CN111575389B - 一种基于线粒体igs56序列的哈蟆油真伪鉴定和定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于线粒体IGS56序列的哈蟆油真伪鉴定和定量方法，属于分子生物学检测和定量领域。公开了线粒体IGS56序列特征以及三对相关引物的序列特征，用于名贵药材哈蟆油真伪鉴定和定量分析的，IGS56序列为近源物种线粒体基因组序列比对中的高变异区域，首次实现了对近源物种来源的哈蟆油正伪品的鉴定，推广的技术门槛较低，同时能快速、稳定地区分哈蟆油正品与相关伪品。进一步，本发明还公布了一种使用F3/R3引物对进行哈蟆油药材定量分析的荧光定量PCR方法；该法特异性较高，相比药典中现行高效液相色谱法在种属特异性方面优势明显，本发明是对新版中国药典记载及现有技术的合理补充，具有较强的应用前景。

Description

一种基于线粒体IGS56序列的哈蟆油真伪鉴定和定量方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测和定量领域，具体涉及一种蛤蟆油药材的真伪鉴定的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法和一种定量分析的荧光定量PCR方法。

背景技术

哈蟆油(Ranae Oviductus)是1985年首次纳入药典的一味名贵药材，为中国林蛙(Rana temporaria chensinensis David)雌蛙干燥输卵管。自1985年首次纳入至2020最新版药典，哈蟆油基源动物的描述均沿用1938年至1940年Boring的欧洲林蛙(Ranatemporaria)中国林蛙亚种的命名方式。1940年，黑龙江林蛙(Rana amurensis)、中国林蛙(Rana chensinensis)和东北林蛙(Rana dybowskii)等均被归入欧洲林蛙中国林蛙亚种。随着中国林蛙亚种与欧洲林蛙在染色体数等方面的差异被发现，原中国林蛙亚种指代的黑龙江林蛙(R.amurensis)、中国林蛙(R.chensinensis)和东北林蛙(R.dybowskii)分别于1955年、1981年和1999年独立成有效种，亚种命名方式已成为历史。因此，中国药典中持续使用亚种方式已严重滞后，在学术界引起长期争议。因东北林蛙(R.dybowskii)在1985年尚未独立成种，1985版中国药典的中国林蛙亚种的命名方式指代的应为中国林蛙(R.chensinensis)和东北林蛙(R.dybowskii)，而非狭义的中国林蛙(R.chensinensis)。依据《本草图经》、《本草纲目》以及《四库全书》等经典古籍记载，哈蟆油最早主产于我国东北地区，结合我国目前哈蟆油的主产地也为东北地区，目前学术界很多学者建议将药典中哈蟆油基源动物修改为东北林蛙(R.dybowskii)。因产地和产量的限制，市场上的哈蟆油的价格非常昂贵，存在较多伪品。主要伪品包括来源于黑龙江林蛙(R.amurensis)、桓仁林蛙(R.huanrensis)、青蛙(Rana nigromaculata)、牛蛙油(Rana catesbeianna)和中华大蟾蜍油(Bufo gargarizans)等蛙科动物来源的干燥输卵管。

目前药典中记载的哈蟆油鉴别和定量方法为高效液相色谱法检测1-甲基海因。然而因1-甲基海因作为一种化学小分子，在蛙科动物中存在较为广泛，特异性较差。近年来，特异性较强的DNA分子鉴定技术逐渐在中药材鉴定领域应用。DNA条形码(DNA barcoding)技术是首个于2010年纳入药典指导原则的中药材分子鉴定方法，该法基于细胞色素C氧化酶亚基(COI)的编码基因序列，借助于COI基因扩增和测序完成药材分子鉴定。DNA条形码在应用存在非特异性扩增、检测时间较长(含测序环节)和检测成本(含测序成本)和技术门槛较高(需分析测序结果)等明显劣势。部分国内学者采用特异性更强的聚合酶链式反应方法(PCR)在乌鞘蛇、蕲蛇、川贝母和金钱白花蛇等4味药材中尝试基于PCR技术的分子鉴定，并分别于2010年和2015年进入中国药典。2020年新版中国药典中新增聚合酶链式反应法通用技术要求(1001)，可见PCR方法进行中药材分子鉴定呈现较好的前景。哈蟆油的分子鉴定方法尚未进入中国药典，多个课题组(石林春等；王孟虎等)主要是基于COI基因测序建立DNA条形码技术。也有其他学者(黄璐琦等)基于线粒体基因组另外一个编码Cyt B的编码区设计PCR方法进行鉴定。然而上述的现有分子鉴定技术中，仅涉及对蟾蜍、青蛙、黑龙江林蛙或者牛蛙等相对远源的伪品进行鉴定，而缺乏针对中国林蛙、东北林蛙和桓仁林蛙在内的近源正伪品鉴别的方法。

现行哈蟆油分子鉴定技术中，所涉及的基因如COI和CytB均为线粒体基因组编码。线粒体基因组(mitogenome)主要编码线粒体呼吸链部分基因和tRNA，通常为15kb至100kb左右，具有较强的保守性，是物种分子进化研究的重要工具。以哈蟆油正伪品动物来源的拉丁名检索NCBI Genbank数据库，所有涉及物种的线粒体基因组均测序完毕，便于进行进一步的生物信息分析。

发明内容

本发明提供一种基于线粒体IGS56序列的哈蟆油真伪鉴定和定量方法，目的在于提供一种基于特异性PCR的中药材分子鉴定方法，能鉴别包括近源动物在内的哈蟆油正伪品；还在于建立特异性较强的荧光定量PCR药材定量分析方法。

本发明采取的技术方案是：

一种用于哈蟆油药材真伪鉴定和定量分析的IGS56特征序列，如SEQ ID No.1所示。

一种用于真伪鉴定的PCR方法引物F1特征序列如SEQ ID No.2所示。

一种用于真伪鉴定的PCR方法引物R1特征序列如SEQ ID No.3所示。

一种用于真伪鉴定的PCR方法引物物F2特征序列如SEQ ID No.4所示。

一种用于真伪鉴定的PCR方法引物特R2特征序列如SEQ ID No.5所示。

一种基于线粒体IGS56序列的哈蟆油真伪鉴定方法，包括下列步骤：

(1)提取待鉴定样品的基因组DNA：因哈蟆油基因组提取常因少上清而导致基因组提取易于失败，本发明包含两个特征环节，第一，样品处理阶段特征在于加入足量水并在50°条件下处理2.5小时，确保样品膨胀充分，提高上清量；第二，基因组提取完毕后设置质控环节，通过检测种属非特异性的18s rRNA通用引物对扩增信号判定哈蟆油正伪品基因组提取成败，避免假阴性结果出现，所述18s rRNA通用引物对如SEQ ID No.8-9所示，18srRNA扩增信号为1800bp左右条带；

(2)以基因组DNA为模板，分别以F1/R1和F2/R2为引物进行PCR扩增；

(3)用于鉴定哈蟆油真伪品的电泳结果特征条带大小：东北林蛙、中国林蛙、桓仁林蛙和青蛙来源的哈蟆油正伪品的F1/R1产物分别为692bp、856bp、1047bp和596bp；黑龙江林蛙和中华大蟾蜍无信号；仅东北林蛙正品哈蟆油样品的F2/R2产物为290bp，其他均无信号。

一种用于定量分析的荧光定量PCR方法引物F3特征序列如SEQ ID No.6所示。

一种用于定量分析的荧光定量PCR方法引物R3特征序列如SEQ ID No.7所示。

一种基于线粒体IGS56序列的哈蟆油真伪的定量方法，包括下列步骤：

(1)高种属特异性引物设计：因IGS56区域仅96bp，将物种特异性较强的F2/R2 DNA产物序列提交Primer 3.0.1软件生成F3/R3引物对，经验证，仅能在东北林蛙哈蟆油样品出扩增信号；

(2)将环糊精和哈蟆油对照品药材按比例定量混合，分别模拟0％、10％至100％等11个浓度梯度的产品，取适量模拟样品和待检样品，研磨粉粹后加热至恒重，精确称取10mg；

(3)提取12个样品中基因组DNA，精确溶解至50μL双蒸水；

(4)加入F3/R3引物对进行荧光定量PCR扩增；

(5)基于不同浓度和Ct值绘制浓度和Ct值的标准曲线，获得回归方程；

(6)基于待检样品Ct值和回归方程，计算对应的浓度。

本发明通过正品及伪品的完整线粒体基因组序列构建系统进化并计算遗传距离，确定近源物种。基于近源物种线粒体基因组比对的高变异区，建立区分包括近源物种来源在内哈蟆油正伪品鉴定方法，并进一步设计荧光定量PCR方法建立定量分析方法。

本发明的优点是：能实现对不同来源的哈蟆油真伪品进行鉴定，尤其能区因膨胀度和1-甲基海因含量接近而难以区分的正伪品。本发明公布的IGS56序列在物种中差异较大，东北林蛙、中国林蛙和桓仁林蛙中分别为96bp、260bp和451bp(表2)。而现行技术涉及的COI或者CytB基因在近源物种中相似度较高，基因大小相同，分别为1551bp和1143bp，相同碱基占比分别为85.42％(1325/1551)和84.08％(961/1143)(表2)，且不存在超过3个连续碱基差异片段(图3和图4)。本发明公布的荧光定量PCR方法较现行方法特异性较强。F3引物位于IGS56区，经验证F3/R3仅能在东北林蛙样品中出现扩增信号(图7)。建议作为现行方法的补充方法。

附图说明

图1是哈蟆油正品及伪品线粒体基因组系统进化树和遗传距离图；其中A系统进化树显示，中国林蛙、东北林蛙和桓仁林蛙为近源物种；B中上述3个物种的遗传距离较其他物种较小，证实为近源物种；

图2是D2000分子marker条带(天根生化科技公司，MD114)；

图3是近源物种COI基因的多序列比对结果图；图中NC_023529.1：R.chensinensis，NC_023528.1：R.dybowskii，NC_028521.1：R.huanrensis。*代表三物种中相同碱基；。

图4是近源物种Cyt b基因的多序列比对结果图；图中NC_023529.1：R.chensinensis，NC_023528.1：R.dybowskii，NC_028521.1：R.huanrensis。*代表三物种中相同碱基；

图5是近源物种线粒体基因组多序列比对的高变异区图；图中NC_023529.1：R.chensinensis，NC_023528.1：R.dybowskii，NC_028521.1：R.huanrensis。*代表三物种中相同碱基，-代表缺失，经分析该区域为ND5和ND6的基因间隔区，命名为IGS56序列；

图6是哈蟆油真伪鉴定电泳图，图中：A至C中7个样本分别为1：哈蟆油对照药材；2至7为动物输卵管干燥后样本，分别取材于中国林蛙油、东北林蛙、桓仁林蛙、青蛙、黑龙江林蛙和中华大蟾蜍等(详见表1)，D-E中19个样本采样与长白山地区的19个采集点(详见表3)；

图7是引物F3/R3的特异性检测，仅东北林蛙有扩增曲线，证实引物特异性较强；

图8是对照样本的标准曲线图；

图9是IGS56及相关引物简图；IGS56序列位于ND5基因和ND6基因的间隔区，F1/R1、F2/R2、F3/R3为本发明公布的引物对(SEQ ID No.2-7)。

具体实施方式

通过生物信息学分析获得IGS56序列(SEQ ID No.1)，具体如下：

①从NCBI Genbank数据库下载东北林蛙、中国林蛙、桓仁林蛙、黑龙江林蛙、青蛙、中华大蟾蜍等正伪品的线粒体全基因序列，登记号分别对应NC_023528.1、NC_023529.1、NC_028521.1、NC_030042.1、NC_022696.1、和NC_008410.1；

②以牛蛙(NC_002805.1)为外群，通过MEGA v7.0软件构建邻接(Neighbor-Joining，NJ)系统发育树，基于K2P计算的遗传距离，确定东北林蛙、中国林蛙和桓仁林蛙等三个物种为近源物种(图1)；

③利用MEGA v7.0软件进行近源物种东北林蛙、中国林蛙及桓仁林蛙的线粒体全基因组序列比对(即NC_023528.1、NC_023529.1和NC_028521.1)，获得高变异(图5)。经序列分析实际为ND5和ND6基因间隔序列，将其命名为IGS56序列(inter-genic sequence ofND5 and ND6,ND5和ND6基因间隔序列)；

该特征序列涉及2个特征。首先，本发明IGS56序列基于线粒体基因组全序列分析，而现有技术涉及基因的全部序列(COI和CytB)均属于线粒体基因组序列子集。第二，本发明IGS56序列基于近源物种寻找，而现有技术并未明确，且未报道具有对近源物种来源正伪品的鉴定功能；

IGS56序列(NC_023528.1，17059-17154bp)SEQ ID No.1：5’-TAAAAATTGCTTCTAGGCCCCCTTATAGCCTTACGCACGCCCACGTACAATTTTTTAGACAGGGATCGCCACCTAGTAAAGTCCGCTGTTCTATAATCTTACAGC-3’

选取距离IGS56序列最近的ND5基因的3’区中在三个近源物种中完全一致的连续25bp序列为F1(NC_023528.1，16868-16892bp)，在IGS56序列相邻的ND6基因的5’区选取三个近源物种中完全一致的连续26bp序列为R1(NC_023528.1，17534-17559bp)。F1/R1为近源物种通用引物，其对应的DNA产物应为差异化片段大小或者无扩增，其中，东北林蛙、中国林蛙、桓仁林蛙和青蛙中产物理论值分别应为692bp、856bp、1047bp和596bp。黑龙江林蛙和中华大蟾蜍无扩增产物。

引物F1序列(NC_023528.1，16868-16892bp)SEQ ID No.2：

5’-AGTAACCCTCAACTCAGCCGGACAA-3’；

引物R1序列(NC_023528.1，17534-17559bp)SEQ ID No.3：

5’-TCTGGGGCTGGGTGTTTAATATTAAT-3’；

东北林蛙种属特异性引物设计，因IGS56区域仅96bp，为防止因PCR产物片段过小导致与引物二聚体无区分度，将PCR产物大小设计在290bp位置，随即设计出F2(NC_023528.1，17059-17083bp)和R2(NC_023528.1，17294-17318bp)引物。因F2位于IGS56序列区，F2/R2对产物为东北林蛙种属特异，仅在东北林蛙来源正品的290bp位置出现条带，其他所有样本均无条带。

引物F2序列(NC_023528.1，17059-17083bp)SEQ ID No.4：

5’-TAAAAATTGCTTCTAGGCCCCCTTA-3’；

引物R2序列(NC_023528.1，17294-17318bp)SEQ ID No.5：

5’-CTGGGTGGGAGGTGGGGAGTGATGA-3’；

因IGS56区域仅96bp，同时F2/R2片段经验证具有高特异性，将F2/R2 DNA产物序列提交Primer 3.0.1软件生成F3(NC_023528.1，17086-17108)和R3(NC_023528.1，17150-17172)，F3位于IGS56区，预期具有高特异性，符合设计目的；

引物F3序列(NC_023528.1，17086-17108)SEQ ID No.6：

5’-GCCTTACGCACGCCCACATACAA-3’；

引物R3序列(NC_023528.1，17150-17172)SEQ ID No.7：

5’-GGGAGGGGGAGCTTTGCGGGCTG-3’；

一种用于哈蟆油真伪鉴定的PCR方法，其步骤如下：

①样品充分膨胀处理：研磨样品后精确称取10mg，置于2mL离心管中，加入双蒸水1.25mL，于50℃水浴2.5h，充分膨胀；

②基因组DNA提取，并以18s rRNA通用引物对(SEQ ID No.8-9)扩增基因组DNA，检测提取成功率；

③以基因组DNA为模板，分别以F1/R1和F2/R2为引物进行PCR扩增；

④聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，并根据条带大小鉴定哈蟆油真伪品。其中来源于东北林蛙正品哈蟆油的F1/R1产物为692bp，且F2/R2产物为290bp；

引物18s RNA F序列SEQ ID No.8：

5’-TAAAAATTGCTTCTAGGCCCCCTTA -3’；

引物18s RNA R序列SEQ ID No.9：

5’-CTGGGTGGGAGGTGGGGAGTGATGA-3’；

一种用于哈蟆油定量分析的荧光定量PCR方法，其步骤如下：

①取适量以环糊精稀释的0％、10％至100％的对照品哈蟆油药材和待检样品，研磨粉粹后加热恒重后精确称取10mg；

②提取基因组DNA，精确溶解至50μL双蒸水；

③以上述基因组DNA和F3/R3进行荧光定量PCR扩增；

④基于不同浓度和Ct值绘制浓度和Ct值的标准曲线；

⑤基于待检样品Ct值和标准曲线，计算对应的浓度。

下过通过实施例来对本发明做进一步说明，具体实施例为例证目的，旨在对发明的进一步说明，并不用于限制本发明的保护范围。

实施例1基于特异性PCR技术的哈蟆油真伪鉴定方法建立

用于建立方法的正品药材从中国食品药品监督管理局购买，其他样品为收集的动物样本干燥后按传统解剖方法取出输卵管，烘干制备(表1)，样本由东北师范大学人文学院赵莫骄进行鉴定，并按编号标识保存于吉林大学药学院。

表1样本及药材来源

一、基于哈蟆油基源动物近源物种的线粒体基因序列分析获得IGS56序列及引物设计

(1)哈蟆油正品基源动物的近源物种确立

①NCBI Genbank数据库检索并下载东北林蛙、中国林蛙、桓仁林蛙、黑龙江林蛙、青蛙、中华大蟾蜍等正伪品的线粒体全基因序列，登记号分别对应NC_023528.1、NC_023529.1、NC_028521.1、NC_030042.1、NC_022696.1、和NC_008410.1，下载并存为FASTA格式；②以牛蛙(NC_002805.1)为外群，通过MEGA v7.0软件构建邻接系统发育树，检验方法为Bootstrap，次数为1000次。以Bootstrap高于85为近源物种判定标准。构建系统进化树时同时计算遗传距离。遗传距离模型使用K2P(Kimura-2-Para-meter)，Gap处理方式为PairwiseDeletion。外类群的K2P遗传距离作为近源物种的参照。Bootstrap值和K2P遗传距离数据一致证明，东北林蛙、中国林蛙和桓仁林蛙为近源物种(图1)。

(2)近源物种的线粒体编码基因多序列比对

现行的哈蟆油分子鉴定技术中主要基于COI和Cyt b的序列特征进行哈蟆油与远源物种的分子鉴定。为探讨现行技术能否鉴定近源物种，申请人利用MEGA v7.0软件进行了近源物种的COI和Cyt b基因的多序列比对，未发现超过3个连续碱基差异片段，相同碱基占比分别为85.42％(1325/1551)和84.08％(961/1143)(表2，图3和图4)，不具备鉴定可能。

表2 COI、CytB及IGS56在近源物种中差异

(3)近源物种的全线粒体编码基因多序列比对确定IGS56序列

将NC_023528.1、NC_023529.1、NC_028521.1的完整序列导入MEGA v7.0软件，进行多序列比对。结合NCBI数据库对上述序列解析，发现高变异区位于ND5和ND6区，申请人将其命名为IGS56区，并基于比对结果设计引物(图5)。

二、基因组提取，具体步骤如下：

a)样本充分膨胀。精密称取哈蟆油药材粉末10mg于2mL离心管中，加入双蒸水1.25mL(按膨胀度125计算的加水量，高于药典规定的膨胀度最低值55)，于50℃水浴2.5h，保证样品充分膨胀。b)加入3×裂解液[0.03mol/L Tris-HCl(PH8.0)，0.03mol/L EDTA(PH8.0)，0.3mol/L NaCl]400μL，20％SDS溶液15μL，20g·L^－1蛋白酶K20μL，20g/L RNase A4μL充分混匀，于56℃消化过夜。c)混匀后吸取上清(约500μL)于2ml离心管中，加入Tris饱和酚600μL，混匀10min,于13000rpm,4℃条件下离心10min。d)将上清液转移至全新的2mL离心管中，加入Tris饱和酚-三氯甲烷-异戊醇(25：24：1)混合液600μL,混匀10min,于13000rpm,4℃条件下离心10min。e)吸取上清液于2mL离心管中，加入三氯甲烷-异戊醇(24：1)混合液600μL，混匀10min,于13000rpm,4℃条件下离心10min。f)吸取上清液于2mL离心管中，加入无水乙醇1mL,3mol/L NaAc 60μL,混匀，置于-20℃冰箱放置30min,于13000rpm,4℃条件下离心10min,弃去上清液，保留沉淀。g)加入75％无水乙醇700μL，离心10min,弃去上清液，保留沉淀，此过程重复一次，自然干燥后,加入双蒸水50μL溶解，-20℃保存。

三、PCR扩增

(1)具体步骤。以上述提取获得的基因组DNA为模板，以引物对18sRNA F/R、IGS56F1/R1和IGS56 F2/R2进行扩增。

(2)PCR反应体系。共20μL，包括2×Taq PCR Master Mix(天根生物科技有限公司，KT201)10μL、上、下游引物各1μL、模板DNA1μL，用无菌双蒸水补至20μL。

(3)PCR反应程序。95℃预变性5分钟，循环反应30次(95℃变性30秒，55℃复制30秒，72℃延伸30s)，72℃延伸5分钟，16℃1hr。

四、琼脂糖凝胶电泳及结果分析

(1)电泳步骤。称取0.4gArgrose置于锥形瓶中，加入已配制好的1×TAE电泳缓冲液50mL，放置于微波炉中加热，取出轻摇排出气泡，再置于微波炉中加热直至琼脂糖全部融化，混匀，加入5μL10000×GeneGreen核酸染料。制备成含有核酸染料的0.8％的琼脂糖凝胶。然后按照常规步骤加入分子标准D2000(图2)同时进行电泳(图6)。

(2)结果分析。图6A为表1中7样品的18sRNA F/R电泳结果，结果均为阳性，表明基因组提取成功。图6B为表1中7样品的F1/R1引物对结果。哈蟆油标准品泳道条带与东北林蛙油的条带大小一致，证明中国食品药品监督管理局样品实为东北林蛙，将PCR产物进行测序，经BLAST比对确为东北林蛙无误。其他泳道中，中国林蛙油、东北林蛙油、桓仁林蛙油和青蛙油中的扩增产物大小分别为692bp、856bp、1043bp和596bp，其他样本为阴性，与理论值一致。图6C中仅东北林蛙与标准品种的IGS56 F2/R2特异性引物产物出现290bp条带，与图6B一致，均表明标准品为东北林蛙来源。

实施例2更大规模样品验证方法稳定性

依据《本草图经》、《本草纲目》以及《四库全书》等经典古籍记载，哈蟆油最早主产于我国东北地区，为扩大样本进行验证方法稳定性，申请人使用长白山地区收集的19个采样进行实验验证。药材由吉林大学药学院王永生教授鉴定，并保存于吉林大学药学院。

表3长白山地区19个哈蟆油样本来源

实验方法如实施例1中所述，结果如图6D至E。其中，所有样本的F1/R1反应产物条带均为692bp，而F2/R2反应均为290，说明长白山地区的哈蟆油基源动物为东北林蛙，而非中国林蛙。同时，该实例证实本发明稳定可靠重复性高。

实施例3哈蟆油定量分析方法的建立

(1)引物设计

将F2/R2 DNA产物序列提交Primer 3.0.1软件生成F3(NC_023528.1，17086-17108)和R3(NC_023528.1，17150-17172)，其中引物F3位于IGS56区，为东北林蛙特有。

(2)引物特异性验证

使用实施例1中提取的基因组的2-7号样本，加入F3/R3引物。反应体系：20μL，包括2×SuperReal PreMix Plus10μL；50×Rox Referencce Dye△2μL；引物各(10uM)0.6μL；模板DNA1μL；无菌双蒸水5.8μL，反应程序：反应程序设置为95℃，15分钟；95℃，10秒；60℃，32秒，共进行40个循环。结果如图7所示，仅在东北林蛙样品中出现扩增信号，可见引物特异性较好。

(3)对照样品的制备及基因组DNA的提取

取适量由环糊精和哈蟆油对照品药材稀释的0％、10％至100％的11个样品以及待检样品，研磨粉粹后加热至恒重，精确称取10mg；其中，待检样品为哈蟆油市售颗粒产品。提取12个样品中基因组DNA，精确溶解至50μL双蒸水。采用BioTek酶标仪对提取的基因组DNA进行纯度和浓度的测定。其A260nm/A280nm和A260nm/A230nm均位于1.8～2.0之间，并且DNA的浓度均位于10-20ng/μL之间，表明所提取的基因组DNA的质量均满足实验要求。

(4)荧光定量PCR反应

以上述提取获得的基因组DNA为模板，以引物对F3/R3进行扩增。反应体系和反应程序如上所示。

(5)标准曲线绘制

以对照样品中哈蟆油的百分含量为横坐标，以含量的Ct值绘为纵坐标绘制标准曲线，见图8。标准曲线方程为y＝-11.649X+30.967，线性系数R²＝0.9809，说明哈蟆油含量在0％～100％范围内线性关系良好，可用于哈蟆油的定量分析。具体Ct值和浓度如表4所示。

表4荧光定量PCR检测不同样品的Ct值

(6)待测样品浓度计算

本实施例中，待测样品CT值为29.69,代入y＝-11.649X+30.967中计算，浓度为10.96％。与产品说明书中10％-15％的数值一致，方法可靠。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种基于线粒体IGS56序列的哈蟆油真伪鉴定和定量方法

<130> jluyang-001

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 105

<212> DNA

<213> 东北林蛙(人工)

<400> 1

taaaaattgc ttctaggccc ccttatagcc ttacgcacgc ccacgtacaa ttttttagac 60

agggatcgcc acctagtaaa gtccgctgtt ctataatctt acagc 105

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工(人工)

<400> 2

agtaaccctc aactcagccg gacaa 25

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工(人工)

<400> 3

tctggggctg ggtgtttaat attaat 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工(人工)

<400> 4

taaaaattgc ttctaggccc cctta 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工(人工)

<400> 5

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<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工(人工)

<400> 6

gccttacgca cgcccacata c 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工(人工)

<400> 7

gggaggggga gctttgcggg ctg 23

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工(人工)

<400> 8

taaaaattgc ttctaggccc cctta 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工(人工)

<400> 9

ctgggtggga ggtggggagt gatga 25

Claims (5)

1.一种用于哈蟆油药材真伪鉴定和定量分析的IGS56特征序列，其特征在于：IGS56特征序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种用于真伪鉴定的PCR方法引物特征序列，其特征在于：引物F1特征序列如SEQ IDNo.2所示，引物R1特征序列如SEQ ID No.3所示，引物F2特征序列如SEQ ID No.4所示，引物R2特征序列如SEQ ID No.5所示。

3.基于权利要求2所述的引物特征序列进行真伪鉴定的聚合酶链式反应方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)提取待鉴定样品的基因组DNA：因哈蟆油基因组提取常因少上清而导致基因组提取易于失败，包含两个特征环节，第一，样品处理阶段特征在于加入足量水并在50°条件下处理2.5小时，确保样品膨胀充分，提高上清量；第二，基因组提取完毕后设置质控环节，通过检测种属非特异性的18s rRNA通用引物对扩增信号判定哈蟆油正伪品基因组提取成败，避免假阴性结果出现，所述18s rRNA通用引物对如SEQ ID No.8-9所示，18s rRNA扩增信号为1800bp左右条带；

(2)以基因组DNA为模板，分别以F1/R1和F2/R2为引物进行PCR扩增；

(3)用于鉴定哈蟆油真伪品的电泳结果特征条带大小：东北林蛙、中国林蛙、桓仁林蛙和青蛙来源的哈蟆油正伪品的F1/R1产物分别为692bp、856bp、1047bp和596bp；黑龙江林蛙和中华大蟾蜍无信号；仅东北林蛙正品哈蟆油样品的F2/R2产物为290bp，其他均无信号。

4.一种用于定量分析的荧光定量PCR方法引物特征序列，其特征在于：引物F3特征序列如SEQ ID No.6所示，引物R3特征序列如SEQ ID No.7所示。

5.一种基于权利要求4所述引物特征序列的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)高种属特异性引物设计：因IGS56区域仅96bp，将物种特异性较强的F2/R2 DNA产物序列提交Primer 3.0.1软件生成F3/R3引物对，经验证，仅能在东北林蛙哈蟆油样品出扩增信号；

(2)将环糊精和哈蟆油对照品药材按比例定量混合，分别模拟0％、10％至100％等11个浓度梯度的产品，取适量模拟样品和待检样品，研磨粉粹后加热至恒重，精确称取10mg；

(3)提取12个样品中基因组DNA，精确溶解至50μL双蒸水；

(4)加入F3/R3引物对进行荧光定量PCR扩增；

(5)基于不同浓度和Ct值绘制浓度和Ct值的标准曲线，获得回归方程；

(6)基于待检样品Ct值和回归方程，计算对应的浓度。

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