CA3067551A1

CA3067551A1 - Procede de production de progeniteurs erythroides

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Publication number: CA3067551A1
Application number: CA3067551A
Authority: CA
Inventors: Laurence GUYONNEAU-HARMAND; Loic Garcon; Frederic Aurade; Nicolas REBERGUE; Frederic Relaix; Luc Douay
Original assignee: Universite Paris Est Creteil Val De Marne; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Francais du Sang Ets; Sorbonne Universite
Current assignee: Universite Paris Est Creteil Val De Marne; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Francais du Sang Ets; Sorbonne Universite
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-07-02
Publication date: 2019-01-03
Also published as: EP3645707A1; FR3068366B1; CN111373029A; WO2019002625A1; JP7162625B2; JP2020525031A; KR20200060343A; AU2018293389A1; FR3068366A1; US20200370015A1

Abstract

La présente invention concerne un procédé de production in vitro de progéniteurs érythroïdes comprenant la mise en contact de cellules souches hématopoïétiques, génétiquement modifiées ou non, avec un milieu de culture cellulaire défini comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie.

Description

Procédé de production de progéniteurs érythroïdes La présente invention relève du domaine de la médecine. Elle se rapporte plus particulièrement à de nouveaux procédés de production de progéniteurs érythroïdes et de globules rouges.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
Le maintien d'un apport constant en dioxygène aux tissus est indispensable à
la survie de nombreux êtres vivants, et en particulier des humains. Ce sont les globules rouges qui transportent le dioxygène au sein de l'organisme via la circulation sanguine.
Ce transport est assuré par l'hémoglobine, une protéine spécifique des globules rouges qui est capable de fixer le dioxygène. Lorsque les globules rouges parviennent aux tissus, le dioxygène diffuse à travers les parois des capillaires. Le rôle des globules rouges est donc primordial.
La transfusion de globules rouges est nécessaire lors de situations d'urgences (hémorragie) ou pathologiques (maladies du sang, cancers, etc.). En 2016, plus de 100 millions de poches de sang ont été collectées dans le monde et ont été
distribuées afin de répondre aux besoins transfusionnels. 50% de ces produits sont distribués dans les pays riches, qui ne représentent que 15% de la population globale. Si, dans les pays en voie de développement, les problématiques de transfusion sont liées à
l'approvisionnement et à
la sécurité transfusionnelle, dans les pays riches, ces problématiques sont mieux maîtrisées. Toutefois, les complications immunologiques liées à des transfusions chroniques (allo-immunisation) peuvent conduire à des impasses transfusionnelles mettant en jeu le devenir des patients.
A ce jour, les transfusions sanguines reposent exclusivement sur le sang issu de donneurs.
Chez l'adulte, la production de globules rouges ou érythropoïèse se déroule dans la moelle osseuse dite moelle hématopoïétique, qui est présente dans les os plats et aux extrémités des os longs. Dans la moelle osseuse, des cellules souches multipotentes, appelées cellules souches hématopoïétiques se différencient successivement en différents types de progéniteurs érythroïdes (BFU-E, CFU-E, proérythroblastes, érythroblastes basophiles, érythroblaste polychromatophiles). Quand les érythroblastes quittent la

2 moelle osseuse, ils perdent leur noyau pour devenir des réticulocytes puis des globules rouges matures.
Des milieux de différentiation des cellules souches hématopoïétiques permettant la production in vitro de globules rouges sont connus. Cependant, les procédés actuels présentent des défauts rédhibitoires pour une production à grande échelle tel qu'une orientation trop rapide vers une maturation en globules rouges, ce qui limite considérablement le rendement de production, ou encore une différenciation en cellules incapables de réaliser les étapes d'énucléation correctement (Akimov S et al, 2005, Stem cells, 23(9) : 1423-1433 ; Hirose SI et al, 2013, Stem Cell Reports, 1(6) :
499-508 ; Huang X, 2013, Mol. Ther., 22(2) : 451-463). Enfin, d'autres procédés recourent à
des co-cultures avec des cellules nourricières (Kurita R et al, 2013, PloS One, 8(3) : e59890), ce qui est à la fois complexe à mettre en place et coûteux.
Il apparaît ainsi que le développement de nouveaux procédés permettant une production in vitro de globules rouges permettrait de répondre aux besoins d'approvisionnement, d'éviter des risques infectieux émergents, et d'éviter des complications immunologiques.
L'invention décrite ici vise, entre autres, à répondre à ces besoins.
RESUME DE L'INVENTION
Les inventeurs ont démontré que la culture de cellules souches hématopoïétiques dans un milieu comprenant de la dexaméthasone, du SMER28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28), et optionnellement du DMOG (diméthyloxalylglycine), permet non seulement de différencier ces cellules souches en progéniteurs érythroïdes, mais également d'amplifier considérablement cette population de progéniteurs tout en préservant leur capacité de différentiation terminale en globules rouges. Les progéniteurs érythroïdes ainsi obtenus peuvent être maintenus en culture et amplifiés pendant plus de 60 jours sans pour autant perdre leur capacité à se différencier en cellules matures énuclées, c'est-à-dire en globules rouges.
Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro de production de progéniteurs érythroïdes comprenant la mise en contact de cellules souches hématopoïétiques avec un milieu de culture cellulaire, de préférence adapté
aux exigences

3 nutritionnelles des cellules souches hématopoïétiques et en particulier adapté
à la croissance et/ou différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique, et comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d' autophagie.
De préférence, l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la cortisone, l'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci. De manière plus particulièrement préférée, l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la prednisone, la prednisolone et la dexaméthasone. De manière tout particulièrement préférée, l'hormone glucocorticoïde est la dexaméthasone.
De préférence, l'inducteur d' autophagie est sélectionné dans le groupe constitué
du SMER-28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28), SMER-10 et SMER-18, et d'une combinaison de ceux-ci. De manière plus particulièrement préférée, l'inducteur d'autophagie est le SMER-28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28).
Selon un mode de réalisation particulier, le milieu de culture comprend en outre un activateur de la voie HIF (Hypoxya Inductible Factor), de préférence un inhibiteur de la prolyl hydroxylase, et de manière encore préférée du DMOG
(diméthyloxalylglycine).
Les cellules souches hématopoïétiques sont de préférence obtenues par différenciation de cellules souches pluripotentes, en particulier des cellules souches embryonnaires (ES) ou des cellules souches pluripotentes induites (iPS), ou sont isolées à partir d'un échantillon de sang de patient avec ou sans mobilisation, de sang de cordon ombilical ou de placenta, ou encore à partir d'un échantillon ou prélèvement de moelle osseuse. De préférence, les cellules souches hématopoïétiques sont des cellules souches hématopoïétiques humaines.
Les cellules souches hématopoïétiques peuvent être génétiquement modifiées, en particulier pour surexprimer un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué
de HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV
insertion region 1 homolog), c-MYC, 1-MYC et MYB. De préférence, les cellules souches hématopoïétiques peuvent être génétiquement modifiées pour surexprimer le gène HTERT ou pour surexprimer le gène BMI1. Elles peuvent également être modifiées pour surexprimer le gène HTERT et le gène BMIl.
Le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué de HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion region 1

4 homolog), c-MYC, 1-MYC et MYB, sont de préférence placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.
Ces cellules souches hématopoïétiques peuvent en outre être génétiquement modifiées pour sur-exprimer :
- un ou plusieurs facteurs de transcription de la voie des CEN (Core Erythroid Network), de préférence LMO2 (LIM domain only 2) ; et/ou - un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence BCL-XL (B-cell Lymphoma-extra large).
De préférence, les cellules souches hématopoïétiques sont génétiquement modifiées pour surexprimer le gène BCL-XL ou pour surexprimer le gène LM02.
Le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL sont, de préférence, placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs constitutifs.
Le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes des facteurs de transcription de la voie des CEN (Core Erythroid Network) sont, de préférence, placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.
Les cellules souches hématopoïétiques peuvent également être des cellules immortalisées.
De préférence, les cellules sont cultivées dans le milieu de culture de l'invention pendant au moins 20 jours, de manière encore préférée pendant au moins 40 jours, de manière tout particulièrement préférée pendant au moins 60 jours.
L'invention concerne encore, dans un deuxième aspect, l'utilisation du milieu de culture cellulaire selon l'invention pour la production et/ou l'amplification de progéniteurs érythroïdes.
Dans un troisième aspect, l'invention concerne des cellules souches hématopoïétiques génétiquement modifiées telle que décrites précédemment ainsi que l'utilisation de ces cellules souches hématopoïétiques pour la production in vitro de progéniteurs érythroïdes et/ou d' érythrocytes.
L'invention concerne, dans un quatrième aspect, un procédé in vitro de production d'érythrocytes comprenant :
- la production de progéniteurs érythroïdes selon le procédé de l'invention ; et - l'induction de la maturation des progéniteurs érythroïdes, - et optionnellement, la récupération des érythrocytes obtenus.

5 De préférence, la maturation des progéniteurs érythroïdes est induite par culture des progéniteurs érythroïdes dans un milieu de différenciation érythrocytaire.

L'invention concerne encore, dans un autre aspect, un milieu de culture cellulaire, de préférence adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée 5 hématopoïétique, et comprenant une hormone glucocorticoïde, de préférence de la dexaméthasone, et un inducteur d'autophagie, de préférence du SMER-28, et optionnellement un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG.
De préférence, le milieu comprend une hormone glucocorticoïde à une concentration comprise entre 0,01 mM et 0,1 mM, et/ou un inducteur d'autophagie à une concentration comprise entre 2 M et 30 M, et/ou un activateur de la voie HIF
à une concentration comprise entre 75 M et 350 M.
L'inducteur d' autophagie est, de préférence, sélectionné dans le groupe constitué
du SMER-28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28), SMER-10 et SMER-18, et d'une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée est le SMER-28.
L'hormone glucocorticoïde est de préférence sélectionnée dans le groupe constitué de la cortisone, l'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci, de manière plus particulièrement préférée est sélectionnée dans le groupe constitué de la prednisone, la prednisolone et la dexaméthasone, et de manière tout particulièrement préférée est la dexaméthasone.
L'activateur de la voie HIF (Hypoxya Inductible Factor) est de préférence un inhibiteur de la prolyl hydroxylase (PHIS), et de manière encore plus préférée du DMOG
(diméthyloxalylglycine).
Le milieu de culture peut comprendre en outre (i) de la transferrine, (ii) de l'insuline, (iii) de l'héparine, et (iv) du sérum, plasma, pool de sérum ou lysat plaquettaire, de préférence du lysat plaquettaire, et optionnellement du SCF (Stem Cell Factor), de l'EPO et/ou de l'IL-3.
La présente invention concerne également l'utilisation du milieu de culture cellulaire selon l'invention pour produire et/ou amplifier des progéniteurs érythroïdes.
L'invention concerne encore, dans un cinquième aspect, une trousse (ou kit) pour la production de progéniteurs érythroïdes et/ou d'érythrocytes comprenant :

6 - un milieu de culture selon l'invention ; et/ou - des cellules souches hématopoïétiques génétiquement modifiées selon l'invention ; et - optionnellement, un guide contenant des instructions pour l'utilisation d'une telle trousse.
Enfin, l'invention concerne, dans un sixième aspect, l'utilisation d'une trousse (ou kit) selon l'invention pour produire des progéniteurs érythroïdes et/ou des érythrocytes.
DESCRIPTION DES DESSINS
Figure 1 : Profil d'expression des marqueurs de surfaces CD117 et CD 235a à
J14, selon les différents protocoles de cultures. A: protocole 4 ; B : protocole 3 ; C :
protocole 1;
D : protocole 2.
Figure 2 : Profil d'expression des marqueurs de surfaces CD117 et CD 235a à
J24 des cellules génétiquement modifiées pour surexprimer HTERT, BMI1 et LM02, selon les différents protocoles de cultures. A : protocole 4 ; B : protocole 1 ; C :
protocole 2.
Figure 3: Profil d'expression des marqueurs de surfaces CD117 et CD 235a à J24 des cellules génétiquement modifiées pour surexprimer HTERT, BMI1 et BCL-XL, selon les différents protocoles de cultures. A : protocole 4 ; B : protocole 1 ; C :
protocole 2.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont démontré que la culture de cellules souches hématopoïétiques dans un milieu comprenant un inducteur d'autophagie, à savoir du SMER28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28) et une hormone glucocorticoïde, à savoir de la dexaméthasone, permet d'augmenter considérablement la production de progéniteurs érythroïdes par rapport à un milieu de culture contrôle dans lequel seul de la dexaméthasone est ajoutée. Les progéniteurs érythroïdes ainsi obtenus peuvent être maintenus en culture et amplifiés pendant plus de 60 jours. Les inventeurs ont également démontré que ces progéniteurs érythroïdes sont capables de se différencier efficacement en globules rouges.
Ce procédé de culture in vitro a non seulement l'avantage d'être simple et économique, mais ouvre également la voie à une production industrielle à
grande échelle

7 de progéniteurs érythroïdes puis de globules rouges. Ceci pourrait permettre de réduire les risques de pénurie de sang ou d'impasse transfusionnelle, tout en offrant une sécurité
optimale aux patients transfusés.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente demande concerne un procédé in vitro de production de progéniteurs érythroïdes comprenant la mise en contact de cellules souches hématopoïétiques avec un milieu de culture comprenant un inducteur d'autophagie et une hormone glucocorticoïde. Ce procédé a pour but d'induire la différenciation des cellules souches hématopoïétiques en progéniteurs érythroïdes et de permettre l'amplification, c'est-à-dire la multiplication, de cette population de progéniteurs tout en conservant leur capacité à se différencier ultérieurement en globules rouges. Le procédé selon l'invention est donc un procédé de production et d'amplification de progéniteurs érythroïdes.
Tel qu'utilisé ici, le terme de progéniteurs érythroïdes se réfère à des cellules progénitrices obtenues par différenciation de cellules souches hématopoïétiques au cours de l'érythropoïèse. Ces cellules progénitrices sont des cellules nucléées qui ont la capacité
de se diviser et de se différencier ultérieurement en globules rouges par énucléation. Les progéniteurs érythroïdes sont de préférence sélectionnés parmi les BFU-E
(Burst Forming Unit ¨ E) qui se caractérisent par l'expression des marqueurs CD117, CD34, CD41, CD71, et CXCR4, les CFU-E (Colony Forming Unit ¨ E) qui se caractérisent par l'expression des marqueurs CD117, CD34, CD36, et CD71, les proérythroblastes qui se caractérisent par l'expression des marqueurs CD117, CD71, CD36, et CD235a, les érythroblastes basophiles qui se caractérisent par l'expression des marqueurs CD117, CD71, CD36, CD235a et les érythroblastes polychromatophiles qui se caractérisent par l'expression des marqueurs CD36, CD71, CD 235a, et les mélanges de ceux-ci.
Tel qu'utilisé ici, le terme de cellule souche hématopoïétique ou CSH
se réfère à des cellules souches multipotentes capables de se différencier en cellules sanguines et cellules immunitaires que sont les globules blancs, les globules rouges et les plaquettes. Les cellules souches hématopoïétiques expriment les antigènes CD45, CD133, et/ou CD34. De préférence, les cellules souches hématopoïétiques expriment les antigènes CD45 et CD34 et, optionnellement l'antigène CD133.
Selon les modes de réalisation préférés, les CSH sont des CSH humaines.

8 Ces CSH peuvent être obtenues à partir de différentes sources et selon des procédés bien connus de l'homme du métier. Elles peuvent notamment être isolées à partir de moelles osseuses, de cytaphérèses, de sang total ou encore de sang de cordon ombilical (ou de sang placentaire) par exemple à l'aide d'un système immuno-magnétique ou d'un système de tri sur la présence de récepteurs membranaires spécifiques (par exemple CD133, CD45 et/ou CD34).
Tel qu'utilisé ici, le terme de cytaphérèse se réfère au prélèvement par aphérèse des CSH dans le sang. L'aphérèse est une technique de prélèvement de certains composants sanguins par circulation extra-corporelle du sang. Les composants que l'on souhaite prélever sont séparés par centrifugation et extraits, tandis que les composants non prélevés sont réinjectés au donneur ou au patient (aphérèse thérapeutique).
Les CSH peuvent également être obtenues par différenciation de cellules souches pluripotentes, en particulier des cellules souches embryonnaires ou des cellules souches pluripotentes induites, de préférence des cellules souches pluripotentes induites. Les techniques pour différencier des cellules souches pluripotentes en CSH sont bien connues de l'homme du métier. Plusieurs protocoles ont été publiés, notamment le protocole de Lengerke C et al (2009, Ann N Y Acad Sci, 1176:219-27) consistant en une différenciation de 17 jours en passant par une étape intermédiaire de corps embryoïdes et grâce à la combinaison des cytokines suivantes: SCF, Flt-3 ligand, IL-3, IL-6, G-CSF et BMP-4.
Tel qu'utilisé ici, le terme de cellule souche embryonnaire se réfère à des cellules dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste et qui ont la capacité de conduire à la formation de tous les tissus de l'organisme (mésoderme, endoderme, ectoderme), y compris aux cellules de la lignée germinale. La pluripotence des cellules souches embryonnaires peut être évaluée par la présence de marqueurs tels que les facteurs de transcription OCT4 et NANOG et des marqueurs de surface comme SSEA3/4, Tra-1-60 et Tra-1-81. Les cellules souches embryonnaires peuvent être obtenues sans destruction de l'embryon dont elles sont issues, par exemple à l'aide de la technique décrite par Chung et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2): 113-117). Dans un mode de réalisation particulier, et pour des raisons légales ou éthiques, les cellules souches embryonnaires sont des cellules souches embryonnaires non humaines. Dans un autre mode de réalisation particulier, les cellules souches embryonnaires utilisées dans l'invention sont des cellules souches embryonnaires humaines, de préférence obtenues

9 sans destruction de l'embryon dont elles sont issues. Les embryons utilisés sont de préférence des embryons surnuméraires obtenus dans le cadre d'un projet parental après obtention des autorisations réglementaires et éthiques conformes aux lois en vigueur.
Tel qu'utilisé ici, le terme de cellule souche pluripotente induite (CSPi, ou iPS), se réfère à des cellules souches pluripotentes obtenues par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées, et présentant une morphologie et un potentiel d' autorenouvellement et de pluripotence en partie similaires à ceux des cellules souches embryonnaires. Ces cellules sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, notamment la coloration à la phosphatase alcaline et l'expression des protéines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA3/4. Les procédés permettant l'obtention des cellules souches pluripotentes induites sont bien connus de l'homme du métier et sont notamment décrits dans les articles de Yu et al (Science, 2007, 318 (5858):
1917-1920), Takahashi et al (Cell, 2007, 131(5): 861-872) et Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1): 101-106).
Les CSH utilisées dans le procédé selon l'invention peuvent également être des CSH génétiquement modifiées afin d'augmenter leur capacité à s'engager dans l'érythropoïèse et/ou leur capacité d'amplification. Ainsi, selon certains modes de réalisation, le procédé selon l'invention, peut comprendre la modification génétique des CSH afin d'augmenter leur capacité à s'engager dans l'érythropoïèse et/ou leur capacité
d'amplification. Les méthodes pour modifier génétiquement ces cellules sont bien connues de l'homme du métier et impliquent, par exemple, l'introduction de transgènes dans le génome des cellules via des rétrovirus ou des lentivirus ou toute autre forme de transfert de gènes ou de protéines.
Selon un mode de réalisation, la capacité d'amplification de ces CSH est améliorée en surexprimant un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué de HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV
insertion region 1 homolog), c-MYC, 1-MYC et MYB.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer HTERT.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer HTERT et un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué de BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog), c-MYC, 1-MYC

et MYB.

Selon un mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer HTERT et/ou BMI1, de préférence HTERT et BMIl.
La capacité des CSH à s'engager dans la voie de l'érythropoïèse peut être améliorée en surexprimant un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie EPO-5 R/JAK2/STAT5/BCL-XL et/ou dans la voie des CEN (Core Erythroid Network).
Tel qu'utilisé ici, le terme voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL se réfère à une voie de signalisation cellulaire dont les protéines clefs sont le récepteur à
l'EPO
(érythropoïétine), JAK2 (Janus Kinase 2), STAT5 (Signal transducer and activator of transcription 5) et BCL-XL (B-cell Lymphoma-extra large). L'EPO est indispensable à

10 l'érythropoïèse, elle favorise l'engagement érythoïde et la survie cellulaire. La liaison de l'EPO à son récepteur membranaire provoque la dimérisation de l'EPO-R qui, ainsi activé, induit à son tour les kinases JAK2. Les kinases JAK2 phosphorylent alors les résidus tyrosine de la queue cytoplasmique du récepteur EPO-R. Ces phosphotyrosines permettent l'interaction avec les protéines contenant un domaine 5H2 (Src Homology 2), ce qui se traduit par l'activation de différentes voies de signalisation dont la principale est la voie du facteur de transcription STAT5. STAT5 est tout d'abord dimérisé
puis phosphorylé, ce qui conduit à sa translocation dans le noyau où il active la transcription de différents gènes dont des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire et la différenciation érythroïde.
Selon un mode de réalisation, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5P/BCL-XL, de préférence un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant EPO-R, JAK2, STAT5P, BCL-XL et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées .. pour surexprimer un gène codant pour BCL-XL.
Tel qu'utilisé ici, le terme voie des CEN se réfère à un groupe de facteurs de transcription essentiels à l'établissement ou au maintien de l'identité des érythrocytes.
Selon un mode de réalisation, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant GATA1 (facteur de transcription appartenant à la famille des protéines à doigt de zinc se fixant sur la séquence ADN GATA ), TAL1 (TAL BHLH Transcription Factor 1), KLF1 (Krueppel-like

11 factor 1), LDB1 (LIM Domain Binding 1), LMO2 (LIM domain only 2) et SCL (Stem Cell Leukemia), et une combinaison de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer un gène codant LMO2.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH utilisées dans le procédé
selon l'invention sont génétiquement modifiées pour surexprimer:
(i) un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant HTERT, BMI1, c-MYC, 1-MYC et MYB, et une combinaison de ceux-ci, de préférence HTERT et/ou BMI1, et de manière plus particulièrement préférée HTERT et BMI1 ;
et (ii) un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant EPO-R, JAK2, STAT5, BCL-XL
et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée BCL-XL ; et/ou (iii) un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LMO2 et SCL, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée LMO2.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les CSH utilisées dans le procédé
selon l'invention sont génétiquement modifiées pour surexprimer:
(i) un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant HTERT, BMI1, c-MYC, 1-MYC et MYB, et une combinaison de ceux-ci, de préférence HTERT et/ou BMI1, et de manière plus particulièrement préférée HTERT et BMI1 ;
et (ii) un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant EPO-R, JAK2, STAT5P, BCL-XL et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée BCL-XL ; et (iii) un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LMO2 et SCL, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée LMO2.
Selon un mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer

12 (i) le gène codant HTERT, et optionnellement le gène codant BMI1, et (ii) le gène codant LMO2 et/ou le gène codant BCL-XL, de préférence le gène codant BCL-XL.
En particulier, les CSH peuvent être génétiquement modifiées pour surexprimer le gène codant HTERT et le gène codant BCL-XL, et optionnellement le gène codant BMI1.
Selon un autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer (i) les gènes codant HTERT et BMI1, et (ii) le gène codant LMO2 et/ou le gène codant BCL-XL.
En particulier, les CSH peuvent être génétiquement modifiées pour surexprimer (i) les gènes codant HTERT et BMI1 et le gène codant LMO2, ou (ii) les gènes codant HTERT et BMI1 et le gène codant BCL-XL.
Tel qu'utilisé ici, le terme surexpression , surexprimer ou surexprimant se réfère au niveau d'expression d'un gène dans une cellule génétiquement modifiée qui est supérieur au niveau d'expression de ce même gène dans la cellule non génétiquement modifiée. Lorsque la cellule n'exprime pas le gène en question avant la modification génétique mais l'exprime après modification, ce terme peut être remplacé par expression , exprimer ou exprimant .
La surexpression d'un gène dans une CSH peut être obtenue par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par introduction dans la CSH d'un acide nucléique comprenant le ou les gènes à surexprimer, ou de plusieurs acides nucléiques comprenant chacun un des gènes à surexprimer. Le ou les acides nucléiques peuvent ainsi être disposés sur la même construction ou dans des constructions distinctes.
Ils peuvent être introduits dans la CSH par toute méthode connue par l'homme du métier, en particulier par transduction virale, microinjection, transfection, électroporation et biolistique.
Tel qu'utilisé ici, le terme construction se réfère à une cassette d'expression ou à un vecteur d'expression.

13 Dans une cassette d'expression, le ou les gènes à surexprimer sont liés de manière opérationnelle aux séquences nécessaires à leur expression. Notamment, ils peuvent être sous le contrôle d'un promoteur permettant leur expression dans une CSH. De manière générale, une cassette d'expression comprend, ou consiste en, un promoteur permettant d'initier la transcription, un ou plusieurs gènes, et un terminateur de transcription.
L'expression "lié de manière opérationnelle" indique que les éléments sont combinés de manière à ce que l'expression de la séquence codante soit sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel. Typiquement, la séquence du promoteur est placée en amont (5') du ou des gènes d'intérêt. Des séquences d'espacement peuvent être présentes, entre les éléments régulateurs et le gène, dès lors qu'elles n'empêchent pas l'expression par traduction de la protéine codée. La cassette d'expression peut également comprendre au moins une séquence activatrice enhancer liée de manière opérationnelle au promoteur.
Un vecteur d'expression comprend un ou plusieurs acides nucléiques ou cassettes d'expression tels que décrits. Ce vecteur d'expression peut être utilisé pour transformer une cellule hôte et permettre l'expression de l'acide nucléique d'intérêt dans ladite cellule.
Les vecteurs peuvent être construits par des techniques classiques de biologie moléculaire, bien connues de l'homme du métier.
Avantageusement, le vecteur d'expression comprend des éléments régulateurs permettant l'expression de l'acide nucléique d'intérêt. Ces éléments peuvent comporter par exemple des promoteurs de transcription, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, des codons d'initiation et de terminaison. Les méthodes pour sélectionner ces éléments sont bien connues de l'homme du métier.
Le vecteur peut être circulaire ou linéaire, simple- ou double-brin. Il est avantageusement choisi parmi les plasmides, phages, phagemides, virus, cosmides et chromosomes artificiels. De manière préférée, le vecteur est un vecteur viral.
Le ou les gène(s) à surexprimer peuvent être placés sous le contrôle de promoteurs constitutifs ou inductibles, identiques ou différents, qu'ils soient ou non présents sur le même acide nucléique.
La CSH peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable et le ou les acides nucléiques, cassettes ou vecteurs peuvent être contenus dans la cellule sous forme d'épisome ou intégrés dans le génome de la CSH. Ils peuvent être insérés dans le génome de la cellule eucaryote en des régions identiques ou distinctes.

14 Il existe de nombreuses techniques bien connues de l'homme du métier permettant l'expression stable ou transitoire de gènes d'intérêt. En particulier, les gènes d'intérêts peuvent être intégrés au génome d'une cellule grâce à une technique de knock-in utilisant un système d'expression ciblé, en particulier le système CRISPR-Cas9 (voir par exemple Platt et al. Cell. 2014 Oct 9; 159(2):440-55 ou encore Lo et al.
Biotechniques. 2017 Apr 1; 62(4):165-174). Cette technique qui permet d'insérer une seule copie d'un ou de plusieurs gènes d'intérêt dans le génome de la cellule en un locus prédéterminé, repose sur la transfection d'un ou de plusieurs vecteurs permettant l'expression coordonnée d'un gène codant la nucléase Cas9 et d'un ARNg (ARN guide ) spécifique du locus où le ou les gènes doivent être insérés. Ledit ou lesdits gènes d'intérêt ou une cassette comprenant ledit ou lesdits gènes d'intérêt sont insérés à la faveur de la réparation de la cassure générée par Cas9.
Tel qu'utilisé dans la présente demande, le terme ARN guide ou ARNg désigne une molécule d'ARN capable d'interagir avec Cas9 afin de la guider vers une région chromosomique cible.
Chaque ARNg peut comprendre deux régions :
- une première région (communément appelée région SDS ), à l'extrémité 5' de l'ARNg, qui est complémentaire de la région chromosomique cible et qui imite l'ARNcr du système CRISPR endogène, et - une seconde région (communément appelé région handle ), à l'extrémité 3' de l'ARNg, qui mime les interactions d'appariement de bases entre l'ARNtracr (trans-activating crRNA) et l'ARNcr du système CRISPR endogène et présente une structure double brin en tige et boucle s'achevant en 3' par une séquence essentiellement simple brin. Cette seconde région est essentielle à la fixation de l'ARNg à Cas9.
Le gène d'intérêt ou la cassette comprenant le ou les gènes d'intérêt est flanqué
de séquences homologues du site de cassure ciblé par l'ARNg, ce qui permet l'insertion du gène ou de la cassette à la faveur de la réparation de la cassure par recombinaison homologue.
Des exemples de promoteurs permettant une expression constitutive comprennent, sans y être limités, pEF1 alpha long, pCMV et pCAG.
Un système d'expression inductible pouvant être utilisé dans la présente invention est le système Tet-On, basé sur l'utilisation de la protéine transactivatrice de la tétracycline (tTA), qui est créée en fusionnant la protéine TetR (répresseur de la tétracycline) présente chez la bactérie Escheri chia cou i avec le domaine activateur de la protéine VP16 présente dans le virus de l'herpès. La protéine rtTA n'est capable de se lier à l'ADN sur une séquence opératrice Tet0 spécifique que si elle est liée à une tétracycline.
Plusieurs répétitions des séquences Tet0 sont placées sous le contrôle d'un promoteur tel 5 que le promoteur EF1 alpha long. Les séquences Tet0 couplées au promoteur sont appelées élément de réponse à la tétracycline (TRE) et répondent à la liaison de la protéine transactivatrice de la tétracycline (tTA) en causant une augmentation de l'expression du gène placé sous le contrôle du promoteur.
Lorsque plusieurs gènes sont surexprimés, ceux-ci peuvent être placés sous le 10 contrôle d'un même promoteur ou de plusieurs promoteurs.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué
des gènes codant HTERT, BMI1, c-MYC, 1-MYC et MYB, et une combinaison de ceux-ci, de préférence HTERT et/ou BMI1, et de manière plus particulièrement préférée HTERT et

15 BMI1, et ce ou ces gènes sont placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LMO2 et SCL, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée LMO2, et ce ou ces gènes sont placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant EPO-R, JAK2, STAT5P, BCL-XL et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée BCL-XL, et ce ou ces gènes sont placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs constitutifs.
Selon un mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer le gène codant HTERT sous le contrôle d'un promoteur inductible et le gène codant pour BCL-XL sous le contrôle d'un promoteur constitutif.
Selon un autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer les gènes codant HTERT, BMI1 et LMO2 sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.

16 Selon un autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer les gènes codant HTERT et BMI1 sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles et le gène codant pour BCL-XL sous le contrôle d'un promoteur constitutif.
De manière alternative, ou en complément des modifications génétiques décrites ci-dessus, les CSH telles qu'utilisées dans le procédé selon l'invention peuvent également être génétiquement modifiées afin de contenir un gène suicide, par exemple le gène HSV-TK ou le gène Casp9, sous le contrôle d'un promoteur inductible. Tel qu'utilisé ici, le .. terme de gène suicide se réfère à tout gène dont l'expression entraîne la mort de la cellule capable de division qui l'exprime, en présence ou en absence d'une molécule supplémentaires (médicament ou autres), selon le gène suicide considéré. A
titre d'exemples, la mort cellulaire d'une cellule exprimant le gène HSV-TK ou le gène Casp9 est obtenue, respectivement, par ajout de gancyclovir ou d'AP1003.
Selon certains modes de réalisation, les CSH telles qu'utilisées dans le procédé
selon l'invention sont des CSH immortalisées. Ces cellules immortalisées peuvent en outre être génétiquement modifiées tel que décrit ci-dessus.
Les CSH immortalisées peuvent être obtenues à partir d'une lignée cellulaire immortalisée établie à partir de cellules malignes.
De préférence, les CSH immortalisées sont obtenues à partir d'une lignée cellulaire immortalisée établie à partir de cellules non malignes, par exemple à partir d'iPS (Kurita et al. PLoS ONE, 2013, 8, e59890), de cellules de sang de cordon (Kurita et al. supra ; Huang, X. et al. Mol. Ther. 2014, 22, 451-463) de cellules souches embryonnaires (Hirose, S. et al. Stem Cell Rep. 2013, 1, 499-508), ou de CSH
isolées à
partir de la moelle osseuse, de cytaphérèses ou de sang périphérique total (Trakamsanga et al., 2017, Nature Communications, Vol. 8, 14750).
Les CSH peuvent être immortalisées par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par transduction avec un vecteur lentiviral portant les oncogènes E6 et E7 du papillomavirus humain de type 16 (HPV16 E6/E7) (Akimov et al. Stem Cells.
2005 Oct; 23(9): 1423-1433 ; Trakamsanga et al. supra). Optionnellement, les CSH
peuvent être en outre transduites avec un vecteur lentiviral portant le gène codant HTERT
(Akimov et al., supra).

17 Selon un mode préféré, les CSH immortalisées utilisées dans le procédé selon l'invention contiennent un gène suicide permettant leur élimination après induction de la maturation des progéniteurs érythroïdes en érythrocytes matures énucléés.
Le procédé selon l'invention comprend la mise en contact des CSH telles que décrites ci-dessus avec une hormone glucocorticoïde et un inducteur d' autophagie, et plus particulièrement avec un milieu de culture adapté à la croissance et/ou différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique et comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d' autophagie.
Tel qu'utilisé ici, les termes autophagie , autolyse et autophagocytose sont équivalents et peuvent s'employer l'un pour l'autre. L'autophagie se réfère à une dégradation d'une partie du cytoplasme de la cellule par ses propres lysosomes.
L'autophagie est un processus physiologique qui contribue à éliminer certaines protéines (virales, mal conformées...) et les organelles endommagées. Ce processus peut également intervenir dans l'élimination de pathogènes intracellulaires.
Plusieurs voies de signalisation détectent différents types de stress cellulaire, allant de la privation de nutriments à l'invasion microbienne, et convergent pour réguler l'autophagie.
Tel qu'utilisé ici, le terme inducteur d'autophagie se réfère à une molécule capable d'induire 1' autophagie dans une cellule.
Les inducteurs d' autophagie peuvent être notamment des inhibiteurs de la voie mTOR tels que la metformine, la rapamycine, la perifosine, l'éverolimus, le resvératrol ou le tamoxifène, des activateurs de la formation d' autophagosomes tels que le composé
MG-132 (un inhibiteur du protéasome 26S), le composé SAHA (un inhibiteur de la Pan-Histone desacétylase), la trichostatine A ou l'acide valproïque, ou encore des petites molécules agissant indépendamment de la voie mTOR telles que SMER-28, SMER-10 ou SMER 18.
Selon un mode de réalisation particulier, l'inducteur d' autophagie est un inducteur agissant indépendamment de la voie mTOR, de préférence sélectionné dans le groupe constitué du SMER-28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28), du SMER 10 et du SMER 18, et d'une combinaison de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation préféré, l'inducteur d' autophagie est le SMER-28.

18 Tel qu'utilisé ici les termes hormone glucocorticoïde , glucocorticoïde , corticostéroïde , ou de corticoïde sont équivalents et peuvent être employés l'un pour l'autre. Ces termes se réfèrent à des hormones stéroïdiennes naturelles ou synthétiques ayant un noyau prégnane et présentant une action sur le métabolisme protidique et glucidique.
Selon un mode de réalisation, l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la cortisone, l'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation particulier, l'hormone glucocorticoïde est une hormone synthétique, de préférence sélectionnée dans le groupe constitué de la prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation préférée, l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la prednisolone, la méthylprednisolone, la dexaméthasone, et les dérivés et mélanges de ceux-ci, de préférence dans le groupe constitué de la prednisolone, la méthylprednisolone et la dexaméthasone.
Selon un mode de réalisation tout particulièrement préféré, l'hormone glucocorticoïde est la dexaméthasone.
Selon un mode de réalisation particulier, l'inducteur d' autophagie est sélectionné
dans le groupe constitué du SMER-28, du SMER 10 et du SMER 18, de préférence est le SMER-28, et l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la prednisolone, la méthylprednisolone et la dexaméthasone, de préférence est la dexaméthasone.
Selon un mode de réalisation tout particulier, l'inducteur d'autophagie est le SMER-28 et l'hormone glucocorticoïde est la dexaméthasone.
Optionnellement, les CSH peuvent également être mises en contact avec un activateur de la voie HIF. Tel qu'utilisé ici, le terme voie HIF se réfère à la voie de signalisation initiée par HIF (Hypoxia induced factor) qui stimule la sécrétion de l'EPO
et active ainsi la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL.

19 De préférence, l'activateur de la voie HIF selon l'invention est un inhibiteur de la prolyl hydroxylase (PHIS).
Tel qu'utilisé ici, les termes prolyl hydroxylase (PHIS) et procollagène-proline dioxygénase sont équivalents et peuvent être employés l'un pour l'autre. La prolyl hydroxylase est une enzyme d'hydroxylation de HIF sur ses résidus prolyls.
Lorsqu'il est hydroxylé, HIF est inhibé. Les inhibiteurs spécifiques de la prolyl hydroxylase sont donc des molécules capables d'inhiber la prolyl hydroxylase et ainsi d'activer la voie HIF qui va à son tour activer la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL.
De préférence, l'inhibiteur de prolyl hydroxylase est sélectionné dans le groupe constitué du DMOG (diméthyloxalylglycine), du NOG (N-oxalylglycine), du DFO
(desferrioxamine), du FG-4383, du F-0041, du FG-2216, du FG-4592, du S956711, de l'EDHB (ethy1-3,4 dihydroxy-benzoate), du TM6089, du TM655, du TM6008, du 8-hydroxyquinoline, et des dérivés de ceux-ci.
De manière tout particulièrement préférée, l'activateur de la voie HIF est le DMOG.
Lors de la mise en uvre du procédé selon l'invention, les CSH sont mises en culture dans un milieu de culture adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique. De nombreux milieux de culture adaptés aux exigences nutritionnelles des CSH sont connus de l'homme du métier et disponibles dans le commerce, tels que le milieu SFEM de Stemspan (Stemcell technologies) de préférence complémenté avec du SCF (Stem Cell Factor), de l'EPO (erythropoïétine), et des lipides ou le milieu StemMACS HSC Expansion Media XF, human (Invitrogen).
De préférence, les CSH sont mises en culture à une concentration comprise entre 200 et 10000 cellules/ml, de préférence entre 500 et 2000 cellules/ml, et de manière encore préférée à environ 1000 cellules/ml.
Le milieu de culture est de préférence changé tous les environ 3 jours de sorte que les cellules ne dépassent pas une concentration d'environ 4000000 cellules/ml.
Les CSH peuvent être mises en contact avec l'hormone glucocorticoïde et l'inducteur d' autophagie dès le premier jour de culture ou après plusieurs jours de culture, par exemple après 10 à 15 jours.

De préférence, les CSH sont mises en contact simultanément avec l'hormone glucocorticoïde et l'inducteur d'autophagie.
Alternativement, les CSH peuvent être tout d'abord mises en contact avec l'hormone glucocorticoïde puis avec l'inducteur d'autophagie, ou vice-versa.
L'ajout du 5 second composé peut avoir lieu, par exemple, quelques heures après la mise en contact avec le premier composé
De préférence, les CSH sont mises en contact simultanément avec l'hormone glucocorticoïde et l'inducteur d'autophagie. De manière plus particulièrement préférée, les CSH sont mises en contact simultanément avec l'hormone glucocorticoïde et 10 l'inducteur d'autophagie dès le premier jour de culture.
La mise en contact peut se faire par ajout de l'hormone glucocorticoïde et/ou de l'inducteur d'autophagie dans le milieu de culture des CSH ou en plaçant les CSH dans un milieu de culture comprenant l'hormone glucocorticoïde et/ou l'inducteur d' autophagie.
Les concentrations de l'hormone glucocorticoïde et l'inducteur d'autophagie peuvent être constantes ou varier tout au long de la culture ou de la mise en contact.
De préférence, lorsque le milieu de culture comprend l'hormone glucocorticoïde, celle-ci est présente à une concentration comprise entre 0,001 mM et 10 mM, de préférence entre 0,01 mM et 1 mM, de manière encore préférée entre 0,01 mM et 0,5 mM, et de manière tout particulièrement préférée entre 0,02 mM et 0,1 mM.
Selon un mode de réalisation particulier, lorsque le milieu de culture comprend l'hormone glucocorticoïde, celle-ci est présente à une concentration d'environ 0,1 mM.
De préférence, lorsque le milieu de culture comprend l'inducteur d'autophagie, celui-ci est présent dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 0,1 M
et 100 M, de préférence entre 0,5 M et 50 M, de manière encore préférée entre 1 M
et 30 M, et de manière tout particulièrement préférée entre 2 M et 30 M.
Alternativement, lorsque le milieu de culture comprend l'inducteur d'autophagie, celui-ci peut être présent dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 10 M
et 30 M.

Selon un mode de réalisation particulier, lorsque le milieu de culture comprend l'inducteur d' autophagie, celui-ci est présent dans le milieu de culture à
une concentration d'environ 2 M.
Tel qu'utilisé ici, le terme environ fait référence à une plage de valeurs de 5% de la valeur spécifiée, de préférence 2% de la valeur spécifiée. Par exemple, environ 20 inclut les 5% de 20, ou de 19 à 21.
De la même manière, dans les modes de réalisation où les CSH sont mises en présence d'un activateur de la voie HIF, la concentration de l'activateur peut être constante ou varier tout au long de la culture ou de la mise en contact.
De préférence, lorsque le milieu de culture comprend un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG, celui-ci est présent dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 1 M et 1000 M, de préférence entre 10 M et 500 M, de manière encore préférée entre 50 M et 400 M, et de manière tout particulièrement préférée entre 75 M et 350 M.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont mises en présence d'une hormone glucocorticoïde, de préférence la dexaméthasone, et d'un inducteur d'autophagie, de préférence le SMER28, après 10 à 15 jours de culture. De préférence, selon ce mode de réalisation, la concentration de l'hormone glucocorticoïde est comprise entre 0,01 mM et 0,5 mM, et de manière plus particulièrement préférée entre 0,02 mM et 0,1 mM et la concentration de l'inducteur d'autophagie est comprise entre 10 M et 30 M.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les CSH sont mises en présence d'une hormone glucocorticoïde, de préférence la dexaméthasone, et d'un inducteur d'autophagie, de préférence le SMER28, dès le premier jour de culture ou avant 10 jours de culture. De préférence, selon ce mode de réalisation, la concentration de l'hormone glucocorticoïde est comprise entre 0,01 mM et 0,5 mM, de préférence environ 0,1 mM, et la concentration de l'inducteur d'autophagie est comprise entre 2 M et 30 M, de préférence environ 2 M.
Les CSH sont de préférence maintenues dans un milieu de culture comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d' autophagie, et optionnellement un activateur de la voie HIF, durant au moins 10 jours. De manière plus particulièrement préférée, les CSH sont maintenues dans un milieu de culture comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie durant au moins 20, 30, 40, 50 ou 60 jours.
Il est entendu que, durant cette étape, la culture cellulaire comprend non seulement des CSH mais également des progéniteurs érythroïdes.
Les inventeurs ont démontré que l'utilisation d'un milieu de culture comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie permettait d'amplifier considérablement la production de progéniteurs érythroïdes, qui ne s'engagent pas dans la voie de différentiation érythroïde terminale. Ainsi, selon le procédé selon l'invention, les CSH peuvent être cultivées dans le milieu de culture comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie durant au moins 60, 70, 80, 90 ou 100 jours.
De préférence, les CSH sont cultivées dans le milieu de culture comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie durant au maximum de 70, 80, 90 ou 100 jours.
La durée de culture des CSH et le temps de mise en contact avec une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie, et optionnellement un activateur de la voie HIF, peuvent être aisément définis par l'homme du métier en évaluant la proportion de progéniteurs érythroïdes présents dans la population cellulaire. De préférence, les CSH
sont mises en contact avec une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie jusqu'à obtenir une population comprenant au moins 90 A de progéniteurs érythroïdes, de préférence au moins 95% de progéniteurs érythroïdes, de manière encore préférée au moins 99% de progéniteurs érythroïdes.
La culture peut être maintenue jusqu'à l'apparition de marqueurs de la maturation en érythrocytes matures. De préférence, la culture est stoppée lorsque les cellules ne s'amplifient plus et/ou que moins de 10% d'entre elles, de préférence moins de 5%
d'entre-elles expriment le récepteur membranaire CD117. Alternativement, la culture peut être stoppée lorsqu'au moins 90 /0, de préférence au moins 95% des cellules en culture ont atteint le stade d'érythroblaste polychromatophile ou sont à un stade de différenciation plus avancé.
Selon certains modes de réalisation, le procédé peut comprendre l'alternance de phases de culture durant lesquelles le milieu de culture comprend une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie, et optionnellement un activateur de la voie HIF, et de phases de culture durant lesquelles le milieu de culture ne comprend pas d'hormone glucocorticoïde, d'inducteur d' autophagie, et/ou d'activateur de la voie HIF.
L'hormone glucocorticoïde, l'inducteur d' autophagie et l'activateur de la voie HIF, peuvent être ajoutés ou retirés du milieu de culture de façon simultanée ou séquentielle.
Les techniques pour modifier la composition d'un milieu de culture sont bien connues de l'homme du métier. En particulier, l'ajout d'une molécule ou l'augmentation de sa concentration peut se faire directement dans le milieu de culture préexistant et le retrait d'une molécule ou la diminution de sa concentration peut se faire par centrifugation des cellules et resuspension dans un nouveau milieu de culture ou par dilution du milieu de culture.
Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre une étape de récupération des progéniteurs érythroïdes obtenus. Cette étape peut se faire par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par centrifugation et élimination du milieu de culture.
Le procédé de l'invention peut également comprendre une étape de tri cellulaire, en particulier une étape de sélection des cellules basée sur l'expression du marqueur CD117.
Les cellules CD117+ peuvent être sélectionnées afin de prolonger l'amplification des progéniteurs érythroïdes. A l'inverse, les cellules CD117- peuvent être sélectionnées pour produire des globules rouges.
Le procédé selon l'invention peut également comprendre une étape de lavage des progéniteurs érythroïdes obtenus/récupérés. Cette étape peut se faire par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par une succession d'étapes de centrifugation et resuspension.
Selon un aspect particulier, l'invention concerne également une population de progéniteurs érythroïdes obtenus par le procédé de l'invention.
Selon un autre aspect, l'invention concerne également l'utilisation de progéniteurs érythroïdes obtenus par le procédé selon l'invention pour la production d'érythrocytes.
Tel qu'utilisés ici les termes globule rouge , globule rouge mature , hématie , érythrocyte et érythrocyte mature sont équivalents et peuvent être employés l'un pour l'autre. Le terme de érythrocyte se réfère à une cellule énucléée présentant des marqueurs caractéristiques de la maturation érythrocytaire. Ils expriment notamment la glycophorine A (CD235a) mais n'expriment pas le marqueur CD36.
La présente invention concerne ainsi un procédé in vitro de production d'érythrocytes comprenant :
- la production de progéniteurs érythroïdes selon le procédé de l'invention décrit ci-dessus ; et - l'induction de la maturation des progéniteurs érythroïdes.
Les modes de réalisation décrits ci-dessus pour le procédé de production de progéniteurs érythroïdes selon l'invention sont également envisagés dans cet aspect.
La maturation des progéniteurs érythroïdes peut se traduire notamment par l'expression des marqueurs de maturation érythrocytaire tels que CD235a et par l'énucléation.
Le procédé de l'invention peut également comprendre une étape de tri cellulaire, en particulier une étape de sélection des cellules CD117-.
La maturation des progéniteurs peut être induite par toute méthode connue de l'homme du métier. La maturation peut notamment être induite par culture des progéniteurs érythroïdes dans un milieu de différenciation érythrocytaire, par exemple un milieu supplémenté en érythropoïétine et optionnellement en SMER28. De préférence, la maturation est induite par culture des progéniteurs érythroïdes dans un milieu ne comprenant pas de SCF (Stem Cell Factor), ni de dexaméthasone, et supplémenté
en érythropoïétine (environ 2,5 UI/mL) ainsi qu'optionnellement en SMER28 (environ 2,5 M). Alternativement, la maturation est induite en plaçant les cellules dans un milieu de culture sans sérum. De préférence, la maturation des progéniteurs est induite à
concentration cellulaire élevée, par exemple supérieure à 5 000 000 cellules/mi de culture.
Selon un mode de réalisation, le procédé de production d'érythrocytes selon l'invention comprend en outre une étape d'élimination des cellules nucléées.
Cette étape permet d'obtenir une population homogène comprenant uniquement des érythrocytes matures.
Selon un mode de réalisation particulier dans lequel les CSH utilisées dans le procédé de production des progéniteurs érythroïdes selon l'invention comprennent un gène suicide inductible, cette étape d'élimination des cellules nucléées peut être réalisée par induction de l'expression de ce gène suicide.

Le procédé de production d' érythrocytes peut en outre comprendre une étape de récupération des érythrocytes obtenus. Cette étape peut se faire par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par filtration, centrifugation et élimination du milieu de culture.
5 Le procédé
selon l'invention peut également comprendre une étape de lavage des érythrocytes obtenus/récupérés. Cette étape peut se faire par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par une succession d'étapes de filtration, centrifugation et resuspension.
10 Selon un autre aspect, la présente invention concerne également une population d'érythrocytes obtenus par le procédé de l'invention.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant des progéniteurs érythroïdes obtenus selon le procédé de 15 l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention concerne également des progéniteurs érythroïdes selon l'invention, ou une composition pharmaceutique comprenant des progéniteurs érythroïdes selon l'invention, pour une utilisation en tant que greffon hématopoïétique. Tel qu'utilisé ici, le terme greffon hématopoïétique se réfère à un ensemble de cellules destinées à être

20 administrées au niveau de la moelle osseuse d'un sujet et capables de produire des érythrocytes.
L'invention concerne également des progéniteurs érythroïdes selon l'invention, ou une composition pharmaceutique comprenant des progéniteurs érythroïdes selon l'invention, pour une utilisation dans le traitement d'une anémie.
25 Tel qu'utilisé ici, le terme anémie se réfère à une anomalie de l'hémogramme caractérisée par un niveau anormalement bas de globules rouges sains et une diminution du taux d'hémoglobine circulante en deçà des valeurs normales pour l'âge du sujet. A titre indicatif, une anémie est généralement caractérisée par un taux d'hémoglobine inférieur à
13g/dL pour un homme, inférieur à 12g/dL pour une femme, inférieur à 11 g/dL
pour un enfant et inférieur à 14 g/dL pour un nouveau-né.
Les anémies peuvent avoir des causes variées et multiples. Des exemples d'anémies incluent, mais ne sont pas limités à, une anémie liée à une hémorragie (par exemple une hémorragie causée par un traumatisme ou une opération chirurgicale), une anémie induite par un traitement médicamenteux (par exemple une chimiothérapie) ou une exposition à des toxiques (par exemple des agents lipolytiques, des agents oxydants, le plomb, des venins ou poisons), une anémie hémolytique causée par une anomalie héréditaire de la membrane érythrocytaire (par exemple une sphérocytose héréditaire, une elliptocytose héréditaire ou une pyropoïkilocytose héréditaire), une anémie hémolytique causée par une anomalie acquise de la membrane érythrocytaire (par exemple une hémoglobinurie paroxystique nocturne ou une acanthocytose, une anémie hémolytique auto immune (par exemple un accident transfusionnel), une anémie causée par un agent infectieux (par exemple le paludisme, une infection par Babesia ou Bartonella, une trypanosomiase, une leishmaniose viscérale, une septicémie ou une infection par le CMV), une anémie sidéroblastique héréditaire ou acquise, une anémie causée par une insuffisance médullaire (par exemple aplasies médullaires, carence en vitamine B12, myélodysplasies ou envahissement médullaire par une hémopathie maligne (leucémie, lymphome, métastase), ou encore une anémie liée à une drépanocytose ou un syndrome thalassémique. De préférence, l'anémie est liée à une drépanocytose ou à un syndrome thalassémique.
L'invention concerne encore une méthode de traitement d'un patient souffrant d'une anémie comprenant l'administration audit patient d'une quantité
thérapeutiquement efficace de progéniteurs érythroïdes obtenus par le procédé
de l'invention, ou d'une composition pharmaceutique comprenant des progéniteurs érythroïdes obtenus selon l'invention.
L'invention concerne également l'utilisation de progéniteurs érythroïdes obtenus selon l'invention, ou une composition pharmaceutique comprenant lesdits progéniteurs pour la préparation d'un médicament, en particulier un médicament biologique, destiné
au traitement d'une anémie.
Tel qu'utilisé ici, le terme de médicament biologique se réfère à un médicament dont la substance active est produite à partir dune source biologique ou en est extraite.
De préférence, dans cet aspect, les progéniteurs érythroïdes sont obtenus à
partir de CSH non génétiquement modifiées.
Tel qu'utilisés ici, les termes sujet et patient sont équivalents et peuvent indifféremment être employés l'un pour l'autre. Ces termes font de préférence référence à un animal, en particulier un mammifère, de manière tout particulièrement préférée un humain, notamment, un foetus, un nouveau-né, un enfant, un adolescent, un adulte ou une personne âgée. Tel qu'utilisé ici, le terme foetus se réfère à un stade de développement intra-utérin de plus de 8 semaines de grossesse, le terme nouveau-né se réfère à un être humain âgé de moins de 12 mois, le terme enfant se réfère à un être humain âgé
de 1 à 12 ans, le terme adulte se réfère à un être humain âgé de 12 à 60 ans et le terme personne âgée se réfère à un être humain âgé de 60 ans ou plus.
Le patient est de préférence un patient en échec de transfusion, polytransfusé, ou présentant un groupe sanguin rare. Selon un mode préféré, ce patient souffre d'une anémie, en particulier une anémie liée à une drépanocytose ou à un syndrome thalassémique.
Tel qu'utilisé ici, le terme échec de transfusion se réfère à une transfusion inefficace et/ou induisant des complications pathologiques chez le patient.
Une transfusion érythrocytaire peut être considérée comme inefficace lorsque, heures après une transfusion de concentrés de globules rouges (CGR), le rendement transfusionnel est inférieur à 80%.
Le rendement transfusionnel érythrocytaire (RTE) est calculé par la formule :
(taux .48 apts transfusion) - {taux Hb avant transfusion) RTE e2 X100 {partite d'HO transfusee I VST du patient La quantité d'HB transfusée minimale est de 40g, la moyenne constatée est de 50g. VST désigne le volume sanguin total.
Les complications pathologiques associées à un échec transfusionnel peuvent être la conséquence d'une transfusion immunisante (allo immunisation transfusionnelle) qui peut se révéler des années après et compromettre l'avenir transfusionnel du patient. En effet, lors d'une nouvelle transfusion, l'immunisation antérieure peut soit provoquer un danger hémolytique direct (si les anticorps sont présents à un titre suffisant), soit, le plus souvent, provoquer une hémolyse retardée (si les anticorps sont présents à un titre faible ou même non décelable sérologiquement lors de la nouvelle transfusion).
Tel qu'utilisé ici, le terme polytransfusé se réfère à un patient ayant subi plusieurs transfusions sanguines et/ou à un patient ayant déjà eu une transfusion sanguine et devant en recevoir une autre.
Tel qu'utilisé ici, le terme groupe sanguin rare se réfère à un groupe sanguin dont la fréquence dans la population française et/ou européenne et/ou mondiale est inférieure à 1/250 et/ou à un groupe sanguin dont le patient qui le porte ne peut pas être transfusé par du sang 0-. Les sangs rares présentent des difficultés d'approvisionnement.
Dans le domaine des applications vétérinaires, le sujet de l'invention peut être un animal non-humain, de préférence un animal de compagnie ou d'élevage, par exemple .. sélectionné dans le groupe constitué des chiens, chats, bovins, ovins, lapins, porcs, caprins, équidés, rongeurs, primates non-humains et volailles.
Tel qu'utilisé ici, le terme traitement se réfère à tout acte visant une amélioration ou disparition des symptômes, un ralentissement de la progression de la maladie, un arrêt de l'évolution de la maladie ou une disparition de la maladie. Ce terme se réfère plus particulièrement à une augmentation du niveau de globules rouges sains et du taux d'hémoglobine circulante, de préférence pour atteindre des valeurs normales pour l'âge du sujet. Ce terme englobe aussi bien le traitement préventif que curatif. Le terme quantité thérapeutiquement efficace tel qu'utilisé ici, se réfère à une quantité
suffisante pour avoir un effet sur au moins un symptôme de la pathologie, et plus particulièrement pour augmenter le niveau de globules rouges sains et du taux d'hémoglobine circulante chez le sujet traité.
Tel qu'utilisé ici, les termes véhicule pharmaceutiquement acceptable et support pharmaceutiquement acceptable sont équivalents et se réfèrent à toute substance autre qu'un principe actif présent dans une composition pharmaceutique. Son addition est notamment destinée à faciliter la conservation et l'administration des cellules, sans en modifier les propriétés. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable utilisé pour la formulation de compositions comprenant des érythrocytes ou des progéniteurs érythrocytaires selon l'invention peut être, par exemple, sélectionné dans le groupe constitué de sérum physiologique, de solution PBS additionné d'albumine sérique humaine, et des mélanges de ceux-ci, ou toute autre solution saline ayant une osmolarité
adaptée à la conservation des érythrocytes et/ou des progéniteurs et, de préférence, pouvant être directement administrée au sujet. Pour la formulation de compositions comprenant des érythrocytes, un milieu SAGM (Saline Adénine Glucose Mannitol) peut également être utilisé comme véhicule pharmaceutiquement acceptable, seul ou en combinaison avec les autres véhicules pharmaceutiquement acceptable listés ci-dessus.
De préférence, l'administration des progéniteurs, ou greffe, est réalisée au niveau de la moelle osseuse du patient ou par injection intraveineuse.

Selon un mode de réalisation préférée, les cellules souches hématopoïétiques utilisées pour produire les progéniteurs érythroïdes sont issues d'un prélèvement réalisé
chez un donneur ou dérivent de cellules obtenues chez un donneur et les progéniteurs érythroïdes sont destinés à être transplantées chez un patient receveur. Le donneur et le receveur peuvent être le même individu (greffe autologue) ou des individus différents (greffe allogénique). De préférence, le donneur et le receveur sont le même individu.
Selon un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique ou un médicament, en particulier un médicament biologique, comprenant des érythrocytes obtenus selon le procédé de l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention concerne également des érythrocytes obtenus par le procédé de l'invention ou une composition pharmaceutique comprenant des érythrocytes obtenus selon l'invention, pour la transfusion de patients souffrant d'anémie, c'est-à-dire nécessitant un apport en érythrocytes.
L'invention concerne encore une méthode de traitement d'un patient souffrant d'anémie, c'est-à-dire nécessitant un apport en érythrocytes, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficaces d' érythrocytes obtenus par le procédé de l'invention, ou d'une composition pharmaceutique comprenant des érythrocytes selon l'invention.
L'invention concerne également des érythrocytes obtenus par le procédé de l'invention ou une composition pharmaceutique comprenant des érythrocytes obtenus selon l'invention, pour une utilisation dans le traitement d'une anémie.
De préférence l'anémie est une anémie liée à une drépanocytose ou à un syndrome thalassémique.
De préférence, les patients sont en échec de transfusion, sont des polytransfusés ou présentent un sang rare.
Dans le cadre d'une médecine personnalisée, les érythrocytes à administrer ou administrés au patient sont obtenus selon un procédé in vitro de production de globules rouges comprenant :
- l'obtention de CSH à partir d'un échantillon provenant dudit patient ;
- l'obtention de progéniteurs érythroïdes à partir desdites CSH selon le procédé de l'invention; et - l'obtention d'érythrocytes à partir desdits progéniteurs érythroïdes selon le procédé de l'invention.
Les CSH peuvent être obtenues à partir d'un échantillon de sang ou de moelle osseuse du patient. Alternativement, les CSH peuvent être obtenues à partir de CSPi 5 obtenues par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées obtenues à
partir du patient.
Les CSH peuvent optionnellement être génétiquement modifiées tel que décrit précédemment.
10 Selon un autre aspect, la présente invention concerne en outre des CSH
génétiquement modifiées afin de surexprimer:
(i) un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant HTERT, BMI1, c-MYC, 1-MYC et MYB, et une combinaison de ceux-ci, de préférence HTERT et/ou BMI1, et de manière plus particulièrement préférée HTERT et BMI1 ;
et 15 (ii) un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant EPO-R, JAK2, STAT5P, BCL-XL et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée BCL-XL ; et/ou (iii) un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence sélectionnés dans le 20 groupe constitué des gènes codant GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LMO2 et SCL, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée LMO2.
Les modes de réalisation concernant les CSH utilisées dans le procédé de production de progéniteurs érythroïdes sont également envisagées dans cet aspect.
Selon un mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour 25 surexprimer le gène codant HTERT sous le contrôle d'un promoteur inductible et le gène codant pour BCL-XL sous le contrôle d'un promoteur constitutif.
Selon un autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer les gènes codant HTERT, BMI1 et LMO2 sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.
30 Selon un autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées pour surexprimer les gènes codant HTERT et BMI1 sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles et le gène codant BCL-XL sous le contrôle d'un promoteur constitutif.

Les CSH génétiquement modifiées peuvent également contenir un gène suicide tel que décrit précédemment ou être immortalisées.
La présente invention concerne également l'utilisation de CSH génétiquement modifiées selon l'invention pour la production, de préférence in vitro, de progéniteurs érythroïdes et/ou d'érythrocytes, notamment selon les procédés de l'invention décrits ci-dessus.
Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne un milieu de culture cellulaire adapté aux exigences nutritionnelles des CSH, et en particulier adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique, et comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d' autophagie, et optionnellement un activateur de la voie HIF.
Les modes de réalisation concernant le milieu comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d' autophagie, et optionnellement un activateur de la voie HIF, utilisé dans le procédé de production de progéniteurs érythroïdes sont également envisagées dans cet aspect.
L'hormone glucocorticoïde et l'inducteur d'autophagie sont tels que définis ci-dessus concernant le procédé selon l'invention. De préférence, l'hormone glucocorticoïde est la dexaméthasone et/ou l'inducteur d' autophagie est le SMER28 et/ou l'activateur de la voie HIF est le DMOG.
La base du milieu de culture cellulaire adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique peut être toute base connue par l'homme du métier pour subvenir aux besoins des CSH et/ou progéniteurs érythroïdes.
Tel qu'utilisé ici, le terme croissance se réfère à la multiplication des cellules.
Le terme différentiation se réfère à l'acquisition par les cellules cultivées de caractéristiques qui n'étaient pas présentes dans les cellules initialement utilisées pour ensemencer le milieu. Dans le cas présent, ce terme se réfère à l'acquisition de caractéristiques des progéniteurs érythroïdes. Un milieu adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique est donc un milieu permettant la différentiation des CSH en progéniteurs érythroïdes ainsi que la multiplication des CSH
et des progéniteurs érythroïdes. Ce terme ne doit pas être confondu avec la maturation qui définit ici le processus par lequel les progéniteurs érythroïdes vont devenir des globules rouges et qui implique notamment l'énucléation des cellules. Le milieu adapté à
la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique ne contient donc, de préférence, aucun composé induisant cette maturation.
La base du milieu de culture cellulaire peut notamment être un milieu de Dulbecco modifié selon Iscove (milieu IMDM) ou un milieu équivalent adapté aux exigences nutritionnelles des CSH (par exemple le milieu SFEM de Stemspan (Stemcell technologies) ou le milieu StemMACS HSC Expansion Media XF, human, Invitrogen), complémenté avec de l'insuline, de la transferrine, du SCF (Stem Cell Factor), de l'héparine, de l'IL-3, de l'EPO, des facteurs de croissance, et/ou du sérum, plasma, lysat plaquettaire et/ou pool de sérum. Les composés ajoutés au milieu sont de préférence des composés humains obtenus par des techniques recombinantes ou de purification.
Les concentrations de ces différents composés sont aisément déterminées par l'homme du métier sur la base des recommandations des fournisseurs ou des connaissances générales du domaine.
Tel qu'utilisé ici, le terme de pool de sérum se réfère à un mélange de plasmas humains AB (le plus souvent un mélange de plus de 100 plasmas différents) viro-atténués.
Pour ce faire, des plasmas AB provenant de centres de transfusion sont mélangés, viro-atténués et enfin aliquotés. Le pool de sérum peut alors être utilisé frais ou conservé
congelé.
Tel qu'utilisé ici, le terme de lysat plaquettaire se réfère à un produit riche en facteurs de croissance qui est obtenu à la suite de la lyse de concentrés plaquettaires. Pour ce faire, des concentrés plaquettaires provenant de centres de transfusion peuvent être mélangés avant d'être lysés. Il existe différentes méthodes de lyse bien connues de l'homme du métier, en particulier une lyse par ultrasons, par l'utilisation de solvants et/ou de détergents, ou encore par cryolyse. De préférence, les concentrés plaquettaires sont lysés par cryolyse. La cryolyse consiste en des cycles de congélation/décongélation, en général deux cycles, provoquant la rupture des plaquettes et le relargage dans le plasma des facteurs de croissance qu'elles contiennent. Optionnellement, la lyse peut être suivie d'une centrifugation et/ou d'une filtration. Le lysat plaquettaire peut alors être utilisé frais ou conservé congelé.
De préférence, la base du milieu selon l'invention est un milieu IMDM tel que défini ci-dessus ou un milieu équivalent, supplémenté en:

- transferrine, de préférence transferrine humain, à une concentration comprise entre environ 200 ug/mL et environ 400 ug/mL, de préférence entre environ 300 ug/mL et environ 350 ug/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 330 ug/mL ; et/ou - insuline, de préférence insuline humain, à une concentration comprise entre environ 1 ug/mL et environ 50 ug/mL, de préférence entre environ 5 ug/mL
et environ 20 ug/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 10 ug/mL ; et/ou - du sérum, plasma ou pool de sérum, de préférence humains, à une concentration comprise entre environ 1 A et environ 10 /0, de préférence entre environ 3 A et environ 7 /0, de manière encore préféré à une concentration d'environ 5%, et/ou un lysat plaquettaire, de préférence d'origine humaine, à
une concentration comprise entre environ 0,05% et environ 0,5 /0, de préférence entre environ 0,1 A et environ 0,5 /0, de manière encore préféré
à
une concentration d'environ 0,3 %; et/ou - héparine, de préférence héparine humaine, à une concentration comprise entre environ 0,5 U/mL et environ 10 U/mL, de préférence entre environ 1 U/mL et environ 5 U/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 3 U/mL.
Optionnellement, en particulier pour un milieu de culture adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique, le milieu peut être également supplémenté en:
- IL-3, de préférence IL-3 humaine, à une concentration comprise entre environ 1 ng/mL et environ 20 ng/mL, de préférence entre environ 3 ng/mL et environ 7 ng/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 5 ng/mL;
- SCF, de préférence humain, à une concentration comprise entre environ 10 ng/mL et environ 200 ng/mL, de préférence entre environ 50 ng/mL et environ 150 ng/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 100 ng/mL; et/ou - EPO, de préférence humaine, à une concentration comprise entre environ 0,5 IU/mL et environ 10 IU/mL, de préférence entre environ 1 IU/mL et environ 5 IU/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 2 IU/mL.

Dans un mode de réalisation particulier, la base du milieu de culture selon l'invention est de préférence un milieu IMDM tel que défini ci-dessus ou un milieu équivalent, et comprend de la transferrine, de l'insuline, de l'héparine, et du sérum, plasma, pool de sérum ou lysat plaquettaire, de préférence la transferrine, de l'insuline, de l'héparine et du pool de sérum ou un lysat plaquettaire, de manière plus particulièrement préférée, de la transferrine, de l'insuline, de l'héparine et un lysat plaquettaire. Ces composés sont de préférence utilisés à des concentrations telles que décrites ci-dessus.
Dans un mode de réalisation préféré, ce milieu comprend en outre de l'IL-3, du SCF et de l'EPO, de préférence à des concentrations telles que décrites ci-dessus.
Alternativement, le milieu peut comprendre du SCF et de l'EPO, de préférence à

des concentrations telles que décrites ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulier, la base du milieu selon l'invention comprend :
- de la transferrine, de préférence de la transferrine humain, à une concentration comprise entre 300 ug/mL et 350 ug/mL;
- de l'insuline, de préférence de l'insuline humain, à une concentration comprise entre 5 ug/mL et 20 ug/mL ;
- du sérum, plasma ou pool de sérum, de préférence humains, à une concentration comprise entre 3 A et 7 /0, et/ou un lysat plaquettaire, de préférence d'origine humaine, à une concentration comprise entre 0,1 A et 0,5 %; et - de l'héparine, de préférence de l'héparine humaine, à une concentration comprise entre 1 U/mL et 5 U/mL, et optionnellement, - de l'IL-3, de préférence de l'IL-3 humaine, à une concentration comprise entre 3 ng/mL et 7 ng/mL;
- du SCF, de préférence humain, à une concentration comprise entre 50 ng/mL
et 150 ng/mL ; et/ou - de l'EPO, de préférence humaine, à une concentration comprise entre 1 IU/mL
et 5 IU/mL.

Le milieu selon l'invention comprend, ajouté à cette base, (i) un inducteur d'autophagie, de préférence du SMER-28, (ii) une hormone glucocorticoïde, de préférence de la dexaméthasone, et optionnellement (iii) un activateur de la voie HIF, de 5 préférence du DMOG.
Selon un mode de réalisation particulier, le milieu selon l'invention comprend, ajouté à cette base:
- une hormone glucocorticoïde, de préférence de la dexaméthasone, à une concentration comprise entre 0,001 mM et 10 mM, de préférence entre 0,002 10 mM et 1 mM, de manière encore préférée entre 0,005 mM et 0,5 mM, et de manière tout particulièrement préférée entre 0,01 mM et 0,1 mM ; et - un inducteur d'autophagie, de préférence du SMER-28, à une concentration comprise entre 0,1 M et 100 M, de préférence entre 0,5 M et 50 M, de manière encore préférée entre 1 M et 30 M, et de manière tout 15 particulièrement préférée entre 2 M et 30 M ; et - optionnellement, un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG, à
une concentration comprise entre 1 M et 1000 M, de préférence entre 10 M et 500 M, de manière encore préférée entre 50 M et 400 M, et de manière tout particulièrement préférée entre 75 M et 350 M.
20 Dans un mode de réalisation particulier, le milieu selon l'invention comprend entre 0,005 mM et 0,5 mM d'une hormone glucocorticoïde, de préférence de la dexaméthasone, entre 0,5 M et 50 M d'un inducteur d'autophagie, de préférence du SMER-28, et optionnellement entre 50 M et 400 M d'un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG.
25 Dans un autre mode de réalisation particulier, le milieu selon l'invention comprend entre 0,01 mM et 0,1 mM d'une hormone glucocorticoïde, de préférence de la dexaméthasone, entre 2 M et 30 M d'un inducteur d'autophagie, de préférence du SMER-28, et optionnellement entre 75 M et 350 M d'un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG.
De préférence, le milieu selon l'invention ne comprend pas de sérum d'origine non humaine (par exemple du sérum de veau foetal), de thrombopoïétine, de facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF), d'IL-6, de BMP (protéine osseuse morphogénétique), de FLT3-ligand et/ou d'hydrocortisone.
La présente invention concerne également l'utilisation du milieu de culture cellulaire selon l'invention et tel que décrit ci-dessus pour la production et/ou l'amplification de progéniteurs erythroïdes et/ou la production d'érythrocytes, notamment selon les procédés de l'invention décrits ci-dessus, et plus particulièrement pour stimuler la différentiation des CSH en progéniteurs érythroïdes et/ou pour amplifier des progéniteurs érythroïdes.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne encore une trousse comprenant :
- un milieu de culture cellulaire selon l'invention; et/ou - des CSH génétiquement modifiées selon l'invention ou des constructions génétiques permettant d'obtenir les CSH génétiquement modifiées selon l'invention; et - optionnellement, un guide contenant des instructions pour l'utilisation d'une telle trousse.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une trousse selon l'invention pour produire des progéniteurs érythroïdes et/ou des érythrocytes, notamment selon les procédés de l'invention décrits ci-dessus.
Toutes les références citées dans cette demande, y compris les articles de journaux ou les résumés, les demandes de brevets publiées, les brevets délivrés ou tout autre référence, sont entièrement incorporées ici par référence, ce qui inclus tous les résultats, tables, figures et textes présentés dans ces références.
Bien qu'ayant des sens différents, les termes comprenant , ayant , contenant et consistant en peuvent être remplacés l'un par l'autre dans toute la description de l'invention.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif.

EXEMPLES
Exemple 1 : Amplification de progéniteurs érythroïdes à partir de CSH issues de sang de cordon et de cytaphérèse Matériels et méthodes Milieu utilisé : Milieu IMDM (Biochrom), supplémenté en transferrine (330 ug/mL), insuline (10 ug/mL), pool de sérum AB (EFS) 5% et héparine (3 U/mL).
De JO
à J7, le milieu a été supplémenté en IL-3 (5 ng/mL), SCF (100 ng/mL) et EPO (2 IU/mL).
A partir de J7 et jusqu'à la fin de l'amplification des progéniteurs érythroblastiques le milieu a été supplémenté en SCF (100 ng/mL) et EPO (2 IU/mL).
CSH :
Elles sont obtenues après une séparation magnétique grâce à des billes CD34+
selon le protocole fourni par Milenyi (cf. CD34 MicroBead Kit human de Miltenyi Biotec).
Entretien des cellules :
A JO les cellules ont été ensemencées à une concentration de 10 000 cellules/ml, à J4 les cellules ont été diluées au 1/5 dans du milieu neuf, à J7 les cellules ont été lavées et mises en culture à 100 000 cellules/mi dans du milieu neuf. A J11 les cellules ont été
diluées à 100 000 cellules/mi et ensemencées dans un milieu neuf. A J14 les cellules ont été réensemencées à 300 000 cellules/mi dans un milieu neuf. A J18 les cellules ont été
diluées à 0,5 million/ml. A partir de J21 les cellules ont été
systématiquement remises à
1 million/mi à chaque jour d'entretien (i.e. deux fois par semaine).
Protocoles de culture :
Protocole 1: De JO à J11 les cellules sont cultivées dans le milieu de base. A

le milieu utilisé est supplémenté avec 253,9 litM de DMOG. A J14 le milieu utilisé est additionné de 333 litM de DMOG, de 0,02 mM de DEX (dexaméthasone) et de 30 litM
de SMER28. Le milieu utilisé à J18 est complété par 0,09 mM de DEX et 20,1 litM de SMER28. A J21, 0,10 mM de DEX et 24,5 litM de SMER28 ont été ajoutés au milieu utilisé, celui de J25 a été additionné de 0,10 mM de DEX et de 17,4 litM de SMER28.

Enfin, à partir du 28ème jour, le milieu a été systématiquement supplémenté
avec 0,10 mM de DEX et 13,8 ILEM de SMER28.
Protocole 2 : de JO à la fin de la culture le milieu est complémenté par 0,1 mM de DEX et 2,27 M de SMER28.
Protocole 3 : de JO à la fin de la culture le milieu est complémenté par 0,1 mM de DEX.
Protocole 4 : ce protocole est le protocole contrôle, il a été réalisé avec le milieu de base sans addition de facteur.
Cytométrie de flux :
Un échantillon de 100 000 cellules est prélevé et lavé, les cellules sont alors mises en présence des anticorps CD235a et CD117, selon les instructions du fournisseur.
Après 30 min à température ambiante et dans le noir, les cellules sont lavées 2 fois avec du PBS.
Les cellules sont alors prêtes pour être analysées au cytomètre.
L'anticorps CD235a reconnait spécifiquement la glycophorin A qui signe l'engagement érythroïde mature ;
L'anticorps CD117 reconnait spécifiquement le récepteur c-kit (ie le récepteur au Stem cell factor) qui signe l'immaturité, la souchitude et la capacité d' auto-renouvèlement des cellules Comptage des cellules :
Les cellules sont diluées au dixième dans une solution de bleu trypan, ce qui permet d'évaluer la mortalité cellulaire si besoin.
Résultats Protocole 1 Protocole 2 Protocole 3 Protocole 4 amplification progén iteurs é ryth roïd es/ 9,00.107 9,19.107 2,47.107 3,47.105 CD34+ de cytaphérèse à J58 amplification progén iteurs é ryth roïd es/
7,73.1010 3,64.1010 ND 2,94.107 CD34+ de sang de cordon à

Tableau 1 : Comptage des cellules après culture selon différents protocoles Les protocoles 1 et 2 permettent une amplification exponentielle des érythroblastes. L' amplification obtenue avec les protocoles 1 et 2 est également largement supérieure à celle obtenue avec de la dexaméthasone seule (cf. tableau 1). Il est également intéressant de noter que les protocoles 1 et 2 permettent une amplification de progéniteurs érythroïdes à partir de cellules CD34+ issues de cytaphérèse ou de sang de cordon.
Le marqueur C-KIT perdure dans ces conditions beaucoup plus longtemps que dans les conditions contrôles (cf. figure 1), ce marqueur membranaire signe la jeunesse des cellules ainsi que leur capacité à proliférer.
Ces travaux ont ainsi permis de démontrer que la culture des cellules souches hématopoïétiques humaines dans un milieu de culture selon l'invention permet d'obtenir:
- des cellules ayant un engagement érythroïde total ;
- un enrichissement et une amplification exponentielle des progéniteurs érythroïdes.
En particulier, l'amplification peut durer jusqu'à 78 jours.
Exemple 2 : Amplification de progéniteurs érytrhoïdes à partir de CSH
ingéniérées issues de cytaphérèse surexprimant de manière inductible HTERT, BMI1 et de manière constitutive BCL-XL ou surexprimant de manière inductible HTERT, BMI1 et LMO2 Matériels et méthodes Milieu utilisé : Milieu IMDM (Biochrom), supplémenté en transferrine (330 ug/mL), insuline (10 ug/mL), pool de sérum AB (EFS) 5% et héparine (3 U/mL).
De JO
à J7, le milieu a été supplémenté en IL-3 (5 ng/mL), SCF (100 ng/mL) et EPO (2 IU/mL).
A partir de J7 et jusqu'à la fin de l'amplification des progéniteurs érythroblastiques le milieu a été supplémenté en SCF (100 ng/mL) et EPO (2 IU/mL).
CSH :

Les CSH sont obtenues à partir de cytaphérèses après une séparation magnétique grâce à des billes CD34+ Miltenyi.
Entretien des cellules :
5 A JO les cellules ont été ensemencées à une concentration de 100 000 cellules/ml, pour deux infections successives avec le surnageant lentiviral HTERT BMI1 et le surnageant rétroviral BCL-XL ou le surnageant lentiviral HTERT BMI1 et le surnageant lentiviral LM02; à J3 les cellules ont été lavées 3 fois et réensemencées à
une concentration de 10 000 cellules/ml, à J4 les cellules ont été diluées au 1/5 dans du milieu 10 neuf. A J7 les cellules ont été lavées et mises en culture à 100 000 cellules/mi dans du milieu neuf. A J11 les cellules ont été diluées à 100 000 cellules/mi et ensemencées dans un milieu neuf. A J14 les cellules ont été réensemencées à 300 000 cellules/mi dans un milieu neuf. A J18 les cellules ont été diluées à à 0,5 million/ml. A partir de J21 les cellules ont été systématiquement remises à 1 million/mi à chaque jour d'entretien (ie 15 deux fois par semaine).
Protocoles de culture :
Protocole 1: De JO à J11 les cellules sont cultivées dans le milieu de base. A

le milieu utilisé est supplémenté avec 253,9 ILEM de DMOG. A J14 le milieu utilisé est 20 additionné
de 333 ILEM de DMOG, de 0,02 mM de DEX (dexaméthasone) et de 30 ILEM
de SMER28. Le milieu utilisé à J18 est complété par 0,09 mM de DEX et 20,1 ILEM de SMER28. A J21, 0,10 mM de DEX et 24,5 ILEM de SMER28 ont été ajoutés au milieu utilisé, celui de J25 a été additionné de 0,10 mM de DEX et 17,4 ILEM de SMER28. Enfin, à partir du 28' jour le milieu a été systématiquement supplémenté avec 0,10 mM
de 25 DEX et 13,8 ILEM de SMER28.
Protocole 2 : de JO à la fin de la culture le milieu est complémenté par 0,1 mM de DEX et 2,27 M de SMER28.
Protocole 3 : de JO à la fin de la culture le milieu est complémenté par 0,1 mM de DEX.
30 Protocole 4: ce protocole est le protocole contrôle, il a été réalisé avec le milieu de base sans addition de facteur.

Résultats amplification progéniteurs érythroïdes/CD34+
Protocole 1 Protocole 2 Protocole 3 Protocole 4 CD34+ HTERT
1,06.108 1,82.108 5,12.106 8,50.105 CD34+ HTERT
1,59.106 1,06.109 5,76.105 6,92.105 Tableau 2: Comptage de cellules à J65 après culture selon différents protocoles Les protocoles 1 et 2 permettent une amplification exponentielle des érythroblastes avec les deux modèles de CSH ingéniérées (cf. tableau 2). L' amplification obtenue avec les protocoles 1 et 2 est également largement supérieure à celle obtenue avec de la dexaméthasone seule.
Le marqueur C-KIT perdure dans ces conditions beaucoup plus longtemps que dans les contrôles, ce marqueur membranaire signe la jeunesse des cellules ainsi que leur capacité à proliférer (cf. figures 2 et 3). Le protocole 2 permet une amplification supérieure avec les deux types de CSH ingéniéries.
Ces amplifications sont remarquables car les cellules ingéniérées sont des CD34+ issues de cytaphérèse qui sont connues pour leur faible taux d'amplification (par rapport au CD34+ de sang de cordon).
Avec ces protocoles de cellules ingéniérées, des cellules CD34+ issues de cytaphérèse acquièrent des capacités d'amplification supérieures à des cellules CD34+
issues de sang de cordon.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé in vitro de production de progéniteurs érythroïdes comprenant la mise en contact de cellules souches hématopoïétiques avec un milieu de culture cellulaire comprenant un inducteur d' autophagie et une hormone glucocorticoïde.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'inducteur d'autophagie est sélectionné dans le groupe constitué du SMER-28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28), SMER-10 et SMER-18, et d'une combinaison de ceux-ci.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'inducteur d'autophagie est le SMER-28.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la cortisone, l'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la prednisone, la prednisolone et la dexaméthasone.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l'hormone glucocorticoïde est la dexaméthasone.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le milieu de culture comprend en outre un activateur de la voie HIF (Hypoxya Inductible Factor), de préférence un inhibiteur de la prolyl hydroxylase (PHIS), et de manière encore préférée du DMOG (diméthyloxalylglycine).

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont obtenues par différenciation de cellules souches pluripotentes, en particulier des cellules souches embryonnaires (ES) ou des cellules souches pluripotentes induites (iPS), ou sont isolées à partir d'un échantillon de sang de patient, de sang de cordon ombilical ou placentaire, ou encore à partir d'un échantillon de moelle osseuse.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont des cellules souches hématopoïétiques humaines.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont génétiquement modifiées pour surexprimer un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué de HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog), c-MYC, 1-MYC et MYB.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont génétiquement modifiées pour surexprimer le gène HTERT.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont génétiquement modifiées pour surexprimer le gène BMI1.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont génétiquement modifiées pour surexprimer le gène HTERT et le gène BMI1.

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué de HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog), c-MYC, 1-MYC et MYB, sont placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont en outre génétiquement modifiées pour surexprimer :
- un ou plusieurs facteurs de transcription de la voie des CEN (Core Erythroid Network), de préférence LMO2 (LIM domain only 2) ; et/ou - un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence BCL-XL (B-cell Lymphoma-extra large).

16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont en outre génétiquement modifiées pour surexprimer le gène BCL-XL.

17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 14 et 16, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont en outre génétiquement modifiées pour surexprimer le gène LMO2.

18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, dans lequel le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence BCL-XL, sont placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs constitutifs.

19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, dans lequel le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes des facteurs de transcription de la voie des CEN (Core Erythroid Network), de préférence LMO2 (LIM domain only 2), sont placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.

20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, dans lequel les cellules souches hématopoïétiques sont immortalisées et/ou comprennent un gène suicide.

21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, dans lequel le milieu de culture est un milieu adapté aux exigences nutritionnelles des cellules souches hématopoïétiques, en particulier adapté à la croissance et/ou la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique.

22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, dans lequel les cellules sont cultivées dans ledit milieu de culture pendant au moins 20 jours, de préférence pendant au moins 40 jours, de manière encore préféré pendant au moins 60 j ours.

23. Utilisation d'un milieu de culture cellulaire tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 21, pour la production et/ou l'amplification de progéniteurs érythroïdes.

24. Cellule souche hématopoïétique génétiquement modifiée telle que définie dans l'une quelconque des revendications 10 à 20.

25. Utilisation d'une cellule souche hématopoïétique selon la revendication 24 pour la production in vitro de progéniteurs érythroïdes et/ou d'érythrocytes.

26. Procédé in vitro de production d'érythrocytes comprenant :
- la production de progéniteurs érythroïdes selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 22 ; et - l'induction de la maturation des progéniteurs érythroïdes, - et optionnellement la récupération des érythrocytes obtenus.

27. Procédé selon la revendication 26, dans lequel la maturation des progéniteurs érythroïdes est induite par culture desdits progéniteurs dans un milieu de différenciation érythrocytaire.

28. Milieu de culture cellulaire adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique et comprenant une hormone glucocorticoïde, de préférence de la dexaméthasone, et un inducteur d'autophagie, de préférence du SMER-28, et optionnellement un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG.

29. Milieu de culture cellulaire selon la revendication 28, comprenant - une hormone glucocorticoïde à une concentration comprise entre 0,01 mM et 0,1 mM, et/ou - un inducteur d'autophagie à une concentration comprise entre 2 µM et 30 µM, et/ou - un activateur de la voie HIF à une concentration comprise entre 75 µM
et 350 µM.

30. Milieu de culture cellulaire selon la revendication 28 ou 29, dans lequel l'inducteur d' autophagie est sélectionné dans le groupe constitué du SMER-28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28), SMER-10 et SMER-18, et d'une combinaison de ceux-ci.

31. Milieu de culture cellulaire selon la revendication 28 ou 29, dans lequel l'inducteur d'autophagie est le SMER-28.

32. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 28 à 31, dans lequel l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la cortisone, l'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci.

33. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 28 à 32, dans lequel l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe constitué de la prednisone, la prednisolone et la dexaméthasone.

34. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 28 à 33, dans lequel l'hormone glucocorticoïde est la dexaméthasone.

35. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 28 à 34, dans lequel le milieu de culture comprend en outre un activateur de la voie HIF (Hypoxya Inductible Factor), de préférence un inhibiteur de la prolyl hydroxylase (PHIS), et de manière encore préférée du DMOG (diméthyloxalylglycine).

36. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 28 à 35, comprenant en outre (i) de la transferrine, (ii) de l'insuline, (iii) de l'héparine, et (iv) du sérum, plasma, pool de sérum ou lysat plaquettaire, de préférence du lysat plaquettaire.

37. Milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 28 à 36, comprenant en outre du SCF (Stem Cell Factor) et de l'EPO, de optionnellement de I'IL-3.

38. Utilisation d'un milieu de culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 28 à 37 pour produire et/ou amplifier des progéniteurs érythroïdes.

39. Trousse pour la production de progéniteurs érythroïdes et/ou d'érythrocytes comprenant :
- un milieu de culture cellulaire tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, 21, et 28 à 37; et/ou - des cellules souches hématopoïétiques génétiquement modifiées selon la revendication 24 ; et - optionnellement, un guide contenant des instructions pour l'utilisation d'une telle trousse.

40. Utilisation d'une trousse selon la revendication 39 pour produire des progéniteurs érythroïdes et/ou des érythrocytes.