JP2023507486A - 造血幹細胞を増幅するための小分子化合物、及びそれらの組み合わせ - Google Patents

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Abstract

造血幹細胞（ＨＳＣｓ）を増幅するための小分子阻害剤及びそれらの組み合わせが提供される。小分子阻害剤及びそれらの組み合わせは、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）のインビトロ増幅を促進しながら、造血幹細胞の幹細胞性を維持することができる。【選択図】なし

Description

本出願は、生物医学の分野に関し、特に造血幹細胞（ＨＳＣs）を増幅するための小分子化合物、具体的には細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤、その組成物、ならびに造血幹細胞の増幅における小分子阻害剤及びその組成物の使用に関する。
造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＨＳＣs）は、血液系の不均一な原始造血細胞のグループであり、自己複製と多系統分化の２つの重要な特徴を備えている。体が健康な状態にあるとき、体内のＨＳＣｓは長い間静止状態にある。体が病変や重度の失血の状態にあるとき、ＨＳＣｓは活性化され、自己複製及び多系統分化の状態になり、血液系の安定性と体の恒常性を維持する。ＨＳＣｓの自己複製特性は、後代ＨＳＣｓの幹細胞性の維持に有益であり、ＨＳＣｓの多系統分化特性により、骨髄細胞（顆粒球、単球、赤血球、及び血小板）、リンパ球（Ｔ細胞及びＢ細胞）などのさまざまな成熟血液細胞に分化することができる。ＨＳＣｓの特性は、体が必要とするときにＨＳＣｓの分化を促進する。
ＨＳＣｓのこれらの特性により、造血幹細胞移植（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＨＳＣＴ）による血液系疾患の治療が可能になる。ＨＳＣは、長期造血幹細胞（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ＨＳＣｓ、ＬＴ－ＨＳＣｓ）及び短期造血幹細胞（ｓｈｏｒｔ ｔｅｒｍ ＨＳＣｓ、ＳＴ－ＨＳＣｓ）を含む。前者は自己複製能力が高く、体のライフサイクル全体で造血再建を行うことができるが、後者は限られた時間だけ造血再建の機能を維持することができる。１９５９年、Ｔｈｏｍａｓらは骨髄造血幹細胞を使用して人類史上で初の造血幹細胞移植を行い、臨床で白血病を治療して患者体内の正常な造血機能を回復させた。その後の数十年間、科学研究者の継続的な努力により、造血幹細胞移植は、さまざまな血液系疾患の治療に使用されるだけではなく、免疫不全疾患や神経系変性疾患などの治療にも使用されてきた。
現在、ＨＳＣｓの主な供給源は、骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ，ＢＭ）、動員末梢血（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ，ｍＰＢ）、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ，ＣＢ）の３つである。骨髄造血幹細胞の採取は、外傷が大きく、採取が不十分であるため、この方法は基本的には放棄された。ヒト末梢血中のＨＳＣｓの割合は非常に低く（０．１％未満）、移植前に造血幹細胞を骨髄から末梢血に移動させるために顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）を使用する必要があり、臨床応用では、動員効果が悪かったり、含まれるＨＳＣｓの数が不十分であったりすることが多いため、繰り返し動員または移植の失敗をもたらす。さらに、これら２つの方法で収集されたＨＳＣはすべて、ドナーと患者との間でヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）のマッチングを実行する必要がある。ＨＬＡマッチングは困難であり、ミスマッチが発生すると、移植片対宿主反応（ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ ｈｏｓｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＧＶＨＤ）が発生してしまう。ＧＶＨＤを発症した患者は、免疫系障害で亡くなる。
ＨＳＣｓの新しい供給源として、臍帯血には多くの利点がある。まず、臍帯血ＨＳＣｓは、ＨＬＡマッチングの要件が低く、部分的なＨＬＡミスマッチが可能であり、移植後のＧＶＨＤの発生率が低いため、従来のＨＳＣＴマッチングの難しさを軽減できる。そして、臍帯採血は便利であり、ドナーに無害であり、倫理的な問題はなく、ＨＳＣｓの造血能力が強い。これらの利点により、臍帯血は、疾患を治療するための将来のＨＳＣの優先的供給源になる。
しかしながら、一つ分の臍帯血中の細胞量が少ないため、ＨＳＣｓの総数は少なく、移植対象は子供や体重の低い成人に限定されており、体重の高い成人の移植ニーズを満たすことはできない。移植されたＨＳＣｓの数が不十分な場合、患者の好中球の回復が遅れ、ＧＶＨＤのリスクが高まる。これらは、臍帯血の臨床応用を制限するボトルネックになっている。
要するに、造血幹細胞移植の安全性と有効性は、移植されたＨＳＣｓの含有量に依存する。ＨＳＣｓの数をインビトロで増やすことができれば、造血幹細胞移植の成功率を向上させることができる。
研究者たちは引き続き努力し、造血幹細胞のインビトロ増幅を達成するためのさまざまな方法を模索している。ＨＳＣｓのインビトロ増幅のための策略の１つは、ＨＳＣｓを標的とする小分子化合物（ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ＳＭＣｓ）を使用することである。ＳＭＣｓは、供給元から容易に入手でき、大量生産が容易であり、性質が安定しており、構造が明確であり、濃度の制御が容易であり、医学研究で広く使用されている。現在のＨＳＣｓのインビトロ増幅技術では、ＳＭＣｓはＨＳＣｓの増幅倍率を大幅に増加させることができる。例えば、ＡｈＲアリール炭化水素受容体阻害剤であるＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ １（ＳＲ１）は、スクリーニングされたインビトロでＨＳＣｓを増幅できる初めてのＳＭＣである。ピリミジンインドール誘導体ＵＭ１７１もインビトロでＨＳＣｓを増幅することができるが、ＡｈＲ細胞シグナル伝達経路を介して作用するのではない。トランスクリプトーム解析の結果は、ＵＭ１７１がＡｈＲ細胞シグナル伝達経路をダウンレギュレートしなかったが、赤血球及び巨核球の分化関連遺伝子を阻害したことを示した。両者の組み合わせは、ＨＳＣｓの増幅倍率を高めることができる。
ヒストンデアセチラーゼ（ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ，ＨＤＡＣ）は、既知の細胞シグナル伝達経路である。ヒストンは、アセチル化または脱アセチル化の調節を通じて、特定の遺伝子の転写プロセス、細胞の増殖及び分化を調節することができる。既存の研究結果は、ヒストンのアセチル化がＨＳＣｓの自己複製と増殖に役割を果たすことを明らかにしている。ＨＤＡＣ阻害剤であるＴＳＡ、トラポキシン（ｔｒａｐｏｘｉｎ）、クラミドシン（ｃｈｌａｍｙｄｏｃｉｎ）は、インビトロでヒストンアセチル化を調節して、ＨＳＣｓの自己複製と増殖を促進することができる。
ＳｒｃはＳｒｃプロトオンコジーンによってコードされており、チロシンプロテインキナーゼ活性を持つ非受容体型プロテインキナーゼである。それは細胞質に存在し、さまざまな細胞表面受容体によって活性化されて複数の細胞シグナル伝達経路の媒介に関与し、それによって細胞増殖や分化などのプロセスを調節することができ、複数の細胞シグナル伝達経路の重要な分子である。例えば、Ｓｒｃは活性化された後、ｐ５２Ｓｈｃと協力してマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）細胞シグナル伝達経路を活性化し、ＭＡＰＫの細胞増殖及び分化プロセスの下流調節に関与する。ＳｒｃはＳＴＡＴ細胞シグナル伝達経路を活性化して関連遺伝子の転写を促進することもできる。今までのところ、Ｓｒｃ阻害剤がインビトロ増殖中にＨＳＣｓの幹細胞性を維持するのに役立つことを報告した研究はないが、本発明の研究では、Ｓｒｃ阻害剤がＨＳＣｓの増殖を促進し、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持できることを発見した。
一部の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤はＨＳＣｓの増殖を促進できることがわかっているが、本分野では、臨床的ニーズを満たすために、ＨＳＣｓの増殖をより効果的に促進し、増殖したＨＳＣの幹細胞性を維持できる小分子化合物、及びこの目的を達成する総合的な戦略を探し続ける必要がある。
本願が解決する課題は、細胞シグナル伝達経路を調節する肝心な要因を研究することにより、ＨＳＣｓのインビトロ増幅を促進するとともにＨＳＣｓの幹細胞性の高い割合を維持する最適な小分子化合物及びその組成物を選別し、これによって従来技術の、ＨＳＣｓのインビトロ増幅数がまだ不十分であるという課題を解決することである。
まず、出願人の研究により、ＳＴＡＴ細胞シグナル伝達経路のＳｒｃ標的に作用する複数の小分子阻害剤がインビトロ培養時のＨＳＣｓの幹細胞性を十分に維持でき、Ｓｒｃ標的がＳＴＡＴ細胞シグナル伝達経路において、造血幹細胞の増幅、及びそれと同時に造血幹細胞の幹細胞性の維持に重要な役割を果たしていることが分かった。これは以前の研究では報告されたことはない。
さらに、本願は、ＨＳＣｓのインビトロ培養中に、ＳＡＨＡ、バルプロ酸（Ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ、ＶＰＡ）などのＨＤＡＣ阻害剤と、Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤との組み合わせがＨＳＣｓの幹細胞性を十分に維持でき、その効果が従来技術で見出されたＳＲ１及びＵＭ１７１よりもはるかに優れていることを発見した。
したがって、本願の一態様は、Ｓｒｃ標的を標的とする小分子阻害剤などの、シグナル伝達及び転写活性化因子（ＳＴＡＴ）細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤が、ＨＳＣｓの増殖を促進し、ＨＳＣｓの幹細胞性特性を維持できることを見出す。一部の実施形態では、本願は、ＨＳＣｓを、ＳＴＡＴ細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤または他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤を含有する培養液とインビトロで接触させることを含む、ＨＳＣｓの増殖を促進し、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する方法を提供する。一部の実施形態では、前記ＳＴＡＴ細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤がＳｒｃ標的の小分子阻害剤である。一部の実施形態では、前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤が、ダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、ケルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、ＵＭ－１６４、ＫＸ２－３９１及びＫＸ１－００４から選択される１つまたは複数である。一部の実施形態では、前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤が、ダサチニブ、ＵＭ－１６４、及びＫＸ１－００４から選択される１つまたは複数である。
一部の実施形態では、前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤は、他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤と併用する。一部の実施形態では、前記他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤が、ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤、ＰＫＣを標的とする小分子阻害剤、及びＪＮＫを標的とする小分子阻害剤から選択1つまたは２つ以上である。一部の実施形態では、前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤は、ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤、ＰＫＣを標的とする小分子阻害剤、またはＪＮＫを標的とする小分子阻害剤と併用する。一部の実施形態では、前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤は、ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤ＶＰＡ、ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤ＳＡＨＡ、ＰＫＣを標的とする小分子阻害剤エンザスタウリン（Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ）、またはＪＮＫを標的とする小分子阻害剤ＪＮＫ－ＩＮ－８と併用する。一部の実施形態では、前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤ダサチニブはＶＰＡまたはＳＡＨＡと併用する。一部の実施形態では、Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤などの前記シグナル伝達及び転写活性化因子（ＳＴＡＴ）細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤、例えば、ダサチニブ、ＵＭ－１６４またはＫＸ１－００４は、細胞全体におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有するＨＳＣｓ細胞の割合が８％を超える、１０％を超える、１５％を超える、２０％を超える、２５％を超える、または３０％を超えることを維持し、例えば、細胞全体におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有するＨＳＣｓ細胞の割合が５％～３５％、１０％～３５％、１５％～３５％、２０％～３５％、２５％～３５％、５％～３０％、１０％～３０％、２０％～３０％、５％～２５％、１０％～２５％、１５％～２５％、２０％～２５％、５％～２０％、１０％～２０％、１５％～２０％であることを維持し、細胞全体におけるＣＤ３４＋細胞の割合が６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、または８５％を超えることを維持する。
一部の実施形態では、本願は、ＳＴＡＴ細胞シグナル伝達経路を含有する小分子阻害剤を含む、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持するための組成物を提供する。一部の実施形態では、前記ＳＴＡＴ細胞シグナル伝達経路を含有する小分子阻害剤がＳｒｃ標的の小分子阻害剤である。一部の実施形態では、前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤が、ダサチニブ、ケルセチン、ＵＭ－１６４、ＫＸ２－３９１及びＫＸ１－００４から選択される１つまたは複数である。一部の実施形態では、前記組成物が他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤をさらに含む。一部の実施形態では、前記他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤が、ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤、ＰＫＣを標的とする小分子阻害剤、及びＪＮＫを標的とする小分子阻害剤を含む。一部の実施形態では、前記他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤が、ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤ＶＰＡ、ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤ＳＡＨＡ、ＰＫＣを標的とする小分子阻害剤エンザスタウリン、及びＪＮＫを標的とする小分子阻害剤ＪＮＫ－ＩＮ－８を含む。一部の実施形態では、前記組成物が、ＳＦＥＭＩＩ培地、成長因子Ｆｌｔ－３Ｌ、成長因子ＳＣＦ、成長因子ＴＰＯ及び成長因子ＩＬ－６をさらに含む。一部の実施形態では、前記組成物は、ＳＴＡＴ細胞シグナル伝達経路を含有する小分子阻害剤及び／またはその他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤、ＳＦＥＭＩＩ培地、成長因子Ｆｌｔ－３Ｌ、成長因子ＳＣＦ、成長因子ＴＰＯ及び成長因子ＩＬ－６からなる。一部の実施形態では、前記組成物は、細胞全体におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有するＨＳＣｓ細胞の割合が８％を超える、１０％を超える、１５％を超える、２０％を超える、２５％を超える、または３０％を超えることを維持し、例えば、細胞全体におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有するＨＳＣｓ細胞の割合が５％～３５％、１０％～３５％、１５％～３５％、２０％～３５％、２５％～３５％、５％～３０％、１０％～３０％、２０％～３０％、５％～２５％、１０％～２５％、１５％～２５％、２０％～２５％、５％～２０％、１０％～２０％、１５％～２０％であることを維持する。一部の実施形態では、前記組成物は、細胞全体におけるＣＤ３４＋細胞の割合が６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、または８５％を超えることを維持する。
一部の実施形態では、Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤などの前記シグナル伝達及び転写活性化因子（ＳＴＡＴ）細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤、例えば、ダサチニブ、ＵＭ－１６４またはＫＸ１－００４と、ＶＰＡまたはＳＡＨＡなどのその他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤との併用は、細胞全体におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有するＨＳＣｓ細胞の割合が８％を超える、１０％を超える、１５％を超える、２０％を超える、２５％を超える、または３０％を超えることを維持し、例えば、細胞全体におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有するＨＳＣｓ細胞の割合が５％～３５％、１０％～３５％、１５％～３５％、２０％～３５％、２５％～３５％、５％～３０％、１０％～３０％、２０％～３０％、５％～２５％、１０％～２５％、１５％～２５％、２０％～２５％、５％～２０％、１０％～２０％、１５％～２０％であることを維持し、細胞全体におけるＣＤ３４＋細胞の割合が６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、または８５％を超えることを維持する。一部の実施形態では、培地における各阻害剤の濃度として、
ダサチニブ：０．１μＭ～５０μＭ、好ましくは０．５μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．５μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．５μＭ～１０μＭであり、
ＳＡＨＡ：１０ｎＭ～２０μＭ、好ましくは２０ｎＭ～１５μＭ、より好ましくは３０ｎＭ～１０μＭ、最も好ましくは０．１μＭ～１０μＭであり、
ＶＰＡ：１０μＭ～２０００μＭ、好ましくは１０μＭ～１５００μＭ、より好ましくは１０μＭ～１０００μＭ、最も好ましくは１００μＭ～１０００μＭであり、
ＪＮＫ－ＩＮ－８：０．１μＭ～２０μＭ、好ましくは０．５μＭ～１５μＭ、より好ましくは０．５μＭ～１０μＭ、最も好ましくは１μＭ～１０μＭであり、
ＥＰＺ００４７７７：０．１μＭ～５０μＭ、好ましくは０．５μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．５μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．５μＭ～１０μＭであり、
ＤＺＮｅＰ：１ｎＭ～５００ｎＭ、好ましくは５ｎＭ～４００ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ～３００ｎＭ、最も好ましくは１０ｎＭ～２５０ｎＭであり、
ＵＭ－１６４：０．１μＭ～１０００μＭ、好ましくは０．５μＭ～５００μＭ、より好ましくは１μＭ～１００μＭ、最も好ましくは１μＭ～１０μＭであり、
ＫＸ２－３９１：０．１ｎＭ～１０００ｎＭ、好ましくは１ｎＭ～１０００ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ～５００ｎＭ、最も好ましくは１０ｎＭ～１００ｎＭであり、
ＫＸ１－００４：０．１μＭ～１０００μＭ、好ましくは１μＭ～１０００μＭ、より好ましくは１０μＭ～５００μＭ、最も好ましくは１０μＭ～１００μＭである。
一態様では、本願は、ＨＳＣｓを、１）ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤ＶＰＡ、２）ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤ＳＡＨＡ、３）ＰＫＣを標的とする小分子阻害剤エンザスタウリン、及び４）ＪＮＫを標的とする小分子阻害剤ＪＮＫ－ＩＮ－８から選択される１つまたは複数の小分子阻害剤を含有する培養液とインビトロで接触させることを含む、ＨＳＣｓの増殖を促進し、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する方法を提供する。
一態様では、本願は、ＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７、ＳＡＨＡ＋ＤＺＮｅＰ、ＳＡＨＡ＋ダサチニブ、ＶＰＡ＋ダサチニブ、ＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ－８またはＳＡＨＡ＋ＶＰＡから選択されるいずれか１つの組み合わせを含む、ＨＳＣｓの乾細胞性を維持するための組成物を提供する。一部の実施形態では、前記組成物は、ＳＦＥＭＩＩ培地、成長因子Ｆｌｔ－３Ｌ、成長因子ＳＣＦ、成長因子ＴＰＯ及び成長因子ＩＬ－６をさらに含む。一部の実施形態では、前記組成物は、ＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７、ＳＡＨＡ＋ＤＺＮｅＰ、ＳＡＨＡ＋ダサチニブ、ＶＰＡ＋ダサチニブ、ＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ－８またはＳＡＨＡ＋ＶＰＡから選択されるいずれか１つの組み合わせ、及びＳＦＥＭＩＩ培地、成長因子Ｆｌｔ－３Ｌ、成長因子ＳＣＦ、成長因子ＴＰＯ及び成長因子ＩＬ－６からなる。一部の実施形態では、前記ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する組成物はさらに、ＣＤ３４＋細胞の割合の維持に寄与する。一部の実施形態では、前記組成物は、細胞全体におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有するＨＳＣｓ細胞の割合が８％を超える、１０％を超える、１５％を超える、２０％を超える、２５％を超える、または３０％を超えることを維持し、例えば、細胞全体におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有するＨＳＣｓ細胞の割合が５％～３５％、１０％～３５％、１５％～３５％、２０％～３５％、２５％～３５％、５％～３０％、１０％～３０％、２０％～３０％、５％～２５％、１０％～２５％、１５％～２５％、２０％～２５％、５％～２０％、１０％～２０％、１５％～２０％であることを維持し、細胞全体におけるＣＤ３４＋細胞の割合が６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、または８５％を超えることを維持する。一部の実施形態では、培地における各阻害剤の濃度として、
ダサチニブ：０．１μＭ～５０μＭ、好ましくは０．５μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．５μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．５μＭ～１０μＭであり、
ＳＡＨＡ：１０ｎＭ～２０μＭ、好ましくは２０ｎＭ～１５μＭ、より好ましくは３０ｎＭ～１０μＭ、最も好ましくは０．１μＭ～１０μＭであり、
ＶＰＡ：１０μＭ～２０００μＭ、好ましくは１０μＭ～１５００μＭ、より好ましくは１０μＭ～１０００μＭ、最も好ましくは１００μＭ～１０００μＭであり、
ＪＮＫ－ＩＮ－８：０．１μＭ～２０μＭ、好ましくは０．５μＭ～１５μＭ、より好ましくは０．５μＭ～１０μＭ、最も好ましくは１μＭ～１０μＭであり、
ＥＰＺ００４７７７：０．１μＭ～５０μＭ、好ましくは０．５μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．５μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．５μＭ～１０μＭであり、
ＤＺＮｅＰ：１ｎＭ～５００ｎＭ、好ましくは５ｎＭ～４００ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ～３００ｎＭ、最も好ましくは１０ｎＭ～２５０ｎＭである。
一態様では、本願は、ＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７＋ＤＺＮｅＰまたはＳＡＨＡ＋ＶＰＡ＋ダサチニブから選択されるいずれか１つの組み合わせを含む、ＨＳＣｓの乾細胞性を維持するための組成物を提供する。一部の実施形態では、前記組成物は、ＳＦＥＭＩＩ培地、成長因子Ｆｌｔ－３Ｌ、成長因子ＳＣＦ、成長因子ＴＰＯ及び成長因子ＩＬ－６をさらに含む。一部の実施形態では、前記組成物は、ＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７＋ＤＺＮｅＰまたはＳＡＨＡ＋ＶＰＡ＋ダサチニブ、及びＳＦＥＭＩＩ培地、成長因子Ｆｌｔ－３Ｌ、成長因子ＳＣＦ、成長因子ＴＰＯ及び成長因子ＩＬ－６からなる。一部の実施形態では、前記組成物は、細胞全体におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有するＨＳＣｓ細胞の割合が８％を超える、１０％を超える、１５％を超える、２０％を超える、２５％を超える、または３０％を超えることを維持し、例えば、細胞全体におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有するＨＳＣ細胞の割合が５％～３５％、１０％～３５％、１５％～３５％、２０％～３５％、２５％～３５％、５％～３０％、１０％～３０％、２０％～３０％、５％～２５％、１０％～２５％、１５％～２５％、２０％～２５％、５％～２０％、１０％～２０％、１５％～２０％であることを維持し、細胞全体におけるＣＤ３４＋細胞の割合が６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、または８５％を超えることを維持する。一部の実施形態では、培地における各阻害剤の濃度として、
ダサチニブ：０．１μＭ～５０μＭ、好ましくは０．５μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．５μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．５μＭ～１０μＭであり、
ＳＡＨＡ：１０ｎＭ～２０μＭ、好ましくは２０ｎＭ～１５μＭ、より好ましくは３０ｎＭ～１０μＭ、最も好ましくは０．１μＭ～１０μＭであり、
ＶＰＡ：１０μＭ～２０００μＭ、好ましくは１０μＭ～１５００μＭ、より好ましくは１０μＭ～１０００μＭ、最も好ましくは１００μＭ～１０００μＭであり、
ＥＰＺ００４７７７：０．１μＭ～５０μＭ、好ましくは０．５μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．５μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．５μＭ～１０μＭであり、
ＤＺＮｅＰ：１ｎＭ～５００ｎＭ、好ましくは５ｎＭ～４００ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ～３００ｎＭ、最も好ましくは１０ｎＭ～２５０ｎＭである。
一部の実施形態では、前記ＳＴＡＴ細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤がＳｒｃ標的の小分子阻害剤である。一部の実施形態では、前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤が、ダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、ケルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、ＵＭ－１６４、ＫＸ２－３９１及びＫＸ１－００４から選択される１つまたは複数である。一部の実施形態では、前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤が、ダサチニブ、ＵＭ－１６４、及びＫＸ１－００４から選択される１つまたは複数である。出願人の研究結果では、上記の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤はいずれも、インビトロ増殖時のＨＳＣｓの幹細胞性及びＣＤ３４＋細胞の割合を十分に維持することができ、これらの小分子阻害剤の組み合わせは、ＨＳＣｓの自己複製、乾細胞性維持などにおいて、従来技術で報告されている小分子と組み合わせる効果よりも優れている。
本願において、出願人の研究結果は、Ｓｒｃ阻害剤が、ＨＳＣのインビトロ増殖及び培養では、ＨＳＣｓの幹細胞性を十分に維持できることを発見し、そして、Ｓｒｃ阻害剤と組み合わせたＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＳＣのインビトロ増殖及び培養では、報告されている小分子阻害剤及びこれらの小分子阻害剤の単独使用の効果よりも優れていることを発見した。出願人の研究結果は、ＨＳＣｓのインビトロ増殖を実現するとともにＨＳＣｓの幹細胞性の高い割合を維持することができ、ＨＳＣｓの臨床応用の基礎を築くことができる。
上記の造血幹細胞の「幹細胞性」は、造血幹細胞の特徴の略称である。造血幹細胞（ＨＳＣｓ）は、自己複製能（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ）と多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）という２つの主要な細胞生物学的特性を示す。造血幹細胞のこれらの特性は「幹細胞性」（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）と略称する。造血幹細胞の細胞表面に発現する分子表現型は、ある程度「幹細胞性」を維持しているかどうかを反映することができる。例えば、造血幹細胞の表現型がＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－である場合、それがＬＴ－ＨＳＣｓであり、「幹細胞性」を維持していることを意味する。本願では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有する造血幹細胞はＬＴ－ＨＳＣｓとして定義され、造血幹細胞がＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有することは、造血幹細胞が造血幹細胞特性、すなわち、「幹細胞性」を維持または保持していると定義される。
細胞全体とは、最初のＣＤ３４＋細胞が培養された後のすべての後代細胞を指す。
本発明において、造血幹細胞は、Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤などのＳＴＡＴ細胞シグナル伝達経路を含む小分子阻害剤、またはＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤、ＰＫＣを標的とする小分子阻害剤、及びＪＮＫを標的とする小分子阻害剤などのその他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤とインビトロで接触することで、インビトロ増殖時のＨＳＣｓの幹細胞性及びＨＳＣｓ全体におけるＣＤ３４＋細胞の割合を十分に維持することができ、これらの小分子阻害剤の組み合わせは、ＨＳＣｓの自己複製、乾細胞性維持などにおいて、従来技術で報告されている小分子と組み合わせる効果よりも優れている。さらに、上記の小分子阻害剤で処理した後の細胞移植効率は、従来技術で報告されている小分子阻害剤で処理した後の細胞移植効率よりも有意に高い。
図１は、標的細胞集団ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋ＣＤ３８－細胞集団のロジックゲートとゲート位置の決定を示す図である。 図２は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子阻害剤の最適濃度と、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持できることに関する１回目のスクリーニングを行い、表４の小分子阻害剤（各小分子について４つの濃度をテストした）による誘導の６～７日後、フローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。図中、横軸は阻害剤の名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。 図３は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子阻害剤の最適濃度と、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持できることに関する２回目のスクリーニングを行い、表５の小分子阻害剤による誘導の６～７日後、フローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。図中、横軸は阻害剤の名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。 図４は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子阻害剤の最適濃度と、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持できることに関する３回目のスクリーニングを行い、表６の小分子阻害剤（ＳＡＨＡ－１μＭを除いて、各阻害剤について３つの濃度をテストした）による誘導の６～７日後、フローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。図中、横軸は阻害剤の名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。 図５は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子阻害剤の最適濃度と、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持できることに関する４回目のスクリーニングを行い、表７の小分子阻害剤（ＳＡＨＡ－１μＭを除いて、各阻害剤について３つの濃度をテストした）による誘導の６～７日後、フローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。図中、横軸は阻害剤の名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。 図６は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子阻害剤の最適濃度と、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持できることに関する５回目のスクリーニングを行い、表８の小分子阻害剤（ＳＡＨＡ－１μＭを除いて、各阻害剤について３つの濃度をテストした）による誘導の６～７日後、フローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。図中、横軸は阻害剤の名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。 図７は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子阻害剤の、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持するための最適な二分子の組み合わせの１回目のスクリーニングを行い、小分子の組み合わせＳＡＨＡ＋ＳＲ１、ＳＡＨＡ＋ＶＥ８２１、ＳＡＨＡ＋ＰＦＩ３、ＳＡＨＡ＋Ｓ－４－Ａによる誘導の６～７日後のフローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。図中、横軸は阻害剤の名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。 図８は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子阻害剤の、ＨＳＣの幹細胞性を維持するための最適な二分子の組み合わせの２回目のスクリーニングを行い、小分子の組み合わせＳＡＨＡ＋ＳＲ１、ＳＡＨＡ＋ＵＭ１７１、ＳＡＨＡ＋ＰＧＥ２、ＳＡＨＡ＋ＧＷ９６６２、ＳＡＨＡ＋ＦＬＵによる誘導の６～７日後のフローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。図中、横軸は阻害剤の名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。 図９は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子阻害剤の、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持するための最適な二分子の組み合わせの３回目のスクリーニングを行い、小分子の組み合わせＳＡＨＡ＋Ｂｕｔｙｒａｔｅ、ＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７、ＳＡＨＡ＋ＤＺＮｅＰ、ＳＡＨＡ＋Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ（ＳＡＨＡを除いて、各阻害剤について３つの濃度をテストした）による誘導の６～７日後のフローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。図中、横軸は阻害剤の名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。ＳはＳＡＨＡ（１μＭ）を表す。 図１０は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子阻害剤の、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持するための最適な二分子の組み合わせの４回目のスクリーニングを行い、小分子の組み合わせＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂ、ＳＡＨＡ＋ＳＧＣ０４９６、ＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ－８、ＳＡＨＡ＋Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ（ＬＹ３１７６１５）（ＳＡＨＡを除いて、各阻害剤について３つの濃度をテストした）による誘導の６～７日後のフローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。図中、横軸は阻害剤の名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。ＳはＳＡＨＡ（１μＭ）を表す。 図１１は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子阻害剤の、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持するための最適な二分子の組み合わせの５回目のスクリーニングを行い、小分子の組み合わせＳＡＨＡ＋ＶＰＡ、ＳＡＨＡ＋Ｇｏ６９８３、ＳＡＨＡ＋ＤＣＡ、ＳＡＨＡ＋ＧＳＫ２６０６４１４（ＳＡＨＡを除いて、各阻害剤について２～３つの濃度をテストした）による誘導の６～７日後のフローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。図中、横軸は阻害剤の名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。ＳはＳＡＨＡ（１μＭ）を表す。 図１２は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子阻害剤の、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持するための最適な三分子の組み合わせの１回目のスクリーニングを行い、小分子の組み合わせＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７＋ＤＺＮｅＰによる誘導の６～７日後のフローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。図中、横軸は阻害剤の名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。各群で３回繰り返し、＊は有意差があることを表す。 図１３は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子阻害剤の、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持するための最適な三分子の組み合わせの２回目のスクリーニングを行い、小分子の組み合わせＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂ＋ＥＰＺ００４７７７、ＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ－８＋ＥＰＺ００４７７７、ＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ－８＋ＤＺＮｅＰ、ＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ－８＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂ、ＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ－８＋ＥＰＺ００４７７７＋ＤＺＮｅＰによる誘導の６～７日後のフローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。図中、横軸は阻害剤の組み合わせの名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣの純度を表す。各群で３回繰り返し、＊は有意差があることを表す。 図１４は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子阻害剤の、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持するための最適な三分子の組み合わせの３回目のスクリーニングを行い、小分子の組み合わせＳＡＨＡ＋ＶＰＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂによる誘導の６～７日後のフローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。図中、横軸は阻害剤の組み合わせの名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。各群で３回繰り返し、＊は有意差があることを表す。 図１５は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上で行われるスクリーニングされた小分子阻害剤と文献で報告されている小分子阻害剤ＳＲ１、ＵＭ１７１との比較を示す図であり、小分子阻害剤による誘導の６～７日後のフローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図である。図中、横軸は阻害剤の組み合わせの名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。各群で３回繰り返し、＊は有意差があることを表す。 図１６は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上のスクリーニングされた小分子阻害剤と文献で報告されている小分子阻害剤ＳＲ１、ＵＭ１７１のインビトロクローン形成能の分析図を示す。ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＧＥＭＭは、赤血球、骨髄、リンパ球などのさまざまな血液系のクローンを表す。その中で、横軸は阻害剤の組み合わせの名前及び使用濃度を表し、縦軸のコロニー数（ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｎｕｍｂｅｒ）はクローンの総数を表し、ＧＥＭＭのコロニー数（ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｎｕｍｂｅｒ оｆ ＧＥＭＭ）はＣＦＵ－ＧＥＭＭクローンの数を表す。各群で３回繰り返し、＊は有意差があることを表す。ＳはＳＡＨＡ（１μＭ）を表す。 図１７は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子阻害剤の最適濃度と、ＨＳＣの幹細胞性を維持できることに関するスクリーニングを行い、表９の小分子阻害剤（ＳＡＨＡ－１μＭを除いて、各阻害剤について３つの濃度をテストした）による誘導の６～７日後、フローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。なお、横軸は阻害剤の名称及び使用濃度を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。 図１８Ａ及び１８Ｃは、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子Ｍｏｃｋ（ＤＭＳＯ）、ＳＲ１（５μＭ）、ＵＭ１７１（３５０ｎＭ）、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ（５０ｎＭ）による処理の８日後、フローサイトメトリーで検出されたＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現解析図を示す。図中、横軸は阻害剤の名称を表し、縦軸のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－（％）は、細胞全体におけるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を表し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（％）はＨＳＣｓの純度を表す。図１８Ｂ及び１８Ｄは、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子Ｍｏｃｋ（ＤＭＳＯ）、ＳＲ１（５μＭ）、ＵＭ１７１（３５０ｎＭ）、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ（５０ｎＭ）による処理の８日後の、ＬＴ－ＨＳＣｓ及びＣＤ３４＋細胞増殖の絶対数を示す図である。図中、横軸は阻害剤の名称を表し、縦軸は細胞の数を表す。 図１９は、ｈＣＤ４５＋及びｍＣＤ４５＋細胞集団のロジックゲート及びゲート位置の決定を示す図である。図中、ＮＣは抗体を添加しなかった対照を表し、３３は抗体を添加した３３番のサンプルを表し、ｈＣＤ４５はヒトＣＤ４５＋細胞を表し、ｍＣＤ４５はマウスＣＤ４５＋細胞を表す。 図２０は、ｈＣＤ４５＋、ｈＣＤ３＋、ｈＣＤ３３＋、ｈＣＤ５６＋、ｈＣＤ１９＋及びｍＣＤ４５＋細胞集団のロジックゲート及びゲート位置の決定を示す図である。図中、ｈＣＤ３＋はヒトＣＤ３＋細胞を表し、Ｔリンパ球の表面マーカーである。ｈＣＤ３３＋は、ヒトＣＤ３３＋細胞を表し、骨髄系細胞の表面マーカーである。ｈＣＤ５６＋は、ヒトＣＤ５６＋細胞を表し、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の表面マーカーである。ｈＣＤ１９＋はヒトＣＤ１９＋細胞を表し、Ｂリンパ球の表面マーカーである。ｍＣＤ４５は、マウスＣＤ４５＋細胞を表す。 図２１は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子Ｍｏｃｋ（ＤＭＳＯ）、ＳＲ１（５μＭ）、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ（５０ｎＭ）による処理の７日後、すべての細胞を収集してマウスの体内に移植し、移植後４週目、８週目、１２週目及び１６週目にフローサイトメトリーで検出されたマウスの末梢血中のヒトＣＤ４５細胞の割合、移植後１６週目にフローサイトメトリーで検出されたマウス骨髄及び脾臓におけるヒトＣＤ４５細胞の割合を示す図である。図２１Ａの横軸は、阻害剤の名称及び移植時間を表し、縦軸のｈＣＤ４５－ＰＢ（％）は、マウスの末梢血で検出されたヒトＣＤ４５＋細胞の割合を表す。ＰＢは末梢血（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ）を表し、ｈＣＤ４５はヒトＣＤ４５＋細胞を表す。図２１Ｂの横軸は阻害剤の名称を表し、縦軸のｈＣＤ４５－ＢＭ（％）は、マウスの骨髄で検出されたヒトＣＤ４５＋細胞の割合を表す。ＢＭは骨髄（Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ）を表し、ｈＣＤ４５はヒトＣＤ４５＋細胞を表す。図２１Ｃの横軸は阻害剤の名称を表し、縦軸のｈＣＤ４５－ＳＰ（％）は、マウスの脾臓で検出されたヒトＣＤ４５＋細胞の割合を表す。ＳＰは脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）を表し、ｈＣＤ４５はヒトＣＤ４５＋細胞を表す。 図２２は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上の小分子Ｍｏｃｋ（ＤＭＳＯ）、ＳＲ１（５μＭ）、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ（５０ｎＭ）による処理の７日後、すべての細胞を収集してマウスの体内に移植し、移植後１６週目にフローサイトメトリーで検出されたマウスの末梢血、骨髄、脾臓中のヒトｈＣＤ３＋、ｈＣＤ３３＋、ｈＣＤ５６＋、ｈＣＤ１９＋細胞（それぞれヒトＴリンパ球（Ｔ）、骨髄系細胞（Ｍｙ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、Ｂリンパ球（Ｂ）を表す）の割合を示す図である。図中、横軸は阻害剤の名称を表し、図２２Ａの縦軸は、末梢血中の異なる系譜細胞のｈＣＤ４５＋細胞に占める割合を表す。図２２Ｂの縦座標は、骨髄内の異なる系譜細胞のｈＣＤ４５＋細胞に占める割合を表す。図２２Ｃの縦座標は、脾臓内の異なる系譜細胞のｈＣＤ４５＋細胞に占める割合を表す。
実施例１：後続の小分子スクリーニングのための臍帯血からのＣＤ３４＋ＨＳＣｓ選別
試薬Ｈ－ｌｙｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ（１ｘ）溶液及びＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（１ｘ）溶液を準備した。５ｍｌのＨ－ｌｙｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ １０ｘストック溶液（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号：ＷＬ１０００）を取り、４５ｍｌの脱イオン水（Ｅｄｉｇｅｎｅ、０．２２μｍフィルターメンブレンでろ過）を加え、均一に混合してＨ－ｌｙｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ（１ｘ）溶液を調製した。５ｍｌのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １０ｘストック溶液（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号：ＷＬ１０００）を取り、４５ｍｌの脱イオン水を加えて均一に混合し、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（１ｘ）溶液を調製した。
１０ｍｌの臍帯血（Ｅｄｉｇｅｎｅ）に、最終容量が３０ｍｌになるまで生理食塩水を注入した。この希釈した血液にヒトリンパ球分離液（Ｄａｋｅｗｅ、カタログ番号：ＤＫＷ－ＫＬＳＨ－０１００）を加え、４００ｇで３０分間遠心分離（スピードアップ３、スピードダウン０に設定）し、バフィーコートを吸引し、５００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを５０ｍｌの遠心チューブに集め、１０ｍｌのＨ－ｌｙｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ（１ｘ）を加え、室温で１０分間赤血球を溶解した。次に、１０ｍｌのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（１ｘ）を加えて溶解反応を停止し、生理食塩水を加えて最終容量を５０ｍｌにした。上記の５０ｍｌ遠心分離チューブを高速遠心分離機に移し、５００ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を５０ｍｌの生理食塩水（１％ＨＳＡ）で再懸濁し、均一に混合し、２０μＬの細胞懸濁液を取り、セルカウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、モデル：Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２）でカウントし、遠心分離チューブを高速遠心分離機に移し、５００ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、カウント結果に応じて、対応する体積の磁気ビーズ（１００ｕｌ ＦｃＲ／１＊１０＾８細胞及び１００ｕｌ ＣＤ３４ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ／１＊１０＾８細胞）を加えた。操作は次のとおりであった。まず、ＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号：１３０－１００－４５３、試薬の量は細胞数の結果に応じて決定した）を加えて細胞を再懸濁し、事前に均一に混合したＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ、ｈｕｍａｎ：ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、カタログ番号：１３０－１００－４５３）を加えて均一に混合し、４℃冷蔵庫で３０分間インキュベートした。生理食塩水（１％ＨＳＡ）を遠心分離チューブに加えて最終容量を５０ｍｌにし、高速遠心分離機に移し、５００ｇで１０分間遠心分離した。磁気分離器（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、モデル：１３０－０４２－１０２）及び磁気スタンド（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、モデル：１３０－０４２－３０３）を準備し、磁気分離器を適切な高さに調整して、ＭＳカラム（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、カタログ番号：１３０－０４２－２０１）またはＬＳカラム（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、カタログ番号：１３０－０４２－４０１）を入れ（選択するカラムのタイプは、細胞の量に応じて決定された。詳細については関連する製品の説明を参照されたい）、１５ｍｌの遠心チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号：４３０７９１）を下に置いて非標的細胞懸濁液を収集し、ＭＳカラムまたはＬＳカラムを１ｍｌ（ＭＳカラム）または３ｍｌ（ＬＳカラム）生理食塩水（１％ＨＳＡ）ですすいだ。上記高速遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ、モデル：ＳＴ４０）の遠心分離チューブで遠心分離した後、上清を捨て、細胞を１ｍｌ（ＭＳカラム）または３ｍｌ（ＬＳカラム）の生理食塩水（１％ＨＳＡ）で再懸濁し、細胞懸濁液を各選別カラムに加えた（選別カラムの量は、臍帯血の数と細胞の量に応じて決定された）。さらに、遠心分離チューブを１ｍｌ（ＭＳカラム）または３ｍｌ（ＬＳカラム）の生理食塩水（１％ＨＳＡ）で洗浄し、洗浄液をカラムに加えた。
ＭＳカラムまたはＬＳカラムを１ｍｌ（ＭＳカラム）または３ｍｌ（ＬＳカラム）の生理食塩水（１％ＨＳＡ）で洗浄した。３回繰り返した。選別カラムを新しい１５ｍｌ遠心チューブの上部に移し、２ｍｌ（ＭＳカラム）または３ｍｌ（ＬＳカラム）の生理食塩水（１％ＨＳＡ）を加えて標的細胞を溶出し、１ｍｌ（ＭＳカラム）または２ｍｌ（ＬＳカラム）生理食塩水（１％ＨＳＡ）で標的細胞を１回繰り返し溶出した。２０μＬの細胞懸濁液を取ってセルカウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、モデル：Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２）でカウントし、残りの細胞懸濁液を４００ｇで５分間遠心分離した。上清を不完全に廃棄し、１ｍｌの上清を残して細胞を再懸濁した。新しいＭＳカラムを取り、１ｍｌの生理食塩水（１％ＨＳＡ）を加えてすすぎ、再懸濁した細胞の細胞懸濁液をＭＳカラムに移し、上記の洗浄及び溶出の手順を繰り返し、３ｍｌの標的細胞懸濁液を取得した。２０μＬの細胞懸濁液を取り、セルカウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、モデル：Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２）でカウントし、細胞密度及び細胞懸濁液の容量に応じて細胞の総数を計算し、残りの細胞懸濁液を４００ｇで５分間遠心分離し、後で使用するために上清を廃棄した。
実施例２：小分子阻害剤の濃度テスト及びスクリーニング
小分子阻害剤の説明書に示された溶解度及び必要な溶媒（小分子阻害剤のカタログ番号については表１を参照）に従って、小分子阻害剤ストック溶液の調製を行った。次に、基礎培地：ＳＦＥＭＩＩ培地（幹細胞、カタログ番号：０９６５５）＋５０ｎｇ／ｍｌ成長因子Ｆｌｔ－３Ｌ（ＰｅＰｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号：３００－１００ＵＧ）＋５０ｎｇ／ｍｌ成長因子ＳＣＦ（ＰｅＰｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号：３００－０７－１００ＵＧ）＋５０ｎｇ／ｍｌ成長因子ＴＰＯ（ＰｅＰｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号：３００－１８－１００ＵＧ）＋１０ｎｇ／ｍｌ成長因子ＩＬ－６（ＰｅＰｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号：２００－０６－２０ＵＧ）＋１％二重抗体（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号：ｓｖ３００１０）を調製した。小分子阻害剤の設定濃度勾配に従って、ストック溶液及び基礎培地を使用して、異なる濃度の小分子阻害剤を含む培地を調製した。
まず、調製した培地を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号：３４７３）にウェルあたり９５０μｌ加え、二酸化炭素インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ、モデル：３１１１）に入れて予熱した。実施例１で調製したＨＳＣｓをＳＦＥＭＩＩ＋５０ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ－３Ｌ＋５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ＋５０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６＋１％二重抗体で再懸濁し、ウェルあたり５０μｌの細胞懸濁液、ウェルあたりの細胞密度が２＊１０＾５／ｍｌで、加えた培地の容量を計算した。例えば、ウェルあたりの細胞培養液の最終容量は１ｍｌであると、ウェルあたりの細胞密度によって計算した結果、各ウェルの細胞の総数は２＊１０＾５細胞であり、各ウェルに添加される５０μｌ細胞懸濁液の密度は４＊１０＾６／ｍｌであり、実施例１で調製したＨＳＣｓの密度を、計算した細胞懸濁液の密度に調整し、添加を行った。インキュベーターから予熱した培地を取り出し、５０μｌ細胞懸濁液を各ウェルに加え、均一に混合した後、顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ、モデル：ＣＫＸ５３）で細胞の状態を観察してから、培養のためにインンキュベーターに入れた。
Figure 2023507486000001
Figure 2023507486000002
実施例３：フローサイトメトリーによるＨＳＣの幹細胞性及びＣＤ３４＋の維持の検出
本実施例で使用されている抗体及びその由来については、表２を参照されたい。
Figure 2023507486000003
上記の実施例２で６～７日間（Ｄ６～Ｄ７）培養した細胞２０μｌをサンプリングしてカウントし、カウント結果に応じて２＊１０＾５細胞の懸濁液を取り出して１．５ｍｌの遠心分離チューブに入れた。４００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。１％ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン、広東省双林、カタログ番号：Ｓ１０９７００６９）を含む１００μｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号：ＳＨ３０２５６．０１）を取り、細胞を再懸濁し、ボルテックスして均一に混合し、後の使用のために置いた。次に、対照細胞サンプルを収集した。細胞数及び収集方法は、テストするサンプル細胞と同じ操作であった。対照はそれぞれＮＣ群とＩＳＯ群として設定され、細胞は、細胞の数に応じて、このバッチの実験でテストするサンプルのいずれか１つまたは混合細胞として選択された。同じバッチの実験では、各対照群は繰り返し検出されなかった。群の設定については、表３を参照されたい。
Figure 2023507486000004
上記の表３によれば、テストされる上記の細胞サンプル及び対照細胞サンプルの細胞懸濁液に、群に対応して抗体を添加した。ボルテックスして均一に混合し、室温で光を避けて１５分間インキュベートした。１５分間のインキュベーション後、１％ＨＳＡを含む１ｍｌのＰＢＳを各実験サンプルに添加し、均一に混合し、４００ｇで５分間室温で遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄し、各実験サンプルについて１％ＨＳＡを含む１００μｌのＰＢＳで細胞を再懸濁した。テストの前に、サンプルを光を避けて室温で保存した。フローサイトメトリーを使用して検出した。
検出結果は次の方法に従って分析した。１）標的細胞集団はＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋ＣＤ３８－細胞集団であった。２）ロジックゲート及びゲート位置の決定は図１に示されている。まず細胞集団を囲み、Ｐ１ゲートとした。Ｐ１ゲートに由来の細胞集団は、付着細胞を除去しＰ２ゲートとした。Ｐ２ゲートに由来の細胞集団は、ＮＣまたはＩＳＯによってＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞集団を囲み、Ｑ３－ＬＬゲート（ＣＤ３４－／ＣＤ４５－）、Ｑ５－ＵＬ＋Ｑ５－ＬＬゲート（ＣＤ４５ＲＡ－）とした。ＦＭＯ９０はＣＤ９０陰性細胞集団を囲み、Ｑ５－ＬＬ＋Ｑ５－ＬＲゲートとした。ＦＭＯ３８はＤ３８陰性細胞集団を囲み、Ｑ６－ＬＲゲートとした。ＮＣ、ＩＳＯ、及びＦＭＯによって囲まれたゲートを使用して、Ｑ３－ＵＲ－Ｑ５－ＵＬ－Ｑ６－ＬＲゲートによって囲まれた細胞が、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋ＣＤ３８－標的細胞であると決定した。
実施例４：単一分子スクリーニング
実施例１で選別された臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞に対して、小分子阻害剤の最適濃度及びＨＳＣｓの幹細胞性を維持できることに関するスクリーニングを、実施例２と同じ方法で行い、小分子による誘導の６～７日後、長期造血幹細胞（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＬＴ－ＨＳＣ）の細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現は、実施例３と同じ方法でフローサイトメトリーによって検出した。
本実施例では、合計５回のスクリーニングを実施し、毎回のスクリーニングの阻害剤及び試験濃度を表４、表５、表６、表７、及び表８に示し、結果をそれぞれ図２から６に示す。
図２の結果は、ＳＡＨＡがＬＴ－ＨＳＣの割合を高める点で、表４の他の阻害剤よりも有意に優れており、その効果が他の阻害剤の２～２０倍であることを示している。ＳＡＨＡが５μＭの場合、顕微鏡下で観察した細胞状態が悪く、細胞計数と比較して増殖が悪かったため、その後のスクリーニングのために１μＭの濃度を選択した。ＳＡＨＡ（１μＭ）は、ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点で、対照群（Ｍｏｃｋ、０．０１％ＤＭＳＯ）よりもわずかに優れている。
図３の結果は、表５の既知の文献（Ｆａｒｅｓ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４；Ｅｖａｎｓ Ｔ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９；Ｂｏｉｔａｎｏ Ａ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０；Ｇｕｏ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１８；Ｇｕｏ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１７）によって報告された小分子阻害剤ＵＭ１７１、ＰＧＥ２、ＳＲ１、ＧＷ９６６２及びＦＬＵと比較して、ＨＳＣｓの幹細胞性の維持の点で、ＳＡＨＡの効果は、報告された小分子の１０～２０倍であり、ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点では、ＳＡＨＡとＳＲ１との間に有意差はないが、ＵＭ１７１、ＰＧＥ２、ＧＷ９６６２、及びＦＬＵよりも有意に優れていることを示している。
図４の結果は、ＳＡＨＡがＨＳＣｓの幹細胞性を維持する点で、表６の他の阻害剤よりも約２～１５倍高いことを示している。一方、ＳＡＨＡは、ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点で他の阻害剤よりも優れていることをも示している。
図５の結果は、ＳＡＨＡがＨＳＣｓの幹細胞性を維持する点で、表７の他の阻害剤よりも有意に優れており、他の阻害剤の１～１２倍であり、そして、低濃度のエンザスタウリンを使用する場合、ＬＴ－ＨＳＣｓの割合が他の阻害剤（ＳＡＨＡを除く）の３～１０倍高いことを示している。ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点では、ＪＮＫ－ＩＮ－８はＣＤ３４＋細胞の割合を約９０％に維持することができる。ＪＮＫ－ＩＮ－８を除き、ＳＡＨＡとダサチニブは、他の阻害剤よりもわずかに優れている。
図６の結果は、ＬＴ－ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する点で、表８のバルプロ酸（ＶＰＡ）が他の小分子よりも有意に高く、約３０倍高く、ＳＡＨＡよりも約１倍高いことを示している。ＳＡＨＡは他の小分子（ＶＰＡを除く）の１５倍である。ＳＡＨＡとＶＰＡは、ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点で他の小分子よりも優れている。
以上によって、本実施例では、ＬＴ－ＨＳＣｓの幹細胞性及びＣＤ３４＋細胞の高い割合を維持できる小分子合計５つをスクリーニングして得た。これらは、ＨＤＡＣを標的とするＶＰＡ及びＳＡＨＡ、Ｓｒｃを標的とするＤａｓａｔｉｎｉｂ、ＰＫＣを標的とするエンザスタウリン、ＪＮＫを標的とするＪＮＫ－ＩＮ－８である。
Figure 2023507486000005
Figure 2023507486000006
Figure 2023507486000007
Figure 2023507486000008
Figure 2023507486000009
実施例５：二分子組み合わせのスクリーニング
実施例１で選別された臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞に対して、小分子阻害剤の、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持するための最適な二分子の組み合わせのスクリーニングを実施例２と同じ方法で行い、小分子組み合わせによる誘導の６～７日後、ＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現を、実施例３と同じ方法でフローサイトメトリーによって検出した。
上記の実施例４に従ってスクリーニングしたＨＳＣｓの幹細胞性を有意に維持できる小分子ＳＡＨＡを他の阻害剤と組み合わせた。具体的な組み合わせ及びその濃度を関連図に示す。結果をそれぞれ図７～１１に示す。
図７の結果から明らかに、ＨＳＣｓの幹細胞性の維持及びＣＤ３４＋細胞の割合の点で、ＳＡＨＡと、表４の４つの造血幹細胞の増幅に関連する細胞シグナル伝達経路に作用する阻害剤との組み合わせ、すなわちＳＡＨＡ＋ＳＲ１、ＳＡＨＡ＋ＶＥ８２１、ＳＡＨＡ＋ＰＦＩ－３、及びＳＡＨＡ＋Ｓ－４－Ａは、ＳＡＨＡの単独使用よりも有意に優れていない。
図８の結果から明らかに、前述の文献で報告された阻害剤、すなわち表５の阻害剤ＳＲ１、ＵＭ１７１、ＰＧＥ２、ＧＷ９６６２、及びＦＬＵの単独使用は、ＨＳＣｓの幹細胞性の維持の点で、ＳＡＨＡの単独使用よりもはるかに効果が低く、ＳＡＨＡとの組み合わせもＳＡＨＡの単独使用よりも効果が低い。また、ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点で、ＳＡＨＡの単独使用は、これらの阻害剤とＳＡＨＡとの組み合わせの使用と比較して有意差はない。
図９の結果から明らかに、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する点で、ＳＡＨＡと表６のＢｕｔｙｒａｔｅとの組み合わせでは、低濃度のＢｕｔｙｒａｔｅの使用効果はＳＡＨＡの単独使用の効果には及ばず、高濃度のＢｕｔｙｒａｔｅの使用効果はＳＡＨＡの単独使用の効果よりも優れているが、高濃度の条件下では、Ｂｕｔｙｒａｔｅは細胞に対する毒性が大きい。さらに、実施例４で得られた結果は、Ｂｕｔｙｒａｔｅの単独使用の効果がＳＡＨＡの単独使用の効果には及ばず、それがＳＡＨＡと同じ標的阻害剤であるため、その後、Ｂｕｔｙｒａｔｅについてはさらなる研究を行わなかった。ＳＡＨＡは表６のＥＰＺ００４７７７及びＤＺＮｅＰとそれぞれ組み合わされており、ＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７及びＳＡＨＡ＋ＤＺＮｅＰの組み合わせはＳＡＨＡの単独使用よりも優れている。これらの二分子の組み合わせは、ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点でＳＡＨＡの単独使用と有意差はなかった。したがって、ＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７及びＳＡＨＡ＋ＤＺＮｅＰの組み合わせは、ＨＳＣｓの幹細胞性及びＣＤ３４＋細胞の割合を十分に維持できるからスクリーニングされた。
図１０の結果から明らかに、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する点で、ＳＡＨＡと表７の４つの小分子阻害剤とそれぞれ組み合わせて、ＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂの組み合わせ及びＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ－８の組み合わせの効果は、ＳＡＨＡの単独使用の効果の３倍であり、Ｍｏｃｋ群の３０倍であった。ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点で、ＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂの組み合わせ及びＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ－８の組み合わせは、ＳＡＨＡの単独使用と有意差はなく、Ｍｏｃｋ群よりも５％～１０％高かった。単一分子スクリーニングでは、ＬＴ－ＨＳＣｓの幹細胞性をよく維持できる小分子ＥｎｚａｓｔａｕｒｉｎとＳＡＨＡの組み合わせは、ＳＡＨＡの単独使用よりも効果がはるかに低く、その後、ＥｎｚａｓｔａｕｒｉｎとＳＡＨＡの組み合わせについてはさらなる研究を行わなかった。したがって、ＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂ及びＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ－８の組み合わせは、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する点、及びＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点では効果がよいため、スクリーニングされた。
図１１の結果から明らかに、ＳＡＨＡと表８のＶＰＡとの組み合わせは、乾細胞性を維持する点で、ＳＡＨＡ＋ＶＰＡの組み合わせはＳＡＨＡの単独使用よりも効果が約２～４倍高く、Ｍｏｃｋ群よりも２０倍高かった。ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点では、ＳＡＨＡ＋ＶＰＡの組み合わせは、ＳＡＨＡの単独使用とは有意差がなく、Ｍｏｃｋ群よりも１０％～２０％高かった。
以上によって、二分子スクリーニングでは、ＬＴ－ＨＳＣｓの幹細胞性及びＣＤ３４＋細胞の割合を維持できる組み合わせとしては、ＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂ、ＳＡＨＡ＋ＤＺＮｅＰ、ＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７、ＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ－８、ＳＡＨＡ＋ＶＰＡがスクリーニングされた。
実施例６：三分子組み合わせのスクリーニング
実施例１で選別された臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上に対して、小分子阻害剤のＨＳＣｓの幹細胞性を維持するための最適な三分子の組み合わせのスクリーニングを実施例２と同じ方法で行い、小分子組み合わせによる誘導の６～７日後、ＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現を、実施例３と同じ方法でフローサイトメトリーによって検出した。
（１）実施例５でスクリーニングしたＨＳＣｓの幹細胞性を維持できる組み合わせのＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７及びＳＡＨＡ＋ＤＺＮｅＰを、三分子の組み合わせし、その結果を図１２に示す。
図１２の結果から明らかに、ＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７＋ＤＺＮｅＰの三分子の組み合わせは、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する点でＭｏｃｋ群よりも効果が約２０倍高く、ＳＡＨＡの単独使用及びＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７の二分子の組み合わせよりも約２倍高く、ＳＡＨＡ＋ＤＺＮｅＰの二分子の組み合わせよりやや高かった。ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点では、三分子の組み合わせ及び二分子の組み合わせは、Ｍｏｃｋ群と有意差があり、ＣＤ３４＋細胞の割合はいずれも約８０％であった。
（２）実施例５でスクリーニングしたＨＳＣｓの幹細胞性を維持できる組み合わせのＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７、ＳＡＨＡ＋ＤＺＮｅＰ、ＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ－８、ＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂを三分子の組み合わせし、結果をそれぞれ図１３及び図１４に示す。
図１３の結果から明らかに、ＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ８の組み合わせは、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する点で、効果がＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂに及ばず、その後はＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ８についてはさらなる研究は行わなかった。ＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂ＋ＥＰＺ００４７７７は、ＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂとは有意差がなく、他の三分子の組み合わせは、ＬＴ－ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する点でＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂには効果が及ばなかった。ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点で、ＳＡＨＡ＋ＤａｓａｔｉｎｉｂはＣＤ３４＋細胞の割合を約８０％維持した。
図１４の結果から明らかに、実施例５でスクリーニングしたＨＳＣｓの幹細胞性を維持できる二分子の組み合わせであるＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂ及びＳＡＨＡ＋ＶＰＡを組み合わせ直した。ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する点で、ＳＡＨＡ＋ＶＰＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂの三分子の組み合わせの効果は、Ｍｏｃｋ群の５０倍であり、二分子の組み合わせの１．５～２倍であった。ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点では、ＳＡＨＡ＋ＶＰＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂの三分子の組み合わせは、Ｍｏｃｋ群よりも２０％高かった。
以上によって、三分子の組み合わせのほとんどは、ＬＴ－ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する点で二分子の組み合わせＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂには効果が及ばず、三分子の組み合わせの中で効果が最も良いのは、ＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７＋ＤＺＮｅＰ、ＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂ＋ＶＰＡである。
実施例７：スクリーニングされた阻害剤ＳＡＨＡ、ＶＰＡ、Ｄａｓａｔｉｎｉｂと、文献で報告された阻害剤ＵＭ１７１、ＳＲ１の単独使用及び組み合わせの使用の比較
実施例１で選別された臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上で、スクリーニングされた阻害剤のＳＡＨＡ、ＶＰＡ、Ｄａｓａｔｉｎｉｂと、文献（Ｆａｒｅｓ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４；Ｂｏｉｔａｎｏ Ａ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０；）で報告された阻害剤のＵＭ１７１、ＳＲ１の単独使用及び組み合わせの使用の比較を実施例２と同じ方法で行った。小分子阻害剤による誘導の６～７日後、ＬＴ－ＨＳＣ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現を、実施例３と同じ方法でフローサイトメトリーによって検出し、その結果を図１５に示す。
図１５の結果から明らかに、小分子を単独で使用した場合、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する点で、ＳＡＨＡ及びＶＰＡは、ＳＲ１及びＵＭ１７１よりも２～５倍高かった。二分子の組み合わせでは、ＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂ及びＶＰＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂは、ＳＡＨＡ＋ＳＲ１及びＳＡＨＡ＋ＵＭ１７１より１．５～２倍高かった。三分子の組み合わせのＳＡＨＡ＋ＤＺＮｅＰ＋ＥＰＺ００４７７７は、ＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂ及びＶＰＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂよりもわずかに低かった。ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点では、単一分子のＳＡＨＡ、ＶＰＡは、二分子の組み合わせのＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂ、ＶＰＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂとの間に有意差がなく、ＣＤ３４＋細胞の割合はいずれも約８０％維持された。
以上によって、ＬＴ－ＨＳＣｓの幹細胞性及びＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点では、ＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂ及びＶＰＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂの二分子の組み合わせは、小分子の単独使用、二分子の組み合わせのＳＡＨＡ＋ＳＲ１及びＳＡＨＡ＋ＵＭ１７１、ならびに三分子の組み合わせのＳＡＨＡ＋ＤＺＮｅＰ＋ＥＰＺ００４７７７よりも効果が優れた。
実施例８：ＣＤ３４＋造血幹細胞コロニーの形成培養
本実施例では、コロニー形成単位（Ｃｏｌｏｎｙ－Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ，ＣＦＵ）を使用して、小分子阻害剤によって誘導された臍帯血由来の造血幹細胞のインビトロ機能について、定性的及び定量的検出を行い、それらのインビトロ分化能を検証した。
まず、１００ｍＬのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）Ｈ４０３４ Ｏｐｔｉｍｕｍ（幹細胞、カタログ番号：０４０３４）を分注し、次に２～８℃で一晩解凍した。１～２分間激しく振ってから、気泡が液面に上がるまで１０分間静置した。５０ｍＬシリンジニードルを５ｍＬディスポーザブルシリンジにしっかりと取り付けた後、培地を１ｍＬに吸引し、シリンジから完全に押し出してシリンジ内のガスを排出し、３ｍＬの培地を新たに吸引して各１５ｍＬ遠心チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号：４３０７９１）に分注した。繰り返して凍結・解凍することなく、２～８℃で１ヶ月間保存し、－２０℃で長期保存した。
３ｍＬの培地ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）Ｈ４０３４ Ｏｐｔｉｍｕｍを準備し、室温（１５～２５°Ｃ）または２～８°Ｃで一晩解凍した。
細胞播種を行った。小分子阻害剤の誘導後に７日間培養した細胞（小分子阻害剤による誘導後の臍帯血由来のＣＤ３４＋造血幹細胞）の懸濁液を取って細胞をカウントし、カウント結果によって１００倍の播種密度の細胞懸濁液を吸引し（例えば、播種密度は１００細胞／ウェル／３ｍｌの場合、１０，０００細胞を収集する必要がある）、１ｍｌの２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１６０００－０４４）－ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１２４４０－０５３）培地に加え、均一に混合しておいた。上記の細胞を均一に混合した後、５０μｌの細胞懸濁液を吸引して０．５ｍＬのＩＭＤＭ（２％ＦＢＳ）に加えて細胞を再懸濁し（細胞懸濁液の１０倍希釈に相当）、均一に混合した後、１００μｌの細胞懸濁液（１００細胞）を３ｍＬのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）Ｈ４０３４ Ｏｐｔｉｍｕｍに添加した。少なくとも４秒間ボルテックスしてから、泡が液面に上がるまで１０分間静置した。３ｃｃシリンジ（幹細胞、カタログ番号：２８２４０）を平滑末端針１６ゲージ（幹細胞、カタログ番号：２８１１０）と組み合わせて使用し、得られた細胞懸濁液を１ｍＬまで吸引し、シリンジからすべて押し出してシリンジ内のガスを排出し、得られたすべての細胞懸濁液を再吸引し、３ｍＬをＳｍｓｒｔＤｉｓｈＴＭ－６（幹細胞、カタログ番号：２７３７０、６ウェルプレート）の１つのウェルに注入し、細胞懸濁液がウェルの底を均一に覆うように６ウェルプレートをゆっくりと傾けた。上記のようにすべての細胞を播種した後、培地が乾燥するのを防ぐために、３ｍｌの滅菌ＰＢＳを６ウェルプレートの各ウェルの隙間に加えた。６ウェルプレートに蓋をしてから、二酸化炭素インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ、モデル：３１１１）に入れて、３７°Ｃ、５％ＣＯ２、９５％相対湿度で、１４日間培養した。
培養７日目と１４日目にコロニーを観察し、培養１４日後にＳＴＥＭｇｒｉｄＴＭ－６カウントグリッド（幹細胞、カタログ番号：２７０００）でコロニーをカウントした。コロニーの判定基準は次のとおりである（異なる分類のコロニーは、ＨＳＣｓのコロニー形成能、及び幹細胞性の維持能力を反映することができる）。
ＣＦＵ－ＧＥＭＭ（ＣＦＵ－Ｇ、ＣＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＭＭ）：顆粒球－赤血球－マクロファージ－巨核球コロニー形成単位。各コロニーには赤血球と２０個以上の非赤血球（顆粒球、マクロファージ及び／または巨核球）が含まれ、通常はコロニーの中央に赤血球があり、非赤血球に囲まれ、非赤血球は赤血球の片側に集中することもある。ＣＦＵ－ＧＥＭＭのコロニーは、一般的にＣＦＵ－ＧＭまたはＢＦＵ－Ｅのコロニーよりも大きい。ほとんどの細胞サンプルでは比較的にまれである（通常、全コロニーの１０％を占める）。
ＣＦＵ－ＧＭ：２０を超える顆粒球（ＣＦＵ－Ｇ）及び／またはマクロファージ（ＣＦＵ－Ｍ）を含むコロニー。赤や茶色に見えずに、コロニー内の個々の細胞は、特にコロニーの周縁で区別できることが多く、大きなコロニーには１つ以上の密集した暗い核がある場合がある。エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、コロニーの成長と分化には必要ない。
ＢＦＵ－Ｅ：バースト赤血球コロニー形成単位。単一または複数の細胞クラスターのコロニーを形成し、各コロニーには２００を超える成熟赤血球が含まれる。細胞がヘモグロビン化されると、赤または茶色に見え、各クラスター内の個々の細胞を区別することが困難である。ＢＦＵ－Ｅは、より未成熟な前駆細胞であり、その成長には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びその他のサイトカイン、特にインターロイキン３（ＩＬ－３）及び幹細胞因子（ＳＣＦ）は、コロニーの最適な成長を促進するために必要である。
ＣＦＵ－Ｅ：赤血球コロニー形成単位。８～２００個の赤血球を含む１～２個の細胞クラスターを形成できる。細胞がヘモグロビン化されると、赤または茶色に見え、コロニー内の個々の細胞を区別することは困難である。ＣＦＵ－Ｅは成熟した赤血球系の前駆細胞であり、それらの分化を促進するためにエリスロポエチン（ＥＰＯ）が必要である。
実施例９：スクリーニングされた阻害剤ＳＡＨＡ、ＶＰＡ、Ｄａｓａｔｉｎｉｂと、文献で報告された阻害剤ＵＭ１７１、ＳＲ１の単独使用及び組み合わせの使用のインビトロクローン形成能の比較
実施例１で選別された臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上で、スクリーニングされた阻害剤のＳＡＨＡ、ＶＰＡ、Ｄａｓａｔｉｎｉｂと、文献で報告された阻害剤のＵＭ１７１、ＳＲ１の単独使用及び組み合わせの使用のインビトロクローン形成能の比較を行った。小分子阻害剤により細胞を処理し、７日後、インビトロクローン（ＣＦＵ）の形成を実施例８と同じ方法で検出し、細胞播種の１４日後にクローン数をカウントし、ＣＦＵ－ＧＥＭＭを分析した。その結果を図１６に示す。その中で、ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＧＥＭＭは、赤血球系、骨髄系、リンパ球系などの血液系の異なるクローンを表す。
図１６の結果から明らかに、総クローン数の点では、ＶＰＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂの組み合わせの効果は、他の組み合わせよりも有意に優れていた。ＬＴ－ＨＳＣｓの分化によって形成されたＧＥＭＭクローンの数では、ＶＰＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂの組み合わせは、既知の文献（Ｆａｒｅｓ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４；Ｂｏｉｔａｎｏ Ａ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０；）で報告された小分子阻害剤の単独使用及び報告された小分子阻害剤とＳＡＨＡとの組み合わせの使用よりも有意に優れていた（ＳＲ１、ＵＭ１７１、ＳＡＨＡ＋ＳＲ１、ＳＡＨＡ＋ＵＭ１７１よりも優れている）。ＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂと比較して、ＶＰＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂの効果がよりよかった。ＳＡＨＡ＋ＤＺＮｅＰ＋ＥＰＺ００４７７７は、総クローン数及びＧＥＭＭクローン数において、ＶＰＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂ及びＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂと比べてはるかに劣った。
以上によって、ＶＰＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂ及びＳＡＨＡ＋Ｄａｓａｔｉｎｉｂの組み合わせは、インビトロクローン形成能の点で、既知の文献で報告された小分子ＳＲ１、ＵＭ１７１の単独使用及びＳＲ１、ＵＭ１７１とＳＡＨＡとの組み合わせの使用よりも優れている。
実施例１０：Ｓｒｃ経路阻害剤の効果の検証
実施例１で選別された臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上で、Ｓｒｃ標的の他の小分子阻害剤を実施例２と同じ方法でスクリーニングし、小分子の組み合わせによる誘導の６～７日後、ＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現を実施例３と同じ方法でフローサイトメトリーによって検出した。その結果を図１７に示す。その中で、このラウンドでスクリーニングした小分子阻害剤及びその濃度を表９に示す。
Figure 2023507486000010
図１７の結果から明らかに、ＬＴ－ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する点で、Ｓｒｃ標的阻害剤ＵＭ－１６４の効果はＳＡＨＡの５倍であり、他のＳｒｃ標的阻害剤ＫＸ１－００４の効果はＳＡＨＡとは有意差がなかった。ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点では、ＵＭ１６４とＳＡＨＡの間に有意差はなく、ＣＤ３４＋細胞の割合は約８０％に維持された。上記の結果は、Ｓｒｃが新しい標的として、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する点で重要な役割を果たしていることを示している。ＨＤＡＣ標的阻害剤と組み合わせると、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持し、ＨＳＣｓの増幅を促進する点で、Ｓｒｃ標的阻害剤の効果がさらに高まった。
実施例１１：スクリーニングされた阻害剤Ｄａｓａｔｉｎｉｂと、文献で報告された阻害剤ＵＭ１７１、ＳＲ１との造血幹細胞のインビトロ増殖及び幹細胞性維持能力の比較
実施例１で選別された臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上で、スクリーニングされた阻害剤Ｄａｓａｔｉｎｉｂを、文献で報告された阻害剤ＵＭ１７１及びＳＲ１と、インビトロでの増殖及び幹細胞性維持能力についての比較を行った。小分子阻害剤による誘導の６～８日後、ＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現を、実施例３と同じ方法でフローサイトメトリーによって検出した。培養の２日目、４日目、６日目、８日目に２０μＬの細胞懸濁液を取り、セルカウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、モデル：Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２）でカウントし、８日目のＣＤ３４＋細胞及びＬＴ細胞の最終的な絶対数を算出し（細胞の絶対数＝細胞の割合＊細胞の総数）、その結果を図１８に示す。
図１８の結果から明らかに、Ｄａｓａｔｉｎｉｂは、幹細胞性を維持する点で、ＳＲ１及びＵＭ１７１よりも有意に優れており、その効果はＳＲ１の約１．２倍、ＵＭ１７１の約２．８倍であった。ＬＴ細胞の絶対数では、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ群はＳＲ１群より有意に良いではなく、ＵＭ１７１群とほぼ同じであった。ＣＤ３４＋細胞の割合を維持する点では、Ｄａｓａｔｉｎｉｂは細胞処理の８日後にＣＤ３４＋細胞を約４０％維持し、ＳＲ１は約６５％維持し、ＵＭ１７１は約４０％維持した。Ｄａｓａｔｉｎｉｂ群のＣＤ３４＋細胞の絶対数は、ＳＲ１及びＵＭ１７１より有意に優れていなかった。
実施例１２：スクリーニングされた阻害剤Ｄａｓａｔｉｎｉｂと、文献で報告された阻害剤ＳＲ１との造血幹細胞のインビボ移植効果の検証
実施例１で選別された臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞上で、スクリーニングされた小分子阻害剤Ｄａｓａｔｉｎｉｂと、文献で報告された阻害剤ＳＲ１の単独使用とを、インビボ造血系再構成能力について比較した。本実施例で使用した小分子阻害剤の濃度及び群分けを表１０に示す。
Figure 2023507486000011
細胞培地：ＳＦＥＭＩＩ培地＋５０ｎｇ／ｍｌ成長因子Ｆｌｔ－３Ｌ＋５０ｎｇ／ｍｌ成長因子ＳＣＦ＋５０ｎｇ／ｍｌ成長因子ＴＰＯ＋１０ｎｇ／ｍｌ成長因子ＩＬ－６＋１％二重抗体を調製した。使用した培地、成長因子、二重抗体などのカタログ番号は、実施例２に記載されたものと同じである。表１０に設定された群に従って、異なる小分子阻害剤を加えた。
調製した細胞培地を２４ウェルプレートに１ウェルあたり９５０μｌ加え、二酸化炭素インキュベーターに入れて予熱した。実施例１で調製しておいたＨＳＣｓをＳＦＥＭＩＩ＋５０ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ－３Ｌ＋５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ＋５０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６＋１％二重抗体で再懸濁し、ウェルあたり５０ｕｌの細胞懸濁液、ウェルあたりの細胞密度が１＊１０＾５／ｍｌで、加えた培地の容量を計算した。予熱した培地をインキュベーターから取り出し、各ウェルに５０μｌの細胞懸濁液を添加し、均一に混合した後、顕微鏡で細胞の状態を観察してから、培養用のインキュベーターに入れた。各マウスに移植した初期培養細胞の量は１＊１０＾５／匹であるため、２４ウェルプレートの各ウェルで増殖した細胞を１匹のマウスに移植することができる。細胞培養プロセス中は、１日おきにカウントし、技術的な方法及びセルカウンターは実施例１のものと同じであり、細胞密度が８＊１０＾５／ｍｌを超えないようにした。細胞密度が高すぎる場合は、ウェルをタイムリーに分割し、新鮮な培地を追加した。
小分子阻害剤で細胞を処理した７日後、ＬＴ－ＨＳＣｓ細胞表面マーカー（ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－）の発現を、実施例３と同じ方法でフローサイトメトリーによって検出した。
群あたり８匹のマウスでマウスを準備した。マウスはＢｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌｓｔａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入し、系統はＮＰＧ（ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄｌｌ２ｒｇｎｕｌｌ／Ｖｓｔ）、６週齢の雌マウスであり、マウス間の体重差を３ｇ以内に制御した。マウスは細胞移植前に半致死量で照射され、照射線量は１．６Ｇｙであった。
培養した細胞懸濁液を収集し（初期培養細胞量は１＊１０＾５／ｍｌ）、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、１００μｌの生理食塩水（１％ＨＳＡ）で再懸濁し、照射したＮＰＧマウスを尾静脈に注射し、異なる群のマウスにラベルを付けた。
細胞をマウスに移植した後、マウスの末梢血をそれぞれ４週目、８週目、１２週目に採取し、フローサイトメトリーでヒトＣＤ４５の割合を検出した。１６週目に、マウスを殺処分し、マウスの末梢血、骨髄細胞、脾臓を採取し、フローサイトメトリーによりヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ１９、ヒトＣＤ３、ヒトＣＤ３３、及びヒトＣＤ５６の割合を検出した。本実施例で使用した抗体、７－ＡＡＤ色素、及びソースを表１１に示す。
Figure 2023507486000012
マウスの末梢血のヒトＣＤ４５の割合をフローサイトメトリーによって検出した。設定した細胞の検出群を表１２に示す。
Figure 2023507486000013
１Ｘ赤血球溶解液の準備：５ｍｌのＲＢＣ Ｌｙｓｉｓ／Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １０Ｘストック溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号：４２２４０１）を取り、４５ｍｌの脱イオン水（Ｅｄｉｇｅｎｅ、０．２２μｍフィルターメンブレンでろ過）を加え、均一に混合して、１Ｘ赤血球溶解液を調製した。
マウスの末梢血（約１００μｌ）を採取し、表１２に設定された群に従って抗体を添加した。ボルテックスして均一に混合し、室温で光を避けて１５分間インキュベートした。インキュベーション後、ＮＣ及び各サンプルに１．２ｍｌの１Ｘ赤血球溶解液を加え、ボルテックスして均一に混合し、室温で光を避けて１５分間溶解した。その間、サンプル遠心チューブを３分ごとに一回逆さにした。溶解後、４００ｇで５分間室温で遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、１％ＨＳＡを含む１ｍｌのＰＢＳを各実験サンプルに加え、均一に混合し、４００ｇで５分間室温で遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、１％ＨＳＡを含む１００μｌのＰＢＳ及び５μｌの７－ＡＡＤ色素を各実験サンプルに加え、ボルテックスして均一に混合し、室温で光を避けて５分間インキュベートした。インキュベーション後、１％ＨＳＡを含む１ｍｌのＰＢＳをＮＣ及び各サンプルに加え、均一に混合し、４００ｇで５分間室温で遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、１％ＨＳＡを含む１００ｕｌのＰＢＳを各実験サンプルに加えて細胞を再懸濁し、検出前にサンプルを光を避けて室温で保存した。フローサイトメトリーを使用して検出した。
検出結果は次の方法に従って分析した。１）標的細胞集団はヒトＣＤ４５＋細胞集団であった。２）ロジックゲート及びゲート位置の決定は図１９に示されている。まず細胞集団を囲み、Ｐ１ゲートとした。Ｐ１ゲートに由来の細胞集団は、付着細胞を除去しＰ２ゲートとした。Ｐ２ゲートに由来の細胞集団は、７－ＡＡＤによって生細胞集団を囲み、Ｐ３ゲートとした。Ｐ３ゲートに由来の細胞集団は、ＮＣによってマウスＣＤ４５－及びヒトＣＤ４５－細胞集団（Ｑ２－ＬＬゲート）を囲んだ。ＮＣによって囲んだゲートを使用して、Ｑ２－ＵＬゲートによって囲んだ細胞がヒトＣＤ４５＋標的細胞であると決定した。ヒト造血幹細胞の移植効率はヒトＣＤ４５細胞の割合で表し、計算方法はヒトＣＤ４５％／（ヒトＣＤ４５％＋マウスＣＤ４５％）である。
マウスの末梢血、骨髄細胞及び脾臓細胞におけるヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ１９、ヒトＣＤ３、ヒトＣＤ３３及びヒトＣＤ５６の割合は、フローサイトメトリーによって検出した。設定した細胞検出群については、表１３を参照されたい。
Figure 2023507486000014
マウスの末梢血（約１００μｌ）を採取し、表１３に示す群に従って抗体を添加した。その後の血液サンプル処理は、マウスの末梢血中のヒトＣＤ４５の割合を検出するための上記の操作と同じであった。操作後、フローサイトメーターを使用して検出した。
マウスを頸椎脱臼により殺処分し、マウスの後肢の片方の脛骨及び大腿骨を取った。眼科用ハサミ及び眼科用鉗子を使用して、脛骨及び大腿骨の両端をそれぞれ切断し、骨髄腔を露出させた。１ｍｌのシリンジを使用して、１％ＨＳＡを含む予冷したＰＢＳを吸引し、骨髄腔の一方の端に針を刺し、ＰＢＳを強力的に注入し、骨髄腔のもう一方の端から骨髄細胞を押し出した。脛骨及び大腿骨の骨髄腔をそれぞれ２ｍｌのＰＢＳですすいだ。骨髄細胞懸濁液を繰り返しピペットで採取し、４０ｕｍの細胞メッシュ（ＢＤ、カタログ番号：３５２３４０）でろ過し、４００ｇで５分間室温で遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄し、骨髄細胞を後で使用するために用意した。
マウスを頸椎脱臼により殺処分し、マウスの脾臓を取り出し、１％ＨＳＡを含む予冷したＰＢＳに入れた。脾臓を眼科用ハサミで切断し、脾臓組織懸濁液をピペットで繰り返し吸引し、４０μｍの細胞メッシュでろ過し、４００ｇで５分間室温で遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄し、脾臓細胞を後で使用するために用意した。
用意した骨髄細胞及び脾臓細胞に１ｍｌの１Ｘ赤血球溶解液を加え、ボルテックスして均一に混合し、室温で１５分間溶解した。その間、サンプル遠心チューブを３分ごとに一回逆さにした。溶解後、１％ＨＳＡを含む４ｍｌのＰＢＳを各サンプルに添加し、４００ｇで５分間室温で遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、１％ＨＳＡを含むＰＢＳ １ｍｌを各サンプルに加え、ボルテックスで均一に混合した。各サンプルから１００μｌの細胞懸濁液を採取し、表１３の群に従って抗体を添加し、ボルテックスして均一に混合し、室温で光を避けて１５分間インキュベートした。インキュベーション後、５μｌの７－ＡＡＤ色素を各実験サンプルに添加し、ボルテックスして均一に混合し、室温で光を避けて５分間インキュベートした。インキュベーション後、１％ＨＳＡを含む１ｍｌのＰＢＳをＮＣ及び各サンプルに加え、均一に混合し、４００ｇで５分間室温で遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、各実験サンプルに１％ＨＳＡを含む１００μｌのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、検出前に室温で光を避けて保存し、フローサイトメトリーで検出した。
検出結果は次の方法に従って分析した。１）標的細胞集団はヒトＣＤ４５＋細胞集団、ヒトＣＤ１９＋細胞集団、ヒトＣＤ３＋細胞集団、ヒトＣＤ３３＋細胞集団、及びヒトＣＤ５６＋細胞集団であった。２）ロジックゲート及びゲート位置の決定は図２０に示されている。まず細胞集団を囲み、Ｐ１ゲートとした。Ｐ１ゲートに由来の細胞集団は、付着細胞を除去しＰ２ゲートとした。Ｐ２ゲートに由来の細胞集団は、７－ＡＡＤによって生細胞集団を囲み、Ｐ３ゲートとした。Ｐ３ゲートに由来の細胞集団は、ＮＣによってマウスＣＤ４５＋（Ｐ４ゲート）及びヒトＣＤ４５＋細胞集団（Ｐ５ゲート）を囲んだ。Ｐ５ゲートに由来の細胞集団は、ＮＣによってヒトＣＤ３３＋（Ｐ６ゲート）及びヒトＣＤ５６＋細胞集団（Ｐ７ゲート）を囲んだ。Ｐ５ゲートに由来の細胞集団は、ＮＣによってヒトＣＤ１９＋（Ｐ８ゲート）及びヒトＣＤ３＋細胞集団（Ｐ９ゲート）を囲んだ。ヒト造血幹細胞の移植効率はヒトＣＤ４５細胞の割合で表し、計算方法はヒトＣＤ４５％／（ヒトＣＤ４５％＋マウスＣＤ４５％）である。マウスにおけるヒト造血幹細胞のさまざまな系統の血液細胞への分化効率は、ヒトＣＤ１９％（Ｂ細胞を表す）、ヒトＣＤ３％（Ｔ細胞を表す）、ヒトＣＤ３３％（骨髄系細胞を表す）、及びヒトＣＤ５６％（ＮＫ細胞を表す）を使用して表した。
図２１の結果から明らかに、Ｄａｓａｔｉｎｉｂによって処理された細胞の移植効率は、マウス移植の初期培養細胞量が同じである場合に、８週目、１２週目、及び１６週目の末梢血検出において、Ｍｏｃｋ群及びＳＲ１群よりも有意に高かった。１６週目の骨髄及び脾臓の検出では、Ｄａｓａｔｉｎｉｂによって処理された細胞群の移植効率はＳＲ１群の移植効率よりも有意に高かった。これは、Ｄａｓａｔｉｎｉｂが造血幹細胞の移植能力を改善でき、その効果が文献で報告された小分子ＳＲ１よりも優れていることを証明した。
図２２の結果から明らかに、移植後１６週目に、マウスの末梢血、骨髄、脾臓からヒトＴ細胞、Ｂ細胞、骨髄系細胞、及びＮＫ細胞を検出でき、各群の各系譜の細胞の割合に有意差はなかった。これは、ヒト由来の造血幹細胞が移植に成功しただけでなく、正常な分化機能を持つさまざまな系統の細胞に分化できることを証明した。

Claims (31)

  1. ＨＳＣｓを、ＳＴＡＴ細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤または他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤を含有する培養液とインビトロで接触させることを含む、ＨＳＣｓの増殖を促進し、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持する方法。
  2. 前記ＳＴＡＴ細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤がＳｒｃ標的の小分子阻害剤である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤が、ダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、ケルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、ＵＭ－１６４、ＫＸ２－３９１及びＫＸ１－００４から選択される１つまたは複数である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤を、他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤と組み合わせて使用する、請求項２～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤が、ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤、ＰＫＣを標的とする小分子阻害剤、及びＪＮＫを標的とする小分子阻害剤から選択1つまたは複数の小分子阻害剤である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤を、ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤、ＰＫＣを標的とする小分子阻害剤、またはＪＮＫを標的とする小分子阻害剤と組み合わせて使用する、請求項５に記載の方法。
  7. 前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤を、ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤ＶＰＡ、ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤ＳＡＨＡ、ＰＫＣを標的とする小分子阻害剤エンザスタウリン（Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ）、またはＪＮＫを標的とする小分子阻害剤ＪＮＫ－ＩＮ－８と組み合わせて使用する、請求項６に記載の方法。
  8. 前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤がダサチニブである、請求項７に記載の方法。
  9. ダサチニブをＶＰＡまたはＳＡＨＡと組み合わせて使用する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤を単独でまたは他の阻害剤と組み合わせて使用することは、細胞全体におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有するＨＳＣｓ細胞の割合が８％を超える、１０％を超える、１５％を超える、２０％を超える、２５％を超える、または３０％を超えることを維持する、請求項２～８のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤を単独でまたは他の阻害剤と組み合わせて使用することは、細胞全体におけるＣＤ３４＋細胞の割合が６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、または８５％を超えることを維持する、請求項２～９のいずれか１項に記載の方法。
  12. ＳＴＡＴ細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤を含む、ＨＳＣｓの幹細胞性を維持するための組成物。
  13. 前記ＳＴＡＴ細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤がＳｒｃ標的の小分子阻害剤である、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記Ｓｒｃ標的の小分子阻害剤が、ダサチニブ、ケルセチン、ＵＭ－１６４、ＫＸ２－３９１及びＫＸ１－００４から選択される１つまたは複数である、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記組成物が他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤をさらに含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
  16. 前記他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤が、ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤、ＰＫＣを標的とする小分子阻害剤、及びＪＮＫを標的とする小分子阻害剤を含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記他の細胞シグナル伝達経路の小分子阻害剤が、ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤ＶＰＡ、ＨＤＡＣを標的とする小分子阻害剤ＳＡＨＡ、ＰＫＣを標的とする小分子阻害剤エンザスタウリン、及びＪＮＫを標的とする小分子阻害剤ＪＮＫ－ＩＮ－８を含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記組成物が、ＳＦＥＭＩＩ培地、成長因子Ｆｌｔ－３Ｌ、成長因子ＳＣＦ、成長因子ＴＰＯ及び成長因子ＩＬ－６をさらに含む、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 前記組成物は、細胞全体におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有するＨＳＣｓ細胞の割合が８％を超える、１０％を超える、１５％を超える、２０％を超える、２５％を超える、または３０％を超えることを維持する、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 前記組成物は、細胞全体におけるＣＤ３４＋細胞の割合が６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、または８５％を超えることを維持する、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の組成物。
  21. ＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７、ＳＡＨＡ＋ＤＺＮｅＰ、ＳＡＨＡ＋ダサチニブ、ＶＰＡ＋ダサチニブ、ＳＡＨＡ＋ＪＮＫ－ＩＮ－８またはＳＡＨＡ＋ＶＰＡから選択されるいずれか１つの組み合わせを含む、ＨＳＣｓの乾細胞性を維持するための組成物。
  22. 前記組成物は、細胞全体におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有するＨＳＣｓ細胞の割合が８％を超える、１０％を超える、１５％を超える、２０％を超える、２５％を超える、または３０％を超えることを維持する、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記組成物は、細胞全体におけるＣＤ３４＋細胞の割合が６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、または８５％を超えることを維持する、請求項２１または２２に記載の組成物。
  24. 前記組成物が、ＳＦＥＭＩＩ培地、成長因子Ｆｌｔ－３Ｌ、成長因子ＳＣＦ、成長因子ＴＰＯ及び成長因子ＩＬ－６をさらに含む、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  25. ＳＡＨＡ＋ＥＰＺ００４７７７＋ＤＺＮｅＰまたはＳＡＨＡ＋ＶＰＡ＋ダサチニブから選択されるいずれか１つの組み合わせを含む、ＨＳＣｓの乾細胞性を維持するための組成物。
  26. 前記組成物は、細胞全体におけるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ３８－表現型を有するＨＳＣｓ細胞の割合が８％を超える、１０％を超える、１５％を超える、２０％を超える、２５％を超える、または３０％を超えることを維持する、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記組成物は、細胞全体におけるＣＤ３４＋細胞の割合が６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、または８５％を超えることを維持する、請求項２５または２６に記載の組成物。
  28. 前記組成物が、ＳＦＥＭＩＩ培地、成長因子Ｆｌｔ－３Ｌ、成長因子ＳＣＦ、成長因子ＴＰＯ及び成長因子ＩＬ－６をさらに含む、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組成物。
  29. 培地における各阻害剤の濃度として、
    ダサチニブ：０．１μＭ～５０μＭ、好ましくは０．５μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．５μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．５μＭ～１０μＭであり、
    ＳＡＨＡ：１０ｎＭ～２０μＭ、好ましくは２０ｎＭ～１５μＭ、より好ましくは３０ｎＭ～１０μＭ、最も好ましくは０．１μＭ～１０μＭであり、
    ＶＰＡ：１０μＭ～２０００μＭ、好ましくは１０μＭ～１５００μＭ、より好ましくは１０μＭ～１０００μＭ、最も好ましくは１００μＭ～１０００μＭであり、
    ＪＮＫ－ＩＮ－８：０．１μＭ～２０μＭ、好ましくは０．５μＭ～１５μＭ、より好ましくは０．５μＭ～１０μＭ、最も好ましくは１μＭ～１０μＭであり、
    ＥＰＺ００４７７７：０．１μＭ～５０μＭ、好ましくは０．５μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．５μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．５μＭ～１０μＭであり、
    ＤＺＮｅＰ：１ｎＭ～５００ｎＭ、好ましくは５ｎＭ～４００ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ～３００ｎＭ、最も好ましくは１０ｎＭ～２５０ｎＭであり、
    ＵＭ－１６４：０．１μＭ～１０００μＭ、好ましくは０．５μＭ～５００μＭ、より好ましくは１μＭ～１００μＭ、最も好ましくは１μＭ～１０μＭであり、
    ＫＸ２－３９１：０．１ｎＭ～１０００ｎＭ、好ましくは１ｎＭ～１０００ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ～５００ｎＭ、最も好ましくは１０ｎＭ～１００ｎＭであり、
    ＫＸ１－００４：０．１μＭ～１０００μＭ、好ましくは１μＭ～１０００μＭ、より好ましくは１０μＭ～５００μＭ、最も好ましくは１０μＭ～１００μＭである、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の組成物。
  30. 培地における各阻害剤の濃度として、
    ダサチニブ：０．１μＭ～５０μＭ、好ましくは０．５μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．５μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．５μＭ～１０μＭであり、
    ＳＡＨＡ：１０ｎＭ～２０μＭ、好ましくは２０ｎＭ～１５μＭ、より好ましくは３０ｎＭ～１０μＭ、最も好ましくは０．１μＭ～１０μＭであり、
    ＶＰＡ：１０μＭ～２０００μＭ、好ましくは１０μＭ～１５００μＭ、より好ましくは１０μＭ～１０００μＭ、最も好ましくは１００μＭ～１０００μＭであり、
    ＪＮＫ－ＩＮ－８：０．１μＭ～２０μＭ、好ましくは０．５μＭ～１５μＭ、より好ましくは０．５μＭ～１０μＭ、最も好ましくは１μＭ～１０μＭであり、
    ＥＰＺ００４７７７：０．１μＭ～５０μＭ、好ましくは０．５μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．５μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．５μＭ～１０μＭであり、
    ＤＺＮｅＰ：１ｎＭ～５００ｎＭ、好ましくは５ｎＭ～４００ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ～３００ｎＭ、最も好ましくは１０ｎＭ～２５０ｎＭである、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の組成物。
  31. 培地における各阻害剤の濃度として、
    ダサチニブ：０．１μＭ～５０μＭ、好ましくは０．５μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．５μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．５μＭ～１０μＭであり、
    ＳＡＨＡ：１０ｎＭ～２０μＭ、好ましくは２０ｎＭ～１５μＭ、より好ましくは３０ｎＭ～１０μＭ、最も好ましくは０．１μＭ～１０μＭであり、
    ＶＰＡ：１０μＭ～２０００μＭ、好ましくは１０μＭ～１５００μＭ、より好ましくは１０μＭ～１０００μＭ、最も好ましくは１００μＭ～１０００μＭであり、
    ＥＰＺ００４７７７：０．１μＭ～５０μＭ、好ましくは０．５μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．５μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．５μＭ～１０μＭであり、
    ＤＺＮｅＰ：１ｎＭ～５００ｎＭ、好ましくは５ｎＭ～４００ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ～３００ｎＭ、最も好ましくは１０ｎＭ～２５０ｎＭである、請求項２５～２８のいずれか１項に記載の組成物。
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