을 위해 많은 연구가 수행되었으며 2000년부터 임상시험이 진행되었다. Pecora 등은 고위험군의 만성 골수성 백혈병을 앓는 2명의 성인환자를 대상으로, 하나의 제대혈로부터 약 85%는 별도의 처리없이 그대로 이식하고 남은 15%정도의 유핵세포를 AastromReplicell 시스템을 이용해 체외확장배양하여 그 효능을 평가하였다. 이때, 두 명 모두 이식에 따른 생착이 성공적으로 이루어지고 별도의 부작용이 없었다고 보고하였으며, 이를 통해 체외확장배양이 조혈작용을 촉진하는데 기여한다고 보고하였다 (Pecora et al ., Bone Marrow Transplant ., 25(7):797, 2000). 2002년에는 Shapall 등이 성인과 소아를 포함하는 37명의 다양한 질환을 갖는 환자들을 대상으로 좀더 체계적인 임상을 수행하였는데, 하나의 제대혈을 각각 40~60%까지 나누어 CD34 양성 세포군을 10일간 배양하여 유핵세포는 평균 56배, CD34양성세포는 평균 4배를 증가시켜 별도의 처리를 하지않은 남은 세포군과 함께 환자에게 투여하였다. 이때, 30개월까지 조사한 결과 약 35%의 생존도를 보였고, 이에 CD34양성 세포를 이용한 체외확장 연구가 의미있다고 보고하였다 (Shapall et al ., Biol . Blood Marrow Transplant ., 8(7):368, 2002). Jaroscak 등은 2003년에 다시 AastromReplicell 시스템을 이용한 임상1상 결과를 보고하였는데, 총 28명의 다양한 질환을 갖는 소아와 성인환자를 대상으로 수행하였다. 이들은 하나의 제대혈로부터 일부의 유핵세포를 체회확장배양하였고 유핵세포의 경우 평균 2.4배, CD34양성 세포의 경우 0.5배 증폭시켜, 마찬가지로 별도의 처리를 하지 않은 세포군과 함께 이식하였으며, 체외확장 배양이 역시 안전하며 의미가 있다고 보고하였다 (Jaroscak et al ., Blood , 101;5061, 2003).

그러나, 이 세 가지 임상결과들은 체외확장배양된 세포들에 의한 이식이 안전하고 이식의 효과를 높일 수 있다는 가능성만을 제시하였고 직접적으로 체외확장을 통한 이식으로 이식결과가 좋아졌다는 것을 제시하지 못하였고 이로 인해 조혈모체포의 체외확장을 통한 연구에 대한 유용성에 대해 오히려 의문을 갖게 하였다. 앞선 임상연구들은 결과적으로 총 유핵세포수는 어느 정도 증가하였지만, 순수한 조혈 줄기세포의 비율은 크게 증가하지 못함으로써 이식된 세포의 생착율을 크게 개선하지 못하고 있는 것으로 평가되고 있다.

한편, 조혈 줄기세포를 선별할 수 있는 마커는 오래 전부터 CD34 항원 단백질이 이용되어 왔다. 대부분의 in vitro 체외확장연구는 CD34 양성세포를 분리하여 수행되었고, 단순히 유핵세포 상태로 체외확장배양하는 것에 비해 이식률을 높이는데 기여할 수 있는 CD34 양성 세포수를 효과적으로 증폭시키는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이후 많은 연구들이 성장인자만을 첨가하여 체외확장배양된 CD34 양성 세포군 유래의 세포들이 NOD/SCID 마우스를 이용한 전임상 생착실험에서 오히려 배양하지 않은 CD34 양성세포군보다 생착률이 떨어진다고 알려져 있다. 이는 초기에 분리된 CD34 양성세포군이 체외확장배양되는 가운데 증식과 분화를 함께 하게 되는데, 성장인자의 조합에 따라 그 균형을 읽고 분화가 촉진되면서 원래의 조혈모세포로서의 기능인 생착능력을 더 이상 유지하지 못하기 때문이라고 알려져 있다.

CD34와 함께 CD133 항원 단백질 또한 조혈 줄기세포의 중요한 마커로 기능을 하는 것으로 알려졌는데, CD34와 CD133 항원 단백질의 경우 약 60%를 상회할 정도로 두 가지 마커가 서로 공유되어 있다. CD133 양성세포군은 CD34 양성세포군에 비해 보다 미성숙한 세포군으로 알려져있고 in vitro와 in vivo 실험결과들이 그 근거를 받쳐주고 있다. 하지만 CD133 양성세포군 또한 체외확장 배양시 CD34양성 세포군과 비슷한 방식으로 배양이 진행됨에 따라 이식능력을 갖춘 조혈전구세포들이 감소되는 것으로 나타났다.

이런 문제점이 대두되는 가운데 최근 CD34나 CD133보다도 더 원시세포로 추정되는 CD34 음성 세포군에 대한 관심이 점차적으로 증가하고 있다. 이들 CD34 음성 세포군만을 따로 분리한 후 일정기간 체외확장 배양시 다량의 CD34양성 세포군을 생산해내고 이들 CD34 양성세포군들은 조혈줄기세포로서의 이식능력을 보유하는 것으로 나타났다. 그러나 제대혈내 CD34 음성 세포군은 그 빈도가 너무 낮기 때문에 이들 세포군만을 직접적으로 따로 분리해내는 데는 기술적으로 많은 어려움이 있다. 이에 미분화 상태의 세포를 네가티브 선별 방식으로 얻는 방법이 고안되었으나, 이들 세포군이 in vitro 체외확장배양능력과 in vivo 이식생착능에 어떠한 차이가 있는지 직접적으로 비교하여 보여준 보고는 아직까지 없다.

이에, 본 발명자들은 생착능이 우수한 조혈줄기세포를 수득하고자 예의 노력한 결과, CD34 양성세포군, CD133 양성세포군, CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD24, CD45, CD56, CD66b 및 CD235a 표현형을 갖는 성숙한 혈액세포들을 제거한 리니지 음성(Lineage negative) 세포군을 분리한 다음, 무혈청배지에서 배양한 결과, CD34양성세포군 및 CD133양성세포군에 비하여 리니지음성세포군을 배양한 경우 in vitro에서 CD34양성CD38음성 세포군을 선택적으로 증식시키며 체외확장능력이 뛰어나고, in vivo에서 생착능력이 우수하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 체외확장능력이 우수한, 전구세포 및 조혈줄기세포를 함유하는 리니지 음성세포군의 분리방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 전구세포 및 조혈줄기세포를 함유하는 리니지 음성세포군을 무혈청 배지에서 배양함으로써 생착능이 증가된 조혈줄기세포의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 이식 시 우수한 생착능을 나타내어 백혈병 등의 질환의 세포치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 조혈줄기세포를 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 조혈줄기세포 및 전구세포를 함유하는 리니지 음성세포군의 분리방법을 제공한다:

(a) 제대혈, 골수 및 말초혈로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 또는 이로부터 분리된 단핵세포구(mononuclear cells)에 CD2, CD3, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b 및 glycophorin A로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 표면항원에 대한 항체를 첨가하고 반응시키는 단계; 및

(b) 상기 표면항원에 대하여 양성인 단핵세포구를 제거하고, 상기 표면항원에 대하여 음성인, 조혈줄기세포 및 전구세포를 함유하는 리니지 음성세포군을 수 득하는 단계.

본 발명은 또한, 상기 리니지 음성세포군을 SCF, Flt-3 리간드, TPO, IL-6, IL-3, GM-CSF 및 G-CSF로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 생착능이 증가된 조혈줄기세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 무혈청 배지는 인간 알부민(human Albumin), 인간 인슐린(human Insulin) 및 인간 트랜스페린(human Transferrin)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된, 생착능이 증가된 조혈줄기세포를 제공한다.

본 발명에 있어서, 표면항원 CD34 양성/ CD38 음성 세포군이 CD34 양성/CD38 양성 세포군에 비하여 높은 비율로 함유된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 조혈줄기세포를 함유하는 조혈줄기세포이식용 키트(kit) 및 약물 독성여부 측정용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조혈줄기세포를 함유하는 세포치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, CD2, CD3, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b 및 glycophorin A로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 표면항원에 대한 항 체를 포함하는 리니지 음성세포군 분리용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 조혈줄기세포는 기존 제대혈, 골수 등의 치료용 줄기세포보다 이식 시 생착능을 현저히 증가시킴으로써 제대혈의 이식범위를 성인으로까지 확대할 수 있도록 하며, 백혈병 등의 난치병의 세포치료제로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

"줄기세포(stem cells)"란 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.

"조혈줄기세포"란 다양한 혈액 세포 유형, 예를 들어 B 세포, T 세포, 과립구, 혈소판 및 적혈구로 발달할 수 있는 줄기세포이다.

"리니지(Lineage) 음성 세포군"이란 성숙한 혈액 세포 계통의 마커인 세포 표면 단백질의 그룹을 유의적인 수준으로 발현하지 않는 조혈 줄기세포를 말한다.q본 발명에서는 상기 표면 단백질의 그룹으로 CD2, CD3, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b 및 글리코포린 A(glycophorin A)를 포함한다.

"생착능"이란 임플란트되거나 이식된 줄기세포가 분화된 후속세포, 이식된 후 체내에서 생산한 세포 또는 주입된 세포가 손실 혹은 손상된 세포를 대체할 수 있는 능력을 말한다.

한편, "체외확장(ex vivo expansion)능력"이란 줄기세포를 분리하여 배양시키는 경우 유의미한 줄기세포를 높은 수준으로 증식시킬 수 있는 능력을 말한다.

본 발명은 일 관점에서, 다음의 단계를 포함하는 조혈줄기세포 및 전구세포를 함유하는 리니지 음성세포군의 분리방법에 관한 것이다:

(a) 제대혈, 골수 및 말초혈로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 또는 이로부터 분리된 단핵세포구(mononuclear cells)에 CD2, CD3, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b 및 glycophorin A로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 표면항원에 대한 항체를 첨가하고 반응시키는 단계; 및

(b) 상기 표면항원에 대하여 양성인 단핵세포구를 제거하고, 상기 표면항원에 대하여 음성인 조혈줄기세포 및 전구세포를 함유하는 리니지 음성세포군을 수득하는 단계.

본 발명은 종래에는 조혈줄기세포를 선별을 위해 CD34 양성세포를 분리하여 체외 확장배양을 한 것과 달리 리니지 음성 세포군을 분리하여 배양시킴을 특징으로 한다.

종래 조혈 줄기세포를 선별할 수 있는 마커는 오래전부터 CD34 항원 단백질이 이용되어 왔는데, 대부분의 in vitro 체외확장은 CD34 양성세포를 분리하여 수 행되었고 단순히 유핵세포 상태로 체외확장배양하는 것에 비해 이식률을 높이는데 기여할 수 있는 CD34 양성 세포수를 효과적으로 증폭시키는 것으로 보고되었다 (Devine et al ., Bone Marrow Transpl ., 31:241, 2003).

그러나, 이후 많은 보고들이 성장인자만을 첨가하여 체외확장배양된 CD34 양성 세포군 유래의 세포들이 NOD/SCID 마우스를 이용한 전임상 생착실험에서 오히려 배양하지 않은 CD34 양성세포군보다 생착률이 떨어짐이 보고되었다 (Devine et al., Bone Marrow Transpl., 31:241, 2003). 이는 초기에 분리된 CD34 양성세포군이 체외확장배양되는 가운데 증식과 분화를 함께 하게 되는데 성장인자의 조합에 따라 그 균형을 읽고 분화가 촉진되면서 원래의 조혈모세포로서의 기능인 생착능력을 더 이상 유지하지 못하기 때문이라고 보고되고 있다.

한편, CD34와 함께 CD133 항원 단백질 또한 조혈 줄기세포의 중요한 마커로 기능을 하는 것이 알려졌다. CD34와 CD133 항원 단백질의 경우 약 60%를 상회할 정도로 두 가지 마커가 서로 공유되어 있는데, CD133 양성세포군은 CD34 양성세포군에 비해 보다 미성숙한 세포군으로 알려져있으며, in vitro와 in vivo 실험결과들이 그 근거를 받쳐주고 있다. 하지만 CD133 양성세포군 또한 체외확장 배양시 CD34양성 세포군과 비슷한 방식으로 배양이 진행됨에 따라 이식능력을 갖춘 조혈전구세포들이 감소되는 것으로 나타났다.

이런 가운데 최근 CD34나 CD133보다도 더 원시세포로 추정되는 CD34 음성 세포군에 대한 관심이 점차적으로 증가하고 있다. CD34 음성/리니지 음성인 이들 세포군은 배양조건에 따라 조혈계이외에 다른 조직이나 기관을 형성하는 세포로도 분 화가 가능한 전다분화능을 가진 줄기세포로 보고되고 있다. 이들 CD34 음성 세포군만을 따로 분리한 후 일정기간 체외확장 배양시 다량의 CD34양성 세포군을 생산해내고 이들 CD34 양성세포군들은 조혈줄기세포로서의 이식능력을 보유하는 것으로 나타났다. 그러나 제대혈 내 CD34 음성 세포군은 그 빈도가 너무 낮기 때문에 이들 세포군만을 직접적으로 따로 분리해내는 데는 기술적으로 많은 어려움이 있었다. 이에 본 발명에서는 리니지 음성 세포군을 분리하여 배양하는 방법을 고안해 내었다.

본 발명은 상기 리니지 음성세포군을 분리하는 데 있어 편의성을 도모하기 위하여, CD2, CD3, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b 및 glycophorin A로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 표면항원에 대한 항체를 포함하는 리니지 음성세포군 분리용 키트를 제공할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 리니지 음성세포군을 SCF, Flt-3 리간드, TPO, IL-6, IL-3, GM-CSF 및 G-CSF로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 생착능이 증가된 조혈줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.

상기 무혈청 배양배지로서, 예를 들어 X-vivo10 배지를 사용하거나, QBSF60배지를 사용하여 본 발명의 분리한 리니지 음성 세포군을 배양할 수 있다. 이때, 인간 알부민, 인간 인슐린 및 인간 트랜스페린 등을 포함하는 X-vivo10 무혈청 배지에서 배양 시 증식된 조혈줄기세포 집단의 총유핵세포 수, CD34 양성세포 수, 콜 로니집락형성능이 QBSF60 배지를 사용한 경우에 비하여 더욱 증가함을 확인하였다.

한편, 본 발명에 있어서, 상기 배양은 무혈청 배지에서 7일~14일간 이루어지는 것이 바람직하다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 생착능이 증가된 조혈줄기세포에 관한 것이다.

유세포 분석기를 이용하여 본 발명에 따른 조혈줄기세포 집단을 분석한 결과, CD7, CD14, CD15, CD19, CD34, CD41, CD45, CD61 및 CD71 중 어느 하나 또는 복수의 면역학적 특성을 나타냄이 확인되었다.

특히, 본 발명에 따른 조혈줄기세포 집단은 표면항원 CD34 양성/ CD38 음성 세포군이 CD34 양성/CD38 양성 세포군에 비하여 높은 비율로 함유된 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조혈줄기세포 집단을 이식한 경우, 이미 공지된 바와 같이 호중성 백혈구(neutrophils), 단핵백혈구(monocytes), 거핵세포(megakaryocytes), 적혈구(erythrocytes) 및 림프구(lymphocytes) 등으로 분화하는 것이 확인되었다(도 14).

본 발명은 의사 등에 의하여 사용될 때 단순화시키기 위하여, 상기 조혈줄기세포를 함유하는 조혈줄기세포이식용 키트(kit)를 제공할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 조혈줄기세포를 함유하는 약물 독성여부 측정용 키트를 제공할 수 있다. 조혈줄기세포를 함유하는 약물 독성여부 측정용 키트에 테스트 약물을 첨가한 후, 줄기세포의 수, 각종 혈구전구세포의 분화, 혈액세포 콜로니 형성능력 등을 측정하는 경우 테스트 약물의 세포 배양에 대한 독성을 진단할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 조혈줄기세포를 함유하는 세포치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 제대혈 유래 조혈줄기세포 집단은 이미 공지된 바와 같이 백혈병 등 난치병 치료를 위한 세포치료제로 사용될 수 있다. 본 발명의 조혈줄기세포 집단을 유효성분으로 함유하는 세포 치료용 조성물은 임상투여 시 근육 또는 정맥 주사제와 같은 형태의 비경구 투여뿐 아니라 직접 질환 부위에 투여할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

사람의 경우, 세포치료제의 통상적인 투여량은 10⁸∼10¹⁰ cells/body, 바람직하게는 10⁸∼10⁹ cells/body, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 리니지 음성세포군을 분리하기 위한 원료로서 제대혈만을 예시하였으나, 기타 골수 및 말초혈로부터 리니지 음성세포군을 분리한 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

실시예 1. 리니지 음성세포군의 분리 및 선정

1-1: 제대혈 취득

제대혈 채혈은 임신 36주 이상의 동의서를 제출한 산모를 대상으로 하였다. 분만 직후 제대 정맥에서 채혈하였으며, 시트르산-인산-덱스트로즈 항응고액(CPDA-1, citrate phosphate dextrose adenine-1) 24.5ml이 들어있는 표준 채혈백(녹십자, 대한민국)을 이용하였다. 채혈한 후 혈액을 함유한 채혈백은 공정을 진행할 때까지 실온에 보관하였다.

1-2: 리니지( Lineage ) 음성세포군의 분리

(1) CD34 양성 세포군의 분리

제대혈에서 먼저 단핵세포구(Mononuclear cells)를 분리하였는데, 무균상태에서 단핵세포구의 분리를 위해 피콜용액(Ficoll-Hypaque, Pharmacia, Sweden)위에 인산염완충용액(PBS)으로 2배 희석된 제대혈을 섞이지 않게 조심스레 넣어주고(overlay) 520g에서 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 일부 제거한 후 단핵세포를 포함하는 버퍼층을 조심스럽게 분리하여 인산염 완충용액(PBS)으로 2회 세척(420g에서 10분 후 330g에서 10분)하여, 단핵세포구를 분리하였다.

분리된 단핵세포구로부터 CD34 양성 세포를 분리하기 위하여 면역자기 세포 분리 시스템(Immunomagnetic cell separation system, MiniMACS, Miltenyi Biotec GmbH, Germany)을 이용하는 CD34 세포 분리 시약(Direct CD34 Progenitor cell isolation kit, Miltenyi Biotec GmbH, Germany)을 사용하였다.

단핵세포구(1× 10⁸개/300ul)를 MACS 버퍼(1xPBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA)로 현탁한 후 100ul FcR 블로킹시약(blocking agent)과 100ul 항-CD34 마이크로비드 (Anti-CD34 microbead)와 섞어 4℃에서 30분간 반응시켰다.

반응을 마친 세포를 10~20배의 MACS 버퍼로 세척(330g에서 10분)하고, 0.5~1ml로 현탁 후 MiniMACS를 이용해 세포를 분리하였다. 분리된 CD34 양성세포를 수거하고, 배양배지에 부유한 다음 트립판블루용액(Trypan blue, Gibco)으로 염색 후 혈구계수기(hemacytometer)로 계수하였다. 분리된 CD34 양성세포군의 순도(Purity)는 항-CD34-PE와 항-CD45-FITC 항체(Beckman Coulter, Mijdrecht, Netherland)로 면역염색을 한 후, 유세포분석기(FC500 flow cytometer, Beckman Coulter, Netherland)로 분석하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, CD34/CD45 양성 세포의 순도는 약 95 ± 2% 였다. 즉시 사용되지 않는 세포는 영하 196도의 액체질소에 냉동 보관 후 사용하였다.

(2) CD133 양성 세포군의 분리

상기 1-2의 (1)에서 분리된 단핵세포구로부터 CD133 양성 세포군을 분리하기 위하여, 면역자기 세포 분리 시스템(Immunomagnetic cell separation system, MiniMACS, Miltenyi Biotec GmbH, Germany)을 이용하는 CD133 세포 분리 시약(CD133 microbead kit, Miltenyi Biotec GmbH, Germany)을 사용하였다.

단핵세포구(1× 10⁸개/300ul)를 MACS 버퍼(1xPBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA)로 현탁한 후 100ul FcR 블로킹시약(blocking agent)과 100ul 항-CD133 마이크로비드(Anti-CD133 microbead)와 섞어 4℃에서 30분간 반응시켰다.

반응을 마친 세포를 10~20배의 MACS 버퍼로 세척(330g에서 10분)하고, 0.5~1ml로 현탁 후 MiniMACS를 이용해 세포를 분리하였다. 분리된 CD133 양성세포를 수거하고, 배양배지에 부유한 다음 트립판블루용액(Trypan blue, Gibco)으로 염 색 후 혈구계수기(hemacytometer)로 계수하였다. 분리된 CD133 양성세포군의 순도(purity)는 항-CD133-PE와 항-CD45-FITC 항체(Beckman Coulter, Mijdrecht, Netherland)로 면역반응을 한 후, 유세포분석기(FC500 flow cytometer, Beckman Coulter, Mijdrecht, Netherland)로 분석하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, CD133/CD45 양성 세포의 순도는 90 ± 2%였다. 제대혈 1개로부터 분리되는 CD34/CD45 양성 세포군을 100%로 볼 때 CD133/CD45 양성 세포군은 40~60% 정도 존재한다. 즉시 사용되지 않는 세포는 영하 196도의 액체질소에 냉동 보관하였다.

(3) 리니지 음성 세포군 분리

상기 1-1의 제대혈로부터 리니지 음성 세포를 분리하기 위하여 두가지 방법의 세포분리 시스템을 사용하였다.

① RosetteSep^®system은 RosetteSep^®CB enrichment cocktail(StemCell Technologies, USA)을 이용하여 분리를 원하지 않는 세포들과 적혈구가 결합하여 면역로제트(immunorosettes)를 형성하여 가라앉는 원리를 이용한다. 20 ml 제대혈에 1ml 항체 혼합용액을 직접 섞은 후 실온에서 20분 동안 반응시켰다. RosetteSep^®CB enrichment cocktail은 성숙한 혈액세포들을 제거시킬 수 있는 CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b 및 glycophorin A에 대한 항체를 포함하였다.

항체와 반응시킨 제대혈을 인산완충용액으로 2배 희석한 후 피콜 농도 구배 방법으로 1차 원심분리하면 항체가 결합된 성숙한 세포들이 적혈구와 로제트를 형성하면서 튜브 바닥으로 가라앉고 리니지 음성 세포군이 버퍼층에 남게 되므로 이를 수거하여 사용한다.

분리된 리니지 음성 세포를 배양배지에 부유한 다음 자동혈구계수기(CBC;Complete Blood Count, Advia120, Bayer, Germany)로 계수하였다. 이때 분리된 리니지 음성 세포는 항-CD34-PE와 항-CD45-FITC 항체로 면역반응을 한 후, 유세포분석기로 분석하였다. 분리된 리니지 음성세포수는 1개의 제대혈에서 얻어지는 CD34/CD45 양성세포수의 5~10배 정도이며 이중 CD34/CD45양성 세포수의 비율은 10~20% 수준으로 존재하였다. 즉시 사용되지 않는 세포는 영하 196도의 액체질소에 냉동 보관하였다.

② EasySep^®system은 EasySep®magnet(StemCell Technologies, USA)을 이용해 별도의 분리 컬럼없이 세포를 분리해내는 방법이다. Human Progenitor Cell Enrichment Kit(StemCell Technologies, USA)은 EasySep^® Negative Selection Human Progenitor Cell Enrichment Cocktail과 EasySep^® Magnetic nanoparticles로 구성된다. EasySep^® Negative Selection Human Progenitor Cell Enrichment Cocktail은 CD2, CD3, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b, glycophorin A에 대한 항체혼합액으로 이들 항체와 결합하지 않은 리니지 음성 세포군을 분리할 수 있다.

상기 1-2의 (1)의 피콜을 이용한 농도구배의 방법으로 단핵세포구를 먼저 분리 후 단핵세포구(1 × 10⁸개/2㎖)를 100ul 항체혼합액과 섞어 실온에서 15분 동안 반응시켰다. 이후 100ul EasySep^® Magnetic nanoparticles을 잘 섞어준 다음 실온에서 15분 동안 반응시켰다. 세포를 담고 있는 튜브를 마그넷에 넣어주고 10분 동안 방치한 후 자석과 반응하지 않은 세포를 새로운 튜브로 옮기고, 다시 새로운 튜브로 옮겨진 세포를 마그넷에 넣고 10분간 반응시킨 후 자석과 반응하지 않는 세포를 새로운 튜브로 옮겨 수거 후 배양액에 부유하고 자동혈구계수기(CBC;Complete Blood Count, Advia120, Bayer, Germany)로 계수하였다.

이때 분리된 리니지 음성세포는 항-CD34-PE와 항-CD45-FITC 항체로 면역반응을 한 후, 유세포분석기로 분석하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 분리된 리니지 음성세포수는 1개의 제대혈에서 얻어지는 CD34/CD45 양성세포수의 1.5~3배 정도이며 CD34/CD45양성 세포수의 비율은 50~70% 수준으로 존재하였다. 즉시 사용되지 않는 세포는 영하 196도의 액체질소에 냉동 보관하였다.

1-3: 리니지 음성 세포군의 선정

(1) 상기 1-2에서 분리된 CD34 양성 세포군, CD133 양성 세포군 및 리니지 음성 세포군을 체외 배양하여 비교하기 위하여, 다음과 같이 배양하였다. 이때 배 양배지는 3가지로 준비하여, 총 3회 반복실험하였다.

배양배지 1은 20% FBS, 1% 페니실린/스트렙타마이신, 2mM L-Glutamine(Gibco, Breda, The Netherlands)이 포함된 IMDM(Gibco, Breda, The Netherlands)배지에 SCF, Flt-3 ligand, TPO, IL-6(R&D systems) 등의 사이토카인을 50~100ng/ml 농도로 첨가하였다.

배양배지 2는 상기 배양배지 1과 동일한 조성에 FBS 대신 제대혈에서 유래한 혈장을 불활성화시킨 후 20%로 첨가하여 제조하였다.

배양배지 3은 혈청을 포함하지 않는 상업용 무혈청배지 StemSpan SFEM(StemCell Technologies)를 사용하였다.

(2) CD34와 CD133세포군의 체외 확장 배양 비교(ex vivo expansion culture)

상기 1-2에서 분리된 CD34 양성 세포군과 CD133 양성 세포군을 조직배양용 24-웰플레이트(24 well plate, Costar)에 1웰 당 1~2 × 10⁴개씩 상기 배양배지에 나누어 담아 5% CO₂ 존재하에 37℃ 배양기에서 배양하였다.

서로 다른 배양배지 조건 하에서 배양된 세포들은 7일과 14일 동안 배양한 후 총유핵세포수, CD34양성 세포 수, 콜로니집락형성능, 유세포분석기를 통한 표현형 분석을 수행하였다.

총유핵세포 수는 트립판블루 염색액으로 염색 후 혈구계수기를 이용하여 측정하였으며, D34양성세포 수는 유세포분석을 통해 배양된 세포군에서 CD45와 CD34 에 모두 양성인 세포군의 비율을 총유핵세포수에 곱하여 얻어진 값으로 측정하였다. 또한, 군락 형성능을 평가하기 위하여 배양된 세포의 군락 형성 단위(colony forming unit ; CFU)분석을 실시하였다. 군락 형성 단위는 과립구(granulocyte)계열과 대식세포구(macrophage)계열의 군락형성 단위(CFU-GM), 적혈구(erythocyte)계열의 군락형성 단위(BFU-E와 CFU-E) 그리고 과립구(granulocyte)계열, 적혈구(erythocyte)계열, 대식세포구(macrophage)계열, 거핵세포구(megakaryocyte)계열 모두를 포함하는 군락형성 단위(CFU-GEMM)에 대하여 분석하였다. 군락형성 단위 분석을 위해서 반고체 배지인 MethocultGF4434(Stemcell Technologies, Vancouver, Canada)배지에 0.3~1 × 10³개/1.1㎖ 농도로 세포를 섞은 후, 조직배양용 24웰 플레이트에 분주하여 14일 동안 5% CO₂ 존재하에 37℃ 배양기에서 배양하였다.

<표 1> CD34 양성세포군과 CD133양성세포군의 체외 확장 배양 시 총유핵세포 수, CD34 양성세포 수 및 총군락형성단위의 증가 배수

Fold increases	CD34양성세포군	CD133양성세포군
총유핵세포 수( TNCs )	1418±520 457±267 1538±791	1479±641 736±573 2344±1399
20% FBS+IMDM 20% AS +IMDM StemSpan SFEM
			CD34 + Cells	74±41 50±35 309±124	159±113 124±104 573±375
			20% FBS+IMDM 20% AS +IMDM StemSpan SFEM
총군락형성단위( Total CFCs )	93±54 63±26 227±217	78±39 91±36 280±252
20% FBS+IMDM 20% AS +IMDM StemSpan SFEM

* 데이터는 3개의 독립된 실험으로부터 얻은 평균±s.d를 나타낸다.

* Total CFCs는 CFU-GM, BFU-E 및 CFU-mix를 포함한다.

분석결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 단위세포당 총유핵세포수는 무혈청배지에서 배양한 경우에 가장 높은 증가율을 보였으며 CD34 양성세포군보다 CD133 양성 세포군이 약 1.5배가량 더 증가하는 것으로 관찰되었다. 그러나 제대혈 내 존재하는 CD133 양성세포군 수가 CD34 양성세포군수의 40~60% 수준임을 감안하면 비슷한 수준으로 증가한 것으로 나타났다.

또한, CD34 양성세포 수는 총유핵세포 수와 마찬가지로 두 세포군 모두 무혈청배지(StemSpan SFEM)에서 가장 높은 증가를 보였으며, 단위세포에 대해 CD133 양성세포군이 CD34 양성세포군에 비해 약 1.9배 가량 증가하였다. 이는 CD133 양성 세포군이 CD34 양성세포군에 비해 더 미성숙한 줄기세포를 포함하고 있어 CD34 양성세포로 더 많은 증식을 유도하는 것으로 보여졌다. 그러나 제대혈 내 존재하는 CD133 양성세포군 수가 CD34 양성세포군 수의 40~60% 수준임을 감안하면 총유핵세포 수와 마찬가지로 비슷한 수준으로 증가한 것으로 나타난다.

총 군락형성능은 두 세포군 모두 무혈청 배양배지에서 가장 높게 증가하였으며, 단위세포 수를 기준으로 CD133 양성세포군이 CD34 양성세포군에 약 1.2배 정도 높게 증가하였다.

한편, 배양된 세포를 각종 혈액 세포를 표지하는 항원과 반응시켜 유세포 분석기(Flowcytometer)로 표현형(Phenotype assay)을 분석하였다.

조혈전구세포 분석을 위해 CD34, CD38 및 CD33를, 호중구(neutrophil)분석을 위해 CD15를, 단핵세포구(monocyte)분석을 위해 CD14를, B세포(B-lymphocyte)분석 을 위해 CD19를, 거핵세포구(megakryocyte)분석을 위해 CD61을, 적혈구(erythrocyte) 분석을 위해 CD71을, 그리고 T 세포(T lymphocyte)분석을 위해 CD7을 이용하였다.

<표 2> CD34 양성세포군과 CD133 양성세포군간 유세포 분석 통한 증식된 세포들의 분화능 비교

분석결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 두 세포군 모두 2주간 in vitro 배양 시 정도의 차이는 있지만, 모든 계열의 세포로 분화하고 있음을 확인할 수 있었다. 두 세포군 모두에서 배양기간이 지날수록 CD34 양성 세포군의 비율은 점차 감소하면서, 다른 성숙한 세포의 마커들은 증가하였다 (도 4).

또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 무혈청 배지(SF, 배양배지 3)로 배양하는 경우엔 배양배지 1(FBS)이나 배양배지 2(AS)로 배양하는 경우와 달리, 의미 있는 조혈 전구세포로 알려진 CD34양성/CD38음성 세포군이 높은 비율로 유지되었다.

(3) CD34 양성세포군과 리니지 음성세포군의 체외 확장 배양 비교(ex vivo expansion culture)

상기 실시예 1-2에서 분리된 CD34 양성세포군과 RosettSep을 이용하여 분리한 리니지 음성 세포군을 조직배양용 24-웰플레이트에 1웰당 1~10 × 10⁴개씩 배양배지에 나누어 담아 5% CO₂ 존재하에 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양배지는 상기 1)과 동일하게 배양배지 1 내지 3을 사용하였다.

서로 다른 배양 배지 조건하에서 배양된 세포들은 7일과 14일 동안 배양한 후 총유핵세포수, CD34양성세포수, 콜로니집락형성능, 유세포분석기를 통한 표현형 분석을 수행하였으며, 구체적인 분석 방법은 상기 1)과 동일하다. 본 실험은 총 4회 반복 수행하였다.

<표 3> CD34 양성세포군과 리니지 음성 세포군간 체외 확장 배양 시 총유핵세포 수, CD34 양성세포 수 및 총군락형성단위의 증가 배수

Fold increases	CD34양성세포군	리니지 음성세포군
총유핵세포 수( TNCs )	1013±314 604±367 1322±532	175±169 131±145 203±104
20% FBS+IMDM 20% AS +IMDM StemSpan SFEM
			CD34 + Cells	48±18 25±16 234±130	38±17 16±11 200±162
			20% FBS+IMDM 20% AS +IMDM StemSpan SFEM
총군락형성단위( Total CFCs )	105±19 107±63 166±14	81±34 114±82 113±27
20% FBS+IMDM 20% AS +IMDM StemSpan SFEM

* 데이터는 3개의 독립된 실험으로부터 얻은 평균±s.d를 나타낸다.

* Total CFCs는 CFU-GM, BFU-E 및 CFU-mix를 포함한다.

분석결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 총유핵세포 수는 두 세포군 모두 무혈청 배지에서 가장 높은 증가를 보였으며, 단위세포 수를 기준으로는 CD34 양성 세포군이 리니지 음성세포군에 비해 약 6.5배 가량 더 증가하는 것으로 관찰되었다.하지만 제대혈 내 존재하는 리니지 음성 세포군이 RosetSep으로 분리할 경우 CD34양성세포군의 5~10배 가량 많은 세포 수를 확보할 수 있다는 점을 감안하면 오히려 리니지 음성 세포군이 보다 높게 증가한 것을 알 수 있었다. 도 6은 CD34 양성세포군과 리니지 음성 세포군의 단위 세포 수(10⁵)와 제대혈 1 유닛(CBU)에 대한 총유핵세포 수(TNC)를 나타낸다.

또한, CD34 양성세포 수는 두 세포군 모두 무혈청 배지에서 가장 높은 증가를 보였으며 단위세포에 대해서는 비슷한 증가율을 보였으나, 마찬가지로 제대혈 1 개를 기준으로 볼 때는 리니지 음성 세포군이 CD34 양성 세포군에 비해, 보다 높게 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

군락 형성능(CFU assay)은 모든 배양조건에서 큰 차이를 보이지 않았지만 CD34 양성세포군의 경우 무혈청 배지에서 가장 증가하였으며, 리니지 음성 세포군은 배양배지 2(AS)로 배양한 경우와 무혈청배지(배양배지 3)로 배양한 경우에 비숫한 수준으로 증가함을 알 수 있었다. 단위세포 수를 기준으로 CD34 양성 세포군이 리니지 음성 세포군에 약 1.5배 정도 높게 증가하였다.

<표 4> CD34 양성 세포군과 리니지 음성 세포군의 ex vivo 배양 시 유세포 분석 통한 증식된 세포들의 분화능 비교

표현형 분석(Phenotype assay)결과, CD34 양성세포군 및 리니지 음성 세포군의 배양 시, 표 4에 나타난 바와 같이, 모든 계열의 세포로 분화하고 있음을 확인 할 수 있었다.

CD34 양성세포군은 배양 초기 CD34 양성세포들이 전체 세포의 95%의 수준에서 배양기간이 지날수록 급격하게 그 비율이 감소하면서, 다른 성숙한 세포의 마커들은 증가하였다. 그러나, 초기 CD34 양성세포의 수가 10% 전후이었던 리니지 음성 세포군은 배양 시 CD34 양성세포 수의 감소폭이 현저히 낮았으며, 무혈청 배지에서 키운 경우는 오히려 조금 증가하는 경향을 보이기도 하였다. 즉, 무혈청 배지(SF, 배양배지 3)로 배양하는 경우엔 배양배지 1(FBS)이나 배양배지 2(AS)로 배양하는 경우와 달리, 의미있는 조혈전구세포로 알려진 CD34양성/CD38음성 세포군이 높은 비율로 유지되고 있었다. 도 7은 CD34 양성 세포군과 리니지 음성 세포군의 단위 세포 수(10⁵) 및 제대혈 1 유닛(CBU) 당 CD34/CD45 양성 세포 수를 나타낸다.

(4) 상기의 실험결과는 ex vivo에서 CD34 양성 세포군, CD133 양성 세포군 및 리니지 음성 세포군을 배양 시, CD133세포군은 CD34 세포군에 비해 단위세포당 증식 능력은 뛰어났으나 제대혈 1개를 기준으로 볼 때 CD34 양성 세포군과 비슷한 세포 증식능력을 보이는 반면, 리니지 음성세포군은 분리 당시 초기 CD34 양성 세포군의 함유율 차이로 인해 단위세포를 기준으로 볼 때 CD34 양성 세포군에 비해 그 증식 능력은 떨어졌으나 제대혈 1 개를 기준으로 볼 때 분리된 세포수가 CD34 양성 세포군에 비해 5~10배 이상 많으므로 오히려 CD34 양성 세포군을 분리하여 증식시키는 것보다 높은 세포 증식 능력을 보이는 것으로 관찰되었다. 또한 의미있는 조혈모세포의 분포가 CD34와 CD133 양성 세포군의 경우 급격히 감소하는 것과는 다르게 완만하게 감소 또는 오히려 증가하고 있음을 확인하였는데, 이는 지금까지 알려지지 않은 보다 원시적인 줄기세포가 리니지 음성 세포군내에 포함되어있음을 짐작하게 한다.

한편, 배양배지 1(FBS), 배양배지 2(AS, 제대혈 유래 혈장) 및 배양배지 3( 무혈청배지)를 이용한 체외 증식 능력에 있어, 무혈청배지를 사용하는 경우가 의미있는 조혈모세포를 가장 높은 수준으로 증식시키는 것을 확인하였다.

따라서 본 실험결과를 토대로 체외확장배양에 적합한 세포군으로 리니지 음성세포군을 1차적으로 선별하였으며 체외확장배양을 위한 배지로 무혈청 배지를 사용할 것을 결정하였다.

1-4: 세포군에 따른 in vivo 마우스 골수 재형성 분석( SRC assay )

① 상기 1-3의 실험결과 토대로 최종적으로 증식에 적합한 세포군을 결정하기 위하여, 상기 1-2에서 분리된 CD34 양성세포군, CD133 양성세포군 및 리니지 음성 세포군을 각각 마우스에 이식하고 골수 재형성 능력을 확인하였다.

5~6주령의 NOD/SCID(non-obese diabetes/severe combined immune disease) 마우스(Jackson laboratory, IL, USA)를 구입하여 여과된 공기조절장치가 되어 있는 라미나 플로우 캐비넷에서 사육하였다. NOD/SCID 마우스는 멸균된 물과 사료를 섭취하였고, 실험이 시작되기 전에 최소한 1주일 이상 사육실에서 안정을 취하였다.

NOD/SCID 마우스는 137Cs을 보유한 감마 방사선 조사기(GC3000Elan, MDS Nordion)를 이용하여 전신조사(3.0~3.5Gy)하였고 방사선 조사 후 24시간 이내에 준비된 세포를 꼬리정맥을 통하여 주사하였다. CD34와 CD133 양성 세포군은 마우스 한 마리당 5 × 10⁴세포 수로 주사하였고, 리니지 음성세포군은 한 그룹은 마우스 한 마리당 5 × 10⁴ 세포 수, 다른 그룹은 CD34 양성세포 수를 동일하게 하여 약 1 × 10⁵ 세포수(이중 CD34 양성세포 수는 5 × 10⁴임)를 주사하였다. 이때 모든 그룹은 보조적 역할을 하기 위한 제대혈 백혈구(Accessory cells)를 방사선 조사(35Gy)하여 마우스당 1 × 10⁶개씩 꼬리정맥주사로 함께 투여하였고, 대조군에는 오직 보조세포만을 투여하였다. 또한, 마우스의 면역거부반응을 억제하기 위해 항-Asialo GM1 항체(Wako, Japan)를 11일 간격으로 네 차례 복강에 주사하였다.

세포 이식 6주 후에 마우스를 희생시키고 골수, 비장(spleen) 및 말초혈액을 채취하여 각 기관에 생착된 사람의 이식된 세포를 분석하였다. 분석방법은 유세포 분석기를 이용해 사람 CD45항원의 분포 확인, 사람에게서만 특이적으로 발현하는 ALU, Cart-1, PST 유전자에 대한 PCR법, 보다 정량적인 접근을 시도하기위한 Cart-1 유전자에 대한 Real-time PCR법등을 사용하였다. 유세포 분석방법은 마우스 골수, 비장, 혈액으로부터 세포를 추출 후 사람 CD7, CD14, CD15, CD19, CD34, CD38, CD41, CD45, CD61, CD71 마커에 대해 수행하였다.

② 분석결과, 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, CD34 및 CD133 양성 세포군은 비슷한 수준의 생착 능력을 보였으며, 리니지 음성세포군의 경우 총 세포 수가 5x10⁴/마우스 (CD34 양성세포 수가 2.5 × 10⁴, LinNeg(All))인 그룹은 CD34 및 CD133 양성 세포군과 비슷한 생착능을 보인데 반하여, 총 세포수가 1x10⁵/마우스 (CD34 세포수가 5 × 10⁴)인 리니지 음성 세포군 그룹(LinNeg(CD34))에서는 약 2배가량 높은 생착능을 보였다. 도 8은 이식된 세포군에 따른 NOD/SCID 마우스 골수 내 인간 CD45 양성 세포 비율을, 도 9는 이식된 세포군에 따른 NOD/SCID 마우스 비장 내 인간 CD45 양성 세포 비율을 나타낸다.

상기의 결과는 리니지 음성 세포군 내에 CD34/CD133 양성 세포군 이외에 이식 후 생착을 증가시키는데 기여할 수 있는 다른 세포들이 존재하고 있음을 의미한다.

③ 상기 PCR법은 인간 ALU, Cart-1, PST(Human Phenol Sulfotransferase) 유전자 중에서 감도가 가장 좋은 PST유전자를 선택해 수행하였는데, DNA는 QIAamp DNA blood Mini kit(Qiagen, Germany)을 이용하여 마우스의 골수, 비장, 말초혈세포에서 분리하였다.

PCR 시료는 100ng 주형 DNA에 500nM 프라이머, 200uM dNTP, 1.5mM MgCl2, 2U AmpliTaq gold DNA Polymerase, LD(Applied Biosystems, CA, USA)를 넣고 95도에서 5분 반응 후, 94에서 30초, 54도에서 30초, 72도에서 45초씩 총 35회 반복하였다. PCR 기기는 MyGenie 96 Gradient thermal block(Bioneer, South Korea)을 사용하였다. PCR 프라이머는 5’-CTCAGGAACGAGCTGAT-3’(서열번호 1)과 5’-TGTGTCTTCAGGAGTCGTG-3’(서열번호 2) (Cytotherapy , 4:109, 2002)를 사용하였으며 PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에서 EtBr로 염색 후 525bp 밴드를 확인하였다 (도 10).

PCR 결과 유세포 분석법의 결과와 일치한 결과를 얻었으며, 사람세포가 생착되지 않은 대조군에서는 전혀 밴드가 관찰되지 않았고, 사람세포가 생착된 그룹에서는 생착 정도에 따라 밴드의 굵기가 조금씩 다르게 관찰되었다.

④ 실시간(Real-time) PCR법은 상기 통상의 PCR법보다 체계적인 정량화와 유세포 분석법에 따른 결과를 재확인하기 위하여 수행하였다.

인간 Cart-1 유전자에 대해 이미 알려진 프라이머로 5‘-AAG GAT ACC ACA ATA AGC TGC-3’(서열번호 3)과 5‘-GGT TTG TGG AGA CTG GCA C-3'(서열번호 4) ( Blood, 90:85, 1997)를 사용하였고, 상기의 프라이머를 이용하기 위해서 두 프라이머 사이의 염기서열을 포함하도록 형광탐침자를 자체 고안하였다.

형광탐침자는 인간 Cart-1 유전자의 1299번부터 1324번 사이의 역방향 염기서열을 이용하였으며, 5’말단에는 FAM을 3‘ 말단에는 TAMRA를 표지하였다. 형광 탐침자는 5’-FAM-TTT AGT CTT TTC AGA GGT TCA TTC TT-TAMRA-3'(서열번호 5)로 제너럴바이오시스템에서 주문 제작하였다.

시료는 주형 DNA에 500nM 프라이머, 250nM 탐침자, Taqman universal PCR master mix (Applied Biosystem, CA, USA)를 넣고 최종 50ul가 되도록 증류수로 채우고 실시간 DNA 증폭기 ABI7500(Applied Biosystem, CA, USA)을 이용하여 1단계로 50도에서 2분, 95도에서 10분 1회 반응, 2단계로 94도에서 30초, 54도에서 1분, 72도에서 45초씩 5회 반응 후 3단계에서 95도에서 15초, 60도에서 1분 반응 과정을 40회 반복하였다. 형광탐지는 3단계 60도 중합반응 단계에서 측정하였다.

반응에 이용한 시료는 농도를 알고 있는 인간 Cart-1 DNA를 300ng, 100ng, 30ng, 10ng, 3ng, 1ng, 0.3ng, 0.1ng으로 희석한 시료와 각 마우스에서 얻은 골수, 비장, 말초혈세포에서 추출한 100ng의 주형 DNA를 사용하였다.

그 결과, 도 11 및 12에 나타난 바와 같이, 실시간 DNA 증폭법은 유세포분석에 의한 CD45 양성세포 분포와 유사한 방식으로 정량 값을 보였으며, 골수와 비장에서 모두 두 실험법간의 상호연관성이 있음을 확인할 수 있었다

⑤ 한편, 이식된 인간 세포가 마우스 골수 내에서 다양한 형태의 혈액 세포로 분화되고 있는 지를 확인하기 위하여 사람 CD34, CD38, CD15, CD14, CD61(or CD41), CD71 및 CD7 마커에 대한 세포 표현형을 분석하였다.

<표 5> 이식된 세포군에 따른 NOD/SCID 골수 내에서 분화된 다양한 세포들의 유세포분석

분석 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 생착이 성공적으로 이루어진 경우에는 이식된 세포들이 골수 내에서 성숙한 혈액 세포들로 분화하고 있음을 확인할 수 있었다.

상기의 ② 내지 ⑤의 분석결과는 리니지 음성 세포군을 무혈청배지에서 배양하여 조혈줄기세포를 증식시켜 이식하는 경우 생착이 가장 성공적임을 의미하며, 이에 이식을 위한 체외 증식 배양 세포군으로 리니지 음성 세포군을 선정하였다.

실시예 2. 리니지 음성세포군의 in vitro 체외확장배양에 적합한 무혈청배지의 선정

상기 실시예 1에서 최종 선정된 리니지 음성세포군을 이용해 임상에서 사용가능한 4종의 상업용 무혈청배지에 대한 선별 실험을 수행하였다.

X-vivo10(Lonza, Switzerland), QBSF60(Quality Biological, lnc, USA), HPGM(Lonza, Switzerland), Stemline II (Sigma, USA) 모두 사람에서 유래한 성분으로 조성된 무혈청배지로 향후 임상허가나 수행을 하는데 적합하다고 판단하였다.

상기 무혈청배지는 인간 단백질을 포함하는 것으로, 이 중 X-vivo10은 특히 인간 알부민, 인간 인슐린, 인간 트랜스페린 등을 포함하고 있는 것으로 알려져 있다.

상기 실시예 1의 EasySep system으로 분리된 리니지 음성세포를 조직배양용 24-웰플레이트에 1웰 당 0.5~1 × 10⁵개씩 배양배지에 현탁 후 나누어 담고, 5% CO₂ 존재하에 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양배지는 상기 4종류의 무혈청배지 각각에 50~100 ng/ml의 SCF, Flt-3 ligand, TPO, IL-6(R&D systems) 등의 사이토카인을 첨가하였다. 본 실험은 총 5회 반복수행하였다.

서로 다른 배양배지 조건 하에서 배양된 세포들은 7일과 14일 동안 배양한 후 총유핵세포 수, CD34양성세포 수, 콜로니집락형성능, 유세포분석기를 통한 표현형 분석을 수행하였다. 분석 방법은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.

<표 6> 리니지 음성 세포군의 4종의 무혈청 배양배지에서 배양 시 총유핵세포 수, CD34 양성세포 수, 총군락형성단위의 증가배수

* 데이터는 3개의 독립된 실험으로부터 얻은 평균±s.d를 나타낸다.

* Total CFCs는 CFU-GM, BFU-E 및 CFU-mix를 포함한다.

그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, 총유핵세포 수는 배양 7일째와 14일째 조금 차이가 있으나 14일째를 기준으로 보았을 때, Stemline II가 가장 높은 증가를 보였으며, QBSF60, HPGM, X-vivo10 순으로 나타났다.

또한, CD34 양성세포 수는 QBSF60이 가장 높은 증가를 보였으며, 나머지 3종의 무혈청배지에서는 비슷한 수준의 증가를 보였다.

군락형성능 분석(CFU assay)은 QBSF60과 HPGM에서 높은 증가를 나타냈으며 X-vivo10, Stemline II 순으로 나타났다. QBSF60과 HPGM이 수적인 증가에서는 우세했으나 실제 콜로니의 크기나 밀집도를 고려한 질적인 측면에서는 오히려 X-vivo10과 QBSF60이 좋았으며, HPGM과 Stemline II의 경우는 콜로니의 크기가 작고 덜 밀집된 형태의 콜로니가 많이 관찰되었다.

<표 7> 리니지 음성세포군의 4종의 무혈청 배지에서 배양 시 유세포 분석을 통한 분화능 비교

한편, 표현형 분석(Phenotype assay) 결과는 상기 표 7에 나타난 바와 같다. 즉, 14일간 배양 시 QBSF60과 X-vivo10에서 CD34 양성세포가 비교적 높게 유지되고 있었으며, 특히 X-vivo10의 경우 7일째와 14일째 CD34 양성세포의 비율이 거의 감소되지 않고 일정하게 유지됨을 확인할 수 있었다.

CD34 양성 세포들은 보다 미성숙한 상태로 알려져 있는 CD34 양성/CD38 음성 세포군과 더 성숙된 CD34 양성/CD38 양성 세포군으로 나눌 수 있는데, X-vivo10으로 배양 시 대부분의 CD34양성 세포가 CD34양성/CD38음성세포군에 속하는 반면 QBSF60으로 배양 시 이 두 세포군의 비율이 반반이거나 CD34 양성/CD38 양성 세포군이 더 높은 비율로 나타났다.

이외에 다른 성숙한 혈액 세포 표지자들은 4종의 무혈청 배지에서 배양한 경우 조금씩 차이가 있기는 하나, 비슷한 경향으로 관찰되어 다양한 형태의 혈액세포로 분화함을 확인할 수 있었다.

상기의 실험 결과는 CD34 양성세포를 높게 유지시키면서도 다양한 형태의 세포로 분화시킬 수 있는 무혈청 배지는 X-vivo10과 QBSF60의 두 종류임을 제시한다.

실시예 3. 두 종의 무혈청 배지로 배양된 리니지 음성 세포군의 in vivo 마우스 골수 재형성 분석( SRC assay )

상기 실시예 2을 통해 선정된 2종의 무혈청배지 X-vivo10과 QBSF60을 이용하여, 리니지 음성 세포군을 7일과 14일간 각각 배양시킨 후 수거한 세포들을 마우스에서 이식해 생착 능력을 비교하였다. 리니지 음성 세포군으로는 상기 실시예 1에서 EasySep system을 이용하여 분리한 리니지 음성 세포군을 사용하였다.

먼저 5~6주령의 NOD/SCID(non-obese diabetes/severe combined immune disease) 마우스(Charles River, Wilmington, MA, USA)를 구입하여 여과된 공기조 절장치가 되어 있는 라미나 플로우 캐비넷에서 사육하였다. NOD/SCID 마우스는 멸균된 물과 사료를 섭취하였고, 실험이 시작되기 전에 최소한 1주일 이상 사육실에서 안정을 취하였다.

1차로 배양하지 않은 리니지 음성세포군을 이식하기 위하여 NOD/SCID 마우스는 137Cs을 보유한 감마방사선조사기를 이용하여 전신조사(3.0~3.5Gy)하였고 냉동보관된 리니지 음성세포를 해동하여 24시간 이내에 마우스 한 마리당 5 × 10⁴세포수로 꼬리 정맥에 주사하였다. 이때 모든 그룹은 보조적 역할을 하기 위한 제대혈 백혈구(Accessory cells)를 방사선 조사(35Gy)하여 마우스당 1 × 10⁶개 씩 꼬리정맥주사로 함께 투여하였고, 대조군에는 오직 보조세포만을 투여하였다. 또한 마우스의 면역거부반응을 억제하기 위해 항-Asialo GM1 항체를 11일 간격으로 네차례 복강에 주사하였다.

1차 이식 후 남은 리니지 음성세포는 조직배양용 24-웰플레이트에 1웰당 5 × 10⁴개씩 배양배지에 나누어 담아 5% CO₂ 존재하에 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양배지는 X-vivo10과 QBSF60에 50~100ng/ml 농도로 SCF, Flt-3 ligand, TPO, IL-6(R&D systems) 등의 사이토카인을 첨가하였다.

배양 7일째에 5 × 10⁴세포수/well로부터 증식된 세포를 수거하여 마우스 한 마리에 상기와 동일한 방법으로 2차 이식을 하고, 배양 14일째 5 × 10⁴세포수/well로부터 증식된 세포를 수거하여 3차 이식을 실시하였다.

7일과 14일째 증식 배양 후 일부의 세포를 수거하여 총유핵세포 수, CD34 양성세포 수, 콜로니집락형성능, 유세포분석기를 통한 표현형 분석을 수행하였다. 분석 방법은 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.

<표 8> 리니지 음성 세포군의 2종의 무혈청 배양배지 배양 시 총유핵세포 수, CD34 양성세포 수, 총군락형성단위

분석결과, 표 8에 나타난 바와 같이, 총유핵세포 수는 7일째 QBSF60이 X-vivo10보다 높았으나, 14일째는 동일하게 증가되었다. CD34 양성세포의 증가도 7일째는 QBSF60이 다소 높았으나, 14일째는 오히려 X-vivo10에서 더 증가하였다. 한편, 콜로니집락형성능은 CD34 양성세포의 증가와 비슷한 경향을 보였다.

실시예 2와 마찬가지로, X-vivo10의 경우 배양 7일째와 14일째 CD34 양성세 포 분포가 크게 감소하지 않고 비슷한 수준으로 유지되었으며, 대부분의 세포들이 보다 미성숙상태인 CD34 양성/CD38 음성 세포군인 것으로 확인되었다. 반면 QBSF60의 경우 오히려 CD34 양성/CD38 음성 세포군보다 CD34 양성/CD38 양성 세포군이 더 많은 것으로 나타났다. 이식된 세포의 성숙한 혈액세포로의 다분화능은 배양 7일째 X-vivo10에서 적혈구계 세포 표지자인 CD71이 QBSF60에 비해 높게 나타난 것을 제외하곤 비슷한 형태로 분화됨을 확인하였다 (도 13, 도 14).

한편, 1, 2 및 3차 이식 후 6주 후에 마우스를 희생시키고 골수와 비장(spleen) 및 말초혈액을 채취하여 세포를 분리한 후, 각 기관에 생착된 사람의 이식된 세포를 분석하였다. 분석방법은 유세포 분석기를 이용한 사람 CD45항원의 분포를 확인하고 필요한 경우 PST 유전자에 대한 PCR법과 Cart-1 유전자에 대한 Real-time PCR법등을 사용하였다.

그 결과, 도 15 및 16에 나타난 바와 같이, 배양하지않은 리니지 음성 세포군에 비하여, 14일간 X-vivo10으로 배양한 세포군이 약 2배 이상의 높은 이식 생착 능력을 보였다. 반면 X-vivo10으로 7일 배양한 경우나 QBSF60으로 7일 또는 14일 배양한 경우는 비슷하거나 오히려 조금 낮게 관찰되었다.

또한, 마우스 골수에서 얻어진 세포로 군락형성능을 시험한 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 14일간 X-vivo10으로 배양하여 이식한 세포군에서 가장 높게 나타났다.

이외에도 골수유래 세포를 이용하여 이식된 세포의 다양한 분화능을 확인하기 위하여 사람 CD7, CD14, CD15, CD19, CD34, CD38, CD41, CD45, CD61, CD71 마커에 대한 세포 표현형 분석하였다. 분석방법은 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.

<표 9> 이식된 세포군에 따른 NOD/SCID 골수 내 분화된 다양한 세포들의 유세포 분석

한편, 마우스 골수에서 얻어진 세포들의 다분화능은 이식 정도에 따라 그 값의 차이는 있었지만 모든 그룹에서 비슷한 경향으로 나타났다. 결과적으로 실시예 2를 통해 in vitro에서 가장 높은 증식능력을 보였던 QBSF60으로 배양된 세포에 비해 증식능력이 조금 떨어지긴 했지만 X-vivo10으로 배양한 세포들이 마우스에서 이식 생착능이 가능한 세포들을 많이 보유하는 것으로 보이며, 리니지 음성 세포 군(LinNeg)이 in vitro 증식을 통해 이식 생착능을 촉진시키기 위해서는 7일보다는 14일 정도의 배양기간이 필요하다는 것을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 분리된 CD34 양성세포군의 순도(Purity) 분석을 위하여 항-CD34-PE와 항-CD45-FITC 항체(Beckman Coulter, Mijdrecht, Netherland)로 면역반응을 한 후, 유세포분석기(FC500 flow cytometer, Beckman Coulter, Netherland)로 분석한 결과 그래프이다.

도 2는 분리된 CD133 양성세포군의 순도(purity) 분석을 위하여, 항-CD133-PE와 항-CD45-FITC 항체(Beckman Coulter, Mijdrecht, Netherland)로 면역반응을 한 후, 유세포분석기로 분석한 결과 그래프이다.

도 3은 분리된 리니지 음성세포를 항-CD34-PE와 항-CD45-FITC 항체로 면역반응을 한 후, 유세포분석기로 분석한 결과 그래프이다.

도 4는 CD34 양성세포군 및 CD133 양성세포군의 배양기간 및 배양조건에 따른 CD34 양성/CD45 양성 세포군 변화를 나타낸 결과이다.

도 5는 CD34 양성세포군 및 CD133 양성세포군의 배양기간 및 배양조건에 따른 CD38 음성/CD34 양성 세포군 변화를 나타낸 결과이다.

도 6은 CD34 양성세포군과 리니지 음성 세포군의 배양기간 및 배양조건에 따른 단위세포 수와 제대혈 1유닛에 대한 총유핵세포 수를 나타내는 비교그래프이다.

도 7은 CD34 양성세포군과 리니지 음성 세포군의 배양기간 및 배양조건에 따른 단위세포 수와 제대혈 1유닛에 대한 CD34 양성세포 수를 나타내는 비교그래프이다.

도 8은 이식세포군에 따른 NOD/SCID 마우스 골수 내 인간 CD45 양성세포의 비율을 나타낸 그래프이다.

도 9는 이식세포군에 따른 NOD/SCID 마우스 비장 내 인간 CD45 양성세포의 비율을 나타낸 그래프이다.

도 10은 이식세포군에 따른 NOD/SCID 마우스 골수와 비장세포의 인간 PST 유전자에 대한 유전자 증폭법(PCR) 결과를 나타내는 도면이다.

도 11은 이식세포군에 따른 NOD/SCID 마우스 골수세포의 인간 cart -1 유전자에 대한 실시간 유전자 증폭법(Real-time PCR) 결과를 나타내는 도면이다.

도 12는 마우스 골수와 비장세포에 대한 실시간 유전자 증폭법과 유세포분석법의 상호연관성을 보여주는 그래프이다.

도 13은 리니지 음성세포군의 2종의 무혈청 배양배지 체외확장배양 시 CD45/CD34와 CD34/CD38간의 유세포 분석결과를 나타낸 그래프이다.

도 14는 리니지 음성세포군의 2종의 무혈청 배양배지 체외확장배양 시 유세포 분석기에 의한 분석결과, 다양한 혈액세포로의 분화를 나타낸 그래프이다.

도 15는 이식된 세포군에 따른 NOD/SCID 마우스 골수 내 인간 CD45 양성세포비율을 나타낸 그래프이다.

도 16은 이식된 세포군에 따른 NOD/SCID 마우스 비장 내 인간 CD45 양성세포비율을 나타낸 그래프이다.

도 17은 이식된 세포군에 따른 NOD/SCID 마우스 골수 내 인간군락 형성단위 수를 나타낸 그래프이다.

<110> MOGAM BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE <120> Method for Preparing Hematopoietic Stem Cells Having Improved Engraftment <130> P07-B246 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 ctcaggaacg agctgat 17 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 tgtgtcttca ggagtcgtg 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Real-time PCR primer <400> 3 aaggatacca caataagctg c 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Real-time PCR primer <400> 4 ggtttgtgga gactggcac 19 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse sequences between 1299th and 1324th base of human Cart-1 gene <400> 5 tttagtcttt tcagaggttc attctt 26

Claims (9)

1. 다음의 단계를 포함하는, 조혈줄기세포 및 전구세포를 함유하는 리니지 음성세포군의 분리방법:

   (a) 제대혈, 골수 및 말초혈로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 또는 이로부터 분리된 단핵세포구(mononuclear cells)에 CD2, CD3, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b 및 glycophorin A로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 표면항원에 대한 항체를 첨가하고 반응시키는 단계; 및

   (b) 상기 표면항원에 대하여 양성인 단핵세포구를 제거하고, 상기 표면항원에 대하여 음성인, 조혈줄기세포 및 전구세포를 함유하는 리니지 음성세포군을 수득하는 단계.
2. 제1항의 방법에 의하여 분리된 리니지 음성세포군을 SCF, Flt-3 리간드, TPO, IL-6, IL-3, GM-CSF 및 G-CSF로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 생착능이 증가된 조혈줄기세포의 제조방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 무혈청 배지는 인간 알부민(human Albumin), 인간 인 슐린(human Insulin) 및 인간 트랜스페린(human Transferrin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제2항 또는 제3항의 방법에 의해 제조된 생착능이 증가된 조혈줄기세포.
5. 제4항에 있어서, 표면항원 CD34 양성/ CD38 음성 세포군이 CD34 양성/CD38 양성 세포군에 비하여 높은 비율로 함유된 것을 특징으로 하는 생착능이 증가된 조혈줄기세포.
6. 제4항의 조혈줄기세포를 함유하는 조혈줄기세포이식용 키트(kit).
7. 제4항의 조혈줄기세포를 함유하는 약물 독성여부 측정용 키트.
8. 제4항의 조혈줄기세포를 함유하는 세포치료용 조성물.
9. CD2, CD3, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b 및 glycophorin A로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 표면항원에 대한 항체를 포함하는 리니지 음성세포군 분리용 키트.

Images