CN101955523B - 一种具抑菌活性的中华绒螯蟹乳清酸蛋白的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，中华绒螯蟹乳清酸蛋白(Es-WAP)两个结构域的体外重组表达技术及其功能鉴定。本发明利用体外重组表达技术获得了中华绒螯蟹乳清酸蛋白rEs-WAP蛋白，还公开了所述中华绒螯蟹乳清酸蛋白两个结构域的重组蛋白在抗菌活性的应用。利用本发明获得重组蛋白可用于抗菌的饲料添加剂、食品保存和药物开发。

Description

一种具抑菌活性的中华绒螯蟹乳清酸蛋白的制备及应用

技术领域：

本发明涉及中华绒螯蟹乳清酸蛋白(Es-WAP)基因的体外重组表达技术及其功能鉴定。本发明利用体外重组表达技术获得了中华绒螯蟹乳清酸蛋白Es-WAP，该重组蛋白对毕赤酵母GS115，平滑假丝酵母和鳗弧菌具有抗菌作用，在开发抗菌类药物和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。

背景技术：

生物的免疫机制可分为两大类，固有免疫和获得性免疫。无脊椎动物缺乏获得性免疫机制只能依靠固有免疫来抵御病害侵害。近年来在动物的乳清中发现一种乳清酸蛋白，它具有一个或多个乳清酸蛋白(WAP)结构域，该蛋白具有蛋白酶抑制活性，抗菌活性，ATP酶抑制活性以及细胞增殖调控等重要生物学作用。在对虾，中华绒螯蟹等甲壳动物中已报道多种单一WAP结构域壳质素抗菌肽，具有抗革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的活性，目前在无脊椎动物凡纳滨对虾中首次发现两个WAP结构域蛋白，具有蛋白酶抑制活性。

2008年全世界水产养殖总产量为5170万吨，产值788亿美元，其中甲壳类养殖产量为450万吨，产值143.61亿美元。中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)属于甲壳动物，是我国重要的水产养殖品种之一。然而，与其它甲壳类养殖品种一样，病害发生日益频繁，尤其是病毒、细菌、真菌等微生物引起的传染性疾病，每年均造成巨大的经济损失，严重阻碍了甲壳动物养殖业的发展。目前，蟹病防治主要是采用抗生素药物防治，但长期盲目滥用药物，造成抗药性问题日益严重，非但难以有效地控制病情，反而带来资金的浪费，蟹品质的下降，环境污染及对人类健康构成潜在威胁等不良后果。因此，开展中华绒螯蟹免疫机制研究，为蟹病的防治寻找更科学有效的途径，以期通过蟹自身免疫抵抗力的提高来防止和减少蟹病的发生，具有十分重要的理论与实践意义。中华绒螯蟹乳清酸蛋白的编码区有一个22个氨基酸的信号肽和两个WAP结构域，说明中华绒螯蟹乳清酸蛋白是一种分泌蛋白，可能在蟹免疫防御中发挥着非常重要的作用。

发明内容：

本发明采用通过PCR技术扩增乳清酸蛋白成熟肽编码区基因片段进行了原核重组表达。为确认其蛋白功能，深入研究重组蛋白(rEs-WAP)对毕赤酵母GS115，平滑假丝酵母和鳗弧菌的抑菌能力，为抗菌药物的筛选提供指导。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：采用技术PCR扩增含两个WAP结构域的编码区基因片段，将其克隆到pET-32a(+)表达载体中，获得重组载体pET-32a(+)-WAP，随后转入宿主细胞BL21(DE3)Plys中实现原核体外重组表达。经镍琼脂糖凝胶纯化获得EsWAP重组蛋白，透析复性后，当蛋白浓度为222μgmL^-1时，对毕赤酵母GS115，平滑假丝酵母有显著的抑菌作用，对鳗弧菌的生长有极显著的抑菌作用(参见图1)，蛋白浓度经梯度吸收后，重组蛋白对毕赤酵母GS115、平滑假丝酵母、鳗弧菌的最小抑菌浓度分别为7.0μgmL^-1、27.8μgmL^-1、55.5μgmL^-1(参见图2，图3，图4)

附图说明

图1.222μg mL-1Es-WAP重组蛋白产物的抑菌活性统计结果

图2.不同浓度梯度的Es-WAP重组蛋白对毕赤酵母GS115的抑菌效果

图3.不同浓度梯度的Es-WAP重组蛋白对平滑肌假丝酵母的抑菌效果

图4.不同浓度梯度的Es-WAP重组蛋白对鳗弧菌的抑菌效果

具体实施方式：

下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实验例1：

本发明的中华绒螯蟹乳清酸蛋白Es-WAP基因编码区体外原核重组表达，包括下列步骤：

1、重组载体的构建

本发明中采用的重组载体为Novagen公司的pET32a(+)原核表达载体。通过PCR技术，使用5’末端分别添加了EcoR I和XohI特定酶切位点的基因特异性引物P1(5’-GAATTCCTGGGGAAGGGGCATGGACACGGGT-3’)和P2(5’-CTCGAGGAATGGCTTAGTGCACTGGT-3’)扩增中华绒螯蟹乳清酸蛋白(Gene bank登陆号：GU002539)Es-WAP基因含两个结构域的编码区片段。反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，68℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行35个循环，最后72℃延伸7分钟。将PCR产物纯化回收，与pMD18-T载体连接。转化后菌落PCR筛选并测序，提取阳性克隆质粒；使用EcoRI和XohI双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)对酶切产生的目的片段纯化回收；回收目的片段与经同样双酶切的表达载体pET-32a连接，完成载体的构建。

2、重组蛋白的表达

本研究中使用的重组表达菌株为BL21(DE3)-plysS。使用构建好的重组载体和空载体转化表达宿主菌，并筛选阳性克隆，测序确认表达框的正确性。挑取单克隆，接种于50mL LB液体培养基中，37℃震荡摇床中培养12-16小时，然后以1∶100的比例接种200mL LB液体培养基中，37℃培养至OD600＝0.5-0.7。加入IPTG，使终浓度达到1mmol/mL，继续培养4h。4℃，5000rpm，离心10min，收集菌体，于-20℃冻存备用。取1ml菌液离心，弃去上清后，加入80μL水和20μL 5X蛋白上样缓冲液，100℃沸水煮沸10分钟，稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。

3、重组蛋白的纯化与复性

本发明采用镍琼脂糖凝胶FF纯化获得了变性重组蛋白，用透析缓冲液透析复性。

用具体操作步骤如下：

镍琼脂糖凝胶FF色谱分离带His标签的重组蛋白

(1)镍琼脂糖凝胶FF装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml

(2)用缓冲液1(1.14g L-1NaH₂PO4，14.5g L^-1Na₂HPO4，29.3g L^-1NaCL，480g L^-1尿素平衡2-5个床体积，流速为2mL min^-1

(3)将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1mL min^-1

(4)用缓冲液1再洗2-5个床体积，流速为mL min^-1

(5)用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2mL min^-1，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度

(6)用纯水流洗5个柱床体积，再用20％的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2mL min^-1，柱子置于4℃环境中保存变性状态下提纯的重组蛋白需要在适当的复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。变性纯化产物经2mM的还原谷胱甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽、1mM EDTA、50mM Tris-HCl、100mM NaCl、10％甘油、1％甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始的6M逐渐替换到4M、3M、2M、0M，最后一次透析至无尿素的透析液时不加甘油。每次在4℃透析12h。TRX蛋白的纯化和复性同上。

实施实例2：

重组蛋白的抑菌活性分析

对毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)、平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)、鳗弧菌(Listonella anguillarum)的生长抑制实验：毕赤酵母，平滑假丝酵母菌接种到YPD液体培养基中，鳗弧菌接种到2216E培养基中，28℃培养至OD值＝0.5-0.6，用Tris-HCl稀释OD值至0.001，进行抑菌活性分析。

取50μL稀释后的菌液加到96孔细胞培养板中，然后加100μL(浓度为222μg mL^-1)的Es-WAP重组蛋白，空白组加50μL Tris-HCl(pH7.4)，对照组加50μL的TRX蛋白，28℃孵育3小时，然后加50μL相应的液体培养基，孵育24小时，每个样品设5个重复。实验表明，空白组和对照组对毕赤酵母GS115，平滑假丝酵母和鳗弧菌的生长没有抑制作用，Es-WAP蛋白对毕赤酵母GS115，平滑假丝酵母有显著的抑制作用，对一些革兰氏阴性菌鳗弧菌也具有极显著的抗菌作用(参见图1)。重组蛋白对毕赤酵母GS115、平滑假丝酵母、鳗弧菌的最小抑菌浓度分别为7.0μg mL^-1、27.8μg mL^-1、55.5μgmL^-1(参见图2，图3，图4)。

序列表

<110>中国科学院海洋研究所

<120>一种具有杀菌活性的中华绒螯蟹乳清酸蛋白的制备及应用

<140>

<141>2010-01-27

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>133

<212>PRT

<213>中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)

<220>

<400>1

Met Val Pro Arg Arg Phe Leu Gln Leu Ala Leu Ala Leu Met Ala Leu

1               5                   10                  15

Val Ala Val Ala Gln Ala Leu Gly Lys Gly His Gly His Gly Ser Ser

            20                  25                  30

Thr Lys Leu Cys Pro Ile Pro Asn Val Lys Asp Ile Val Cys Ile Gln

        35                  40                  45

Tyr Leu Asp Gln Cys His Thr Asp Tyr Asp Cys Gly His Gly Glu Thr

    50                  55                  60

Cys Cys Leu Val Pro Asn Cys Gly Arg Gln Cys His Pro Arg Tyr Gly

65                  70                  75                  80

Asn Pro Val Thr Lys Pro Gly Asp Cys Pro Ala Ile Pro Leu Phe Val

                85                  90                  95

Pro Asn Cys Ser Tyr Lys Asp Gln Val Asp Gly Cys His Asn Asp Lys

            100                 105                 110

Gln Cys Pro Gly Asn Leu Lys Cys Cys Phe Leu Gly Cys Ser Asn Gln

        115                 120                 125

Cys Thr Lys Pro Phe

    130

Claims (3)

1.一种中华绒螯蟹乳清酸蛋白Es-WAP，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。 

2.一种权利要求1所述的中华绒螯蟹乳清酸蛋白Es-WAP的制备方法，其特征在于：(1)用特定引物P1和引物P2对中华绒螯蟹WAP基因编码区片段进行扩增，此处引物P1的序列是5′-GAATTCCTGGGGAAGGGGCATGGACACGGGT-3′，引物P2的序列是5′-CTCGAGGAATGGCTTAGTGCACTGGT-3′；(2)将pET32a载体与PCR扩增产物经EcoR I和Xoh I双酶切，连接后转化，测序鉴定重组子；(3)转入表达菌株BL21(DE3)plysS进行诱导培养，超声波破碎处理菌体收获重组蛋白，经镍柱纯化，透析复性后得到具有活性的乳清酸蛋白。 

3.一种权利要求1所述的中华绒螯蟹乳清酸蛋白Es-WAP在制备抗真菌或细菌的药物或制备饲料添加剂中的应用，其特征在于：所述真菌是毕赤酵母菌(Pichia pastoris)GS115和平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)，细菌是鳗弧菌(Listonella anguillarum)。 

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