JPH11511979A

JPH11511979A - ヒト乳癌細胞を含むヒト乳腺細胞を標的として、連結された異種性遺伝子を発現させるためのｗａｐまたはｍｍｔｖ制御配列の使用

Info

Publication number: JPH11511979A
Application number: JP9510876A
Authority: JP
Inventors: ギュンツブルク、バルター・ハー; ザラー、ローベルト・ミヒャエル; ザルモンス、ブリアン
Original assignee: ババリアン・ノルディック・リサーチ・インスティテュート・アクティーゼルスカブ; ゲーエスエフ−フォルシュンクスツェントラム・フュア・ウムベルト・ウント・ゲズントハイト・ゲーエムベーハー
Priority date: 1995-09-06
Filing date: 1996-09-06
Publication date: 1999-10-19
Also published as: EP0848757B1; DE69619683T2; ATE214101T1; DE69619683D1; DK0848757T3; ES2174103T3; US20050019307A1; EP0848757A1; WO1997009440A1; AU6987696A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト乳癌細胞を含むヒト乳腺細胞を標的として、連結された異種性ＤＮＡを発現させるためのＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト乳癌細胞を含むヒト乳腺細胞を標的として、連結された異種性遺伝子を発現させるためのＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の使用本発明は、ヒト乳癌細胞を含むヒト乳腺細胞（mammary cells）を標的として、連結された異種性遺伝子、特に治療用遺伝子を発現させるための齧歯類のＷＡＰ（Ｗhey Ａcidic Ｐrotein）およびＭＭＴＶ（Ｍouse Ｍammary Ｔumor Ｖiru s）制御配列の使用に関する。発明の背景乳癌は、女性の癌の中で、最も頻度が高い癌である(Ｍiller and Ｂulbrook,1 986)。現在にいたるまで、伝統的な治療法は、原発腫瘍を外科的に除去した後に、化学療法または放射線療法を行うことである。腫瘍の段階によっては、再発率は非常に高く、多くの場合致命的な結果をもたらす。主な困難は、全ての転移および微小転移を除去することである。この２つの問題に加え、伝統的治療によって引き起こされる患者への副作用は甚大であるため、遺伝子治療のアプローチを開発することが望まれている（遺伝子治療の総説に関しては、Ａnderson,1992を参照）。しかし、遺伝子治療のアプローチでは、腫瘍細胞を標的として治療用遺伝子を発現させなければならないという問題が生じる。それ故、治療用遺伝子が腫瘍細胞内のみで発現することを保証するために、制御要素が必要とされる。種々のタイプの乳腺特異的制御要素を担持するベクター構築物がマウスで試されてきたが、ホルモン刺激を行った乳腺中で、制御要素によってマーカー遺伝子の発現を誘導することが可能となった（ＷＯ-Ａ1−9607748）。妊娠中および授乳中のマウス乳腺で発現を生じさせることが実証された制御要素の１つに、齧歯類ＷＡＰプロモーターの小領域がある（Ｋolb et al.,1994）。該遺伝子は、妊娠中および授乳中の齧歯類の乳腺内でのみ発現し、ヒトには相同物がない（Ｈen nighausen,1992）。それ故、該制御要素が、ヒト乳腺細胞内で発現を誘導するように、および／またはヒト乳癌細胞内での発現を可能とするように何らかの機能を示すことは、予想し得ないことである。このため、乳癌細胞を含む初代（primary）ヒト細胞内で、ＷＡＰ制御配列が連結された異種性遺伝子の発現を誘導し得ることを本発明の発明者が見出した時は、極めて予想外であった。発明の概要従って、本発明は、とりわけ以下のもの：ＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写制御下にある治療用遺伝子であって、ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病の治療のための遺伝子を１以上具備するＤＮＡ構築物；上記のＤＮＡ構築物であって、制御配列が転写開始部位を含むＷＡＰプロモーターの近位の（proximal）445bpを含んでなるＤＮＡ構築物；上記のＤＮＡ構築物であって、制御配列がＷＡＰプロモーター領域のＸhoI／ＸbaI断片320bpを含むＤＮＡ構築物；上記のＤＮＡ構築物であって、制御配列がＭＭＴＶのＵ3領域であるＤＮＡ構築物；上記のＤＮＡ構築物であって、制御配列がＭＭＴＶプロモーターのＰstI断片0 .6kbを含むＤＮＡ構築物；上記のＤＮＡ構築物であって、ウイルスおよびプラスミドベクターから選ばれた組換えベクターであるＤＮＡ構築物；上記の組換えベクターであって、前記ウイルスベクターがＲＮＡおよびＤＮＡウイルスベクターから選ばれ、前記プラスミドベクターが真核細胞性発現ベクターから選ばれている組換えベクター；上記の組換えベクターであって、前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクターまたは組換えヘルペスウイルスベクターである組換えベクター；上記の組換えベクターであって、レトロウイルスベクターがＵ3−Ｒ−Ｕ5構造の5'ＬＴＲ領域；治療用遺伝子をコードするコーディング領域を１以上；および完全にまたは部分的に除去されたＵ3領域を具備し、該除去された領域がＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列を含有するポリリンカーによって置き換えられ、その後にＲおよびＵ5領域が続いている3'ＬＴＲ領域であって、前記治療用遺伝子が該ＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写調節下にある3'ＬＴＲ領域を具備してなる組換えベクター；上記の構築物であって、治療用遺伝子がヒト乳癌治療用の抗腫瘍遺伝子およびサイトカイン遺伝子から選ばれている構築物；上記の構築物であって、前記治療用遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ gpt）、シトクロムＰ450のようなタンパク質をコードする遺伝子、ＳＤＩのようなタンパク質をコードする細胞周期調節遺伝子、p53のようなタンパク質をコードする腫瘍抑制遺伝子、メリチン、セクロピンのようなタンパク質またはＩＬ− 2のようなサイトカインをコードする抗増殖遺伝子からなる群から選ばれる構築物；ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病を治療するための組換えレトロウイルス粒子であって、上記のレトロウイルスベクター構築物、および前記レトロウイルスベクターのゲノムをパッケージするために必要なタンパク質をコードする１以上の構築物を含有するパッケージング細胞系を培養することによって産生される組換えレトロウイルス粒子；ヒトゲノム内に組み込まれたＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写調節下にある１以上の治療用遺伝子を具備する構築物を担持するレトロウイルスプロウイルス；上記のレトロウイルスプロウイルスであって、完全にまたは部分的に除去されたＵ3領域を具備し、該除去された領域がＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列を含有するポリリンカーによって置き換えられ、その後にＲおよびＵ5領域が続いている5'ＬＴＲ領域；治療用遺伝子をコードするコーディング配列を１以上；および完全にまたは部分的に除去されたＵ3領域を具備し、該除去された領域がＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列を含有するポリリンカーによって置き換えられ、その後にＲおよびＵ5領域が続いている3'ＬＴＲ領域であって、前記治療用遺伝子が該ＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写調節下にある3'ＬＴＲ領域からなるレトロウイルスプロウイルス；上記の構築物を含有する細胞系であって、ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病の治療のための細胞系；上記の細胞系であって、上記レトロウイルスベクター構築物、および前記レトロウイルスベクターをパッケージするために必要なタンパク質をコードする１以上の構築物を含有するパッケージング細胞系；上記のレトロウイルスプロウイルスを含有するヒト細胞；上記の細胞を含有するコアおよび該コアを取り囲む多孔性カプセル壁を具備する封入された細胞であって、該多孔性カプセル壁が、ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病を治療するための、前記細胞によって産生される治療用ポリペプチドまたはウイルス粒子に対して透過性である封入された細胞；上記の封入された細胞であって、前記多孔性カプセル壁が対電荷を帯びた多価電解質から形成された多価電解質複合体からなる封入された細胞；ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病を治療するための医薬の調製のための上記構築物の使用；ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病を治療するための医薬の製造のための上記組換えウイルス粒子の使用；ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病を治療するための医薬の製造のための上記細胞の使用；ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病を治療するための薬学的組成物であって、上記のＤＮＡ構築物および薬学的に受容可能な担体または希釈剤を具備する薬学的組成物；ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病を治療するための薬学的組成物であって、上記の組換えレトロウイルス粒子および薬学的に受容可能な担体または希釈剤を具備する薬学的組成物；ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病を治療するための薬学的組成物であって、上記の細胞系および薬学的に受容可能な担体または希釈剤を具備する薬学的組成物；連結された治療用遺伝子をヒト乳癌細胞を含むヒト乳腺細胞内で発現させるためのＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の使用；制御配列が転写開始部位を含むＷＡＰプロモーターの近位の445bpを具備する上記の使用；制御配列がＷＡＰプロモーター領域のＸhoI／ＸbaI断片320bpを含有している上記の使用；制御配列がＭＭＴＶのＵ3領域である上記使用；制御配列がＭＭＴＶプロモーターのＰstI断片0.6kbを含有している上記使用；治療用遺伝子が抗腫瘍遺伝子およびサイトカイン遺伝子から選択される上記使用；前記治療用遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（gpt）、シトクロムＰ450 のようなタンパク質をコードする遺伝子、ＳＤＩのようなタンパク質をコードする細胞周期調節遺伝子、p53のようなタンパク質をコードする腫瘍抑制遺伝子、メリチン、セクロピンのようなタンパク質またはＩＬ−2のようなサイトカインをコードする抗増殖遺伝子からなる群から選ばれる上記の使用；ＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写制御下にある治療用遺伝子がウイルスおよびプラスミドベクターから選ばれた組換えベクターの一部を成す上記の使用；前記ウイルスベクターがＲＮＡおよびＤＮＡウイルスベクターから選択され、前記プラスミドベクターが真核細胞性発現ベクターから選ばれる上記の使用；前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである上記の使用；レトロウイルスベクターがＵ3−Ｒ−Ｕ5構造の5'ＬＴＲ領域；治療用遺伝子をコードするコーディング領域を１以上;および完全にまたは部分的に除去されたＵ3領域を具備し、該除去された領域がＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列を含有するポリリンカーによって置き換えられ、その後にＲおよびＵ5領域が続いている3 'ＬＴＲ領域であって、前記治療用遺伝子が該ＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写調節下にある3'ＬＴＲ領域を具備する上記の使用；治療を必要とするヒトに対して、上記の構築物を投与することを含んでなるヒト乳癌の治療法；治療を必要とするヒトに対して、上記のウイルス粒子を投与することを含んでなるヒト乳癌の治療法；治療を必要とするヒトに対して、上記の細胞を投与することを含んでなるヒト乳癌の治療法；および治療を必要とするヒトの腫瘍部位内またはその近傍に、上記の封入された細胞を移植することを含んでなるヒト乳癌の治療法を単独でまたは組み合わせて具備する。好ましくは、治療用遺伝子は抗腫瘍遺伝子およびサイトカイン遺伝子からなる群の一以上の要素から選択される。好ましくは、前記治療用遺伝子は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（gpt）、シトクロムＰ450のようなタンパク質をコードする遺伝子、ＳＤＩのようなタンパク質をコードする細胞周期調節遺伝子、またはp53のようなタンパク質をコードする腫瘍抑制遺伝子、メリチン、セクロピンのようなタンパク質またはＩＬ−2 のようなサイトカインをコードする抗増殖遺伝子からなる群から選ばれる。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（gpt）、シトクロムＰ450は、これらの酵素によって毒性を示す型に転換されるプロドラッグと組み合わせて、癌治療に用いることができる。本発明によるＤＮＡ構築物は、マーカー遺伝子も担持し得る。好ましくは、該マーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン、アルコール脱水素酵素、ルシフェラーゼ、ピューロマイシン、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ハイグロマイシン、分泌型アルカリフォスファターゼ、および緑色または青色の蛍光タンパク質のようなタンパク質をコードするマーカー遺伝子からなる群から選択される。本発明によって、驚くべきことに、ヒト乳癌細胞を含む初代ヒト乳腺細胞内で、ＷＡＰおよびＭＭＴＶ制御配列が、連結された異種性遺伝子の発現を誘導し得るということが明らかとなった。妊娠中および授乳中の齧歯類の乳腺で、乳漿酸性タンパク質（ＷＡＰ）遺伝子の発現が誘導されていることは周知である（Ｇunzburg et al.,1991,Ｈennighau sen,1992）。ＷＡＰ遺伝子発現は、ホルモン依存性およびホルモン非依存性の両機構によって制御されている。ＷＡＰプロモーター中の負の制御要素（ＮＲＥ;n egative regulatory element）は、ＷＡＰを発現することができない全ての細胞中に存在するＮＲＥ結合因子（ＮＢＦ）（Ｋolb et al.,1995）と相互作用する。乳腺特異性を仲介するのに必要とされるＷＡＰプロモーターの領域は、320bpのＸhoI／ＸbaI制限断片（−413〜−93）であると思われる（Kolb et al.，1995）。さらに、ＮＢＦ結合部位は、0.6kbのＰstI ＭＭＴＶプロモーター断片（Salmons et al.,1985に記載されている）上に存在することが、ある実験によって示されており、ＭＭＴＶによって示される乳腺特異的な発現を制御する役割を果たしているかもしれない（Ｋolb et al.,1995）。ＷＡＰおよびＭＭＴＶが両者ともに、齧歯類系から由来しているという事実は、安全性の上で重要な特質となるかもしれない。何故なら、レトロウイルスベクターにヒト制御配列を用いれば、ベクターが担持する配列と対応する細胞の配列との間で相同的な組換えが促進され、ゲノムが不安定になるかもしれないからである。ＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写調節下にある治療用遺伝子を担持する本発明のＤＮＡ構築物は、リン酸カルシウム沈殿によって(Ｇraham et al,1973,Ｗ igler et al.,1979)、電気穿孔によって（Ｎeumann et al.,1982）、ミクロ注入によって（Ｇraessmann et al.,1983）、リポソームによって（Ｓtraubinger et al.,1983）、スフェロブラスト（spherobalsts）によって（Ｓchaffner,1980）または当業者に公知の他の方法を含めた、既知の細胞内への遺伝子導入法を用いて、細胞内に導入することができる。ＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写調節下にある治療用遺伝子を担持する本発明のＤＮＡ構築物は、組換えウイルスベクターを用いて細胞内に導入することが好ましい。このようなベクターは、当業者に周知であり、レトロウイルスベクター、組換えアデノウイルスおよび組換えアデノ随伴ウイルス（Ｇunzburg and Ｓalmons,1995）、並びにヘルペスウイルスベクターが含まれる。本発明の好適な実施態様において、本発明によるＤＮＡ構築物は修飾されたレトロウイルスベクターであり、好ましくはインビボで、細胞へ治療用遺伝子を供給するために用いられる。レトロウイルスシステムの大きな利点は、レトロウイルスは分裂中の細胞（特に腫瘍細胞のような急速に分裂している細胞）だけに感染することができ、転移している腫瘍細胞と同様に、該ウイルス粒子は血流中に拡散することができることであり、これにより、従来の方法によって検出され得るずっと以前に、微小転移を除去することが可能となるであろう。レトロウイルスベクター系は２つの成分： 1)レトロウイルスベクター自体は、修飾されたレトロウイルス（ベクタープラスミド）であり、ウイルスタンパク質をコードしている遺伝子が、標的細胞に運ばれる治療用遺伝子および／またはマーカー遺伝子と置き換えられている。ウイルスタンパク質をコードしている遺伝子の置換によって、ウイルスの機能が顕著に喪失するので、修飾されたレトロウイルスに喪失したウイルスタンパク質を供給する系中の第２の成分によって、レトロウイルスを救出しなければならない。第２の成分は、 2)大量のウイルスタンパク質を産生するが、複製能力を有するウイルスを産生することができない細胞系である。該細胞系は、パッケージング細胞系として知られており、修飾されたレトロウイルスベクターをパッケージングすることができる遺伝子を担持する１以上のプラスミドでトランスフェクトされた細胞系からなる。からなる。パッケージされたベクターを作出するためには、ベクタープラスミドをパッケージング細胞系にトランスフェクトする。これらの条件下で、挿入された治療用およびマーカー遺伝子を含む修飾されたレトロウイルスゲノムは、ベクタープラスミドから転写され、修飾されたレトロウイルス粒子（組換えウイルス粒子）中にパッケージされる。次に、該組換えウイルスを用いて標的細胞を感染させ、ベクターゲノムおよび全ての担持されたマーカーまたは治療用遺伝子を該標的細胞のＤＮＡ中に組み込ませる。これらの細胞中にはウイルスタンパク質が全く存在していないので、このような組換えウイルス粒子に感染した細胞は、新しいベクターウイルスを産生することができない。しかし、治療用およびマーカー遺伝子を担持するベクターのＤＮＡは、プロウイルスとして細胞のＤＮＡに組み込まれ、被感染細胞中で発現できるようになる。ＷＯ−Ａ1−9607748は、新型のレトロウイルスベクター、プロコンベクター（ＰroＣon−vector）の原理および構築を記載している：該レトロウイルスゲノムは、Ｒ−Ｕ5−gag−pol−env−Ｕ3−Ｒ構造を有するＲＮＡ分子からなる。逆転写の過程でＵ5領域は複製され、生じたＤＮＡ分子の右側末端に配置されるが、Ｕ3領域は複製されて、生じたＤＮＡ分子の左側末端に配置される。生じた末端配列Ｕ3−Ｒ−Ｕ5はＬＴＲ（Ｌong Ｔerminal Ｒepea t）と呼ばれ、従って同一であり、ＤＮＡ構造またはプロウイルスの両端で繰り返される（Ｖarmus,1988）。プロウイルスの左側末端のＵ3領域は、感染が起こった後で発現を誘導するために使用されるプロモーターを有する。該プロモーターは、左側のＵ3とＲ領域の間の境界から始まり、右側のＲとＵ5領域の間の境界で終わるＲＮＡ転写物の合成を誘導する。該ＲＮＡは、レトロウイルス粒子中へパッケージされ、感染させるべき標的細胞へ輸送される。標的細胞内で、ＲＮＡゲノムは、上述のように逆転写される。プロコンベクタープラスミドでは、右側（3'）のＵ3領域は変化しているが、通常の左側(5')のＵ3構造は保持されている；パッケージング細胞中へ導入されるとすぐに、左側（5'）のＵ3領域内に位置する通常のレトロウイルスプロモーターを利用して、該ベクターは正常にＲＮＡへ転写され得る。しかし、生じたＲＮＡは、変化した右側の（3'）のＵ3構造のみを含有しているであろう。逆転写の後、被感染標的細胞内では、該変化したＵ3構造はレトロウイルス構造の両端において、両ＬＴＲの中に存在するであろう。もし変化した領域がＵ3領域の代わりにポリリンカーを担持していれば、ＷＡＰ制御配列のような組織特異的発現を誘導するプロモーターを含めた全てのプロモーターが容易に挿入されるであろう。次に、該プロモーターは、レトロウイルスベクターが担持する連結された遺伝子を専ら標的細胞内で発現させるために用いることができる。さらに、遺伝子を標的化する目的で、１以上の細胞配列と相同性のあるＤＮＡセグメントを相同的な組換えによってポリリンカー内に挿入することができる。本発明のレトロウイルスベクターは、プロコン型である必要はなく、ＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写調節下にある治療用遺伝子を担持する、どのような従来のレトロウイルスベクターであってもよい。このようなベクターには、自己不活性化ベクター（ＳＩＮ；Ｓelf−Ｉnactiva ting−Ｖectors）が含まれ、該ベクター内においてレトロウイルスプロモーターは、標的細胞内で機能的に不活性化される（ＷＯ−Ａ1−94／29437）。これらのベクターのさらなる修飾には、２重コピーベクター（ＷＯ−Ａ1−89／11539）を作るために、ＬＴＲ領域内のプロモーター遺伝子のカセットを挿入することが含まれる。これらの両ベクターにおいて、ベクターの本体またはＬＴＲ領域中の何れかに挿入された異種性プロモーターは、治療遺伝子と直接連結されている。本発明のベクターは、好ましくは、内部プロモーターとしてＷＡＰまたはＭＭＴＶプロモーターが用いられているレトロウイルスベクター、すなわちＬＴＲ− neo−ＷＡＰ−tk−ＬＴＲであるが、最も好ましくは、本発明のレトロウイルスベクターはプロコン型のものである。好ましくは、レトロウイルスベクターはＢＡＧベクター（Ｐrice et al.,1987 ）もしくはＬＸＳＮベクター（Ｍiller and Ｒosman，1989）の何れか、またはこれらの誘導体である。レトロウイルス粒子は、ベクター構築物（例えば、gag、polおよびenv）が欠如した要素であって、感染性レトロウイルスの産生に必要なベクター要素を含むパッケージング細胞中にウイルスベクター構築物を導入することによって作成することができる。パッケージング細胞系は、psi−2(Ｍann et al.,1983)、psi−Ｃrip(Ｄanos a nd Ｍulligan,1988)、psi−ＡＭ(Ｃone and Ｍulligan,1984)、ＧＰ＋Ｅ−86(Ｍ arkowitz et al.，1988a)、ＰＡ317（Ｍiller and Ｂuttimore，1986）、ＧＰ＋ envＡＭ−12（Ｍarkowitz et al.,1988b）、Ｂosc23、Ｂing(Ｐear et al.，199 3)またはＦＬＹＡ13、ＦＬＹＲＤ18（Ｃasset et al.,1995）、またはエンベロープに包まれた別のウイルスからの表面タンパク質を発現させ得る組換え構築物でこれらをトランスフェクトしたもの全てからなる群の要素から選択することができる。このようなシュードタイプの（pesudotyped）レトロウイルス粒子は、ＰＣＴ／ＥＰ96／01348に記載されている。特に好適な実施態様においては、パッケージング細胞系はヒト細胞、例えばＨＴ1080細胞（ＷＯ−Ａ1−9621014）、293（Ｇraham et al.，1977）またはミンク細胞系から作成され、これによって、ヒト血清による不活化から免れることができる組換えレトロウイルスの産生が可能となる。本発明においては、「ポリリンカー」なる語は、任意のプロモーターまたはＤＮＡセグメントを容易に挿入し得るユニークな制限部位を担持する、人工的に合成した一続きの短いＤＮＡに対して用いる。「異種性の」なる語は、通常、本来は密接に連関して見出されない、任意のＤＮＡの組み合わせに対して用いる。ウイルス粒子の保存および投与精製または濃縮された組換えレトロウイルスは、まず組換えレトロウイルスを含む溶媒に十分量の調製用緩衝液を加えることによって、水性懸濁液を形成させて保存してもよい。調製用緩衝液とは、糖質、高分子量の構造用添加物、および水中の緩衝成分を含む水溶液である。また、該水溶液は１以上のアミノ酸を含んでもよい。組換えレトロウイルスは、精製した形態で保存してもよい。さらに具体的には、調製用緩衝液の添加前に、フィルターを通過させることにより、上述の未精製（Ｃrude）組換えレトロウイルスを清澄にして、続いてクロスフロー濃縮システム（Ｆiltron Ｔechnology Ｃorp.,Ｎorborough,ＭＡ）などによって濃縮してもよい。ある実施態様においては、外来ＤＮＡを消化するために、該濃縮物にＤＮアーゼを添加する。次に、該消化物を分離濾過（diafiltrate）して、過剰な溶媒成分を除去し、さらに好ましい緩衝作用を持った溶液中にて、組換えレトロウイルスを確立する。続いて、該分離濾過物をセファデックスＳ−500ゲルカラムに通して、精製された組換えレトロウイルスを溶出させる。構成成分が所望の最終濃度に達するが、組換えレトロウイルスの希釈が最小限になるように、該溶出液に調製用緩衝液を十分量加え、好ましくは−70℃で該水性懸濁液を保存するか、または即座に乾燥して保存する。先に、特記したように、調製用緩衝液は、糖質、高分子量の構造用添加物、および水中の緩衝用成分を含む水溶液である。該水溶液は、１以上のアミノ酸を含有してもよい。イオン交換カラムクロマトグラフィーによって、未精製組換えレトロウイルスを精製することもできる。通常、未精製組換えレトロウイルスは、フィルターを通過させることによって清澄にされ、高度にスルホン化されたセルロースマトリックスを含むカラムに、該濾過物を載せる。高塩濃度の緩衝液を用いることによって、組換えレトロウイルスは精製された形でカラムから溶出される。次に、該溶出液を分子排除カラムに通して、高塩濃度緩衝液をさらに好ましい緩衝液に交換する。続いて、上述したように、精製された組換えレトロウイルスに調製用緩衝液を十分量添加し、水性懸濁液を即座に乾燥するか、または好ましくは−70℃ で保存する。未精製または精製された形態の水性懸濁液は、凍結乾燥または周囲の温度での蒸発によって乾燥してもよい。具体的には、凍結乾燥は、水性懸濁液をガラス転移温度または水性懸濁液の共晶点（eutectic point）温度以下に冷却し、該冷却した懸濁液から昇華によって水を除去して凍結乾燥されたレトロウイルスを形成するステップを含む。一度凍結乾燥されれば、組換えレトロウイルスは安定であり、以下でさらに詳述されているように、−20〜25℃で保存してもよい。蒸発法においては、周囲の温度で蒸発させることによって、水は水性懸濁液から除去される。水は、スプレー乾燥によっても除去することができる。前述したように、調製に用いられる水溶液は、糖質、高分子構造添加物、緩衝用成分、および水からなる。該溶液は、１以上のアミノ酸を含んでもよい。これらの成分の組み合わせは、凍結および凍結乾燥、または蒸発による乾燥に際して、組換えレトロウイルスの活性を保存するように作用する。高分子量構造用添加物は、凍結する間にウイルスが凝集するのを防ぐ役目を果たし、凍結乾燥または乾燥した状態で、構造的支持を与える。本発明においては、構造用添加物は、分子量5000以上であれば、「高分子量」と考えられる。好適な高分子量構造用添加物は、ヒト血清アルブミンである。アミノ酸が存在する場合、水性懸濁液を冷却および融解する際に、さらにウイルスの感染能を保存するように機能する。加えて、アミノ酸は、冷却した水性懸濁液が昇華する間および凍結乾燥された状態の間、さらにウイルスの感染能を保存するように機能する。緩衝用成分は、相対的に一定のpＨを維持することによって、溶液に緩衝能を与えるように作用する。所望のpＨ範囲（好ましくは7.0〜7.8）によって、様々な緩衝液を用いることができる。組換えレトロウイルスの調製用水溶液は、ＷＯ−Ａ2−96121014の中で詳述されている。さらに、水溶液は、最終調製された組換えレトロウイルスを適切な等張塩濃度に調整するために用いられる中性の塩を含有することが好ましい。様々な物質を用いて、凍結乾燥されたまたは脱水されたレトロウイルスを再構成してもよいが、水を用いて再構成することが好ましい。ある例では、最終的調製物を等張にする希釈塩溶液を用いてもよい。さらに、再構成したレトロウイルスの活性を増強することが知られている成分を含む水溶液を用いることも有用であるかもしれない。このような成分には、ＩＬ−2のようなサイトカイン、プロタミンサルフェートのようなポリカチオン、または再構成されたレトロウイルスの形質導入効率を増大せしめる他の成分が含まれる。凍結乾燥されたまたは脱水された組換えレトロウイルスは、任意の適度な容量の水で再構成してもよく、または該凍結乾燥されたもしくは脱水されたサンプルを実質的に、好ましくは完全に可溶化し得る再構成試薬によって再構成してもよい。組換えレトロウイルス粒子は、例えば腫瘍臓器または腫瘍部位のような部位を含む極めて多様な場所に投与してもよい。他の実施態様においては、組換えレトロウイルスは経口、静脈内、頬／舌下、腹腔内、または皮下投与してもよい。１日投与量は、正確な投与様式、投与される形態、投与の対象となる症候、その患者およびその患者の体重、さらに担当医の選択および経験に依存する。本明細書に記載した投与経路は、針、カテーテルまたは関連する用具を用いて直接投与することによって容易に達成し得る。特に、本発明の実施態様においては、１以上の投与形態によって、直接投与してもよい。本発明の他の実施態様では、ＷＡＰもしくはＭＭＴＶ制御配列の転写調節下にある治療用遺伝子を担持する治療ウイルス粒子または治療用ポリペプチドの何れかを産生する本発明による細胞系は、治療用ポリペプチドまたは産生されたウイルス粒子を通過させ得る多孔性の膜に封入されている（Ｓtange et al.，1993，Ｄautzenberg et al.，1993,Ｍerten et al.，1991，および英国特許出願第2135 954 号参照）。本発明による封入された細胞は、例えば多価電解質（例えば、サルフェート基を含有する多糖もしくは多糖誘導体、またはスルフォネート基を含有する合成ポリマーから選択される）の水溶液中に細胞を懸濁して調製することができ、対電荷を帯びた多価電解質（例えば、４級アンモニウム基を有するポリマーのような多価電解質）の水溶液を含む沈殿漕中に、プレフォーム粒子形態での懸濁液を導入する。サルフェート基含有多糖または多糖誘導体には、硫酸セルロース、酢酸硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロース硫酸、デキストラン硫酸、またはデンプン硫酸の塩、特にナトリウム塩の型が含まれる。スルフォネート基を含有する合成ポリマーは、ポリスチレンスルフォネート塩、好ましくはナトリウム塩であり得る。４級アンモニウム基を有するポリマーには、ポリジメチルジアリルアンモニウムまたはポリビニルベンジル−トリメチルアンモニウム、それらの塩、好ましくは塩素塩が含まれる。好ましくは、このようなカプセルは、0.5−50％、好ましくは2−5％の硫酸セルロースナトリウムおよびＰＢＳ中の5％ウシ胎児血清を含む溶液中に、本発明の細胞を懸濁することによって調製される。次に、ＰＢＳ中の0.5−50％、好ましくは2−10％、または最も好ましくは3％ポリジメチル−ジアリルアンモニウムクロライドを含む沈殿漕を攪拌しながら、分配システム（例えば、エアジェットシステムまたは圧電性システム）によって、該懸濁液を滴下させる。カプセルの形成はミリ秒以内に起こり、細胞を含有するカプセルを30秒〜5分間沈殿漕内に放置した後、洗浄する。本方法は迅速であるため、全操作の間、細胞が過度の刺激に晒されることはない（Ｓtange et al.，1993）。封入された細胞は、通常の細胞培養培地内（培地の性質は、封入化された細胞に依存する）にて、標準的な湿度、温度、およびＣＯ₂濃度条件で生育させることができる。該培養期間中、カプセルから細胞培養培地中に、治療用ポリペプチドおよびウイルス粒子が産生されることを示し得る。ウイルス粒子の産生は、ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、または（0.45μｍフィルターで濾過された）無細胞上清を標的細胞へ移した後、ウイルス粒子内に含有されているウイルスベクター構築物によって担持されている遺伝子がコードするマーカータンパク質の活性に対するアッセイによってウイルス感染を示すことにより、実証することができる。ウイルスベクターによって担持されているマーカー遺伝子が、標的細胞に特定の化合物に対する耐性を与える遺伝子、またはその産物が容易に細胞上にて、細胞ベース（cell basis）でアッセイされれば（例えば、緑色もしくは青色の蛍光タンパク質）、システムによって産生されたウイルスの力価を確認することができる。適切な培養期間の後（通常、少なくとも１時間、30日を超えない）、直接、または胸を含む身体の様々な領域中へシリンジを用いて注射することによって、カプセルを含む細胞を外科的に移植することができる。図図１：ＭＬＶのＵ3を除去し、該部位にＳacII−Ｍluポリリンカーを挿入するために用いるプライマーＡ、Ｂ、およびＣ図２：プラスミドpＳmaＵ3delの調製図３：プラスミドpＢＡＧＮＵ3delおよびpＣＯＮ6の調製図４：プラスミドpＭＭＴＶ−ＢＡＧの調製図５：ＭＭＴＶのＵ3−領域の増幅に用いるプライマーＤおよびＥ図６：プラスミドpＭＭＴＶ−ＢＡＧ図７：ＷＡＰプロモーターの近位の445bpおよびヒト成長ホルモンの最初の143bp を含有する配列の増幅に用いたプライマーＦおよびＧ図８：プラスミドpＷＡＰ−ＢＡＧの調製図９：プラスミドpＷＡＰ−ＢＡＧ図１０：初代ヒト乳腺細胞に感染させた後のベクター構築物のβＧal発現以下の実施例によって、さらに本発明を説明する。しかし、明瞭な変更が明らかであり、さらにその他の変更および置換が当業者には明らかであろうが、本実施例は、本発明の範囲の限定を意図するものでは決してない。本発明を実施するのに用いられる組換えＤＮＡ法は、標準的な操作であり、当業者には周知である。例えば、「Ｍolecular Ｃloning」（Ｓambrook et al．19 89）および「ＡＰractical Ｇuide to Ｍolecular Ｃloning」（Ｐerbal，1984 ）に詳述されている。実施例１Ｕ3領域の除去およびポリリンカーの挿入 β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、ＢＡＧ（Ｐrice et al.，1987）として知られているマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクター内で、ＬＴＲ中のＵ3領域にある無差別（すなわち組織非特異的）なＭＬＶプロモーターによって発現される。本発明に従って、ＭＬＶプロモーター（Ｕ3）が3'ＬＴＲ内に位置するＢＡＧベクター誘導体であって、逆方向反復配列がＰＣＲによって除去され、ポリリンカーによって置換されたＢＡＧベクター誘導体を構築した。Ｕ3 が欠如したＢＡＧベクターがパッケージング細胞系中へ導入されると、5'ＬＴＲ内のＭＬＶプロモーター（Ｕ3）から発現する。細胞サイクルの間に、レトロウイルスゲノム中で起こる再配置の結果として、標的細胞への感染後、ＷＯ−Ａ1 −9607748中で述べられているように、ポリリンカーはレトロウイルスゲノムの両末端に複製して配置されるであろう。このようにして、ＢＡＧのβ−ガラクトシダーゼが、ポリリンカー中に挿入された何らかの異種性プロモーターによって制御されるであろうレトロウイルスベクターを構築することができる。ＰＣＲのテンプレートとして、我々はpＢＡＧＮ（ＬＴＲを１つだけ担持するＢＡＧ構築物誘導体を担持するプラスミドであり、オリジナルのpＢＡＧをＮheI で消化した後、7018bp断片を自己連結することによって作成する）を用いた。プライマーAの3'末端は、ＬＴＲのＲ−領域と相補的である（図１）。5'伸長部は人工の（art.）ポリリンカーおよび人工の逆方向配列（ＩＲ（art.））を含む。プライマーＢは、ＬＴＲのＵ5領域と相補的である（図１）。47℃でのアニーリング、60℃での伸長を35サイクル行った後、140bpの産物が得られ、第２のＰＣＲのテンプレートとして用いた。この反応で、プライマーＢとプライマーＣ（図１）を組み合わせて用いて、ＣlaI部位および人工的（＋）ＰＢＳをＩＲ領域の5'に付加した。53℃でアニーリングを行い、72℃で伸長を行った。35サイクルの後、163bpの産物が得られ、これをＣlaIおよびＳmaIで消化して、pＳmaIのＣlaI／ＳmaI断片（2722bp）に連結した（図２）。ＳmaIでの消化によって、生じたプラスミドpＳmaＵ3del（2792bp）を直鎖状にして、pＢＡＧＮのＳmaI断片（3677bp）（図３）に連結し、プラスミドpＢＡＧＮＵ3del（6469bp）を得た。テンプレートとしてpＳmaＵ3delを用いて、ＣlaI部位からＵ5領域まで配列決定することによって、Ｕ3領域が欠如していることを確認した。pＢＡＧＮＢ（pＢＡＧＮの3946bp断片を自己に連結して作成される）のＣlaI／ＮheI断片に、Ｕ3を欠いたＬＴＲを含有するＣlaI／ＳpeI（322bp）断片を連結し、プラスミドpＣＯＮ6（4097bp）を得た。さらなるクローニングの基礎として、完全にＵ3を喪失したレトロウイルスベクターを担持する該プラスミドを用いた。上述した原理に従って、以下の特異的プロモーターをポリリンカー領域または修飾したＢＡＧベクター中へ挿入した。実施例２ pＭＭＴＶgalのクローニング逆方向反復配列を持たない、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）Ｕ3−領域（mtv −2）には、グルココルチコイドホルモンに対する応答性を与える領域、および乳腺に対して発現を指令する要素を含有する領域が含まれる。プラスミドpＢＧ102（mtv2からの3'ＬＴＲを含むプラスミド）をテンプレートとして用い、プライマーＤおよびプライマーＥでＰＣＲ行うことによって、ＭＭＴＶのＵ3領域を増幅した。プライマーＤの3'末端はＭＭＴＶＵ3領域の5'末端と相補的であり、5'伸長部にＳacII部位を担持する（図５）。プライマーＥの3'末端は、ＭＭＴＶＵ3領域の3'末端と相補的であり、5'伸長部にＭluI部位を有する（図５）。 49℃でのアニーリングおよび72℃での伸長を35サイクル行った後、1229bpの産物が得られ、ＳacIIおよびＭluIで消化して、ＳacII／ＭluIで消化したベクター pＣＯＮ6に連結した。ＸbaIおよびＨindIIIを用いて、生じたプラスミドp125.6 （5305bp）（図４）を消化し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むpＢＡＧＮの4 190bp断片に4187bp断片を連結して、トランスフェクト後にはＭＬＶプロモーターの転写調節下にあり、感染後にはＭＭＴＶプロモーターの転写調節下にあるプラスミドpＭＭＴＶ−ＢＡＧ（8377bp）を得た（図６）。実施例３転写開始部位を含むＷＡＰプロモーターの近位445bpを包含する乳漿タンパク質（ＷＡＰ）プロモーター領域のクローニングＷＡＰプロモーターの近位445bpを具備する配列およびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）の最初の143bpを具備する配列を増幅することによって、ＷＡＰプロモーターの近位445bpの転写調節下にあるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpＷＡＰＢＡＧを調製した。該配列は、プライマーＦおよびＧ（図７）を用いたＰＣＲによって、pＷＡＰ2−ＨＧＨ（Ｇunzburg et al.,1991）から増幅した。両プライマーは、末端配列として、ＳacIIおよびＭluI認識部位を担持した。増幅された606bp産物およびpＣＯＮ6をＳacIIとＭluIで消化し、ベクターの4094bp断片およびＰＣＲ産物をともに連結して、pＷＡＰ.6.を作成した。生じたベクターpＷＡＰ.6（4687bp）中に、Ｅ.Ｃoliのβ−ガラクトシダーゼ（β−g al）遺伝子をクローニングした（図８）。pＷＡＰ.6およびpＢＡＧＮをＢamＨI で消化して、該直鎖化されたベクター断片およびpＢＡＧＮの3072bpβ−gal断片をともに連結した。生じたプラスミドはpＷＡＰＢＡＧ（図９）であり、ＷＡＰ −ＮＲＥを含む3'445bpとともに、ＨＧＨコーディング配列の5'143bpを含むプロコンベクターが、3'ＬＴＲ中のＵ3領域に代わって挿入された。実施例４ポリリンカー中に挿入されたＷＡＰおよびＭＭＴＶプロモーターの転写調節下でのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現の制御は、構築されたＭＭＴＶおよびＷＡＰレトロウイルスベクターを用いて、種々の細胞に感染させる感染テストによって有効性を評価した。レトロウイルスベクター粒子を産生するために、パッケージング細胞系ＰＡ31 7（Ｍiller and Ｂuttimore，1986）中に、ＭＭＴＶおよびＷＡＰプロコンベクターをトランスフェクトした。ネオマイシン耐性（ベクターによってコードされている）に対する選択の後、組換えプロコンウイルスの安定な群およびクローンを産生する細胞を得た。これらの群からの上清を含むウイルスを用いて、整復的乳房形成（reduction mammaplasties）から得て、体外培養した正常な初代ヒト乳腺組織を感染させた。ＷＡＰおよびＭＭＴＶプロモーターは妊娠ホルモンに応答することが知られているので、該組織は、10^-6Ｍのデキサメタゾン、インシュリン（1μg／ml）、ＥＧＦ（5ng／ml）およびコルチゾール（0.1g／ml）の存在下で生育せしめた。マーカー遺伝子の発現は、化学発光によるβ−ガラクトシダーゼ活性の検出に基づく定量的β−galアッセイによって決定した。 β−galアッセイ β−ガラクトシダーゼ活性のレベルは、製造者の指示に従い、トロピックスキット（Tropix kit）を用いてアッセイした。細胞にトリプシン処理を施し、ＰＢＳで２度洗浄して、溶解させた。タンパク質濃度は、修正したローリー（Ｌowry）（ＢioＲad ＤＣ protein assay）によって決定した。β−galアッセイには、5 および10μｇのタンパク質を用いた。該キットは、酵素によって切断された基質を用い、このため酵素活性の量は、発生した光量に比例する。Ｂerthold Ａuto Ｌumat953（ＥＧ＋ＧＢerthold）中で化学発光を測定することによって、発現を定量した。組織化学的染色による被感染細胞の検出は、以前に概説したように（［Ｃepko ，1989］）行った。簡潔に述べれば、冷やしたＰＢＳで細胞を洗浄し、次に2％のパラホルムアルデヒド溶液で20分間固定した。ＰＢＳで徹底的に洗浄した後、基質Ｘ-galを含有する溶液（20mＭＫ₃FeＣＮ₆,20mＭＫ₄ＦeＣＮ₆・3Ｈ₂Ｏ，2m ＭＭgＣl₂および1mg／ml Ｘ−gal）中で、該細胞を少なくとも２時間、37℃でインキュベートした。全ての実験で、陽性対照として、元の組織非特異的なＢＡＧベクターを用いた。ＢＡＧ、ＷＡＰＢＡＧおよびＭＭＴＶＢＡＧで正常初代ヒト乳腺細胞を感染した後、３つの独立した実験で、サンプルはβガラクトシダーゼ発現を示した（図１０）。このように、ＷＡＰ制御配列およびＭＭＴＶ-Ｕ3領域が、初代ヒト乳腺細胞の中で、ＭＬＶレトロウイルスベクター中の遺伝子の発現を誘導し得ることが初めて実証された。実施例５シトクロムＰ450は、一般的に用いられる癌のプロドラッグであるシクロホスファミド（ＣＰＡ）およびイフォスファミド（ifosfamide）の水酸化を触媒して、活性をもった毒性型にする。通常は、患者の内在性シトクロムＰ450遺伝子の発現は肝臓に限定されており、全身投与されたＣＰＡの抗腫瘍効果は、引き続き、肝臓から毒性をもった薬品代謝物が全身に分配されることに依存する。活性化された薬物が腫瘍に影響を与えるのみならず、骨髄および腎臓のような、患者の他の正常組織にも影響を与えるので、これは毒性という問題を引き起こす。シトクロムＰ450遺伝子を腫瘍細胞中へ、直接選択的に導入して、これらの細胞内で過剰発現させるという治療的アプローチによって、この問題が回避されるかもしれない。形質導入された腫瘍細胞から産生された毒性代謝物は、濃度勾配依存的な様式で、周囲の形質導入されていない腫瘍細胞に影響を与える。さらに、シトクロムＰ450／ＣＰＡシステムの利点は、周囲の細胞への細胞毒性効果のために、細胞の複製に依拠しないことである。細胞サイクルの相に関わらず、生成した活性代謝物の一つがストランド間のクロスリンクを引き起こすためである。その後、ＤＮＡ合成の間、これらのストランド間のクロスリンクは細胞死をもたらす。ＷＡＰ制御配列の調節下にあるラットシトクロムp450遺伝子を担持するレトロウイルスベクターの構築：ラットシトクロムＰ450 2Ｂ1遺伝子を産生するために、ラット肝臓癌細胞系の細胞であるＨＴＣを溶液Ｄ（4Ｍグアニジウムチオシアネート、25mＭクエン酸ナトリウムpＨ7、0.5％Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム、0.1Ｍ 2−メルカプトエタノール）で溶解させ、水を飽和させた、同量のフェノールおよび1／5容量のクロロホルム／イソアミルアルコール（49：1）中の1／15容量の3Ｍ酢酸ナトリウムを加えることによって抽出した全ＲＮＡを添加し、混合液全体を激しく混ぜ合わせた。氷上に置いて15分後、4℃で該抽出物を20分間、10,000gで遠心した。水相中のＲＮＡは、等量のイソプロパノールによって、20℃で30分間沈殿させ、 4℃、10,000gで遠心した。該沈殿を70％エタノールで洗浄し、15分間室温で放置した。4℃、10,000gで5分間遠心した後、真空乾燥機で沈殿物を乾燥し、0.5％のＳＤＳ溶液中に再び溶解させた。 cＤＮＡ合成のプロトコール（Ｐharmacia）を用いて、抽出したＲＮＡを逆転写する。生じたcＤＮＡは、ＰＣＲ用のテンプレートとして用いる。プライマーは、左側のプライマーにＢamＨI制限部位（下線を付した部分）が含まれ（例えば、5'−ＡＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＴＧＣＡＣ−3'）、右側のプライマーにＢamＨI部位(下線を付した部分)が含まれる(例えば、5'−ＣＧＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＣＡ−3')ようにデザインされる。両プライマーは、適切な制限酵素による切断効率を上昇させるために、5'末端に塩基が付加されている。1562bpの産物をＢamＨIで消化し、得られたP450の遺伝子を含む断片は、ＢamＨIで消化されたプラスミドpＷＡＰ.6に連結される（実施例３）。リポフェクション（lipofection）の１日前に、6cmのペトリ皿または培養皿中に3×10⁵のレトロウイルスパッケージング細胞を植え付ける。感染の日に、ＷＡＰ制御配列の転写調節下でシトクロムP450をコードする２μｇのベクターと100 μｌの無血清培養液を混合する。平行して、15μｌのリポフェクタミン（Ｌipof ectamine；Ｇibco ＢＲＬ）を100μlの無血清培養液と混合する。リポフェクタミン−ミックスにプラスミドを含有する溶液を加え、45分間インキュベートする。35分後に、2mlの無血清培養液で一度細胞を洗浄する。800μlの無血清培養液をリポフェクション−ミックスに加え、得られた1mlを調製した細胞上に滴下する。6時間後に、10％ＦＣＳを含む1mlのダルベッコの修正イーグル培地を加える。翌日、細胞をトリプシン処理し、1:10に希釈して、100mlの皿に植え付ける。2 4時間後に、ネオマイシン類縁体Ｇ418を含む培養液と培地を置換する。単一の細胞クローンまたは細胞群を単離し、Ｐ450の発現を分析する。細胞の封入および封入された細胞の移植 1mlの0.5−50％（ただし、好ましくは2−5％）の陰イオン性ポリマー（例えば、硫酸セルロースナトリウム）溶液であり、さらに5％ウシ胎児血清も含む溶液中に、パッケージング細胞を産生するレトロウイルスベクターを懸濁する。次に、0.5−50％のポリマー性ポリカチオン（例えば、ポリジメチルジアリルアンモニウム）を含む沈殿漕を攪拌しながら、分配システム（例えば、Ａ−ジェットシステムまたは圧電性システム）によって、該懸濁液を滴下させる。カプセルの形成はミリ秒以内に起こり、細胞を含有するカプセルを30秒〜5分間沈殿漕内に放置した後、洗浄する。本方法は迅速であるため、全操作の間、細胞が過度の刺激に晒されることはない（Ｓtange et al.，1993）。乳癌中またはその周囲に、ウイルス粒子を産生するカプセルを移植して、カプセル内から継続的にウイルスが放出されるようにする。代わりに、多様な（multible））直接注射によって、乳癌中にウイルスを導入してもよいと思われる。シクロホスファミドまたはイフォスファミドの全身投与または局所投与によって、これらの化合物が局所で毒性型に転換され、腫瘍細胞が除去されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ギュンツブルク、バルター・ハードイツ連邦共和国、デー−85229 アインホッフェン、ミッターフェルトシュトラーセ 11 (72)発明者ザラー、ローベルト・ミヒャエルドイツ連邦共和国、デー−80636 ミュンヒェン、ユーラシュトラーセ 22 (72)発明者ザルモンス、ブリアンドイツ連邦共和国、デー−85229 アインホッフェン、ミッターフェルトシュトラーセ 11

Claims

【特許請求の範囲】１．ＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写制御下にある治療用遺伝子であって、ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病の治療のための遺伝子を１以上具備するＤＮＡ構築物。２．請求項１に記載のＤＮＡ構築物であって、制御配列が転写開始部位を含むＷＡＰプロモーターの近位の（proximal）445bpを含んでなるＤＮＡ構築物。３．請求項１または２の何れか１項に記載のＤＮＡ構築物であって、制御配列がＷＡＰプロモーター領域のＸhoI／ＸbaI断片320bpを含むＤＮＡ構築物。４．請求項１に記載のＤＮＡ構築物であって、制御配列がＭＭＴＶのＵ3領域であるＤＮＡ構築物。５．請求項１および請求項４に記載のＤＮＡ構築物であって、制御配列がＭＭＴＶプロモーターのＰstI断片0.6kbを含むＤＮＡ構築物。６．ウイルスベクターおよびプラスミドベクターから選択された組換えベクターである請求項１〜５の何れか１項に記載のＤＮＡ構築物。７．請求項６に記載の組換えベクターであって、前記ウイルスベクターがＲＮＡおよびＤＮＡウイルスベクターから選択され、前記プラスミドベクターが真核細胞発現ベクターから選択される組換えベクター。８．請求項７に記載の組換えベクターであって、前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、または組換えヘルペスウイルスベクターである組換えベクター。９．請求項８に記載の組換えベクターであって、レトロウイルスベクターがＵ 3−Ｒ−Ｕ5構造の5'ＬＴＲ領域；治療用遺伝子をコードするコーディング領域を１以上；および完全にまたは部分的に除去されたＵ3領域を具備し、該除去された領域がＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列を含有するポリリンカーによって置き換えられ、その後にＲおよびＵ5領域が続いている3'ＬＴＲ領域であって、前記治療用遺伝子が該ＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写調節下にある3'ＬＴＲ領域を具備してなる組換えベクター。１０．請求項１〜９の何れか１項に記載の構築物であって、治療用遺伝子がヒト乳癌治療用の抗腫瘍遺伝子およびサイトカイン遺伝子から選ばれている構築物。１１．請求項１０に記載の構築物であって、前記治療用遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（gpt）、シトクロムＰ450のようなタンパク質をコードする遺伝子、ＳＤＩのようなタンパク質をコードする細胞周期調節遺伝子、p53のようなタンパク質をコードする腫瘍抑制遺伝子、メリチン、セクロピンのようなタンパク質またはＩＬ-2のようなサイトカインをコードする抗増殖遺伝子からなる群から選ばれる構築物。１２．ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病を治療するための組換えレトロウイルス粒子であって、請求項８または９に記載のレトロウイルスベクター構築物および前記レトロウイルスベクターのゲノムをパッケージするために必要なタンパク質をコードする１以上の構築物を有するパッケージング細胞系を培養することによって産生される組換えレトロウイルス粒子。１３．ヒトゲノム内に組み込まれたＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写調節下にある１以上の治療用遺伝子を具備する構築物を担持するレトロウイルスプロウイルス。１４．請求項１３に記載のレトロウイルスプロウイルスであって、完全にまたは部分的に除去されたＵ3領域を具備し、該除去された領域がＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列を含有するポリリンカーによって置き換えられ、その後にＲおよびＵ5領域が続いている5'ＬＴＲ領域；治療用遺伝子をコードするコーディング配列を１以上；および完全にまたは部分的に除去されたＵ3領域を具備し、該除去された領域がＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列を含有するポリリンカーによって置き換えられ、その後にＲおよびＵ5領域が続いている3'ＬＴＲ領域であって、前記治療用遺伝子が該ＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写調節下にある3'ＬＴＲ領域からなるレトロウイルスプロウイルス。１５．請求項１〜１１の何れか１項に記載の構築物であって、ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病を治療するための構築物を含有する細胞系。１６．請求項１５に記載の細胞系であって、請求項８または９に記載のレトロウイルスベクター構築物、および前記レトロウイルスベクターのゲノムをパッケージするために必要なタンパク質をコードする１以上の構築物を含有するパッケージング細胞系。１７．請求項１３または１４に記載のレトロウイルスプロウイルスを含有するヒト細胞。１８．請求項１５〜１７の何れか１項に記載の細胞を含有するコア、および該コアを取り囲む多孔性カプセル壁であって、前記細胞によって産生される、ヒト乳癌を含めたヒト乳腺細胞の疾患または疾病を治療するための治療用ポリペプチドまたはウイルス粒子を通過させ得る前記多孔性カプセル壁を具備する封入された細胞。１９．請求項１８に記載の封入された細胞であって、前記多孔性カプセル壁が対電荷を帯びた多価電解質から形成された多価電解質複合体からなる封入された細胞。２０．ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病の治療のための医薬の調製のための請求項１〜１１の何れか1項に記載の構築物の使用。２１．ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病の治療のための医薬の製造のための請求項１２に記載の組換えウイルス粒子の使用。２２．ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病の治療のための医薬の製造のための請求項１５〜１７の何れか１項に記載の細胞の使用。２３．ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病の治療のための薬学的組成物であって、請求項１〜１１の何れか１項に記載のＤＮＡ構築物および薬学的に受容可能な担体または希釈剤を具備する薬学的組成物。２４．ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病を治療するための薬学的組成物であって、請求項１２に記載の組換えレトロウイルス粒子および薬学的に受容可能な担体または希釈剤を具備する薬学的組成物。２５．ヒト乳癌を含むヒト乳腺細胞の疾患または疾病を治療するための薬学的組成物であって、請求項１５〜１７の何れか１項に記載の細胞系および薬学的に受容可能な担体または希釈剤を具備する薬学的組成物。２６．連結された治療用遺伝子をヒト乳癌細胞を含むヒト乳腺細胞内で発現させるためのＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の使用。２７．制御配列が転写開始部位を含むＷＡＰプロモーターの近位445bpを具備する請求項２６に記載の使用。２８．制御配列がＷＡＰプロモーター領域のＸhoI／ＸbaI断片320bpを含有している請求項２６または２７に記載の使用。２９．制御配列がＭＭＴＶのＵ3領域である請求項２６に記載の使用。３０．制御配列がＭＭＴＶプロモーターのＰstI断片0.6kbを含有している請求項２６〜２９の何れか１項に記載の使用。３１．治療用遺伝子が抗腫瘍遺伝子およびサイトカイン遺伝子から選択される請求項２６〜３０に記載の使用。３２．請求項３１に記載の使用であって、前記治療用遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（gpt）、シトクロムＰ450のようなタンパク質をコードする遺伝子、ＳＤＩのようなタンパク質をコードする細胞周期調節遺伝子、p53のようなタンパク質をコードする腫瘍抑制遺伝子、メリチン、セクロピンのようなタンパク質またはＩＬ-2のようなサイトカインをコードする抗増殖遺伝子からなる群から選択される使用。３３．ＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写制御下にある治療用遺伝子がウイルスベクターおよびプラスミドベクターから選ばれた組換えベクターの一部を成す請求項２６〜３２に記載の使用。３４．前記ウイルスベクターがＲＮＡおよびＤＮＡウイルスベクターから選択され、前記プラスミドベクターが真核細胞性発現ベクターから選択される請求項３３に記載の使用。３５．前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである請求項３４に記載の使用。３６．レトロウイルスベクターがＵ3−Ｒ−Ｕ5構造の5'ＬＴＲ領域；治療用遺伝子をコードするコーディング領域を１以上；および完全にまたは部分的に除去されたＵ3領域を具備し、該除去された領域がＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列を含有するポリリンカーによって置き換えられ、その後にＲおよびＵ5領域が続いている3'ＬＴＲ領域であって、前記治療用遺伝子が該ＷＡＰまたはＭＭＴＶ制御配列の転写調節下にある3'ＬＴＲ領域を具備する請求項３５に使用。３７．治療を必要とするヒトに対して、請求項１〜１１の何れか１項に記載の構築物を投与することを含んでなるヒト乳癌の治療法。３８．治療を必要とするヒトに対して、請求項１２に記載のウイルス粒子を投与することを含んでなるヒト乳癌の治療法。３９．治療を必要とするヒトに対して、請求項１５〜１７の何れか１項に記載の細胞を投与することを含んでなるヒト乳癌の治療法。４０．治療を必要とするヒトの腫瘍部位内またはその近傍に、請求項１９または２０に記載の封入された細胞を移植することを含んでなるヒト乳癌の治療法。