JP5791191B2 - 分化細胞の新規製造法 - Google Patents
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Description
血液関連疾患を治療する場合、あるいは、外科的な治療を行う場合、治療に供される血球系細胞が必要とされる。血球系細胞の中でも、血液凝固(止血)のために必須の細胞である血小板、血小板前駆体(proplatelet)さらには血小板を産生する細胞である巨核球細胞は特にニーズの高い細胞である。とりわけ血小板は、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおける需要が多く、安定供給の必要性は高い。これまでに、血小板は、ドナーからの献血により採取する方法の他、TPO様類似構造 (ミメティクス)製剤を投与する方法、臍帯血又は骨髄細胞から巨核球細胞を分化させる方法などにより確保されてきた。さらに、造血幹細胞又は造血前駆細胞を生体外で増幅させ、これらの前駆細胞から血球系細胞を調製する方法なども試みられている。例えば、マウスES細胞から造血幹細胞株を樹立する方法(特許文献1)、霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞へ分化させる方法(特許文献2)、あるいは、造血幹細胞の未分化性を維持したCD34陽性/CD38陰性細胞を生体外で簡便かつ安定的に増幅させる方法(特許文献3)などが報告されている。
このような巨核球細胞や血小板などの血球系細胞の十分量を、安定に供給するために解決すべき問題は、他の細胞の供給についても言えることである。
所望の細胞を、細胞の分化誘導により調製する場合であっても、所望の細胞の前駆細胞を大量に調製することは容易なことではないため、最終的に分化した所望の細胞を十分量確保することは、現段階では困難である。
そこで、上記事情に鑑み、本発明は、細胞を分化誘導して目的の細胞を製造するため、所望の分化段階にある細胞の増殖能を高め、細胞数を増幅し、該細胞から目的の細胞を製造する方法を提供する。
さらに、本発明は、上記方法を使用して、所望の分化した血球系細胞を提供する。特に、本発明は、成熟巨核球細胞や血小板のソースとなる血球系細胞である、増殖能の高い巨核球前駆細胞、及びその製造方法を提供する。
また、本発明は、該巨核球前駆細胞から大量かつ安定に成熟巨核球細胞及び血小板を製造する方法、並びに、これらの方法により製造される成熟巨核球細胞、及び該成熟巨核球細胞から分化誘導される血小板の提供を目的とする。
また、赤血球細胞についても血小板と同様に安定供給の必要性が指摘されていることから、本発明は、赤血球細胞の製造方法及び該方法で製造される赤血球の提供をも目的とする。
さらに、本発明は血小板の前駆細胞である成熟巨核球細胞の未成熟状態の細胞である巨核球前駆細胞の長期保存方法の提供を目的とする。
また、一般に、c−MYC等の癌遺伝子を細胞中で過剰発現させた場合、細胞周期が亢進し、増殖が活発化する。細胞は、この増殖をストレスとして捉え、これを抑制する防御反応(oncogene−induced senescence:OIS 癌遺伝子誘導性細胞老化)が誘導され、過剰な細胞増殖を抑制することが知られている。本発明者等は、さらに、この現象に着目し、分化段階にある細胞のOISを制御することで特定の分化した細胞を大量に製造する方法を見出した。
本発明は、以上の知見に基づき、完成されたものである。
(1)細胞を分化誘導して特定の細胞を製造する方法であって、
所望の分化段階の細胞を増幅するために、当該所望の分化段階の細胞内で癌遺伝子を強制発現させる、特定細胞の製造方法。
(2)所望の分化段階の細胞内で癌遺伝子を強制発現させることにより誘導される、癌遺伝子誘導性細胞老化を抑制することを特徴とする上記(1)に記載の特定細胞の製造方法。
(3)前記癌遺伝子誘導性細胞老化の抑制が、ポリコーム遺伝子を発現させることにより達成される、上記(1)又は(2)に記載の特定細胞の製造方法。
(4)前記所望の分化段階の細胞が、ES細胞又はiPS細胞から分化誘導された細胞であることを特徴とする上記(1)乃至(3)のいずれかに記載の特定細胞の製造方法。
(5)前記所望の分化段階の細胞内に、外来の癌遺伝子、又は、癌遺伝子及びポリコーム遺伝子を導入し、該癌遺伝子又は、該癌遺伝子及び該ポリコーム遺伝子を強制発現させることを特徴とする上記(1)乃至(4)のいずれかに記載の特定細胞の製造方法。
(6)前記外来の癌遺伝子又はポリコーム遺伝子を、所望の分化段階の細胞の前駆細胞に導入し、該癌遺伝子又は、該癌遺伝子及び該ポリコーム遺伝子を強制発現させることを特徴とする上記(5)に記載の特定細胞の製造方法。
(7)前記癌遺伝子及び/又はポリコーム遺伝子を、各々、誘導型のプロモーターの下流に作用可能に連結し、該癌遺伝子又は、該癌遺伝子及び該ポリコーム遺伝子を誘導的に強制発現させることを特徴とする上記(5)又は(6)に記載の特定細胞の製造方法。
(8)前記所望の分化段階の細胞の分化を進めるために、当該所望の分化段階の細胞内の癌遺伝子又は、癌遺伝子及びポリコーム遺伝子の発現を抑制することを特徴とする上記(5)乃至(7)のいずれかに記載の特定細胞の製造方法。
(9)前記癌遺伝子又は、癌遺伝子及びポリコーム遺伝子の発現抑制が、各々、抑制型プロモーター下流に作用可能に連結し、該遺伝子の発現を抑制することで達成されることを特徴とする上記(8)に記載の特定細胞の製造方法。
(10)前記癌遺伝子がMYCファミリー遺伝子であることを特徴とする上記(1)乃至(9)のいずれかに記載の特定細胞の製造方法。
(11)前記ポリコーム遺伝子がBMI1であることを特徴とする上記(3)乃至(10)のいずれかに記載の特定細胞の製造方法。
(12)前記所望の分化段階の細胞の前駆細胞が造血前駆細胞であり、前記所望の分化段階の細胞が多核化前の巨核球前駆細胞であり、前記特定細胞が成熟巨核球細胞であることを特徴とする上記(6)乃至(11)のいずれかに記載の特定細胞の製造方法。
(13)前記所望の分化段階の細胞の前駆細胞が造血前駆細胞であり、前記所望の分化段階の細胞が多核化前の巨核球前駆細胞であり、前記特定細胞が血小板であることを特徴とする上記(6)乃至(11)のいずれかに記載の特定細胞の製造方法。
(14)前記造血前駆細胞が、ES細胞又はiPS細胞から調製されたネット様構造物内に存在するものであることを特徴とする上記(12)又は(13)に記載の特定細胞の製造方法。
(15)上記(12)又は(14)に記載の特定細胞である成熟巨核球細胞。
(16)上記(13)又は(14)に記載の特定細胞である血小板。
(17)上記(16)に記載の血小板を有効成分とする血液製剤。
(18)上記(15)又は(16)に記載の成熟巨核球細胞又は血小板を製造するためのキット。
(19)癌遺伝子が強制発現された所望の分化段階の血球系細胞。
(20)さらにポリコーム遺伝子が強制発現された、上記(19)に記載の血球系細胞。
(21)前記所望の分化段階の血球系細胞が、ES細胞又はiPS細胞から分化誘導された細胞であることを特徴とする上記(19)又は(20)に記載の血球系細胞。
(22)前記所望の分化段階の血球系細胞内に、外来の癌遺伝子、又は、癌遺伝子及びポリコーム遺伝子を導入し、癌遺伝子又は、癌遺伝子及びポリコーム遺伝子を強制発現させることを特徴とする上記(19)乃至(21)のいずれかに記載の血球系細胞。
(23)前記外来の癌遺伝子又はポリコーム遺伝子を、所望の分化段階の血球系細胞の前駆細胞に導入し、該癌遺伝子又は、該癌遺伝子及び該ポリコーム遺伝子を強制発現させることを特徴とする上記(22)に記載の血球系細胞。
(24)前記癌遺伝子及び/又はポリコーム遺伝子を、各々、誘導型のプロモーターの下流に作用可能に連結し、該癌遺伝子又は、該癌遺伝子及び該ポリコーム遺伝子を誘導的に強制発現させることを特徴とする上記(22)又は(23)に記載の血球系細胞。
(25)前記癌遺伝子がMYCファミリー遺伝子であることを特徴とする上記(19)乃至(24)のいずれかに記載の血球系細胞。
(26)前記ポリコーム遺伝子がBMI1であることを特徴とする上記(20)乃至(25)のいずれかに記載の血球系細胞。
(27)前記所望の分化段階の血球系細胞の前駆細胞が造血前駆細胞であり、前記所望の分化段階の血球系細胞が多核化前の巨核球前駆細胞であることを特徴とする上記(23)乃至(26)のいずれかに記載の血球系細胞。
(28)前記造血前駆細胞が、ES細胞又はiPS細胞から調製されたネット様構造物内に存在するものであることを特徴とする上記(27)に記載の血球系細胞。
(29)上記(19)乃至(28)のいずれかに記載の血球系細胞を含む凍結細胞組成物。
(30)上記(27)又は(28)に記載の血球系細胞である多核化前の巨核球前駆細胞を製造するためのキット。
ここで、「ソースとなる細胞」としては、分化誘導を行って得られる目的の細胞(ここでは、特定細胞)の前駆細胞に相当するものであって、分化能を保持した最終分化した細胞以外の細胞であれば、如何なるものであってもよく、例えば、完全に未分化の多能性幹細胞等であっても、あるいは、ある程度分化は進行しているが依然として分化能を保持している細胞(例えば、血球系細胞の造血前駆細胞など)であってもよい。また、本実施形態で製造される「特定の細胞」又は「特定細胞」とは、完全未分化な細胞(例えば、多能性幹細胞)以外の細胞であれば、ある程度未分化な状態を保持した細胞であってもよく、つまり、完全未分化な段階から最終分化した段階の間に登場する細胞であって、完全未分化な細胞以外の細胞のことである。例えば、本実施形態の「特定の細胞」又は「特定細胞」とは、血球系細胞の例の一部を示すならば、成熟巨核球細胞、血小板又は赤血球細胞などのことである。
本発明において、所望の分化段階の細胞内での癌遺伝子又は後に詳述するポリコーム遺伝子の強制発現は、癌遺伝子又はポリコーム遺伝子を当該「所望の分化段階の細胞」内に導入し、強制発現させることで達成されてもよく、また、当該「所望の分化段階の細胞」の前駆細胞内にこれらの遺伝子を導入し、強制発現させ、その発現を維持しながら分化を進行させ、「所望の分化段階の細胞」内においてこれらの遺伝子の強制発現状態を維持することによって達成されてもよく、さらに、当該「所望の分化段階の細胞」の前駆細胞内にこれらの遺伝子を導入しておき、「所望の分化段階の細胞」に分化したときにこれらの遺伝子の強制発現を誘導することによって達成されてもよい。例えば、所望の分化段階の細胞として多核化前の巨核球前駆細胞を増幅する場合には、その前駆段階にある造血前駆細胞(後述)に癌遺伝子又はポリコーム遺伝子を導入し、強制発現させてもよい。所望の分化段階の細胞内で癌遺伝子とポリコーム遺伝子とを強制発現させる場合、癌遺伝子とポリコーム遺伝子とは同時に細胞に導入してもよく、異なったタイミングで導入してもよい。
癌遺伝子誘導性細胞老化(oncogene−induced senescence:OIS)とは、RASやMYCなどの癌遺伝子による異常な増殖刺激等により誘導されるストレス誘導性細胞老化のことである。癌遺伝子産物が過剰に細胞内で発現すると、CDKN2a(INK4a/ARF)遺伝子座にコードされるp16やp19などの癌抑制遺伝子産物の発現が誘導される。その結果細胞の老化とアポトーシスが誘導され、細胞の増殖活性が低下する。従って、癌遺伝子が誘導するOISを回避すれば、細胞の増殖能の高い状態で維持できることが予想される。
本発明で使用されるポリコーム群遺伝子としては、例えば、BMI1、Mel18、Ring1a/b、Phc1/2/3、Cbx2/4/6/7/8、Ezh2、Eed、Suz12、HADC、Dnmt1/3a/3bなどを挙げることができるが、特に好ましいポリコーム群遺伝子は、BMI1遺伝子である。
さらに、癌遺伝子誘導性細胞老化の抑制は、HOXA2遺伝子又はBCLXL遺伝子の発現によっても達成することができる。
本明細書において、「多核化前の巨核球前駆細胞」とは、巨核球系列の特異的マーカーであるCD41a陽性/CD42a陽性/CD42b陽性で、核の多倍体化を起こしていない単核もしくは二核の細胞である。また、「造血前駆細胞」とは、CD34+細胞(CD34陽性細胞)として特徴付けられる造血系の細胞であり、例えば、ES細胞又はiPS細胞由来の細胞、特に、ES細胞又はiPS細胞から調製されるネット様構造物(ES−sac又はiPS−sacとも称する)から得られる細胞(特に、ネット様構造物から分離した直後の細胞)が好ましい。ここで、ES細胞又はiPS細胞から調製される「ネット様構造物」とは、ES細胞又はiPS細胞由来の立体的な嚢状(内部に空間を伴うもの)構造体で、内皮細胞集団などで形成され、内部に造血前駆細胞を含むもののことである。ネット様構造物の詳細については、例えば、TAKAYAMAら,BLOOD 2008,111:5298−5306、を参照のこと。
形成されたネット様構造物は、濾胞状構造になっており、内部には、造血前駆細胞が濃縮された状態で存在している。ネット様構造物の内部に存在する造血前駆細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具(例えば、セルストレイナーなど)に通すことにより、分離することができる。このようにして得られる造血前駆細胞を本発明に使用することができる。
MYCファミリー遺伝子などの癌遺伝子、及びBMI1遺伝子などのポリコーム遺伝子を発現させた造血前駆細胞は、SCF(10〜200ng/ml、例えば100ng/ml)、TPO(10〜200ng/ml、例えば40ng/ml)、FL(10〜200ng/ml、例えば100ng/ml)、VEGF(10〜200ng/ml、例えば40ng/ml)などのいずれか又はこれらのうちの2つ以上を組合せて添加した条件で培養を行い、例えば、遺伝子導入後4〜7日程度で、高い増殖能を獲得した多核化前の巨核球前駆細胞になる。このようにして得られた多核化前の巨核球前駆細胞は、細胞増殖が、少なくとも、30〜50日程度、好ましくは、50〜60日程度以上、より好ましくは、60日以上は継続し、その細胞数は、c−MYC遺伝子及びBMI1遺伝子導入時の細胞数の約1.0×104倍以上、好ましくは、約1.0×105倍以上、より好ましくは、約1.0×106倍以上にまで増幅する(例えば、図12を参照のこと)。
癌遺伝子及びポリコーム遺伝子を導入して高い増殖能を獲得した多核化前の巨核球前駆細胞を、成熟巨核球細胞及び血小板などに分化誘導する場合、上述のように、必要に応じて、癌遺伝子及びポリコーム遺伝子の発現を抑制的に制御してもよい。
造血前駆細胞内で強制発現させる癌遺伝子は、上述のように、癌遺伝子であれば如何なるものも使用可能であるが、MYCファミリー遺伝子が好ましく、特に、c−MYC遺伝子が好ましい。
本明細書において、「赤血球前駆細胞」とは、赤血球系列特異的な分子であるGlycophorin A(グリコフォリンA)陽性の脱核前の細胞である。
所望の分化段階の細胞内での癌遺伝子又はポリコーム遺伝子の強制発現は、癌遺伝子又はポリコーム遺伝子を当該「所望の分化段階の血球系細胞」内に導入し、強制発現させることで達成されてもよく、また、当該「所望の分化段階の血球系細胞」の前駆細胞内にこれらの遺伝子を導入し、強制発現させ、その発現を維持しながら分化を進行させ、「所望の分化段階の血球系細胞」内においてこれらの遺伝子の強制発現状態を維持することによって達成されてもよい。さらに、該「所望の分化段階の血球系細胞」の前駆細胞内にこれらの遺伝子を導入しておき、「所望の分化段階の血球系細胞」に分化したときに、これら遺伝子の強制発現を誘導することによって達成されてもよい。例えば、所望の分化段階の血球系細胞として多核化前の巨核球前駆細胞を増幅する場合には、その前駆段階にある造血前駆細胞に癌遺伝子又はポリコーム遺伝子を導入し、強制発現させてもよい。
本発明の多核化前の巨核球前駆細胞などの血球系細胞を用いて、凍結細胞組成物を作製する場合には、多核化前の巨核球前駆細胞などの血球系細胞と、凍結保存液とから構成することができ、その他必要に応じた添加剤なども組成中に含めることができる。
凍結保存液としては、DMSO入りの凍結液などを利用できる。具体的にはセルバンカー(日本全薬工業株式会社)やバンバンカー(日本ジェネティクス株式会社)、TCプロテクター(DSファーマバイオメディカル株式会社)、アルブミン加cp−1(極東製薬工業株式会社)などである。
MYCファミリー遺伝子のうち、c−MYC遺伝子のホモログとは、そのcDNA配列が、例えば、配列番号1で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号1で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるcDNAとは、配列番号1で表される配列からなるDNAと、約60%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,最も好ましくは約99%の同一性を有する配列からなるDNA、もしくは、配列番号1で表わされる核酸配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAであって、これらのDNAによってコードされるタンパク質が、多核化前の巨核球前駆細胞など、分化段階の細胞の増幅に寄与するもののことである。
また、本発明で用いられるBMI1遺伝子のホモログとは、そのcDNA配列が、例えば、配列番号2で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなる遺伝子のことである。配列番号2で示される核酸配列と実質的に同一の配列からなるcDNAとは、配列番号2で表される配列からなるDNAと、約60%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,最も好ましくは約99%の同一性を有する配列からなるDNA、もしくは、配列番号2で表わされる核酸配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAであって、そのDNAによってコードされるタンパク質が、MYCファミリー遺伝子などの癌遺伝子が発現している細胞内で生じる癌遺伝子誘導性細胞老化を抑制し、該細胞の増幅を促進するもののことである。
具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、37℃〜42℃の温度条件下、0.1×SSC、0.1%SDS溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、65℃、5×SSCおよび0.1%SDS中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。
ACD−A液:FFP(fresh frozen plasma;献血で得られた全血液から調整したもの、アルブミン、凝固因子など血液成分以外のものをすべて含む)を1:10の比率で調整し、15−50Gyの放射線照射後に20−24℃にて振とうしながら保存する。ACD−A液;クエン酸ナトリウム22g/クエン酸8g/ブドウ糖22gを注射用水で全体を1Lとするように調整する。
以上の方法を使用する場合、血小板の濃度としては、例えば、1×109血小板/mL程度が望ましい。
また、GM6001(a broad−range hydroxamic acid−based metalloprotease inhibitor)(Calbiochem社、La Jolla,CA,USA)を添加しておくと、冷凍保存および室温保存中に起きる血小板機能分子GPIb−V−IXやGPVIの切断に伴う不活化を予防できる。本発明者らは、この方法により、マウスES細胞由来血小板に関し不活性化の予防が可能であることを確認している。なお、ヒト血小板を使用したこの血小板不活性化に関する機序の参考論文として、Bergmeier,W et al.,Cir Res 95:677−683,2004及び Gardiner,EE et al.,J Thrombosis and Haemostasis,5:1530−1537,2007を参照のこと。
なお、血小板を含む製剤を収納する容器は、ガラスのように血小板を活性化する材質のものを避けるのが好ましい。
より具体的には、取得した赤血球は、例えば、以下の方法により製剤化することができる。
培養上清を遠心後濃縮した濃厚赤血球液にMAP液(組成は以下参照)を加えて調製し、15−50Gyの放射線照射後に2〜6℃で保存する。
以上の方法を使用する場合、赤血球の濃度としては、例えば、1×1010赤血球/mL程度が望ましい。取得した赤血球は、赤血球保存用添加液 (MAP液)として、例えば、D−マンニトール(14.57g)、アデニン(0.14g)、結晶リン酸二水素ナトリウム(0.94g)、クエン酸ナトリム(1.50g)、クエン酸(0.20g)、ブドウ糖(7.21g)、塩化ナトリム(4.97g)を、注射用水を加えて溶かし、全量を1000mlとしたものを使用することができる。
その他、赤血球の製剤化に適当と思われる公知の方法を適宜選択することは、当業者において容易なことである。
4遺伝子(OCT3/4、SOX2、KLF−4、c−MYC)により樹立したiPS細胞(TkDA3−2、TkDA3−4及びTkDA3−5)とc−MYCを除く3遺伝子(OCT3/4、SOX2、KLF−4)により樹立したiPS細胞(253G1(京都大学、山中伸弥博士より供与)及びTkDN4−M)、及びヒトES細胞(KhES−3;京都大学、中辻憲夫先生より供与)からの産生される巨核球細胞の数を比較した(図1)。iPS細胞及びES細胞からの培養後15日目に、ネット様構造物から取り出した造血前駆細胞を、フィーダー細胞上に播種し、最終濃度15%のFBSを添加したIMDMにTPO(100ng/mL)、SCF(50ng/mL)及びHeparin(25U/ml)の存在下で培養を行う。その後、誘導されるCD42b陽性である巨核球細胞の数を経時的にカウントした(図1)。その結果、3遺伝子(c−MYCなし)由来iPS細胞及びヒトES細胞に比べて、4遺伝子(c−MYCあり)由来のiPS細胞は、使用した3株とも巨核球細胞数が増加していた。
以上のことから、iPS細胞を作製するために導入した遺伝子のうち、いずれかの遺伝子発現の再活性化が、産生される巨核球細胞数の増加に関与している可能性が示唆された。そこで、巨核球細胞数の増加に関与している原因遺伝子の検証を行った。ヒトES細胞(iPS細胞と異なりOCT3/4、SOX2、KLF−4、c−MYCが外因性に導入されていない)由来の造血前駆細胞に、レトロウイルスにより各遺伝子を単独で強制発現させ、産生されたCD42b陽性の巨核球細胞の数をカウントした。その結果、c−MYCを導入した場合、他の遺伝子を導入した場合と比較して、産生されるCD42b陽性の巨核球細胞数が約10倍程度増加することが明らかとなった(図3)。以上のことから、4遺伝子由来iPS細胞からの巨核球誘導効率が高い理由として、c−MYC遺伝子の発現の再活性化が考えられた。
また、4遺伝子由来iPS細胞から誘導した巨核球細胞は、ES細胞又は3遺伝子由来iPS細胞から誘導した巨核球細胞よりも、凍結融解後生存率が高いことが確認された。具体的には、ヒトES細胞(KhES−3)又は3遺伝子由来ヒトiPS細胞(TkDN4−M)から誘導した巨核球細胞の凍結融解後生存率が、各々、56.7%、54.5%と約5割程度に留まったのに対し、4遺伝子由来ヒトiPS細胞(TkDA3−4)から誘導した巨核球細胞の凍結融解後生存率は、81.0%と約8割に達することが分かった。この事から、c−MYC遺伝子などの癌遺伝子の再活性化が生じている巨核球前駆細胞は、より凍結保存に適しており、解凍後の供給をしやすい細胞と考えられる。
次に、最も血小板産生能が高いTkDA3−4株を用いて、試験管内で産生した血小板の輸血実験を行った。あらかじめ放射線照射して血小板減少モデルの免疫不全マウスを作製し、iPS細胞由来の血小板を尾静脈より輸血した(図5A)。輸血後30分では20%前後、2時間後でも10%前後の血小板キメリズムが観察され、ヒト末梢血由来の新鮮な血小板と同様であった(図5B)。
あらかじめ、iPS細胞由来血小板はテトラメチルローダミンエチルエステル(TMRE;赤い色素)で染色し、ヘマトポルフィリン(hematoporphyrin)と混ぜてマウス尾静脈から注射した。血流(細胞成分以外)をFITC−dextran(緑色)で染色することで、血管内の血液成分が抜けて見え、形態や大きさから血球成分を確認できる。レーザーによりヘマトポルフィリンが反応し、血管内皮障害が引き起こされると、障害内皮もしくは内皮剥離スポットに血小板が固層化および接着し、血栓形成が誘導される。
マウスの腸間膜微小動脈に波長488nm,30mWのレーザー照射を行うと、13秒後には赤く染色されたiPS細胞由来血小板が障害内皮へ接着した(図6中、矢印で「iPS由来」と示す部位)。20秒後には他のホスト由来の血小板(マウス血小板)と協調して血栓を形成し、血管閉塞を引き起こしたことが確認され、iPS細胞由来の血小板は生体内の流血下で血栓を形成する能力があることが証明された。
以上のことから、c−MYC遺伝子を含む4遺伝子の導入により樹立され、c−MYC遺伝子が再活性化されているiPS細胞から調製した血小板も、ヒト末梢血由来の血小板と同様の生理学的特徴を保持していることが確認できた。
iPS細胞の4遺伝子樹立株と3遺伝子樹立株の巨核球産生効率の比較により、巨核球前駆細胞中における、c−MYC遺伝子の再活性化が、その後誘導される成熟巨核球細胞の数に影響を与えることが分かった。そこで、c−MYC遺伝子が導入されていない多能性幹細胞であるES細胞由来の巨核球前駆細胞におけるc−MYC遺伝子の発現が、その後の巨核球細胞の誘導にどのような影響を与えるかを検討した。
ヒトES細胞株(KhES−3)から20ng/mlVEGF存在下でネット様構造物を調製し、このネット様構造物から取り出した巨核球前駆細胞(多核化前)を、10T1/2細胞上に細胞数1×105/ウェルになるように播き、c−MYC遺伝子(配列番号1)を保持したレトロウイルスベクターを、播種後、0時間、12時間、24時間経過時に感染させた。36時間後に、レトロウイルスを含まない培地に変更し、培養を継続した。レトロウイルスによる遺伝子導入は、培地を2〜3ml添加した6ウェルプレートを使用して、900rpm、90分の条件で、スピン感染法(Spin infection)を用いて行った。最終濃度15%のFBSを添加したIMDMに100ng/ml SCF、40ng/ml TPO、100ng/ml FL、40ng/ml VEGF及びプロタミンを添加した培地を用いて培養を行った(図7)。
次に、c−MYC遺伝子を導入した造血前駆細胞から得られる赤血球前駆細胞からの赤血球の産生を試みた。上記2において記載したc−MYC遺伝子又はBMI1遺伝子の導入と同様に、c−MYC/HOXA2(配列番号3)発現細胞及びc−MYC/BCLXL(配列番号4)発現細胞を作製し、FACS解析を行った。その結果、c−MYC/HOXA2発現細胞では、遺伝子導入後105日目において、赤血球のマーカーであるCD71及びGlyA陽性細胞群の存在が確認された(図14右上段)。また、c−MYC/BCLXL発現細胞においてもGlyA陽性細胞群の存在が確認された(図14右下段)。この結果から、c−MYC遺伝子の導入した造血前駆細胞は、組み合わせる導入因子を変えることで、赤血球への分化も可能であることが分かった。
巨核球細胞、血小板を効率よく、大量に調製するためには、巨核球前駆細胞の数を増加させることが有効であることが、明らかとなった。そのためには、c−MYCファミリー遺伝子、ポリコーム遺伝子を多核化前の巨核球前駆細胞中で同時に共発現させて、該多核化前の巨核球前駆細胞の増殖能を高めることが必要となるが、巨核球細胞の成熟化を(多核化)を促進するために、場合によっては、c−MYCファミリー遺伝子、ポリコーム遺伝子の発現を抑制的に制御することが望ましい。
4−1.遺伝子制御部ベクターの機能性の確認
pMX tet offベクター(自治医科大学 間野 博行 教授より供与)にc−MYC−2A−BMI1を組み込んだオールインワン(all in one)型ベクターを作製した(「2A]は、foot-and-mouth disease virus 由来のself cleavage 活性をもつペプチドで、この配列を複数のタンパク質の間に挟むことで、単一のプロモーターから複数のタンパク質を効率良く取得するためのものである(Hasegawaら、2007 Stem Cells))。pMx tet off c-MYC 2A BMI1ベクターは、エストラジオール存在化で、c−MYC遺伝子及びBMI1遺伝子を発現させる。一方、テトラサイクリン存在化、エストラジオール非存在化では、c−MYC遺伝子及びBMI1遺伝子の発現を抑制する。
作製したpMx tet off c-MYC 2A BMI1ベクターを、293GPG細胞内で発現させ、c−MYC遺伝子及びBMI1遺伝子の発現制御の状況をFACSにより確認した。図15は、細胞内のc−MYCタンパク質を、抗c−MYCタンパク質抗体で染色後、Alexa647標識の2次抗体で染色し、FACS解析を行った結果である。pMX tet off c-MYC 2A BMI1を組み込んだ293GPG細胞において、テトラサイクリン存在化では、コントロールの293GPG細胞と変わらないc−MYC遺伝子の発現量であるが(図15中、293gpg及び+テトラサイクリンで示すグラフ)、エストラジオール存在化ではc−MYC遺伝子の発現が促進されていることがわかる(図15、+β−エストラジオール)。
以上の結果から、ここで使用するpMx tet off c-MYC 2A BMI1ベクターにより目的遺伝子の発現制御が可能であることが確認できた。
上記4−1で記載した遺伝子制御ベクターを用いて、c−MYC遺伝子及びBMI1遺伝子をヒトES細胞株(KhES−3)由来の巨核球前駆細胞内で発現させ、その増殖能及び分化能について検討した。
ベクターのみを導入した細胞(図16A(a))、pMX c-MYC及びDsam BMI1を別個に強制発現させた細胞株(図16A(b))、pMX tet off c-MYC及びpMX tet off BMI1で別個に発現させた細胞株(図16A(c))、pMX tet off c-MYC 2A BMI1で発現させた細胞株(図16A(d))及びpMX tet off BMI1 2A c-MYC(図16A(e))で発現させた細胞株について検討を行った。ここで、(d)と(e)は、2A配列を挟んでc−MYC遺伝子とBMI1遺伝子の配置の順番が異なるコンストラクトである。
これらの細胞株について、CD41a+細胞の増殖曲線を図16Aに示す。巨核球マーカーである抗CD41a抗体及び抗CD42b抗体で各細胞株を染色し、フローサイトメーターを用いて解析した。pMX tet off c-MYC 2A BMI1で作成した細胞株(図16A(d))は、pMX c-MYC及びDsam BMI1を別個に強制発現させた細胞株(図16A(b))と同様の表現系を示し、ほとんどの集団が巨核球マーカーを発現していた(図16B上のパネル)。さらに、pMX tet off c-MYC 2A BMI1で作成した細胞株(図16A(d))は、pMX tet off c-MYC及びpMX tet off BMI1を別個に導入した細胞株(図16A(c))及びpMX tet off BMI1 2A c-MYCで作成した細胞株(図16A(e))よりも高い増殖能を示した。
また、抗Glycophorin-a抗体及び抗CD41a抗体で染色すると、pMX c-MYC及びDsam BMI1を別個に強制発現させた細胞株では、巨核球/赤芽球共通のマーカーであるCD41a+/Gly−a+の細胞集団が存在するのに対して(図16B、下のパネル左側)、pMX tet off c-MYC 2A BMI1で作成した細胞株ではGly−aは消失していた(図16B、下のパネル右側)。この結果は、pMX tet off c-MYC 2A BMI1で作成した細胞株は、pMX c-MYC及びDsam BMI1を別個に強制発現させた細胞株よりも、より巨核球系への分化が進んだ細胞株であることを示している。
β−エストラジオールの存在下、pMX tet off c-MYC 2A BMI1ベクターでc−MYC遺伝子及びBMI1遺伝子を強制発現させた細胞株の多核化の程度について検討を行った。ヒト由来巨核球は、通常、32N程度に多核化しているが(図17A)、pMX tet off c-MYC 2A BMI1ベクターでc−MYC遺伝子及びBMI1遺伝子を強制発現させた細胞株では、ほとんど多核化が進んでおらず、2N−4Nであることが示された。
c−MYC遺伝子及びBMI1遺伝子を発現する巨核球細胞株に由来する血小板の機能アッセイを行った。
コントロールのヒト末梢血由来血小板は、ADP(アデノシン二リン酸;血小板を活性化する細胞内因子)存在化でフィブリノーゲンと結合し、血栓形成の初期に必要なインテグリン活性化能(インサイドアウトシグナル)が正常であることを示される(図18上段右図)。一方、pMX tet off c-MYC 2A BMI1株(エストラジオール存在下)及びpMX c-MYC及びDsam BMI1強制発現株ともに、ADPを加えてもフィブリノーゲンに結合しなかった(図18中段及び下段)。従って、c−MYC遺伝子及びBMI1遺伝子が強制発現されたままであると、正常機能を有する血小板を放出しないことがわかった。
次に、pMX tet off c-MYC 2A BMI1ベクターでc−MYC遺伝子及びBMI1遺伝子を強制発現させている細胞株に対し、+テトラサイクリン及び−β−エストラジオールの条件下で強制発現を解除した後、培養4日目のCD41a+/CD42b+血小板のインテグリン活性化能を、フローサイトメーターを用いて解析した(図19)。その結果、ADP存在下でPAC1抗体(活性型インテグリンαIIbβ3結合抗体)が結合し、インテグリン活性化能(インサイドアウトシグナル)が正常であることが示された(図19B)。
以上の結果から、c−MYC遺伝子の強制発現により増殖させた巨核球株から産生される血小板は、機能に障害を持つが、巨核球株のc−MYC遺伝子等の強制的な発現を解除することで、正常な機能を有する血小板の産生が可能であることが示された。
同様にMYC遺伝子とBCLXL又はHOXA2遺伝子導入で作製した赤血球前駆細胞株も凍結保存し、必要なときに解凍して調製できる。
また、導入したMYC遺伝子、BMI1遺伝子の発現を上方あるいは下方に制御することで、生理活性を保持した血小板又は赤血球細胞を充分な量調製することが可能となる。
Claims (8)
- 成熟巨核球細胞を製造する方法であって、
造血前駆細胞、CD34陽性細胞、又は多核化前の巨核球前駆細胞において、MYCファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子と、BMI1遺伝子とを強制発現させ、該細胞を培養して増殖させる工程と、
前記増殖させた細胞を、成熟巨核球細胞に分化させる工程と、を含む方法。 - 前記分化させる工程は、前記癌遺伝子と前記BMI1遺伝子との強制発現を抑制して、又は、前記癌遺伝子と前記BMI1遺伝子とを前記細胞から除去して、前記増殖させた細胞を培養することによって行う、請求項1に記載の方法。
- 前記増殖させる工程の後、該増殖させた細胞を凍結保存する工程をさらに含み、該凍結保存した細胞を解凍した後、前記分化させる工程を行う、請求項1又は2に記載の方法。
- 血小板製剤の製造方法であって、
請求項1から3のいずれか1項に記載の方法で成熟巨核球細胞を製造する工程と、
前記成熟巨核球細胞の培養物から血小板画分を回収する工程と、
前記血小板画分から血小板以外の血球系細胞成分を除去する工程と、を含む方法。 - 血液製剤の製造方法であって、
請求項4に記載の方法で血小板製剤を製造する工程と、
前記血小板製剤を他の成分と混合して血液製剤を得る工程と、を含む方法。 - MYCファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子と、BMI1遺伝子とが導入されている多核化前の巨核球前駆細胞又は成熟巨核球細胞を含む細胞集団。
- 請求項6に記載の細胞集団を凍結した凍結細胞組成物。
- MYCファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子と、BMI1遺伝子とを強制発現させるための発現ベクターを含む、多核化前の巨核球前駆細胞、成熟巨核球細胞、又は血小板を製造するためのキット。
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