CN101403015B - 一种用于检测白血病病毒载量的标准品及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测Friend鼠白血病病毒载量的标准品，以及用该标准品通过实时荧光定量聚合酶链式反应方法(Real-time RT-PCR法)检测Friend鼠白血病病毒载量的方法。在检测过程中包括白血病病毒核酸(RNA)的提取及含量测定、用引物对逆转录扩增获得核酸片段、实时荧光定量聚合酶连式反应(Real-time PCR)检测等步骤，本发明检测Friend鼠白血病病毒载量与常规PCR检测方法相比，具有较好的特异性，所检测的基因扩增产物为欲检测的目的基因产物，并且具有较好的线性关系，适合应用于对Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的检测。

Description

一种用于检测白血病病毒载量的标准品及其检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的标准品以及用该标准品通过实时荧光定量聚合酶链式反应方法(Real-time RT-PCR法)检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的方法。

背景技术

白血病病毒(leukemia virus)，是一类肿瘤病毒，它是骨髓性白血病或淋巴性白血病等各种白血病的病因，有许多毒株。在组织培养的细胞体系中，有时可以引起骨髓芽球和淋巴球等特定的靶细胞发生转化，但缺乏普遍性。感染于纤维芽细胞后会发生增殖，但不引起转化。主要有三类：(1)禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)：为V.Ellerman和0.Bang(1908)所分离。(2)鼠白血病病毒(Murine leukosis virus，MuLV)：由L.Gross(1951)分离，后来又从自然产生的及放射线或致癌物诱发的白血病体中分离出来。(3)其他：1960年以后自各种实验动物及猿猴中分离的白血病病毒，主要是猫白血病病毒(Feline leukemixvirus，FeLV)。有的毒株不仅能使原来的寄主动物发生白血病，还可引起不同种类的动物发病。同时，它和具有共同寄主的肉瘤病毒关系密切，其中的缺陷毒株(不完全病毒)可作为疱疹病毒起作用，而完全型肉瘤病毒能制备基因重组体。在同种病毒中，也有的以内在病毒的形式，处于整合到正常动物基因中的状态，并通过生殖细胞一代代传递下去。

目前国内外尚无检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测Friend鼠白血病病毒载量的标准品，本发明的另一个目的在于提供一种用该标准品通过实时荧光定量聚合酶链式反应方法(Real-time RT-PCR法)检测Friend鼠白血病病毒载量的方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供的用于检测Friend鼠白血病病毒载量的标准品，其包含用引物对逆转录扩增获得核酸片段，其中所述病毒基因序列的引物对分别是：

5′-CAACCACCCTCTGTGGACTT-3′和5′-TGTAAACCGGATAGCCAAGG-3′；

5′-CGTGTTCAACGCTCTCAAAA-3′和5′-CAAGTCCACAGAGGGTGGTT-3′；

5′-GTGGCCTACCTGTCCAAAAA-3′和5′-GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG-3′；

5′-CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT-3′和5′-AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT-3′；

上述引物依次如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示。

本发明用上述标准品通过实时荧光定量聚合酶连式反应方法(RT-PCR法)检测Friend鼠白血病病毒载量的方法包括如下步骤：

(1)制作病毒液：

将Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)按1:10用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含0.1重量份脾脏的悬液，在4℃下以2×103r/min的速度离心10-15min，取上清液作为病毒液，备用；

(2)制作标本：

取小鼠，用上述病毒液腹腔注射，感染小鼠，解剖取脾组织，冻存于-80℃，备用；

(3)白血病病毒核酸(RNA)的提取及含量测定

总RNA提取：将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50～100mg小鼠脾组织加入1mlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min；移上清液入1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育2～3min；于4℃下以12000rpm的速度离心15min；移上层水相到1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入1ml75％乙醇，于4℃下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA；

总RNA含量测定：总RNA用DEPC处理水(RNase-free水)稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、OD260值、OD260/OD280、蛋白质含量，OD260/OD280比值为1.8～2.0的RNA保留，备用；

(4)逆转录反应

将上述提取的RNA用30μl焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA；

(5)标准品的制备

以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，其中使用的引物对是：

5′-CAACCACCCTCTGTGGACTT-3′和5′-TGTAAACCGGATAGCCAAGG-3′；

5′-CGTGTTCAACGCTCTCAAAA-3′和5′-CAAGTCCACAGAGGGTGGTT-3′；

5′-GTGGCCTACCTGTCCAAAAA-3′和5′-GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG-3′；

5′-CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT-3′和5′-AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT-3′；

上述引物依次如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示；

将扩增完毕的PCR产物进行1.5％的5×Tris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值(A₂₆₀)，计算每ml PCR产物的拷贝数，公式为：拷贝数/ml＝6.02×10²³×C×A₂₆₀/MW₁，其中C＝5×10^-5/ml，MW₁＝PCR产物的分子量＝碱基数×6.58×10²，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml1.0×10¹⁰拷贝，得标准品，置-20℃保存，备用；

(6)实时荧光定量聚合酶连式反应(Real-time PCR)检测

反应总体积为25μl，反应体系含10倍系列稀释的标准品的互补DNA或以同法制备的样品的互补DNA2μl，浓度为20pmol/μl的每种引物各1μl，Power SYBR GREEN12.5μl，用灭菌双蒸水补足到25μl；Real-time PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为：95℃预变性10min；95℃，15s变性；60℃，60s退火与延伸，扩增40个循环，在每个循环的第二步结束时进行荧光检测，分别得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值；

(7)结果计算与分析

利用样本扩增后的Ct值在标准曲线上对应其起始拷贝数，数值使用Opticon Monitor3软件得出。

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种用于检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的标准品以及用该标准品通过实时荧光定量聚合酶连式反应方法(RT-PCR法)检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的方法。本发明检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量与常规PCR检测方法相比，具有较好的特异性，所检测的基因扩增产物为欲检测的目的基因产物，并且具有较好的线性关系，适合应用于对Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的检测。

附图说明

图1：白血病病毒基因Real-time PCR产物溶解曲线图；

图2：白血病病毒基因Real-time PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图3：Real-time PCR扩增Fr.MuLV基因的标准曲线图；

图4：各组小鼠脾脏病毒载量随时间变化曲线。

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1实施例1方法得到的基因PCR产物的鉴定

由实施例1方法得得基因扩增产物，对此产物进行鉴定，结果如附图1和附图2。从附图1可知，基因扩增产物溶解曲线只有单一峰值，没有明显的引物二聚体和非特异峰出现，说明扩增产物具有特异性，溶解曲线测定显示Fr.MuLV特异性产物的Tm值为88.1℃，结合附图2可知，目的基因产物片断长度与设计长度148bp相吻合，证明所检测的基因扩增产物为欲检测的目的基因产物。

实验例2标准曲线的建立

用10倍系列稀释的标准品(1.0×10¹～1.0×10⁷拷贝)为模板，在实时荧光定量PCR仪上扩增结束后，用Opticon Monitor3软件进行数据分析，以起始模板数的对数为x轴，Ct值为y轴做回归曲线，即得Fr.MuLV病毒的检测的标准曲线(附图3)。纯化后的Fr.MuLV标准品cDNA的稀释倍数均为10³-10⁷拷贝/mL，在此范围内有极好的线性关系。标准曲线的线性范围较广，至少可达5个数量级。梯度浓度互补DNA标准品的Ct值与该标准品浓度的对数呈线形关系方程式为Y＝-3.128X+36.708，回归系数为0.9923；扩增效率为102％。

实验例3小鼠脾组织病毒载量的检测

根据实施例1的方法制得病毒液，分别将病毒液稀释成2.5％、5.0％、10.0％浓度腹腔注射感染小鼠，于感染后第1、2、3、4周在每个感染浓度取10只小鼠解剖取脾组织，制作标本，根据实施例1的方法提取白血病病毒RNA，进行逆转录反应，制作标准品，利用实时荧光定量聚合酶连式反应(Real-time PCR)检测Friend鼠白血病病毒载量，结果见表1和附图4。

表1不同时间点各组病毒载量的比较(χ±sn＝10)

与10.0％感染量组比较¹P<0.01；与5.0％感染量组比较²P<0.01。

结果表明：病毒感染后，各感染量组小鼠脾脏病毒载量均随时间进行性升高。1周、2周、3周、4周各个感染量组间小鼠脾脏病毒载量均呈极显著性差异(P<0.01)。

下述实施例均能实现上述实验例的效果：

具体实施方式

实施例1：检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的方法

(1)制作病毒液：

将Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)按1:10用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含0.1重量份脾脏的悬液，在4℃下以2×10³r/min的速度离心10-15min，取上清液作为病毒液，备用；

(2)制作标本：

取BALB/c小鼠，120只，雌雄各半，体重18-22g，将上述病毒液稀释成2.5％、5.0％、10.0％浓度腹腔注射感染小鼠，分别于感染后第1、2、3、4周在每个感染浓度取10只小鼠解剖取脾组织，冻存于-80℃，备用；

(3)白血病病毒核酸(RNA)的提取及含量测定

总RNA提取：将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50～100mg小鼠脾组织加入1mlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min；移上清液入1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育2～3min；于4℃下以12000rpm的速度离心15min；移上层水相到1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入1ml75％乙醇，于4℃下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA；

总RNA含量测定：总RNA用DEPC处理水(RNase-free水)稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、OD260值、OD260/OD280、蛋白质含量，OD260/OD280比值为1.8～2.0的RNA保留，备用；

(4)逆转录反应

将上述提取的RNA用30μl焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA；

(5)标准品的制备

以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，其中使用的引物对是：

5′-CAACCACCCTCTGTGGACTT-3′和5′-TGTAAACCGGATAGCCAAGG-3′；

上述引物依次如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

将扩增完毕的PCR产物进行1.5％的5×Tris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值(A₂₆₀)，计算每ml PCR产物的拷贝数，公式为：拷贝数/ml＝6.02×10²³×C×A₂₆₀/MW₁，其中C＝5×10^-5/ml，MW₁＝PCR产物的分子量＝碱基数×6.58×10²，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml1.0×10¹⁰拷贝，得标准品，置-20℃保存，备用；

(6)实时荧光定量聚合酶连式反应(Real-time PCR)检测

反应总体积为25μl，反应体系含10倍系列稀释的标准品的互补DNA或以同法制备的样品的互补DNA2μl，浓度为20pmol/μl的每种引物各1μl，Power SYBR GREEN12.5μl，用灭菌双蒸水补足到25μl；Real-time PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为：95℃预变性10min；95℃，15s变性；60℃，60s退火与延伸，扩增40个循环，在每个循环的第二步结束时进行荧光检测，分别得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值；

(7)结果计算与分析

利用样本扩增后的Ct值在标准曲线上对应其起始拷贝数，数值使用Opticon Monitor3软件得出，12批Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)的载量，见表2：

表2不同时间点各组病毒载量的比较(χ±s，n＝10)

与10.0％感染量组比较¹P<0.01；与5.0％感染量组比较²P<0.01。

实施例2：检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的方法

(1)制作病毒液：

将Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)按1:10用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含0.1重量份脾脏的悬液，在4℃下以2×103r/min的速度离心10-15min，取上清液作为病毒液，备用；

(2)制作标本：

取BALB/c小鼠，120只，雌雄各半，体重18-22g，将上述病毒液稀释成2.5％、5.0％、10.0％浓度腹腔注射感染小鼠，分别于感染后第1、2、3、4周在每个感染浓度取10只小鼠解剖取脾组织，冻存于-80℃，备用；

(3)白血病病毒核酸(RNA)的提取及含量测定

总RNA提取：将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50～100mg小鼠脾组织加入1mlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min；移上清液入1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育2～3min；于4℃下以12000rpm的速度离心15min；移上层水相到1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入1ml75％乙醇，于4℃下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA；

总RNA含量测定：总RNA用DEPC处理水(RNase-free水)稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、OD260值、OD260/OD280、蛋白质含量，OD260/OD280比值为1.8～2.0的RNA保留，备用；

(4)逆转录反应

将上述提取的RNA用30μl焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA；

(5)标准品的制备

以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，其中使用的引物对是：

5′-CGTGTTCAACGCTCTCAAAA-3′和5′-CAAGTCCACAGAGGGTGGTT-3′；

上述引物依次如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

将扩增完毕的PCR产物进行1.5％的5×Tris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值(A₂₆₀)，计算每ml PCR产物的拷贝数，公式为：拷贝数/ml＝6.02×10²³×C×A₂₆₀/MW₁，其中C＝5×10^-5/ml，MW₁＝PCR产物的分子量＝碱基数×6.58×10²，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml1.0×10¹⁰拷贝，得标准品，置-20℃保存，备用；

(6)实时荧光定量聚合酶连式反应(Real-time PCR)检测

反应总体积为25μl，反应体系含10倍系列稀释的标准品的互补DNA或以同法制备的样品的互补DNA2μl，浓度为20pmol/μl的每种引物各1μl，Power SYBR GREEN12.5μl，用灭菌双蒸水补足到25μl；Real-time PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为：95℃预变性10min；95℃，15s变性；60℃，60s退火与延伸，扩增40个循环，在每个循环的第二步结束时进行荧光检测，分别得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值；

(7)结果计算与分析

利用样本扩增后的Ct值在标准曲线上对应其起始拷贝数，数值使用Opticon Monitor3软件得出，12批Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)的载量，见表3：

表3不同时间点各组病毒载量的比较(χ±s，n＝10)

与10.0％感染量组比较¹P<0.01；与5.0％感染量组比较²P<0.01。

实施例3：检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的方法

(1)制作病毒液：

将Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)按1:10用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含0.1重量份脾脏的悬液，在4℃下以2×103r/min的速度离心10-15min，取上清液作为病毒液，备用；

(2)制作标本：

取BALB/c小鼠，120只，雌雄各半，体重18-22g，将上述病毒液稀释成2.5％、5.0％、10.0％浓度腹腔注射感染小鼠，分别于感染后第1、2、3、4周在每个感染浓度取10只小鼠解剖取脾组织，冻存于-80℃，备用；

(3)白血病病毒核酸(RNA)的提取及含量测定

总RNA提取：将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50～100mg小鼠脾组织加入1mlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min；移上清液入1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育2～3min；于4℃下以12000rpm的速度离心15min；移上层水相到1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入1ml75％乙醇，于4℃下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA；

总RNA含量测定：总RNA用DEPC处理水(RNase-free水)稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、OD260值、OD260/OD280、蛋白质含量，OD260/OD280比值为1.8～2.0的RNA保留，备用；

(4)逆转录反应

将上述提取的RNA用30μl焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA；

(5)标准品的制备

以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，其中使用的引物对是：

5′-GTGGCCTACCTGTCCAAAAA-3′和5′-GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG-3′；

上述引物依次如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；

将扩增完毕的PCR产物进行1.5％的5×Tris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值(A₂₆₀)，计算每ml PCR产物的拷贝数，公式为：拷贝数/ml＝6.02×10²³×C×A₂₆₀/MW₁，其中C＝5×10^-5/ml，MW₁＝PCR产物的分子量＝碱基数×6.58×10²，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml1.0×10¹⁰拷贝，得标准品，置-20℃保存，备用；

(6)实时荧光定量聚合酶连式反应(Real-time PCR)检测

反应总体积为25μl，反应体系含10倍系列稀释的标准品的互补DNA或以同法制备的样品的互补DNA2μl，浓度为20pmol/μl的每种引物各1μl，Power SYBR GREEN12.5μl，用灭菌双蒸水补足到25μl；Real-time PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为：95℃预变性10min；95℃，15s变性；60℃，60s退火与延伸，扩增40个循环，在每个循环的第二步结束时进行荧光检测，分别得到标准品和样品的扩增曲线和C_t值；

(7)结果计算与分析

利用样本扩增后的Ct值在标准曲线上对应其起始拷贝数，数值使用Opticon Monitor3软件得出，12批Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)的载量，见表4：

表4不同时间点各组病毒载量的比较(χ±sn＝10)

与10.0％感染量组比较¹P<0.01；与5.0％感染量组比较²P<0.01。

实施例4：用于检测Friend鼠白血病病毒载量的标准品的制备

(1)制作病毒液：

将Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)按1:10用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含0.1重量份脾脏的悬液，在4℃下以2×103r/min的速度离心10-15min，取上清液作为病毒液，备用；

(2)制作标本：

取BALB/c小鼠，120只，雌雄各半，体重18-22g，将上述病毒液稀释成2.5％、5.0％、10.0％浓度腹腔注射感染小鼠，分别于感染后第1、2、3、4周在每个感染浓度取10只小鼠解剖取脾组织，冻存于-80℃，备用；

(3)白血病病毒核酸(RNA)的提取及含量测定

总RNA提取：将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50～100mg小鼠脾组织加入1mlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min；移上清液入1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育2～3min；于4℃下以12000rpm的速度离心15min；移上层水相到1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入1ml75％乙醇，于4℃下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA；

总RNA含量测定：总RNA用DEPC处理水(RNase-free水)稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、OD260值、OD260/OD280、蛋白质含量，OD260/OD280比值为1.8～2.0的RNA保留，备用；

(4)逆转录反应

将上述提取的RNA用30μl焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA；

(5)标准品的制备

以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，其中使用的引物对是：

5′-CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT-3′和5′-AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT-3′；

上述引物依次如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；

将扩增完毕的PCR产物进行1.5％的5×Tris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值(A₂₆₀)，计算每ml PCR产物的拷贝数，公式为：拷贝数/ml＝6.02×10²³×C×A₂₆₀/MW₁，其中C＝5×10^-5/ml，MW₁＝PCR产物的分子量＝碱基数×6.58×10²，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml1.0×10¹⁰拷贝，得标准品。

SEQ ID NO：1：5′-CAACCACCCTCTGTGGACTT-3′

SEQ ID NO：2：5′-TGTAAACCGGATAGCCAAGG-3′

SEQ ID NO：3：5′-CGTGTTCAACGCTCTCAAAA-3′

SEQ ID NO：4：5′-CAAGTCCACAGAGGGTGGTT-3′

SEQ ID NO：5：5′-GTGGCCTACCTGTCCAAAAA-3′

SEQ ID NO：6：5′-GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG-3′

SEQ ID NO：7：5′-CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT-3′

SEQ ID NO：8：5′-AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT-3′

Untitledl.ST25.txt

SEQUENCE LISTING

<110>崔，晓兰

<120>一种用于检测白血病病毒载量的标准品及其检测方法

<130>000

<160>8

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

caaccaccct ctgtggactt

                                    20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tgtaaaccgg atagccaagg

                                    20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cgtgttcaac gctctcaaaa

                              20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

caagtccaca gagggtggtt

                               20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gtggcctacc tgtccaaaaa

                                20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gaagcagagc ctggtagtgg

                           20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ctggaagccc tcctcttctt

                           20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

aagtaagccc tgggtcctgt

                           20

Claims (2)

1.一种用于检测Friend鼠白血病病毒载量的标准品，其特征在于该标准品由如下方法制成：

(1)制作病毒液：

将Friend鼠白血病病毒按1∶10用磷酸盐缓冲溶液稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含0.1重量份脾脏的悬液，在4℃下以2×103r/min的速度离心10-15min，取上清液作为病毒液，备用；

(2)制作标本：

取小鼠，用上述病毒液腹腔注射，感染小鼠，解剖取脾组织，冻存于-80℃，备用；

(3)白血病病毒核酸的提取及含量测定

总RNA提取：将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50～100mg小鼠脾组织加入1mlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min；移上清液入1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育2～3min；于4℃下以12000rpm的速度离心15min；移上层水相到1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入1ml 75％乙醇，于4℃下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA；

总RNA含量测定：总RNA用DEPC处理水稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、OD260值、OD260/OD280、蛋白质含量，OD260/OD280比值为1.8～2.0的RNA保留，备用；

(4)逆转录反应

将上述提取的RNA用30μl焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA；

(5)标准品的制备

以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应扩增，其中使用的引物对是：

5′-CGTGTTCAACGCTCTCAAAA-3′和5′-CAAGTCCACAGAGGGTGGTT-3′；

上述引物依次如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示；

将扩增完毕的PCR产物进行1.5％的5×Tris-硼酸琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值，计算每ml PCR产物的拷贝数，公式为：拷贝数/ml＝6.02×10²³×C×A₂₆₀/MW₁，其中C＝5×10^-5/ml，MW₁＝PCR产物的分子量＝碱基数×6.58×10²，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml 1.0×10¹⁰拷贝，得标准品。

2.如权利要求1所述的标准品制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)制作病毒液：

将Friend鼠白血病病毒按1∶10用磷酸盐缓冲溶液稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含0.1重量份脾脏的悬液，在4℃下以2×103r/min的速度离心10-15min，取上清液作为病毒液，备用；

(2)制作标本：

取小鼠，用上述病毒液腹腔注射，感染小鼠，解剖取脾组织，冻存于-80℃，备用；

(3)白血病病毒核酸的提取及含量测定

总RNA提取：将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50～100mg小鼠脾组织加入1mlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min；移上清液入1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育2～3min；于4℃下以12000rpm的速度离心15min；移上层水相到1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4℃下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入1ml 75％乙醇，于4℃下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA；

总RNA含量测定：总RNA用DEPC处理水稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、OD260值、OD260/OD280、蛋白质含量，OD260/OD280比值为1.8～2.0的RNA保留，备用；

(4)逆转录反应

将上述提取的RNA用30μl焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA；

(5)标准品的制备

以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应扩增，其中使用的引物对是：

5′-CGTGTTCAACGCTCTCAAAA-3′和5′-CAAGTCCACAGAGGGTGGTT-3′；

上述引物依次如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示；

将扩增完毕的PCR产物进行1.5％的5×Tris-硼酸琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值，计算每ml PCR产物的拷贝数，公式为：拷贝数/ml＝6.02×10²³×C×A₂₆₀/MW₁，其中C＝5×10^-5/ml，MW₁＝PCR产物的分子量＝碱基数×6.58×10²，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml 1.0×10¹⁰拷贝，得标准品。

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