JPH10513358A - ヒト膵臓細胞系：発達と用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ベクター、好ましくはレトロウイルスベクターで細胞を形質転換させることによって発達させた細胞系、特にホ乳類細胞系に関する。ベクターは、１つ以上の誘導プロモーターおよび／または遺伝学的成分の制御下にある、オンコジーンを２つ以上含む。また、１つ以上の、好ましくは外来性の誘導プロモーターおよび／または遺伝学的成分の制御下にあるオンコジーンを１つ以上含むベクターによって形質転換した、インビトロの寿命が延びたヒト細胞系が本発明の範囲内に含まれる。ベクターは、所望の遺伝子生成物をコードする遺伝子を含むことができる。さらに、人間の糖尿病患者の移植に有用なインスリン産生ヒト膵臓細胞系を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト膵臓細胞系：発達と用途 本発明は、米国国立衛生研究所の許可番号第1R01DK50171-01号の下、政府の支 援を受けて行われた。米国政府は、本発明について一定の権利を有する。 本発明は、米国特許出願08/386,897号（1995年２月10日出願）の一部継続出願 である。 発明の分野 本発明は、遺伝子工学的に操作された細胞系および細胞移植療法に関する。特 に、移植に有用なオンコジーン形質転換細胞系に関する。 発明の背景 インスリンは、膵臓全体に分布するランゲルハンス島の主要な内分泌細胞型で ある膵臓β細胞によって合成され、加工され、分泌される。膵臓β細胞は、細胞 外のブドウ糖濃度の増加に反応してインスリンを分泌する。 糖尿病の２つの主要な形態、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）およびイン スリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）はともに、ブドウ糖のホメオスタシス制御 に必要な量および正確なタイミングでインスリンを配送することができないとい う特徴を有する。この不適切なインスリン配送は、ＩＤＤＭでは自己免疫機構に よるβ細胞の破壊、およびＮＩＤＤＭではインスリン耐性と密接に関連するβ細 胞の機能不全によって惹起される。病因におけるこのような相違にもかかわらず 、この２種の疾患の共通の治療目標は、ブドウ糖仲介インスリン遊離能力を正常 レベルまでに回復させることである。 ＩＤＤＭの治療には、ホルモンを慣用的に投与するか又はインスリン分泌組織 を移植するかによるインスリン補充が必要である。後者の手法は、インスリン供 給源として稀少な人間の膵臓を用いることに極めて大きく依存しているので、一 般的な応用としてはこれまで実現可能なものではなかった。ある研究者らは、組 織の入手可能性の問題を克服する手段として、異種移植片（例えばブタ）を用い ることを提唱した。しかしながら、異種移植片の免疫障壁は、例えば被包化のよ うな手段を用いて宿主免疫反応を回避させたとしても克服不可能である。 多くの研究者らは、インスリンプロモーターの制御下で優性オンコジーン（特 にＳＶ40 Ｔ抗原）を発現する遺伝子導入マウスを用いる膵臓β細胞系を開発し ている(C.B．Newgard，Diabetes，43:341-350(1994); D．Hanahan，Nature，315 :33-40(1985))。ラットインスリン遺伝子のプロモーターの制御下でＴ抗原を発 現するマウスは、生まれてから12〜20週でβ細胞腫を発達させる。残念ながら、 これらの動物に由来する殆どのβ細胞系(Knaackら、Diabetes，43: 1413-1417(1 994))は、正常なブドウ糖反応性インスリン産生を保持していない(M．Talら、Mo l．Cell．Biol.，12:422-32(1992))。 所望の特性をもつ偶発的に得られた細胞系が存在しない場合は、細胞系は優性 オンコジーンを初代細胞に導入して作製できる(J.Y．Chou，Mol．Endocrinol.， 3:1511-14(1889))。そのような細胞系が脳、肝および骨髄から構築されている。 いくつかの事例では、このようにして生成した細胞系は、分化した機能またはイ ンビボで分化する能力を保持している(E.Y．Snyderら、Cell，68: 33-51(1992)) 。残念ながら、他の多くの事例では、分化した機能の消失が生じて細胞系の有用 性が減少した(B．Jehnら、Mol．Cell．Biol.，12:3890-3902(1992))。 ＳＶ40 Ｔ抗原は、腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３と網膜芽腫（Ｒｂ）と の結合および不活化を含む多数のメカニズムによって細胞を形質転換させる（A. Anderssonら、Transplantation Reviews，6:20-38(1992)）。ＳＶ40 Ｔ抗原は ゲッ歯類細胞の形質転換には十分であることが示されたが、ヒトの初代細胞は形 質転換に対してより抵抗性を有する(S.E．Chang，Biochem．Biophys．Acta，823 : 161-94(1986))。ＳＶ40 Ｔ抗原を核酸感染させたヒトの初代線維芽細胞の永 代化(immortalization)の頻度は、概算によれば培養継代につき３×10^-7である( J.W．Shayら、Exp．Cell Res.，184: 109-18(1989))。 上皮成長因子（ＥＧＦ）レセプタの過剰発現は、ＥＧＦ類似体ｃ−ｅｒｂＢ２ およびｃ−ｅｒｂＢ３の過剰発現と同様に、しばしば膵臓癌で認められる(P.A． Hallら、Cancer Surveys，16:135-55(1993))。Ｒａｓ遺伝子は、膵臓癌を含むヒ トの癌で最も一般的に突然変異する。ｒａｓ遺伝子のうちで、Ｋ−ｒａｓ変異は 膵管の癌に80〜90％存在する(R.H．Hrubanら、Am．J．Pathol.，143: 545-54(19 93))。興味深いことには、Ｈ−ｒａｓ変異は膵臓癌には見出されなかった(R.H． Hrubanら、Am．J．Pathol.，143:545-54(1993); V.T.H.B.M．Smit ら、Nucl．Ac id Res.，16:7773-82(1988))。エラスターゼプロモーターの制御下で活性化変異 を含むＨ−ｒａｓは、遺伝子導入マウスの外分泌腺組織で発現され引き続いて腫 瘍形成をともなった(E.P．Sandgrenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:93-97 (1991);C.J．Quaifeら、Cell，48: 1023-34(1987))。しかしながら、活性化Ｈ− ｒａｓが特にインスリンプロモーターを用いるβ細胞で発現されるとき、糖尿病 の小島細胞の破壊は雄のマウスで発生したが、雌では認められなかった(S．Efra tら、Mol．Cell．Biol.，10: 1779-83(1990); S．Efrat，Endocrinol.，128:897 -901(1991))。 他の多くの癌の場合のように、通常ｐ５３は膵臓癌でも変異を起こしている。 ｃ−ｍｙｃ過剰発現は、ヒト原発性腫瘍でよく研究されてきたが、遺伝子導入マ ウスの膵臓で発現される場合、強力な形質転換遺伝子である。初代細胞への遺伝子の伝達 初代細胞、特にヒト初代細胞から永代化細胞系を発達させる際の問題は、これ らの細胞がほとんどの遺伝子伝達方法に抵抗性を示すということである。小島細 胞への遺伝子伝達は電気穿孔法によって実施された(M.S．Germanら、J．Biol．C hem.，265.22063-22066(1990))。しかしながら、遺伝子発現は一時的な観察を基 に調べられただけで、しかも小島を単一細胞懸濁液に解離することが必要であっ た。そのような処置は、ヒト膵臓由来の細胞の生存に有害である(G．Beattieら 、J．Clin．Endocr．Metab.，78:1232-40(1994))。アデノウイルスベクターは効 率よく膵臓細胞に感染するが（C.B．Newgard，Diabetes，43: 341-50(1994)）、 これらのベクターから長期にわたって遺伝子発現を維持させることには問題があ った(T.A.G．Smithら、Nature Genet.，5: 397-402(1993))。また、遺伝子導入 技術を用いることができる。これは、遺伝子導入動物でインスリンプロモーター の制御下で通常オンコジーン（通常はＳＶ40 Ｔ抗原）を発現させることを含み 、それによってインスリノーマ細胞系を増殖させるために用いることができる細 胞腫瘍を作製することができる(S．Fratら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:9 037-41(1988);J.I．Miyazakiら、Endocrinology，127:127-32(1990))。β細胞で の Ｔ抗原の遺伝子導入発現によって得られた細胞系は、種々の表現型を示す。ある ものはブドウ糖刺激インスリン遊離をほとんど示さないか、または生理的ブドウ 糖濃度以下で最大の反応を示す一方、他の細胞系は生理的範囲を越えるブドウ糖 の濃度に反応する。しかしながら、後者の細胞系の正常に近い反応性は永続的で はない。なぜならば、持続的な細胞培養によって、細胞は生理的ブドウ糖濃度以 下でインスリンを分泌するようなブドウ糖投与応答へと移行するからである。こ れら細胞系の詳細な考察は、C.B．Newgard，Diabetes，43:341-350(1994)に記載 されている。ヒトのインスリノーマ細胞系は得られているが、培養として維持す ることは困難であり、かつインスリンを産生しない(N．Gueliら、Exp．Clin．Ca ncer Res.，6(4): 281-285(1987))。 レトロウイルス仲介遺伝子伝達（すなわち、レトロウイルスを用いて遺伝子を 細胞に配送すること）は、他の遺伝子伝達技術であるが、この技術は必ずしも成 功するわけではない。この技術では、所望の遺伝子をレトロウイルスベクターに 挿入して組換えウイルスを得て、その後これを用いて標的細胞を感染させる。レ トロウイルスはリボ核酸（ＲＮＡ）ウイルスである。レトロウイルス仲介遺伝子 伝達では、ＲＮＡウイルスが標的細胞に侵入した後、ウイルスＲＮＡは先ずデオ キシリボ核酸（ＤＮＡ）に変換される。侵入された標的細胞が複製性細胞である （すなわち有糸分裂活性である）とき、ＤＮＡが核に入り標的細胞のゲノムに組 み込まれる。この組み込まれた形態で、ウイルス遺伝子は発現される。ウイルス ゲノムが標的細胞ゲノムに組み込まれることは、細胞の増殖の必須部分である。 レトロウイルスベクターは、多くの組織の初代細胞を含む多様な細胞型に極めて 効率よく感染できる(J.R．McLachlinら、Prog．Nuc．Acid Res．Mol．Biol.，38 : 91-135(1990))。レトロウイルスベクターの主な欠点は、レトロウイルスの組 み込み前複合体が核に入りそのゲノムに組み込まれるために、有糸分裂活性の細 胞が要求されるということである。 米国特許第 5,256,553号(Overell)は３つの挿入遺伝子（２つのオンコジーン および少なくとも１つの異種遺伝子）を含むレトロウイルスを開示する。各々の 遺伝子はその対応する転写制御配列の制御の下でそれぞれ別個に転写される。こ の特許は、実施例１で初代ラット胎児線維芽細胞（ＲＥＦ）Ｂａｌｂ／３Ｔ３お よびψ２（ψ２は３Ｔ３細胞由来レトロウイルスパッケージング細胞系）を開示 する。これらは、その各々がｖ−Ｈａ−ｒａｓオンコジーン、ｖ−ｍｙｃオンコ ジーン、およびＧ４１８抗生物質耐性に対する耐性を付与するネオマイシンホス ホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子を含む、２つの３重プロモーターレトロ ウイルスベクターによって形質転換されている。この特許の実施例２は２つの他 の３重プロモーターベクターを開示する。これは、ｎｅｏ遺伝子の代わりに、こ れらベクターはヒグロマイシンＢに対する耐性を付与するヒグロ（ｈｐｈ）遺伝 子を含むという点を除いて、実施例１と同様である。実施例２のベクターを用い て、Ｂａｌｂ／３Ｔ３およびψ２細胞を形質転換した。この特許の実施例３で、 実施例１および２のベクターをψ２細胞に核酸感染させた。ウイルス産生クロー ンから採集したウイルスをＢａｌｂ／３Ｔ３細胞でインキュベートし、これらの 細胞に感染可能であることがわかった。しかしながら、細胞形質転換は、全ての 種において多数の段階を経る遺伝的過程であるが、この過程はヒトとゲッ歯類の 間では異なり、ヒトの細胞は形質転換に対して比較的抵抗性を有する。この相違 の理由は分かっていない。さらに、ヒトの初代細胞は、安定な遺伝子伝達に対し て相対的に抵抗性を有することはしばしば認められる。さらにまた、このような 事実はインビトロでのヒトの細胞系の発達を困難にさせる。したがって、ヒト細 胞系のほとんどは、インビトロでの培養に順応させた原発性癌から得られている 。 発明の要旨 本発明の１つの面は、１つ以上の誘導プロモーター（inducible promoter）お よび／または遺伝学的成分(genetic element)の制御下にある、２つ以上のオン コジーンを含むベクターを提供することにある。好ましいベクターは、１つの誘 導プロモーターまたは２つの遺伝学的成分の制御下にあるオンコジーンを２つ以 上、好ましくは２つ又は３つ含む。誘導プロモーターは、オンコジーンの転写、 ゆえにオンコジーンの発現を活性化するか又は抑圧する手段を提供する。遺伝学 的成分、好ましくはオンコジーンに隣接する１対の遺伝学的成分は、ベクターま たは該ベクターが組み込まれているゲノムもしくは遺伝配列からオンコジーンの 切り出し（除去）を可能にする。これらのベクターは、好ましくは感染性を有す るが複製不全ウイルスを産生することができるウイルスベクターである。最も好 ましいベクターは、レトロウイルスである。このベクターは、さらに誘導プロモ ーターのリプレッサーまたはアクチベーターをコードする遺伝子を含んでいても よい。これらの遺伝子は以下ではそれぞれリプレッサー遺伝子またはアクチベー ター遺伝子と呼ぶ。また、このベクターは、誘導プロモーター内にそのようなリ プレッサーまたはアクチベーター遺伝子のための結合部位を含んでいてもよい。 このベクターはさらに、遺伝学的修飾細胞内で発現される所望の遺伝子をそれぞ れ１つ以上含んでいてもよい。 本発明の他の面として、移植に有用な細胞を製造する方法を提供する。本方法 は、標的細胞を形質転換させるために上記のベクターを用いる。遺伝学的修飾細 胞では、オンコジーンが発現し、細胞系を発達させるためにこれらの細胞を増殖 させることが可能になる。いったん十分な数の細胞を得ると、オンコジーンの発 現を抑圧するのに誘導プロモーターを抑制するか又はオンコジーンを除去する。 これらの細胞が前駆細胞であるとき、それらの細胞は続いて分化が可能になる。 遺伝学的修飾細胞、オンコジーン抑圧細胞又はオンコジーン除去細胞、および／ または分化細胞は患者への移植に有用である。 本発明の他の面として、上記の方法で製造された細胞系を提供する。 本発明の他の面として、上記の遺伝学的修飾細胞、オンコジーン抑圧細胞又は オンコジーン除去細胞、及び分化細胞を患者に移植することによる細胞移植療法 を提供する。 本発明の他の面として、１つ以上、好ましくは外来性の誘導プロモーターの制 御下にある１つ以上の外来性のオンコジーンによって形質転換された、インビト ロでの存続期間が長くなった、自然発生ではないヒトの細胞系を提供する。より 好ましくは、この細胞系は、少なくとも２つのオンコジーンによって形質転換さ れる。好ましい細胞系はヒトの膵臓細胞系である。もっとも好ましくはこの細胞 系はインスリンを産生する。 図面の簡単な説明 図１は、レトロウイルスプラスミドpLNSVoTPMPRLおよびpLoTPMPRRNLoのクロー ニングを模式的に示す。白四角は調節成分を示す。影付き四角はコード配列を示 す。全ての環状プラスミドは直鎖状で表わされ、サブクローニングされた遺伝子 とそれに隣接する成分のみが示されている。表記方法は以下のとおりである：Ｓ Ｖ−ＴまたはＳＶ Ｔ−Ａｇ（ＳＶ40 Ｔ抗原）、ｍｙｃ（ヒトｃ−ｍｙｃ）、 ｒａｓ（Ｈ−ｒａｓ^val12）、ｎｅｏまたはＮｅｏ^r（ネオマイシン耐性遺伝子） 、ＬＴＲ（レトロウイルス末端長反復配列(long terminal repeat)）、ＬＴＲｏ （ｌａｃオペレーター配列を含む修飾ＬＴＲ）、ＳＶｏ（ｌａｃオペレーター配 列を含む修飾ＳＶ40プロモーター）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモ ーター）およびＰＯ（ポリオウイルスリボソーム内進入配列(ribosomal interna l entry sequence)。構造物の上の文字は制限酵素部位を表す。即ち、Ｎ（Ｎｏ ｔＩ）、Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ）およびＥ（ＥｃｏＲＩ）である。矢印は予想され る転写開始部位を示す。模式図は大きさを描いていない。 図２は、pLNSVLacOCatL の制限地図を模式的に示す。 図３は、pLoCRNLoの制限地図を模式的に示す。 図４は、擬似型レトロウイルスLNSVoTPMPRL およびLoTPMPRRNLo の作製を模式 的に示す。 図５は、ｌａｃオペレータ（Ｏ）−ｌａｃリプレッサー（Ｉ）系を模式的に示 す。 図６は、ＬａｃＩ（ｌａｃＩ遺伝子）、ＳＶ（ＳＶ４０初期プロモーター）、 ｈｙｇ（ヒグロマイシン優性選別マーカー）およびＬＴＲ（末端長反復配列）を 含むレトロウイルスベクターpLISVHygL を模式的に示す。 図７は、ＴＲＭ−６のインスリン陽性細胞を示す。 図８は、プロデューサー細胞系＃４−１１およびＴＲＭ−１細胞内の直鎖状で 表したプロウイルス構造を模式的に示す。白四角および影付き四角は調節成分お よび発現されるべき遺伝子をそれぞれ示す。表記方法は図１と同じである。構造 の上の文字は、サザンブロット分析で用いられる制限酵素部位を示す。即ち、Ｈ （ＨｉｎｄＩＩＩ）、Ｅ（ＥｃｏＲＩ）、Ｎ（ＮｏｔＩ）およびＰ（Ｐｆ１ＭＩ ）である。 発明の詳細な説明 遺伝子伝達 本願で用いるとき、“ベクター”という用語は、例えばプラスミドのようなＤ ＮＡまたはＲＮＡ輸送手段を指し、適切な宿主細胞、例えば細菌ホスト内でＤＮ ＡまたはＲＮＡの複製を可能にするヌクレオチド配列を含む。本発明では、ベク ターは、プロウイルス配列が遺伝学的修飾標的細胞で発現されるとき、ｍＲＮＡ に転写されて、さらにタンパク質に翻訳されるオンコジーンを含む組換えレトロ ウイルスを含む。 “核酸感染(transfection)”とは、例えばホ乳類標的細胞の場合のＤＮＡベク ターのような外来ヌクレオチド配列を、いずれのコード配列も完全に発現される か否かに関係なく、標的細胞に導入することを指す。当業者には多くの核酸感染 法が知られている。例えば、化学的方法（例えばカルシウム−リン酸塩核酸感染 ）、物理的方法(例えば電気穿孔法、微量注入、粒子砲撃(particle bombardment ))、融合（例えばリポゾーム）、レセプター仲介エンドサイトーシス（例えばＤ ＮＡ−タンパク質複合体、ウイルスエンベロープ／カプシド−ＤＮＡ複合体）お よび組換えウイルスのようなウイルスによる生物学的感染によるもの(J.A．Wolf f編、Gene Therapeutics、Birkhause 刊、ボストン、USA(1994))である。レトロ ウイルスによる感染の場合、感染するレトロウイルス粒子は標的細胞に吸収され 、結果としてレトロウイルスＲＮＡゲノムが逆転写され、生じたプロウイルスは 細胞ＤＮＡに組み込まれる。標的細胞の遺伝学的修飾は核酸感染の成功のしるし である。“遺伝学的修飾細胞”とは、核酸感染による外来ヌクレオチド配列の細 胞取込みの結果としてその遺伝子型が変化した細胞を指す。“初代細胞”とは、 生物体の組織から採集された細胞である。 本発明のある面として、１つ以上の誘導プロモーターおよび／または遺伝学的 成分の制御下にあるオンコジーンを２つ以上含むベクターであって、それらが遺 伝学的に修飾した細胞での発現を可能にするオンコジーンを含むベクターを提供 することにある。例えば、各ベクターは、１つ以上の誘導プロモーターまたは遺 伝学的成分の制御下にあるオンコジーンを２つ〜５つ含むことができる。より好 ましくは、全てのオンコジーンは、１つの誘導プロモーターまたは１対の遺伝学 的成分の制御下にある。最も好ましいベクターは、１つの誘導プロモーターまた は１対の遺伝学的成分の制御下にあるオンコジーンを２つまたは３つ含む。この ベクターはまた、プロモーターと相互反応するリプレッサーまたはアクチベータ ー遺伝子を含むのが好ましい。また、ベクターは、リプレッサーまたはアクチベ ーター遺伝子の導入用部位を含むことができる。これらのベクターは、ウイルス ベクターであるのが好ましく、その場合には本発明はそれらの組換えウイルスも 提供する。好ましくは、このオンコジーンは優性オンコジーンである。組換えウ イルスは、感染性であるが増殖不全であるのが好ましい。ベクターは、好ましく は、細胞に核酸感染させることができ、さらに長期間にわたってインビトロでの 細胞生長を可能にするために安定的にオンコジーンを発現させることができる。 本発明は、好ましくは遺伝学的修飾真核細胞に関するものであり、これらの細胞 はこの修飾がなければインビトロで長期にわたって生長することができない。後 者の真核細胞はホ乳類であるのが好ましく、より好ましくはヒトの細胞である。 １ベクター系において、ベクターは、誘導プロモーターを抑制するかまたは活性 化させる１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子をさらに含む。ま た、２ベクター系において、ベクターはそのようなリプレッサーまたはアクチベ ーター遺伝子のための部位を含むことができる。続いて、このリプレッサーまた はアクチベーター遺伝子は、このリプレッサーまたはアクチベーター遺伝子を含 む第二のベクターによる核酸感染によって遺伝学的修飾細胞に導入される。１ベ クター系および２ベクター系の具体的な例は、下記の“誘導プロモーターおよび 遺伝学的成分”の節で考察する。ベクターは各々、それらによって遺伝学的修飾 細胞内で安定的に発現されるさらに１つ以上の所望の遺伝子を含むことができる 。。ベクターは、上述のような当技術分野で既知のいずれかの方法で標的細胞に 導入する（核酸感染させる）ことができる。好ましいベクターはウイルスベクタ ーであり、細胞は感染性であるが複製不全な組換えウイルスによる感染によって 遺伝学的に修飾されるのが好ましい。レトロウイルスベクターおよびレトロウイ ルス仲介遺伝子伝達が最も好ましい。 本発明では、ベクターは１つのオンコジーンを含むことができる。しかしなが ら、好ましくはただ１つの誘導プロモーターまたは１対の遺伝学的成分の制御下 にある２つ以上のオンコジーンを用いることによって、本発明は従来技術を凌ぐ 利点を有する。多数の遺伝学的変更が完全な形質転換に必要とされるかもしれな い。効果的な形質転換はオンコジーンの協同作用によって達成できる(T．Hunte r，Cell，64:249-270(1991))。別々のベクター内のオンコジーンの伝達、特にプ ラスミドによる核酸感染型の場合は、ただ１つのレトロウイルスベクター内の多 数のオンコジーンの同時伝達よりも効率がはるかに低い(W.R．Taylorら、Oncoge ne，7:1383-1390(1992); D.A．Spandidos ら、Anticancer Res.，9:1149-1152(1 989))。レトロウイルスベクター内のオンコジーンの同時伝達は以前、各オンコ ジーンを機能させるために別々のプロモーターを用いた(R.W．Overellら、Mol. Cell．Biol.，8:1803-1808(1988))。しかしながら、この方法はプロモーターの 干渉をもたらす可能性がある（M．Emermanら、Nucl．Acid．Res.，14:9381-9396 (1986)）。さらに、そのようなプロモーターは単一オンコジーン系では用いられ たが、２オンコジーン型ベクターで利用できる誘導ベクターはない(S．Efratら 、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92:3576-3580(1995);R．Epstein-Baakら、Cell ．Growth Diff.，3:127-134(1992))。本発明では、単一のオンコジーンが核酸感 染細胞の遺伝子内のオンコジーンの形成を誘導するとき、単一オンコジーン、例 えばｐ５３を用いることができる。 本発明の他の面として、上記のベクターによって遺伝学的修飾した細胞を用い る細胞移植療法を提供する。これらの細胞を患者に移植して、例えば患者の破壊 された細胞もしくは機能不全細胞と置き換えるかまたは所望の遺伝子産物を産生 させる。遺伝学的修飾細胞は、それらが移植されるホストと同じ種であるのが好 ましい。一般に、ホ乳類の患者を治療するためにはホ乳類の標的細胞が用いられ る。したがって、ヒトの患者の場合、細胞はヒトの細胞であるのが好ましい。 標的細胞は成人細胞でも前駆細胞でもよい。前駆細胞は、例えば完全な器官ま たは器官の一部に分化できる細胞、例えば発生または分化によって特定の組織（ 例えば筋肉、皮膚、心臓、脳、子宮、および血液）を形成することができる細胞 である。前駆細胞の例は内分泌前駆細胞および胎児細胞である。胎児細胞は容易 に得られ、さらなる生長が可能である。組換えレトロウイルスの場合、胎児細胞 はなお分裂が可能であり、したがってこれらのウイルスに対する標的として用い ることができる。成人細胞の場合は、組換えレトロウイルスにそれら細胞を感染 させる前に、例えば８０４Ｇ細胞およびＨＧＦ／ＳＦ由来の細胞外マトリックス でそれらを生長させるか、またはそれらをコラゲナーゼ、デキサメタゾン、線維 芽細胞成長因子のような有糸分裂誘発剤に曝すことによって生長させることがで きる。遺伝学的修飾標的細胞でのオンコジーンの発現によって、長期にわたる細 胞生長が一層得やすくなる。 本発明は、特にヒトの細胞の新規な感染および長期間、例えば50回の細胞分裂 の間または少なくとも６ヵ月間、より好ましくは少なくとも 150回の細胞分裂の 間または10ヵ月、最も好ましくは少なくとも１年間、インビトロで生長できる感 染ヒト細胞系の製造に関する。これらの細胞系は上記のベクターによって形質転 換されるのが好ましい。特に本発明は、ヒトの膵臓の内分泌前駆細胞から製造さ れた第１の細胞系、およびヒト、またはいずれかの種の胎児の膵臓に直接由来す る第１のインスリン産生細胞系を開示する。これらのインスリン産生細胞系は、 好ましくは、誘導プロモーターの制御下にある少なくとも２つのオンコジーンを 含むレトロウイルスベクターが感染した細胞に由来する。好ましいレトロウイル スベクターは、ｌａｃリプレッサー反応性プロモーターの制御下で、ＳＶ40Ｔ抗 原およびＨ−ｒａｓ^val12を感染細胞内で発現する。 初代細胞、例えば内分泌前駆細胞の多数のオンコジーンの発現は、これらの細 胞の分化する能力とおそらく干渉するであろうと思われるので、ベクター内の誘 導プロモーターおよび遺伝学的成分は誘導によりオンコジーン発現を調節する。 また、ホスト内でのオンコジーンの発現は腫瘍をもたらすかもしれない。したが って、いったん遺伝学的修飾細胞の数が採集に望ましい量に達すると、細胞内の オンコジーンは抑圧または除去され、存在する場合、前駆細胞は成熟細胞へと分 化する。その後、これらの分化成熟細胞は患者に移植される。したがって、この 細胞系のインビトロの寿命に関係なく、最も好ましい細胞系は、好ましくは所望 の生成物を産生するため、移植に有用な、分裂しない、好ましくは分化したヒト 細胞系である。 細胞の移植には２つの面が存在する。第一の面として、移植細胞は、破壊され 機能不全に陥った細胞または患者には存在しない細胞を補充するように機能する 。第二の面として、ベクターは、移植患者において失われた所望の生成物、機能 不全の生成物または低レベルで発現している生成物を発現する異質遺伝子を含む ことができる。第二の場合、移植細胞は移植患者において所望の遺伝子生成物を 発 現する。 細胞移植療法のこの第一の面を実施する場合、標的細胞は患者で再生しない細 胞であるのが好ましい。したがって、例えばヒト胎児のニューロンを上記の方法 によって生長し、インビトロで増殖させ、さらにオンコジーン抑圧またはオンコ ジーン除去した分化ニューロンを人間の患者に移植することができる。患者は、 ニューロンの消失または機能不全をもつ者、例えばアルツハイマー、パーキンソ ン、および他の神経退行性疾患に罹患した者である。同様に、ヒト骨髄または幹 細胞を製造し、免疫反応抑制疾患をもつ患者に移植することができる。このよう な患者には、遺伝性欠陥、癌、免疫不全症候群（エイズ）を罹患する者または癌 治療を受けている患者が含まれる。いったん循環系に入ると、これら移植された 骨髄細胞または幹細胞は骨に移動し、そこで未成熟細胞は機能的なＢおよびＴ細 胞に成長する。使用可能な他の胎児細胞は、例えば下垂体および視床下部の細胞 のような内分泌細胞、特に内分泌前駆細胞、例えばヒト胎児下垂体（ＨＦＰ）細 胞である。遺伝学的修飾され移植された細胞は、移植ホスト細胞に必要な内分泌 ホルモンの産生不足を補うのが好ましい。筋原細胞もまた遺伝学的に修飾し分化 させて、筋肉の消失、機能不全または退行をもつ患者（例えば心臓疾患または筋 ジストロフィーを罹患する患者）に移植することができる。他の例として、遺伝 学的修飾し、オンコジーン抑圧又はオンコジーン除去した、分化胎児膵臓細胞の 人間の患者への移植が挙げられる。好ましくは、移植された細胞は、患者のブド ウ糖レベルに応じてブドウ糖のホメオスタシスの制御に必要な正確なタイミング 及び量でインスリンを分泌する。ベクターは、所望の遺伝子生成物をコードする １つ２つ以上の遺伝子をさらに含むことができる。所望の遺伝子生成物は、移植 されたホストで不足しているか、欠如しているかまたは不完全であろう。したが って、移植細胞は、遺伝子生成物を発現させることによって移植されたホストの 正常な遺伝子生成物が欠乏しているのを補いまたは克服する。例えば、このベク ターは、血液凝固因子をコードする第ＩＸ因子遺伝子をさらに含むことができる 。いったん血友病患者に移植されると、得られた遺伝学的修飾細胞は血液凝固因 子をインビボで産生し、患者の血液凝固因子を補う。他の実施例では、ベクター はジストロフィン（dystrophin）をコードする遺伝子を含むことができ、このベ ク ターは、遺伝学的に修飾されるべき筋原細胞または、筋ジストロフィーを罹患す る患者に移植される他の細胞に用いられる。また他の実施例では、神経伝達物質 の産生を高めるために、オンコジーン、誘導プロモーターおよび神経伝達物質を コードする１つ以上の遺伝子を含む組換えウイルスをニューロン細胞に感染させ る。望まれる遺伝子の他の例としては、以下のものを産生する遺伝子がある。即 ち、免疫グロブリン、血清タンパク質、ウイルスもしくは腫瘍細胞抗原、または 生物学的に活性な分子、例えば酵素、ホルモン、成長因子、またはホルモンもし くは成長因子のレセプタ、または前述の物質の類似体である。望まれる遺伝子の 例として、非ホ乳類性遺伝子、例えばコレステロール代謝酵素をコードする細菌 性配列も挙げられる。 本発明は、細胞系、特に胎児細胞系の確立と細胞系の長期にわたる生長を可能 にする。これら細胞系は、遺伝学的修飾し、オンコジーン抑圧又は除去された、 分化細胞であって、これら細胞はその性状がよく調べられ、したがって個々の患 者に対して適合させる必要がなく多くのヒトの患者に用いることができる。好ま しくはこれらの細胞系は永久的である。 移植された患者の免疫拒絶反応を減少させるために、好ましいベクターおよび ウイルスは、遺伝学的に修飾される細胞系の免疫原性を低下させる遺伝子をさら に含むことができる。そのような遺伝子の例として、トランスメンブラン糖タン パク質（ｇｐ１９Ｋ）をコードするアデノウイルスＰ１９遺伝子がある。ｇｐ１ ９Ｋは小胞体に局在し、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ抗原（Ａｇ ）に結合する。この結合によって感染細胞の表面へのクラスＩＡｇの移送が阻害 され、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によるクラスＩ限定細胞溶解が防止される （S．Paaboら、Cell，50:311-317(1987); W.S.M．Wold & L.R．Gooding，Mol．B iol．Med.，6:433-452(1989)中の参考文献）。免疫原性が低下した遺伝学的修飾 細胞系バンクを設立して、細胞系バンクから離れた処置センターで例えば人間の 患者に移植するための細胞を供給することができる。このような細胞系および細 胞系バンクを利用することが可能になることによって、当技術分野で既知の他の 目的のために使用できる細胞の容易な供給源が提供され、死体および胎児組織の ような稀少な供給源に代わることができる。 また、ホスト対移植片免疫拒絶をさらに減少させるために、患者の細胞を用い て、本発明の方法を用いてその細胞を遺伝学的に修飾する前に、その細胞をコラ ゲナーゼ、デキサメタゾン、線維芽細胞成長因子のような有糸分裂促進剤に曝す ことによって、患者の細胞の生長を促してもよい。 移植の他に、この遺伝学的修飾細胞系を培養し、これらを用いてインビトロで 所望の遺伝子生成物を産生させ、この生成物を採集し当技術分野で既知の方法に したがって精製することができる。遺伝学的修飾細胞が所望の遺伝子生成物を産 生させるのに用いるとき、誘導プロモーターをベクターに取り込ませる必要はな い。なぜならば、移植されるホストにとっては問題となる腫瘍原性はこの場合に は重要ではないと考えられるからである。 本明細書で開示する細胞系はまた、例えば細胞表面上のタンパク質と相互作用 する、例えば治療的用途のための化学物質のスクリーニングのような他の目的の ために性状がよく調べられた細胞を提供するであろう。ウイルスベクターの選択 レトロウイルスベクターは本発明の好ましいベクターであるが、例えばアデノ ウイルスベクターのような他のウイルスベクターも用いることができる。アデノ ウイルスベクターは核酸感染のために分裂細胞を必要としないという利点はある が、ゲノムに組み込まれることがなく、おそらく安定な細胞系の誘導を一層困難 にするであろうという欠点をもつ。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターもま た用いることができるが、レトロウイルスベクターに較べてパッケージング限界 がより小さくなるという欠点がある。 レトロウイルスベクターは当技術分野で既知のいずれのものでもよい。本発明 の使用に適したレトロウイルスは多くの鳥類またはホ乳類ホストに由来する。し かしながら使用に必要なことは、このウイルスが、レトロウイルスベクターを用 いて導入される新規な遺伝学的物質（オンコジーンおよび／または所望の遺伝子 ）の受容者である細胞に感染することができるということである。レトロウイル スの例には、鳥類レトロウイルス、例えばトリ赤芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、ト リ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＢＶ）、トリ肉腫ウ イルス（ＡＣＶ）、フジナミ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、脾臓壊死ウイルス（Ｓ ＮＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が含まれる。非鳥類ウイルスには、 ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコレトロウイルス、例えばネコ白血病ウイル ス（ＦｅＬＶ）もしくはネコ肉腫ウイルス（ＦｅＳＶ）、ネズミレトロウイルス 、例えばネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ） およびネズミ肉腫ウイルス（ＭＳＶ）、ラット肉腫ウイルス（ＲａＳＶ）および 霊長類レトロウイルス、例えばヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス１型および２型（ ＨＴＬＶ−１、２）並びにサル肉腫ウイルス（ＳＳＶ）が含まれる。他の多くの 適切なレトロウイルスは当業者には周知である。レトロウイルスの分類はタイク によって提供される（Teich，Weissら編、"RNA腫瘍ウイルス(RNA Tumor Virus)" 第２巻より、コールドスプリングハーバー研究所刊、ニューヨーク（pp.1-16，1 985)）。本発明に関連して使用される好ましいレトロウイルスは、モロニーネズ ミ肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベーネズミ肉腫ウイルス（ＨａＭＳＶ）お よびカーステンネズミ肉腫ウイルス（ＫｉＳＶ）として知られているネズミレト ロウイルスである。ＭｏＭＳＶのゲノムは、ｐＢＲ３２２プラスミド配列ｐＭＶ (ＡＴＣＣ37190)と連結して得られる一方、Ｋ−ＢＡＬＢ細胞のＫｉＳＶ産生細 胞系はＡＴＣＣ 163.3として寄託された。ＲＳＶゲノムとｎｅｏマーカーを含む ｐＢＲ３２２由来プラスミド(pRSVneo)はＡＴＣＣ 37198として入手可能である 。ＳＮＶゲノムを含むプラスミド（pPBI01）はＡＴＣＣ 45012として入手できる 。例えば、レトロウイルスベクターは、１つ以上の複製遺伝子、例えばｇａｇ（ 群特異的抗原）、ｐｏｌ（ポリメラーゼ）またはｅｎｖ（エンベロープ）タンパ ク質をコードする遺伝子を欠くように構築することができる。したがって、得ら れた組換えレトロウイルスは感染ホスト細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれるが、 いったん組み込まれると、当該組換えウイルスが導入された細胞が、機能的に活 性なトランス作動性ウイルスタンパク質をコードする別のプロウイルス挿入物を 含まないかぎり、複製して感染性ウイルスを産生することができない。感染性を 有するが複製不全であるウイルスを産生する方法は当技術分野で既知であり、例 えば、Mannら、Cell，33:153(1983)及びMillerら、Mol．Cell．Biol.，6:2895(1 986)に記載されており、これらの文献は参考として本明細書に含まれる。オンコジーンの選択 多種多様な、好ましくは優性のオンコジーンは、当技術分野で既知のいずれで もよい。オンコジーンは、好ましくは、細胞の形質転換におけるそれらの協力作 用および標的細胞を形質転換させるそれらの能力にしたがって選択される。さら に、いくつかのサイズの大きいオンコジーンは同じベクターに包含させる場合に 影響を与えるであろう。形質転換能力を与えるために、本発明のＲＮＡまたはＤ ＮＡ構築物は少なくとも２つまたは３つのオンコジーンを含むが、これらはウイ ルス、細胞性ゲノム、ホ乳類または鳥類染色体ＲＮＡもしくはＤＮＡに由来する ことができる。オンコジーンの部分リストはビショップらによって提供される（ Bishopら、Weiss ら編、"RNA腫瘍ウイルス(RNA Tumor Virus)"第１巻より、コー ルドスプリングハーバー研究所刊、ニューヨーク(pp.1004-1005(1984)；Watson ら、”遺伝子の分子生物学(Molecular Biology of the Gene)"第４版、第ＩＩ巻 より、Benjamin Cummings 刊、Menlo Park，カリフォルニア、USA(P.1037))。含 まれているオンコジーンは既知のオンコジーンで、例えばｓｒｃ、ｙｅｓ、ａｂ ｌ、ｆｐｓ、ｆｅｓ、ｆｍｓ、ｒｏｓ、ｋｉｔ、ｍｏｓ、ｒａｆ、Ｈ−ｒａｓ、 Ｋ−ｒａｓ、ｓｉｓ、ＳＶ40 Ｔ−抗原（ＳＶ40 Ｔ−Ａｇ）、Ｈｅｒ２／ｎｅ ｕ、Ｃ−ｅｒｂＢ２、Ｃ−ｅｒＢ３、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｆｏｓ、ｓｋｉおよびｅ ｒｂＡである。多くのオンコジーン産物がチロシン特異的タンパク質キナーゼま たはセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するか、または成長因子、 成長因子レセプターの類似体のようであるか、または未知の機能を有する核タン パク質である。多くのオンコジーンは公的な生物学的物質寄託収集所から入手で きる。したがって、ｖ−ｒａｆはＡＴＣＣ45010 として寄託されたプラスミドｐ Ｆ４に存在する(Rappら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，80:4218(1983))。ｖ− ｍｙｃ^mc29はＡＴＣＣ45014 として入手でき、ｖ−Ｈａ−ｒａｓはＡＴＣＣ4104 7 の遺伝学的構成成分である。誘導プロモーターおよび遺伝学的成分 各ベクターのオンコジーンは、１つ以上、好ましくは多くても２つの誘導プロ モーターまたは誘導遺伝学的成分の制御下にある。より好ましくは、同じプロモ ーターの制御下で全てのオンコジーンを発現させるために多シストロン性転写ユ ニットが用いられる。 誘導プロモーターおよび誘導遺伝学的成分は当技術分野で既知であり、ウイル スゲノムまたはホ乳類ゲノムから得ることができる。誘導プロモーターの例は以 下のとおりである：ｌａｃＯ−含有ＳＶ４０プロモーター、ｌａｃＯ−含有ＬＴ Ｒプロモーター、メタロチオネインプロモーターおよびＴＥＴプロモーターであ る。ＳＶ４０ＤＮＡの供給源は多く、例えばNew England Biolabs，Inc(ビバー リー、マサチューセッツ、USA)のような販売元が含まれる。誘導遺伝学的成分を 用いる誘導系では、該オンコジーンは核酸感染細胞からそれらを削除することに よって抑圧される。例えば、二ベクター系では、第一のベクターは、バクテリオ ファージＰ１Ｃｒｅ／ｌｏｘ組換え系から得られた組換え部位からなる遺伝学的 成分が隣接するオンコジーンを含む。第一のベクターが標的細胞を形質転換させ 、この細胞を所望の数まで増殖させた後、第二のベクターをこの細胞の核酸感染 のために用いる。第二のベクターは、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含み、これ は細胞内で発現されると、細胞のゲノムから当該オンコジーンを切り出す。Ｐ１ Ｃｒｅ／ｌｏｘ系は、E.C．Dale ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:10558-1 0562(1991)に記載されている（この文献は参考として本明細書に含まれる）。ま た、このベクターは誘導プロモーターおよび遺伝学的成分の両方を含むことがで きる。最も簡単な例では、ベクターは誘導プロモーターおよびオンコジーンに隣 接する１対の遺伝学的成分を含む。この系では、誘導プロモーターを用いて、オ ンコジーンの発現を徐々に減少させることができる。例えば、遺伝学的成分によ ってオンコジーンが切り出される前に、オンコジーン活性の消失に細胞を適応さ せることができる。 所望のオンコジーンおよび誘導プロモーターまたは遺伝学的成分系を含む適切 なベクターの構築には標準的な連結技術が用いられる。単離プラスミドまたはヌ クレオチド配列を切断し切り縮めて、さらに必要なプラスミドを形成するために 再び連結して所望の形状を得る。例えば、核酸感染の前に細菌ホスト内でレトロ ウイルスの遺伝学的成分を増幅させるために有用なプラスミドベクターは、１つ 以上の表現型選別マーカーおよび細菌ホスト内での増幅を担保する複製起点を含 むベクターに以前に述べた遺伝学的成分をコードするレトロウイルスＤＮＡ配列 を挿入することによって構築される。ベクター増幅に好ましい原核細胞ホストは 大腸菌(E ．coli)であるが、選択の問題として他のものもまた用いることができ る。組換えウイルスのようなウイルスベクターを細胞に核酸感染または感染させ るために用い、さらに遺伝学的修飾細胞を当技術分野で既知の方法によって選別 できる。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、J．Sambr ook ら編、コールドスプリングハーバー研究所出版部、(1989)を参照のこと。遺 伝学的修飾細胞は、プロモーターを活性化または抑制し、さらに遺伝学的修飾細 胞の選別に適するように変更した従来の栄養培地で培養する。培養条件は標的細 胞に適した条件であり、当業者には明らかであろう。 プロモーターの制御下にある多数の遺伝子を真核細胞内で発現することができ るレトロウイルスベクターは、当技術分野で既知である。例えば、ある方法では 、その走査メカニズムによって終止コドンに出くわした後で翻訳を再開始させる リボソームの能力が利用される（M．Kozak，J．Biol．Chem.，108:229-41(1989) ）。この方法は、同じプロモーターによって制御される２つの遺伝子が接近して 配置されることによって効果的に発現されるレトロウイルスベクターを開発する ために利用された(F．Levineら、Gene，108:167-74(1991))。第二の方法では、 ホ乳類細胞の内部リボソーム進入を仲介するためにポリオウイルス由来の配列が 利用され、これによって多数の遺伝子が同じｍＲＮＡから発現することができる (Pelletierら、Nature，334:320-25(1988))。 誘導オンコジーンの機能を発揮させるために多くの異なる系が用いられた。遺 伝学的修飾細胞が移植される予定の場合は、誘導プロモーターは移植ホストにそ の時点で存在する条件、例えばホストに存在する化学物質またはホストのインビ ボの環境によって誘導されてはいけない。誘導によって形質転換される細胞系を 生み出すためにＳＶ40 Ｔ抗原の温度感受性変異体が用いられた。このような細 胞系はインビボで移植され、分化していくつかの正常機能を保持することを示し た(J.Y．Chou，Mol．Endocrinol.，3: 1511-14(1989))。オータとバルシャフス キーは温度感受性変異体の一般的作製方法を開発した(I.M．Otaら、Science，26 3: 1273-76(1994))。温度感受性変異の欠点は、温度感受性タンパク質に正常機 能を維持させるために細胞を低温で維持しなければならないということである。 ＨＥＰ由来の細胞を含む多くの初代細胞タイプは、最適温度より低い温度に対し て耐性をもたない。遺伝学的修飾細胞が移植される予定である場合、移植ホスト の体温はオンコジーンの発現を誘導してはならない。 その他の可能な誘導系は、オンコジーンとステロイドホルモンレセプター間で 融合タンパク質を構築することである。これにより、融合パートナーのステロイ ド誘導機能をもたらすことが示された。そのような方法は、ｍｙｃおよびｐ５３ オンコジーンの両方について用いられ、誘導可能な形質転換が得られた(M．Eile rsら、Nature，340:66-68(1989); K．Roemerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA， 90:9253-56(1983))。遺伝学的修飾細胞が移植される予定である場合、移植ホス トの内在性ステロイドレベルによってオンコジーンの発現が誘導されてはならな い。さらに、ホストは、オンコジーン発現を誘導する可能性がある量のステロイ ドを摂取することを避けなければならない。このようなことを考慮すると、ステ ロイド誘導プロモーター系は、最良の系ではないかもしれない。 他の誘導プロモーターの例は、重金属によって誘導可能なメタロチオネインプ ロモーター(K.E．Mayoら、Cell，29:99-108(1982))、糖質コルチコイドによって 誘導可能なマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター（M．Beatoら、J．Ste roid Biochem.，27:9-14(1987)）、およびテトラサイクリンによって抑制される ＴＥＴプロモーター(R．Pesciniら、Biochem．& Biophy．Res．Communications, 202(3):1664-7(1994))である。残念なことにこれらの系は重大な問題を有する。 メタロチオネインプロモーターは、重金属の添加がないときの基礎発現が許容不 能なほど高レベルである。ＭＭＴＶプロモーターは糖質コルチコイドの添加のな いときの基礎発現は極めて低いが、誘導性は、標的細胞内の糖質コルチコイドの 十分なレベルの発現に依存する。糖質コルチコイドのインビボ内在性レベルがプ ロモーターを活性化し、オンコジーンの発現を惹起する可能性があるので、糖質 コルチコイドのインビボ内在性レベルは大きな問題である。さらに、ＭＭＴＶは レトロウイルスであるが、これを遺伝子伝達用のベクターにする試みは、効果的 なパッケージング細胞系を製造することの困難さによって妨げられてきた。本発 明では、ＴＥＴ系は、オンコジーンを抑圧するのに移植患者にテトラサイクリン またはその類似体を摂取させる必要があるという欠点を有する。 好ましい系は、ｌａｃリプレッサー−ｌａｃオペレータ誘導プロモーター系で ある。特に、ＤＮＡ結合タンパク質、すなわちｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ） およびｌａｃオペレータ（ｌａｃＯ）をベースとする大腸菌由来の誘導プロモー ター系は、ホ乳類細胞で機能することが示され、２つの成分からなる(M．Brown ら、Cell，49:603-12(1987))。第一の成分は、ｌａｃＯがそのＴＡＴＡボックス に隣接して導入されているプロモーターの制御下にある対象遺伝子からなる。こ の系の第二の成分はｌａｃＩ遺伝子である。同じ細胞内で発現されるとき、ｌａ ｃリプレッサータンパク質はｌａｃオペレータＤＮＡ配列に結合し、転写開始の 抑制タンパク質として、さらに転写終結因子として作用する。本発明では、対象 遺伝子はオンコジーンである。 上記で考察したように、本発明のベクターは２つの方法で構築され、標的細胞 の形質転換は１ベクター系または２ベクター系によってそれ相応に達成される。 以下では、レトロウイルスベクターのｌａｃリプレッサー−ｌａｃオペレータ誘 導プロモーター系を用い、他のリプレッサーまたはアクチベーター−プロモータ ー系に同様に利用できる１および２ベクター系を詳述する。 １ベクター系では、誘導プロモーターの制御下にあるオンコジーンおよびリプ レッサーまたはアクチベーター遺伝子を含むようにただ１つのベクターが構築さ れる。 ２ベクター系では、第一のベクターは、ｌａｃＯ配列がその中に導入されてい る誘導プロモーター（これは多数の優性オンコジーンを制御する）を含む。第二 のベクターはｌａｃＩ遺伝子を含む。各ベクターは異なる優性選別マーカーを含 み、両ベクターを核酸感染させた標的細胞の選別を可能にする。マーカーの例と して、抗生物質耐性表現型、例えばneo(G418耐性)、hygro(ヒグロマイシン耐性) 、またはgpt(ミコフェノール酸耐性)を導入するものがある。他の遺伝子産物マ ーカーおよびホスト株には次のものが含まれる。即ち、ｔｋ−細胞のチミジンキ ナーゼ活性、またはＨＰＲＴ−細胞のヒポキサンチンホスホリボシルトランスフ ェラーゼ（HPRT）活性である。そのような選別マーカーは、マーカー補完に適し たホスト細胞系と同様に研究者の間では広く入手可能である。リプレッサーまた はアクチベーター遺伝子の結合部位は、第一のベクターに、例えば該ベクターの ＬＴＲ内、またはオンコジーン発現を制御するプロモーター内に、細胞の核酸 感染または感染前に挿入される。例えば、レトロウイルスベクターのＬＴＲは大 腸菌ｌａｃリプレッサー結合部位を取り込むことができ、例えばｌａｃＩ遺伝子 を含む第二のベクターの核酸感染を介して、第１のベクターにより遺伝学的修飾 した細胞系にｌａｃＩ遺伝子を導入することができる。したがって、第一のベク ターは誘導可能な調節能力を有する。第一のベクターのオンコジーン発現は、遺 伝学的修飾初代細胞系へのｌａｃリプレッサー遺伝子の導入によってダウンレギ ュレーションを受け、これは細胞系が成熟細胞に分化するのを誘導するという目 標をもつ。第一および第二のベクターは、好ましくは感染性であるが複製不能の レトロウイルスベクターであり、核酸感染はこれらベクターの感染によって達成 される。 ２ベクター系として有用なベクターの例として、ｎｅｏ遺伝子およびオンコジ ーンを調節するそれらプロモーターーに挿入されたｌａｃＯを含むレトロウイル スベクター、例えばレトロウイルスベクターpLNSVoTPMPRLおよびpLoTPMPRRMLoが ある。第二のベクターは、ｌａｃＩ遺伝子およびｎｅｏ遺伝子とは異なる選別マ ーカーを発現しているレトロウイルスベクター、例えばベクターpLISVHygL で、 これはヒグロマイシンの優性選別マーカー(hyg)を発現する。図６はベクターpLI SVHygL の構築物を示す。pLISVHygL は、サンブルックらのMolecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Sambrookら編、(1989)）に記載されている当技 術分野で既知の方法を用いてｐＬＳＨＬのＢａｍＨＩ部位にｌａｃＩ遺伝子を挿 入することによって作製された。ｐＬＳＨＬはモロニーネズミ白血病ウイルスに 由来するベクターであり、サグデン博士(Dr．W．Sugden，McArdle Laboratory f or Cancer Research，University of Wisconsin、マジソン、ウィスコンシン、U SA)から提供された。ｌａｃＩ遺伝子はｐＭＴＬａｃＩ（J．Figgeら、Cell，52: 713-722(1988)）に含まれており、リビングストン博士(Dr．David Livingston, Dana Faber Cancer Institute，ボストン、マサチューセッツ、USA)から提供さ れた。連続的に誘導ベクターを導入し、その後でLISVHygLを導入することによっ て、培養液にＩＰＴＧを添加することによりオンコジーンを誘導できる細胞系を 得ることができる。 図５は、レトロウイルスベクターに取り込ませたｌａｃオペレータ（Ｏ）−ｌ ａｃリプレッサー（Ｉ）系を利用する２ベクター系の例を示す。ｌａｃＩ（Ｉ） は、５’末端長反復配列（ＬＴＲ）のｌａｃＯ配列に堅固に結合し、対象オンコ ジーン（Ｘ）の転写を妨げる。内部プロモーター（ＩＰ）から下流のｎｅｏ遺伝 子の転写は影響を受けない。転写は、ガラクトース類似体イソプロピルチオガラ クトピラノシド（ＩＰＴＧ）を細胞に添加することによって誘導することができ る。ＩＰＴＧはｌａｃＩに結合して構造的変化を引き起こし、ｌａｃＯ配列から 解離させることによって転写を開始させる。１ベクター系でも同じことが起こる が、リプレッサーは同じベクターによって発現され第二のベクターは使用されな いという点が異なる。 したがって、ヒトへの移植に適した細胞系を開発するために、ヒトの標的細胞 に第一のベクター、例えばLNSVoTPMPRL またはLoTPMPRRMLo をインビトロで感染 させることができる。標的細胞は、好ましくはヒト胎児細胞または前駆細胞であ る。オンコジーンは感染細胞内で発現され、細胞を分裂させ長期間のあいだイン ビトロで生存させる。所望の数の遺伝学的修飾細胞を得たとき、これら遺伝学的 修飾細胞にベクターpLISVHygL を核酸感染、好ましくは感染させる。続いて細胞 をヒグロマイシン、Ｇ４１８、およびＩＰＴＧを含む培養液中で選別する。Ｇ４ １８およびヒグロマイシンの両方に耐性を有するクローンを、ＩＰＴＧ（例えば 20ｍＭ ＩＰＴＧ）の存在下及び非存在下でのオンコジーンの発現について調べ る。オンコジーン発現は、当技術分野で既知の種々の技術によって調べることが できる。これらの技術には、免疫組織化学、ウェスタンブロット法、ノザンブロ ット法の他、腫瘍発生テスト、例えばヌードマウスでの腫瘍形成が含まれる。厳 密に調節可能なオンコジーン発現を示す細胞クローンを選別して、それらクロー ンの分化する能力について、例えばヌードマウスの腎皮膜下移植によって調べる （G．Beattieら、J．Clin．Endocr．Metab.，78:1232-40(1994)に記載された方 法を用いる）。所望の分化特性をもつ細胞を選別する。例えば、本方法は、ＩＤ ＤＭの移植治療に適した細胞系の製造に用いられる。この場合、標的細胞は好ま しくはヒト胎児膵臓細胞で、その環境でのブドウ糖レベルに応じて正常な生理学 的レベルのインスリンを安定的に発現する遺伝学的修飾細胞系を選別する。また 、ブドウ糖反応性インスリン産生特性を細胞に付与する種々の遺伝子をこれらの 細 胞に導入することが可能である。これらの遺伝子は、細胞の核酸感染または感染 に用いられるベクターの１つに挿入することができる。分化細胞をヒトのホスト に移植する場合、これらの細胞は、ヒトのホストの体内ではＩＰＴＧが存在しな いので、オンコジーンを発現しないであろう。 本発明のレトロウイルスベクターの他の例には次のものが含まれる： (1) ｌａｃオペレーターｌａｃリプレッサー系の制御下にある、レトロウイル スベクターに挿入されたｓｒｃ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、およびＭｙｂオンコジーンで ある。得られたベクター、好ましくはレトロウイルスベクターを用いて、例えば 造血幹細胞を形質転換させる。遺伝学的修飾し、オンコジーン抑圧した分化細胞 は、リンホカインもしくはサイトカインの製造に有用であり、さらに例えば免疫 細胞または免疫反応を欠失もしくは減少に患う患者、例えばエイズ患者への移植 に有用である。 (2) ｌａｃオペレーターｌａｃリプレッサー系の制御下にある、レトロウイル スベクターに挿入された優性のネガティブｐ５３変異遺伝子、ｍｅｔオンコジー ン、およびＢＣＬ２遺伝子である。得られたベクター、好ましくはレトロウイル スベクターを用いて、例えばヒトの肝実質細胞を形質転換させる。遺伝学的修飾 し、オンコジーン抑圧した分化細胞は、肝機能、例えば凝固因子の産生を維持す るのに有用であり、さらに肝機能不全に患う患者への移植に有用である。 (3) ｌａｃオペレーターｌａｃリプレッサー系の制御下にある、レトロウイル スベクターに挿入されたＣ−ｊｕｎおよびｋ−ｒａｓオンコジーンである。得ら れたベクター、好ましくはレトロウイルスベクターを用いて、例えばヒト胎児ニ ューロン培養を形質転換させる。遺伝学的修飾し、オンコジーン抑圧した分化細 胞は、火傷または事故のようなニューロン細胞の損傷を患う患者への移植に有用 である。 上記の３つの例では、例に挙げた３つのオンコジーンに代わって２つを含むレ トロウイルスベクターもまた用いることができることは明らかである。さらに、 上述のｌａｃリプレッサー−ｌａｃオペレータ誘導プロモーター系下のＳＶ40Ｔ およびＨ−ｒａｓを含むレトロウイルスベクターも、これらの例で述べたレトロ ウイルスベクターの代わりに用いることができる。さらに、１ベクター系もこの ２ベクター系の代わりに用いることができる。 オンコジーンは誘導可能である必要もなく、除去される必要もないことは特筆 されるべきである。さらに、ウイルスベクターが、永代化（または長期のインビ トロ増殖）をもたらすが腫瘍発生をもたらさないオンコジーンの組み合わせを含 み、さらに形質転換細胞が所望の分化遺伝子生成物を産生する場合は、上記のプ ロモーター−リプレッサー系は必要とされない。このことはまた、移植後に遺伝 学的修飾細胞が包含されたままで、さらにホストの体の他の部分に脱出しない場 合に当てはまる。例えば、遺伝学的修飾細胞を物理的マトリックスに収納して移 植することができる。この物理的マトリックスは、この遺伝学的修飾細胞とホス ト間のタンパク質、液体および栄養物の交換を可能にし、さらに細胞がホストの 体の他の部分へ脱出するのを許容しない。例えば、これらの細胞はアルギン酸塩 −ポリ（アミノ酸）膜中に被包化できる（P．Soon-Shiongら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，90:5843-5847(1993)）。 以下の実施例は、本発明の特徴のいくつかを例証するために提供され、本発明 の範囲を限定することを目的とするものではない。 実施例 材料と方法 特記しない限り、細胞は、10％ウシ胎児血清(FBS)を含むダルベッコ改変イー グル培地(Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM))で37℃、10％ＣＯ₂で成長さ せた。同様に特記しない限り、本明細書で用いられる実験室手法は、"Current P rotocols in Molecular Biology"(Ausubelら編、(1987)Wiley Interscience & G reene Publishing Assoc.刊)に記載されている標準的技術に基づき、かつクロー ニング方法は、"Molecular Cloning:A Laboratory Manual" （Sambrookら編、第 ２版、(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press刊）に従った。 ＳＶ−Ｔについての免疫組織化学(IHC)は、抗体SV40T-Ag(Ab-2)(Oncogene Sci ence製、マサチューセッツ、ニューヨーク、USA)、および先述した(W.N．Erber ら、Amer．J．Clin．Pathol．88:43-50(1987))ようにストレプトアビジン−ビオ チン共役免疫−アルカリ性ホスファターゼ技術を用いて実施した。Ｒａｓ^val12 −特異的ＥＬＩＳＡアッセイ（Oncogene Science）は製造元の指示にしたがっ て実施した。 サザンおよびノザンブロット分析は、"Molecular Cloning:A Laboratory Manu al" （Sambrookら編、第２版、(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press刊 ）にしたがって実施した。ＲＮアーゼ保護アッセイ(RPA)および逆転写ポリメラ ーゼ連鎖反応（RT-PCR）分析は、M.I．Mallyら、Ped．Res.，36:537-544(1994) の記載にしたがって実施した。 懸濁液中のヨウ化プロピジウム標識細胞のＤＮＡ成分分析はフローサイトメー タを用いて実施した。３オンコジーンレトロウイルスプラスミドの構築 レトロウイルスプラスミドpLNSVoTPMPRLおよびpLoTPMPRRNLoの各々は、ｌａｃ リプレッサー結合能をもつｌａｃＯ含有誘導プロモーターの制御下で、３つのオ ンコジーンを取り入れた。各オンコジーンの発現を最大限にするために、２つの 内部リボソーム進入配列を用いた。一方はｍｙｃ発現を仲介する配列であり、他 方はｒａｓ発現を仲介する配列である。pLoTPMPRRNLoでは、ＬＴＲは大腸菌ｌａ ｃリプレッサー結合部位を取り込み、これは形質転換細胞系にｌａｃＩ遺伝子を 導入することを可能にし、ベクターに誘導可能な調節能力を付与する。pLNSVoTP MPRLでは、ｌａｃリプレッサー結合部位は、ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ） に組み入れられる。このレトロウイルスベクターは、レトロウイルスＬＴＲの多 シストロン性転写物として、ＳＶ40 Ｔ抗原、ｍｙｃ遺伝子、およびＨ−ｒａｓ 含有ｖａｌ１２活性化変異を発現させる。これらのオンコジーンは、細胞の形質 転換におけるＴ抗原、Ｈ−ｒａｓ、およびｃ−ｍｙｃの協力作用と、上皮細胞を 形質転換させるそれらの能力のゆえに選択された(J.M．Bradburyら、Intl．J．C ancer，48:908-15(1991); C.J．Quaife ら、Cell，48:1023-34(1987);J.W．Peac ock ら、Oncogene，5:1769-74(1990);V.W．Merz ら、Mol．Endocrinol.，5:503- 13(1991); J．Bartek ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:3520-24(1991))。 Ｈ−ｒａｓとＳＶ40Ｔ抗原およびｍｙｃとの協力作用の性状がより明らかにされ ているので、Ｈ−ｒａｓは、Ｋ−ｒａｓが膵管の癌により共通に含まれるという 事実にもかかわらずＫ−ｒａｓに優先して選択された。上皮細胞の形質転換にお けるその関わり合いのためにいくつかのオンコジーンは望ましい選択であったろ うが、例えばＥＧＦレセプタ類のレセプタは、その大きなサイズのゆえに同じベ クターに他のオンコジーンを包含させることが一層困難となるので最初は選択さ れなかった。 図１は、このベクターの構築を模式的に表している。図１で用いられている略 語は以下のとおりである。 Ｔ７、Ｓｐ６、およびＴ３：バクテリオファージプロモーター。 ＰＯ：ポリオウイルス内部リボソーム進入配列。 ｍｙｃ：ｃ−ｍｙｃオンコジーン。 ｒａｓ：Ｈ−ｒａｓ（ｖａｌ１２）オンコジーン。 ＳＶＴ−Ａｇ：サルウイルス４０大型Ｔ抗原。 ＬＴＲ：末端長反復配列。 ＬＴＲｏ：ＬＴＲ含有ｌａｃＯ配列。 Ｎｅｏ^r：組換えｎｅｏ遺伝子。 ＳＶｏ：ＳＶ４０初期プロモーター含有ｌａｃＯ配列。 ＲＳＶ：ｎｅｏ遺伝子を制御するラウス肉腫ウイルス末端長反復配列。 さらに図１において、数字は塩基対におけるおよその長さを表している。Ｓｐ ｈＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、およびＫｐｎＩの種々の制限部位が表示されている 。 ベクター構築物中に用いられているオンコジーン成分は以下のとおりである。 サルウイルス40大型Ｔ抗原（ＳＶ40 Ｔ抗原）ｃＤＮＡはプラスミドｐＴＥＸ− ＸＨ（David Livingston博士より提供(Dana Faber Cancer Institute，ボストン 、マサチューセッツ、USA)から得た。ヒトｃ−ｍｙｃ（ｍｙｃ）ｃＤＮＡはプラ スミドｐＣＭＶ−ＨＭから得た。12位でグリシンからバリンへの変異を含むｖ− Ｈ−ｒａｓ（ｒａｓ）（また“Ｈ−ｒａｓ^val12”と称される）ｃＤＮＡは、プ ラスミドｐＣＭＶ−ｒａｓｖから得た。プラスミドｐＣＭＶ−ＨＭもｐＣＭＶ− ｒａｓｖもともにGeorge C．Prendergast 博士(Merck，Sharp and Dohme Resear ch Laboratories，Dept．of Cancer Research，ウエストポイント、ペンシルバ ニア、USA)から提供された。ポリオウイルス内部リボソーム進入配列（ＰＯ）は プラスミドｐＢＳ−ＰＯ（N.Sonenberg 博士(McGill University，ケベック、カ ナダ)から提供）から得た。このプラスミドはまた 750塩基対（ｂｐ）のＰＯフ ラグメントを含み、またPelletire らによって報告された（Mol．Cellular Biol .，8:1103-1112(1988)）。図１Ａに示すように縦並びでＰＯ−ｍｙｃ−ＰＯ−ｒ ａｓ（ＰＭＰＲ）となるようにクローニングベクターｐＧＥＭ−７ＺＦ（＋）(P romega，マジソン、ウィスコンシン、USA)に、ｃ−ｍｙｃ、ｖ−Ｈ−ｒａｓおよ びＰＯＤＮＡフラグメントを最初にサブクローニングした。 得られたベクターをｐＧＥＭ−ＰＭＰＲと名付けた。続いてＰＭＰＲフラグメ ントをｐＧＥＭ−ＰＭＰＲから取り出し、ｐＴＥＸ−ＸＨのＸｈｏＩ部位（ＳＶ 40 Ｔ抗原ｃＤＮＡの下流）にサブクローニングし、プラスミドｐＧ−ＴＰＭＰ Ｒを作製した（図１Ｂ）。２つの複製不完全モロニーネズミ白血病ウイルスをベ ースにしたベクタープラスミドpLNSVLacOCATL およびpLoCRNLo（これは対応する ｌａｃオペレータ配列修飾ＳＶ４０プロモーターおよびｌａｃリプレッサー結合 能をもつＬＴＲを含む）を出発親ベクターとして用いた。レトロウイルスベクタ ープラスミドpLoCRNLoは、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌ）をクロラムフェニカルア セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子（Ｃ）で置換し、さらに高親和性ｌ ａｃオペレータ配列（M．Brownら、Cell，49:603-612(1987)）を含むオリゴヌク レオチドを5'および3'側ＬＴＲ内のＳｓｔＩ部位（ＴＡＴＡボックスの直ぐ5'側 ）に挿入することによってpLLRNL(L．Xyら、Virol.，171:331-341(1989))から得 た。レトロウイルスベクターpLNSVoCLは、MoMLV-由来レトロウイルスベクターpL NLALおよびpSVLacOCatから得た（M．Brownら、Cell，49:603-612(1987)）。SVLa cOCat 配列をＫｐｎＩおよびＨｐａＩで切り出し、ＫｐｎＩ（これはｎｅｏ遺伝 子（Ｎ）の直ぐ3'側を切断する）およびＨｐａＩ（これは3'ＬＴＲの上流を切断 する）でpLNLAlを消化することによってpLNLALにクローニングした。pLoCRNLoお よびpLNSVoCLの構造は、ＴＰＭＰＲカセットに代わってＣＡＴ遺伝子が存在する という点を除いて図１に示した構造と同じである。第三のベクター、pLISVHygL( 5'ＬＴＲの制御下でｌａｃＩ遺伝子（Ｉ）を発現させ、さらにＳＶ４０初期プロ モーター（ＳＶ）の制御下でヒグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）を発現させる ）は、レトロウイルスベクタープラスミドpLSHL にｌａｃＩ遺伝子を挿入するこ とによって作製した。ＴＰＭＰＲフラグメントはｐＧ−ＴＰＭＰＲから取出し、 ＣＡＴ遺伝子の代わりにＮｏｔＩリンカーを用いてpLNSVoCatLおよびpLoCRNLoに サブクローニングした。サブクローニング工程の正確さは、個々のオンコジーン プローブを用いたpLNSVoTPNPRLおよびpLoTPMPRRNLoの制限地図の作製およびサザ ンブロット分析によって調べた。これらベクターの制限地図は、それぞれ図２お よび図３に示す。ｌａｃオペレータは、文献に開示された方法(J．Figgeら、Cel l 52:713-722(1988))にしたがってＳＶ４０プロモーターに挿入した。続いてｌ ａｃオペレータを含むＳＶ４０プロモーターをプラスミドpSVlacOCAT（上記J．F iggeらの論文で開示）から切り出し、図２に示すレトロウイルスに挿入した。ｌ ａｃオペレータがＬＴＲに挿入されたベクターを作製するために、ｌａｃＯ配列 （上記J．Figgeらの論文）およびＳｓｔＩ粘着末端を含むオリゴヌクレオチドを 当該ベクターの5'および3'ＬＴＲプロモーター内のＴＡＴＡボックスの近傍のＳ ｓｔＩ部位にクローニングした。クロラムフェニカルアセチルトランスフェラー ゼ遺伝子（“Ｃａｔ”）を当該ベクターから除去し、新しい親レトロウイルスベ クター、pLNSVoL およびpLoRNLo を得た（図１Ｃ）。 最後の３オンコジーンレトロウイルスベクター、pLNSVoTPMPRLおよびpLoTPMPR RNLoは、それぞれ親ベクターの各々のＮｏｔＩ部位にＴＰＭＰＲフラグメントを サブクローニングすることによって得た（図１Ｄ）。このサブクローニング工程 の正確さは、各工程後、多数の制限酵素でベクターを消化することにより調べた 。ｌａｃリプレッサー誘導可能遺伝子調節 誘導ＣＡＴ発現を仲介できるLNSVoCL およびLoCRNLo の能力をラット２０８Ｆ 細胞で調べた。細胞をこの２つのＣＡＴ発現ベクターの１つに感染させ、その後ｌａｃ リプレッサー発現ベクターpLISVHygL で感染させた。感染細胞をＧ４１８ とヒグロマイシンを含む培養液中で選別した。LNSVoCL 感染２０８Ｆクローンの ＣＡＴ活性をＩＰＴＧの存在下または非存在下で決定した。誘導能力の程度にお ける変動は顕著であったが、いくつかのクローンでは基準ＣＡＴ活性は極めて低 く、ＩＰＴＧが存在するときは存在しないときよりＣＡＴ活性が80〜 100倍増加 した。他のクローンは、おそらくｌａｃリプレッサー発現のレベルの低さまたは 極めて弱いＣＡＴ活性のために高い基準ＣＡＴ活性を示し、レトロウイルスベク ター由来のＣＡＴ発現が不安定であることを示した。同様な結果はLoCRNLo 感染 細胞についても認められた。この実験によって、レトロウイルスベクターでｌａ ｃ オペレーター修飾プロモーターを用いることの適切さが明らかになった。擬似型形成パッケージング細胞系 この実験は、感染性を有するが複製不全な組換えウイルスLNSVoTPMPRL および LoTPMPRRNLo を製造するためにＧ擬似型化ベクターを用いた。特記しない限り、 本明細書で用いられる方法は、バーンズらの記載した方法にしたがった（J.C．B urnsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90:8033-37(1993)）。Ｇ擬似型化ベクタ ーは、通常の両親和性ＭｏＭＬＶ由来レトロウイルスベクターに較べていくつか の利点を有する。通常のレトロウイルスベクターと異なり、Ｇ擬似型化レトロウ イルスベクターは超遠心によって 100〜1000倍に濃縮され、10⁹ＣＦＵ／ｍｌに 達する力価を得ることができる（J.C．Burnsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA， 90:8033-37(1993)）。さらにＧ擬似型化ベクターのホスト域が広がる。最後に、 本明細書で用いる２９３ＧＰ細胞(Viagene，Inc.，ラホイヤ、カリフォルニア、 USA)（J.C．Burnsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90:8033-37(1993)では293- gag-pol と記載されている）は、培養にｐＨＣＭＶ−Ｇ（J．Yeeら、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，91:9564-9568(1994)）を核酸感染させるまでレトロウイルス を全く産生しないという事実は、多数のオンコジーンを発現しているレトロウイ ルスベクターによってもたらされる生物学的汚染問題について有利である。10⁴ から10⁶ＣＦＵ／ｍｌのウイルス力価が本方法で得られた。 図４は、擬似型化レトロウイルスの作製を示す。水疱性口内炎ウイルスＧ（Ｖ ＳＶ−Ｇ）タンパクによるレトロウイルス擬似型の形成によってレトロウイルス ベクター産生細胞系を製造した（J.C．Burnsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA， 90:8033-37(1993)）。この方法では、レトロウイルスベクタープラスミドおよび プラスミドｐＨＣＭＶ−Ｇ（強力なＣＭＶプロモーターーから水疱性口内炎Ｇタ ンパクを発現）を、安定的にレトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現す る２９３ＧＰ細胞に同時核酸感染させた。２９３ＧＰ細胞系は、ヒト胎児腎細胞 系２９３(ATCC CRL 1573)から得た。レトロウイルスプラスミドおよびＶＳＶ− Ｇ発現プラスミド、ｐＨＣＭＶ−Ｇの導入に際して、２９３ＧＰ細胞は、ＶＳＶ −Ｇタンパク擬似型形成を介してレトロウイルスをパッケージする能力を獲得す る（J.C．Burnsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90:8033-37(1993)）。 この実験では、標準的なリン酸カルシウム沈澱工程を用いてｐＣＭＶ−Ｇを含 む２９３ＧＰ細胞にpLNSVoTPMPRLまたはpLoTPMPRRNLoを一時的に核酸感染させる ことによって、ＶＳＶ−Ｇ擬似型化レトロウイルスが産生された（J.C．Burnsら 、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90:8033-37(1993)）。同時核酸感染後２日目〜 ４日目まで毎日、産生されるウイルスを含む培養液を採集した。続いて同時核酸 感染を実施した各培養液をまとめ、これを用いて、８μｇ／ｍｌポリブレンの存 在下で新鮮な２９３ＧＰ細胞に感染させた。感染後２日して、Ｇ４１８を 400μ ｇ／ｍｌとなるよう培養液に加えた。Ｇ４１８は、細胞がｎｅｏ遺伝子を発現し なければその細胞を殺す抗生物質である。最初の感染から約10日後に、Ｇ４１８ 耐性細胞コロニーを単離しさらに成長させた。 これら２９３ＧＰコロニーのレトロウイルス力価は、２９３ＧＰクローンから 得た擬似型化レトロウイルスに感染させたハムスター乳児腎臓（ＢＨＫ）細胞（ ATCC CCL10と呼ばれるBHK-21(C-31)細胞）を用いてスクリーニングした。ＢＨＫ 細胞は、核酸感染および感染が容易なためにスクリーニング用に選ばれた。レト ロウイルス上清の添加後２日して、免疫組織化学染色を用いてＳＶ40 Ｔ抗原の 発現について感染ＢＨＫ細胞を分析した。このスクリーニングアッセイを３回繰 り返し、各２９３ＧＰクローンの感染性は陽性に染色された細胞のパーセントに よって概算した。クローニングした２つの産生細胞系（＃１０−２(レトロウイ ルスLNSVoTPMPRL)および＃４−１１(レトロウイルスLoTPMPRRNLo)）を感染ＢＨ Ｋ細胞における高レベルのＳＶ−Ｔタンパク質を基に選択した。２０８Ｆ細胞で 測定したときこれらのクローンの力価は５×10⁴〜９×10⁵ｐｆｕ／ｍｌの範囲で あった。初代ヒト線維芽細胞でのオンコジーン発現レトロウイルスの効果 レトロウイルスベクターは一般に高い変異率を有し、これらレトロウイルスベ クターは多数の複雑な遺伝子および重複ＰＯ配列コピーを含むので、ヒト胎児膵 臓細胞をレトロウイルスに感染させる前に、これらレトロウイルスをその力価に ついてスクリーニングするだけでなく形質転換能についてもまたテストすること が重要である。ＢＨＫ細胞の概算力価を基に、LNSVoTPMPRL から３つの２９３Ｇ ＰクローンとLoTPMPRRNLo から14個の２９３ＧＰクローンを選別した。 これらオンコジーン発現レトロウイルスベクターの形質転換能をテストするた めに、ヒト初代線維芽細胞系に由来するベージンガ細胞（Basinger cell，Dr．D ．Steinberg(カリフォルニア大学、サンディエゴ校、カリフォルニア、USA)より 提供、レヴィンらの論文(F．Levineら、Cell Transplant.，3:307-13(1994))に も記載）の７代継代細胞を16ウェルプレートに10⁵／ウェルで播種し、これら個 々のウイルスを別々に約 0.5の感染数(MOI)で４μｇ／ｍｌのポリブレンの存在 下で感染させた。２日後に、400μｇ／ｍｌのＧ４１８中に細胞を置き、感染細 胞を選別した。感染後７日で多数の感染巣に形態変化が出現し初めた。16日目ま でに、細胞は球形化し、核対細胞質比が増加し、核小体は透明になった。Ｇ４１ ８耐性細胞は正常な形態を維持せず、オンコジーン発現レトロウイルス感染によ って誘導される効果的な形態学的形質転換を示した。 オンコジーン含有レトロウイルスを含む細胞は多形性を獲得し、核対細胞質比 の増加を示し、別の細胞の上に重なって増殖した。対照的に、コントロールレト ロウイルスＬＺＲＮＬに感染した細胞では、非感染培養と異なる形態は全く示さ れなかった。ＬＺＲＮＬは、ｂ−ガラクトシダーゼをコードするレポーター遺伝 子ｌａｃＺを発現するモロニーネズミ白血病ウイルス由来ベクターである(L．Xu ら、Virology，171:331-341(1989))。さらに、ＳＶ40 Ｔ抗原のみを発現してい るベクターに感染させた細胞は形態的な違いを示さず、また調べた時間枠内では フォーカス形成も認められなかった。このことは、単一のオンコジーンは迅速で ポリクローン性の形質転換を生じるには充分ではないことを示している。興味深 いことには、同じオンコジーン（すなわちＳＶ−ＴおよびＨ−ｒａｓ^val12）を 発現しているけれども、産生クローン＃１０−２および＃４−１１から得られた レトロウイルス感染細胞間で相違が認められた。LoTPMPRRNLo(#4-11)感染細胞と 比較して、LNSVoTPMPRL(#10-2)感染細胞はより多形性で、これはおそらくプロモ ーターの相違によるものであろう。 一般に、形質転換細胞は血清の補充が少ない培養液中で成長することができる 。感染ベージンガ細胞は血清の少ない培養液中で成長を維持する。この実験では 、LNSVoTPMPRL(#10-2)またはLoTPMPRRNLo(#4-11)で感染させたベージンガ細胞の 成長速度を、10％または２％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ培養液中で測定した。２％ＦＢ Ｓ はコントロールＬＺＲＮＬ感染ベージンガ細胞の成長を顕著に遅延させた一方、 LNSVoTPMPRL(#10-2)またはLoTPMPRRNLo(#4-11)感染細胞の成長は２％ＦＢＳで顕 著な影響を受けなかった。分裂時間は約30時間であった。感染ベージンガ細胞は接触抑制を失った 感染ベージンガ細胞の形質転換の程度をさらに精査するために、感染細胞のイ ンビトロでのフォーカス形成能を求めた。これは、接触抑制（形質転換細胞で通 常失われる特性）の消失を測定するものである。Ｇ４１８で選別したあと、20,0 00個の細胞を10ｃｍのプレートに播種し、10％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで成長させ た。３週間後にプレートを５％ギムザで染色して細胞を可視化した。コントロー ル感染細胞はフォーカスを形成しない一方、オンコジーン感染細胞は多数のフォ ーカスを形成した。ＬＺＲＮＬ感染ベージンガ細胞と比較して、LNSVoTPMPRL(#1 0-2)感染細胞は、形態学的に不均質な細胞から成る極めて境界の明瞭なフォーカ スを形成する一方、＃４−２感染細胞は、より少数の形態学的に均質な細胞から なる境界の不明瞭なフォーカスを形成した。感染ベージンガ細胞は異数体ＤＮＡ含有量を含む 腫瘍誘発性形質転換（特にＳＶ−Ｔによる形質転換）はしばしば異数体をもた らす。ＤＮＡ含有量分析によって、ＬＺＲＮＬ感染ベージンガ細胞は２ｎの二倍 体ＤＮＡ含有量を有し、一方、LNSVoTPMPRL(#10-2)感染ベージンガ細胞は異数体 ＤＮＡ含有量を有する顕著な亜集団をもつことが示された。LoTPMPRRNLo(#4-11) 感染細胞は、LNSVoTPMPRL(#10-2)感染ベージンガ細胞よりも異数体細胞の割合は 低かった。感染ベージンガ細胞は永代化されない 感染ベージンガ細胞は多くの形質転換細胞の特性を有するが、それでも寿命に 限りがある。感染細胞は、培養で約２ヵ月（LNSVoTPMPRL(#10-2)感染）から４ヵ 月（LoTPMPRRNLo(#4-11)感染）成長後、老化した。永代化細胞を得るために通常 必要とされるような試みは、死滅危機の間、細胞を維持するのに行わなかった。感染ベージンガ細胞はヌードマウスで腫瘍を形成しない 腫瘍誘発アッセイは、３匹の６週齢ＮＩＨスイス同型接合無胸腺ヌードマウス を用いて実施した。これらのマウスは、チャールズリバー交配研究所(Charles River Breeding Laboratories，Charles River，メリーランド、USA)からＮＩＨ グラント被支給者リインバースメントプログラムによって入手した。マウスを準 無菌室内のマイクロアイソレータ飼育箱に入れた。２×10⁶細胞を大腿部外側の 皮下の合計６ヵ所の注射部位に先述のように注射した(A．Hayekら、Transplanta tion，49:224-225(1990))。２ヵ月後に動物を殺して腫瘍の進展を調べた。ヌー ドマウスの大腿部の皮下に注射したレトロウイルス感染ベージンガ細胞は腫瘍を 形成しなかった。 LoTPMPRRNLo またはLNSVoTPMPRL 感染の最も顕著な特徴は、オンコジーン発現 レトロウイルスベクター感染培養から生じた 100以上のコロニーの実質的に全て が形態学的変化を表しているということである。ここに提示するデータは、本発 明のベクターがこの目標を達成していることを示す。 以下のＴＲＭ−１及びＴＲＭ−６細胞系は、レトロウイルスクローン＃４−１ １由来であった。組換えレトロウイルスからのオンコジーンの発現 オンコジーン発現レトロウイルスの複雑性のゆえに、オンコジーンの発現を調 べることは重要である。これは、最初ＴＲＭ−１（LoTPMPRRNLo 産生クローン(# 4-11)に由来するレトロウイルスに感染させたヒト胎児膵臓から得た細胞系）を 用いて実施した。ＳＶ−Ｔ、ｍｙｃおよびｒａｓプローブを用いたノザンブロッ ティング分析は、ＳＶ−ＴおよびＨ−ｒａｓ^val12はレトロウイルス転写物で検 出されるがｍｙｃは検出されないことを示し、このことはｍｙｃがＴＰＭＰＲか ら欠落していることを示している。内在性ｍｙｃＲＮＡは検出されたが、これか ら、レトロウイルス転写物とのｍｙｃハイブリダイゼーションが認められないの はノザンブロットの技術的問題のためではないことが示唆される。全ＲＮＡ（各 々30ｍｇ）を標準的ノザンブロット分析工程並びにＳＶ−Ｔ、ｍｙｃおよびｒａ ｓのそれぞれに対応する³²Ｐ標識プローブとのハイブリダイゼーションに付した 。２８Ｓ ｒＲＮＡを非特異的ハイブリダイゼーションによって可視化する。 レトロウイルスｍｙｃの発現がないということをＴＲＭ−１ゲノムＤＮＡのサ ザンブロット分析によって調べた。ＴＲＭ−１（20ｍｇ）およびpLoTPMPRRNLo（ 20ｐｇ）をＮｏｔＩで完全に消化し、続いて標準的なサザンブロット分析工程に 付して³²Ｐ標識ＳＶ−Ｔプローブでハイブリダイズさせた。ＴＲＭ−１中のプロ ウイルスは本来のレトロウイルスプラスミドより短いことが分かった。この短縮 プロウイルスはまた、産生細胞系＃４−１１(LoTPMPRRNLo)および＃１０−２(LN SVoTPMPRL)にも見出され、産生細胞系で再構成(rearrangement)が生じることを 示唆している。種々の制限酵素並びにＳＶ−Ｔ、ｍｙｃ、ｒａｓおよびＰＯプロ ーブを用いたさらに徹底したサザンブロットを基に、＃４−１１およびＴＲＭ− １細胞の再構成プロウイルスの構造においてｍｙｃと１つのＰＯ配列が欠失して いることを確認した（図８）。したがって、再構成のメカニズムは、おそらくこ の２つのＰＯ配列間の組換え事象であったと考えられる。 再構成が残存するＳＶ−ＴおよびＨ−ｒａｓ^val12遺伝子の発現に影響を与え たかもしれない懸念から、これらの遺伝子のタンパク質生成物の存在を調べた。 ＩＨＣ分析によって、レトロウイルス産生株（＃４−１１および＃１０−２）並 びに対応する感染ベージンガ細胞で核ＳＶ−Ｔタンパク質が検出された。Ｈ−ｒ ａｓ^val12発現は、ｒａｓ^val12タンパク質に強い特異性をもつＥＬＩＳＡで分析 した。ｒａｓ^val12特異的ＥＬＩＳＡ（Oncogene Science）を製造元の指示にし たがって実施した。コントロール細胞溶解物は既知の変異（すなわちｖａｌ１２ 、ａｒｇ１２およびａｓｐ１２）をもつｒａｓタンパク質を含む、製造元から提 供された細胞から得た。ベージンガ初代ヒト線維芽細胞および２９３ＧＰレトロ ウイルスパッケージング細胞はまた陰性コントロールとして用いた。非感染ベー ジンガ細胞および２９３ＧＰ細胞と較べて、シグナルは＃１０−２および＃４− １１パッケージング細胞で数倍上昇した。 この実施例では、ＰＯ成分は再結合して介在するｍｙｃ遺伝子の欠落をもたら した。欠落を避けるために、互いに同種でない他の内部リボソーム進入配列（す なわち、脳心筋炎ウイルスのキャップ非依存翻訳エンハンサ(G.D．Parksら、J. Virol．60:376-384(1986);S.K．Jangら、J．Virol.，62:2636-2643(1988))を用 いるか、または、リボソームの走査翻訳再開始メカニズムによって下流の遺伝子 が翻訳されるようにコード配列が近傍に配置されている多シストロン性レトロウ イルスベクターを構築してもよい(F．Levineら、Gene，108:167-174(1991))。ＨＦＰの単離 初代ヒト線維芽細胞の感染結果によってＨＦＰから細胞系を単離する試みに期 待がもたれた。 膵臓から採集した上皮細胞には、通常膵臓の支持構造体を形成する基質細胞が 夾雑する。ウシ胎児血清で成長させると、ＨＦＰ上皮細胞は低い有糸分裂指数を もち（T．Otonkoskiら、Transplant．Proc.，26:3334(1994)）、出願人らの予備 実験ではレトロウイルス感染の効率が低いことが示唆された。上皮細胞と基質細 胞の混合培養に感染させるために両親和性レトロウイルスベクターを用いた実験 で、基質細胞は上皮細胞よりもはるかに高い効率で感染することが明らかになっ た。したがって、できるだけ上皮細胞に富む培養から出発することが重要であっ た。基質細胞に優先して上皮細胞を選別するいくつかの方法がある。その方法の １つは、ＨＦＰの上皮細胞における高レベルの内在性β−ガラクトシダーゼを基 にする(G．Beattieら、J．Clin．Endocr．Metab.，78:1232-40(1994))。親油性 の蛍光β−ガラクトシダーゼ基質を用いて、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞を蛍 光活性化細胞分類法によって分類することができる。しかしながら、この方法は 得られた細胞集団の純度に関しては理想的であるが、単一細胞懸濁物として分離 される細胞の大量の損失および残存細胞の生存度の低下をもたらす。別の方法は 、基質細胞と比較してＨＦＰ上皮細胞は高レベルのβ１インテグリンを発現する という発見に基づく(F．Levineら、Cell Transplant.，3:307-13(1994))。腸病 原性エルジニアによって産生されるタンパク質、インベーシンはβ１インテグリ ンに強固に結合し、細菌の上皮細胞内への進入を仲介する。したがって、上皮細 胞に富む小島様細胞集団（ＩＣＣ）を単離するために精製インベーシンタンパク 質を用いる(F．Levineら、Cell Transplant.，3:307-13(1994))。上皮細胞に富 むＩＣＣは、多くの基質細胞を含むＩＣＣよりも小さく、より半透明であり、形 態学的な識別を可能にする。比較的純粋な膵臓の上皮細胞集団を分離する能力に よって、極めてわずかの基質細胞を含む細胞集団のレトロウイルス感染が可能に なった。 本発明で、成長因子／分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）はヒト胎児膵臓（ＨＦＰ）の 上皮細胞に対して強力に有糸分裂を誘発することがわかった。８０４Ｇ細胞は膀 胱癌細胞系から得た。この系は、他のいずれの細胞外マトリックスの供給源より も膵臓上皮細胞の成長をより強く支持する細胞外マトリックスを産生することが わかった（M．Langhoferら、J．Cell．Sci.，05:753-64(1993)）。したがって、 この実施例では、上皮細胞は、８０４Ｇ細胞の細胞外マトリックスおよびＨＧＦ ／ＳＦ中で、10％ウシ胎児血清補充ＤＭＥＭで37℃、10％ＣＯ₂で先ず成長させ た。この成長条件で、上皮細胞は小島様細胞集団（ＩＣＣ）由来単層培養を形成 し、分裂時間は48時間であった。そのような高い％の有糸分裂活性をもつ細胞に よって、ウイルスＤＮＡの組込みを成功させるために、有糸分裂活性を有する細 胞を必要とするレトロウイルスベクターを用いるのは、より魅力が増す。レトロ ウイルス感染後、８０４Ｇ細胞由来細胞外マトリックスおよびＨＧＦ／ＳＦを含 まない10％ウシ胎児血清補充ＤＭＥＭ中で37℃、10％ＣＯ₂でこの上皮細胞を成 長させた。ＨＧＦ／ＳＦの使用は、基質細胞より上皮細胞を選別するという他の 利点を提供する。基質細胞は成長因子ＨＧＦを産生する。基質細胞はＨＧＦ／Ｓ Ｆレセプター、ｃ−ｍｅｔ原始オンコジーンを発現せず、その結果ＨＧＦ／ＳＦ に反応しない。したがって、ＨＧＦ／ＳＦ処理は上皮細胞の選択的成長をもたら すが、また上皮細胞の有糸分裂指数を上昇させる。以下の方法はＨＧＦ／ＳＦ手 法を用いた。 簡単に記せば、これらの実験で用いられたヒト胎児膵臓は、International In stitute for the Advancement of Medicine(エキストン、ペンシルバニア、USA) およびAdvanced Bioscience Resources(オークランド、カリフォルニア、USA)か ら、説明後同意を得て入手した。膵臓は、頸管拡張牽出術によって妊娠終了後に 得た。組織の消化と培養は文献の記載にしたがって実施した(G．Beattieら、J． Clin．Endocr．Metab.，78:1232-40(1994); T．Otonkoski ら、Diabetes，43:94 7-953(1994);A．Hayek ら、Ped．Res.，37:62A(1995))。細胞系は、特記しない 限り、10％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０で37℃、５％ＣＯ₂で成長させた 。細胞はコンフルエンスしたときに１：10の希釈で継代した。 より詳細には、18週または24週の新しいヒト胎児膵臓（ＨＦＰ）を用いた。Ｈ ＦＰから異質な組織を取り除いた後、27ゲージの注射針でＨＢＳＳ(ハンクス緩 衝塩類溶液、Sigma Chemical Company，セントルイス、ミズーリ、USA)を組織に ふりかけた。膨満後、組織をいくつかの細片に切断し、続いて３ｍｇ／ｍｌのコ ラゲナーゼＰ（ベーリンガーマンハイム、インジアナポリス、インジアナ）を含 むＨＢＳＳ中で20分消化した。ＨＢＳＳで洗浄後、インスリン含有細胞の選択的 識別のために調製物をジチゾン(DTZ; Sigma Chemical Company，セントルイス、 ミズーリ、USA)で染色した(Z.A．Latifら、Transplantation，45:827-830(1988) )。この染色を用いて、立体顕微鏡下で直接見ながら 200〜 500の胎児ＩＣＣを 取り出した。新鮮な調製物でのインスリン含有量／ＤＮＡ（小島対ＩＣＣ）は因 数として５の差で異なり、ＤＴＺ陽性細胞集団は極めてβ細胞に富むことを示し た。 基質細胞数を最小にするために注意深く選別したジチゾン陽性ＩＣＣの単層培 養を、ＨＧＦ／ＳＦの存在下でＭＯＩ 0.5でLoTPMPRRNLo またはLNSVoTPMPRL に 感染させた。感染後３日して、ＳＶ40 Ｔ抗原の存在について培地を染色し、顕 著な数の細胞が感染していることが明らかになった。感染後約１週間で形態変化 （より小型でより立体化）をもつ細胞のフォーカスが認められるようになった。 これらのフォーカスは大きさが増し、感染細胞のクローンを示唆した。これはＳ Ｖ40Ｔ抗原染色で確認された。形態変化を有する細胞群をサブクローニングして 細胞系を増加させた。しかしながら、細胞が多数の空胞を生じ（これは細胞質全 体を徐々に満たしていった）、増殖の停止と細胞死をもたらしたため、最初の試 みは成功しなかった。これらの細胞の電子顕微鏡分析によって、この空胞は脂質 含有構造と一致する形態を有することが明らかになった。 継代培養では細胞系を増加させることができないことを考慮して、約６個のＩ ＣＣを含む大量の感染単層培養を一緒に培養し、一切継代培養することなく該ウ イルスに感染させた。感染後22日で、LoTPMPRRNLo(レトロウイルスクローン#4-1 1)を感染させた培養において、優勢な細胞型、名付けてＴＲＭ−１（ＳＶ40Ｔ抗 原のＴ、ＲａｓのＲ、およびＭｙｃのＭから、このように呼ぶ）が過剰増殖した 。ＴＲＭ−１は18週の胎児の膵臓に由来する。ＴＲＭ−１に由来するいくつかの クローンは、ＨＦＰ由来の初代上皮細胞により厳密に類似する形態を有する。ＴＲＭ−１の性状決定 上皮性マーカー 基質細胞はインスリンを分泌しないが、上皮細胞は分泌する。ＨＦＰから完全 に純粋な上皮細胞培養を得ることは不可能であるので、ＴＲＭ−１の性状を調べ る場合の第一の重要な疑問は、それがＨＦＰの上皮細胞または基質細胞から由来 しているのかどうかを決定することである。ＴＲＭ−１を18週の胎児の膵臓から 得た。発達のこの段階では、膵臓細胞の３％のみがインスリンを発現する（ベア ッティら(G．Beattieら、J．Clin．Endocr．Metab.，78:1232-40(1994))の記載 したインスリン発現細胞検出方法を用いた場合）。 ＴＲＭ−１は、ＥＰ４抗原（ラッツァら(U．Latzaら、J．Clin．Pathol.，43: 213-19(1990))の記載した方法で決定）、ＥＰ−ＣＡＭ抗原（リトビノフら(S.V ．Litvinovら、J．Cell Biol.，125:437-46(1994))の記載した方法で決定）、お よびＨＧＦ／ＳＦレセプタｍｅｔ遺伝子発現（ツァルファティら(I．Tsarfatyら 、Science，257:1258-61(1992))の記載した方法で決定）について陽性で、これ らは、ＴＲＭ−１を上皮細胞と特定させることができる特性である。さらにＴＲ Ｍ−１はサイトケラチンを発現するが、これは上皮細胞でのみ見出される。上皮 細胞付随糖タンパク質ＥＰ４はＴＲＭ−１で強く発現される(S.V．Litvinovら、 J．Cell Biol.，125:437-46(1994))。Ｅ−カドヘリン（E-cadherin）およびＮ− ＣＡＭ（これらは膵臓小島細胞で発現されることが分かっている(G.D．Rouiller ら、Exp．Cell．Res.，191:305-312(1990); D.G．Rouiller ら、Dev.，148:233- 242(1991))）はまたＴＲＭ−１に存在するが、低レベルである。ＴＲＭ−１のイ ンテグリン発現パターンはＨＦＰ初代上皮細胞のそれと同じであるが、個々のイ ンテグリンの発現レベルには量的な違いが存在する。表１はＴＲＭ−１によって 発現される遺伝子のいくつかをまとめた。 表１の細胞で認められる遺伝子の発現は多くの異なる技術で測定された。ＲＰ ＡはＲＮアーゼ保護アッセイを示す。Ｈｉｓｔとは組織化学的検出を示す。ＦＡ ＣＳはフローサイトメトリーを意味する。ＩＨＣは免疫組織化学的検出を意味す る。ＲＩＡは放射能免疫アッセイを示す。ＲＴ−ＰＣＲは逆転写とそれに続くポ リメラーゼ連鎖反応を示す。β−ｇａｌはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を表す。 （上皮）は上皮細胞を表す。ＮＤは“実施せず”を表す。 ＴＲＭ−１のＲＮアーゼ保護アッセイでは全細胞ＲＮＡを用いた。陽性コント ロールは次の組織の全細胞ＲＮＡであった。即ち、胎児膵臓細胞単層培養、ＩＣ Ｃ、妊娠22〜24週ヒト胎児全膵臓組織、副腎である。ＲＮＡは、以下の対応する プローブと別々にハイブリダイズさせた。即ち、グルカゴン、インスリン、ソマ トスタチン、ＩＰＦ−１／ＳＴＦ１、ｃ−ｍｅｔ、ＨＧＦ／ＳＦおよびＴＨであ る。シクロフィリン発現は、内部コントロールとして供される同じサンプルで測 定した。低レベルのｍＲＮＡを検出するために異なる量のＲＮＡを用いた。ネガ ティブコントロールとして酵母のｔＲＮＡを全アッセイで平行して流したところ 、常に陰性であった。ＴＲＭ−１のＲＴ−ＰＣＲでは、次のものから得たＲＮＡ の陽性コントロールを用いた。即ち、ＩＣＣおよび妊娠18週ヒト胎児膵臓組織で ある。グルコキナーゼおよびｇｌｕ−２のためのプライマー（これはイントロン にまたがる）は、ＲＮＡサンプル中の夾雑ＤＮＡから生じる増幅生成物を識別す るために用いた。 単層培養の免疫組織化学およびβ−ガラクトシダーゼ組織化学染色は、W.N．E rberら、Amer．J．Clin．Pathol.，88:43-50(1987);G．Beattie ら、J．Clin．E ndocr．Metab.，78:1232-1240(1994)の記載にしたがって実施した。一次抗体は 以下のとおりである。即ち、ＳＶ40 Ｔ抗原（Ａｂ−２）；多クローン性モルモ ット抗ブタインスリン、ウサギ抗グルカゴン（Chemicon，エルセガンド、カリフ ォルニア、USA）;ウサギ抗ヒトソマトスタチンである。正常ウサギまたはマウス 血清をコントロールとして用いた。 フローサイトメトリーは以下のように実施した。サブコンフルエント（subcon fluent）のＴＲＭ−１単層細胞を非酵素性解離媒体(Sigma Immunochemicals，セ ントルイス、ミズーリ、USA)によって解離して遊離細胞懸濁物とし、ＨＢＳＳ（ ３％ＦＣＳ、0.1％ナトリウムアジドおよび0.2 ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、さ らにＥ−カドヘリン（クローンＤＥＣＭＡ−１）、ＮＣＡＭ（クローンＥＲＩＣ −１）またはＥＧＰ４０（ｍＡｂ３２３Ａ３）のいずれかに対して特異的な一次 抗体（10⁶細胞につき10ｍｇの濃度で使用）と先ず４℃で60分インキュベートし た。充分に洗浄した後、サンプルを適切なＦＩＴＣ−Ｆ（ａｂ’）２二次抗体と インキュベートした。サイトケラチン−７について分析するサンプルは、最初に 70％エタノール中で４℃で一晩インキュベートして固定し、透過性を付与した。 ＨＢＳＳ（３％ＦＣＳ、0.1％ナトリウムアジドおよび0.2 ｍＭ ＥＤＴＡ）で 洗浄し、さらにＦＩＴＣ共役抗サイトケラチン−７ｍＡｂ（クローンＬＤＳ−６ ８）またはＦＩＴＣ共役コントロールＩｇＧ１マウスアイソタイプのいずれかと インキュベートした。充分に洗浄した後、サンプルをＦＡＣＳｃａｎフローサイ トメトリー(Becton Dickinson,マウンテンビュー、カリフォルニア、USA)で調べ た。 サイトケラチンおよびインスリンのための二重免疫蛍光では、サブコンフルエ ントのＴＲＭ−１単層細胞をＰＢＳで洗浄し、新しく調製した４％ホルムアルデ ヒド（パラホルムアルデヒドから）で４℃で20分固定し、さらに 0.1％サポニン 中で室温で10分透過性にした。続いてＰＢＳ中の50ｍＭグリシンでインキュベー トし、ホルムアルデヒド固定によって生じた反応基を飽和させた。非特異的結合 は、２％正常ロバ血清(Jackson Immunoresearch Lab．Inc.，ウエストグローブ 、ペンシルバニア、USA)および１％ＢＳＡ(分画Ｖ、Sigma Immuno Chemicals， セントルイス、ミズーリ、USA)を含むＰＢＳ中で室温で１時間インキュベートし てブロックした。ＰＢＳ（0.2％ＤＳ、0.1％ＢＳＡ）中で充分に洗浄した後、単 層細胞を次の一次抗体の混合物と室温で１時間インキュベートした。即ち、ヒツ ジ抗ヒトインスリン多クローン性抗血清（The Binding Site，バーミンガム、イ ギリス）；マウス抗パンサイトケラチン（C9687，Sigma）である。別々のサンプ ルとして、正常なヒツジおよびマウスのＩｇＧの混合物を一次抗体の特異性につ いてのコントロール用参照として用いた。ＰＢＳ（0.2％ＤＳ、0.1％ＢＳＡ）で 数回洗浄した後、細胞の単層培養を二次抗体カクテル（Jackson Immunoresearch Lab．Inc.）と室温で１時間インキュベートした。このカクテルは以下を含む。 即ち、リサミンローダミン（ＬＲＳＣ）共役−親和性精製ロバ抗ヒツジＩｇＧ（ Ｈ＋Ｌ）（ニワトリ、モルモット、ハムスター、ウマ、ヒト、マウス、ウサギお よびラット血清タンパク質で予め吸収；Jackson Immunoresearch Lab．Inc.）； フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役−親和性精製ロバ抗マウス ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ウシ、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、ヒ ト、ウサギ、ラットおよびヒツジ血清タンパク質で予め吸収）である。それぞれ ５分間６回ＰＢＳ（0.2％ＤＳ、0.1％ＢＳＡ）で洗浄した後、色褪せ抑制液（Mo lecular Probes，ユージーン、オレゴン）中でサンプルをマウントし、レーザー 走査共焦点用アタッチメント(MRC-1000，Bio-Rad Laboratories，ケンブリッジ 、マサチューセッツ、USA)を備えたツァイスアクシオバート(Zeiss Axiovert)３ ５Ｍ顕微鏡で40Ｘ 1.3ＮＡ対物レンズを用いて調べた。各マーカーに対応する蛍 光画像は、アルゴン／クリプトン混合ガスレーザーを用いることによって集めた 。カラー画像はTektoronix Phaser II-SDXにプリントした。 培養液中に遊離されるインスリンおよびグルカゴンレベルおよび超音波破壊細 胞の酸エタノール抽出物の対応するホルモン含有量を、T．OtonKosKiら、J．Cli n．Invest．92:1459-1466(1993)に記載されたように放射能免疫アッセイ（ＲＩ Ａ）で測定した。 形態が平たんであるという点で形態学的に初代ＨＦＰ上皮細胞とより厳密に類 似するＴＲＭ−１のサブクローンを単離したところ、核／細胞質比が減少し、さ らに初代ＨＦＰ上皮細胞で認められるものより強い核周囲の顆粒形成を示す。興 味深いことに、最初は形態のみを基準に選別したこれらのクローンで、ＥＰ−Ｃ ＡＭおよびＥ−カドヘリンの両方の発現もまた増加していることがＦＡＣＳによ って明らかになった。内分泌前駆体マーカー β−ガラクトシダーゼはＴＲＭ−１で高レベルで発現される（図３１ ＰＮＡ Ｓ）。この酵素は、高レベルでＨＦＰ上皮細胞（特に内分泌前駆体）でのみ発現 され、基質細胞または成人の上皮細胞では発現されない（G．Beattieら、J．Cli n．Endocr．Metab.，78:1232-40(1994))。このデータは、ＴＲＭ−１はＨＦＰの 上皮細胞に由来することを示している。チロシンヒドロキシラーゼ（これは少な くともいくつかのβ細胞前駆体で発現され、さらに高レベルのβ−ガラクトシダ ーゼを発現する上皮細胞のサブセットに限定されている）は、ＴＲＭ−１では抗 ＴＨ抗体を用いるＩＨＣによって(G．Beattieら、J．Clin．Endocr．Metab.，78 :1232-40(1994))、またはＲＰＡによって検出されなかった。ブドウ糖輸送、センシングおよび小島細胞抗原 ＧＬＵＴ−２はＴＲＭ−１でＲＴ−ＰＣＲによって検出されるが、グルコキナ ーゼは検出されない。ＲＰＡおよびＩＨＣによればＴＲＭ−１細胞はグルタミン 酸デカルボキシラーゼを発現しないが(J.S．Petersenら、Diabetes，42:484-495 (1993))、ＲＰＡではＩＣＡ６９は検出される（M．Pietropaoloら、J．Clin．In vest.，92:359-371(1993)）。ＴＲＭ−１の形質転換の状態および成長の特徴 ＴＲＭ−１細胞はインビトロでよく成長し、分裂時間は約36時間である。それ らはコントロールの線維芽細胞と比較して少ない血清（２％ＦＣＳ補充ＤＭＥＭ ）中でよく成長する。ＨＦＰの初代上皮細胞と異なり、ＴＲＭ−１は、インビト ロ成長のために外来性細胞外８０４ＧマトリックスまたはＨＧＦ／ＳＦを必要と しない。しかしながら、ＴＲＭ−１は、ＨＧＦ／ＳＦのレセプタであるｍｅｔ原 始オンコジーンの発現を保持している。 しかしながら、約 150回の細胞分裂、45継代、または10ヵ月以上の培養後、細 胞増殖の鈍化が認められた。これから、これらの細胞は寿命が延長されたことが 示唆される。初代ＩＣＣと同様に、ＴＲＭ−１細胞は、浮遊培養として成長して ＩＣＣ再集合初代ＨＦＰ上皮細胞と極めて類似する構造を形成することができる 。 さらにＴＲＭ−１の腫瘍形成性を調べるために、６週齢のＮＩＨスイス同型接 合無胸腺ヌードマウスを、チャールズリバー交配研究所(Charles River，マサチ ューセッツ、USA)からＮＩＨグラント被支給者リインバースメントプログラムに よって入手した。このマウスを準無菌室のマイクロアイソレータ飼育箱に収容し た。10代継代した５×10⁵のＴＲＭ−１細胞をA．Hayekら、Transplantation，49 : 224-225(1990)の記載にしたがって腎皮膜下に移植した。２ヵ月後にマウスを 殺し、腫瘍の発達を調べた。結果は、３匹のマウスの全てにおいて腎被膜下腫瘍 とともに腹腔内の転移と腹水の誘発を示した。しかしながら、皮下注射の後では 腫瘍の形成は検出されなかった。ＴＲＭ−１はクローン由来で、培養中に核型変化を生じる 初めに感染させた培養では多数のフォーカスが認められたので、ＴＲＭ−１が １つ以上の感染初代細胞に由来しているのかどうかを知ることが重要である。Ｓ Ｖ40 Ｔ抗原遺伝子プローブによるサザンブロットを、20継代で単離したＥｃｏ ＲＩ消化ＴＲＭ−１ ＤＮＡで行ったところ、ただ１本のバンドを示した。ＴＲ Ｍ−１にはただ１つのＥｃｏＲＩ部位が存在するので（図８）、単一バンドの存 在は、ＴＲＭ−１にはただ１つのレトロウイルス組込み部位が存在することを証 明している。レトロウイルスはゲノムに任意に組込まれるので、ただ１つの組込 み部位は、ＴＲＭ−１はクローン由来であることを示唆している。感染初代培養 には最初、多数の別個の細胞フォーカスが存在していたので、培養中にＴＲＭ− １が増殖選別を受け、より成長の遅いクローンは消失した可能性がある。 ＴＲＭ−１がインビトロで変化を受けた可能性を調べるために、ヨウ化プロピ ジウム標識細胞を用いてフローサイトメトリー分析によってＤＮＡ含有量分析を 行った。10継代で、ＴＲＭ−１は二倍体ＤＮＡ含有量を有していた。しかしなが ら、25継代で実施した核型分析によって２つの細胞集団が明らかになった。両者 共に異数体であるが、１つは二倍体に近い核型をもち、他方は四倍体に近い核型 をもつ。多くの末端融合、１４ｐ＋、Ｘｑ＋および１７ｑ＋が認められ、これら は最も普遍的な異常である。ＴＲＭ−１のオンコジーン発現 レトロウイルスによって導入されたＳＶ−ＴおよびＨ−ｒａｓ^val12ラスオン コジーンの発現をＴＲＭ−１で調べた。免疫組織学的染色によって、ＳＶ−Ｔは ＴＲＭ−１で発現されることが分かった。ｒａｓ^val12タンパク質に対して極め て特異的なＥＬＩＳＡでＨ−ｒａｓ^val12の発現を調べたところ、ＴＲＭ−１は Ｈ−ｒａｓ^val12を発現していることが分かった。ＴＲＭ−１のインスリン産生 ＴＲＭ−１についての第二の重要な疑問は、ＴＲＭ−１が、ブドウ糖に応じて インスリンを分泌することができる細胞に分化する能力を保持しているかどうか ということである。効果的な分化を達成するためには、ＴＲＭ−１でのオンコジ ーンの転写がダウンレギュレーションを受ける必要があると考えられる。インス リン産生細胞への分化を誘発することが示された薬剤であるニコチンアミド(T. Otonkoskiら、J．Clin．Invest.，92: 1459-66(1993))で処理したＴＲＭ−１細 胞を用いて予備実験を実施した。ＩＣＣは、単層培養として成長した細胞よりも ニコチンアミドに対してより良好に反応するので、ＴＲＭ−１細胞は浮遊培養と して成長させた。この方法で成長させたとき、細胞は再集合してＩＣＣに極めて 類似する球形構造を形成する。このように成長させた細胞をニコチンアミドで種 々の時間処理し、非常に感度のよい放射能免疫アッセイを用いてインスリン産生 について調べた（G．Beattieら、J．Clin．Endocr．Metab.，78:1232-40(1994) ）。結果は下記の表２に示す（表の“Ｎｉｃ”はニコチンアミドを表す）。 インスリン測定値はμＵインスリン／48時間／ｍｌ培養液として表す。 ＴＲＭ−１の単層培養および浮遊培養は、ニコチンアミド非存在下では検出可 能レベルのインスリンを産生しなかった。ニコチンアミド存在下の浮遊培養は、 ニコチンアミド暴露後11日で少量のインスリンを発現した。ＴＲＭ−１のインス リン産生レベルは、約 100倍のインスリンを分泌する正常なＩＣＣと比較して低 いが、バックグラウンドを明らかに越える明瞭なシグナルが存在した。この結果 は、ＴＲＭ−１細胞はインスリン産生細胞に分化する能力を有することを示して いる。 低レベルのインスリンｍＲＮＡがＲＰＡによって検出できた。低レベルのイン スリンが全ての細胞で発現しているのか、またはＴＲＭ−１細胞はインスリン産 生に関して不均質であるのかを決定するために、インスリン免疫組織化学的分析 を実施したところ、ほとんどの細胞がインスリン陰性で、ごくわずかの細胞だけ が高レベルのインスリンを発現していた。インスリン産生は、胎児β細胞につい ての既知のインスリン分泌促進物質であるブドウ糖またはテオフィリンによる処 理では刺激されなかった(R.D.G．Milnerら、J．Endocrinol．51:323-332(1971)) 。グルカゴンｍＲＮＡもソマトスタチンｍＲＮＡもＲＰＡでは検出されなかった が、ＴＲＭ−１腫瘍切片の免疫染色によって、ごくわずかの細胞だけがグルカゴ ン陽性であることが示された。ＴＲＭ−１はβ細胞特異的転写因子ＩＰＦ１／ＳＴＦ−１を発現しない 予備実験では、ＴＲＭ−１細胞は検出可能な量のＩＰＦ１／ＳＴＦ−１を産生 しないことが示唆された。ＩＰＦ１／ＳＴＦ−１は、相同ドメイン(homeodomai n)含有転写因子であるが、これは、インスリンの遺伝子転写の制御に重要である とともに、膵臓の形態発生に役割を果たすであろう(B．Peersら、Mol．Endocrin ol.，8:1798-1806(1994); J．Jonsson ら、Nature，371:606-609(1994); H．Ohl sson ら、EMBO J.，12:4251-4259(1993))。ＩＰＦ１／ＳＴＦ−１のアミノおよ びカルボキシ末端に対する多クローン性ウサギ抗血清を用いたウェスタンブロッ ト分析により、ＴＲＭ−１にはＩＰＦ１／ＳＴＦ−１が存在しないことが示され た。プローブとしてヒトＩＰＦ１／ＳＴＦ−１ｃＤＮＡを用いたＲＰＡによって 、ＨＦＰにはＩＰＦ１／ＳＴＦ−１ｍＲＮＡが存在するが、ＴＲＭ−１にはＩＰ Ｆ１／ＳＴＦ−１ｍＲＮＡは検出できないことが分かった。必要な場合には、転 写因子候補物質（例えばＳＴＦ−１）またはｌａｃリプレッサーでＴＲＭ−１細 胞を処理することによって、この細胞の分化を誘発することができるであろう。 また、細胞をファルネシルトランスフェラーゼ抑制因子で処理して、ｒａｓ活性 を抑制し、それによって細胞増殖を抑制してもよい。ＴＲＭ−１細胞はまた、転 写因子候補物質またはｌａｃリプレッサー遺伝子を含むレトロウイルスベクター に感染させて、そのような遺伝子をＴＲＭ−１細胞に導入してもよい。当技術分 野で既知の他の方法もまた用いることができる。 要約すれば、ＴＲＭ−１細胞は10ヵ月以上培養で維持された。感染ベージンガ 細胞と対照的に、ＴＲＭ−１細胞はヌードマウスの腎被膜下で腫瘍を形成し、特 定の形質転換特性を決定するうえで細胞の型が果たす役割を明らかにした。これ らの細胞系は、低レベルのホルモン産生を含むいくつかの分化した性状を保持し ている。ｌａｃＩ遺伝子を細胞に導入することによって、オンコジーンの発現お よび更なる分化の停止が可能になる。この多くの用途をもつレトロウイルスベク ター系の高い形質転換効率と誘導可能な潜在的調節能力は、条件に応じて分化さ せることが可能なヒト細胞系の増大を促進させるであろう。２つのオンコジーン をもつプラスミド（例えば図８に示したようなもの）もまた、同様な細胞系を作 製するために用いることができる。ＴＲＭ−６細胞系の性状 上記のレトロウイルス感染実験で、５つの別個の細胞系が、感染後２〜３週間 以内に増殖を開始した６個の別々の培養から得られた。これらの細胞系は比較的 容易に単離されたという事実から、ヒト初代細胞から細胞系を得るために多数の 優性オンコジーンの同時導入を用いるこの方法の有効性が実証され、選択された オンコジーンが初代ＨＦＰ細胞の増殖を促進することができることが確認された 。ＴＲＭ−１の他の別の派生細胞系はＴＲＭ−６である。ＴＲＭ−６は新鮮な24 週のＨＦＰから得られた。ＴＲＭ−６細胞のインスリン発現は、それらを４％パ ラホルムアルデヒドで固定して免疫アルカリ性ホスファターゼ法とモルモット抗 ブタインスリン抗体を用いて染色することにより調べた。赤染はインスリン陽性 細胞を示す。図７は、初期の継代培養におけるインスリン陽性ＴＲＭ−６細胞集 団を示す。陽性細胞集団は多くのインスリン陰性細胞に取り囲まれている。 ＴＲＭ−６のインスリン陽性細胞は稀（＜１％）であるが、それらは常に２個 から８個の細胞の小集団として認められた（図７）。このことは、ＴＲＭ−６は 高レベルのインスリンを発現している細胞の安定した亜集団を含む可能性を示唆 している。 希釈によってＴＲＭ−６細胞をサブクローニングした。この方法で、いくつか のウェルは高い％のインスリン陽性細胞を含むことが示された。しかしながら、 選別されたインスリン陽性クローンは数カ月にわたる単離工程で陰性になり、イ ンスリン発現は、おそらく分化に対して安定ではないことが示唆される。オンコ ジーンのダウンレギュレーションまたはサプレッションは、細胞が分化してイン スリンを安定的に発現することを可能にするであろうと考えられる。ダウンレギ ュレーションまたはサプレッションはｌａｃリプレッサー遺伝子を細胞に導入す ることによって（例えばｌａｃＩ遺伝子を含む第二のレトロウイルスベクターを 細胞に感染させることによって）達成できる。 また別の実験で上記に述べた方法と同様な方法を用いて、本実施例に開示した 組換えレトロウイルスは、８０４細胞から得た細胞外マトリックスと10％ウシ胎 児血清添加ＤＭＥＭ中のＨＧＦ／ＳＦで37℃、10％ＣＯ₂下で成長させた成人の 膵臓細胞を形質転換することができた。８０４Ｇ細胞の細胞外マトリックスおよ びＨＧＦ／ＳＦは細胞の感染を強化し、マトリックスとＨＧＦ／ＳＦは成人細胞 の有糸分裂指数を増加させるように考えられる。得られた細胞系はブドウ糖に反 応してインスリンを産生した。これらの細胞系は数回の細胞サイクルの間インビ トロで生存した。感染と形質転換が成功した後、これらの成人および胎児膵臓細 胞系は、成長のために８０４Ｇ細胞由来マトリックスおよびＤＭＥＭ中にＨＧＦ ／ＳＦを必要としなくなったようである。 寄託 以下のＴＲＭ−１およびＴＲＭ−６細胞系、並びにpLNSVoTPMPRLおよびpLoTPM PRRRNLo ベクターはブダペスト条約に基づきAmerican Type Culture Collection (ロックビル、メリーランド 20852、USA)に寄託され、下記のＡＴＣＣ承認番号 を有する。 当該寄託細胞系およびベクターの入手可能性は、いずれであれ政府当局がその 特許法に基づいて付与した権利に違反して本発明を実施する権利と解してはなら ない。 さらにまた、当該寄託ベクターおよび細胞系は本発明の特徴を説明することを のみ目的とするので、本発明は当該寄託組換えベクターおよび細胞系によってそ の範囲を限定されると解してはならない。本出願に開示した細胞系を作製するた めに機能することができる組換え微生物を調製するために用いることができる一 切の組換えベクターは、本発明の範囲内にあると解される。さらに、本明細書に 記載したものに加え、前述の記載から当業者にとって明白である本発明の種々の 改変もまた、添付の請求の範囲内に包含されると解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ (72)発明者 ワング、シィジアン アメリカ合衆国 92122 カリフォルニア 州 サンディエゴ アベニュ ナビダッド ナンバー 558008 (72)発明者 ビーティー、ジリアン エム. アメリカ合衆国 92064 カリフォルニア 州 ポウェイ セイジウッド ドライブ 13615 (72)発明者 ヘイエク、アルベルト アメリカ合衆国 92037 カリフォルニア 州 ラホイヤ ノッティンガム プレイス 8821

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１つ以上の誘導プロモーターおよび／またはオンコジーンの発現を調節する 遺伝学的成分の制御下にある、オンコジーンを少なくとも２つ含むベクター。 ２．ベクターが、オンコジーンを２つまたは３つ含む請求項１記載のベクター。 ３．ベクターが、１つの誘導プロモーターまたは１対の遺伝学的成分を含む請求 項２記載のベクター。 ４．ベクターが、レトロウイルスベクターである請求項３記載のベクター。 ５．(a)少なくとも１つのリプレッサーもしくはアクチベーター遺伝子のための 少なくとも１つの結合部位、または(b)少なくとも１つのリプレッサーまたはア クチベーター遺伝子をさらに含む請求項１記載のベクターであって、該リプレッ サーまたはアクチベーター遺伝子が少なくとも１つの誘導プロモーターを抑制す るかまたは活性化させるタンパク質をコードする請求項１記載のベクター。 ６．オンコジーンがＲａｓ、ＳＶ40 Ｔ抗原を含み、かつ誘導プロモーターがｌ ａｃオペレーター修飾プロモーターである、請求項４記載のレトロウイルスベク ター。 ７．ベクターに挿入された外来性遺伝子をさらに含む請求項１記載のベクター。 ８．ホ乳類細胞を安定に形質転換することができる少なくとも２つのオンコジー ンを含むベクター。 ９．ベクターが、１つ以上の誘導プロモーターおよび／またはオンコジーンの発 現を調節する遺伝学的成分をさらに含む、請求項８記載のベクター。 10．ベクターが、誘導プロモーターの制御下にある、２つまたは３つのオンコジ ーンを含む組換えウイルスである、請求項８記載のベクター。 11．組換えウイルスが、(a)少なくとも１つのリプレッサーもしくはアクチベー ター遺伝子のための少なくとも１つの結合部位、または(b)少なくとも１つのリ プレッサーもしくはアクチベーター遺伝子をさらに含み、該リプレッサーまたは アクチベーター遺伝子が、プロモーターの少なくとも１つを抑制するかまたは活 性化させるタンパク質をコードする請求項10記載の組換えウイルス。 12．誘導プロモーターまたはオンコジーンの発現を調節する１対の遺伝学的成分 の制御下にある、オンコジーンを少なくとも２つ含む第一のベクターによって形 質転換された細胞。 13．第一のベクターが、(a)少なくとも１つのリプレッサーもしくはアクチベー ター遺伝子のための少なくとも１つの結合部位、または(b)少なくとも１つのリ プレッサーもしくはアクチベーター遺伝子をさらに含み、該リプレッサーまたは アクチベーター遺伝子が、プロモーターの少なくとも１つを抑制するかまたは活 性化させるタンパク質をコードする請求項12記載の細胞。 14．細胞を増殖させ、かつ誘導プロモーターに対するリプレッサーをコードする 遺伝子または該遺伝学的成分による該遺伝子の除去を活性化させるタンパク質を コードする遺伝子を含む第二のベクターによって該細胞が形質転換される請求項 12記載の細胞。 15．第一および第二のベクターがレトロウイルスであり、核酸感染が感染によっ て達成され、かつ第一のベクターが誘導プロモーターまたは１対の遺伝学的成分 の制御下にある２つのオンコジーンを含む請求項14記載の細胞。 16．細胞がヒトの細胞である請求項15記載の細胞。 17．細胞がオンコジーンによる形質転換後分裂し、かつオンコジーンが抑圧され るか又は除去された後、成熟細胞に分化した前駆ホ乳類細胞である請求項12記載 の細胞。 18．細胞の増殖を誘導するために細胞で発現することができるオンコジーンを少 なくとも２つ含む第一のベクターを細胞に感染させ、細胞を分裂させて、続いて 該オンコジーンの発現を除去するか又は抑圧する工程を含む遺伝学的修飾細胞を 製造する方法。 19．細胞が前駆細胞であり、方法がさらに、オンコジーンの発現を抑圧するか又 は細胞からオンコジーンを除去した後、前駆細胞を成熟細胞に分化させることを 含む請求項18記載の方法。 20．遺伝学的修飾ヒト細胞をヒトのホストに移植することからなるヒト細胞移植 治療のための方法であって、遺伝学的修飾ヒト細胞が、(a)ヒト細胞で発現する ことができるオンコジーンを少なくとも２つ含むベクターをヒト細胞に核酸感染 させてヒト細胞の増殖を誘導し、(b)細胞を人間のホストに移植する工程を含 む方法によって作製する、ヒト細胞移植治療のための方法。 21．細胞をヒトのホストに移植する前にオンコジーンを抑圧するか、又は除去す る工程をさらに含む請求項20記載の方法。 22．ヒト細胞が前駆細胞であり、かつ方法が、ヒトのホストに細胞を移植する前 にオンコジーンの発現を抑圧するか、又はオンコジーンを除去して前駆細胞を成 熟細胞に分化させることをさらに含む請求項21記載の方法。 23．少なくとも50回の細胞分裂または６ヵ月の間インビトロで生存することがで きる自然には生じないヒト膵臓細胞。 24．細胞がインスリンを産生することができる請求項23記載の自然には生じない ヒト膵臓細胞。 25．細胞が、誘導プロモーターの制御下にある外来性オンコジーンを少なくとも １つ含む、請求項23記載の自然には生じないヒト膵臓細胞。 26．細胞が、誘導プロモーターの制御下にある外来性オンコジーンを２〜５個含 む、請求項25記載の自然には生じないヒト膵臓細胞。 27．２つ以上の外来性オンコジーンを含む膵臓細胞。 28．１つの誘導プロモーターの制御下にあるオンコジーンを２つまたは３つ含む 請求項27記載の膵臓細胞。 29．１つの誘導プロモーターの制御下にある外来性オンコジーンを少なくとも１ つ含む天然には生じないヒト膵臓細胞。 30．細胞がインスリンを産生することができ、かつヒト膵臓に由来する請求項28 記載の膵臓細胞。 31．天然には生じないヒト細胞が２つの外来性オンコジーンを含む、請求項29記 載の天然には生じないヒト細胞。 32．２つの外来性オンコジーンがｒａｓおよびＳＶ40 Ｔ抗原である、請求項31 記載の天然には生じないヒト細胞。 33．誘導プロモーターがｌａｃオペレータ修飾プロモーターである、請求項32記 載の天然には生じないヒト細胞。 34．細胞を１つ以上の外来性オンコジーンで形質転換して細胞を増殖させ、続い て細胞からオンコジーンを除去することによって作製した天然には生じない細 胞。 35．細胞が、バクテリオファージＰＩから得た組換え部位に隣接する外来性オン コジーンを含むベクターによって形質転換されたヒト細胞であって、細胞にＣｒ ｅリコンビナーゼを導入することによってオンコジーンを細胞から除去する、請 求項34記載の天然には生じない細胞。 36．バクテリオファージＰＩから得た組換え部位に隣接する１つ以上の外来性オ ンコジーンを含むレトロウイルスベクターで細胞を形質転換して形質転換細胞を 増殖させ、続いて細胞にＣｒｅリコンビナーゼを導入することにより細胞からオ ンコジーンを除去することによって、天然には生じない細胞を作製する方法。 37．第一のベクターのオンコジーンが１つの誘導プロモーターの制御下にあり、 かつ該誘導プロモーターを抑圧するタンパク質をコードする１つの遺伝子を含む 第二のベクターを細胞に核酸感染させることによって、オンコジーンを抑圧する 請求項18記載の方法。 38．誘導プロモーターを活性化させるか、又は抑制することができるタンパク質 をコードする遺伝子を１つ以上含むレトロウイルスベクター。