CN101974082B - 一种大黄鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种大黄鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法。涉及生物技术领域中的鱼类基因工程，提供一种大黄鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法。所述大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法包括：克隆大黄鱼hepcidin抗菌肽基因，构建重组载体，转化宿主细胞，挑选阳性克隆进行原核表达，分离纯化表达产物，获得大黄鱼hepcidin抗菌肽。分离纯化时提高了蛋自的得率，解决了大黄鱼hepcidin抗菌肽表达复性时会有蛋自析出的间题。所用的溶液，配置简单，价格低廉。制备的大黄鱼hepcidin抗菌肽具有很高的广谱抗菌活性，不仅可用于科研，而且可以作为饲料添加剂用于海水养殖鱼类的疾病防治，具有广阔的应用前景。

Description

一种大黄鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的鱼类基因工程，特别涉及大黄鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)广泛存在于动植物中，是动植物机体免疫反应中的重要角色。Hepcidin是一个在C端保守位点上富含半胱氨酸残基的抗菌肽家族。2000年，Krause A等(1.Krause A，Neitz S，Magert HJ，Schulz A，Forssmann WG，Knappe PS，AdermannK.LEAP-1，a novel highly disulfide-bonded human peptide，exhibits antimicrobial activity[J]FEBS Lett.，2000，480：147-150)从人类血浆中首次发现了LEAP-1(后称为hepcidin)。Hepcidin抗菌肽的C末端保留了半胱氨酸形成的富集区，圆二色(circular dichroism，CD)光谱学特性研究证实，在磷酸缓冲液中hepcidin抗菌肽具有两个稳定的β折叠结构，这一结构与抗菌多肽的胱氨酸(cystin-eknot)结构非常相似。鱼类抗菌肽是鱼类先天免疫的重要组成部分，使用抗菌肽作为药物用于海水养殖鱼类的疾病防治，具有广阔的应用前景。

大黄鱼hepcidin抗菌肽基因(Genebank accession no：EF156401)由258个碱基组成，编码85个氨基酸。同其他已经发现的hepcidin抗菌肽结构一样，大黄鱼hepcidin抗菌肽包括内质网靶向的位于N端的信号肽(前24个氨基酸)，前导肽(35个氨基酸)和位于C端的成熟肽(26个氨基酸)。其中前导肽和成熟肽共同构成了前体pro-hepcidin(2.Ke-Jian Wang，Jing-Jing Cai，Ling Cai，Hai-Dong Qu，Ming Yang，Min Zhang，Cloning and expression of a hepcidin gene from amarine fish(Pseudosciaena crocea)and the antimicrobial activity of its synthetic peptide，Peptides，Volume 30，Issue 4，April 2009，638-646)成熟肽部分含有8个半胱氨酸(3.HunterHN，Fulton DB，Ganz T & Vogel HJ(2002)The solution structure of human hepcidin，a peptide hormone withantimicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditary hemochromatosis.J Biol Chem277，37597-37603)，形成4个二硫键结构。但由于此4个二硫键结构较为复杂，因此使得通过化学方法合成大黄鱼hepcidin抗菌肽的技术难度较大，费用昂贵，且难以工业化生产。目前，通过基因工程的方法获得的重组hepcidin抗菌肽往往没有广谱抗菌效果，或者抗菌谱研究不充分(4.Zhang H，Yuan QP，Zhu YP，Ma RY.Expression and preparation of recombinant hepcidin inEscherichia coli[J]Protein.Expr.Purif.，2005，41：409-416；5.Srinivasulu B.，Syvitski R.，Seo J.K.，Mattatall N.R.，Knickle L.C.，Douglas S.E.，Expression，purification and structural characterizationof recombinant hepcidin，an antimicrobial peptide identified in Japanese flounder，Paralichthysolivaceus，Protein Expr.Purif.，2008，61：36-44)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大黄鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法。

所述一种大黄鱼hepcidin抗菌肽(简写为C-pro-PC-hepc)的氨基酸序列如下：

Met Val Pro Ala Asn Glu Glu Gln Glu Leu Glu Gln Gln Ile Tyr Phe

1                5                  10                15

Ala Asp Pro Glu Met Pro Val Glu Ser Cys Lys Met Pro Tyr Tyr Met

20                  25                  30

Arg Glu Asn Arg Gln Gly Ser Pro Ala Arg Cys Arg Phe Cys Cys Arg

35                  40                  45

Cys Cys Pro Arg Met Arg Gly Cys Gly Ile Cys Cys Arg Phe Leu Glu

50                  55                  60

His His His His His His

65

其中N端含有表达起始密码子的Met蛋白，C端连接有6个His标签和Xho I酶切位点翻译后的2个氨基酸：Leu和Glu。

所述一种大黄鱼hepcidin抗菌肽的基因序列为：

gcgccatggt cccagccaat gaagagcaag agctggagca gcaaatttat tttgctgatc   60

cagagatgcc agtggaatca tgcaagatgc cgtattacat gcgtgagaat cgtcagggca  120

gccctgctag atgcaggttt tgctgccgtt gctgtcctag aatgagggga tgtggtatct  180

gctgcaggtt cctcgag cgg                                             200

其中Nco I酶切位点为CCATGG，Xho I酶切位点为CTCGAG。

所述一种大黄鱼hepcidin抗菌肽的制备方法包括以下步骤：

1)克隆大黄鱼hepcidin抗菌肽基因，并将大黄鱼hepcidin抗菌肽基因插入表达载体，构建携带大黄鱼hepcidin抗菌肽基因的重组表达载体；将所述大黄鱼hepcidin抗菌肽基因的重组表达载体转化到大肠杆菌中，选取转化后大肠杆菌中的阳性克隆于培养基中进行培养，提取质粒；

2)将步骤1)中的所得质粒转化到大肠杆菌中，选取转化后大肠杆菌中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养，离心收集发酵后的大肠杆菌细胞，重悬所述大肠杆菌细胞于悬菌磷酸缓冲液中，再次离心，弃上清，将沉淀溶于变性液中，得混合溶液；

3)测定混合溶液中蛋白浓度，调节蛋白浓度，加入氧化液，再加入复性液，离心，过滤，即得大黄鱼hepcidin抗菌肽蛋白粗提物；

4)纯化大黄鱼hepcidin抗菌肽蛋白粗提物，即得大黄鱼hepcidin抗菌肽。

在步骤1)中，所述表达载体可为原核表达载体pET-28a⁺，所述大肠杆菌可为E.coliTOP10F′，所述培养基可为含有卡那霉素和D-葡萄糖的LB培养基；所述培养条件可为：37℃，180rpm培养8h，所述提取质粒可采用常规小量质粒提取试剂盒进行提取。

在步骤2)中，所述大肠杆菌可为E.coli BL21(DE3)pLysS，所述培养基可为含有卡那霉素和D-葡萄糖的LB液体培养基；所述发酵培养的条件可为：温度为37℃，摇床培养至菌液OD₆₀₀＝0.3～0.5时，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为100μg/mL，32℃，180rpm诱导5h；所述离心可为：5000rpm，4℃离心10min，所述悬菌磷酸缓冲液的配方为：50mmol/L Na₂HPO₄，50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，去离子水定容至1L，调节pH为8.0；所述再次离心为：8000rpm，4℃离心10min，所述变性液的配方为：8mol/L尿素，50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，100mmol/L β-巯基乙醇，去离子水定容至1L，调节pH为9.0。

在步骤3)中，所述调节蛋白浓度至1.2mg/mL为宜，所述加入氧化液的时间最好在所述沉淀溶于变性液12h之后；所述氧化液的配方为：2mol/L尿素，50mmol/L Tris，100mmol/LNaCl，2mmol/L cysteine，0.1mmol/L cystine，5％甘油，去离子水定容至1L，调节pH为9.0；所述复性液为配方为：50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，5％甘油，去离子水定容至1L，调节pH为9.0；所述复性的时间为48h，所述离心为：12000rpm，4℃离心15min；所述过滤的滤膜孔径为0.45μm；所述混合液、氧化液与复性液的体积比可为1∶2∶3。

在步骤4)中，所述纯化可采用HisTrap层析柱纯化，所述HisTrap层析柱纯化可采用以下方法：

亲和层析介质装柱后，先用溶液A鏊合Ni²⁺金属离子，用5～10个柱体积超纯水(可由美国Millipore公司的超纯水系统制备)洗柱；再过5～10个柱体积的溶液B的溶液洗去多余的Ni²⁺，并用5～10个柱体积超纯水洗柱；接着过5～10个柱体积溶液C平衡层析柱；将过滤后的大黄鱼hepcidin抗菌肽蛋白粗提物全部上柱，用5～10个柱体积的溶液C过柱，洗去未结合的蛋白；再用30个柱体积将溶液C过渡到溶液D以去除尿素，3个柱体积的溶液D过柱平衡，最后用5个柱体积的溶液E过柱洗脱目标蛋白，收集洗脱峰，即得大黄鱼hepcidin抗菌肽；

所述溶液A为摩尔浓度200mmol/L的硫酸镍；

所述溶液B的组成为NaH₂PO₄和NaCl，所述NaH₂PO₄的摩尔浓度为25mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为500mmol/L，用磷酸调pH为4；

所述溶液C的组成为Tris缓冲液、NaCl、咪唑和尿素，所述Tris缓冲液的摩尔浓度为50mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述咪唑的摩尔浓度为20mmol/L，所述尿素的摩尔浓度为2mol/L，pH为9；

所述溶液D的组成为Tris缓冲液、NaCl和咪唑，所述Tris缓冲液的摩尔浓度为50mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述咪唑的摩尔浓度为20mmol/L，pH为9；

所述溶液E的组成为Tris缓冲液、NaCl和咪唑，所述Tris缓冲液的摩尔浓度为50mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述咪唑的摩尔浓度为400mmol/L，pH为9；

所述大黄鱼hepcidin抗菌肽基因序列与已经发表的其它鱼类同类hepcidin抗菌肽基因序列同源性不高，与杂交斑纹鲈鱼Morone chrysops hepcidin抗菌肽基因序列的相似度为85％。与已经发表的其它鱼类hepcidin抗菌肽相比，所述大黄鱼hepcidin抗菌肽的主要表达组织不同。由于基因序列不同，所述大黄鱼hepcidin抗菌肽的表达载体所也区别于其它的hepcidin抗菌肽原核表达载体。

目前尚无报道大黄鱼hepcidin抗菌肽的原核表达，本发明采用融合表达方式，增大了表达产物分子量，使表达产物大黄鱼hepcidin抗菌肽更加稳定。优化了蛋白变性复性条件，包括复性时采用的蛋白浓度，复性时间，配置的溶液等，可以得到优于以往报道的更为广谱的抗菌活性的大黄鱼hepcidin抗菌肽。本发明所述的大黄鱼hepcidin抗菌肽蛋白纯化条件，不仅提高了蛋白的得率，而且解决了大黄鱼hepcidin抗菌肽表达复性时会有蛋白析出的问题。所用的溶液配置简单，价格低廉。

大黄鱼hepcidin抗菌肽蛋白的抗菌活性测定的结果(参见实施例中的表2)表明：经过变性复性纯化后的大黄鱼hepcidin抗菌肽具有较强的广谱抗菌活性，比以往报道的hepcidin蛋白具有更为广谱和更强的抗菌功能。不仅对革兰氏阳性菌的抑制作用较革兰氏阴性菌强，对真菌和酵母也显示出很强的抑制效果。对重要致病菌金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为＜1.5μmol/L，具有潜在的医用价值。对水产致病菌嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度为1.5～3μmol/L；同时对水产致病菌哈维氏弧菌也有一定的抑制作用。

与现有抗菌肽相比，如原核表达的Japanese flounder hepcidin抗菌肽的最小杀菌浓度为25μmol/L且几乎不抗各种真菌及其它细菌(5.Srinivasulu B.，Syvitski R.，Seo J.K.，Mattatall N.R.，Knickle LC.，Douglas S.E.，Expression，purification and structural characterization of recombinanthepcidin，an antimicrobial peptide identified in Japanese flounder，Paralichthys olivaceus，ProteinExpr.Purif.，2008，61：36-44.)，本发明所制备的大黄鱼hepcidin抗菌肽具有很高的抗细菌，抗真菌，抗酵母的广谱抗菌活性，不仅可用于科研，也可以作为饲料添加剂用于海水养殖鱼类的疾病防治，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为PET-28a+载体酶切处理后的电泳图。在图1中，M为DNA Marker，1为未进行酶切的PET-28a+载体，2为使用NdeI和EcoRI进行双酶切后的PET-28a+载体，bp代表碱基对。

图2为大黄鱼hepcidin抗菌肽表达载体图谱。在图2中，T7为启动子，ATG为起始密码子，Pro-PC-hepc gene为大黄鱼hepcidin抗菌肽基因，His Tag为6个His标签，TGA为终止密码子，Nco I和Xho I分别为酶切位点，C-pro-PC-hepc为大黄鱼hepcidin抗菌肽的简写；A为目的片段插入位点，B为载体上游，C为载体下游。

图3为PCR扩增后的大黄鱼hepcidin抗菌肽基因电泳图。在图3中，M为DNA Marker，1为PCR扩增后获得的产物，即大黄鱼hepcidin抗菌肽基因。

图4为检测原核表达产物的电泳图。在图4中，M为蛋白Marker；1为表达产物的超声上清，含有少量目的蛋白和菌体杂蛋白，2为表达产物超声沉淀，含有大量表达的包涵体和杂蛋白，3为洗涤包涵体后的上清，洗涤掉了部分杂蛋白，4为洗涤后离心的沉淀，大部分为目的蛋白。

图5为C-Pro-PC-hepc蛋白复性产物的亲和层析图。在图5中，横坐标为体积Volume(mL)，纵坐标为紫外吸收值Absorbance(mAU)，10～180mL左右的平缓峰为没有挂柱的流穿的蛋白峰，在360mL处的紫外吸收的尖峰即为收集的纯化目的蛋白。

图6为检测蛋白纯化产物的电泳图。在图6中，M代表蛋白Marker，1、2为不同浓度的纯化后的蛋白，3为上柱纯化前的蛋白，4为流穿的杂蛋白。

具体实施方式

以下实施例可以使本专业技术领域的技术人员更加全面的了解本发明，本发明并不限于下述的实施例。

本发明所涉及的原核表达载体pET-28a⁺购自Novagen公司，菌株E.coli BL21(DE3)pLysS和E.coli TOP10F均购自晶美生物有限公司。

本发明所涉及的菌种：大肠杆菌(Escherichia coli)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、溶壁微球菌(Micrococcus luteus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi C)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemloyticus)、解藻朊酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、白假丝酵母(Candida albicans)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、腐皮镰孢(Fusarium solani)、黑曲霉(Aspergillus niger)购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，毕赤酵母(Pichiapastoris GS115)购自Invitrogen公司。

本发明采用的主要试剂和耗材：Chelating Sepharose Fast Flow和DEAE Sepharose FastFlow层析填料购自安玛西亚公司；Qiaquick Gel Extraction Kit购自QIAGEN公司；Ex TaqDNA聚合酶，限制性内切酶NcoI、XhoI、NdeI、EcoRI，DNA Ligation Kit，虾碱性磷酸酶SAP，核酸共沉剂购自TaKaRa公司；PCR及酶反应纯化试剂盒和质粒小量纯化试剂盒购自东盛公司；丙烯酰胺、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺为BBI公司产品；Hybond ECL(硝酸纤维素膜)为安玛西亚产品；Kan、IPTG、考马斯亮兰R250均购自购自上海生工；低分子量标准蛋白质Marker购自BBI公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；其它试剂均为国产分析纯试剂。

实施例1pET-28a⁺载体的处理

1)pET-28a⁺质粒的提取；

将含有pET-28a⁺原核表达载体的E.coli BL21(DE3)pLysS的保存于20％甘油的大肠杆菌划线于含50μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃培养12h。挑取单克隆，接种至5ml添加了50μg/ml卡那霉素和0.5％D-葡萄糖的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养8h，按照东盛质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒。

2)pET-28a⁺载体的酶切和去磷酸化处理；

按照以下体系对pET-28a⁺质粒进行NcoI-XhoI双酶切

NcoI-XhoI双酶切：

10×K Buffer(缓冲液)            15μl

0.1％BSA                        15μl

NcoI内切酶                      7μl

XhoI内切酶                      7μl

pET-28a⁺质粒                    100μl

超纯水                          6μl

总体积                           150μl

37℃孵育6h，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离酶切后产物，Qiagen凝胶回收试剂盒回收特异性片段，溶于88μl洗脱液中。按以下体系对酶切后载体进行磷酸化处理：

pET-28a⁺双酶切回收产物           88μl

10×PCRBuffer(缓冲液)            10μl

碱性磷酸酶SAP                    2μl

总体积                           100μl

37℃孵育30min，65℃灭活15min，将100μl酶切后载体稀释到200μl，酚氯仿异戊醇法抽提蛋白，按照核酸共沉剂说明书沉淀处理好的载体，用水重悬后存于-20℃待用。处理好的载体具有NcoI-XhoI的粘性末端(参见图1)。

实施例2目的基因的获得

1)引物的设计：

根据pET-28a+载体上的多克隆位点及大黄鱼hepcidin cDNA序列设计含有大黄鱼hepcidin抗菌肽前导肽的表达载体(参见图2)，PCR上下游引物如表1，黑体表示限制性内切酶位点，C-Pro-PC-hepc forward其中CCATGG为Nco I酶切位点，前端的GCG为酶切位点的保护碱基，C-Pro-PC-hepc reverse其中CTCGAG为Xho I的酶切位点，前端的CCG为设计的保护碱基：

表1.用于表达C-Pro-PC-hepc的上下游引物

2)PCR扩增大黄鱼hepcidin抗菌肽基因序列

以含有大黄鱼hepcidin的cDNA的pPMD18-T阳性质粒为模板，以相应的上、下游引物，PCR扩增目的片段，反应体系为：

灭菌水                           169.5μl

含Mg²⁺的10×PCRbuffer(缓冲液)    20μl

大黄鱼pPMD 18-T质粒              2μl

10mmol/L dNTPs(25mmol/L/个)      3μl

pPMD18-T/AS-hepc2质粒            12μl

上游引物(10μmol/L)            12μl

下游引物(10μmol/L)            1.5μl

Ex Taq多聚酶(5U/μl)           0.8μl

总反应体积                     200μl

混合均匀，在热循环仪上按照以下程序进行PCR反应：

①          94℃    4min

②30个循环：94℃    30s

            60℃    30s

            72℃    30s

③          72℃    10min

④          4℃     Pause

反应结束后，将所有反应液进行1.5％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳，用东盛凝胶回收试剂盒回收特异性片段(参见图3)。

(3)目的片段的酶切处理

将回收后的目的片段分别进行NcoI-XhoI)双酶切，酶切体系如下：

NcoI-XhoI双酶切

10×K Buffer(缓冲液)        10μl

0.1％BSA                    10μl

NcoI                        5μl

XhoI                        5μl

C-Pro-PC-hepc回收产物       50μl

超纯水                      20μl

总体积                      100μl

37℃孵育6h，将所有反应液进行1.5％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳，切下特异性条带，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收特异性片段，除去酶及核苷酸碎片。得到的目的基因分别具有与处理好的线性载体相互配对的粘性末端。

实施例3表达载体的构建、转化和鉴定

将经过处理后的pET-28a+原核表达载体与含有相同粘性末端的大黄鱼hepcidin抗菌肽cDNA目的片段连接，反应体系如下：

pET-28a+               2μl

目的片段               1μl

超纯水                 1.8μl

T4DNA连接酶            0.2μl

Ligation Solution I    5μl

总体积                 10μl

16℃连接过夜，次日取5μl连接反应液转化至50μl E.coli TOP10F′感受态细胞中，涂布在含有50μg/mL卡那霉素和0.5％D-葡萄糖的LB琼脂平板上37℃培养过夜。次日挑取单菌落，挑取阳性克隆菌株，37℃，180rpm培养8h，按照东盛质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒。以之前所用的上下游引物，如前所述的体系和程序PCR法鉴定阳性质粒。

目的片段上的序列含有PstI酶切位点，而pET-28a⁺载体上没有该酶切位点，则用以下体系进行酶切法鉴定阳性质粒：

10×H Buffer(缓冲液)   10μl

PstI酶                 3μl

超纯水                 57μl

载体                   5μl

总体积                 100μl

将含有两种方法鉴定均为阳性的质粒的菌株送上海英伟创津(Invitrogen)公司进行DNA核苷酸序列测定。

实施例4含有大黄鱼hepcidin抗菌肽的表达载体在大肠杆菌中的诱导表达

1)含有大黄鱼hepcidin抗菌肽cDNA的质粒转化至E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞活化培养E.coli BL21(DE3)plysS冻干菌株，按照鹭隆生物有限公司感受态制作试剂盒说明书制作感受态细胞，50μl分装，置-80℃保存备用。将保种含有经测序验证序列正确的大黄鱼hepcidin抗菌肽前导肽cDNA的质粒的E.coli TOP10’菌株划线于含卡那霉素的LB琼脂平板上，挑取单克隆后，用东盛质粒小量提取试剂盒提取质粒。参照《分子克隆实验指南》用CaCl₂法转化进E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞，涂布于含有50μg/mL的卡那霉素和D-葡萄糖的LB平板上，37℃培养至单克隆长出。

2)含有大黄鱼hepcidin抗菌肽的表达载体的诱导表达

挑取转化后的单克隆至5mL LB液体培养基(含有50μg/mL的卡那霉素和0.5％D-葡萄糖)中，培养至对数生长期，接种到含400mL LB液体培养基(含有50μg/mL的卡那霉素和0.5％D-葡萄糖)的2L三角瓶中，37℃，180rpm培养至OD₆₀₀＝0.3～0.5，加入IPTG 100μg/mL，32℃，180rpm诱导5h。5000rpm离心10min，收集沉淀。沉淀用40mL pH＝8.0的悬菌PBS悬浮，保存于-80℃待纯化。

实施例5载体表达产物--大黄鱼hepcidin抗菌肽(C-Pro-PC-hepc)的复性和纯化

1)从表达菌体得到C-Pro-PC-hepc蛋白包涵体的处理

将保存于-80℃的菌体融解，在冰浴条件下用功率10W超声3min，再用功率15W超声8min，超声方式都为3s超声，6s间歇。8000rpm，4℃离心10min，将沉淀用含1％Triton-100的悬菌PBS重悬，即为包涵体的洗涤，按上述条件再次离心。进行SDS-PAGE电泳鉴定(参见图4)。此时大量的C-Pro-PC-hepc蛋白在沉淀的包涵体中，得到的沉淀即为大量的C-Pro-PC-hepc蛋白包涵体。

2)C-Pro-PC-hepc蛋白的变性和复性

将收集的沉淀用变性液搅拌溶解，Bradford法测定蛋白浓度，并调节蛋白浓度到1.2mg/mL。变性12h后缓慢加入2倍体积的氧化液，此时溶液中含有4mol/L的尿素。继续搅拌48h，逐滴加入等体积的复性液。11000rpm，离心25min，并用0.45μm膜过滤。经过上述步骤得到具有广谱抗菌活性的大黄鱼hepcidin抗菌肽(C-Pro-PC-hepc)的粗提物，此时蛋白溶液中含有2mol/L的尿素。纯化前溶液放4℃保存。

3)亲和层析柱纯化C-Pro-PC-hepc粗提物

C-Pro-PC-hepc带有6×His-Tag，因此可以采用HisTrap层析柱纯化。亲和层析介质装柱后，先过10ml溶液A鏊合Ni²⁺金属离子，用5～10个柱体积超纯水洗柱；再过5～10个柱体积的溶液B洗去多余的Ni²⁺，并用5～10个柱体积超纯水洗柱；接着过5～10个柱体积溶液C平衡层析柱。将大黄鱼hepcidin抗菌肽粗提物全部上柱，用5～10个柱体积的溶液C过柱，洗去未结合的蛋白；再用30个柱体积将溶液C过渡到溶液D以去除尿素，3个柱体积的溶液D过柱平衡，最后用5个柱体积的溶液E过柱洗脱目标蛋白，收集洗脱峰，即得大黄鱼hepcidin抗菌肽。少量进行SDS-PAGE电泳鉴定(参见图5和6)。

实施例6大黄鱼hepcidin抗菌肽的抗菌情况测定

1)大黄鱼hepcidin抗菌肽最小抑菌浓度(MIC：minimum inhibition concentration)的测定。

(a)将保种的大肠杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒杆菌、溶壁微球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌在营养肉汤平板上划线，副溶血弧菌、解藻朊酸弧菌、哈氏弧菌在2216海水肉汤平板上划线，在相应温度倒置培12～16h；禾谷镰孢、腐皮镰孢、黑曲霉在PDB平板上划线，白假丝酵母、毕赤酵母在YPG平板上划线，于28℃培养一至两周。全部用接种于相应的斜面上，继续培养12～16h，霉菌和酵母则继续培养3～7天；10mmol/L磷酸钠盐缓冲液(pH 7.4)冲洗新鲜制备的细菌斜面培养物，调整稀释至OD600＝0.003；弧菌用海水培养基调整稀释至OD₆₀₀＝0.0006；真菌用10mmol/L磷酸钠盐缓冲液(pH 7.4)冲洗下来后，真菌孢子，在显微镜下用血球计数板计算孢子数量，调整孢子浓度为3.3×10⁴个孢子/mL备用。酵母则调整至OD₆₀₀＝0.00067，使其浓度为3.3×10⁴个孢子/mL备用。准备好的细菌需在20min内使用。

(b)将保存的蛋白粉末用灭菌超纯水溶解，Bradford法测定蛋白浓度，倍比稀释蛋白浓度为3，6，12，24，48，96μmol/L，4℃保存备用。

(c)参照Belén LG.等(2007)的方法(Belén LG，Wimal Ubhayasekera，Richard L.Gallo，et al.Parallel evaluation of antimicrobial peptides derived from the synthetic PAF26 and the humanLL37，Biochemical and Biophysical Research Communications，2007(356)：107-113)，在96孔细胞培养板上进行，每种被测细菌和真菌按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置3个平行样：

①阳性对照组：加50μl灭菌超纯水和30μl菌悬液；

②空白对照组：加50μl待测蛋白样品和30μl磷酸钠盐缓冲液；

③样品实验组：加50μl待测蛋白样品和30μl菌悬液。

对于细菌，每孔加入20μl MH液体培养基，28℃培养24h，观察结果。对于真菌，每孔加入20μl PDB液体半培养基，并添加氯霉素(终浓度25μg/mL)以避免细菌污染，28℃培养48h，观察结果。

对于弧菌，按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置3个平行样：

①阳性对照组：加50μl灭菌超纯水和50μl菌悬液；

②空白对照组：加50μl待测蛋白样品和50μl2216海水培养基；

③样品实验组：加50μl待测蛋白样品和50μl菌悬液；

28℃培养24h，观察结果。

大黄鱼hepcidin抗菌肽的抗菌活性结果如表2所示：

表2

CGMCC no：中国普通微生物菌种保藏管理中心编号；a：购买自Gene Power公司，b：CMCC，医学微生物菌种保藏管理中心，c：购买自上海Invitrogen公司。

Claims (1)

1.一种大黄鱼hepcidin抗菌肽，其特征在于其氨基酸序列如下：

Met Val Pro Ala Asn Glu Glu Gln Glu Leu Glu Gln Gln Ile Tyr Phe

1                5                  10                 15

Ala Asp Pro Glu Met Pro Val Glu Ser Cys Lys Met Pro Tyr Tyr Met

20                  25                  30

Arg Glu Asn Arg Gln Gly Ser Pro Ala Arg Cys Arg Phe Cys Cys Arg

35                40                    45

Cys Cys Pro Arg Met Arg Gly Cys Gly Ile Cys Cys Arg Phe Leu Glu

50                 55                   60

His His His His His His

65

其中N端含有表达起始密码子的Met蛋白，C端连接有6个His标签和Xho Ⅰ酶切位点翻译后的2个氨基酸：Leu和Glu；

所述大黄鱼hepcidin抗菌肽基因的序列如下：

gcgccatggt cccagccaat gaagagcaag agctggagca gcaaatttat tttgctgatc  60

cagagatgcc agtggaatca tgcaagatgc cgtattacat gcgtgagaat cgtcagggca  120

gccctgctag atgcaggttt tgctgccgtt gctgtcctag aatgagggga tgtggtatct  180

gctgcaggtt cctcgag cgg                                             200

其中Nco Ⅰ酶切位点为CCATGG，Xho Ⅰ酶切位点为CTCGAG；

所述大黄鱼hepcidin抗菌肽由以下方法制备：

1）克隆大黄鱼hepcidin抗菌肽基因，并将大黄鱼hepcidin抗菌肽基因插入表达载体，构建携带大黄鱼hepcidin抗菌肽基因的重组表达载体；将所述大黄鱼hepcidin抗菌肽基因的重组表达载体转化到大肠杆菌中，选取转化后大肠杆菌中的阳性克隆于培养基中进行培养，提取质粒；所述表达载体为原核表达载体pET-28a⁺；所述大肠杆菌为E.coli TOP10Fˊ，所述培养基为含有卡那霉素和D-葡萄糖的LB培养基；所述培养条件为：37℃，180rpm培养8h，所述提取质粒采用常规小量质粒提取试剂盒进行提取；

2）将步骤1）中的所得质粒转化到大肠杆菌中，选取转化后大肠杆菌中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养，离心收集发酵后的大肠杆菌细胞，重悬所述大肠杆菌细胞于悬菌磷酸缓冲液中，再次离心，弃上清，将沉淀溶于变性液中，得混合溶液；所述大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)pLysS；所述培养基为含有卡那霉素和D-葡萄糖的LB液体培养基；所述发酵培养的条件为：温度为37℃，摇床培养至菌液OD₆₀₀=0.3～0.5时，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为100μg/mL，32℃，180rpm诱导5h；所述离心为：5000rpm，4℃离心10min；所述悬菌磷酸缓冲液的配方为：50mmol/L Na₂HPO₄，50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，去离子水定容至1L，调节pH为8.0；所述再次离心为：8000rpm，4℃离心10min，所述变性液的配方为：8mol/L尿素，50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，100mmol/L β-巯基乙醇，去离子水定容至1L，调节pH为9；

3）测定混合溶液中蛋白浓度，调节蛋白浓度，加入氧化液，再加入复性液，离心，过滤，即得大黄鱼hepcidin抗菌肽蛋白粗提物；所述调节蛋白浓度至1.2mg/mL，所述加入氧化液的时间在所述沉淀溶于变性液12h之后；所述氧化液的配方为：2mol/L尿素，50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，2mmol/L cysteine，0.1mmol/L cystine，5%甘油，去离子水定容至1L，调节pH为9.0；所述复性液为配方为：50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，5%甘油，去离子水定容至1L，调节pH为9.0；所述复性的时间为48h，所述离心为：12000rpm，4℃离心15min；所述过滤的滤膜孔径为0.45μm；所述混合液、氧化液与复性液的体积比为1∶2∶3；

4）纯化大黄鱼hepcidin抗菌肽蛋白粗提物，即得大黄鱼hepcidin抗菌肽；所述纯化采用HisTrap层析柱纯化，所述HisTrap层析柱纯化采用以下方法：

亲和层析介质装柱后，先用溶液A鏊合Ni²⁺金属离子，用5～10个柱体积超纯水洗柱；再过5～10个柱体积的溶液B的溶液洗去多余的Ni²⁺，并用5～10个柱体积超纯水洗柱；接着过5～10个柱体积溶液C平衡层析柱；将过滤后的大黄鱼hepcidin抗菌肽蛋白粗提物全部上柱，用5～10个柱体积的溶液C过柱，洗去未结合的蛋白；再用30个柱体积将溶液C过渡到溶液D以去除尿素，3个柱体积的溶液D过柱平衡，最后用5个柱体积的溶液E过柱洗脱目标蛋白，收集洗脱峰，即得大黄鱼hepcidin抗菌肽；

所述溶液A为摩尔浓度200mmol/L的硫酸镍；

所述溶液B的组成为NaH₂PO₄和NaCl，所述NaH₂PO₄的摩尔浓度为25mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为500mmol/L，用磷酸调pH为4；

所述溶液C的组成为Tris缓冲液、NaCl、咪唑和尿素，所述Tris缓冲液的摩尔浓度为50mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述咪唑的摩尔浓度为20mmol/L，所述尿素的摩尔浓度为2mol/L，pH为9；

所述溶液D的组成为Tris缓冲液、NaCl和咪唑，所述Tris缓冲液的摩尔浓度为50mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述咪唑的摩尔浓度为20mmol/L，pH为9；

所述溶液E的组成为Tris缓冲液、NaCl和咪唑，所述Tris缓冲液的摩尔浓度为50mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述咪唑的摩尔浓度为400mmol/L，pH为9。

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