CN101705231A

CN101705231A - 中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因及其编码多肽与应用

Info

Publication number: CN101705231A
Application number: CN200910154257A
Authority: CN
Inventors: 沈立荣; 丁美会; 金凤; 张伟光; 张瑮文
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2009-11-19
Filing date: 2009-11-19
Publication date: 2010-05-12

Abstract

本发明公开了中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因及其编码多肽与应用，该基因具有SEQ ID No.4所示的DNA序列；该基因的编码蛋白具有SEQ ID No.5所示的氨基酸序列，该抗菌肽基因可通过构建大肠杆菌表达载体建立高效表达的基因工程菌株，通过发酵工程诱导表达进行生产、重组产物分离和纯化，其重组产物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和黄色微球菌等多种革兰氏阳性细菌具有明显的抑制作用，可用于食品防腐保鲜，特别是预防食源性细菌污染，对人体和动物安全无害，可作为抗生素和化学防腐剂的替代品，也适合于养殖动物细菌性病害防治。本发明为Royalisin的开发、规模化工业生产及应用奠定了基础。

Description

中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因及其编码多肽与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别地，本发明涉及一种中华蜜蜂(Apis ceranacerana)王浆抗菌肽AccRoyalisin基因及其编码多肽。更具体地说，本发明涉及AccRoyalisin基因的cDNA序列，该cDNA序列编码的AccRoyalisin是西方蜜蜂(Apis mellifera)AmRoyalisin多肽的同系物，该AccRoyalisin经过翻译后加工所得到的多肽是西方蜜蜂AmRoyalisin多肽的同系物。本发明还涉及有该核苷酸序列编码的多肽，这些核苷酸和多肽的应用，以及所述核苷酸和所述多肽的制备方法。

背景技术

蜂王浆是蜜蜂头部王浆腺分泌的生物活性物质，作为人类的营养保健品历史悠久。现有国内外研究表明，王浆具有促进人体生长发育，抗疲劳、提高免疫力、抗肿瘤、抗炎和抗菌等多种功能。Royalisin是蜂王浆中的一种抗菌肽，是蜜蜂受到微生物或其他外源有害物质侵染时由头部或胸部产生的一种低分子肽类。日本学者Fujiwara等(Fujiwara，S.et al.J.Biol.Chem.，1990，265：11333-11337)最初通过酸处理王浆，从王浆中分离获得了Royalisin，其分子量为5523Da，其一级结构由51个氨基酸残基组成，与蜜蜂血淋巴中的defensin序列几乎相同，仅第50位的氨基酸残基出现变化，由defensin中的精氨酸代替了王浆中Royalisin中的酪氨酸。Royalisin没有特异性，诱导产物不仅只对特定微生物，通常对其他微生物也有抗生作用。Bilikova和Bachanová等(Bilikova，K.，et al.Apidologie，2001，32：275-283；Bachanová，K.，etal.Apidologie，2002，33：259-269.)对从天然王浆中分离的Royalisin进行相应的抑菌试验，证实该多肽对革兰氏阳性细菌蜜蜂幼腐病菌(Paenibacilluslarvae larvae)有很强的抑菌作用，在低至1μM的浓度下也具有抑菌作用；对革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌(Bucillus.subtilis)和藤黄八叠球菌(Sarcinalutea)，包括灰霉菌Botrytis cinerea也有很好的抑菌作用，但对革兰氏阴性细菌无作用。

在目前全世界已报道的9个蜜蜂属(Apis)成员中，只有西方蜜蜂(Apismellifera(其中分布最广的为意大利蜜蜂A.mellifera mellifera)和东方蜜蜂(A.cerana)得到人工驯化和规模化人工养殖，并用于蜂蜜生产。相对于西方蜜蜂来说，东方蜜蜂(A.cerana)，包括我国特有的亚种中华蜜蜂(A.ceranacerana)因生产性能较低，蜂群数量在原产地正处于萎缩状态。但国内外研究表明，因中华蜜蜂因长期适应于我国地理气候环境，具有西方蜜蜂所不具备的抗病性、耐寒性等抗逆性能，其生物学特点也非常不同于前者，在蜜蜂育种和生态多样性保护等方面具有非常重要的利用价值。因为抗菌肽在蜜蜂的自身防御系统里起着不可替代的作用。近年国内学者(Xu，P.，et al.PLoS ONE.2009，4：1-9.)研究表明，东方蜜蜂所具有的抗病性是与其分泌抗菌肽的能力强、种类多有着密切关系。

由于抗菌肽的高效、无毒副作用，目前对各种动物、植物和昆虫来源的抗菌肽国内外已有大量研究.已发现的抗菌肽分为四大类：(a)cecropins，(b)defensins或sapecins，(c)attacin-like proteins，(d)proline-richpeptides。Defensins是昆虫抗菌肽中最多的一类，它包括了三个亚类：精典defensins，β-defensins和昆虫defensins。Royalisin属于昆虫defensins亚类。昆虫defensins亚类一般由36-51个氨基酸残基组成，三对二硫键，一个α-折叠、两个β折叠和一个N-端环组成的稳定结构，均具有抗革兰氏阳性细菌的活性(Cho，W.L.，et al Insect Biochem.Molec.Biol.1996，26：395-402)。

近年来由于对食品安全性的高度重视，有机食品和无公害食品越来越受消费者欢迎，抗菌肽作为一类安全无害的食品防腐添加剂受到重视(Cleveland，J.；et al.Int.J.food Microbiol.2001，7l：1-20.)。近年来对天蚕素、蝇抗菌肽、Nisin(尼辛)等抗菌肽开展了大量研究开发，并已有大量发明专利公开。利用乳酸链球菌生产的尼辛已在全球作为唯一合法食品添加剂广泛开发生产(Broughton，J.B.Food Technol.，1990，44，100-117；Tolonen，M.，et al.Appl.Microbiol.Biot.2004，63：659-6651.)。但对Royalisin，除了西方蜜蜂的Royalisin基因序列和氨基酸序列有报道，从天然王浆中分离的Royalisin进行了抑菌试验外，目前国内外尚未见中华蜜蜂Royalisin基因和多肽序列，利用生物工程进行重组表达和表达产物生物活性鉴定的相关报道和专利，也未有将其应用到食品中作为防腐添加剂的先例。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因及其编码多肽与应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因，它具有SEQ ID No.4所示的序列。

一种上述中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因的编码多肽，它具有SEQID No.5所示的氨基酸序列。

上述中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因的编码蛋白在制备抗体方面和抑制革兰氏阳性细菌方面的应用。

本发明的有益效果是：本发明首次提取分离中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin的基因，该基因所编码的AccRoyalisin蛋白是一种生物活性物质，可应用于食品及医药领域的抗菌作用，其抗体对Royalisin今后的检测打下了基础。该抗菌肽基因可通过构建大肠杆菌表达载体建立高效表达的基因工程菌株，通过发酵工程诱导表达进行生产、重组产物分离和纯化，其重组产物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和黄色微球菌等多种革兰氏阳性细菌具有明显的抑制作用，可用于食品防腐保鲜，特别是预防食源性细菌污染，对人体和动物安全无害，可作为抗生素和化学防腐剂的替代品，也适合于养殖动物细菌性病害防治。本发明为Royalisin的开发、规模化工业生产及应用奠定了基础。

附图说明

图1是AccRoyalisin前体基因PCR扩增产物和插入该基因的pGEM-T easy载体的酶切鉴定图；其中，M泳道为DNA标样；1泳道为插入AccRoyalisin前体基因的pGEM-T载体的BamH I and Not I酶切产物；2泳道为.AccRoyalisin前体基因PCR扩增产物。

图2是AccRoyalisin成熟肽基因PCR扩增产物和插入该基因的pGEM-T easy载体的酶切鉴定图；其中，M泳道为DNA标样；1泳道为插入AccRoyalisin成熟肽基因的pGEX-4T-2的载体的BamH I and Not I酶切产物；泳道为2为AccRoyalisin成熟肽基因PCR扩增产物。

图3是AccRoyalisin成熟肽基因在大肠杆菌中表达产物及纯化GST-AccRoyalisin的SDS-PAGE电泳图；其中，泳道1-2为纯化的GST-AccRoyalisin；泳道3-4为GST-AccRoyalisin在大肠杆菌中表达产物可溶性蛋白；泳道5为GST-AccRoyalisin在大肠杆菌中表达产物不可溶性蛋白(无目标蛋白)；泳道M为蛋白标样。

图4为大肠杆菌中表达GST-AccRoyalisin和GST蛋白的Western blot检测效果图；其中，泳道1为GST-AccRoyalisin，泳道2为GST。

图5为纯化后GST的SDS-PAGE电泳图谱；其中，泳道1-3为纯化的GST-AccRoyalisin；泳道M为蛋白标样。

图6为滤纸片法测定GST-AccRoyalisin融合蛋白和Nisin对三种革兰氏阳性细菌的抑菌效果图；其中，平板(A)为枯草芽孢杆菌；平板(B)为黄色乳球菌M.luteus；平板(C)为金黄色葡萄球菌。各平板中纸片1和2代表经过GST-AccRoyalisin处理，纸片3、4和5分别代表经过GST、Tris-HCl和Nisin处理。

具体实施方式

本发明提取分离的中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因，其前体pre-pro-AccRoyalisin全长为288个核苷酸，其中成熟肽全长为153个核苷酸。pre-pro-AccRoyalisin胡详细核苷酸序列见SEQ ID No.4。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来；还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin编码序列”指编码具有中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin的核苷酸序列，如SEQ ID No.4中1～288位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指位于SEQ ID No.4序列的编码框1～288位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID No.4中1～288位核苷酸序列同源性低至约70％简并序列也能编码出SEQ ID No.5所述的序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳地在高度严谨条件下，与SEQ ID No.4中从核苷酸1～288位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ IDNo.4中从核苷酸1～288位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin前体相同功能蛋白的、SEQ ID No.5序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质是指其占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计).纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层折、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度.基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分.

在本发明中，术语“中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin”指具有中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin活性的SEQ ID No.5序列1-95的多肽。该术语还包括具有与中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin相同功能的、SEQ ID No.5序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端添加-个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin蛋白的活性片段和活性衍生物。

该蛋白的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体，诱导突变体，在高或低的严谨度条件下能与中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin的抗血清获得的蛋白。本发明还提供了其他蛋白，如包含中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin蛋白片段的融合蛋白。

本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin编码序列的8～100个，较佳地1～50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin核苷酸分子。

本发明还包括检测中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度一般为15～50个核苷酸。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌等。

另一方面，本发明还包括对中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因产物或片段。较佳地，指那些能与中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin的分子，也包括那些并不影响中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner et al，美国专利No.4，946，778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备，例如，纯化的中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来制备抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler et al 1975，Nature 256：495，；Kohler et al 1976，Eur.J.Immunol，6：511；Kohler et al 1976，Eur.J.Immunol，6：292；Hammerling et al 1981，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.)。本发明的各类抗体可以利用中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术而获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如大肠杆菌Escherichia.coli)中制备的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

在本发明的一个实施例中，中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以在1、3、4、5、7、9、12、15、18、21、24、27和30日龄的中华蜜蜂工蜂头部混合样本(每个日龄各取10个头)抽提总RNA，反转录成cDNA建立文库，通过文库大规模表达序列片断(EST)的DNA测序，用生物信息学软件进行有效性处理、功能基因序列拼接和功能注释，建立EST数据库。获得AccRoyalisin功能基因的完整编码序列。然后根据功能基因的EST来源和编号，从EST数据库查出具有AccRoyalisin完整序列的EST的65个对应克隆，抽提目标质粒作为模板，用载体中的一对M13通用引物，即：5’端引物GTAATACGACTCACTATAGGGCG，3’端引物GGAAACAGCTATGACCATGA进行PCR扩增和PCR产物电泳鉴定，对其中1个AccRoyalisin克隆测定cDNA全长，将所得DNA序列与AmRoyalisin和AccRoyalisin的EST，其扩增产物测序后得到的全长cDNA序列(见SEQ ID No.4)。

以一个具有完整AccRoyalisin前体核苷酸序列的克隆为模板，用一对根据编码AccRoyalisin成熟肽的核苷酸序列设计的一对寡核苷酸为引物，即Accr-f2：5’端引物5’-AGGATCCATGGTAACTTGTGACCTT-3’(SEQ ID No.2)，3’端引物Accr-r1：5’-GCGGCCGCTTAACCGAAACGTTTGTC-3’(SEQ ID No.3)，进行PCR扩增。将扩增产物插入pGEM-Teasy载体，进行阳性克隆测序后确认得到SEQ ID No.6的全长cDNA序列。引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pGEX-4T-2上的限制性内切酶的酶切位点。

将从pGEM-T载体双酶切获得的AccRoyalisin成熟肽基因片断插入PGEM-4T-2(带谷胱甘肽GST编码序列)载体，阳性克隆转化大肠杆菌BL21感受态细胞，加入IPTG至终浓度0.8mmoL/L进行诱导表达，获得AccRoyalisin(5.52kDa)与载体所带GST(26kDa)融合表达蛋白，总分子量为32kDa，与其预期理论蛋白质量相符。经薄层扫描分析，表达蛋白占细胞总蛋白的15.1％。将诱导表达产物用超声波破碎后，取沉淀进行SDS-PAGE电泳。用GST多克隆抗体对GST-AccRoyalisin融合表达蛋白SDS-PAGE胶进行Western-blot检测，蛋白印迹呈现32kDa的特异性条带。

诱导表达的产物离心后收集菌体，将收集的菌体用PBS悬浮，放置于冰上，超声处理60次(每次5s，间隔6s)。将处理后的菌液12000r离心10min，取上清(可溶性蛋白)及沉淀(包涵体蛋白)分别进行SDS-PAGE电泳检测两者的含量。电泳检测结果表明重组表达蛋白基本上属于可溶性蛋白。收集可溶性蛋白，过GST亲和胶(High-Affinity GST Resin)进行分离纯化。将纯化的可溶性蛋白用透析袋去除盐离子后进行冷冻干燥。将冻干粉电泳检测，显示清晰的分子量为32kDa的单一条带(图3，泳道1-2)。

将实验室中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、黄色乳球菌(Micrococcus luteus)及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活化后，将三种菌液均按比例用无菌水稀释为1.0*10⁷cfu/mL的菌液后，取1mL涂布于细菌培养基。(A枯草芽孢杆菌，B黄色乳球球菌，C金黄色葡萄球菌)在平板上贴上无菌滤纸片(直径为9mm)，在各个滤纸片上分别滴加浓度为2mg/mL)的20μL可溶性GST-AccRoyalisin溶液，以尼辛(Nisin)商品(活性1000IU/mg)为阳性对照，以PGEM-4T-2转化菌表达产物GST为阴性对照。通过抑菌圈的直径判定AccRoyalisin的抑菌作用。实验证明AccRoyalisin对三种细菌均有类似于Nisin的抑菌作用。

从SDS-PAGE凝胶中切下特异性表达的蛋白条带，冷冻保存，使用前加0.9％的生理盐水置玻璃匀浆器内碾磨匀浆，作为抗原，皮下注射免疫新西兰大白兔，6周后从兔颈动脉收集血液，制取抗血清，-70℃保存备用。

采用间接ELISA法。以免疫前采集的正常兔血清为阴性对照，经高速离心的西方蜜蜂蜂王浆溶液上清为抗原，HRP标记的羊抗兔IgG做酶标二抗，对所制备多克隆抗体进行酶联免疫吸附试验，OPD显色后在492nm下测定OD值，确定抗体的效价正常。

中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin为中华蜜蜂头部或胸部表达的蛋白，本发明的中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin为研究中华蜜蜂抗病机理及其大规模的生产并应用于抗菌方面打下了基础。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1：中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因的克隆和测定

1.cDNA文库构建

用油漆笔标记当日羽化的中蜂工蜂，在1、3、4、5、7、9、12、15、18、21、24、27和30日龄期进行回捕，-80℃保存。分别从每个日龄工蜂样品取10个头部，加液氮匀浆，加TRIZOL进行总RNA提取。用试剂盒分步纯化出mRNA，合成cDNA第一链和第二链。然后用末端补平酶将双链cDNA末端补平，加上EcoRI接头并将其磷酸化，再经Xho I酶切处理，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，再用MinElute Gel Extraction试剂盒进行凝胶回收。

将cDNA与载体pBluescript IISK(+)相连，用电击反应法转化E.coli DH10B感受态菌，加SOC培养基，37℃摇床复苏1h，取50μL菌液涂布含有IPTG/X-gal的LB培养基，37℃培养过夜。从生长转化菌的平板上随机挑取若干个菌落，培养，抽提质粒，采用M13通用引物进行PCR扩增鉴定文库质量。

2.cDNA文库测序

从文库挑取单克隆接种在含LB培养基的96孔板，37℃培养18小时左右，提取质粒作为模板，用通用引物M13进行PCR扩增，样品经纯化后放入Megabace1000中进行测序，相应的EST序列。

3.EST功能注释、芯片用EST筛选与数据库构建

利用浙江大学生物信息服务平台服务器进行EST片段处理和拼接，phrap软件作有效性处理.。选出具有独立功能的Contig、Siglet序列，用Ontology(GO)和Blast软件进行功能注释。用DNAstar软件选出与Contig、Siglet序列相匹配的EST代表性序列。从中选出具有AccRoyalisin功能基因完整编码的序列。

然后根据功能基因的EST来源和编号，从含8568个EST序列的数据库查出AccRoyalisin克隆，抽提目标质粒作为模板，采用根据AccRoyalisin前体核苷酸序列两端设计的一对引物，Accr-f1：5’-AGGATCCATGAAGATCTATTTTATTG-3(SEQ ID No.1)和Acc-r1：5’-GCGG CCGCTTAACCGAAACGTTTGTC-3’(SEQ IDNo.3)，进行PCR扩增，PCR产物电泳鉴定，所选AccRoyalisin克隆显示大小约为300kb的DNA片断(见附图1泳道1)。

对其中一个AccRoyalisin前体克隆测定cDNA全长，将所得DNA序列与AmRoyalisin和AccRoyalisin的EST序列进行比对和同源分析，显示编码完整AccRoyalisin前体序列，其扩增产物测序后得到的全长cDNA序列见SEQ IDNo.4，该序列所编码的多肽见SEQ ID No.5。

3.同源比较

用本发明的中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin前体的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用Blast程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，它与三个已发布的三个西方蜜蜂王浆抗菌肽AmRoyalisin前体【在GenBank发布的三个序列号分别为：Nm0010116(Am-1)，AY496432(Am-2)和AY333923(Am-3)】有显著的同源性。AccRoyalisin前体与三个AmRoyalisin前体的氨基酸序列联配结果(见表1)。AccRoyalisin与AmRoyalisin氨基酸序列的长度均为95aa，两者的同源性为90％-92％。

表1：中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin前体与西方蜜蜂王浆抗菌肽AmRoyalisin前体【在GenBank发布的三个序列号分别为：Nm0010116(Am-1)，AY496432(Am-2)和AY333923(Am-3)】的比较。

由表1可见，中华蜜蜂王浆主蛋白抗菌肽AmRoyalisin前体与西方蜜蜂抗菌肽AmRoyalisin前体的同源性为90％-92％。

实施例2，中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin成熟肽基因克隆及在大肠杆菌中的表达

在该实施例中，以实施例1中已测序的，具有完整AccRoyalisin前体核苷酸序列的克隆为模板，用一对根据AccRoyalisin成熟肽基因序列设计的一对寡核苷酸为引物，作PCR扩增

PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为：

5’端引物序列Accr-f2为：AGGATCCATGGTAACTTGTGACCTT(SEQ ID No.2)，该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，翻译起始密码子和AccRoyalisin的部分编码序列；

3’端引物序列Acc-r1为：5’-GCGGCCGCTTAACCGAAACGTTTGTC-3’(SEQ IDNo.3)该引物含有Not I限制性内切酶的酶切位点，翻译终止子和AccRoyalisin的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pGEX-4T-2上的限制性内切酶的酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(Ori)、一个IPTG可调启动子/操纵子(P/O)，一个凝血酶识别位点，一个谷胱甘肽转移酶(GST)融和蛋白标记物以及限制性内切酶克隆位点。

以具有完整AccRoyalisin成熟肽核苷酸序列的克隆为模板进行PCR扩增，经电泳检测，得到约150bp的目的DNA片断(图2，泳道1)。将该PCR产物纯化后连接到pGEM-T easy载体，转化大肠杆菌感受态细胞，接种于细菌培养基平板，在含有Amp^r的LB培养皿上筛选转化子，挑取阳性克隆，抽提质粒进行PCR和BamH I和Not I内切酶双酶切鉴定。阳性克隆的PCR产物和酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约150bp的片段(图2，泳道2)与目的片段大小相符。将其中一个阳性克隆进行测序，得到SEQ ID No.6的全长为153bp基因的全长序列，该序列基因编码全长为51个氨基酸残基的成熟肽(SEQ ID No.7)。

用BamH I和Not I双酶切表达载体pGEM-4T-2及带有AccRoyalisin成熟肽基因的pGEM-T easy载体，分别电泳回收，随后将回收的AccRoyalisin成熟肽基因片段连接到经BamH I和Not I双酶切的pGEX-4T-2载体。随后用连接混合物转化商品名为BL21的E.coli菌株感受态细胞。在含有Amp^r的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒。用BamH I和Xho I双酶切所得质粒，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在约4900bp和150bp处有与预期载体和目的片段大小相符的片段(结果同图2)。

将鉴定正确的重组表达质粒转化到BL21感受态细胞中，涂布菌液于含100μg/mL Amp的LB平板中，挑取白色菌落，接种于含同等质量浓度Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜活化。按每支试管6mL含Amp的LB液体培养基加入100μL菌液的量，转接活化菌液，共接四支试管，37℃、220r/min振荡培养至OD₆₀₀：0.6-1.0，按一定浓度0.08g/L加入IPTG，37℃、180r/min诱导培养6h。后取1mL菌液，8000r/min离心5min收集菌体，弃上清后，加入PBS 200μL震荡悬浮沉淀，8000r/min离心5min，弃上清，再加入等体积的PBS和2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀后100℃煮沸10min，12000r/min离心1min，取其上清液。诱导产物经10％的SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝R-250染色2h后，室温摇床上脱色至背景色脱尽观察。鉴定表达的目的蛋白分子量大小为约32kDa(图3)，该蛋白为AccRoyalisin(5.52KDa)和pGEX-4T-2载体所带谷胱甘肽基因表达产物(26KDa)的融合蛋白AccRoyal isin-GST。经薄层扫描分析，所表达蛋白占细胞总蛋白的15.1％。将诱导表达产物用超声波破碎后，取沉淀进行SDS-PAGE电泳。用GST多克隆抗体为一抗对GST-AccRoyalisin融合表达蛋白的SDS-PAGE胶进行Western-blot检测，蛋白印迹呈现32kDa的特异性条带(图5)。

诱导表达的产物离心后收集菌体，将收集的菌体用PBS悬浮，放置于冰上，超声处理60次(每次5s，间隔6s)。将处理后的菌液12000r离心10min，取上清(可溶性蛋白)及沉淀(包涵体蛋白)分别进行SDS-PAGE电泳检测两者的含量。电泳检测结果表明重组表达蛋白主要属于可溶性蛋白(图3，泳道3-4)。收集可溶性蛋白，过GST亲和胶(High-Affinity GST Resin)进行分离纯化。将纯化的可溶性蛋白用透析袋去除盐离子后进行冷冻干燥。将冻干粉电泳检测，显示清晰的分子量为32kDa的单一条带(图3，泳道1-2)。同样，对pGEX-4T-2载体转化菌表达的GST蛋白进行纯化，得到纯化的GST蛋白(图6)。

实施例3：中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin成熟肽抑菌作用

将实验室中金黄色葡萄球菌、黄色乳球菌及枯草芽孢杆菌活化后，挑单菌落接种于LB培养基中在37℃，220r/min的条件下培养8小时后取出。分别将三个菌种稀释10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10后，各取1mL涂布于细菌培养基平板上，放置培养箱中培养16个小时后，取菌落总数在100-300间的平板，读取菌落总数。

计算出三种细菌的浓度分别为：枯草芽孢杆菌为1.5*10⁸cfu/mL，黄色乳球菌1.2*10⁹cfu/mL，金黄色葡萄球菌1.8*10⁸cfu/mL。

将三种菌液按比例用无菌水稀释为1.0*10⁷cfu/mL的菌液，各取200μL涂布于营养琼脂细菌培养基，置37℃培养1小时。然后在平板上贴上无菌滤纸片(直径为9mm)备用。

将纯化的AccRoyalisin-GST融合蛋白冻干粉按2mg/mL的浓度溶解于经灭菌的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，以从PGEM-4T-2转化菌表达产物纯化的GST为阴性对照(2mg/mL)，商品化抗菌肽Nisin(2mg/mL)为阳性对照，Tris-HCl为空白对照。每个处理各取20μL滴加于滤纸片，作三组以上平行。静置3h后，37℃倒置培养16小时，用卡尺分别测量各处理每张滤纸片周围的抑圈直径，最后统计各处理的抑圈直径差异。

实验结果显示GST-AccRoyalisin对三种细菌均有类似于阳性对照Nisin的抑制作用抑菌效果，抑制圈均非常明显(图6，表2)，而阴性对照GST和空白对照Tris-HCl均未显示抑制圈。该结果排除了GST-AccRoyalisin融合蛋白中GST的作用，证明发挥抑菌作用的是AccRoyalisin。

表2：本发明中GST-AccRoyalisin融合蛋白和Nisin对三种革兰氏阳性细菌的抑菌效果测定

备注：抑菌圈直径上“*”表示GST-AccRoyalisin与Nisin有显著性差异(p-value＜0.05)

实施例4：制备GST-AccRoyalisin抗体

将实施例2中获得的重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离用来免疫动物以产生抗体。

具体方法如下：

将诱导表达产物进行SDS-PAGE电泳，从凝胶中切下特异性表达的蛋白条带，冷冻保存，使用前加0.9％的生理盐水置玻璃匀浆器内碾磨匀浆，从而完成GST-AccRoyalisin抗原的制备.具体抗体制备步骤如下：(1)选取14-16周龄的健康新西兰大白兔，每次注射相当于0.5mg左右纯化的融合蛋白抗原.免疫前，从兔耳抽取血样，作为阴性对照.(2)融合蛋白抗原溶于700μL生理盐水，加700μL弗氏完全佐剂和适量青霉素、链霉素溶液乳化，皮下多点注射免疫.(3)3.3周后，融合蛋白抗原溶于700μL生理盐水，加700μL弗氏不完全佐剂和适量青霉素、链霉素溶液乳化，皮下多点注射免疫.(4)4.2周后，融合蛋白抗原溶于1mL生理盐水肌肉注射免疫.(5)5.1周后，再次用1mL溶有融合蛋白抗原的生理盐水加强免疫.同时，从兔耳抽血样，采用间接ELISA方法进行多抗血清效价测定.(6)6.1周后，颈动脉收集血液，置室温下使其凝固.(7)将凝固的血液放入37℃温箱内半小时，再置4℃冰箱过夜，使血块收缩，抗血清析出；(8)吸出抗血清，3000r/min离心10min，吸上清液分装，-70℃保存备用.

采用间接ELISA法。以免疫前采集的正常兔血清为阴性对照，经高速离心的蜂王浆溶液上清为抗原，HRP标记的羊抗兔IgG做酶标二抗，对所制备多克隆抗体进行酶联免疫吸附试验，OPD显色后在492nm下测定0D值，确定抗体效价。

多克隆抗体的稀释采用倍半法，第一次稀释100倍，第二次200倍，依次类推。所表达蛋白在抗体稀释倍数为15000时，多克隆抗体D₄₉₂平均值仍大于阴性对照0D₄₉₂值的两倍(表3)。为Royalisin的研究和检测提供了材料。

表3：本发明中GST-AccRoyalisin融合蛋白多克隆抗体效价的ELISA检测

中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因及其编码多肽与应用基因序列表

<110>浙江大学

<120>中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因及其编码多肽与应用

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>Accr-f1引物

<400>1

aggatccatg aagatctatt ttattg 26

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>Accr-f2引物

<400>2

aggatccatg gtaacttgtg acctt 25

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>Acc-r1引物

<400>3

gcggccgctt aaccgaaacg tttgtc 26

<210>4

<211>288

<212>DNA

<213>中华蜜蜂王浆

<400>4

atgaagatct attttattgt cgcctttctc ttcatggcta tggttgccat catggctgca 60

cctgttgagg atgaattcga gccacttgag catcctgaga acgaagaacg taccgataga 120

catagaagag taacttgtga ccttctctca ttcaaaggac aagtcaatga cagtgcttgc 180

gctgctaact gtcttagttt gggtaaagct ggaggtcatt gcaagaacgg agtttgtatt 240

tgtcgaaaaa ccagtttcaa agatctctgg gacaaacgtt tcggttaa 288

<210>5

<211>288

<212>PRT

<213>中华蜜蜂王浆

<400>5

Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala

1 5 10 15

Thr Thr Gly Thr Cys Gly Cys Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Thr Thr

20 25 30

Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Gly Cys Cys

35 40 45

Ala Thr Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Thr Gly

50 55 60

Thr Thr Gly Ala Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Thr Thr Cys Gly Ala

65 70 75 80

Gly Cys Cys Ala Cys Thr Thr Gly Ala Gly Cys Ala Thr Cys Cys Thr

85 90 95

Gly Ala Gly Ala Ala Cys Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys Gly Thr Ala

100 105 110

Cys Cys Gly Ala Thr Ala Gly Ala Cys Ala Thr Ala Gly Ala Ala Gly

115 120 125

Ala Gly Thr Ala Ala Cys Thr Thr Gly Thr Gly Ala Cys Cys Thr Thr

130 135 140

Cys Thr Cys Thr Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala Gly Gly Ala Cys

145 150 155 160

Ala Ala Gly Thr Cys Ala Ala Thr Gly Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys

165 170 175

Thr Thr Gly Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Ala Ala Cys Thr Gly Thr

180 185 190

Cys Thr Thr Ala Gly Thr Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala Gly

195 200 205

Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Cys Ala Thr Thr Gly Cys Ala Ala

210 215 220

Gly Ala Ala Cys Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Thr Ala Thr Thr

225 230 235 240

Thr Gly Thr Cys Gly Ala Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Thr Thr

245 250 255

Thr Cys Ala Ala Ala Gly Ala Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala

260 265 270

Cys Ala Ala Ala Cys Gly Thr Thr Thr Cys Gly Gly Thr Thr Ala Ala

275 280 285

<210>6

<211>159

<212>DNA

<213>AccRoyalisin

<400>6

gtaacttgtg accttctctc attcaaagga caagtcaatg acagtgcttg cgctgctaac 60

tgtcttagtt tgggtaaagc tggaggtcat tgcaagaacg gagtttgtat ttgtcgaaaa 120

accagtttca aagatctctg ggacaaacgt ttcggttaa 159

<210>7

<211>159

<212>PRT

<213>AccRoyalisin

<400>7

Gly Thr Ala Ala Cys Thr Thr Gly Thr Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys

1 5 10 15

Thr Cys Thr Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala

20 25 30

Ala Gly Thr Cys Ala Ala Thr Gly Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Thr

35 40 45

Thr Gly Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Ala Ala Cys Thr Gly Thr Cys

50 55 60

Thr Thr Ala Gly Thr Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala Gly Cys

65 70 75 80

Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Cys Ala Thr Thr Gly Cys Ala Ala Gly

85 90 95

Ala Ala Cys Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Thr Ala Thr Thr Thr

100 105 110

Gly Thr Cys Gly Ala Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Thr Thr Thr

115 120 125

Cys Ala Ala Ala Gly Ala Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys

130 135 140

Ala Ala Ala Cys Gly Thr Thr Thr Cys Gly Gly Thr Thr Ala Ala

145 150 155

Claims

1.一种中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因，其特征在于，它具有SEQ IDNo.4所示的序列。

2.一种权利要求1所述中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因的编码多肽，其特征在于，它具有SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。

3.一种权利要求2所述中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因的编码多肽在制备抗体方面的应用。

4.一种权利要求2所述中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因的编码多肽对革兰氏阳性细菌的抑制作用。