KR20200060343A - 적혈구 전구체 세포의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전적으로 변형되거나 변형되지 않은 조혈 줄기 세포를 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제를 포함하는 정의된 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 적혈구 전구체의 시험관내 생산을 위한 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 의약 분야에 속한다. 보다 특히, 본 발명은 적혈구 전구체(erythroid progenitor) 및 적혈 세포(red blood cell)의 신규한 생산 방법에 관한 것이다.
발명의 기술적 배경
조직으로 산소의 일정한 공급을 유지하는 것은 많은 살아있는 생물, 특히 사람에게 필수적이다. 이는 체내에서 혈류를 통해 산소를 운반하는 적혈 세포이다. 이러한 수송은 산소를 결합시킬 수 있는 적혈 세포에 대해 특이적인 단백질인, 헤모글로빈에 의해 제공된다. 적혈 세포가 조직에 도달하면, 산소는 모세관의 벽을 통해 확산된다. 따라서, 적혈 세포의 역활은 필수적이다.
적혈 세포 수혈은 응급(출혈) 및 병리학(혈액 질환, 암 등)의 경우에 필수적이다. 2016년도에, 1억개 이상의 혈액 주머니(blood bag)가 전세계적으로 수집되어 수혈 요구도를 충족시키기 위해 분배되었다. 이들 제품의 50 퍼센트는 부국(rich country)에 분배되었으며, 이는 전세계 인구의 15% 만을 나타낸다. 개발 도상국에서 수혈 쟁점은 수혈 공급 및 안전성을 포함하지만, 부국에서는 이러한 쟁점이 우수하게 제어되고 있다. 그러나, 만성적인 수혈과 관련된 면역학적 합병증(동종면역화)는 환자의 사망을 포함하는 수혈 교착상태를 초래할 수 있다.
지금까지, 수혈은 전적으로 공여자로부터의 혈액을 기반으로 하여 왔다.
성인에서, 적혈 세포 생산, 또는 적혈구형성은 소위 조혈 골수에서 일어나며, 이는 편평골(flat bone) 속에 및 장골(long bone)의 말단에 존재한다. 골수에서, 조혈 줄기 세포로 불리는 다능성 줄기 세포는 상이한 유형의 적혈구 전구체(BFU-E, CFU-E, 전적혈모구(proerythroblast), 호염기성 적혈모구, 적혈모구, 다염성 적혈모구(polychromatophilic erythroblast)로 성공적으로 분화된다. 적혈모구가 골수를 떠나는 경우, 적혈모구는 이의 핵을 상실하여 망상적혈구(reticulocyte)가 된 다음 성숙한 적혈 세포가 된다.
적혈 세포의 시험관내(in vitro) 생산을 허용하는 조절 줄기 세포의 분화 배지가 알려져 있다. 그러나, 현재의 방법은 대규모 생산하기에는 결정적인 결함, 예를 들면, 적혈 세포 성숙으로의 너무 신속한 배향을 가지며, 이는 생산 수율, 및 적출 단계를 정확하게 수행할 수 없는 세포로의 분화를 유의적으로 제한한다(Akimov S et al., 2005, Stem cells, 23(9): 1423-1433; Hirose SI et al., 2013, Stem Cell Reports, 1(6): 499-508; Huang X, 2013, Mol. Ther., 22(2): 451-463). 최종적으로, 다른 방법은 배양보조 세포(feeder cell)와 함께 동시-배양을 사용하며(Kurita R et al., 2013, PloS One, 8(3): e59890), 이는 시행하기 복잡하고 비용이 많이 든다.
적혈 세포의 시험관내 생산에 대한 신규 방법의 개발은 공급 필요성을 충족시키고, 드러나는 감염 위험을 피하고 면역학적 합병증을 피하는 것을 가능하도록 하는 것으로 여겨진다.
본 발명은 다른 것들 중에서도 이러한 요구를 충족하는 것을 목표로 한다.
발명의 요약
본 발명자들은 덱사메타손, 라파마이신-28의 소-분자 인핸서(small molecule enhancer of ripamycin-28)(SMER28), 및 임의로 디메틸옥살릴글리신(DMOG)을 함유하는 배지 속에서 조혈 줄기 세포의 배양이 이러한 줄기 세포를 적혈구 전구체 세포로 분화시킬 뿐만 아니라, 최종적으로 적혈 세포로 분화하는 이들의 능력을 보존하면서 이러한 전구체 집단을 유의적으로 증폭시킴을 입증하였다. 이렇게 수득된 적혈구 전구체는 성숙한 제핵 세포(enucleated cell), 즉, 적혈 세포로 분화하는 이의 능력을 상실하지 않으면서 60일 이상 동안 배양물 속에 유지되고 증폭될 수 있다.
제1 양태에 따라서, 본 발명은 조혈 줄기 세포를 바람직하게는 조혈 줄기 세포의 영양 요건에 맞춰지고, 특히 조혈 세포주(hematopoietic line)의 세포의 성장 및/또는 분화에 맞춰지며, 글르코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 적혈구 전구체의 생산을 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 글루코코르티코이드 호르몬은 코르티손, 하이드로코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 파라메타손, 베타메타손, 덱사메타손, 코르티바졸, 및 이들의 유도체 및 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 특히 바람직하게는, 글루코코르티코이드 호르몬은 프레드니손, 프레드니솔론 및 덱사메타손으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 가장 특히 바람직하게는, 글루코코르티코이드 호르몬은 덱사메타손이다
바람직하게는, 자가포식 유도제는 라파마이신-28의 소-분자 인핸서(SMER-28), SMER-10 및 SMER-18, 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 특히 바람직하게는, 자가포식 유도제는 라파마이신-28의 소-분자 인핸서(SMER-28)이다.
특수한 구현예에 따라서, 배양 배지는 또한 저산소증-유도 인자(HIF) 경로 활성화제, 바람직하게는 프롤릴 하이드록실라제 억제제, 및 보다 바람직하게는 디메틸옥살릴글리신(DMOG)을 포함한다.
조혈 줄기 세포는 바람직하게는 다능성 줄기 세포, 특히 배아 줄기 세포(ES) 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPS)의 분화에 의해 수득되거나, 가동화(mobilization)하에 또는 가동화없이 환자 혈액의 샘플로부터, 태반의 제대 혈액의 샘플로부터, 또는 골수 샘플 또는 수집물로부터 단리된다. 바람직하게는, 조혈 줄기 세포는 사람 조혈 줄기 세포이다.
조혈 줄기 세포는 특히 사람 텔로머라제 역 전사 효소(human telomerase reverse transcriptase: HTERT), B 림프종 Mo-MLV 삽입 영역 1 동족체(BMI1), c-MYC, 1-MYC 및 MYB로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 조혈 줄기 세포는 유전적으로 변형되어 HTERT 유전자를 과발현하거나 BMI1 유전자를 과발현할 수 있다. 이들은 또한 변형되어 HTERT 유전자 및 BMI1 유전자를 과발현할 수 있다.
사람 텔로머라제 역 전사 효소(HTERT), B 림프종 Mo-MLV 삽입 영역 1 동족체(BMI1), c-MYC, 1-MYC 및 MYB로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자는 바람직하게는 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어 하에 위치한다.
이러한 조혈 줄기 세포는 또한 유전적으로 변형되어:
- 하나 이상의 코어 적혈구 네트워크(CEN) 경로 전사 인자, 바람직하게는 LIM 도메인 단독 2(LMO2)를 과발현하고/하거나;
- 하나 이상의 EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL 경로 유전자, 바람직하게는 B-세포 림프종-익스트라 라지(B-cell lymphoma-extra large: BCL-XL)를 과발현할 수 있다.
바람직하게는, 조혈 줄기 세포는 유전적으로 변형되어 BCL-XL 유전자를 과발현하거나 LMO2 유전자를 과발현할 수 있다.
EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL 경로 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자는 바람직하게는 하나 이상의 구성 프로모터의 제어 하에 있다.
코어 적혈구 네트워크(CEN) 경로 전사 인자 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자는 바람직하게는 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어하에 있다.
조혈 줄기 세포는 또한 무한증식 세포일 수 있다.
바람직하게는, 세포는 본 발명의 배양 배지 속에서 적어도 20일, 보다 바람직하게는 적어도 40일, 특히 바람직하게는 적어도 60일 동안 배양된다.
제2의 양태에서, 본 발명은 또한 적혈구 전구체의 생산 및/또는 증폭을 위한 본 발명에 따른 세포 배양 배지의 용도에 관한 것이다.
제3의 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 조혈 줄기 세포 및 적혈구 전구체 및/또는 적혈구의 시험관내 생산을 위한 이러한 조혈 줄기 세포의 용도에 관한 것이다.
제4 양태에서, 본 발명은:
- 본 발명의 방법에 따른 적혈구 전구체를 생산하는 단계; 및
- 적혈구 전구체의 성숙을 유도하는 단계,
- 및 임의로, 수득된 적혈구의 회수하는 단계를 포함하는, 적혈구의 생산을 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 적혈구 전구체의 성숙은 적혈구 분화 배지 속에서 적혈구 전구체를 배양함으로써 유도된다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 바람직하게는 조혈 세포주의 세포의 성장 및/또는 분화에 대해 맞춰지고, 글루코코르티코이드 호르몬, 바람직하게는 덱사메타손, 및 자가포식 유도제, 바람직하게는 SMER-28, 및 임의로 HIF 경로 활성인자, 바람직하게는 DMOG를 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다.
바람직하게는, 배지는 글루코코르티코이드 호르몬을 0.01 mM 내지 0.1 mM의 농도에서, 및/또는 자가포식 유도제를 2 μM 내지 30 μM의 농도에서, 및/또는 HIF 경로 활성인자를 75 μM 내지 350 μM의 농도에서 포함한다.
자가포식 유도제는 바람직하게는 라파마이신-28의 소-분자 인핸서(SMER-28), SMER-10 및 SMER-18, 이들의 조합물로 이루이진 그룹으로부터 선택되고 보다 특히 바람직하게는 SMER-28이다.
글루코코르티코이드 호르몬은 바람직하게는 코르티손, 하이드로코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 파라메타손, 베타메타손, 덱사메타손, 코르티바졸, 및 이의 유도체 및 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 보다 특히 바람직하게는 프레드니손, 프레드니솔론 및 덱사메타손으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 가장 특히 바람직하게는 덱사메타손이다.
저산소증-유도성 인자(HIF) 경로 활성인자는 바람직하게는 프롤릴 하이드록실라제(PHIS) 억제제, 및 보다 바람직하게는 디메틸옥살릴글리신(DMOG)이다.
배양 배지는 또한 (i) 트랜스페린, (ii) 인슐린, (iii) 헤파린, 및 (iv) 혈청, 혈장, 혈청 혼주물(pool) 또는 혈소판 용해물, 바람직하게는 혈소판 용해물, 및 임의로 줄기 세포 인자(SCF), EPO 및/또는 IL-3을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 적혈구 전구체를 생산하고/하거나 증폭시키기 위한 본 발명에 따른 세포 배양 배지의 용도에 관한 것이다.
제5 양태에서, 본 발명은 또한:
- 본 발명에 따른 배양 배지; 및/또는
- 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 조혈 줄기 세포; 및
- 임의로, 키트(kit)를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 안내서를 포함하는, 적혈구 전구체 및/또는 적혈구의 생산을 위한 키트에 관한 것이다.
최종적으로 제6 양태에서, 본 발명은 적혈구 전구체 및/또는 적혈구를 생산하기 위한 본 발명에 따른 키트의 용도에 관한 것이다.
도면의 설명
도 1: 상이한 배양 프로토콜에 따른, 14일째에 표면 마커 CD117 및 CD235a의 발현 프로파일. A: 프로토콜 4; B: 프로토콜 3; C: 프로토콜 1; D: 프로토콜 2.
도 2: 상이한 배양 프로토콜에 따른, HTERT, BMI1 및 LMO2를 과발현하도록 유적적으로 변형된 세포의 24일째에 표면 마커 CD117 및 CD235a의 발현 프로파일. A: 프로토콜 4; B: 프로토콜 1; C: 프로토콜 2.
도 3: 상이한 배양 프로토콜에 따른, HTERT, BMI1 및 BCL-XL을 과발현하도록 유전적으로 변형된 세포의 24일째에 표면 마커 CD117 및 CD235a의 발현 프로파일. A: 프로토콜 4; B: 프로토콜 1; C: 프로토콜 2.
도 1: 상이한 배양 프로토콜에 따른, 14일째에 표면 마커 CD117 및 CD235a의 발현 프로파일. A: 프로토콜 4; B: 프로토콜 3; C: 프로토콜 1; D: 프로토콜 2.
도 2: 상이한 배양 프로토콜에 따른, HTERT, BMI1 및 LMO2를 과발현하도록 유적적으로 변형된 세포의 24일째에 표면 마커 CD117 및 CD235a의 발현 프로파일. A: 프로토콜 4; B: 프로토콜 1; C: 프로토콜 2.
도 3: 상이한 배양 프로토콜에 따른, HTERT, BMI1 및 BCL-XL을 과발현하도록 유전적으로 변형된 세포의 24일째에 표면 마커 CD117 및 CD235a의 발현 프로파일. A: 프로토콜 4; B: 프로토콜 1; C: 프로토콜 2.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 자가포식 유도제, 즉, 라파마이신-28의 소-분자 인핸서(SMER28) 및 글루코코르티코이드 호르몬, 즉, 덱사메타손을 포함하는 배지 속에서 조혈 줄기 세포의 배양이 덱사메타손 만이 첨가된 대조군 배양 배지와 비교하여 적혈구 전구체의 생산을 유의적으로 증가시킴을 입증하였다. 이렇게 수득된 적혈구 전구체는 배양물 속에서 유지되고 60일 이상 동안 증폭될 수 있다. 본 발명자들은 또한 이러한 적혈구 전구체가 적혈 세포로 효과적으로 분화할 수 있음을 입증하였다.
이러한 시험관내 배양 방법은 단순하고 경제적인 장점을 가질 뿐만 아니라, 적혈구 전구체에 이은 적혈 세포의 대규모 산업적인 생산을 위한 길을 연다. 이는 수혈받은 환자에 대해 최적의 안전성을 제공하면서, 혈액 부족 또는 수혈 교착 위험성을 감소시킬 수 있다.
따라서, 제1 양태에 따라서, 본 출원은 조혈 줄기 세포를 자가포식 유도제 및 글루코코르티코이드 호르몬을 포함하는 배양 배지와 접촉시킴을 포함하는, 적혈구 전구체의 생산을 위한 시험관내 방법에 관한 것이다. 이러한 방법의 목적은 조혈 줄기 세포의 적혈구 전구체로의 분화를 유도하고 후에 적혈 세포로 분화하는 이의 능력을 유지하면서, 이러한 전구체의 집단의 증폭, 즉, 증식을 허용하는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 적혈구 전구체의 생산 및 증폭을 위한 방법이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "적혈구 전구체(erythroid progenitors)"는 적혈구생성 동안 조혈 줄기 세포의 분화에 의해 수득된 전구체 세포를 지칭한다. 이러한 전구체 세포는 분열하여 제핵에 의해 적혈 세포로 후에 분화하는 능력을 갖는 제핵 세포이다. 적혈구 전구체는 바람직하게는 마커 CD117, CD34, CD41, CD71 및 CXCR4의 발현에 의해 특징화된 버스트-형성 단위(burst-forming units-E: BFU-E), 마커 CD117, CD34, CD36 및 CD71의 발현에 의해 특징화된 콜로니-형성 단위-E(CFU-E), 마커 CD117, CD71, CD36, 및 CD235a의 발현에 의해 특징화된 전적혈모구, 마커 CD117, CD71, CD36 및 CD235a의 발현에 의해 특징화된 호염기성 적혈모구, 및 마커 CD36, CD71, CD235a, 및 이의 혼합물의 발현에 의해 특징화된 다염성적혈구성 적혈모구로부터 선택된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell)" 또는 "HSC"는 혈액 세포 및 면역 세포, 예를 들면, 백혈 세포, 적혈 세포 및 혈소판으로 분화할 수 있는 다능성 줄기 세포를 지칭한다. 조혈 줄기 세포는 CD45, CD133, 및/또는 CD34 항원을 발현한다. 바람직하게는, 조혈 줄기 세포는 CD45 및 CD34 항원 및, 임의로, CD133 항원을 발현한다.
바람직한 구현예에 따라서, HSC는 사람 HSC이다.
이러한 HSC는 상이한 공급원으로부터 당해 분야의 기술자에게 잘 공지된 과정에 따라 수득될 수 있다. 특히, 이들은 골수로부터, 세포성분채집술(cytapheresis)로부터, 전체 혈액으로부터 또는 제대혈액(또는 태반 혈액)으로부터 면역자기 시스템(immunomagnetic system) 또는 특이적인 막 수용체(예를 들면, CD133, CD45 및/또는 CD34)의 존재에 대한 스크리닝 시스템을 사용하여 단리할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "세포성분채집술"은 성분채집(apheresis)에 의해 혈액으로부터 HSC를 제거함을 지칭한다. 성분채집은 체외 혈액 순환에 의해 특정 혈액 구성성분을 수집하기 위한 기술이다. 수집될 구성성분은 원심분리 및 추출에 의해 분리되지만, 수집되지 않은 구성성분은 공여자 또는 환자내로 재-주사된다(치료학적 성분채집).
HSC는 또한 다능성 줄기 세포, 특히 배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포, 바람직하게는 유도된 다능성 줄기 세포의 분화에 의해 수득될 수 있다. 다능성 줄기 세포를 HSC로 분화하는 기술은 기술자에게 잘 공지되어 있다. 몇가지 프로토콜이 발표되었으며, 특히 렝거크 씨(Lengerke C) 등에 의한 프로토콜(2009, Ann N Y Acad Sci, 1176:219-27)은 배아 체의 중간 단계를 통한 17-일 분화 및 다음의 사이토킨의 조합으로 이루어진다: SCF, Flt-3 리간드, IL-3, IL-6, G-CSF 및 BMP-4.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "배아 줄기 세포"는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래되고 생식 계열 세포를 포함하는, 체내 모든 조직의 형성을 초래하는 능력을 가진 세포(중배엽, 내배엽, 외배엽)를 지칭한다. 배아 줄기 세포의 전분화능은 마커, 예를 들면, 전사 인자 OCT4 및 NANOG 및 표면 마커, 예를 들면, SSEA3/4, Tra-1-60 및 Tra-1-81의 존재에 의해 평가될 수 있다. 배아 줄기 세포는 예를 들면 청(Chung) 등이 기술한 기술(Cell Stem Cell, 2008, 2(2): 113-117)을 사용함으로써, 이들이 유래된 배아를 파괴하지 않고 수득할 수 있다. 특수한 구현예에서, 및 법적 또는 윤리적 이유로, 배아 줄기 세포는 비-사람 배아 줄기 세포이다. 다른 특수한 구현예에서, 본 발명에 사용된 배아 줄기 세포는 바람직하게는 이들이 유래되는 배아를 파괴하지 않으면서 수득된 사람 배아 줄기 세포이다. 사용된 배아는 바람직하게는 시행 법에 따라서 규제적 및 윤리적 승인을 수득한 후, 임시촉진 치료(fertility treatment) 동안 수득된 과잉 배아이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유도된 다능성 줄기 세포"(iPS)는 분화된 체세포의 유전적 재프로그래밍(reprogramming)에 의해 수득되고, 자가-재생을 위한 형태 및 잠재능 및 배아 줄기 세포와 부분적으로 유사한 다능성을 갖는 다능성 줄기 세포를 지칭한다. 이러한 세포는 다능성 마커, 예를 들면, 알칼린 포스파타제 염색 및 단백질 NANOG, SOX2, OCT4 및 SSEA3/4의 발현에 대해 특히 양성이다. 유도된 다능성 줄기 세포를 수득하는 방법은 기술자에게 잘 공지되어 있으며 특히 유(Yu) 등(Science, 2007, 318 (5858): 1917-1920), 다카하시(Takahashi) 등(Cell, 2007, 131(5): 861-872) 및 나카가와(Nakagawa) 등(Nat Biotechnol, 2008, 26(1): 101-106)의 문헌에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 HSC는 적혈구생성 및/또는 이들의 증폭 능(amplification capacity)에 관여하는 이들의 능력을 증가시키기 위하여 유전적으로 변형된 HSC일 수 있다. 따라서, 특정의 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 방법은 적혈구생성 및/또는 이의 증폭능에 관여하는 이들의 능력을 증가시키기 위하여 HSC의 유전적 변형을 포함할 수 있다. 이러한 세포를 유전적으로 변형시키는 방법은 기술자에게 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, 이식유전자(transgene)를 세포 게놈내로 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 또는 유전자 또는 단백질 전달의 임의의 다른 형태를 통한 도입을 포함한다.
일 구현예에 따라서, 이러한 HSC의 증폭능은 사람 텔로머라제 역 전사 효소(HTERT), B 림프종 Mo-MLV 삽입 영역 1 동족체(BMI1), c-MYC, l-MYC 및 MYB로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현시킴으로써 증진시킨다.
특수한 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 HTERT를 과발현한다.
다른 구체적인 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 HTERT 및 B 림프종 Mo-MLV 삽입 영역 1 동족체(BMI1), c-MYC, l-MYC 및 MYB로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현한다.
바람직한 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 HTERT 및/또는 BMI1, 바람직하게는 HTERT 및 BMI1을 과발현한다.
적혈구생성 경로에 관여하는 HSC의 능력은 EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL 경로 및/또는 코어 적혈구 네트워크(CEN) 경로에 포함된 하나 이상의 유전자를 과발현시킴으로써 증진시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL 경로"는 세포 신호전달 경로를 지칭하며 이의 주요 단백질은 에리스로포이에틴(EPO) 수용체, 야누스 키나제(Janus kinase) 2(JAK2), 전사 5의 신호 변환기 및 활성인자(STAT5) 및 B-세포 림프종-익스트라 라지(BCL-XL)이다. EPO는 적혈구생성에 필수적이며, 이는 적혈구 관여 및 세포 생존을 증진시킨다. 이의 막 수용체에 대한 EPO의 결합은, 활성화되는 경우, 궁극적으로 JAK2를 유도하는 EPO-R의 이량체화를 유발한다. JAK2는 이후 EPO-R의 세포질성 테일(tail)의 타이로신 잔기를 인산화시킨다. 이러한 포스포타이로신은 Src 상동성 2(SH2) 도메인을 함유하는 단백질과의 상호작용을 허용하며, 이는 상이한 신호전달 경로의 활성화를 생성하는데, 중요한 경로는 STAT5 경로이다. STAT5는 먼저 이량체화된 후 인산화되며, 이는 핵내로의 이의 전좌를 초래하며, 여기서 이는 세포 증식 및 적혈구 분화에 관여하는 유전자를 포함하는 상이한 유전자의 전사를 활성화시킨다.
일 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 EPO-R/JAK2/STAT5P/BCL-XL 경로의 하나 이상의 유전자, 바람직하게는 EPO-R, JAK2, STAT5P, BCL-XL 및 BCL-2, 및 이들의 조합을 암호화하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현시킨다.
특수한 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 BCL-XL을 암호화하는 유전자를 과발현시킨다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CEN 경로"는 적혈구의 실체를 확립하고 유지시키는데 필수적인 전사 인자의 그룹을 지칭한다.
일 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 하나 이상의 CEN 경로 유전자, 바람직하게는 GATA1를 암호화하는 유전자(DNA 서열 "GATA"에 결합하는 아연-핑거 단백질(zinc-finger protein)의 계열에 속하는 전사 인자), TAL bHLH 전사 인자 1(TAL1), 크뢰펠-유사 인자 1(Krueppel-like factor 1: KLF1), LIM 도메인 결합 1(LDB1), LIM 도메인 단독 2(LMO2) 및 줄기 세포 백혈병(SCL), 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현한다.
특수한 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 LMO2를 암호화하는 유전자를 과발현한다.
특수한 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 방법에서 사용된 HSC는 유전적으로 변형되어 다음을 과발현한다:
(i) HTERT, BMI1, c-MYC, l-MYC 및 MYB, 및 이들의 조합, 바람직하게는 HTERT 및/또는 BMI1, 및 보다 특히 바람직하게는 HTERT 및 BMI1를 암호화하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자; 및
(ii) 바람직하게는 EPO-R, JAK2, STAT5, BCL-XL 및 BCL-2, 및 이들의 조합, 및 보다 특히 바람직하게는 BCL-XL을 암호화하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL 경로 유전자; 및/또는
(iii) 바람직하게는 GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LMO2 및 SCL, 및 이들의 조합, 및 보다 특히 바람직하게는 LMO2를 암호화하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 CEN 경로 유전자.
다른 특수한 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 방법에 사용된 HSC는 유전적으로 변형되어 다음을 과발현한다:
(i) HTERT, BMI1, c-MYC, l-MYC 및 MYB, 및 이들의 조합, 바람직하게는 HTERT 및/또는 BMI1, 및 보다 특히 바람직하게는 HTERT 및 BMI1를 암호화하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자; 및
(ii) 바람직하게는 EPO-R, JAK2, STAT5P, BCL-XL 및 BCL-2, 및 이들의 조합, 및 보다 특히 바람직하게는 BCL-XL를 암호화하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL 경로 유전자; 및
(iii) 바람직하게는 GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LMO2 및 SCL, 및 이들의 조합, 및 보다 특히 바람직하게는 LMO2를 암호화하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 CEN 경로 유전자.
바람직한 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 다음을 과발현한다:
(i) HTERT를 암호화하는 유전자, 및 임의로 BMI1을 암호화하는 유전자, 및
(ii) LMO2를 암호화하는 유전자 및/또는 BCL-XL을 암호화하는 유전자, 바람직하게는 BCL-XL을 암호화하는 유전자.
특히, HSC는 유전적으로 변형되어 HTERT를 암호화하는 유전자 및 BCL-XL을 암호화하는 유전자, 및 임의로 BMI1을 암호화하는 유전자를 과발현할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 다음을 과발현한다:
(i) HTERT 및 BMI1을 암호화하는 유전자, 및
(ii) LMO2를 암호화하는 유전자 및/또는 BCL-XL을 암호화하는 유전자.
특히, HSC는 유전적으로 변형되어 다음을 과발현할 수 있다:
(i) HTERT 및 BMI1을 암호화하는 유전자 및 LMO2, 또는
(ii) HTERT 및 BMI1을 암호화하는 유전자 및 BCL-XL을 암호화하는 유전자.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "과발현", "과발현하다" 또는 "과발현하는"은 비-유전적으로 변형된 세포내에서 동일한 유전자의 발현 수준보다 더 높은 유전적으로 변형된 세포내 유전자의 발현 수준을 지칭한다. 세포가 유전적 변형 전 그러나 이를 변형 후 발현하는 문제의 유전자를 발현하지 않는 경우, 이러한 용어는 "발현", "발현하다" 또는 "발현하는"으로 대체될 수 있다.
HSC내 유전자의 과발현은 기술자에게 공지된 임의의 기술에 의해, 특히 과발현될 하나 이상의 유전자, 또는 과발현될 유전자 중 하나를 각각 포함하는 수개의 핵산을 포함하는 핵산의 HSC내로 도입시킴에 의해 달성할 수 있다. 따라서 하나 이상의 핵산은 동일한 작제물(construct) 또는 별도의 작제물 위에 정렬될 수 있다. 이들은 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해, 특히 바이러스 형질도입, 미세주사, 형질감염, 전기천공(electroporation) 및 유전자총법(biolistics)에 의해 HSC내로 도입시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "작제물"은 발현 카세트 또는 발현 벡터를 지칭한다.
발현 카세트내에서, 과발현될 하나 이상의 유전자는 이의 발현을 위해 필요한 서열에 작동적으로 연결된다. 특히, 이들은 HSC내에서 이들의 발현을 허용하는 프로모터의 제어하에 존재할 수 있다. 일반적으로, 발현 카세트는 전사를 개시하기 위한 프로모터, 하나 이상의 유전자, 및 전사 터미네이터를 포함하거나 이로 이루어진다. 표현 "작동적으로 연결된"은 성분이 조합됨으로써 암호화 서열의 발현이 전사 프로모터의 제어하에 존재함을 나타낸다. 전형적으로, 프로모터의 서열은 목적한 하나 이상의 유전자의 상부(5')에 위치한다. 스페이서 서열(spacer sequence)은 조절 성분과 유전자 사이에 존재할 수 있으며, 단 이들은 암호화된 단백질의 해독에 의해 발현을 방지하지 않는다. 발현 카세트는 또한 프로모터에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 "인핸서(enhancer)" 활성화 서열을 포함할 수 있다.
발현 벡터는 기술된 바와 같은 하나 이상의 핵산 또는 발현 카세트를 포함한다. 이러한 발현 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시켜 목적한 핵산을 상기 세포내에서 발현시킬 수 있다. 벡터는 기술자에게 잘 공지된, 통상의 분자 생물학 기술에 의해 작제할 수 있다.
유리하게는, 발현 벡터는 목적한 핵산의 발현을 허용하는 조절 성분을 포함한다. 이러한 성분은 예를 들면, 전사 프로모터, 전사 활성인자, 터미네이터 서열, 출발 및 정지 코돈을 포함할 수 있다. 이러한 성분을 선택하기 위한 방법은 기술자에게 잘 알려져 있다.
벡터는 환형 또는 선형, 단일- 또는 이중-가닥일 수 있다. 이는 플라스미드, 파아지, 파지미드, 바이러스, 코스미드 및 인공 염색체로부터 유리하게 선택된다. 바람직하게는, 벡터는 바이러스 벡터이다.
과발현될 하나 이상의 유전자는 동일한 핵산에 존재하는지의 여부에 상관없이, 동일하거나 상이한 구성 또는 유도성 프로모터의 제어하에 위치할 수 있다.
HSC는 일시적으로 또는 안정하게 형질전환/형질감염될 수 있으며 하나 이상의 핵산, 카세트 또는 벡터는 에피솜(episome)으로서 세포내에 함유되거나 HSC 게놈내로 통합될 수 있다. 이들은 동일하거나 상이한 영역내 진핵세포 게놈내로 삽입될 수 있다.
목적한 유전자의 안정하거나 일시적인 발현을 허용하는 기술자에게 잘 공지된 많은 기술이 존재한다. 특히, 목적한 유전자를 표적화된 발현 시스템, 특히 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하는 녹-인 기술(knock-in technique)을 사용하여 세포의 게놈내로 통합시킬 수 있다(참고: 예를 들면, Platt et al. Cell. 2014 Oct 9; 159(2):440-55 또는 Lo et al. Biotechniques. 2017 Apr 1; 62(4):165-174). 예정된 유전자자리에서 세포 게놈내로 삽입될 목적한 하나 이상의 유전자의 단일 카피는 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 유전자 및 하나 이상의 유전자가 삽입될 유전자자리에 대해 특이적인 가이드 RNA(gRNA)의 조화된 발현을 허용하는 하나 이상의 벡터의 형질감염을 기반으로 한다. 상기 목적한 하나 이상의 유전자 또는 상기 목적한 하나 이상의 유전자를 함유하는 카세트는 Cas9에 의해 생성된 브레이크(break)의 복구의 결과로서 삽입된다.
본 출원에 사용된 바와 같은, 용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 Cas9과 상호작용하여 이를 표적 염색체 영역내로 안내할 수 있는 RNA 분자를 지칭한다.
각각의 gRNA는 다음 2개의 영역을 포함할 수 있다:
- 표적 염색체 영역에 대해 상보성이고 내인성 CRISPR 시스템의 crRNA를 모사(mimic)하는, gRNA의 5' 말단에서의 제1 영역(일반적으로 "SDS" 영역으로 지칭됨), 및
- 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)와 내인성 CRISPR 시스템 crRNA 사이의 염기 쌍식 상호작용을 모사하고 3' 말단에서 필수적으로 단일-가닥 서열을 지닌 이중 가닥 줄기-루프 구조를 갖는, gRNA의 3' 말단에서의 제2 영역(일반적으로 "핸들(handle)" 영역으로 공지됨). 이러한 제2 영역은 gRNA-Cas9 결합에 필수적이다.
목적한 유전자 또는 목적한 하나 이상의 유전자를 포함하는 카세트는 gRNA에 의해 표적화된 브레이크 부위의 동족 서열에 의해 플랭킹(flanking)됨으로써 유전자 또는 카세트가 동종 재조합에 의한 브레이크 복구를 통해 삽입되도록 한다.
구성적 발현을 허용하는 프로모터의 예는 pEF1 알파 롱(alpha long), pCMV 및 pCAG를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용될 수 있는 유도성 발현 시스템은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세균 내에 존재하는 테트라사이클린 리프레서(TetR) 단백질을 헤르페스 바이러스내에 존재하는 VP16 단백질의 활성화 도메인과 융합시킴으로써 생성된, 테트라사이클린 트랜스활성인자 단백질(tTA)의 사용을 기반으로 하는, Tet-On 시스템이다. rtTA 단백질은 테트라사이클린과 결합한 경우에만 특이적인 TetO 오페레이팅 서열에서 DNA에 결합할 수 있다. 수개의 반복된 TetO 서열이 EF1 알파 롱 프로모터와 같은 프로모터의 제어 하에 위치한다. 프로모터에 커플링된 TetO 서열은 테트라사이클린 반응 성분(TRE)으로 불리며 프로모터의 제어 하에 유전자의 발현에 있어서의 증가를 유발시킴으로써 테트라사이클린 트랜스활성인자 단백질(tTA) 결합에 대해 반응한다.
수개의 유전자가 과발현되는 경우, 이들은 동일한 프로모터 또는 수개의 프로모터의 제어하에 위치할 수 있다.
특수한 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 HTERT, BMI1, c-MYC, l-MYC 및 MYB, 및 이들의 조합, 바람직하게는 HTERT 및/또는 BMI1, 및 보다 특히 바람직하게는 HTERT 및 BMI1를 암호화하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현하며, 이러한 및 이들 유전자는 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어 하에 위치한다.
특수한 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 바람직하게는 GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LMO2 및 SCL, 및 이들의 조합, 및 보다 특히 바람직하게는 LMO2를 암호화하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 하나 이상의 CEN 경로 유전자를 과발현시키며, 이러한 또는 이들 유전자는 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어 하에 위치한다.
특수한 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 바람직하게는 EPO-R, JAK2, STAT5P, BCL-XL 및 BCL-2, 및 이들의 조합, 및 보다 특히 바람직하게는 BCL-XL을 암호화하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL 경로 유전자를 과발현시키며, 이러한 또는 이들 유전자는 하나 이상의 구성 프로모터의 제어 하에 위치한다.
바람직한 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 유도성 프로모터의 제어하에서 HTERT를 암호화하는 유전자 및 구성 프로모터의 제어하에서 BCL-XL을 암호화하는 유전자를 과발현시킨다.
다른 바람직한 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어하에서 HTERT, BMI1 및 LMO2를 암호화하는 유전자를 과발현시킨다.
다른 바람직한 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어하에서 HTERT 및 BMI1을 암호화하는 유전자 및 구성 프로모터의 제어하에서 BCL-XL을 암호화하는 유전자를 과발현시킨다.
대안적으로, 또는 상술한 유전적 변형 외에, 본 발명에 따른 방법에서 사용된 바와 같은 HSC는 또한 유전적으로 변형되어 자살 유전자, 예를 들면, HSV-TK 유전자 또는 Casp9 유전자를 유도성 프로모터의 제어 하에 함유할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "자살 유전자"는 고려된 자살 유전자에 따라서, 추가의 분자(의약 또는 다른 것)의 존재 또는 부재하에서 이의 발현이 이를 발현하는 분열가능한 세포의 사멸을 유발시키는 임의의 유전자를 지칭한다. 예로서, HSV-TK 유전자 또는 Casp9 유전자를 발현하는 세포의 세포 사멸은 간시클로비르 또는 AP1003을 가함으로써, 각각 수득된다.
특정의 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 방법에 사용된 바와 같은 HSC는 무한증식 HSC이다. 이러한 무한증식 세포는 상술한 바와 같이 추가로 유전적으로 변형될 수 있다.
무한증식 HSC는 악성종양 세포로부터 확립된 무한증식 세포주로부터 수득될 수 있다.
바람직하게는, 무한증식 HSC는 비-악성종양 세포로부터, 예를 들면, iPS로부터(Kurita et al. PLoS ONE, 2013, 8, e59890), 제대혈 세포로부터(Kurita et al. supra; Huang, X. et al. Mol. Ther. 2014, 22, 451-463), 배아 줄기 세포로부터(Hirose, S. et al. Stem Cell Rep. 2013, 1, 499-508) 확립된 무한증식 세포주, 또는 골수로부터, 세포성분채집술로부터 또는 전 말초 혈액으로부터 단리된 HSC(Trakarnsanga et al., 2017, Nature Communications, Vol. 8, 14750)로부터 확립된 무한증식 세포로부터 수득된다.
HSC는 기술자에게 공지된 임의의 기술에 의해, 특히 사람 파필로마바이러스 제16형 종양유전자 E6 및 E7(HPV16 E6/E7)에 의해 무한증식시킬 수 있다(Akimov et al. Stem 세포. 2005 Oct; 23(9): 1423-1433; Trakarnsanga et al. supra). 임의로, HSC는 또한 HTERT를 암호화하는 유전자를 수반하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시킬 수 있다(Akimov et al., 상기 참고).
바람직한 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 방법에서 사용된 무한증식 HSC는 적혈구 전구체의 성숙한 제핵된 적혈구로의 성숙의 유도후 이들의 제거를 허용하는 자살 유전자를 함유한다.
본 발명에 따른 방법은 상기 기술된 바와 같은 HSC를 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제, 및 보다 특히 조혈 세포주의 세포의 성장 및/또는 분화에 대해 맞춰지고 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제를 포함하는 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "자가포식(autophagy)," "자가분해(autolysis)" 및 "자가포식작용(autophagocytosis)"은 동일하며 상호교환적으로 사용될 수 있다. 자가포식은 이의 자체의 라이소좀에 의해 세포의 세포질의 부분의 분해를 지칭한다.
자가포식은 특정 단백질(바이러스성, 기형인 등) 및 손상된 세포기관을 제거하는 것을 돕는 생리학적 방법이다. 이러한 방법은 또한 세포내 병원체의 제거에 관여될 수 있다. 수개의 신호전달 경로는 영양 고갈 내지 미생물 침입 범위의 상이한 유형의 세포 스트레스를 검출하며, 자가포식을 조절하기 위해 집중한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "자가포식 유도제"는 세포내에서 자가포식을 유도할 수 있는 분자를 지칭한다.
특히, 자가포식 유도제는 mTOR 경로 억제제, 예를 들면, 메트포르민, 라파마이신, 페리포신, 에베롤리무스, 레스베라트롤 또는 타목시펜, 자가포식소체 형성 활성인자, 예를 들면, 화합물 MG-132(26S 프로테오좀 억제제), 화합물 SAHA(팬-히스톤 데아세틸라제 억제제), 트리코스타틴 A 또는 발프로산, 또는 mTOR 경로와 독립적으로 작용하는 소 분자, 예를 들면, SMER-28, SMER-10 또는 SMER 18일 수 있다.
특수한 구현예에 따라서, 자가포식 유도제는 바람직하게는 라파마이신-28의 소-분자 인핸서(SMER-28), SMER 10 및 SMER 18, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, mTOR 경로와 독립적으로 작용하는 유도제이다.
바람직한 구현예에 따라서, 자가포식 유도제는 SMER-28이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "글루코코르티코이드 호르몬", "글루코코르티코이드", "코르티코스테로이드", 또는 "코르티코이드"는 동일하며 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 용어는 프게그난 핵 및 단백질 및 탄수화물 대사에서 작용을 지닌 천연 또는 합성 스테로이드 호르몬을 지칭한다.
일 구현예에 따라서, 글루코코르티코이드 호르몬은 코르티손, 하이드로코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 파라메타손, 베타메타손, 덱사메타손, 코르티바졸, 및 이들의 유도체 및 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특수한 구현예에 따라서, 글루코코르티코이드 호르몬은 바람직하게는 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 파라메타손, 베타메타손, 덱사메타손, 코르티바졸, 및 이들의 유도체 및 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 합성 호르몬이다.
바람직한 구현예에 따라서, 글루코코르티코이드 호르몬은 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 및 이들의 유도체 및 혼합물로 이루어진 그룹으로부터, 바람직하게는 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특히 바람직한 구현예에 따라서, 글루코코르티코이드 호르몬은 덱사메타손이다.
특수한 구현예에 따라서, 자가포식 유도제는 SMER-28, SMER 10 및 SMER 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게는 SMER-28이고, 글루코코르티코이드 호르몬은 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게는 덱사메타손이다.
매우 특수한 구현예에 따라서, 자가포식 유도제는 SMER-28이고 글루코코르티코이드 호르몬은 덱사메타손이다.
임의로, HSC는 또한 HIF 경로의 활성인자와 접촉될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "HIF 경로"는 EPO 분비를 자극함으로써 EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL 경로를 활성화시키는 저산소증-유도성 인자(HIF)에 의해 개시된 신호전달 경로를 지칭한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 HIF 경로 활성인자는 프롤릴 하이드록실라제(PHIS) 억제제이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "프롤릴 하이드록실라제(PHIS)" 및 "프로콜라겐-프롤린 디옥시게나제"는 동일하며 상호교환적으로 사용될 수 있다. 프롤릴 하이드록실라제는 이의 프롤릴 잔기 상에서 HIF의 하이드록실화 효소이다. 하이드록실화된 경우, HIF가 억제된다. 따라서, 프롤릴 하이드록실라제의 특이적인 억제제는 프롤릴 하이드록실라제를 억제함으로써 궁극적으로 EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL 경로를 활성화시키는 HIF 경로를 활성화시킬 수 있다.
바람직하게는, 프롤릴 하이드록실라제 억제제는 디메틸옥살릴글리신(DMOG), N-옥살릴글리신(NOG), 데스페리옥사민(DFO), FG-4383, F-0041, FG-2216, FG-4592, S956711, 에틸-3,4 디하이드록시-벤조에이트(EDHB), TM6089, TM655, TM6008, 8-하이드록시퀴놀린, 및 이들의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
가장 특히 바람직하게는, HIF 경로 활성인자는 DMOG이다.
본 발명에 따른 방법의 시행 동안에, HSC는 조혈 세포주의 세포의 성장 및/또는 분화에 맞춰진 배양 배지 속에서 배양된다. HSC의 영양 요건에 맞춰진 많은 배양 배지가 기술자에게 공지되어 있고 바람직하게는 줄기 세포 인자(SCF), 에리스로포이에틴(EPO), 및 지질이 보충된 StemSpan SFEM(STEMCELL Technologies) 또는 StemMACS HSC Expansion Media XF, 사람"(Invitrogen)과 같이 상업적으로 이용가능하다.
바람직하게는, HSC는 200 내지 10000개의 세포/mL, 바람직하게는 500 내지 2000개의 세포/mL, 및 보다 바람직하게는 대략 1000개의 세포/mL의 농도에서 배양된다.
배양 배지는 바람직하게는 약 3일마다 변화됨으로써 세포가 약 4000000개의 세포/mL의 농도를 초과하지 않도록 한다.
HSC는 배양 첫날 또는 수일 배양 후, 예를 들면, 10 내지 15일 후 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제와 접촉될 수 있다.
바람직하게는, HSC는 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제와 동시 접촉된다.
대안적으로, HSC는 글루코코르티코이드 호르몬과 우선 접촉된 후 자가포식 유도제와 접촉되거나, 역으로 접촉될 수 있다. 제2 화합물의 첨가는 예를 들면 제1 화합물과의 접촉 후 수시간내에 일어날 수 있다.
바람직하게는, HSC는 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제와 동시에 접촉된다. 보다 특히 바람직하게는, HSC는 배양 첫날로부터 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제와 동시에 접촉된다.
접촉은 글루코코르티코이드 호르몬 및/또는 자가포식 유도제를 HSC 배양 배지에 가하거나 HSC를 글루코코르티코이드 호르몬 및/또는 자가포식 유도제를 함유하는 배양 배지 속에 위치시킴으로써 달성할 수 있다.
글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제의 농도는 일정할 수 있거나 배양 또는 접촉 전체에서 변할 수 있다.
바람직하게는, 배양 배지가 글루코코르티코이드 호르몬을 함유하는 경우, 후자는 0.001 mM 내지 10 mM, 바람직하게는 0.01 mM 내지 1 mM, 보다 바람직하게는 0.01 mM 내지 0.5 mM, 및 특히 바람직하게는 0.02 mM 내지 0.1 mM의 농도에서 존재한다.
특수한 구현예에서 따라서, 배양 배지가 글루코코르티코이드 호르몬을 함유하는 경우, 후자는 약 0.1 mM의 농도로 존재한다.
바람직하게는, 배양 배지가 자가포식 유도제를 포함하는 경우, 후자는 배양 배지 속에 0.1 μM 내지 100 μM, 바람직하게는 0.5 μM 내지 50 μM, 보다 바람직하게는 1 μM 내지 30 μM, 및 특히 바람직하게는 2 μM 내지 30 μM의 농도에서 존재한다. 대안적으로, 배양 배지가 자가포식 유도제를 포함하는 경우, 후자는 배양 배지 속에 10 μM 내지 30 μM의 농도로 존재할 수 있다.
특수한 구현예에 따라서, 배양 배지가 자가포식 유도제를 포함하는 경우, 후자는 배양 배지 속에 약 2 μM의 농도로 존재한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약"은 명시된 값의 ± 5%, 바람직하게는 명시된 값의 ± 2%의 값의 범위를 지칭한다. 예를 들면, "약 20"는 20 ± 5%, 또는 19 내지 21을 포함한다.
유사하게, HSC가 HIF 경로 활성인자의 존재하에 위치하는 구현예에서, 활성인자의 농도는 일정할 수 있거나 배양 또는 접촉 전체에서 변할 수 있다.
바람직하게는, 배양 배지가 HIF 경로 활성인자, 바람직하게는 DMOG를 포함하는 경우, 후자는 배양 배지 속에 1 μM 내지 1000 μM, 바람직하게는 10 μM 내지 500 μM, 보다 바람직하게는 50 μM 내지 400 μM, 및 특히 바람직하게는 75 μM 내지 350 μM의 농도에서 존재한다.
특수한 구현예에 따라서, HSC는 글루코코르티코이드 호르몬, 바람직하게는 덱사메타손, 및 자가포식 유도제, 바람직하게는 SMER28의 존재하에 배양 10 내지 15일 후 존재한다. 바람직하게는, 이러한 구현예에 따라서, 글루코코르티코이드 호르몬의 농도는 0.01 mM 내지 0.5 mM, 및 보다 특히 바람직하게는 0.02 mM 내지 0.1 mM이고, 자가포식 유도제의 농도는 10 μM 내지 30 μM이다.
다른 특수한 구현예에 따라서, HSC는 글루코코르티코이드 호르몬, 바람직하게는 덱사메타손, 및 자가포식 유도제, 바람직하게는 SMER28의 존재하에서 배양 첫날 또는 배양 10일 전에 위치한다. 바람직하게는, 이러한 구현예에 따라서, 글루코코르티코이드 호르몬의 농도는 0.01 mM 내지 0.5 mM, 바람직하게는 약 0.1 mM이고, 자가포식 유도제의 농도는 2 μM 내지 30 μM, 바람직하게는 약 2 μM이다.
HSC는 바람직하게는 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제, 및 임의로 HIF 경로 활성인자를 함유하는 배양 배지 속에서, 적어도 10일 동안 유지된다. 보다 특히 바람직하게는, HSC는 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제를 함유하는 배양 배지 속에 적어도 20, 30, 40, 50 또는 60일 동안 유지된다.
이러한 단계 동안 세포 배양물은 HSC 뿐만 아니라 적혈구 전구체도 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명자들은 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제를 함유하는 배양 배지의 사용이 적혈구 전구체의 생산을 유의적으로 증폭시켰으며, 이는 말단 적혈구 분화 경로에 연루되지 않음을 입증하였다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라서, HSC는 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제를 함유하는 배양 배지 속에서 적어도 60, 70, 80, 90 또는 100일 동안 배양할 수 있다. 바람직하게는, HSC는 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제를 함유하는 배양 배지 속에서 최대 70, 80, 90 또는 100일 동안 배양된다.
HSC 배양 기간 및 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제, 및 임의로 HIF 경로 활성인자와의 접촉 시간은 세포 집단 속에 존재하는 적혈구 전구체의 비율을 평가함으로써 기술자에 의해 용이하게 정의될 수 있다. 바람직하게는, HSC는 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제와 적어도 90% 적혈구 전구체, 바람직하게는 적어도 95% 적혈구 전구체, 보다 바람직하게는 적어도 99% 적혈구 전구체를 포함하는 집단이 수득될 때까지 접촉된다.
배양물은 성숙한 적혈구로의 성숙 마커가 나타날 때까지 유지할 수 있다. 바람직하게는, 배양은 세포가 더이상 증식하지 않고/않거나 이들 중 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만이 막 수용체 CD117을 발현하는 경우 정지된다. 대안적으로, 배양은 배양물 속의 세포의 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%가 다염성 적혈모구 단계에 이르거나 보다 진전된 분화 단계에 있는 경우 중지될 수 있다.
특정의 구현예에 따라서, 방법은 배양 배지가 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제, 및 임의로 HIF 경로 활성인자를 포함하는 동안 배양물의 상, 및 배양 배지가 글루코코르티코이드 호르몬, 자가포식 유도제, 및/또는 HIF 경로 활성인자를 포함하지 않는 배양물의 상을 교호시킴을 포함할 수 있다.
글루코코르티코이드 호르몬, 자가포식 유도제 및 HIF 경로 활성인자는 배양 배지에 또는 이로부터 동시 또는 연속적으로 첨가되거나 제거될 수 있다.
배양 배지의 조성을 변경시키는 기술은 기술자에게 잘 알려져 있다. 특히, 분자의 첨가 또는 이의 농도에 있어서의 증가는 기존의 배양 배지내에서 직접 수행될 수 있으며 분자의 제거 또는 이의 농도에 있어서의 감소는 세포를 원심분리하고 이들을 새로운 배양 배지 속에 재현탁시키거나 배양 배지를 희석시킴으로써 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 수득된 적혈구 전구체를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 단계는 기술자에게 공지된 임의의 기술, 특히 원심분리 및 배양 배지의 제거에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 세포 분류 단계, 특히 마커 CD117의 발현을 기반으로 한 세포 선택 단계를 포함할 수 있다. CD117+ 세포를 선택하여 적혈구 전구체 세포의 증폭을 연장시킬 수 있다. 역으로, CD117- 세포를 선택하여 적혈 세포를 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 또한 수득/회수된 적혈구 전구체를 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단계는 기술자에게 공지된 임의의 기술, 특히 연속적인 원심분리 및 재현탁 단계로 수행할 수 있다.
특수한 양태에 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득된 적혈구 전구체의 집단에 관한 것이다.
다른 양태에 따라서, 본 발명은 또한 적혈구의 생산을 위한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 적혈구 전구체의 용도에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "적혈 세포", "성숙한 적혈 세포", "적혈 세포", "적색 소체(red corpuscle)", "적혈구" 및 "성숙한 적혈구"는 동일하며, 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "적혈구"는 적혈구 성숙의 특징적인 마커를 지닌 제핵된 세포를 지칭한다. 이들은 특히 글리코포린 A(CD235a)를 발현하지만 마커 CD36은 발현하지 않는다.
따라서, 본 발명은 다음을 포함하는 적혈구의 시험관내 생산 방법에 관한 것이다:
- 상술한 본 발명의 방법에 따른 적혈구 전구체를 생산하는 단계; 및
- 적혈구 전구체의 성숙을 유도하는 단계.
본 발명에 따른 적혈구 전구체의 생산을 위한 방법을 위한 상술한 구현예가 또한 당해 양태에서 고려된다.
적혈구 전구체의 성숙은 적혈구 성숙 마커, 예를 들면, CD235a의 발현 및 제핵(enucleation)을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 세포 분류 단계, 특히 CD117-세포 선택 단계를 포함할 수 있다.
전구체의 성숙은 기술자에게 공지된 임의의 방법으로 유도할 수 있다. 특히, 성숙은 적혈구 전구체를 적혈구 분화 배지, 예를 들면, 에리스로포이에틴 및 임의로 SMER28이 보충된 배지 속에서 배양함으로써 유도할 수 있다. 바람직하게는, 성숙은 적혈구 전구체를 줄기 세포 인자(SCF) 또는 덱사메타손을 포함하지 않는 배지 속에서 배양함으로써 유도되며 에리스로포이에틴(약 2.5 IU/mL) 및 임의로 SMER28(약 2.5 μM)로 보충된다. 대안적으로, 성숙은 세포를 혈청-유리된 배양 배지 속에 둠으로써 유도된다. 바람직하게는, 전구체 성숙은 높은 세포 농도, 예를 들면, 5,000,000개 초과의 세포/mL의 배양물에서 유도된다.
일 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 적혈구의 생산 방법은 또한 제핵된 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 이러한 단계는 성숙한 적혈구만을 포함하는 균질한 집단을 생성한다.
본 발명에 따른 적혈구 전구체의 생산 방법에 사용된 HSC가 유도성 자살 유전자를 포함하는 특수한 구현예에 따라서, 제핵된 세포를 제거하는 이러한 단계는 이러한 자살 유전자의 발현을 유도함으로써 수행될 수 있다.
적혈구를 생산하는 방법은 수득된 적혈구를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 단계는 기술자에게 공지된 임의의 기술, 특히 여과, 원심분리 및 배양 배지의 제거에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 또한 수득된/회수된 적혈구를 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단계는 기술자에게 공지된 임의의 기술, 특히 연속된 여과, 원심분리 및 재현탁 단계에 의해 수행할 수 있다.
다른 양태에 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 방법으로 수득된 적혈구의 집단에 관한 것이다.
다른 양태에 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 수득된 적혈구 전구체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 조혈 이식에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 적혈구 전구체, 또는 본 발명에 따른 적혈구 전구체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "조혈 이식"은 대상체의 골수에 투여되도록 의도되고 적혈구를 생산할 수 있는 세포의 세트를 지칭한다.
본 발명은 또한 빈혈의 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 적혈구 전구체, 또는 본 발명에 따른 적혈구 전구체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "빈혈"은 건강한 적혈 세포의 비정적으로 낮은 수준 및 대상체의 연령에 대해 정상 값 미만의 순환하는 헤모글로빈에 있어서의 감소로 특징화되는 비정상적인 혈액 수(blood count)를 지칭한다. 예로서, 빈혈은 일반적으로 남성의 경우 13 g/dL 미만, 여성의 경우 12 g/dL 미만, 어린이의 경우 11 g/dL 미만 및 신생아의 경우 14 g/dL 미만의 헤모글로빈 수준에 의해 특징화된다
빈혈은 다양한 다수의 원인을 가질 수 있다. 빈혈의 예는 출혈(예를 들면, 외상 또는 수술에 의해 유발된 출혈)과 관련된 빈혈, 약물 치료요법(예를 들면, 화학치료요법) 또는 독성 물질(예를 들면, 지방분해제, 산화제, 납, 뱀독 또는 독소)에 대한 노출에 의해 유발된 빈혈, 적혈구 막의 유전된 장애(유전된 공모양적혈구증, 유전된 타원적혈구증 또는 유전된 피로포이킬로사이토시스(pyropoikilocytosis))에 의해 유발된 용혈성 빈혈, 적혈구 막의 후천적 장애(예를 들면, 발작성 야간혈색소뇨증 또는 가시적혈구증가증)에 의해 유발된 용혈성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈(예를 들면, 수혈 사고), 감염성 제제(예를 들면, 말라리아, 바베시아(Babesia) 또는 바르토넬라(Bartonella) 감염, 트리파노소마증(trypanosomiasis), 내장 리슈만편모충증(visceral leishmaniasis), 패혈증 또는 CMV 감염)에 의해 유발된 빈혈, 유전성 또는 후천성 철적혈모구빈혈, 골수 부전(예를 들면, 골수 억제, 비타민 B12 결핍증, 골수이형성증 또는 악성 혈액병(malignant hematopathy)(백혈병, 림프종, 전이)에 의한 골수 질환 침해)에 의해 유발된 빈혈, 또는 낫형 세포병 또는 지중해 빈혈 증후군(thalassemic syndrome)과관련된 빈혈을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 빈혈은 낫 세포병 또는 지중해 빈혈 증후군과 관련된다.
본 발명은 또한 변혈로 고생하는 환자에게 치료학적 유효량의 본 발명의 방법에 의해 수득된 적혈구 전구체, 또는 본 발명에 따라 수득된 적혈구 전구체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 상기 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 빈혈 치료용 의약, 특히 생물학적 의약의 제조를 위한, 본 발명에 따라 수득된 적혈구 전구체, 또는 상기 전구체를 포함하는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "생물학적 의약"은 이의 활성 물질이 생물학적 공급원에 의해 생산되거나 이로부터 추출된 의약 생성물을 지칭한다.
바람직하게는, 이러한 양태에서, 적혈구 전구체는 비-유전적으로 변형된 HSC로부터 수득된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체" 및 "환자"는 동일하고 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 용어는 바람직하게는 동물, 특히 포유동물, 가장 특히 바람직하게는 사람, 특히 태아, 신생아, 어린이, 10대, 성인 또는 노인을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "태아"는 임신 8주 이상의 자궁내 발달 단계를 지칭하며, 용어 "신생아"는 나이가 12개월 이하인 사람을 지칭하며, 용어 "어린이"는 1 내지 12세인 사람을 지칭하고, 용어 "성인"은 12 내지 60세인 사람을 지칭하며, 용어 "노인"은 60세 이상인 사람을 지칭한다.
환자는 바람직하게는 수혈에 실패했거나, 다중수혈되거나, 희귀 혈액 그룹을 가진 환자이다. 바람직한 구현예에 따라서, 이러한 환자는 빈혈, 특히 낫 세포병 또는 지중해 빈혈 증후군과 관련된 빈혈을 겪는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "수혈 실패"는 환자에서 효과적이지 않고/않거나 환자내에서 병리학적 합병증을 유도하는 수혈을 지칭한다.
적혈 세포 수혈은 적혈 세포 농축물(RCC)의 수혈 후 24시간째에, 수혈 효율이 80% 미만인 경우 효과적이지 않은 것으로 고려될 수 있다.
적혈구 수혈 효율은 다음 식에 의해 계산된다:
수혈된 HB의 최소량은 40 g이고, 관찰된 평균은 50 g이다. TBV는 총 혈액 용적을 지칭한다.
수혈 실패와 관련된 병리학적 합병증은 몇년 후 발생할 수 있으며 환자의 미래 수혈을 절충하는 면역화 수혈(수혈 동종면역화)의 결과일 수 있다. 실제로, 새로운 수혈 동안에, 사전 면역화는 직접적인 용혈 위험(항체가 충분한 역가로 존재하는 경우)을 유발할 수 있거나, 보다 흔히 지연된 용혈(항체가 저 역가로 존재하거나 새로운 수혈 동안 심지어 혈청학적으로 검출되지 않는 경우)을 유발할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "다중수혈된(polytransfused)"은 수회의 혈액 수혈을 받은 환자 및/또는 혈액 수혈을 이미 받았고 다른 것을 제공받을 환자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "희귀 혈액 그룹"은 프랑스 및/또는 유럽 및/또는 세계 집단에서 이의 빈도가 1/250 미만인 혈액 그룹 및/또는 O형-혈액으로 수혈받을 수 없는 것을 지닌 환자를 지칭한다.
수의학적 적용 분야에서, 본 발명의 목적은 비-사람 동물, 바람직하게는 개, 고양이, 소, 양, 토끼, 돼지, 염소, 말, 설치류, 비-사람 영장류 및 가금류로부터 이루어진 그룹으로부터 선택된 농장 동물 또는 애완동물일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료"는 증상을 증진시키거나 제거하고, 질환의 진행을 지연시키거나, 질환의 진행을 중지하거나 질환을 제거하는 것을 목적으로 하는 임의의 활동을 지칭한다. 이러한 용어는 보다 구체적으로 건강한 적혈 세포 및 순환하는 헤모글로빈의 수준에 있어서, 바람직하게는 대상체의 연령에 대해 정상인 값까지 이르는 증가를 지칭한다. 이러한 용어는 예방적 및 치유적 치료 둘 다를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료학적 유효량"은 치료된 대상체내에서 상태의 적어도 하나의 증상에서 효과를 갖고, 보다 구체적으로 건강한 적혈 세포 및 순환하는 헤모글로빈의 수준을 증가시키는데 충분한 양을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체" 및 "약제학적으로 허용되는 지지체"는 동일하며 약제학적 조성물 속에 존재하는 활성 주요성분 이외의 임의의 물질을 지칭한다. 이의 첨가는 특히 이들의 특성을 변형시키지 않으면서, 세포의 보존 및 투여를 용이하게 함을 의도한다. 본 발명에 따라 적혈구 또는 적혈구 전구체를 함유하는 조성물의 제형에 사용된 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들면, 염수, 사람 혈청 알부민이 첨가된 PBS 용액, 및 이의 혼합물, 또는 적혈구 및/또는 전구체의 보존에 적합한 삼투압을 갖고, 바람직하게는 대상체에게 직접 투여될 수 있는 임의의 다른 염수 용액으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 적혈구를 함유하는 조성물의 제형을 위해, 염수-아데닌-글루코즈-만니톨(SAGM) 배지를 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 단독으로 또는 상기 나열된 다른 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 사용할 수 있다.
바람직하게는, 전구체, 또는 이식체의 투여는 환자의 골수에서 또는 정맥내 주사에 의해 수행된다.
바람직한 구현예에 따라서, 적혈구 전구체를 생산하는데 사용된 조혈 줄기 세포는 공여체 샘플로부터 또는 공여체로부터 수득된 세포로부터 유래되며 적혈구 전구체는 수용자 환자내로 수혈되는 것으로 의도된다. 공여자 및 수용자는 동일한 개인(자가 이식체) 또는 상이한 개인(동종이계 이식체)일 수 있다. 바람직하게는, 공여자 및 수용자는 동일한 개인이다.
다른 양태에 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득된 적혈구 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 또는 의약, 특히 생물학적 의약에 관한 것이다.
본 발명은 또한 빈혈을 앓고 있는 환자, 즉, 적혈구의 공급을 필요로 하는 환자의 수혈을 위한, 본 발명의 방법에 의해 수득된 적혈구 또는 본 발명에 따라 수득된 적혈구를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득된 적혈구, 또는 본 발명에 따른 적혈구를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, 빈혈을 앓고 있는 환자, 즉, 적혈구의 공급을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 빈혈의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 방법에 의해 수득된 적혈구 또는 본 발명에 따라 수득된 적혈구를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는, 빈혈은 낫 세포병 또는 지중해 빈혈 증후군과 관련된 빈혈이다.
바람직하게는, 환자는 수혈 실패되거나, 다중수혈되거나, 희귀 혈액을 가진다.
맞춤형 의약의 맥락에서, 환자에게 투여될 예정이거나 투여된 적혈구는 다음을 포함하는 적혈 세포의 생산을 위한 시험관내 방법에 따라 수득된다:
- 상기 환자로부터의 샘플로부터 HSC를 수득하는 단계;
- 본 발명의 방법에 따라 상기 HSC로부터 적혈구 전구체를 수득하는 단계; 및
- 본 발명의 방법에 따라 상기 적혈구 전구체로부터 적혈구를 수득하는 단계.
HSC는 환자의 혈액 또는 골수의 샘플로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, HSC는 환자로부터 수득된 분화된 체세포의 유전적 재프로그래밍에 의해 수득된 iPSC로부터 수득될 수 있다.
HSC는 상술한 바와 같이 임의로 유전적으로 변형될 수 있다.
다른 양태에 따라서, 본 발명은 또한 다음을 과발현시키기 위해 유전적으로 변형된 HSC에 관한 것이다:
(i) HTERT, BMI1, c-MYC, l-MYC 및 MYB, 및 이들의 조합, 바람직하게는 HTERT 및/또는 BMI1, 및 보다 특히 바람직하게는 HTERT 및 BMI1을 암호화하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자; 및
(ii) 바람직하게는 EPO-R, JAK2, STAT5P, BCL-XL 및 BCL-2, 및 이들의 조합, 및 보다 특히 바람직하게는 BCL-XL을 암호화하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 하나 이상의 EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL 경로 유전자; 및/또는
(iii) 바람직하게는 GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LMO2 및 SCL, 및 이들의 조합, 및 보다 특히 바람직하게는 LMO2를 암호화하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 CEN 경로 유전자.
적혈구 전구체의 생산 방법에 사용된 HSC에 관한 구현예가 본 양태에서 또한 고려된다.
바람직한 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 유도성 프로모터의 제어하에 HTERT를 암호화하는 유전자 및 구성 프로모터의 제어하에 HTERT를 암호화하는 유전자를 과발현한다.
다른 바람직한 구현예에 따라서, HSC는 유전적으로 변형되어 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어하에 HTERT, BMI1 및 LMO2를 암호화하는 유전자를 과발현한다.
다른 바람직한 구현예에서, HSC는 유전적으로 변형되어 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어하에 HTERT 및 BMI1을 암호화하는 유전자 및 구성 프로모터의 제어하에 BCL-XL을 암호화하는 유전자를 과발현한다.
유전적으로 변형된 HSC는 또한 상술한 바와 같은 자살 유전자를 함유할 수 있거나 무한증식될 수 있다.
본 발명은 특히 상술한 본 발명의 방법에 따른, 적혈구 전구체 및/또는 적혈구의, 바람직하게는 시험관내, 생산을 위한 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 HSC의 용도에 관한 것이다.
여전히 다른 양태에 따라서, 본 발명은 HSC의 영양적 요건에 대해 맞춰지고, 특히 조혈 세포주의 세포의 성장 및/또는 분화에 맞춰지고, 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제, 및 임의로 HIF 경로 활성인자를 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다.
적혈구 전구체의 생산을 위한 방법에 사용된, 글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제, 및 임의로 HIF 경로 활성인자를 포함하는 배지에 관한 구현예가 이러한 양태에서 고려된다.
글루코코르티코이드 호르몬 및 자가포식 유도제는 본 발명에 따른 방법에 대해 상기 정의된 바와 같다. 바람직하게는, 글루코코르티코이드 호르몬은 덱사메타손이고/이거나 자가포식 유도제는 SMER28이고/이거나 HIF 경로 활성인자는 DMOG이다.
조혈 세포주의 세포의 성장 및/또는 분화에 맞춰진 세포 배양 배지의 기재(base)는 HSC 및/또는 적혈구 전구체의 필요성을 충족시키는 기술자에게 공지된 임의의 기재일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "성장"은 세포의 증폭을 지칭한다. 용어 "분화"는 배지를 접종시키는데 초기에 사용된 세포내에 존재하지 않는 특성의 배양된 세포에 의한 획득을 지칭한다. 본 경우에, 이러한 용어는 적혈구 전구체의 특성의 획득을 지칭한다. 따라서, 조혈 세포주의 세포의 성장 및/또는 분화에 맞춰진 배지는 HSC의 적혈구 전구체로의 분화 뿐만 아니라 HSC 및 적혈구 전구체의 증폭을 허용하는 배지이다. 이러한 용어는 본원에서 적혈구 전구체가 적혈 세포로 될 것이고 특히 세포의 제핵을 포함하는 방법을 정의하는 "성숙"과는 혼동되지 않아야 한다. 따라서, 조혈 세포주의 세포의 성장 및/또는 분화에 대해 맞춰진 배지는 이러한 성숙을 유도하는 임의의 화합물을 함유하지 않는다.
세포 배양 배지의 기재는 인슐린, 트랜스페린, 줄기 세포 인자(SCF), 헤파린, IL-3, EPO, 성장 인자, 및/또는 혈청, 혈장, 혈소판 분해물 및/또는 혈청 혼주물이 보충된, 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's modified Dulbecco's medium: IMDM) 또는 HSC의 영양적 요건에 대애 맞춰진 등가의 배지(예를 들면, StemSpan SFEM(STEMCELL Technologies) 또는 StemMACS HSC 확장 배지 XF, 사람, Invitrogen)를 포함할 수 있다. 배지에 가해진 화합물은 바람직하게는 재조합 또는 정제 기술에 의해 수득된 사람 화합물이다. 이러한 상이한 화합물의 농도는 공급업자의 추천 또는 당해 분야의 일반적인 지식을 기반으로 기술자에 의해 용이하게 측정된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "혈청 혼주물(serum pool)"은 바이러스 약독화된 사람 AB 혈장의 혼합물(가장 흔히 100개 이상의 상이한 혈장의 혼합물)을 지칭한다. 이를 수행하기 위해, 수혈 센터로부터의 AB 혈장이 혼합되어, 바이러스-약독화되고 최종적으로 분취된다. 이후에, 혈청 혼주물은 신선하게 사용되거나 동결되어 유지될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "혈소판 분해물"은 혈소판 농도의 분해의 결과로서 수득된 성장 인자가 풍부한 생성물을 지칭한다. 이를 수행하기 위해, 수혈 센터로부터의 혈소판 농축물은 용해되기 전에 혼합할 수 있다. 기술자에게 잘 공지된 상이한 분해, 특히 초음파 분해, 용매 및/또는 세제의 사용, 또는 저온파괴(cryolysis)가 존재한다. 혈소판 농축물은 바람직하게는 저온파괴에 의해 분해된다. 저온파괴는 일반적으로 혈소판을 파괴시키고 이들이 함유하는 성장 인자를 혈장내로 방출시키는, 2개의 주기인, 동결/해동 주기로 이루어진다. 임의로, 분해는 원심분리 및/또는 여과를 수반할 수 있다. 혈소판 분해물은 이후 신선하게 사용되거나 동결되어 유지될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 배지의 기재는 다음이 보충된 상기 정의된 바와 같은 IMDM 또는 등가의 배지이다:
- 약 200 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 바람직하게는 약 300 μg/mL 내지 약 350 μg/mL의 농도, 보다 바람직하게는 약 330 μg/mL의 농도에서의 트랜스페린, 바람직하게는 사람 트랜스페린; 및/또는
- 약 1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 바람직하게는 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 농도, 보다 바람직하게는 약 10 μg/mL의 농도에서의 인슐린, 바람직하게는 사람 인슐린; 및/또는
- 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 3% 내지 약 7%의 농도, 보다 바람직하게는 약 5%의 농도에서의, 바람직하게는 사람의, 혈청, 혈장 또는 혈청 혼주물, 및/또는 약 0.05% 내지 약 0.5%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 0.5%의 농도, 보다 바람직하게는 약 0.3%의 농도에서의 바람직하게는 사람 기원의 혈소판 분해물; 및/또는
- 약 0.5 U/mL 내지 약 10 U/mL, 바람직하게는 약 1 U/mL 내지 약 5 U/mL의 농도, 보다 바람직하게는 약 3 U/mL의 농도에서의 헤파린, 바람직하게는 사람 헤파린.
임의로, 특히 조혈 세포주의 세포의 성장 및/또는 분화에 대해 맞춰진 배양 배지의 경우, 배지는 또한 다음으로 보충될 수 있다:
- 약 1 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 바람직하게는 약 3 ng/mL 내지 약 7 ng/mL의 농도, 보다 바람직하게는 약 5 ng/mL의 농도에서의 IL-3, 바람직하게는 사람 IL-3;
- 약 10 ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 바람직하게는 약 50 ng/mL 내지 약 150 ng/mL의 농도, 보다 바람직하게는 약 100 ng/mL의 농도에서의, 바람직하게는 사람의, SCF; 및/또는
- 약 0.5 IU/mL 내지 약 10 IU/mL, 바람직하게는 약 1 IU/mL 내지 약 5 IU/mL의 농도, 보다 바람직하게는 약 2 IU/mL의 농도에서의, 바람직하게는 사람의, EPO.
특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 배양 배지의 기재는 바람직하게는 상기 정의한 바와 같은 IMDM 또는 등가의 배지이며, 트랜스페린, 인슐린, 헤파린, 및 혈청, 혈장, 혈청 혼주물 또는 혈소판 분해물, 바람직하게는 트랜스페린, 인슐린, 헤파린 및 혈청 혼주물 또는 혈소판 분해물, 보다 특히 바람직하게는, 트랜스페린, 인슐린, 헤파린 및 혈소판 분해물이다. 이러한 화합물은 바람직하게는 상기한 농도로 사용된다.
바람직한 구현예에서, 이러한 배지는 IL-3, SCF 및 EPO를, 바람직하게는 상술한 농도에서 포함한다.
대안적으로, 배지는 SCF 및 EPO를, 바람직하게는 상술한 바와 같은 농도에서 포함할 수 있다.
특수한 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 배지의 기재는 다음을 포함한다:
- 300 μg/mL 내지 350 μg/mL의 농도에서의 트랜스페린, 바람직하게는 사람 트랜스페린;
- 5 μg/mL 내지 20 μg/mL의 농도에서의 인슐린, 바람직하게는 사람 인슐린;
- 3% 내지 7%의 농도에서의, 바람직하게는 사람의, 혈청, 혈장 또는 혈청 혼주물, 및/또는 0.1% 내지 0.5%의 농도에서의, 바람직하게는 사람 기원의, 혈소판 분해물; 및
- 1 U/mL 내지 5 U/mL의 농도에서의 헤파린, 바람직하게는 사람 헤파린, 및 임의로,
- 3 ng/mL 내지 7 ng/mL의 농도에서의 IL-3, 바람직하게는 사람 IL-3;
- 50 ng/mL 내지 150 ng/mL의 농도에서의, 바람직하게는 사람의, SCR; 및/또는
- 1 IU/mL 내지 5 IU/mL의 농도에서의, 바람직하게는 사람의, EPO.
이러한 기재에 가해진 본 발명에 따른 배지는 (i) 자가포식 유도제, 바람직하게는 SMER-28, (ii) 글루코코르티코이드 호르몬, 바람직하게는 덱사메타손, 및 임의로 (iii) HIF 경로 활성인자, 바람직하게는 DMOG를 포함한다.
특수한 구현예에 따라서, 이러한 기재에 가해진 본 발명에 따른 배지는 다음을 포함한다:
- 0.001 mM 내지 10 mM, 바람직하게는 0.002 mM 내지1 mM, 보다 바람직하게는 0.005 mM 내지 0.5 mM, 및 특히 바람직하게는 0.01 mM 내지0.1 mM의 농도에서의 글루코코르티코이드 호르몬, 바람직하게는 덱사메타손; 및
- 0.1 μM 내지 100 μM, 바람직하게는 0.5 μM 내지 50 μM, 보다 바람직하게는 1 μM 내지 30 μM, 및 특히 바람직하게는 2 μM 내지 30 μM의 농도에서의 자가포식 유도제, 바람직하게는 SMER-28; 및
- 임의로, 1 μM 내지 1000 μM, 바람직하게는 10 μM 내지 500 μM, 보다 바람직하게는 50 μM 내지 400 μM, 및 특히 바람직하게는 75 μM 내지 350 μM의 농도에서의 HIF 경로 활성인자, 바람직하게는 DMOG.
특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 배지는 0.005 mM 내지 0.5 mM 글루코코르티코이드 호르몬, 바람직하게는 덱사메타손, 0.5 μM 내지 50 μM의 자가포식 유도제, 바람직하게는 SMER-28, 및 임의로 50 μM 내지 400 μM의 HIF 경로 활성인자, 바람직하게는 DMOG를 포함한다.
다른 특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 배지는 0.01 mM 내지 0.1 mM 글루코코르티코이드 호르몬, 바람직하게는 덱사메타손, 2 μM 내지 30 μM 자가포식 유도제, 바람직하게는 SMER-28, 및 임의로 75 μM 내지 350 μM HIF 경로 활성인자, 바람직하게는 DMOG를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 배지는 비-사람 기원(예를 들면, 태아 송아지 혈청)의 혈청, 트롬보포이에틴, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), IL-6, 골 형성 단백질(BMP), FLT3-리간드 및/또는 하이드로코르티손을 포함하지 않는다.
본 발명은 또한 특히 상술된 본 발명의 방법에 따른, 적혈구 전구체의 생산 및또는 증폭 및/또는 적혈구의 생산, 및 보다 특히, HSC의 적혈구 전구체로의 분화를 자극하고/하거나 적혈구 전구체를 증폭시키기 위한 본 발명에 따른 및 상술된 세포 배양 배지의 용도에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은:
- 본 발명에 따른 세포 배양 배지; 및/또는
- 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 HSC 또는 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 HSC를 수득하기 위한 유전 작제물; 및
- 임의로, 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 안내서를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 상술된 본 발명의 방법에 따라, 적혈구 전구체 및/또는 적혈구를 생산하기 위한 본 발명에 따른 키트의 용도에 관한 것이다.
본원에 이용된 모든 참고문헌, 예를 들면, 학술지 논문 또는 초록, 공개된 특허원, 승인된 특허 또는 임의의 다른 참고문헌은 참고로 본원에 완전히 포함되며, 이는 이러한 참고문헌에 나타난 모든 결과, 표, 도 및 내용을 포함한다.
상이한 의미를 가진다고 해도, 용어 "포함하는", "갖는", "함유하는" 및 "로 이루어진"은 본 발명의 설명 전체에서 서로에 의해 대체될 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 다음의 예시적 및 비-제한적 실시예를 판독시 보다 명확하게 드러날 것이다.
실시예
실시예 1: 제대혈액으로부터 및 세포성분채집술로부터 유래된 HSC로부터 적혈구 전구체의 증폭
물질 및 방법
사용된 배지: 트랜스페린(330 μg/mL), 인슐린(10 μg/mL), 5% AB 혈청 혼주물(EFS) 및 헤파린(3 U/mL)이 보충된 IMDM(Biochrom). 0일로부터 7일까지, 배지에IL-3(5 ng/mL), SCF(100 ng/mL) 및 EPO(2 IU/mL)를 보충하였다. 7일부터 적혈모구 전구체 의 증폭이 끝날때까지, 배지에 SCF(100 ng/mL) 및 EPO(2 IU/mL)를 보충하였다.
HSC:
HSC는 CD34+ 비드(bead)를 사용하여 밀레나이(Milenyi)가 제공된 프로토콜(참고: CD34 MicroBead Kit, 사람, Miltenyi Biotec로부터)에 따라 자기 분리 후 수득한다.
세포 유지:
0일째에, 세포를 10,000 세포/mL의 농도에서 씨딩(seeding)하고, 4일째에, 세포를 새로운 배지 속에서 1/5로 희석시키고, 7일째에, 세포를 세척하고 새로운 배지 속에서 100,000개의 세포/mL로 배양하였다. 11일째에, 세포를 100,000개의 세포/mL로 희석시키고 새로운 배지 속에 씨딩하였다. 14일째에, 세포를 새로운 배지 속에서 300,000 세포/mL로 재씨딩(reseeding)하였다. 18일째에, 세포를 5천만개/mL로 희석시켰다. 이어 21일째로부터, 세포를 각각의 유지일(즉, 주당 2회)에 1 백만개/mL로 전신계적으로 복귀시켰다.
배양 프로토콜:
프로토콜 1: 0일부터 11일까지 세포를 기본 배지 속에서 배양한다. 11일째에 사용된 배지는 253.9 μM의 DMOG이다. 14일째에, 333 μM DMOG, 0.02 mM 덱사메타손 (DEX) 및 30 μM SMER28를 사용된 배지에 가한다. 18일째에 사용된 배지에 0.09 mM DEX 및 20.1 μM SMER28를 보충한다. 21일째에, 0.10 mM DEX 및 24.5 μM SMER28을 사용된 배지에 가하는 반면, 0.10 mM DEX 및 17.4 μM SMER28은 25일째의 배지에 가하였다. 최종적으로, 28일째로부터, 배지에 0.10 mM DEX 및 13.8 μM SMER28로 전신계적으로 보충하였다.
프로토콜 2: 0일부터 배양 말기까지 배지에 0.1 mM DEX 및 2.27 μM SMER28을 보충한다.
프로토콜 3: 0일째로부터 배양 말기까지 배지에 0.1 mM DEX를 보충한다.
프로토콜 4: 본 프로토콜은 대조군 프로토콜이다; 이는 임의의 인자의 첨가없이 기본 배지를 사용하여 수행하였다.
유동 세포분석법
100,000개의 세포를 수집하고, 세척한 후 CD235a 및 CD117 항체에 공급업자의 설명서에 따라 노출시킨다. 실온 및 암실에서 30분 후, 세포를 PBS로 2회 세척한다. 이후에, 세포를 혈구계산 분석을 위해 준비시킨다.
CD235a 항체는 성숙한 적혈구 포함을 나타내는 글리코포린 A를 특이적으로 인식한다;
CD117 항체는 세포의 미성숙도, 혈통 및 세포의 자가-재생 능력을 나타내는 수용체 c-키트(즉, 줄기 세포 인자 수용체)를 특이적으로 인식한다.
세포 수(cell count):
세포를 트립신 블루 용액 속에서 1/10으로 희석시켜 필요할 경우, 세포 사망률이 평가되도록 한다.
결과
표 1: 상이한 프로토콜에 따른 배양 후 세포 수
프로토콜 1 및 2는 적혈모구의 대수적 증폭을 허용한다. 프로토콜 1 및 2에 의해 수득된 증폭은 또한 덱사메타손 단독으로 수득된 것보다 실질적으로 더 높다(표 1). 프로토콜 1 및 2가 세포성분채집술 또는 제대 혈액으로부터 유래된 CD34+ 세포로부터의 적혈구 전구체의 증폭을 허용하는 것을 주목하는 것은 흥미로운 것이다.
C-KIT 마커는 정상 조건하에서의 이러한 조건보다 훨씬 더 오래 견딘다(도 1); 이러한 막 마커는 세포의 젊음 및 증식하는 이의 능력을 나타낸다.
이러한 작업은 본 발명에 따른 배양배지 속의 사람 조혈 줄기 세포의 배양이 다음을 수득하는 것을 가능하게 함을 입증하였다:
- 총 적혈구를 포함한 세포;
- 적혈구 전구체의 대수적 농축 및 증폭.
특히, 증폭은 78일까지 지속될 수 있다.
실시예 2: HTERT, BMI1를 유도적으로 과발현하고 BCL-XL를 구성적으로 과발현하거나 HTERT, BMI1 및 LMO2를 유도적으로 과발현하는 세포성분채집술로부터 유래된 가공된 HSC로부터 적혈구 전구체의 증폭
물질 및 방법
사용된 배지: 트랜스페린(330 μg/mL), 인슐린(10 μg/mL), 5% AB 혈청 혼주물(EFS) 및 헤파린(3 U/mL)이 보충된 IMDM(Biochrom). 0일로부터 7일까지, 배지에 IL-3(5 ng/mL), SCF (100 ng/mL) 및 EPO(2 IU/mL)를 보충하였다. 7일부터 적혈모구성 전구체의 증폭의 종결까지, 배지에 SCF(100 ng/mL) 및 EPO(2 IU/mL)를 보충하였다.
HSC:
HSC를 밀테나이(Miltenyi) CD34+ 비드를 사용하여 자기 분리 후 세포성분채집술로부터 수득한다.
세포 유지:
0일째에 세포를 HTERT BMI1 렌티바이러스 상층액 및 BCL-XL 레트로바이러스 상층액 또는 HTERT BMI1 렌티바이러스 상층액 및 LMO2 렌티바이러스 상층액을 사용한 2회의 연속 감염을 위해, 100,000개의 세포/mL의 농도에서 씨딩하고; 3일째에, 세포를 3회 세척하고 10,000 세포/mL의 농도로 재씨딩하고, 4일째에, 세포를 새로운 배지 속에서 1/5로 희석시켰다. 7일째에, 세포를 세척하고 새로운 배지 속에서 100,000개의 세포/mL로 배양하였다. 11일째에, 세포를 100,000개의 세포/mL로 희석시키고 새로운 배지 속에 씨딩하였다. 14일째에, 세포를 새로운 배지 속에 300,000개의 세포/mL로 재씨딩하였다. 18일째에, 세포를 5천만개의 세포/mL로 희석하였다. 이후 21일째로부터, 세포를 각각의 유지일(즉, 주당 2회)에 1 백만개/mL로 전신계적으로 재설정하였다.
배양 프로토콜:
프로토콜 1: 0일로부터 11일까지 세포를 기본 배지 속에서 배양하였다. 11일째에, 사용된 배지에 253.9 μM DMOG를 보충하였다. 14일 째에, 333 μM DMOG, 0.02 mM 덱사메타손 (DEX) 및 30 μM SMER28을 사용된 배지에 가한다. 18일째에 사용된 배지는 0.09 mM DEX 및 20.1 μM SMER28이다. 21일째에, 0.10 mM DEX 및 24.5 μM SMER28를 사용된 배지에 가한 반면, 0.10 mM DEX 및 17.4 μM SMER28은 25일째에 가하였다. 최종적으로, 28일로부터 배지에 0.10 mM DEX 및 13.8 μM SMER28을 전신계적으로 보충하였다.
프로토콜 2: 0일로부터 배양 말기까지 배지에 0.1 mM DEX 및 2.27 μM SMER28을 보충한다.
프로토콜 3: 0일부터 배양 말기까지 배지에 0.1 mM DEX를 보충한다.
프로토콜 4: 본 프로토콜은 대조군 프로토콜이다; 이는 임의의 인자의 첨가없이 기본 배지로 수행하였다.
결과
표 2: 상이한 프로토콜레 따른 배양 후 65일째의 세포 수
프로토콜 1 및 2는 가공된 HSC 모델 둘 다를 사용한 적혈모구의 대수적 증폭을 허용한다(표 2 참조). 프로토콜 1 및 2를 사용하여 수득된 증폭은 덱사메타손 만으로 수득된 것보다 실질적으로 더 크다.
C-KIT 마커는 대조군보다 더 오랫동안 이러한 조건하에서 견딘다; 이러한 막 마커는 세포의 젊음 및 증식하는 이의 능력을 나타낸다(도 2 및 도 3 참조). 프로토콜 2는 가공된 HSC 둘 다의 유형을 사용한 우세한 증폭을 허용한다.
이러한 증폭은 가공된 세포가 이의 낮은 증폭 속도로 공지된 세포성분채칩술로부터 유래된 CD34+이므로 놀라운 것이다(제대혈액으로부터의 CD34+와 비교하여)
이러한 가공된 세포 프로토콜을 사용하여, 세포성분채집술로부터 유래된 CD34+ 세포는 제대혈액으로부터 유래된 CD34+ 세포보다 더 큰 증폭능을 획득한다.
Claims (40)
- 조혈 줄기 세포를 자가포식 유도제 및 글루코코르티코이드 호르몬을 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 적혈구 전구체의 생산을 위한 시험관내(In vitro) 방법.
- 제1항에 있어서, 자가포식 유도제가 라파마이신-28의 소-분자 인핸서(small-molecule enhancer of rapamycin-28: SMER-28), SMER-10 및 SMER-18, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 자가포식 유도제가 SMER-28인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코코르티코이드 호르몬이 코르티손, 하이드로코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 파라메타손, 베타메타손, 덱사메타손, 코르티바졸, 및 이들의 유도체 및 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코코르티코이드 호르몬이 프레드니손, 프레드니솔론 및 덱사메타손으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코코르티코이드 호르몬이 덱사메타손인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 저산소증-유도성 인자(HIF) 경로 활성인자, 바람직하게는 프롤릴 하이드록실라제(PHIS) 억제제, 및 보다 바람직하게는 디메틸옥살릴글리신(DMOG)을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포가 다능성 줄기 세포, 특히 배아 줄기 세포(ES) 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPS)의 분화에 의해 수득되거나, 환자 혈액의 샘플로부터, 제대 또는 태반 혈액으로부터, 또는 골수 샘플로부터 단리되는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포가 사람 조혈 줄기 세포인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포가 유전적으로 변형되어 사람 텔로머라제 역 전사 효소(HTERT), B 림프종 Mo-MLV 삽입 영역 1 동족체(BMI1), c-MYC, 1-MYC 및 MYB로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현하는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포가 유전적으로 변형되어 HTERT 유전자를 과발현하는 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포가 유전적으로 변형되어 BMI1 유전자를 과발현하는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포가 유전적으로 변형되어 HTERT 유전자 및 BMI1 유전자를 과발현하는 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 텔로머라제 역 전사 효소(HTERT), B 림프종 Mo-MLV 삽입 영역 1 동족체(BMI1), c-MYC, 1-MYC 및 MYB로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어 하에 위치하는 방법.
- 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포가 추가로 유전적으로 변형되어 다음을 과발현하는 방법:
- 하나 이상의 코어 적혈구 네트워크 (CEN) 경로 전사 인자, 바람직하게는 LIM 도메인 단독 2(LMO2); 및/또는
- 하나 이상의 EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL 경로 유전자, 바람직하게는 B-세포 림프종-익스트라 라지(B-cell lymphoma-extra large: BCL-XL). - 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포가 추가로 유전적으로 변형되어 BCL-XL 유전자를 과발현하는 방법.
- 제10항 내지 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포가 추가로 유전적으로 변형되어 LMO2 유전자를 과발현하는 방법.
- 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL 경로 유전자, 바람직하게는 BCL-XL로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 하나 이상의 구성 프로모터의 제어 하에 위치하는 방법.
- 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 코어 적혈구 네트워크(CEN) 경로 전사 인자 유전자, 바람직하게는 LIM 도메인 단독 2(LMO2)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어하에 위치하는 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포가 무한증식되고/되거나 자살 유전자를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 조혈 줄기 세포의 영양 요건에 대해 맞춰진(adapted) 배지, 특히 조혈 세포주의 세포의 성장 및/또는 분화에 대해 맞춰진 배지인, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 상기 배양 배지 속에서 적어도 20일, 바람직하게는 적어도 40일, 보다 바람직하게는 적어도 60일 동안 배양되는 방법.
- 적혈구 전구체의 생산 및/또는 증폭을 위한, 제1항 내지 제7항 및 제21항 중 어느 한 항에 정의된 세포 배양 배지의 용도.
- 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 유전적으로 변형된 조혈 줄기 세포.
- 적혈구 전구체 및/또는 적혈구의 시험관내 생산을 위한, 제24항에 따른 조혈 줄기 세포의 용도.
- - 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법에 따른 적혈구 전구체를 생산하는 단계; 및
- 적혈구 전구체의 성숙을 유도하는 단계,
- 및 임의로 수득된 적혈구를 회수하는 단계,를 포함하는, 적혈구의 생산을 위한 시험관내 방법. - 제26항에 있어서, 적혈구 전구체의 성숙이 상기 전구체를 적혈구 분화 배지 속에서 배양함으로써 유도되는 방법.
- 조혈 세포주의 세포의 성장 및/또는 분화를 위해 맞춰지고 글루코코르티코이드 호르몬, 바람직하게는 덱사메타손, 및 자가포식 유도제, 바람직하게는 SMER-28, 및 임의로 HIF 경로 활성인자, 바람직하게는 DMOG를 포함하는 세포 배양 배지.
- 제28항에 있어서,
- 0.01 mM 내지 0.1 mM의 농도에서의 글루코코르티코이드 호르몬, 및/또는
- 2 μM 내지 30 μM의 농도에서의 자가포식 유도제, 및/또는
- 75 μM 내지 350 μM의 농도에서의 HIF 경로 활성인자를 포함하는 세포 배양 배지. - 제28항 또는 제29항에 있어서, 자가포식 유도제가 라파마이신-28의 소-분자 인핸서(SMER-28), SMER-10 및 SMER-18, 및 이들의 조합로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포 배양 배지.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, 자가포식 유도제가 SMER-28인 세포 배양 배지.
- 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코코르티코이드 호르몬이 코르티손, 하이드로코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 파라메타손, 베타메타손, 덱사메타손, 코르티바졸, 및 이들의 유도체 및 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포 배양 배지.
- 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코코르티코이드 호르몬이 프레드니손, 프레드니솔론 및 덱사메타손으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포 배양 배지.
- 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코코르티코이드 호르몬이 덱사메타손인 세포 배양 배지.
- 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 저산소증-유도성 인자(HIF) 경로 활성인자, 바람직하게는 프롤릴 하이드록실라제(PHIS) 억제제, 및 보다 바람직하게는 디메틸옥살릴글리신(DMOG)을 추가로 포함하는 세포 배양 배지.
- 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 트랜스페린, (ii) 인슐린, (iii) 헤파린, 및 (iv) 혈청, 혈장, 혈청 혼주물 또는 혈소판 분해물, 바람직하게는 혈소판 분해물을 추가로 포함하는 세포 배양 배지.
- 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포 인자(SCF) 및 EPO, 임의로 IL-3를 추가로 포함하는 세포 배양 배지.
- 적혈구 전구체를 생산하고/하거나 증폭시키기 위한, 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 배지의 용도.
- 하기를 포함하는, 적혈구 전구체 및/또는 적혈구의 생산을 위한 키트:
- 제1항 내지 제7항, 제21항, 및 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 세포 배양 배지; 및/또는
- 제24항에 따른 유전적으로 변형된 조혈 줄기 세포; 및
- 임의로, 이러한 키트(kit)를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 안내서. - 적혈구 전구체 및/또는 적혈구를 생산하기 위한, 제39항에 따르는 키트의 용도.
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