JPH08502901A

JPH08502901A - 真核細胞における、治療を目的とした遺伝子の移入と発現のためのレトロウィルスベクター

Info

Publication number: JPH08502901A
Application number: JP7503325A
Authority: JP
Inventors: ーアーゲノエル、オディールコーエン
Original assignee: ーアーゲノエル、オディールコーエン
Priority date: 1993-06-30
Filing date: 1994-06-30
Publication date: 1996-04-02
Also published as: IL110182A0; EP0659216A1; AU692163B2; IL110182A; FR2707091B1; AU7189394A; FR2707091A1; US6949242B2; ATE319843T1; US6312948B1; EP0659216B1; US20020106790A1; WO1995001447A1; DE69434648D1; CA2143620A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、外因性ヌクレオチド配列をクローニングおよび／または発現および／または移入するための組替えレトロウィルスベクターであって、図１に示した配列におけるヌクレオチド番号7702と1527との間に略位置するＣｌａＩ−ＰｖｕIIフラグメント中に含まれる何れかの配列から成り、ヌクレオチド番号7842と144の間に含まれるＬＴＲ配列、ヌクレオチド番号145から始まるＰＢＳ部位、ＬＴＲ配列の末端に続く250ヌクレオチドの配列に含まれるパッケージング配列を具備し、前記配列は、その転写方向がウイルスの転写方向に関して何れの転写方向であっても、前記外因性配列のクローニングおよび／または発現および／または移入を制御できることを特徴とする組替えレトロウィルスベクターに関する。また、本発明は特に治療の目的での、遺伝子の導入および／またはクローニングおよび／または発現のための上記ベクターの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】真核細胞における、治療を目的とした遺伝子の移入と発現のためのレトロウィルスベクター本発明の目的は、特に真核細胞での治療を目的とした、遺伝子の移入と発現のための新規なレトロウィルスベクターである。この点で、本発明は、特に医学的治療、予防、診断のための遺伝子の移入に適したベクターを提案する。分子遺伝学の急速な進歩は、人の疾病の原因となる多くの分子異常を同定してきた。遺伝子から構成される機能単位の中では、生物学的なシグナルの発現のための領域と、その調節のための領域とは隣り合っている。これらの領域はそれぞれ、合成の質的または量的な異常の原因となっている病理学的変化の場所になりやすい。これら異常の検出は、それらのスクリーニングを可能とするが、おもな目的はやなり治療である。治療を目的とした遺伝子の移入または体の“遺伝子治療”は、“治療”遺伝子を生物の体細胞に挿入して内因性遺伝子の機能不良を補い、或いは更に治療目的のための新しい機能を付加する。生じた遺伝子的変化は、処理した細胞の娘細胞に遺伝しそうだが、遺伝されないであろう。従って、損傷されたＤＮＡ配列の正常な対応物は医薬になる。遺伝子治療の分野は、今日非常に活発に発展しており、臨床的なアッセイ（患者数は未だ極く僅かである）と、治療的核酸配列のベクター化や遺伝子発現のような事項における非常に基礎的な研究との結合が行われている。現在使われているベクターは、レトロウィルス若しくはアデノウイルスのような不活化されたウィルス、または巨大分子複合体に由来している。レトロウィルスは、生体外で扱うことのできる一群の幹細胞を含んだ標的組織における使用にはより適している。一方、目標の組織が最終的に分化した細胞で構成されているか、或いは構造的な束縛が機能的に重要性である器官（例えば肺）の中に密接に取り込まれているときには、遺伝子の移入は生体内において、例えばアデノウイルスを使って行なわなけらばなければならない。遺伝子治療は、デュシェーヌ筋障害（Duchennne′s myopathy）、リソゾーム性疾患，膵臓繊維症（mucovisadosis）のような、一つの遺伝子が変化による種々の遺伝病、或いはＡＩＤＳ、癌、血栓塞栓症（thrombo-embolic dise ase）、変性神経病（degenerative neurological disease）、体質的血液疾患（ constitutional hematological diseases）のような後天的な病気に適用される。しかし、このように遺伝子の移入の潜在的な用途は非常に大きいにもかかわらず、この方法の治療的な発展と適用は、いまだ技術的な困難に直面している。この点において、現存のベクターよりも効力のあるレトロウィルスベクターの開発が主な目的である。実際に、レトロウィルスベクターは、移入の標的細胞が古典的に有糸分裂の主体であり、理想的には一群の幹細胞を含んでいるシステムにおいて、その効果が立証されている。しかし、主に、使用したウィルスの感染性が不十分であることと、転写レベルが低いことに関連した制限がある。この目的のためには、有用なベクターは、特にベクターの感染力価を考慮して選択することができる。本発明の目的は、現在のベクターよりも効果的なベクターを提供することにある。現在するベクターの殆どは、モロニー・ネズミ白血病ウィルスのバックボーンに由来する。本発明は、特にフレンドウイルス（Friend virus）の毒性株から始まった研究に基づいている。環境栄養性（ecotropic）のフレンド．マウス白血病ウィルスの単離体Ｉ−５は、赤血球増加症（polycythemia）（ＦＶ−Ｐ）を誘起するフレンドウィルス複合体を感染させた骨髄の長期培養株から得られた（Mathieu-Mahu l el al.，1982）。この単離Ｉ−５から誘導されたＦ−ＭｕＬＶ（フレンド−マウス白血病ウィルス）のＦＢ２９株（Sitbon el al.，1986）は、赤血球に対して細胞破壊や白血病誘発効果を引き起こす原因となり、誕生時に接種した感受性の強いマウスでは、初期の重篤な溶血性貧血を引き起こし、後期には赤白血病を引き起こす。赤白血病を引き起こす領域は、ウィルスのＬＴＲのＵ３領域の中にある（Sitbon el al.，1986;Sitbon et al.，1991）。溶血性貧血のおもな同定法は、ＦＢ２９株に特異的なエンヴェロープ配列に頼っているようだ。その厳密性は３つの異なる領域、即ち、エンヴェロープの構造セグメント、Ｕ３領域にある転写エンハンサー配列、およびＵ５−ｇａｇ−ｐｏｌ領域の配列によって影響され得る（Silbon et al.，1990）。さらに、電子顕微鏡によるウィルス粒子の分析によって、非常に高いパッケージング容量（１．５〜２ｌｏｇ）が確認された。発明者は、このＦＢ２９株の特異な性質に興味をもち、これをレトロウィルスベクターを定義するために用いた。第一の態様によると、本発明の目的は、外因性ヌクレオチド配列をクローニングおよび／または発現および／または移入するための組替えレトロウィルスベクターであって、図１に示した配列のヌクレオチド番号7702と1527との間に位置するＣｌａＩ−ＰｖｕIIフラグメント中に含まれる何れかの配列から成り、ヌクレオチド番号7842と144の間に含まれているＬＴＲ配列、ヌクレオチド番号145から始まるＰＢＳ部位、ＬＴＲ配列の末端に続く250ヌクレオチドの配列に含まれるパッケージング配列を具備し、前記配列は前記外因性配列のクローニングおよび／または発現および／または移入を制御できることを特徴とする、組替えレトロウィルスベクターである。本発明の他の態様によると、この組み替えベクターの特徴は、図１に示したヌクレオチド7702〜310を含むＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに含まれる何れかの配列からなっており、ヌクレオチド番号7842と310の間にあるＬＴＲ配列、ヌクレオチド番号145から始まるＰＢＳ部位、ＬＴＲ配列の末端に続く250ヌクレオチドの配列中に含まれるパッケージング配列を具備し、前記配列は、その転写方向がウィルスの転写方向に関して何れの方向であっても、前記外因性配列のクローニングおよび／またはは発現および／または移入をコントロールすることができる。従って本発明のこの２番目の態様によれば、該ベクターは、図１に示した配列のヌクレオチド番号で略7702〜310の間にあるＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント中に含まれる何れかの配列からなり、該配列は外因性配列をクローニングおよび／または発現および／または移入する能力を有する、外因性ヌクレオチド配列をクローニングおよび／または発現および／または移入するためのレトロウィルスベクターである。上記のＣｌａＩ部位およびＢａｍＨＩ部位は、ＦＢ２９株に起源を有する。レトロウィルスベクター又はパッケージングラインを生成するべく運命付けられたベクターを構築する際に、これらの部位は修飾され、特に置換されて、任意に異なった酵素開裂部位が創製され得る。従って、ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを含むベクターは、同じウィルス起源の二つのＬＴＲ配列、即ち、５´ＬＴＲおよび３´ＬＴＲを有する。このベクターは、５´ＬＴＲおよび３´ＬＴＲ配列の上流および／または下流に存在するウイルスエンヴェロープ配列の一部または全部を削除することによって修飾され得る。このタイプのベクターは、例えば図７に記載したｐＦＯＣＨ２９−ＰＬである。これらのＬＴＲ配列類は、ベクター内においては、前述のｇａｇ配列の存在によって、および／または移入、クローニング若しくは発現が望まれる外因性ヌクレオチド配列によって隔てられている。本発明の魅力的な態様によると、この組み替えベクターは、ＣｌａＩ−Ｐｕｖ II フラグメントの全部からなり、図１に示した配列のヌクレオチド7702〜1527を含んでいることを特徴とする。他の好ましいレトロウイルスベクターは、ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（7702〜310）の全てからなる。本発明のレトロウイルスベクターは、患者に臨床上重要なヌクレオチド配列を移入して、診断または治療の目的で使用することができる。実際、本発明のベクターは、この用途に要求される有効性と安全性を示している。好都合なことに、本発明に従えば、ウィルスの転写方向に関してこの配列の転写方向が何れであっても、外因性配列のクローニング、発現または移入の制御を達成することができる。本発明に従う外因性のヌクレオチド配列は、ベクターを構成する遺伝物質（特に発現、クローニングまたは移入の制御に必要な配列）には本来含まれていない。これは、天然もしくは合成の配列、特にハイブリッド配列であり得る。「外因性ヌクレオチド配列の移入」の表現は、ベクターに担持された配列を、このベクターによって形質転換した細胞のゲノム或いはそのサテライト中に組み込むことを意味する。そのような移入は、組み替え（特に相同性組み替え）の結果であり得る。従って、本発明のベクターは、標的細胞のゲノム中に融合される性質があるために選択された外因性ヌクレオチドの、標的細胞のゲノム内における恒久的な発現を可能にすることができる。本発明の魅力的な態様によれば、外因性の配列は、既述のＣｌａＩ−ＰｖｕII フラグメント、ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント又は上記フラグメント類の一つに含まれる配列と共に、例えばプラスミドＰｕｃ１９、プラスミドＰｕｃ１８または適合する他の何れかのプラスミドに挿入される。好ましくは、この組み替えベクターは更に、図５に示す配列のヌクレオチド61 9〜2245の間にあるｇａｇ配列の一部、特に図１に示す配列のヌクレオチド619〜 1527の間の配列を含んでいる。ｇａｇ配列の一部または全部の存在は、得られた該ベクターの安定性に寄与し得る。このｇａｇ配列は、フレンドウィルスの核蛋白質をコードしており、少なくとも基部におけるパッケージング効果を増大する。しかしながら、本発明のベクター中に存在するｇａｇ配列の一部を制限することは、ベクターに導入される外因性配列のサイズの機能として、より高いウィルス感染力価を得るために、並びにウィルス蛋白の生産を抑制し且つ複製拮抗ウィルス産生の危険性を抑制するために有用であり得る。好ましくは、ベクターに存在するｇａｇ配列部分は、通常のｇａｇ配列の約２／３より小さくすべきである。好都合なことに、保存されたｇａｇ配列は、得られたレトロウィルスベクターのパッケージング段階に関係する該配列の一部である。本発明の有用なベクターは、本質的には、ウィルス配列であるｐｏｌおよび／またはｅｎｖを欠失していることである。一方、図５に示すＦＢ２９株のｐｏｌ配列およびｇａｇ配列は、パッケージングラインの生産のために、ＬＴＲの下流に保存され得る（例えば図２３を参照のこと）。ｐｏｌ配列およびｇａｇ配列の発現は、ウィルスＬＴＲ（その後削除される）とは異なるプロモーターによって調節され得る。従って本発明の目的は、既述のＣｌａＩ−ＰｖｕIIフラグメントに含まれる配列を含み、更にパッケージングラインを生産するのに十分なｇａｇ及びｐｏｌ配列またはこれら配列の一部を含んだ、上述の構築体にある。これらのラインは、本発明のレトロウィルスベクターのパッケージングに使用され得る。ＣｌａＩ−ＰｖｕIIフラグメント（独特なＬＴＲ配列を持つ）と、ｇａｇ配列およびｐｏｌの配列またはこれら配列の一部の何れをも有するベクターは、とくに生体外または生体内の遺伝子移入のためのパッケージングラインの調製に関連して使用され得る。なお、前記遺伝子は外因性のヌクレオチド配列で表される。ｅｎｖウィルス配列の一部がベクター内に存在するときは、複製競合ウィルスを生産し易い組み替えのためには、未だ不十分である。エンヴェロープの配列を欠く本発明の有用なベクターは、図１に示した配列のヌクレオチド7806〜1527を含むフラグメントからなる。本発明はまた、ＣｌａＩ−ＰｖｕIIフラグメント（7702〜1527）に含まれる配列および／またはこのフラグメントおよび／またはＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（7102〜310）に含まれる配列および／またはこのフラグメントが、高度に厳格な条件下で上記のフラグメントに相当する配列とハイブリッド形成する配列で置換され、或いは少なくとも上記のフラグメントと９５％のヌクレオチド相同性を有し、Ｕ３配列の場合は少なくとも８５％のヌクレオチド相同性を有する配列で置換された組み替えベクターに関する。ハイブリッド形成は、実験の部に記述したのと同じハイブリッド形成溶液の中で行った。但し、１×ＳＳＣ、０．１ＳＤＳ溶液中での２回の洗浄（夫々６５℃ で１０分間）、並びに０．１×ＳＳＣ、０．１ＳＤＳ溶液中での２回の洗浄（夫々６５℃で１０分間）を加えた。ヌクレオチドの命名は、図１に示したウィルスの配列のヌクレオチド番号を参照することによって、上に与えられている。任意的に、Ｆ−ＭｕＬＶウィルス（フレンドウィルスのＦＢ２９株）の配列から始まる先に定義した二つのＬＴＲ配列の一つは、他のウイルス、例えばモロニー・ネズミ白血病ウィルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）由来のＬＴＲ配列によって置換され得る。同様に、本発明の組み替えベクターは、以上に述べた以外の他のレトロウィルス配列をも含み得る。それらの配列は、図５に示した配列を有する同じＦ−ＭｕＬＶウィルス由来であってもよく、他のウィルス由来であってもよい。本発明の目的はまた、更に、ベクターに含まれる部位に関してユニークな制限部位を有する少くとも一つのポリリンカーを具備したことを特徴とする組み替えベクターである。特にこのようなアダプター、好ましくは多重部位（ポリリンカー）によって、移入、クローニングまたは発現が望まれる一以上の外因性の配列の挿入が可能になる。特に有用なベクターは、E．coli SCS1株のpFOCH29-SCS1という名称で、1993年６月30日に、No．I-1326の番号でＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍに供託されたプラスミドｐＦＯＣＨ２９であることを特徴とするベクターである。 E．coli SCS1株はストラタジーン社によって市販されている。本発明のベクターはまた、例えばネオマイシン抵抗性遺伝子のようなマーカー遺伝子またはその一部を含んでいる。このマーカー遺伝子の存在によって、特に組み替え細胞におけるベクターの存在を容易に検出することができる。本発明の目的はまた、ＬＴＲのＵ３領域が少なくとも一部削除されていて、Ｕ３に含まれる転写配列、とくにプロモーターおよび／またはエンハンサーの少なくとも一部が不活化または修飾されている、先の記述に従う組替えベクターである。この場合、このベクターは自動的に活性化することができるか、或いはＳＩＮベクター（自己不活化ベクター）である。このように構築されたＳＩＮベクターは、含有している外因性配列の発現を可能にする。これが可能なのは、その外因性配列が、ウイルス性または非ウイルス性いわゆる“内部プロモーター”、任意にはこの配列のプロモーター、或いはＥＧＦ（上皮成長因子）レセプターのプロモータ、またはホスホグリセレートキナーゼの遍在ＰＫＧプロモーターのようなプロモータの制御下に置かれたときである。本発明の優位性は、安全性の改善にある（繁殖がなく、隣接配列の活性化の危険性が減少する）。他の利点は、レトロウイルスに媒介された一体化の利益が得られるが、内部プロモータによって転写が特定またはターゲットされることである。同様に、Ｕ５配列（もし必要なら配列Ｒも）は、少なくとも一部が削除され得る。この削除は、このベクターに存在する独特のＬＴＲ配列で行われ得るし、或いはこのベクターの各ＬＴＲ配列で任意に行われ得る。しかしながら、これによって頻繁にウィルス粒子の力価が減少し、更に、もしＵ５が欠損していれば、標的細胞のゲノムに組み込まれなくなる。本発明のその他の態様によれば、外因性のヌクレオチド配列は、外因性の（または内部の）プロモーターの制御下にある。 “外因性のプロモーター”は、天然にはベクターに存在しないプロモーターを意味する。このようなプロモーターは、外因性配列の天然のプロモーターであろう。これは、本来的プロモーターまたは誘導プロモーターであり得る。前に定義した組み替えベクターは、好ましくは、例えばトランスフェクションやエレクトロポレーションによってパッケージングラインに導入される。このトランスフェクションは、ベクターに含まれる外因性ヌクレオチド配列のクローニング、移入または発現のための標的細胞内において、形質移入による組み替え体の製造に固有のウィルス粒子構築を可能にする。従って、とくに有用なベクターはｐｓｉ−ＣＲＩＰ系にトランスフェクトされ得る。もし、ベクターに含まれるプロウィルスＤＮＡから野生型ウィルス粒子の生産を生じる組み替えがもたらされないならば、パッケージングラインｐｓｉ−ＣＲＥまたは他の系を用いることも可能である。本発明の他の態様によれば、この組み替えベクターは、リポソームまたは巨大分子複合体に移入され得る（Monsigny M et al．M/S 1993）。Ｆ−ＭｕＭＶベクターは、McLachlin JR et al.，1990に説明されている方法に従って、このようなパッケージングラインを生産するために利用され得る。かかるラインは、ｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌ遺伝子の配列から構築され得、そのパッケージング配列は削除され、またｇａｇ、ｐｏｌ、またはｅｎｖ配列の少なくとも一つは、蛋白質の生産に悪影響を与えないポイントミューテーションを受ける。本発明のベクターは、一以上の外因性配列を含み得る。これらの配列は、上記の通りＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントまたはＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの外側に挿入され得るし、或いは、これらのフラグメントの中（特にＬＴＲ配列内）に挿入され得る。これらのベクターはまた、特定の細胞内におけるベクターの組み込みに適応するための、細胞ターゲッティング要素を含み得る。好都合なことに、本発明によるレトロウィルスベクター構造は、標的細胞への感染に際して、ネオマイシン遺伝子をコードする外因性ヌクレオチド配列をこのベクターの中に挿入して測定すると、ウィルス力価を１０⁴ｐｆｕ／ｍｌ以上にまで高める。このベクターは多種多様な用途を有しており、特にこれらベクターは臨床的に（治療上または診断上）重要なヌクレオチド配列のクローニング、発現および／または移入に用いることができる。従って、如何なる病気または疾患に関する治療目的においても、本発明のベクターは、遺伝子を細胞（例えば体細胞）に移入するために使うことが可能である。ここで述べた治療上重要な配列とは、例えば、ある病気におけて機能しなくなっている遺伝子の正常な等価物に対応する配列、ある遺伝子のアンチセンス配列もしくは負の優性変異種、ある遺伝子の機能阻害物質をコードする配列、並びにマーカー遺伝子の利用をコードしている配列である。従って、本発明のベクターは、遺伝子修復技術または腫瘍細胞破壊ストラテジーの改良を適用した、癌の遺伝子治療において適している。最初の方法に従えば、癌の遺伝的な素質、ｒａｓ癌遺伝子とその同族体に媒介される経路のような信号変換の異常、癌遺伝子のエンハンサー異常、癌抑制遺伝子の阻害異常、遺伝子の不安定性を促進する異常、ＤＮＡ修復に影響する異常等における構造的変異を直すために、本発明のベクターを使うことが可能である。２番目の方法によれば、このベクターは、ガンシクロビル（Ganciclovir）またはアシクロビル（Acyclovir）を細胞毒性のある薬物に変換するヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子、または５−フルオロウラシルの前駆物質を活性薬物に転換するシトシンデアミナーゼ遺伝子の場合のように、プロドラッグを活性化するために用いられ得る。或いは、例えばサイトカイン遺伝子を使って癌細胞を操作したり、抗原提示細胞やその前駆体（造血幹細胞）を操作したり、免疫エフェクター細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＬＡＫ、ＴＩＬを操作したりすることによって、免疫系を誘導または刺激するために使用され得る。遺伝子病および貧血の治療に関しては、本発明は、例えば生まれつきの代謝欠陥、サラセミア、鎌状赤血球貧血のようなヘモグロビンの病気、止血と凝固の病気、脱髄もしくは筋障害の遺伝病に対して適用できる。本発明のベクターは、患者を、病理学的物質にたいして一時的もしくは永続的に予防接種するためにも適している。本発明における移入は、細胞、組織、器官または微生物中への形質導入によって達成される。本発明の他の態様によれば、外因性ヌクレオチド配列は抗原または抗原決定基をコードする。そのような抗原決定基を有するベクターは、永久的または一時的なワクチンとして使用されるに違いないし、或いは治療プロトコルの中で任意に、例えば免疫を誘導するために使用されるに違いない。例えば、ＨＩＶレトロウィルス抗原の配列が、本発明のベクターに組み込まれ得る。この点に関して、本発明のレトロウィルスベクターは、ＣＤ４、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｇｐ１２０の超優性な突然変異体を用いることにより、細胞内免疫のために使用することができ、ＴＡＲのような調節たんぱく、ウィルス配列またはアンチセンス遺伝子の特異的リボザイムの過剰な合成を誘導することができる。これと同じ方法は、他のレトロウィルス感染を治療するためにも利用され得る。先に述べた外因性ヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡの配列、ｃＤＮＡ配列、或いはＲＮＡ配列であり得る。同様に、この配列は天然のものでもよく、或いは合成のものでもよい。本発明の目的はまた、本発明の組み替えベクターによって修飾されていることを特徴とする、組み替え真核細胞または組み替え原核細胞である。好都合なことに、この種の細胞は内因性レトロウィルスを持っていない。このような細胞は哺乳類細胞、特にヒトの細胞であるのが有利である。同様に、これは全部分化した細胞または前駆体細胞である。例えば、本発明のベクターは、特に造血細胞および造血前駆体細胞、またはリンパ骨髄の分化全能性細胞株の修飾に適合している。さらに、神経膠（グリア）細胞または神経ニューロン細胞もまた、本発明のベクターによって修飾され得る。また、例えばＴリンパ球もしくはＢリンパ球、あるいは他の細胞性免疫メディエータ、腫瘍細胞、髄質ストロマ細胞、内皮細胞、または間充織細胞も、本発明のベクターによって修飾され得る。本発明による組み替えベクターは、繊維芽細胞、皮膚細胞、肝細胞または筋肉細胞を修飾するためにも使用され得る。他の標的細胞も、本発明のベクターによって形質転換され得る。特に言及すべきは、上皮細胞（例えば、乳上皮または胞状上皮）、腫瘍細胞、稀突起細胞またはシュワン細胞の前駆体のような神経系の付随細胞である。また、Jurkat Ｔリンパ球系、YT2C2のようなＮＫ細胞系、単細胞マクロファージ系（例えばＵ937）、または赤芽巨大核細胞系（例えばＫ562）のような細胞系も修飾することができる。本発明の他の特徴と有用性は、以下の実施例および添付の図面において更に明らかになるであろう。図１：ベクターFOCH29を構築するために使ったウィルスＤＮＡの配列図２：Ａ：ベクターFOCH29の制限地図ＦＢ２９の参照配列Ｂ：ＦＯＣＨ 29の制限地図。部位は図１に示したＦＢ２９配列の番号と、こうして達成された構造に固有の番号（かっこ内の番号）を使って指示した。図３：ベクターＦＯＣＨ２９−Ｎｅｏの制限地図。ｎｅｏ遺伝子はポリリンカーにクローニングした。ポリリンカー内で使える酵素は、Ｘｂａ、Ｓａｌ、ＳｐｈＩである。切断：−ＢｇｌII 2070 5300 −Ｂａｍ 1392 1500 4456 −Ｓａｌ／ＢｇｌII 300 2070 5000 図４：プラスミドｐＵＣ１９の制限地図図５：Ｆ−ＭｕＬＶの配列図６〜２４：レトロウィルスベクターＦＯＣＨ２９から作られた構造の制限地図実施例Ａ）レトロウィルスベクターの調製＜材料および方法＞１．ウィルスゲノム材料の供給源プロウィルスのゲノムＤＮＡを、ｐＢＲ３２２（Sitbon et al.，1986）中にクローニングした。ウィルス配列の7702位にあるＣｌａＩ部位をＥｃｏＲＩ部位に置換した後、ウィルスの長い末端繰返し配列（ＬＴＲ）の全てを含む2110塩基対（ｂｐ）を、Ｐｕｃ１９のポリリンカーのＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ部位にサブクローニングした。２．レトロウィルスベクターＦＯＣＨ２９の構築ＥｃｏＲＩ−ＰｖｕIIフラグメントを含むｐＵＣ１９のポリリンカーのＨｉｎｄIII 部位を、ＢｇｌIIで置換した。ＨｉｎｄIIIで開いた後、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ（クレノウフラグメント）の長いフラグメントで埋め、ＨｉｎｄIIIを再生しないＢｇｌIIアダプターに連結した。ＢｇｌII部位は、フレンドウィルスの本来のＬＴＲの２番目のコピーを含む865塩基対のＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを組込むために導入された。このフラグメントは、下流のＬＴＲ（または３´ ＬＴＲ）を構成するように運命付けられている。このＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントによって末端を埋めた後、ＥｃｏＲＩを再生しないリンカーによって、Ｐｕｃ１９のＥｃｏＲＩ部位を上流のＢａｍＨＩ部位に置換することによって単離された。下流のＢａｍＨＩ部位は、ウィルス配列に対して内因性である。このフラグメントは、骨格（Ｐｕｃ１９）と連結することによって導入された。この骨格をＢｇｌIIで開くことによって、その付着端をＢａｍＨＩで生じる末端と結合すること可能となった。こうして得られたプラスミドをｐＦＯＣＨ２９と称する。３．マーカー遺伝子の導入レトロトランスポゾン Tn5（ＮｅｏＲ）由来のネオマイシン抵抗性をもつ遺伝子のＢｇｌII−ＢａｍＨＩｃＤＮＡフラグメント（1500塩基対）は、次の３つのフラグメントを連結した後に、２つのウィルスＬＴＲの間に導入された。この３つのフラグメントは、Ｐｕｃ１９−５´・ＬＴＲ・ＢｇｌII、ＮｅｏＲ・ＢｇｌII−ＢａｍＨＩ、および３´ＬＴＲ・ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩである。その結果できたプラスミドは、ｐＦＯＣＨ２９−Ｎｅｏと称する。４．パッケージングラインｐｓｉ−ＣＲＩＰのトランスフェクションと、繊維芽細胞の感染 Danos et al.，（1988）に記述されているように、プラスミドｐＦＯＣＨ２９ −Ｎｅｏは、両栄養性パッケージング系のｐｓｉ−ＣＲＩＰ中に、ＤＮＡ担体を使わない標準の方法に従って、燐酸カルシウム沈殿を用いたトランスフェクションにより導入された。１０μｇのプラスミドを、一日前に５×１０⁴の細胞を植えた直径３５ｍｍの培養皿に載置した。ｐｓｉ−ＣＲＩＰ細胞を、１０％の新生仔牛の血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を加えたダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で培養した。トランスフェクションの二日後に、細胞をトリプシン処理し、１／２０に希釈し、培地１ミリリットル当たり１ミリグラムの最終濃度のジェネティシン（geneti cin）存在下で選別した。１２日後に現れたコロニーを選別し、２４ウェルの培養皿に、一つのウェルに一つのクローンという濃度になるように再接種した。集密状態になったウェルの細胞培養上清をとり、０．４５μｍのフィルターを通して上清中の細胞を除去し、別個に８μｇ／mlのポリブレン（polybrene）存在下で２４ウェルの培養皿に接種されたマウス繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）を感染させるために用いた。ＮＩＨ３Ｔ３は、１０％胎児牛血清（ＦＣＳ）を加えたＤＭＥＭで培養した。ウィルスの組込みについては、集密状態に達したＮＩＨ３Ｔ３の細胞溶解物をＰＣＲで分析した５．ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）２４ウェル培養皿のウェルで集密状態になったＮＩＨ３Ｔ３を溶解した上清を１００μｌ，１０μｌで回収し、これをＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲは次の緩衝液中で行われた。即ち、２５ｍＭのＭｇＣｌ₂を含む１０×標準ＰＣＲ緩衝液（Perkin-Elmer/Roche MS）；夫々のプライマー１００ｎｇ、２μｌのｄＮＴＰ類１０ｍＭ（初期濃度１０ｍＭ、即ち各々２．５ｍＭでのヌクレオチド類の等モル混合物）；４０サイクルためのクローン化Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer /Roche MS）を２単位、１単位で２５サイクル；最終量は５０μｌである。２対のプライマーを使用した。使用したオリゴヌクレオチドは次の通りである。１゜)第一の対：２゜)第二の対：増幅したシークエンスのサイズは、第一の対の場合には、ｅｎｄ−ｇａｇ／ＮｅｏＲ遺伝子の基端部2/3：９００塩基対である。第二の対の場合は、ＮｅｏＲ遺伝子先端部の1/3／３´ＬＴＲの基端部半分：６１０塩基対である。ジーンアンプ（GeneAmp）ＰＣＲ・９６００を用い、９４℃で５分間の変性を４０サイクル行った。１サイクルは、９４℃で３０秒間の変性を、５５℃で１５秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間のエロンゲーション、最後に１０分間の末端エロンゲーションからなる。サンプル（５０μｌ中、１５μｌ）を、１．２％アガロースゲル（Seakem,FMC ）に乗せ、８０ボルトで４５分間水平電気泳動にかけた。シグナルの検出は、エチジウムブロマイド（ＢＥＴ）蛍光濃度の分析に基づいて行った。６．感染力価の測定ＮＩＨ３Ｔ３に感染する能力について試験された各クローンを増幅し、必要に応じ、ＰＣＲによる感染効果の分析に先立って凍結した。ＰＣＲの後、２つの主なクローンを選択し、ＮＩＨ３Ｔ３を感染するために標準的な方法を用いて増幅した。直径３５ｍｍの皿の夫々のクローンから、１６時間培養した上清を１ｍｌ集めて、懸濁液中の産生細胞を除去するために、０．４５μｍのフィルターで濾過した。上清は同じ直径（３５ｍｍ）の培養皿の中に入れ、培地１ミリリットル当たり８μｇの濃度のポリブレン存在下において、５０％集密状態のＮＩＨ３Ｔ３細胞に接触させた。細胞は３７℃で約２時間３０分培養した。培地は３０分ごとに攪拌した。２時間３０分後に新しい培地を３倍量加えた。ウィルスの感染力価初めの上清の連続した希釈液を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に感染させるために用いた。上清原液と、希釈倍率1/10、1/1000、1/100000の上清である。感染の２日後に細胞をトリプシン処理し、直径１００ｍｍの３つの培養皿上において約１／２０で継代培養し、ジェネティシン（１ｍｇ／ml）を上清に加えて選択した。この実験方法は、次の点でより厳密に行われた。一方では、感染後に非常に素早く薬剤を加えた。また他方では、細胞をトリプシン処理しないで選択するによって、生産したコロニー数の人工的な増加が阻害され、感染細胞から派生し娘細胞は集合して、原位置で一つのコロニーのみを形成した。逆に、細胞をトリプシン処理したときは、娘細胞は培養皿に拡散して人為的に独立したコロニーを形成し、これは、もし計数すれば、力価を人工的に増大する。サザンブロット希釈しない上清で感染させた２日後、ＮＩＨ３Ｔ３をトリプシン処理し、約１／２０を３つの直径１００ｍｍの培養皿で継代培養し、そのうちの一つをジェネティシン（geneticin）で選択した。集密状態において、選別後または選別しないで、２つのクローンの夫々の感染細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、量を測った。このＤＮＡを、サザンブロットをするためにＰｓｔＩおよびＫｐｎＩの２つの制限酵素で分解した。分解の質を調節し、各ウェルに同量のＤＮＡを入れた後、ハイボンドＮナイロンＮ膜（Amersham社）上で転写した。ハイブリッド形成は、全てのウィルスＬＴＲ配列をすべて含み、その上流に１００塩基、下流に１００塩基が隣接しているプローブを用いて行われた。このプローブは、比活性が５×１０⁸ｃｐｍ／μｇのα−³²Ｐ標識ｄＣＴＰを用いたプライマー伸長によってラベルされた（Feinberg and Vogelstein，1 983，1984）。ハイブリッド形成は、５０％の脱イオン化したホルムアミド、５×ＳＳＥＰ、１×デンハート、５％の硫酸デキストランおよび０．２mg／mlの音波処理したサケＤＮＡからなる培地中において、４２℃で２０時間行われた。あまり厳密でない溶液中で次のように簡単に洗浄した；２×SSEP／0.1％ＳＤＳ、室温で５分間、６５℃で１０分間。その後、ＬＩ＋強化スクリーン（Dupont-NEN）で、コダック−ＸＡＲ−５フィルムに−８０℃で３日間露出した。７．ヘルパーウィルス生産の検索この検索は、３Ｔ３ＢＡＧ系でのモビライゼーション試験（mobilization t est）により（Danos et al.，1988；Danos，1991）。最初に、３Ｔ３ＢＡＧ細胞を、感染パッケイジング系の非希釈上清で感染させた。この試験を増感するために、感染されていない３Ｔ３ＢＡＧを、先に感染した３Ｔ３ＢＡＧの上清を用いて幾つか連続したサイクルで感染させ。＜結果＞１．レトロウィルスベクターＦＯＣＨ２９の構築フレンド・ネズミ白血病ウィルスのＦＢ２９ウィルス株が単離され（Mathie u-Mahul et al.，1982）、組込まれたプロウィルスのゲノムＤＮＡがｐＢＲ３２２にクローニングされた（Silbon et al.，1986）。このゲノムＤＮＡは完全に配列を決定されている（Perryman et al.，1991）。2120塩基対のＣｌａＩ−ＰｖｕII ゲノムフラグメントが、ｐＢＲ３２２にクローニングされた。このフラグメントは、ウィルスエンヴェロープのｐ１５Ｅをコードする配列の最後のヌクレオチド、全ての長い末端繰返し構造（ＬＴＲ）およびｇａｇ配列の３／５を含んでいる。これはベクターの構造のマトリックスを構成している。ＣｌａＩ部位をＥｃｏＲＩ部位に置換した後、このＥｃｏＲＩ−ＰｖｕIIフラグメントを、Ｐｕｃ１９のポリリンカーのＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ中にサブクローン化した。一方において、このクローンは上流ＬＴＲ（または５´ＬＴＲ）、ウィルス転写のイニシエイター結合部位（プライマー結合部位またはＰＢＳ）、パッケージング配列、ｇａｇ配列およびＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ分解を受けたＰｕｃ１９のポリリンカー断片を含むベクターの基本的な構造を形成するために、そのまま保持された。なお、これには問題の遺伝子が挿入される。他方、ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは、上流のＥｃｏＲＩ部位をＢａｍＨＩ部位で置き換えることによって、またドナー継ぎ目部位の直ぐ下流にあるウィルスの内因性ＢａｍＨＩ部位を利用することによって得られる。このフラグメントは、ポリリンカーのＨｉｎｄIII 部位を予めＢｇｌII部位に置換した基本的な枠組みに中に導入された。なお、該ＢｇｌII 部位は、ＢａｍＨＩ酵素によってできた末端と付着する末端を生じる。ネオマイシン抵抗性（ＮｅｏＲ）を与えるレトロトランスポゾンＴｎ５から得たマーカー遺伝子を、２つのＬＴＲの間に導入した。存在する配列の可能な再構成を阻害するために優性な負の組替え酵素表現型の超コンピーテント（supercom petant）なバクテリア株に対して形質転換した後、全構造を調査した伸長した制限地図に基づいて、期待される構造の形質転換株選別した。その内の一つはｐＦＯＣＨ２９と命名され、ウィルス粒子を形成するヘルパー系トランスフェクションに使用すべき材料の入手可能な十分な供給源を得るために、増幅および精製された。２．不完全ウィルスの産生クローンの単離ｐｓｉ−ＣＲＩＰパッケージング系のトランスフェクション：プラスミドｐＦＯＣＨ２９−Ｎｅｏが、担体ＤＮＡを用いない標準法に従う燐酸カルシウム沈殿を使用したトランスフェクションによって、Danos et al.，（1988）に記載された両栄養性パッケージング系のｐｓｉ−ＣＲＩＰに導入された。ジェネチシンによる選別の後、形成されたコロニーのうちの４０個が採取され、培養上清はマウスの繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の感染に用いられた。一連の最も生産性の高い、不完全に包まれたウィルス粒子クローンの初めの選別方法は、ポリメラーゼチェーン反応による遺伝子増幅の方法の使用に基づいていた。ウィルスの組込みを、集密状態に達したＮＩＨ３Ｔ３の溶解物についてのＰＣＲによって分析した。２つの異なる対のＰＣＲプライマーが使われた。第一の対は、構造内のｇａｇ配列の末端断片と、ネオマイシン抵抗性遺伝子の略２／３を増幅させる。第二の対は、ネオマイシン抵抗性遺伝子の末端の１／３と、下流のＬＴＲ（３´）の半分を増幅させる。４つのクローンが、他の３６より強いＰＣＲシグナルに基づいて選ばれた。この方法の繰り返しによって、２個のクローンのシグナルが著しく強いという初めのデータが確認された。量的な構築効率を評価するために、これらの２つのクローンを増幅して、産生細胞の培養上清を、ＮＩＨ３Ｔ３の大スケールでの感染に用いた。３．産生クローンの評価定量的ＰＣＲＮｅｏＲ遺伝子の末端１／３から下流のＬＴＲ（３´ＬＴＲ）の中央部分に相当する領域を増幅させるプライマー対を使って、ＰＣＲによる半定量的な分析を行った。各クローンについて、希釈していない上清で感染させたＮＩＨ３Ｔ３細胞から、ネオマイシンによる選別の後または選別をしないで抽出した１μｇと３μｇのゲノムＤＮＡを使用した。夫々の分析を２回行った。プラスミドｐＦＯＣＨ２９−Ｎｅｏの幾つかの希釈液についての試験を、夫々が１μｇのゲノムＤＮＡと等価な導入遺伝子の0.1コピー、0.5コピー及び１コピー；即ち7164塩基対のプラスミドの0.11 5ｐｇ，0.575ｐｇ，1.15ｐｇに相当するように計算して、並行して行った。ＰＣＲは２４サイクル行ったが、これはまだ反応の指数増殖期に相当する。読取りは、エチジウムブロマイド蛍光のコンピューター化された光学密度計測分析器（Cybertech社）によって行われ（表参照）。最初のクローンの場合には、選別された感染細胞と選別されなかった感染細胞から得たシグナルの強度の間で、はっきりした違いが観察された。１μｇ（選別された細胞に関するシグナルの７０％）のサンプルでは、検出システムがシグナル強度で飽和されてしまう３μｇのサンプルに比較して、もっと明快であった。二番目のクローンの場合には、選別された細胞と選別されなかった細胞とのシグナルの強さに違いはなく、１μｇのサンプルと３μｇのサンプルについても相違はなかった。これは１００％に近いＮＩＨ３Ｔ３細胞が、生産クローンの希釈しない上清によって感染されたことを示している。培養上清で感染させたＮＩＨ３Ｔ３をネオマイシンで選別したとき、細胞の死亡率がないという観察によると、このクローンの高い感染性は疑わしい。サザンブロット感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞のＤＮＡは、ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩの２つの制限酵素によって加水分解された。ウィルスの組込みの後、予想されるバンドのサイズは使用したプローブに応じて変化する。ＬＴＲの中とＰｕｃ１９のポリリンカーとの中間を切断するＫｐｎＩ酵素の場合には、ＬＴＲプローブは３６１０塩基の一定サイズのフラグメントと、内因性ゲノムのＫｐｎＩ部位と組込み部位との距離によってサイズが変わる二つのフラグメントを示した。末端1/3のＮｅｏＲ／基端部ＬＴＲ断片のプライマーを用いたＰＣＲによって誘導されたプローブでは、同じ大きさ（3610塩基）のフラグメントと、一方の組み込みが他方の組み込みとは異なる前記他の二つのフラグメントのうちの片方だけが示された。ｇａｇの中間を２度、Ｐｕｃ１９のポリリンカーを１度切断するＰｓｔＩ酵素の場合は、組込みの後、先の２つのプローブによって同定されたフラグメントは様々な大きさでなければならない。ＰＣＲによって第二のプライマー対から生成されたプローブは、７９０塩基対の一定のフラグメントを同定する。ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで分解されたプラスミドｐＦＯＣＨ２９−Ｎｅｏの幾つかの希釈液は、サザンブロットによって分析された。これらの希釈液は、１０ μｇのゲノムＤＮＡについて、夫々0.1、0.5、1.0コピーのプラスミドに相当する。更に、ネオマイシンで選別されなかった感染細胞のＤＮＡは、該構築物の感染性を定量するために、系統的に整列させて載置された。選択を受けた細胞を、１００％感染のコントロールとする。［滴定］：ウィルス希釈液による感染ウィルスの力価初めの上清液の連続希釈系列を、ＮＩＨ３Ｔ３の感染に用いた。即ち、非希釈上清と、1/10、1/1000、1/100000に希釈した上清である。直径３５ｍｍのウェル当たり０．５mlのウイルス上清によって細胞を感染させた。感染の後、細胞をトリプシン処理することなく、選別薬品を正確に２０時間、培養皿に直接加えた。選別された感染力価は、コロニーが現れた最後の希釈で観察されたコロニーの数に対してこの希釈倍率の逆数をかけたものに相当する。最初のクローンの場合、初期産生細胞の力価は２×１０⁶ｐｆｕ／mlである。二番目のクローンの場合、力価は１０⁶ｐｆｕ／mlである。この二つの生産クローンは、一部は初期の継代（passage）を保存するために凍結されると共に、残りは連続培養で数ケ月間維持された。連続滴定（ウイルスの上清の希釈液）によって、力価の減少を同定することができた。初めのクローンの場合、力価は、２か月の連続培養の間に、２×１０⁶以上からたった１０¹に変化した。この急激な力価の減少には、培養中の細胞の増殖が同心円的になり且つ容易に分離するという変化が伴われた。二番めのクローンでは、２か月の連続培養の間に力価は１０⁶以上から１０⁵に変化し、3.5ケ月後には１０³から１０⁴ に減少した。この緩やかな力価の減少は、培養中の形態または細胞増殖の何れにおいても変化を伴わなかった。４．３Ｔ３．ＢＡＧに対するヘルパー活性分析この研究は、３Ｔ３・ＢＡＧ系（Danos et al.，1988；Danos et al.，1991 ）に対するモビライゼーション試験（mobilization test）によって行った。先ず、３Ｔ３・ＢＡＧ細胞を、感染したパッケイジング系の非希釈上清によって感染させた。感染していない３Ｔ３・ＢＡＧを、予め感染させた３Ｔ３・ＢＡＧの上清液を用いた幾つかの連続サイクルで感染させて分析の感度を上げたが、感染していないことがわかった。更に、感染していないＮＩＨ３Ｔ３を、ネオマイシンで選別した感染ＮＩＨ３Ｔ３の上清と接触させた後には、ネオマイシン抵抗性細胞のコロニーは検出できなかった。５．組込み部位感染後のウィルスの組込み部位の数を決定するために、ヒトと非ヒト霊長類の細胞を利用した。マウス細胞は、レトロウイルス配列またはレトロウイルス様配列の多重組み込みに関連する重要なバックグラウンドである細胞に存在するのと同様の、非常に温和な質を示した。この目的のために、サルＶＥＲＯ細胞を、ウイルス上清の幾つかの希釈液で感染させた。１０^-2の希釈の場合には、独立したクローンが得られたが、その夫々は単一のウイルス組み込みプロファイルから出発したものである。一方では、ウイルスの構築物を切断する制限酵素と、他方では宿主細胞のゲノムＤＮＡの中を組込み部位から様々な距離で切断する制限酵素によって、組込みがあったのと同じくらい多くの様々な大きさの制限フラグメントを得ることができた。この場合、ＸｂａＩ酵素およびＳａｌＩ酵素を使った。６．ウイルスの力価安定性（マスターバンクシステム(MASTER BANK SYSTEM)）生体内で起こりうる病原発生を研究するために、同系統のウイルス産生細胞が構築され、複製しやすいウィルスをなくすために、次のような方法によって広範囲にわたって制御された。３Ｔ３・ＢＡＧ細胞に対するモビリゼーション試験ＮＩＨ３Ｔ３で増幅新生マウスの腹膜内接種この細胞バンク（“Master Cell Bank”；ＭＣＢ）から出発して、実際に役立つ細胞バンクが作られた。得られたウイルス力価は数か月安定であり、その次数は、２０×１０⁶から３×１０⁷ｃｆｕ／mlである（初期の稀釈は、１０^-6でのみ系統的に増殖された）。結果は、１０^-7の希釈液を含んだアッセイでも得られる。このレベルの強度において、力価は数か月間著しく安定である。＜考察＞１゜．ウイルスの構築ウイルスの構築は、ＰＢＳ、パッケージング配列、供与継ぎ目部位といった重要な配列の保存の原理に基づいており、また他の著者が示したように、維持することによって転写物の安定性に寄与する長いｇａｇ断片の保存に基づいている（McLachlin et al.，1989に概説されている）。同じレトロウイルス骨格から誘導された幾つかの他の構築物が、以前に作成されている。その初期のものは、３´ＬＴＲの上流および下流に長いレトロウイルス配列が隣接しており、Ｐｕｃ１９およびＰｕｃ１８の２つのポリリンカーが存在している。この構築物は非常に不安定で、感染性も控え目であった。ＦＯＣＨ２９に類似した変形が組み立てられた。これは、フレンドウィルス“ クローン５７”株の受容体スプライシング部位を含む大きな配列の挿入を除けば、全ての点において類似していた（Sitbon et al．）。その結果得られたプラスミドは、ｐＦＯＣＨ２９ＳＡ−Ｎｅｏと命名された。この構築物の感染性は、ｐＦＯＣＨ２９−Ｎｅｏよりも顕著ではないことが分かった。しかし、この相違はＰＣＲによる初期のスクリーニングのデータで認められているだけである。２゜．生産クローンの選択結果の章でのべた方法による生産クローンの一次選別では、ポリメラーゼチェーン反応が用いられる。使った条件によって、この方法の分析能力は、最小のレトロウイルス力価が略１０⁴ｐｆｕ／mlに相当する閾値に制限される。この方法の潜在的な欠点は、特に４０サイクル増幅するとき、ＰＣＲが厳密に定量的特徴をもっていないことと結び付いている。結局、高生産クローンを失う可能性は僅かではない。この不利益を一部補うために、ＰＣＲのための独立した二つのプライマー対に基づく一次選別法が採用された。３゜．感染効率とウイルスの安定性ＰＣＲについて、で、夫々が予想される寸法の増幅物を生じる二つのプライマー対を使うことによって、分析した断片の中への組込みの後に、ウイルスゲノムの全体の転位（再構成）がなかったことを確かめることが可能となる。この要素は、サザンブロット法によって最良に検査できる。この方法においては、数および大きさの両方において不適当なバンドのない場合に、大きな転位がなかったことが確認され、並びにヘルパーウィルスの存在を示唆する同じクローンから得た細胞内で種々の組込みが行われなかったことが確認される。最後に、構築に悪影響を及ぼし易い大きな転位がないことは、機能的なアッセイによって最も良く評価できる。このアッセイでは、マーカー遺伝子を染色体に組込んだ後に、ネオマイシン抵抗性の表現型を獲得したことが立証される。感染の効力は、ここでは３つの重要なパラメーターで評価された。即ち、１）力価が１０⁶ｐｆｕ／ml以上であることを証明できる従来のウイルス滴定；２）導入遺伝子の生産物が抵抗性を与える薬物で選別され、または選別されない感染細胞から得たゲノムＤＮＡの１０μｇの加水分解物とハイブリダイズさせた後に、得られたシグナルの強度を比較するサザンブロット。もし理論的に計算された量のプラスミド希釈物を加えたならば、ここで述べたよりも不十分な標準値が得られていたであろう。事実、プラスミドの希釈物は、扱うときのわずかな不正確さによって、まったく異なる誤った結果をもたらす。半定量的なＰＣＲの実験（３゜）に加味されたこれらの要素はすべて、二番目のクローンの非希釈上清が、マウスの繊維芽細胞に対して１００％に近い効力で感染することを示している。しかし、最初のクローンの場合には、力価が急激に低下し、最良のものでも徐々に減少した。この現象は、連続的な継代と共に初期のパッケージング能力を喪失すると思われる産生細胞を扱うときに、よく見られる観察結果である。この欠点は、初めに細胞を大量に生産すること、並びに注意深く凍結することによって補うことが可能である。それでも、力価は系統的に、繰り返して検査しなければならない。更に、両栄養性の生産系が選択された。しかし、環境栄養性生産細胞の初めのトランスフェクションは、多分「ピンポン機構」（McLLachlin JR）（２つのタイプの細胞が混ざることを防ぐために濾過した上清によって）によって、互いに何度も繰り返して、両栄養性細胞系の感染を可能にしたであろう。後者は、産生細胞感染力の増加だけでなく、レトロウィルス力価の安定にも寄与しただろう。しかし、ヘルパーウィルスが系統的に生産されていることが観察されており、この方法は動物や診療には使えない。この構築物の全く特別な効力は、特に次の理由から、強調に値するものである。即ち、これはフレンドウィルスのＦＢ２９株の骨格は、パッケージング系を確立するのに使われた骨格と異なっているからである。複製能力のあるウィルスを生産するような潜在的組み替えの危険性はかなり低減されているので、取扱いの安全性は更に一層改善されている。マーカー遺伝子、センス若しくはアンチセンスのｃＤＮＡ配列、または標的細胞内でイントロンを除去されてｃＤＮＡを派生するような７ｋｂ以下の小さく且つ複雑でない（イントロンの数が少ない）ゲノムＤＮＡフラグメントの導入は、前述の方法から出発することによって達成され得る。安定な転写物の生産のためにイントロン配列の保存が重要である場合には、７ｋｂ以下の前記小さいゲノムフラグメントは、ウィルスの転写に関して逆の転写方向で導入することが必要であろう。一番良いのは、３´ＬＴＲをＵ３から削除し、ゲノムフラグメントを転写プロモーターおよび／またはエンハンサーと同じ方向に置いた構造を用いて、ウイルスのＬＴＲに依存したセンス転写と、追加したプロモーターに依存するアンチセンス転写とを拮抗させないようにすることである。３´ＬＴＲのＵ３領域のプロモーターまたはエンハンサー配列の全てか一部を削除することは、レトロウィルスの組込みの後の顕著な安全性を保証する。この場合、導入された遺伝子の発現は、構築物内における外因性のプロモーターおよび／またはエンハンサーの制御下に置かれる必要がある。４゜．組込み部位霊長類細胞に感染した後のウィルスの組込み部位の数の研究によって、高い感染力価をもった不完全なウィルスの生理学や、これらのウィルスをヒトの治療に適用する安全性とに非常に関連した情報が提供された。Ｂ）追加のレトロウィルス構築物Ｂ１）一般的な概念と多方面にわたる利用１．自己不活化レトロウィルス構造（ＳＩＮ）命名：図６に示したＦＯＣＨ２９−ｄｅ１Ｕ３。レトロウィルスのゲノム遺伝物質の複製生理学の観点から、転写のエンハンサーウィルス配列を削除するような修飾を、３´ＬＴＲに導入した。ウイルス複製は、感染の標的細胞のレベルにおいて、その二つのＬＴＲが初期３´ＬＴＲの配列から発生する組み込まれたプロウイルスを導く。従って、この欠損は、３´ＬＴＲ配列を含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを有するプラスミドに作られた。こうして得られた３３９塩基対を短縮されたＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントが切除され、基本のベクターと同じ方法に従って、５´ＬＴＲとその隣接配列を有するプラスミドに連結された。実際には、ウィルス転写が起こって“読み通し”転写が行われるように、５´ＬＴＲのエンハンサー配列はそのまま残された。こうして、感染ウィルス粒子はパッケージング系のレベルで形成された。選ばれた構造設計において、ＴＡＴＡボックスは粒子中に残したが、ＣＡＡＴボックス（Yu et al.，1986）については、ＣＡＡＴボックスを取り除くＢｓｓＨＩＩ酵素（生来のウィルス配列の8203における独特の部位）を用いて取り除いた。ＢｓｓＨＩＩ酵素によって生成した突出した５´付着端は、デオキシヌクレオチドの存在下において、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントによって埋められ、“鈍端”にされた。上流に使われた制限酵素は次の通りである。・7864位のＥｓｐＩ（＝ｉｓｏ−ＣｅｌII）は。これは、逆方向反復塩基配列（ＩＲ）の開始点のすぐ後に位置している。ＥｓｐＩ酵素によって生成した突出した５´付着端は、デオキシヌクレオチドの存在下においてＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントによって埋められ、“鈍端”にされた。・7984位のＥｃｏＲＶ_oこれは、切断が中断される直接反復塩基配列の中間に位置している。ＥｃｏＲＩＶ酵素によって生成した末端は鈍端である。上流と下流の末端は両方とも鈍端であるので、この構築物は直接連結して閉鎖することが可能であり、その後はＵ３領域に大きな欠損を有することになる。第一バージョンのｄｅｌＵ３（５´でＥｓｐＩ欠落／３´でＩｓｏ・ＣｅｌII 欠落）を機能について研究した：即ち、ウィルスの感染および組み込みと、残余発現（residual expression）である。生じた欠損によって、事実上、ウィルスのＵ３配列の全部が除去された。これはレトロウィルス構築物の安全性の点において理想的である。我々は、核の位置シグナルをもったβ−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子をこの構造に導入することは、パッケージング系でのウィルスの転写に悪影響を及さないことを示すことができた。事実、この生産細胞は、トランスフェクションの後に、レトロウィルス構造の遺伝子の存在だけでなく、その転移遺伝子の発現をも確認する青色を呈する。遺伝子の組込みは、分子的方法、特に次のプライマーを用いたＰＣＲで研究された。下記配列をもったβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の中に存在するオリゴ・センス：５´−ＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＡＴＣ−３´ ウィルスのＬＴＲの中に存在し、ＲとＵ５の開始点（ＬＴＲ−５０８）の間と重なるオリゴ・アンチセンス：ＥｓｐＩ／ＢｓｓＨＩＩの削除によって調製された領域にある５´−ＣＡＧＣＧＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＧＣ−３´ 例えば、ＥｃｏＲＶによる欠損の場合のように、ウィルスのエンハンサーを不活化し、むしろ短い欠損を作る代わりの構造は、感染の標的細胞内でウィルスがバックグラウンド転写活性の保持を導く。一方、１Ｕ３の第一バージョンと称する変形における配列に対して、更にＴＡＴＡボックスを取り除く欠損を加えることは、安全装置を追加することを意味する。しかし、このような構築物が形成されれば、かなりの力価の減少が起こるかもしれない（Yee et al.，1987）。内部プロモータを有するＳＩＮ構築物これらの構造を作るのに使われる内部のプロモーターは、例えば、プラスミドｐＥＲＣＡＴ２ＤＥ（ｃ）（Maekawa et al.，1989）から得たＥＧＦ（上皮成長因子）レセプターのプロモーターである。上流のヌクレオチド-2200及び-15の間に位置するプロモーター配列（2.2kbのＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩフラグメント）だけが選択された。プラスミドｐＥＲＣＡＴ２ＤＥ（ｃ）に含まれる、下流エンハンサー配列は含めてられていない。他のプロモーターは、遍在するＰＧＫプロモーター（ホスホグリセレートキナーゼ）である。２．現存する構築物の定義２゜−１：特に、３´ＬＴＲから上流にあるＬＴＲを更にもっと小さくして構造を作り、ＦＯＣＨ２９−ＰＬと命名し（ＦＯＣＨ２９ｐｕｒｅ・ＬＴＲｓについて）、これを図７に示した。この構築物により、ウィルスＬＴＲの上流にあるエンベロープ末端の104を含む１４０塩基を切除することの、遺伝子的安定性に関する有用性を評価することが可能になった。この構築物は、Ｂ１−１で述べたＥｃｏＲＩ−ＰｖｕIIフラグメントを含むプラスミドＰｕｃ１９から作成された。制限酵素ＥｓｐＩ（またはＩｓｏＣｅｌII ）によって、7864（即ち、ウィルスＬＴＲの＋２３）の位置を酵素的に切断した。５´末端において、ＥｃｏＲＩ切断によって生成した塩基は、ＬＴＲの２３塩基に相補的な標準的の合成二本鎖オリゴヌクレオチド（140塩基で、その103塩基はエンヴェロープの塩基）に人工的に加えられた。３´末端において、このオリゴヌクレオチドはＳｐｅＩの付着端に相補的である。このオリゴヌクレオチド配列は次の通りである。オリゴ・センス：５´−ＡＡＴＴＣＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＡＴＴＧＣ−３´ オリゴ・アンチセンス：５´−ＴＡＡＣＣＡＡＴＴＣＧＧＴＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡＴＴＧ−３´ ２°−２．パッケージング配列は無傷で保存しながら、ＧＡＧを短縮した。これをＦＯＣＨ２９−ＳＧ（ＦＯＣＨ２９ｓｈｏｒｔＧＡＧ）と命名し、図８に示した。基本的な構造ＦＯＣＨ２９は、ＧＡＧ配列の半分を残している。ＭＡｐ１５およびｐｐ１２の転写と、多分その翻訳は保持されている。ＧＡＧの重要な部分を保持することは、レトロウィルス構造の安定性に有益であるといわれている。しかし、一方では、外因性配列のベクター化に利用し得る余地の点において不利かも知れない。他方では、構築物の安全性の関しても、複製能力のあるウィルス粒子を生成するレトロウィルス配列との組替えを促進する可能性が非常に増大する点でも不利であろう。ＦＯＣＨ２９は、ＦＢ２９株のＧＡＧ配列の半分よりも多くない配列を有しており、非常に顕著な効能の点で有利である。ＦＯＣＨ２９の産生クローンの培養は、１８か月維持したときに、複製能力のあるウィルス粒子を形成し、従って使用の安全性にとって有害なレトロウィルス配列との組替えをもたらさなかった。ウィルスの安全性を改善する観点から、ＦＢ２９のＧＡＧを、1031位にある独特のＡｈａIII（またはｉｓｏＤｒａｌ）部位で切断して、代わりの構造を作成した。この場合、ＧＡＧ配列の１／４のみが保存された。ＡｈａIIIで生成した断片は、ＦＯＣＨ２９のクローニングで使われたＰｖｕIIと同じように鈍端を有しており、その構造は正確に重ねられる。上流のクローニング部位は修飾されておらず、Ｐｕｃ１９のポリリンカーの下流の鈍端ＳｍａＩ部位が使われた。２゜−３．ポリシストロニック・メッセンジャーＲＮＡに導くＩＲＥＳ（Intra Ribosome Entry SiteまたはRibosome Landin g Pads）を含む構造ＩＲＥＳを含むレトロウィルスの構造は、原理的には、問題の幾つかの遺伝子の導入のために設計されており、ここでは転写が一つのプロモーターから始まるので、転写レベルが均衡することが望ましい（Morgan et al.，1992）。最適な例証となる実例は、ヘテロ二量体または三量体における機能的分子の異なる鎖をコードしている配列の導入である。ポリシストロニック（polycistronic）ベクターは、インターロイキン１２またはＩＬ１２の二つの鎖（一方はｐ３５で他方はｐ４０）を導入するために作られた。導入されたｐ３５フラグメントは、次のようなフラグメントであった。５´：イン・フェーズ（in phase）の２つのＡＴＧ（メチオニン）コドン配列（100-10 2、202-204）の+187位にあるＰｓｔＩ（使われたのは202-204である）。３´：+ 1065位置にあるＥｃｏＲＩ（ストップコドンＴＧＡは904-906）。導入されたｐ４０フラグメントは、隣接する５´配列または３´配列を欠いている。配列の+1位置（ＡＴＧは＋９）にあるＸｂａＩ部位；そして、３´：+100 7（ストップコドンＴＡＧは993-995）のＥｃｏＲＩ。ｐ４０に対する相補的なＤＮＡは、最適化されたＡＵＧコドン（配列Kozak ＣＣＡＴＧＧ；ＮｃｏＩ制限部位に相当する）を有する。次の２つのタイプのＩＲＥＳが使われた（Borman et al.，1992；1993）。・ポリオウィルスから誘導された正確な位置を必要とするＩＲＥＳ。リボゾーム結合部位は560で、ＡＵＧは743に結合する。これは、ｐ３５（ＦＯＣＨ２９−ＮＩＲＩＬ１２）の上流、またはネオマイシン抵抗性遺伝子（ＦＯＣＨ２９−ＩＬ１２−３０ＩＲ４ＯＮ）上流の何れかに使用された、フラグメントＫｐｎＩ（+70位置）／ＢａｌＩ（+630）である。・ＥＭＣＶ（脳炎心筋ウィルス）から誘導されたＩＲＥＳ。ここでは、ＥＭＣＶ由来のＩＲＥＳ配列は、発現する遺伝子のイン・フェーズでの非常に正確な位置決め要求する（ＥＭＣＶ由来のＩＲＥＳ配列は、キャップ非依存性翻訳エンハンサーのためのｐＣＩＴＥ（Novogen，USA）の名称で市販されており、ここで使われているのとよく似ている）。ｐ４０のＡＵＧの最適化された性質の観点からは、どのような構造であろうとＩＲＥＳ−ＥＭＣＶと結合するのはこの鎖である。使用したＥＭＣＶフラグメントは、上流にＥｃｏＲＩ部位（+280の位置）を含み、下流のＡＵＧの直後にＮｃｏＩ部位を含んでいる（４番目のコドンの２つ目の塩基に相当するＣ残基を残している）。下記の３つの構築物が作成された。図９１）ＦＯＣＨ−ＩＬ１２：ｐ３５／ポリオウィルスのＩＲＥＳ／ｐ４０：ＬＴＲプロモータ図１０２）ＦＯＣＨ２９−ＮＩＲＩＬ１２：ネオマイシン抵抗性遺伝子／ポリオウィルスのＩＲＥＳ／ｐ３５／ＥＭＣＶのＩＲＥＳ／ｐ４０図１１３）ＦＯＣＨ２９−３０ＩＲ４０Ｎ：ｐ３０／ＥＭＣＶのＩＲＥＳ／ｐ４０ポリオウィルスのＩＲＥＳ／ネオマイシン抵抗性遺伝子これらの構造はすべて、Ｐｕｃ１８の中間構造を利用している。ここで、１゜）ＮｏｔＩ部位はポリリンカーの夫々の末端、即ち、上流のＨｉｎｄII Iと下流のＥｃｏＲＩに導入された。２゜）ＳａｌＩ部位は、ポリリンカーの下流のＥｃｏＲＩ部位とＮｏｔＩ部位の間に導入された。３゜）塩基モチーフ（Ｐｕｃ１８−ｂａｓｅ）はクローニングされ、ｐ３５／ポリオウィルスのＩＲＥＳ／ｐ４０を含んでいる。この塩基モチーフから始めると、ＦＯＣＨ−ＩＬ１２の構造は、ＮｏｔＩによる分解による切除によって得られる。得られたフラグメントと、ＮｏｔＩで開かれたベクターＦＯＣＨ２９とが結合し、リンカーはＸｂａＩ部位に導入された。ＦＯＣＨ２９−ＮＩＲＩＬ１２およびＦＯＣＨ２９−ＩＬ１２−３０ＩＲ４０Ｎの構築物は、夫々“Ｐｕｃ１８−塩基”の上流にあるＳｐｈＩ部位にネオマイシン抵抗性遺伝子／ポリオウィルスのＩＲＥＳの断片を加えた後に、およびＰｕｃ１８−塩基”の下流にあるＳａｌＩ部位にポリオウィルスのＩＲＥＳ／ネオマイシン抵抗性遺伝子の断片を付加した後に得られた。２゜−４．ＧＡＧ−ＰＯＬ構造の新規なパッケージングラインの開発への寄与ヌクレオキャプシッド蛋白質および逆転写酵素は、相補ラインのＦＢ２９株の配列から誘導された。現在マウス細胞由来の入手可能なパッケージングラインには、次のような欠点がある。・不完全な構造に伴う、内因性レトロウィルス配列（ＭＣＦ、ＶＬ３０、トランスポゾン）の同時パッケージングである。これらの同時パッケージされる配列は、導入または転移の標的細胞に感染の後、同様に組み込まれるらしい。・これらのラインにおいて、レトロウィルスＬＴＲによって導かれる相補性蛋白質、特にエンヴェロープ蛋白の発現。３番目に生成したラインは、幾つか変異と欠損部位を含む相補的なレトロウィルス構造を用いるが、ＬＴＲ配列の保存はそれ自体が潜在的に不利であり、事実、相補されるべき不完全な構造と遺伝的組み替えを生じる可能性がある。これらのすべての要索は、レトロウィルスベクターを用いた遺伝子導入の条件を改善する試みにつながる。パッケージングラインは、３番目の生成ラインの原理に基づいて開発された。つまり、２つの部分（２つの連続したトランスフェクション段階）において、相補蛋白質の配列の切断を伴う。２゜−４−１．初めの段階では、フレンドウィルスのＦＢ２９株から誘導された配列の使用を含む段階が記述される。特に、基本的細胞“ＤＯＧＰ２９”の開発である。ＤＯＧＰ２９は、以下に詳述するＬＴＲ−ＳＤ−欠損ｐｓｉ−ＧＡＧ／ＰＯＬ構造（および選別したフレオマイシン抵抗性遺伝子の同時トランスフェクション）の、犬胎児細胞でのトランスフェクションによって得られ、次の基準によって最適化された：１−内生レトロウィルスの欠如。２−粘着細胞。３−早い成長。４−安定で均質な形態。５−簡単にトランスフェクションすること。６−非常に多くの継代に耐えること（アッセイのための強い人工的な継代）。７−任意にＬＴＣ−ＩＣ（ヘマト）を維持することができること。マスター細胞バンクシステム（Master Cell Bank System）は、ウィルスの相補蛋白質合成の強度と逆転写酵素（ＰＯＬ）の安定性にしたがって、選別選ばれた犬細胞のクローンから作られた。ヌクレオキャプシッド蛋白質および逆転写酵素のための相補的なｇａｇ／ｐｏｌ構造は、フレンドウィルスのＦＢ２９株から誘導される。基本構築物は、パラグラフで述べた構築物（ＬＴＲが残っているか、またはＲＡＲ−ベータプロモーターの配列に置換された構造）から組み立てられた。ｇａｇキャプシッド核蛋白質をコードする配列（+619から始まる）の上流にある、パッケージング配列の大きな削除は次のように行われた。+280の独特の部位（またはＩｓｏｃｅｌII）をＳｐｅＩで切断し、ＰｓｔＩで+560-561を切断して 280塩基を除去した。合成リンカーのＳｐｅＩ−ＰｓｔＩ、５´−ＣＴＡＧＴＧＣＡ−３´が合成された。プラスミドにアニーリングして、ＨｉｎｄIIIで再び切断した。ＧＡＧ配列およびＰＯＬ配列の主要な部分を含む、３番目のフラグメントＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIIIとの結合が行われた。その後、２番目の段階（形質転換と正の組替え体の選別の後）において、ＧＡＧのＡＴＧを含むＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ（561-737）は、ＧＡＧ配列の全体を再構築するために、本来の位置であるＰｓｔＩ部位にクローニングされた。この小さな対称なＰｓｔＩ−ＰｓｔＩフラグメントのクローニングの方向は、ＨａｅII（ 720位；２番目の部位は4291にあるが方向を妨げない）、ＡｈａIII（完全なＦＢ２９内の独特の部位で、1031にある）またはＥｓｐＩ（完全なＦＢ２９内の独特な部位で、ＬＴＲの7864にある）による酵素分解によって確立された。Ｐｕｃ１９のＨｉｎｄIII部位での、完全なＦＢ２９ゲノムに相当するＤＮＡ配列のクローニングに用いた方法の結果として、ＰＯＬ配列の末端は次のようにして回復され。最初にＨｉｎｄIII（5060）とＳｎａＩ（＝iso Bst11 071）（6335における独特の部位）で切断した。精製の後、このフラグメントを再びＳｍａＩ（6079）で切断し、最小のエンヴェロープ配列（244塩基）を含む1 019塩基のフラグメントを得た。このフラグメントは、Ｐｕｃ１８のポリリンカーにおけるＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIIIにサブクローン化された。ＳＶ４０のポリアデニレーションシグナルは、この構造の下流に並置された（プラスミドｐＣＲＩＰｇａｇ−２から切り取られた：Danos and Mulligan，1988）。ＰＯＬおよびポリＡ配列は、１単位としてｐＵＣ１８から切り取られ、先のパラグラフで述べたように、プラスミドｐＵＣ１９／部分的に削除されたＬＴＲ／ｄｅｌ−ｐｓｉ／ＧＡＧ／２／３−ＰＯＬと結合された。。２゜−４−２．ごく普通の両栄養性エンヴェロープ配列が、ｐｓｉ−ＣＲＩＰ系で使われたのと同様に、ＳＶ４０の下流のポリアデニレーション部位をもつウィルスの５´ＬＴＲの転写による配列の補充に用いられた（Danos and Mulligan，1988）。Ｂ２）重要な遺伝子の取り込み次の何れによって構築するか：・生来のＬＴＲをもつ基本のベクターか、ウィルスのエンハンサーを削除したＳＩＮの変形を使い、・ＳＩＮベクターから誘導された構築物のために、様々な内部プロモーターを使い、・重要な遺伝子を、ウィルスの転写に関してセンスまたはアンチセンスの転写方向に位置付ける。１゜．核位置シグナルを伴うβ−ガラクトシダーゼをコードしているｃＤＮＡ（図１２、１３）２゜．細胞毒性を持つ薬品にたいする多面的な抵抗性遺伝子から誘導されたｇｐ１７０をコードするｃＤＮＡ（例えばｐＭＤＲ１から誘導された挿入物）（図１５）３゜．ゲノム配列とメタロチオネインIIＡをコードするｃＤＮＡ（図１６、１７、１８、１９）４゜．相補性グループＣのファンコーニ病の患者に欠けている、プロモーター要素を含み又は含まないＦＡＣＣ遺伝子のｃＤＮＡＦＯＣＨ２９レトロウィルスの骨格は、次ａ）またはｂ）のようにして使用された。ａ）ウィルスの長い末端繰り返し構造（ＬＴＲｓ）の活性によって規定される、転写を伴う生来の形で使われる。この構築によって、フレンドウィルスのＬＴＲｓによる造血細胞内でのＦＡＣＣ遺伝子の発現の効果を評価することが可能になった。ｂ）ウィルスエンハンサーのＵ３欠損バージョンで使われる。これによっては、転写命令の有用性を、遍在的に機能している普通の安定した基本的機能の遺伝子から得た内部プロモーターによってテストすることを可能にした。これは、ＦＡＣＣ遺伝子自体のプロモーターか、ＭＴ・IIＡ（メタロチオネインIIＡ）プロモーターか、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）プロモーターの何れかである。得られた発現のレベルが表現型の修正に適合するならば、ＦＡＣＣ遺伝子のプロモーターを使った構築物は好ましいものである。ｃＤＮＡの選択３つのタイプのメッセンジャーＲＮＡに相当する３つの異なった一本鎖ＤＮＡが、ファンコーニ病の相補性グループＣのためにクローニングされた。一本鎖ＤＮＡには関係なく、オープンリーディングフレームは同一である（Strathdee et al.，1992）。メッセンジャーの一つは、培養株の細胞の中で非常に優性である。５´末端は、エキソン１の一部を含むだけである。一方、コードされていない３´末端はとても大きい。隣接している３´配列は、転写の安定性にとって決定的に重要と思われる。何れの一本鎖ＤＮＡを選んだとしても、後者はＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩでの切断によって切除され、次のようにして、アンチセンス方向でレトロウィルス構造中に導入される。上流では、ＸｈｕＩがＳａｌＩ切断によってできた末端と接着する。下流では、ＳｐｈＩ部位は鈍端であるから、同じく鈍端であるＢａｍＨＩ部位に付着される。１．多くの一本鎖ＤＮＡは、４．５ｋｂ（略レトロウィルスベクターの上限に相当する大きさ）である。２．他の２つのメッセンジャーの一つに対して相補的なＤＮＡは、エンハンサーのないレトロウィルス構造（ｄｅｌ−Ｕ３）の中で、隣接する５´配列および-1エキソンをＦＡＣＣ遺伝子の発現に使うことの潜在的な利点を調べるために、センス方向に用いられた。クローニングに際しては、上流ではＸｂａＩで切断することによりＢａｍＨＩに適合する鈍端とし、下流では、ＳａｌＩ−ＸｈｏＩの付着が行われた。３．最後に、もっと簡単に、５´と３´に隣接する領域をもたないＦＡＣＣ遺伝子をコードする領域に相当する、相補鎖ＤＮＡを、・生来のレトロウィルスベクターの中に、レトロウィルスＬＴＲＳに制御された転写においてセンスの位置に、・或いは、エンハンサーの存在しないレトロウィルスベクター中に、遍在するメタロチオネイン又はＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）のプロモーターに支配された転写に関してセンスの方向に導入した。５゜．ペリツェウス・メツバッハー病（Pelizaeus-Metzbacher Disease）（ Dautigny et al.，1986；Hutson LD et al.，1989；Morello et al.，1986）の患者の、ＰＬＰ遺伝子を欠損したｃＤＮＡ高い特異性をもった熱帯の天然のプロモーターの制御下でグルココルチコイドに誘導されるＰＬＰ遺伝子を発現するためと、脳に固定移植した後に、インビボでＰＬＰを発現しているオリゴデンドロサイト又はシュワン細胞の監視を可能とするために、構築物（図２４）が組み立てられた。この目的で、核位置シグナル（ｎｌｓ−Ｌａｃｚ）を具備したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＬＴＲの直接の制御下に置いた。ＰＬＰプロモーター／相補鎖ＤＮＡ−ＰＬＰ配列は、ポリリンカーの下流に置かれた。ｎｌｓ−ＬａｃｚのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは、ｐＳＰＴ１８のポリリンカーのＢａｍＨＩ部位にクローニングされた。ＰＬＰプロモーターを有するＡｌｕＩ／ＢａｍＨＩと、ＰＬＰに相補的なＤＮＡを有するＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント（ｄＮＴＰｓの存在下でクレノウで処理した）は、結合の後、上流のＳｍａＩ部位（ＡｌｕＩの場合）と、ｐＳＰＴ１８の下流のＥｃｏＲＩ部位にクローニングされた。挿入物の全体が、下流のＥｃｏＲＩで除去して挿入物の末端をクレノウ（鈍端）で処理し、次いで上流のＳａｌＩで切断することによって切除された。そして、ＦＯＣＨ２９のポリリンカーの上流のＳａｌＩに適合させ、下流のＳｐｈＩはクレノウで処理された（鈍端）。ＦＯＣＨ２９のＵ３欠損バージョンのその他の構造は、逆の方向で、ＰＬＰプロモーターと、これに続く相補鎖ＤＮＡ関連遺伝子の初めのイントロンを含む配列とを含むように計画される。このイントロンの存在によって、転写物の安定性および発現が改善され、別のスプライシングＰＬＰ−ＤＭ２０が可能になる。６゜．インターロイキン１２の夫々の鎖のｃＤＮＡ：ポリシストロン性ベクター内のｐ３５とｐ４０、ＩＲＥＳを含む構造の例として前述した構築物。例えば次のような遺伝子を含むことによって、他の構築物を得ることができよう。７゜．ＴＩＭＰ：メタロプロテイナーゼの組織インヒビター８゜．ＴＮＦ：腫瘍壊死因子９゜．ＩＦＮ−ガンマ：ガンマインターフェロン１０゜．ＩＦＮ−Ｂ：ベータインターフェロン１１゜．例えばインターロイキンのようなサイトカイン遺伝子Ｃ）標的細胞本発明のベクターは、異なる幹細胞をトランスフェクトするために使用された。例として、次の細胞があげられる。ａ．ヒト由来の造血幹細胞レトロウィルスベクターＦＯＣＨ２９が初め作られたのは、通常使われているベクターを用いるよりも、より効率良く造血幹細胞に感染し、これらの細胞の中で問題の遺伝子の高い発現を導くウィルス株を研究するためであった。この想定された効果は、ウィルスの調節配列、特にＬＴＲのＵ３配列の特別な誘発の結果として期待された。ネオマイシン抵抗性の遺伝子（トランスポゾンＴｎ５から得たネオマイシン燐酸転移酵素）が、前に述べたベクターＦＯＣＨ２９−Ｎｅｏを作るために導入され、遺伝子マーカーとして利用された。一年間、ヒト由来のＣＤ３４+造血幹細胞の形質導入のためにの最適条件が研究され、次のものから得られた様々な方法に従って選択された：１１）臍帯の血液、２１）骨髄（同種異系移植）、３１）化学療法と成長因子の組み合わせによって動く末梢血液の幹細胞。次の２つの問題に直面した。（１）異なるウィルス感染の進行の比較１−１．ウィルスの上清の使用と、共培養（ウィルスを連続的に培養するパッケージング細胞に対するもの）１−２．成長因子の異なった組み合わせによる細胞の刺激（２）導入成果の評価２−１．形質導入した細胞がどの分化の段階にあっても、絶対的に生物学的および分子的方法２−２．長期培養の進展に伴って多機能性を示すことができる細胞、特にマウス由来の異種ストロマと、細胞のクローン原性の配列分析得られた結果（詳細は以下に述べる）は、特にウィルス上清から出発する場合に、レトロウィルスベクターが造血前駆物質に対して顕著な効果をもたらすという初めの仮説を立証した。実験プロトコール、並びに得られた結果の詳細を以下に示す。＜実験のプロトコール＞（１）異なるウィルス感染の進行の比較１−１．ウィルスを連続的に産生するパッケージング細胞についての、ウィルスの上清の使用と共培養実際は、共培養の使用は、次の点において、ヒトで使用するには大きく不利であることが示された。１）異種細胞による、造血細胞の潜在的な雑菌混入２）共培養で使用する前にＸ線を照射（または細胞毒性薬剤による処理）したにもかかわらず、これらの生産細胞の増殖が潜在的に持続すること３）欠陥のあるウィルスを補なう配列がある結果、複製能力のあるウィルスの生成の危険が非常に増し、内因性レトロウィルス配列、または培地内で偶然に混入したウィルスと相同組替えおよび非相同組替えを誘導する可能性がある（ Temin et al.，1990）。並行して、唯一の細胞源（臍帯の血液の独特のｓａｃから、またはサイタフレイシス（cytapheresis）から選択されたＣＤ３４+の幹細胞）の感染の比較を行ない、これらをあらゆる点から見て、２つの等しいサンプルに分けた。その一つは、ウィルス生産細胞の接着性サブ層と接触させた。このウイルス産生細胞は、１％のゼラチン上で、２ｍｇ／ｍｌのポリブレン存在下に４８時間、８０％集密状態にまで増殖したものである。他のサンプルについては、同じ濃度のポリブレン存在下で培養フラスコの中に入れ、産生細胞の培地から新しく集めて0.45μｍ膜（上清とともに取った可能性のある細胞全部を除去した）を通して濾過したウィルス上清（培地を加えて薄めなかった）で覆った。ウィルス上清による感染のプロトコールは、３６時間にわたる４サイクルの繰り返しに基づいている。つまり、一日に２サイクルを８時間おきに２日続ける。造血細胞は入れずに、上清を単純に培養ウェルに加えた。ウィルス感染に使用した培地は、感染様式の如何にかかわらず、造血幹細胞について最適化された培地である。すなわち、仔牛胎児血清（Boehringer-Mannhei m）を１０％、馬血清（GIBCO-BRL）を１０％補充したIscoveの修飾ＤＭＥＭ（GI BCO-BRL）である。夫々のパラメータは、少なくとも２つのウェルで同時に２回テストされた。感染の後、細胞は異種ストロマ上での長期培養のために移植された。１−２．成長因子の異なった組み合わせによる細胞の刺激成長因子は、感染するであろう造血前駆細胞の全能性を最高に保持するために、最低量を使用した。その目的は、既に自然にサイクルに入っている細胞を最良に取り扱うことである。比較は、以下の同じ感染条件のもとで同じ細胞源について行われた。１゜．成長因子の異なった組み合わせ（幹細胞因子：ＳＣＦ；白血病阻害因子：ＬＩＦ；インターロイキン３：ＩＬ３；エリスロポエチン：Ｅｐｏ；顆粒細胞マクロファージ刺激因子：ＧＭ−ＣＳＦ）すなわち、・ＳＣＦ＋ＬＩＦ・ＳＣＦ＋ＬＩＦ＋ＩＬ３・ＳＣＦ＋ＬＩＦ＋ＩＬ３＋Ｅｐｏ・ＳＣＦ＋ＬＩＦ＋ＩＬ３＋ＧＭＣ−ＳＦ２゜．これらの異なる因子の、異なる濃度・ＳＣＦ：５０ｎｇ／ｍｌ；２５ｎｇ／ｍｌ；１０ｎｇ／ｍｌ；５ｎｇ／ｍｌ・ＬＩＦ：１０Ｕ／ｍｌ；５Ｕ／ｍｌ；１Ｕ／ｍｌ・ＩＬ３：１０Ｕ／ｍｌ；ＩＵ／ｍｌ；０．１Ｕ／ｍｌ・ＧＭ−ＣＳＦ：１０ｎｇ／ｍｌ（２）導入成果の評価２−１．感染後すぐ全ての細胞を一緒にとり、分子、生物学手法に基づいて、トランスフェクションした細胞の初めの割合を調べた。・二つの形式に従ったＣＦＵ−ＧＥＭＭ（顆粒−赤芽球−単球−巨核細胞の混合コロニーの存在のアッセイ）・選別なし・ネオマイシンを初めに大量に（１mg／ml）使うことによる薬理学的選別・夫々のコロニーでの、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）非選択培養で継代したメチルセルロース上でのＣＦＵ−ＧＥＭＭのアッセイから始めた。継代培養の後、各コロニーを、成長因子による刺激によって、１ウェルあたり約１０⁵細胞にまで増幅した。成長因子は、ＳＣＦ 50ｎｇ／ｍｌ；ＧＭ− ＣＳＦ 50ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ３ 10Ｕ／ｍｌ；Ｅｐｏ２Ｕ／ｍｌを含む。次いで細胞を溶解し、分析した（該当部分に示したプロトコールとＰＣＲプライマーを参照のこと）。２−２多能性を示しそうな細胞において：マウス由来の（ＭＳ５系）異種ストロマでの長期培養のアッセイが使用され、細胞のクローン原性の配列分析を行った。異種ストロマでの長期培養、予め１％ゼラチン膜に作られた接着性の単層。これらの培養株は、表面積が９cm²の“スライドフラスコ”（Ｎｕｎｃ）のなかで６０日間成育された。毎週表面の上清の半分を除去し、最低量の成長因子（幹細胞ＣＥII因子：ＳＣＦ５ｎｇ／ｍｌ；白血病阻害因子：ＬＩＦ５Ｕ／ｍｌ；インターロイキン３：ＩＬ３ 0.1Ｕ／ｍｌ、及びエリスロポエチン：Ｅｐｏ 0 .1Ｕ／ｍｌ）を含む新しい培地にとりかえた。長期培養株は、通常の培地または選択培地中において、ネオマイシン抵抗性にするためにＰＧＫ−ｎｅｏプラスミドでトランスフェクトされたストロマと共に増殖された。長期培養の評価は、次の基準に基づいている。・ストロマ細胞の表面に造血細胞の小島があるかの観察（Cobblestone）・ネオマイシン抵抗性遺伝子の存在について、薬理学的選択を伴うか又は伴わないで、決まった時間にＣＦＵ−ＧＥＭＭ配列アッセイを始めること。抽出された細胞を計数し、分析ウェル当り1000細胞を接種した。細胞は、次のようにして、一般に毎週取られている表面上清からか、或いは同様にストロマ（特にＤ６０長期培養が終わったとき）についた造血小島を分離するために回収した上清から得た。上清を全て取り、次いで培養皿をカルシウムを含まない１×ＰＢＳで１分から２分覆った。これによって、一部接着した細胞を引き離す。この２番目の上清を取り除いて１番目と一緒にし、殆ど壊れやすい細胞を保護する牛胎児血清の緩衝材を使って、全体を非常に遅い速度（1000回転／分）で遠心分離した。細胞沈殿物の一部をＣＦＵ−ＧＥＭＭのために移植し、その他の細胞は異種ストロマに再接種し、長期培養した。・ウィルス組込みの分子的特徴付けを、ＣＦＵ−ＧＥＭＭから取った個々のコロニーについて配列のＰＣＲアッセイで分析した（上記参照）。・最初、十分な数の細胞が得られたときに、長期培養株が多く残ったときは、細胞の一部をＦＡＣＳ分析に使った。＜結果＞１）．長期培養培養株は６０日間連続して維持され、この期間、ストロマを変えなかった。その日に培養を止め、残っていたすべての細胞をＣＦＵ−ＧＥＭＭに接種した。これによって、効果的な造血前駆細胞の形質導入が長期培養で維持され、造血前駆細胞内のＦＯＣＨ構造によって、遺伝子の発現が数か月に亘って保存されることが確かめられた。２）．異なるウィルス感染の比較２−１ウィルス上清の使用と、共培養細胞を加工することなく、２日間４サイクル繰り返す上清による感染は、パッキングラインとの４８時間の共培養に比べて著しい効果を示した。これらのデータは、次の事実によって確証された。１゜ネオマイシン抵抗性のストロマに対するネオマイシンによる選別の存在下で、長期培養が維持されたこと。Ｄ６０において、上清で感染された細胞株は生産性であったが、共培養によって感染されたウェルは非生産性であった。２゜コロニー、特に混合コロニーの数のＣＦＵ−ＧＥＭＭアッセイは、上清による感染の後には、４倍から５倍多かった。３゜継代培養してＣＦＵ−ＧＥＭＮから増幅した夫々のコロニーについてのＰＣＲによる、ウィルス組込みの分子評価。初めのアッセイの場合、上清による感染後には９０％に上る導入が検出された。２−２成長因子の異なった組み合わせによる細胞の刺激実験のプロトコールの章に挙げた多数の異なった組み合わせの中で、最小濃度で選択された成長因子（ＧＦｓ）の最小混合物は、ＳＣＦ 10ｎｇ／ｍｌ＋ＬＩＦ 10Ｕ／ｍｌである。事実、１Ｕ／ml〜１０Ｕ／ml濃度のＩＬ３存在下で感染させた後には、有為な長期培養は維持されなかった。これは、生産的な長期培養株が維持されずに、顕著な初期増殖が生じたことによる。更に、マウスの細胞による潜在的な汚染を除いて、異種ストロマによる前処理は効果がなかった。これらの結果は、次のことを示している。１゜．共培養ではなくウィルスの上清から出発することによって、長期培養の初期可能性を危険にさらすことなく、生産的なレトロウィルス感染を実行可能であること。２゜．ＦＯＣＨ２９構築物によってＣＤ３４+細胞から誘導したヒト造血前駆細胞のウィルス形質導入の効率、並びにこれら同じ細胞において、この構造物から出発した長期培養による問題の遺伝子の発現の効率。これらの要素は、ヒト造血幹細胞において、このレトロウィルスベクターを治療に使用する可能性があることを立証している。これは、移植ラベリング（graf t labelling）の臨床実験プロトコールで確認されるべきである。ｂ）上皮細胞１゜胞状上皮・ラット、犬、猿・ヒト起源２゜乳房の上皮・ラット・ヒト起源ｃ）腫瘍細胞１゜胞状腫瘍・ラット・ヒト起源２゜乳癌の細胞・ヒト起源ｄ）神経系の付随細胞１゜稀突起細胞前駆体２゜シュワン細胞これらの２つのタイプのマウス由来細胞を、レトロウィルスＬＴＲの神経親和性向性（neurotropic tropism）を評価するために、ＦＯＣＨ２９−Ｎｅｏ構築物で感染させた。問題の遺伝子の発現は、レトロウィルスＬＴＲによって制御されている。稀突起細胞は初期の培養から誘導された。シュワン細胞の場合はＭＳＣ８０系が使われた。感染の後、ＭＳＣ８０細胞は連続培養で維持され、４か月の間ネオマイシンによる選別を受けた。特徴的な細胞形態は、この長期培養の間維持された。これら神経親和性細胞の感染およびＦＯＣＨベクターに担持されたマーカー遺伝子の十分な発現の維持が成功したという予備的な証拠によって、治療に向けてた研究の持続が導かれる。ベクターＦＯＣＨ２９−ＰＬＰの構築が達成された。事実、ペリツェウス・メツバッハー病（Pelizaeus-Metzbach er disease）の患者にはこの遺伝子が欠けている（Saugier-Veber et al.，1994 ）。中枢神経系のミエリン合成に関与している膠幹細胞、または遺伝的に変化したシュワン細胞に対して、レトロウィルスによって正常な形の遺伝子を導入することが治療上有効であることは、ヒトの病気のマウスモデルにおいて評価されている（Jimpy mouse，Jimpy/MSD(Pham-Dinh et al.，1992) and Rumpshaker）。我々は現在、遺伝的に変化させたＭＳＣ８０細胞の、脳に脳固定再移植した後の生体内での運命を監視している。ｅ）繊維芽細胞１゜マウス起源２゜イヌ起源３゜非ヒト霊長類起源４゜ヒト起源ｆ）造血ストロマの細胞１゜マウス起源、ＭＳ５系において、造血幹細胞の長期培養に使われ、１年以上発現した。２゜研究所で確立された胎児骨髄繊維芽細胞の一次培養のイヌ起源３゜非ヒト霊長類起源４°ヒト起源ｇ）内皮細胞ｈ）間充織細胞ｉ）ケラチン細胞ｊ）肝細胞１）ヒト起源の系１゜Ｔリンパ球：Ｊｕｒｋａｔ２゜ナチュラルキラー細胞：ＹＴ２Ｃ２３゜単球マクロファージ：Ｕ９３７４゜赤血球巨大核細胞：Ｋ５６２これらの４つの細胞系は、１サイクルの感染または４サイクルの感染（２つのサイクルは８時間の間隔をおいて連続２日間）の何れかにおいて、ウィルス上清で感染された。感染の１６時間後に、細胞は下記の種々の濃度のネオマイシンで選別された：０．３ｍｇ／ｍｌ；０．５ｍｇ／ｍｌ；１ｍｇ／ｍｌ。トリチウム化チミジンによる標識分析は、感染１週間後に行った（つまり、選別の５日後）。このアッセイは、これら細胞系（Ｊｕｒｋａｔ及びＫ５６２）が、使用したネオマイシンが如何なる濃度であっても迅速に増殖することを積極的に示した。ネオマイシンによる３週間の選別の後、異なる濃度で選別されたウェルと、選別されていないコントロールのウェルとの間の細胞の生存率（懸濁液の細胞）の比較分析によって、実際に形質導入されたネオマイシン抵抗性を有する細胞の高い割合が示された。Ｔ細胞腫瘍系ＪＵＲＫＡＴＴ：７５〜８０％ＮＫ細胞ＹＴ２Ｃ２：３０〜５０％単球マクロファージＵ９３７：４０〜６０％赤血球巨大核細胞Ｋ５６２：７５〜８０％膀胱癌に対するレトロウィルス転移の適用のためのインビボのモデル膀胱は中が空洞の器官であり、簡単な尿道内プローブによって接近しやすいので、投薬の形式と、インビボでの直接内胞注入による遺伝子転移の効果とを逐一評価した。この評価には、幾つかのパラメーター系が含まれる。１゜“レポータ（reporter）”構造を輸送するウィルス上清の生体内内胞注入による、小胞ウロテリウム（urothelium）のレトロウィルス導入の効果２゜機械的な手術および上皮細胞への導入の無害性３゜ウィルス粒子の全身的拡散の欠如４゜健康な上皮と比較した、腫瘍細胞への優先的感染実際は、小胞性ウロテリウム（vesicular urothelium）を犠牲にして進行した表面の膀胱ガン（このケースでは９０％を占める）は、内視鏡の手術による完全な切除の後に再発する傾向を特徴とした進行を示す。再発および進行の危険性の高いグループは、ｐＴ１段階の腫瘍、ｐＴａ段階の多病巣性腫瘍、イン・サイトのカルシノーマまたは関連する異形成、および腫瘍の多重再発を定義し、またはこれを含む。このグループでは、内胞経路（endovesicular rout）による非特異的化学療法と免疫療法が、内視鏡手術の後の再発防止のための処置として用いられる。しかし、現在行われている内胞処置は、多様な腫瘍の再発を撲滅することはできず、あるケースでは腫瘍の進行も止められなかった。従って、前述のように、腫瘍の侵入を抑制するか（ＴＩＭＰ遺伝子、ＦＯＣＨ２９構造）、または内因性の免疫応答を刺激でき（既述のＦＯＣＨ２９−ＩＬ１２、およびＦＯＣＨ２９−ＩＦＮ−ガンマ構造）、あるいは腫瘍細胞の増殖のエンハンサーシグナルの形質導入を妨げる遺伝子の導入に基づく独自の治療プロトコルが提案されるべきである。パッケージングを欠くウィルス粒子の、生体液の中での保持耐久性これに関連して、等量の尿（０．４５μｍ膜で濾過し又は濾過しない）の存在下に３７℃でインキュベートした後のウイルス粒子の感染性を、所定容量について連続して分析した。これら分析の間隔は、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分であった。 β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子および核位置シグナルを用いることによって、ウイルス力価が初めの３時間は変化しないことを証明することができた。生体内の内胞注入によるアプローチが、水の摂取制限と関連性を有することが確認された。参照文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 8314−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．外因性ヌクレオチド配列をクローニングおよび／または発現および／または移入するための組替えレトロウィルスベクターであって、図１に示した配列におけるヌクレオチド番号7702と1527との間に略位置するＣｌａＩ−ＰｖｕIIフラグメント中に含まれる何れかの配列から成り、ヌクレオチド番号7842と144の間に含まれるＬＴＲ配列、ヌクレオチド番号145から始まるＰＢＳ部位、ＬＴＲ配列の末端に続く250ヌクレオチドの配列に含まれるパッケージング配列を具備し、前記配列は、その転写方向がウイルスの転写方向に関して何れの転写方向であっても、前記外因性配列のクローニングおよび／または発現および／または移入を制御できることを特徴とする組替えレトロウィルスベクター。２．請求項１に記載の組換えレトロウイルスベクターであって、外因性ヌクレオチド配列をクローニングおよび／または発現および／または移入するための、図１に示した配列のヌクレオチド7702〜310に略位置するＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに含まれる何れかの配列からなっており、ヌクレオチド番号7842と 310の間に夫々含まれる５´ＬＴＲ配列および３´ＬＴＲ配列、並びにヌクレオチド番号145から始まるＰＢＳ部位、ＬＴＲ配列の末端に続く250ヌクレオチドの配列中に含まれるパッケージング配列を具備し、前記配列は、その転写方向がウィルスの転写方向に関して何れの方向であっても、前記外因性配列のクローニングおよび／またはは発現および／または移入をコントロールすることができる組換えレトロウイルスベクター。３．請求項１または２に記載の組換えベクターであって、更に、図５に示す配列のヌクレオチド619〜2245の間に位置するｇａｇ配列の全部又は一部、特に図１で示す配列のヌクレオチド619〜1527の間の配列を具備する組換えベクター。４．請求項１または２に記載の組替えベクターであって、図１に示した配列のヌクレオチド7702〜1527を含むＣｌａＩ−ＰｖｕIIフラグメントからなることを特徴とする組換えベクター。５．請求項２〜４の何れか１項に記載の組替えベクターであって、図１に示した配列のヌクレオチド7702〜310を含むＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントからなることを特徴とする組換えベクター。６．請求項１〜５の何れか１項に記載の組替えベクターであって、更に、該ベクターに含まれる部位に関して独特な制限部位を有する少なくとも一つのポリリンカーを含むことを特徴とする組替えベクター。７．第Ｉ-1326の番号で、1993年６月30日にＣＮＣＭに寄託されたプラスミドｐＦＯＣＨ２９であることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の組替えベクター。８．請求項１〜７の何れか１項に記載の組替えベクターであって、更に、例えばネオマイシン抵抗性遺伝子のような、マーカー遺伝子又はその一部を含むことを特徴とする組替えベクター。９．請求項１〜８の何れか１項に記載の組替えベクターであって、ＬＴＲのＵ３領域が少なくとも一部削除されていて、Ｕ３に含まれるプロモーターおよび／またはエンハンサーが、少なくとも一部不活化あるいは修飾されていることを特徴とする組替えベクター。１０．請求項１〜８の何れか１項に記載の組替えベクターであって、ＬＴＲＣのＵ５領域が少なくとも一部削除されていることを特徴とする組替えベクター。１１．請求項１〜９の何れか１項に記載の組替えベクターであって、ＣｌａＩ −ＰｖｕIIフラグメントに含まれる配列および／またはこのフラグメント、および／またはＣｌａＩ−ＢａｍＨＩに含まれる配列および／またはこのフラグメントが、高度に厳格な条件下で上記のフラグメントに相当する配列とハイブリッド形成する配列で置換され、或いは少なくとも上記フラグメントと９５％のヌクレオチド相同性を有する配列またはＵ３配列と少なくとも８５％のヌクレオチド相同性を有する配列で置換された組み替えベクター。１２．請求項１〜１１の何れか１項に記載の組替えベクターであって、ＦＢ２９株のｇａｇ配列およびｐｏｌ配列を含むことを特徴とする組換えベクター。１３．請求項１〜１１の何れか１項に記載の組替えベクターであって、前記外因性ヌクレオチド配列が前記外因性プロモーターの制御下にあることを特徴とする組替えベクター。１４．請求項１〜１２の何れか１項に記載の組替えベクターであって、パッケージング系に導入されることを特徴とする組替えベクター１５．請求項１〜１３の何れか１項に記載の組替えベクターであって、ｐｓｉ −ＣＲＩＰ系にパッケージされることを特徴とする組替えベクター。１６．請求項１〜１３の何れか１項に記載の組替えベクターであって、ｐｓｉ −ＣＲＥ系にパッケージされることを特徴とする組替えベクター。１７．請求項１〜１５の何れか１項に記載の組替えベクターであって、幾つかの幾つかの外因性配列を含むことを特徴とする組替えベクター。１８．請求項１〜１６の何れか１項に記載の組替えベクターであって、少なくとも一つの外因性配列ＬＴＲに挿入されていることを特徴とする組替えベクター。１９．請求項１〜１７の何れか１項に記載の組替えベクターであって、前記外因性配列が治療上重要な配列であることを特徴とする組替えベクター。２０．請求項１〜１７の何れか１項に記載の組替えベクターであって、前記外因性配列が抗原または抗原決定基をコードしていることを特徴とする組替えベクター。２１．請求項１〜９の何れか１項に記載の組替えベクターであって、前記外因性配列がゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列またはＲＮＡシークエンスであることを特徴とする組替えベクター。２２．原核組替え細胞または真核組替え細胞であって、請求項１〜２０の何れか１項に記載の組替えベクターによって修飾されており、特に内因性レトロウィルスを欠失している細胞種。２３．請求項２２に記載の組換え細胞であって、哺乳動物細胞、特にヒト細胞であることを特徴とする組替え細胞。２４．請求項２２に記載の組換え細胞であって、造血細胞、特に造血前駆体またはリンパミエロイド全能性幹細胞であることを特徴とする組替え細胞２５．請求項２２に記載の組換え細胞であって、神経細胞、特に神経細胞もしくは膠細胞、繊維芽細胞、肝細胞、皮膚細胞もしくは筋肉細胞、ＴもしくはＢリンパ球、他の細胞免疫メディエイター、腫瘍細胞、骨髄のストロマ、内皮細胞、間充織細胞であることを特徴とする組替え細胞。２６．真核細胞を生体外または生体内でトランスフェクトする方法であて、前記真核生物が請求項１〜２０の何れか１項に記載のレトロウィルスベクターで感染されることを特徴とする方法。