CN105200140A - 一种用于鉴定蛤蚧的pcr方法及其特异引物 - Google Patents
一种用于鉴定蛤蚧的pcr方法及其特异引物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定蛤蚧的PCR方法及其特异引物。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的引物对，具体为如下(a)或(b)所示的引物对：(a)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。本发明通过分析蛤蚧与其混伪品的细胞色素c氧化酶I基因序列，获得蛤蚧高特异性区域，设计鉴别引物，采用特异性PCR技术实现了蛤蚧及其混伪品的准确鉴别，并引入了荧光染料法对真伪鉴别结果进行检测，为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于中药材鉴定领域，涉及一种用于鉴定蛤蚧的PCR方法及其特异引物。
背景技术
蛤蚧为壁虎科动物蛤蚧GekkogeckoLinnaeus的干燥全体，收载于2010年及即将实施的2015年版《中国药典》。蛤蚧具有补肺益肾，纳气定喘，助阳益精的功效，在临床上主要用于肺肾不足，虚喘气促，劳嗽咳血，阳痿，遗精等。
以蛤蚧为主要原料的中成药，如蛤蚧精、蛤蚧补肾丸、蛤蚧定喘丸等应用广泛，用量甚大。当前国内大壁虎的数量已急剧减少，几近枯竭，早在1989年1月，林业部与农业部联合颁布《国家重点保护野生动物名录》中，就已将蛤蚧列为国家II级保护动物。近年来随着蛤蚧资源的缩减，已有蛤蚧的伪品出现。据文献资料，市场上出现过的蛤蚧伪品多达18种，包括东方蝾螈、中国瘰螈、变色树蜥、无蹼壁虎、多疣壁虎、红螺疣螈、喜山岩蜥、青海沙蜥、石龙子、变色沙蜥等。市场中也存在蛤蚧的伪品，Liu等使用分子检测技术对9批蛤蚧样品进行分析，发现只有3批为正品蛤蚧。对其中一些品种，蛤蚧正品与之形态学特征差别细微，传统的鉴别方法很难对蛤蚧药材进行鉴定。尤其是经过炮制加工、运输储藏后，甚至切片分类后，市场流通的商品蛤蚧形态有所改变，蛤蚧及其混伪品的性状特征消失，难以区分。
此外，也有研究表明可采用DNA测序技术进行鉴别，但DNA测序技术鉴别结果不够直观，操作略显复杂，不能满足快速鉴别的需求。为确保药材市场中蛤蚧的质量及其临床疗效，需要建立快速、准确、科学性强、使用方便的方法进行鉴定。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的引物对。
本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的引物对，具体为如下(a)或(b)所示的引物对：
(a)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。
所述引物对中，两条单链DNA分子既可以分别单独包装，也可以按照摩尔比为1:1的比例混合后包装在一起。
本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的试剂盒。
本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的试剂盒，具体可含有所述引物对、dNTP和DNA聚合酶。
根据需要，所述试剂盒中还可含有荧光染料SYBRGreenI。
制备所述引物对的方法也属于本发明的保护范围。
制备所述引物对的方法，具体可包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
制备所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。
制备所述试剂盒的方法，具体可包括如下A)或B)的步骤：
A)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内：
B)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP、DNA聚合酶和SYBRGreenI包装于同一个试剂盒内。
所述引物对或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的第三个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧的方法。
本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧的方法，具体可包括如下步骤：
(a)从待测中药样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增；
(b)为如下(b1)或(b2)：
(b1)根据步骤(a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧：若PCR产物中含有250-500bp(如400-450bp)的DNA片段，则所述待测中药样品中含有或候选含有中药蛤蚧；若PCR产物中不含有250-500bp(如400-450bp)的DNA片段，则所述待测中药样品中不含有或候选不含有中药蛤蚧；
(b2)向步骤(a)扩增后的反应体系中加入荧光染料SYBRGreenI，得到含有荧光染料的体系，按照如下方法确定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧：若观察到所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品中含有或候选含有中药蛤蚧；若观察不到所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品不含有或候选不含有中药蛤蚧。
本发明的第四个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测中药样品为蛤蚧正品还是蛤蚧伪品的方法。
本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测中药样品为蛤蚧正品还是蛤蚧伪品的方法，具体可包括如下步骤：
(a)从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对(序列1和序列2)进行PCR扩增；
(b)为如下(b1)或(b2)：
(b1)根据步骤(a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测中药样品为蛤蚧正品还是蛤蚧伪品：若PCR产物中含有250-500bp(如400-450bp)的DNA片段，则所述待测中药样品为或候选为蛤蚧正品；若PCR产物中不含有250-500bp(如400-450bp)的DNA片段，则所述待测中药样品为或候选为蛤蚧伪品；
(b2)向步骤(a)扩增后的反应体系中加入荧光染料SYBRGreenI，按照如下方法确定待测中药样品为蛤蚧正品还是蛤蚧伪品：若观察到所述反应体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品为或候选为蛤蚧正品；若观察不到所述反应体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品为或候选为蛤蚧伪品；
所述待测中药样品为蛤蚧正品或蛤蚧伪品；所述蛤蚧正品为中药蛤蚧；所述蛤蚧伪品选自变色树蜥、变色沙蜥、丽斑麻蜥、红螺疣螈、中国石龙子和无蹼壁虎的任一种或任几种。
在上述两种方法的步骤(a)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度可为60-68℃(如65℃)。
在本发明中，进行所述PCR扩增时采用的具体反应条件如下：95℃1min；95℃5s、65℃5s，30个循环。
在所述方法的步骤(a)中，在进行所述PCR扩增的反应体系中，所述引物对中每条单链DNA分子的终浓度均为80nmol/L。
在本发明中，进行所述PCR扩增时采用的具体反应体系如下：10×PCR缓冲液2.5μL、dNTP(2.5mmol·L-1)1μL、TaqDNA聚合酶(5U·L-1)0.2μL和模板DNA1μL(30ng)，上下游鉴别引物(10μmol·L-1)各0.2μL，灭菌蒸馏水补足至25μL。
在实际应用中，判断所述PCR产物中是否含有250-500bp(如400-450bp)的DNA片段，可通过将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行检测，若电泳结果显示有250-500bp(如400-450bp)目的条带，则所述PCR产物中含有250-500bp(如400-450bp)的DNA片段；反之，则不含有250-500bp(如400-450bp)的DNA片段。当然也通过测序的方法判定所述PCR产物中是否含有250-500bp(如400-450bp)的DNA片段。
在上述两种方法的步骤(b2)中，向所述反应体系中加入荧光染料SYBRGreenI时，所述荧光染料SYBRGreenI的加入量为：每20μL所述反应体系中加入2μL100×SYBRGreenI(100×SYBRGreenI由10000×SYBRGreenI稀释而来，10000×SYBRGreenI为Sigma-Aldrich公司产品，其产品目录号为S9430，CAS号为163795-75-3)。
在上述两种方法的步骤(b2)中，确定所述含有荧光染料的体系是否产生绿色荧光具体是在365nm紫外波长下进行检测的。
在本发明中，以上所述250-500bp(如400-450bp)的DNA片段具体为412bp的DNA片段；所述412bp的DNA片段具体为序列表中序列3所示的DNA片段。
本发明通过分析蛤蚧与其混伪品的细胞色素c氧化酶I基因(COI基因)序列，获得蛤蚧高特异性区域，设计鉴别引物，采用特异性PCR技术实现了蛤蚧及其混伪品的准确鉴别，并引入了荧光染料法对真伪鉴别结果进行检测，为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。
附图说明
图1为部分供试蛤蚧类中药样品的特异性PCR电泳检测结果。其中，M为DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。1为中国食品药品检定研究院提供的蛤蚧阳性对照；23-24为使用水为模板的空白对照；2-4为蛤蚧；5-7为变色树蜥；8-10为变色沙蜥；11-13为丽斑麻蜥；14为红螺疣螈；15-17为中国石龙子；18-22为无蹼壁虎。
图2为不同批次蛤蚧类中药样品的特异性PCR电泳检测结果。其中，M为DNA分子量标准：从下至上分别为50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp；1-4：蛤蚧(亳州)；5-20：蛤蚧(玉林)；21-24：蛤蚧(成都)。
图3为部分供试蛤蚧类中药样品的特异性PCR荧光检测结果。其中，a为蛤蚧；1为变色树蜥；2为变色沙蜥；3为丽斑麻蜥；4为中国石龙子；5为使用水为模板的空白对照。
图4为模板量对蛤蚧鉴别结果的影响。M:DL2000Marker；1-4：蛤蚧；5-6：变色树蜥；7-8：变色沙蜥；9：丽斑麻蜥；10：红螺疣螈；11：中国石龙子；12：无蹼壁虎。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的仪器有：台式高速离心机(Eppendorf公司)、9700基因扩增仪(ABI公司)、电泳仪、紫外凝胶成像仪。
实施例1、鉴定中药蛤蚧的试剂盒的制备及鉴定方法的建立
一、用于鉴定中药蛤蚧的引物对的设计与合成
本发明的发明人通过分析蛤蚧与其混伪品的COI基因序列，获得蛤蚧与其混伪品的差异区域，进而设计了用于鉴别两种品系的引物对GeJie-1及GeJie-2。
GeJie-1：5'-CACTCCTTGGACACGACCAACTA-3'(序列1)；
GeJie-2：5'-AGGGGTGTCGTGTATTGGGTC-3'(序列2)。
以蛤蚧基因组DNA为模板，其理论PCR产物长度为412bp，其核苷酸序列具体如序列表中序列3所示。
二、用于鉴定中药蛤蚧的试剂盒的组装
将步骤一设计合成的引物GeJie-1及GeJie-2分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP、DNA聚合酶、10×buffer缓冲液、荧光染料SYBRGreenI等包装于同一个试剂盒内，即得到本发明用于鉴定中药蛤蚧的试剂盒。
三、鉴定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧的方法
采用步骤二的试剂盒按照包括如下步骤的方法鉴定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧：
1、PCR扩增
从待测中药样品中提取基因组DNA作为模板，采用步骤一设计合成的引物GeJie-1及GeJie-2(序列1和序列2)按照如下进行PCR扩增：
在200μL离心管中进行PCR反应。反应总体积为25μL，10×PCR缓冲液2.5μL、dNTP(2.5mmol·L-1)1μL、TaqDNA聚合酶(5U·L-1)0.2μL和模板DNA1μL(30ng)，上下游鉴别引物(10μmol·L-1)各0.2μL，灭菌蒸馏水补足至25μL。其中，10×PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶均为Takara公司产品，其产品目录号分别为RR001Q和R001Q。
在ABI公司的9700型基因扩增仪上进行扩增，循环参数为：95℃预变性1min，循环反应30次(95℃5s，65℃5s)；反应结束后4℃保存。
2、PCR产物检测
可以采用两种方法检测PCR产物：
(1)琼脂糖凝胶电泳法
取5μL扩增产物，采用1％的琼脂糖凝胶，在电压100-150V下电泳15分钟，凝胶成像系统下观察并拍照。根据目的条带的大小，按照如下方法确定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧：若获得大小约为412bp的目的条带(序列3)，则所述待测中药样品中含有中药蛤蚧；若没有获得大小约为412bp的目的条带(序列3)，则所述待测中药样品中不含有中药蛤蚧。
(2)荧光染色法
在PCR扩增产物(20μL)中加入2μL100×SYBRGreenI(100×SYBRGreenI由10000×SYBRGreenI稀释而来，10000×SYBRGreenI为Sigma-Aldrich公司产品，其产品目录号为S9430，CAS号为163795-75-3)于365nm紫外波长下检测荧光，按照如下方法确定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧：若观察到所述反应体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品中含有中药蛤蚧；若观察不到所述反应体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品不含有中药蛤蚧。
实施例2、采用实施例1制备的试剂盒鉴定中药蛤蚧
供试蛤蚧类中药样品：表1中所示的78个来自不同产地的已知样品。
表1样品表来源
| 序号 | 材料名称 | 拉丁名 | 数量 | 来源地 | 鉴定人 |
| 1 | 蛤蚧 | Gekko gecko | 4 | 亳州 | 赵群 |
| 2 | 蛤蚧 | Gekko gecko | 10 | 玉林 | 金艳 |
| 3 | 蛤蚧 | Gekko gecko | 12 | 亳州 | 金艳 |
| 4 | 蛤蚧(红斑) | Gekko gecko | 3 | 成都 | 赵群 |
| 5 | 蛤蚧(灰斑) | Gekko gecko | 3 | 成都 | 赵群 |
| 6 | 变色树蜥 | Calotes versicolor | 10 | 亳州 | 赵群 |
| 7 | 变色沙蜥 | hrynocephalus versicolor | 5 | 亳州 | 赵群 |
| 8 | 中国石龙子 | Eumeces chinensis | 10 | 亳州 | 赵群 |
| 9 | 红瘰疣螈 | Tylototriton verrucoosus | 1 | 亳州 | 赵群 |
| 10 | 丽斑麻蜥 | Eremias argus | 5 | 亳州 | 赵群 |
| 11 | 无蹼壁虎(泰国) | Gekko swinhonis | 5 | 亳州 | 赵群 |
| 12 | 无蹼壁虎(缅甸) | Gekko swinhonis | 5 | 亳州 | 赵群 |
| 13 | 无蹼壁虎(国产) | Gekko swinhonis | 5 | 亳州 | 赵群 |
注：表中各样品均符合中国药典(2010年版)一部正文各药材项下的有关规定。通过鉴定，各味药材实物与名称相符，质量符合标准。
一、待测中药基因组DNA的提取
取供试药材约50mg，置2.0mL离心管中，加入磁珠1枚，使用球磨粉碎机粉碎成粉末。取粉末20mg，分别加入到2mL离心管中；取粉末5-20mg，分别加入到2mL离心管中；加入200μL提取缓冲液(配方：0.5mol·L-1NaOH，1％PVP，0.5％Triton-100，％表示质量分数)，振荡30s充分混匀；每一管内加入0.1mol·L-1Tris-HCl(pH＝8.0)800μL，混匀；12000rpm下离心5min；取500μL上清至一新的1.5mL离心管，加入500μL0.1mol·L-1Tris-HCl，充分混匀；12000rpm下离心5min；取上清，稀释5-50倍用于PCR反应。
二、PCR扩增
以步骤一从待测样品中提取的基因组DNA为模板，采用实施例1步骤一设计的引物对(引物GeJie-1和GeJie-2)进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例1步骤三1。实验同时设置以水替代模板的空白对照，以中国食品药品检定研究院提供的中药蛤蚧作为阳性对照品。实验重复三次。
反应结束后，一方面，按照实施例1中步骤三2(1)的方法对待测样品进行鉴定。另一方面，按照实施例1中步骤三2(2)的方法对待测样品进行鉴定。
结果显示，利用本发明的引物对(引物GeJie-1和GeJie-2)对表1中所有的78个已知蛤蚧类中药样品进行检测，蛤蚧都能够扩增出片段大小约为412bp的目的条带(测序后序列正为序列表中序列3)。而蛤蚧外的其他样品均未扩增出412bp目的条带。图1、图2为部分蛤蚧类样品的特异性PCR产物凝胶电泳结果。另外，荧光检测结果表明，蛤蚧均显示出明亮绿色荧光，而蛤蚧外的其他样品均不发绿色荧光。图3为部分蛤蚧类样品的特异性PCR荧光检测结果。可见，采用本发明的引物对(引物GeJie-1和GeJie-2)鉴定中药蛤蚧，可通过荧光染色的方法对结果进行直接判定，操作简便，且检测准确率高达100％。
实施例3、采用实施例1制备的试剂盒鉴定中药蛤蚧的灵敏度分析
待测样品：中药蛤蚧(亳州)。符合中国药典(2010年版)一部正文各药材项下的有关规定。通过鉴定，药材实物与名称相符，质量符合标准。
对照样品：变色树蜥；变色沙蜥；丽斑麻蜥；红螺疣螈；中国石龙子；无蹼壁虎符合中国药典(2010年版)一部正文各药材项下的有关规定。通过鉴定，药材实物与名称相符，质量符合标准。
一、从待测样品中提取基因组DNA
分别取约50mg干燥样品，用CTAB法提取总DNA。具体参照实施例2步骤一进行。
二、PCR扩增
将步骤一从中药蛤蚧和其他对照样品中分别提取的基因组DNA进行倍比稀释，得到基因组DNA模板浓度分别为100ng/μl、20ng/μl、4ng/μl、1ng/μl的系列稀释液，以各稀释液分别为模板，采用实施例1步骤一设计的引物对(引物GeJie-1和GeJie-2)进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例1步骤三1。实验同时设置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。
反应结束后，按照实施例1中步骤三2的方法对待测样品和对照样品进行鉴定。
结果如图4所示，从图中可以看出：
利用本发明的引物对(引物GeJie-1和GeJie-2)对中药蛤蚧进行检测，当模板浓度为4ng/μl时仍能够检测到大小约为412bp的目的条带。将大小约为412bp的目的条带回收测序，其序列正为序列表中序列3。而对其他对照样品的均为检测到大小约为412bp的目的条带。
Claims (10)
1.用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的引物对，为如下(a)或(b)所示的引物对：
(a)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。
2.用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的引物对、dNTP和DNA聚合酶。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有荧光染料SYBRGreenI。
4.制备权利要求1所述引物对的方法，包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
5.制备权利要求2或3所述试剂盒的方法，包括如下A)或B)的步骤：
A)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内：
B)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP、DNA聚合酶和SYBRGreenI包装于同一个试剂盒内。
6.权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧中的应用。
7.利用权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂盒鉴定或辅助鉴定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧的方法，包括如下步骤：
(a)从待测中药样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；
(b)为如下(b1)或(b2)：
(b1)根据步骤(a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧：若PCR产物中含有250-500bp的DNA片段，则所述待测中药样品中含有或候选含有中药蛤蚧；若PCR产物中不含有250-500bp的DNA片段，则所述待测中药样品中不含有或候选不含有中药蛤蚧；
(b2)向步骤(a)扩增后的反应体系中加入荧光染料SYBRGreenI，得到含有荧光染料的体系，按照如下方法确定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧：若观察到所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品中含有或候选含有中药蛤蚧；若观察不到所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品不含有或候选不含有中药蛤蚧。
8.利用权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂盒鉴定或辅助鉴定待测中药样品为蛤蚧正品还是蛤蚧伪品的方法，包括如下步骤：
(a)从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；
(b)为如下(b1)或(b2)：
(b1)根据步骤(a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测中药样品为蛤蚧正品还是蛤蚧伪品：若PCR产物中含有250-500bp的DNA片段，则所述待测中药样品为或候选为蛤蚧正品；若PCR产物中不含有250-500bp的DNA片段，则所述待测中药样品为或候选为蛤蚧伪品；
(b2)向步骤(a)扩增后的反应体系中加入荧光染料SYBRGreenI，按照如下方法确定待测中药样品为蛤蚧正品还是蛤蚧伪品：若观察到所述反应体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品为或候选为蛤蚧正品；若观察不到所述反应体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品为或候选为蛤蚧伪品；
所述待测中药样品为蛤蚧正品或蛤蚧伪品；所述蛤蚧正品为中药蛤蚧；所述蛤蚧伪品选自变色树蜥、变色沙蜥、丽斑麻蜥、红螺疣螈、中国石龙子和无蹼壁虎的任一种或任几种。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：在步骤(a)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度为60-68℃；或
在步骤(b2)中，确定所述含有荧光染料的体系是否产生绿色荧光是在365nm紫外波长下进行检测的。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：所述250-500bp的DNA片段为412bp的DNA片段；
所述412bp的DNA片段具体为序列表中序列3所示的DNA片段。
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| CN105603107B (zh) * | 2016-03-21 | 2019-06-21 | 中国中医科学院中药研究所 | 基于its序列位点的鉴别酸枣仁及其伪品的pcr方法及试剂盒 |
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